KR102308085B1 - 정전기적 분리를 위한 대전된 이소포러스 재료 - Google Patents

정전기적 분리를 위한 대전된 이소포러스 재료 Download PDF

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Abstract

멀티블록 중합체 재료, 제조방법, 및 정전기적 상호작용을 통해 높은 플럭스(flux)로서, 단백질, 핵산, 다른 생물학적 물질 또는 다른 생체 분자, 화합물 또는 용질을 분리하기 위한 사용으로, 상기 자가-조립 블록 중합체 재료는 매크로(macro), 메조(meso) 또는 마이크로(micro) 포어(pore) 중 하나 이상을 포함하고, 상기 포어 중 적어도 일부는 이소포러스(isoporous)이며, 적어도 하나의 중합체 블록은 이소포러스 구조에 대전되는 넓은 표면적을 제공하기 위해 고정 정전하 또는 반응성 기능성 그룹을 포함한다.

Description

정전기적 분리를 위한 대전된 이소포러스 재료
본 출원은 2016년 4월 28일자로 출원된 미국 임시 출원번호 62/328,707의 이익을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 포함된다.
이소포러스 재료를 포함하는 멀티블록 중합체 분리기(separator), 제조방법, 정전기적 상호작용을 통해 용질을 분리하기 위한 사용에 관한다.
단백질 발현, 구조 및 기능을 이해하는데 있어 중대한 진전에도 불구하고, 복잡한 혼합물로부터 단백질을 정제하는 것은 여전히 문제로 남아있다. 주로 세포 배양액에 있는 표적 분자는 또한 매우 다양한 불필요한 또는 심지어 우발적인 성분, 예를 들어 숙주 단백질, 세포 잔해물, DNA, 바이러스 및 내 독소를 포함하여 분리의 복잡성을 더한다. 표적 단백질은 종종 환경 조건에 매우 민감하며 쉽게 변성되거나 손상될 수 있다.
업스트림 기술은 5g/L보다 큰 제품 역가를 가져올 수 있으며, 높은 처리량 정제에 대한 필요성을 불러 일으키고 있다. 전통적으로 생체 분자 정제는 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 컬럼을 포함하는 크로마토그래피에 크게 의존해왔다. 그러나, 이러한 크로마토그래피 기술은 처리량이 제한적이며 다운스트림 바이오공정의 높은 비용에 광범위하게 기여한다.
한외여과(Ultrafiltration, UF)는 단백질 농도와 배합을 위한 다운스트림 바이오공정의 후반 단계에서 자주 사용된다. 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 UF 멤브레인이 있으며, 이는 트랙-에칭(Track-etched) 또는 위상-반전(phase-inverted) 멤브레인이다. 트랙-에칭 멤브레인은 매우 균일한 포어들을 갖고, 선택적 분리가 가능하나, 낮은 포어 밀도로 인해 처리량이 낮다. 한편, 위상-반전 멤브레인은 보다 높은 플럭스를 허용하지만, 비균일한 포어들을 가지고 있고 선택적 분리를 얻을 수 없다. 플럭스 한계로 인해 트랙-에칭 멤브레인은 벤치-규모(bench-scale) 연구에 거의 독점적으로 사용되는 반면, 위상-반전 멤브레인은 다운스트림 생물약제학적 공정에 광범위하게 사용된다. 위상-반전 멤브레인은 경험적으로 넓은 대수-정규(log-normal) 포어 크기 분포를 나타내어 효과적인 분획화를 위하여 단백질 몰 질량의 6-10배 차이를 필요로 한다. 이러한 포어 크기의 변화는 멤브레인을 가로지르는 고르지 않은 흐름 패턴을 야기하고, 파과곡선(breakthrough curves)을 넓히고 배지(media) 용량을 감소시킨다.
멤브레인 구조 및 화학적 기능성의 결핍은 농도 및 배합 단계에서의 이들의 사용을 크게 제한했다. 따라서, 실험실 규모의 검증 및 의학적으로 관련된 단백질의 상업적 규모의 제조를 위한 단백질 정제 방법을 개선할 필요가 있다. 출원인은 이소포러스 재료들의 물리적 구조의 독특한 조정(tuning)을 화학적 기능성과 결합하여 정전기적 상호작용을 통해 유사 크기의 용질을 용이하게 분리시킴으로써, 이소포러스이고, 대전된 멀티블록 중합체 재료, 예를 들어 필름, 멤브레인, 시트 및 튜브의 생산을 가능하게 하고, 결과적으로 높은 처리량 및 고해상도 분리 응용을 가져와 종래 기술의 한계를 극복함을 발견하였다.
복잡한 혼합물로부터의 다른 생체 분자 분리도 특히 어려울 수 있다. 예를 들어, 핵산은 진단을 위해 전혈에서 분리될 수 있다. 전혈로부터 DNA를 분리하는 것은 적혈구, 단백질 및 염분을 포함한 다양한 길이의 용질로 인해 특히 어려운 분리이다. DNA 분리의 한 가지 방법은 정전기적 상호작용을 이용하여 복잡한 혼합물로부터 음으로 대전된 DNA를 분리하는 것이다. 그럼에도 불구하고 기존 멤브레인 기술을 통한 분리의 어려움으로 인해 전혈에서 DNA를 분리하기 위한 효과적인 멤브레인 기술은 상업화되지 않았다. 출원인은 본 명세서에 기재된 발명이 상기 전혈로부터의 핵산의 분리 및 농축을 가능하게 함을 발견했다.
대전된 다공성(porous) 재료는 생물막 성장을 예방하는데 효과적이다. 예를 들어, 상처용 드레싱과 같은 재료를 사용할 때 다공성 재료는 수증기, 질소 및 산소와 같은 기상 화학물질의 통과를 가능하게 한다. 그러나, 생물막이 성장하면 상처 치유를 억제 할 수 있다. 본 명세서에 기재된 대전된 다공성 재료는 생물막 성장을 억제하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 대전된 다공성 물질은 상처 치유 특성을 더욱 향상시키고 상처 치료 응용에 도움을 주기 위하여 항균 화학 작용에 의해 추가로 기능화될 수 있다.
크로마토그래피 컬럼은 또한 전하 및 크기를 포함하는 다양한 물리적 및 화학적 특성에 기초하여 종(species)을 분리하는데 광범위하게 사용되어 왔지만, 크로마토그래피는 처리량이 제한되고 종종 비용이 많이든다. 본 명세서에 기재되는 대전된 다공성 재료는 전하 및 크기에 기초하여 용질을 분리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 정전기 상호작용을 통해 멤브레인에 결합된 종은 용리제의 구배(gradient)를 상기 재료에 통과시켜 멤브레인에서 탈착될 수 있다. 이러한 방식으로, 구배 분리(gradient separation)가 수행될 수 있다. 대안적으로, 고정되어 있는 조성물의 용리제를 상기 멤브레인에 통과시킴으로써 종의 선택물(selection)을 상기 멤브레인으로부터 탈착시킬 수 있다. 상기 고정되어 있는 조성물은 종의 목적하는 선택물만을 탈착시키는데 적합하다. 이 방법으로, 등용매 분리(isocratic separation)가 수행될 수 있다. 추가로 일련의 용리는 종의 부가적인 선택물을 탈착시키는데 적합한, 고정되어 있는 조성물의 각각의 용리제를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 방식으로, 한 단계 용리가 수행될 수 있다.
전하와 크기가 결합된 효과를 사용하여 생체 분자를 포함하는 용질을 분별하는데 대한 강한 관심이 있어왔다. 그러나, 상기 유망한 접근의 추가 개발에서의 중요한 한계 요인은 기존 멤브레인 플랫폼의 포어 크기가 균일하지 않다는 것이다. 도 1은 포어 크기 분포로 인한 문제를 보여준다. 큰 포어 크기 영역(5)은 화살표 (35)로 나타낸 것보다 더 큰 흐름 부분을 나타내는 화살표(30)에 의해 표시된 작은 포어 크기 영역(10)보다 더 많은 유체 흐름을 전달한다. 대전된 부위는 큰 포어 크기 영역에 결합된 종으로 빠르게 채워져, 작은 포어 크기 영역이 계속하여 결합하는 동안 멤브레인으로부터 상기 종들이 빠져나갈 수 있게 한다. 따라서 결합을 목적으로 하는 종들의 파과(breakthrough)가 모든 포어들이 균일한 크기일 경우 발생하는 것보다 더 적은 양의 처리량에서 발생한다.
본 출원인은 역사적인 멤브레인 플랫폼의 대수-정규(log-normal) 포어 크기 분포의 확산을 감소시키기 위해 포어 크기 균일성을 향상시킴으로써 이 문제를 해결하였다. 예를 들어, 본 발명의 멤브레인의 일 실시예에서, 도 2에 보여지는 바와 같이, 거의 동일한 포어의 단일층(15)이 멤브레인의 다운스트렘 표면상에 형성된다. 이 층은 동일한 크기의 흐름 화살표 (20) 및 (25)로 표시된 바와 같이, 멤브레인의 업스트림 부분에서의 포어 크기 분포에 관계없이, 흐름이 균일하게 분포되도록 하는 흐름 저항(resistance to flow)의 대부분에 기여한다.
본 발명은 이소포러스 멀티블록 중합체 재료를 갖는 필터(filter)/분리기(separator), 총괄적으로는 재료, 제조방법 및 정전기적 상호작용을 통해 생체 분자를 포함하는 용질을 분리하기 위한 사용에 관한 것이다.
본 발명의 대전된, 자가-조립 블록 중합체 재료는 매크로(macro), 메조(meso) 또는 마이크로(micro) 포어(pore) 중 하나 이상을 포함하고, 이들 중 적어도 일부는 이소포러스(isoporous)이며, 상기 중합체 블록의 적어도 하나는 고정 정전하(stationary electrostatic charge) 또는 반응성 기능성 그룹(reactive fuctional group)를 포함한다. 상기 재료는 상기 기능성 그룹의 대전된 모이어티(moiety)에 의해 부분적으로 또는 정량적으로 기능화된 메이저(major), 마이너(minor) 및 간극(interstitial) 영역을 가지며, 상기 재료에 고정 전하를 생산하기 위한 것이고, 대전된 넓은 표면적, 및 높은 플럭스(flux)를 갖는 단백질, 핵산, 다른 생물학적 물질 또는 다른 생체 분자, 또는 용질의 용이한 분리를 위한 이소포러스 구조를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 이소포러스이고, 대전된, 멀티블록 중합체 재료는 매크로, 메조 또는 마이크로 포어 중 하나 이상을 가지고 이들 중 일부는 이소포러스인 A, B 및 C 블록을 적어도 포함하고, 중합체 블록 중 하나 이상은 고정 정전하 또는 반응성 기능성 그룹을 포함하며, 하기의 식에 의해 정의된다:
A-B-C (I),
A-B-C-B (II),
A-B-C-D (III),
A-B-C-B-A (IV),
A-C-B-C-A (V)
본 발명의 멀티블록 중합체는 일반적으로 블록 A, B, C, (X)n, 여기서 n = 0-7인 것을 포함하는 것으로 정의되며, X는 동일하거나 상이할 수 있고 A, B, C, D, E, F 또는 G로부터 선택된 것이다. A, B 또는 C 중 하나에 적합한 블록은 낮은 Tg 블록 (≤ 25℃)이나, 단, 상기 블록 중 하나가 낮은 Tg 블록일 때 하나 이상의 다른 블록은 높은 Tg 블록 (> 25℃)이다. 적어도 하나의 블록은 고정 전하를 갖거나 반응하여 고정 전하를 생성할 수 있는 반응성 기능성 그룹을 포함해야 한다.
D, E, F 또는 G에 적합한 블록은 폴리(부타디엔), 폴리(이소부틸렌), 폴리(부틸렌), 폴리(이소프렌), 폴리(에틸렌), 폴리(스티렌), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(부틸 메타크릴레이트), 폴리(에테르술폰), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(n-부틸 아크릴레이트), 폴라(2-하이드록세틸 메타크릴레이트), 폴리(글리시딜 메타크릴레이트), 폴리(아크릴 에씨드), 폴리(아크릴아마이드), 폴리(술폰), 폴리(비닐리덴 플루오라이드), 폴리(n,n-디메틸아크릴아미드), 폴리(2-비닐피리딘), 폴리(4-비닐피리딘), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(비닐 클로라이드), 폴리(테트라플루오로에틸렌), 폴리(실록산), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 옥사이드), 폴리(n-이소프로필아크릴아마이드), 폴리(디메틸아미노에틸 메타크릴레이트), 폴리(아믹 에씨드), 폴리(디메틸실록산), 폴리(락틱 에씨드), 폴리(이소시아네이트), 폴리(에틸 시아노아크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜 메틸 에테르 메타크릴레이트), 폴리(아크릴로니트릴), 폴리(하이드록시스티렌), 폴리(α-메틸스티렌), 폴리(에틸렌이민), 폴리(스티렌 술포네이트), 폴리(알릴아민 하이드로클로라이드), 폴리(펜타플루오로스티렌), 폴리(2-(퍼플루오로헥실)에틸 메타크릴레이트)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 재료들, 예를 들어, 3차원, 멤브레인, 필름, 시트, 튜브 또는 나선형(helical) 또는 스파이럴(spiral) 형태로 지지되거나 지지되지 않는 것을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 여기서 상기 재료는 대전된 모이어티로 기능화된 이소포러스 블록 중합체를 포함하고, 상기 재료를 높은 처리량 및 전하-기반 분리에 적합하게 만든다.
본 발명은 용질의 크기 및 정전기적 특성 모두에 기초하여 용질 분리를 용이하게 하는 고정 전하를 갖는 이소포러스 멀티블록 중합체를 포함한다.
본 발명은 분석 및 산업 단백질 분획화를 위한 단백질 분획화 및 분리를 위해, 높은 플럭스를 갖는 기능화된 분리기를 포함한다.
본 발명은 예를 들어 하나의 양전하 단백질과 하나의 중성 단백질의 정전기적 반발력을 통해, 단백질과 같은 유사한 크기를 갖는 분자들의 분리를 용이하게 하는 이소포러스 재료에 관한 것이며, 실험실, 확대된 규모 또는 상업적 환경에서의 환자 특이적 생체분자를 포함하는 생물학적 특이적 분자들의 단백질 생산 및 분석을 위한 것이다.
본 발명은 이소포러스 재료에 관한 것으로, 정전기적 상호작용을 통한 유사한 크기의 단백질의 분리, 제조 방법 및 사용을 용이하게 하고; 정전기적 상호작용을 통해 핵산의 분리를 용이하게 하고; 정전기적 상호작용을 통해 대전된 생체 분자들의 분리를 용이하게 한다.
본 발명은 이소포러스 재료에 관한 것으로, 정전기적 상호작용을 통해 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinase)의 선택적 분리를 용이하게 한다.
본 발명은 3차원, 필름, 튜브, 나선형(spiral), 시트 등의 다양한 형태의 대전된 이소포러스 재료에 관한 것이다.
상기 대전된 이소포러스 재료는 상이한 전하 상태를 갖는 유사한 크기의 단백질을 정전기적으로 분리하기 위해 10 이상의 선택성 및/또는 50 Lm-2hr-1bar-1의 투과성을 갖는다.
본 발명은 높은 표면적 및 균일한 포어 크기를 갖는 계층적으로 다공성인 물질을 형성하는 화학적으로 반응성인 기능화된 중합체 블록을 하나 이상 갖는 자가-조립 멀티-블록 중합체 또는 자가-조립 멀티-블록 공중합체(MBP 또는 BCP) 재료를 포함하며, 이는 본 명세서에 개시된다. 이들 이소포러스 재료의 반응성 영역은 말단 또는 가교 결합제와 반응성 단위의 반응에 의해 부분적으로 또는 정량적으로 기능화되어 상기 재료에 고정 전하를 생산하며, 상기 전하도(degree of charge)는 이용 가능한 반응성 단위의 적어도 20% 내지 90%, 예를 들어 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90 %이다.
자가-조립 멀티블록 공중합체 대전된 재료에서, 상기 재료는 약 1-200nm의 크기 및 그 사이의 모든 단위 크기 및 범위를 포함하는 메조포어(mesopore) 및 적어도 50nm 또는 그 이상의 크기를 포함하는 매크로포어(macropore)를 갖는다.
자가-조립 멀티블록이 개시되며, 본 명세서에 기재된 이소포러스 대전된 재료는 대전된 용질 또는 수분투과도가 >50Lm-2hr-1bar-1, > 100Lm-2hr-1bar-1, > 200Lm-2hr-1bar-1인 용질을 효과적으로 분리한다. 상기 크기-배제 및 전하-상호작용의 이중 분리 방법은 단백질, 핵산, 치료적 화합물 또는 기타 관련된 분자 또는 화합물의 높은 처리량의 바이오공정(bioprocessing)을 유도한다.
본 명세서에는 하나의 양전하 단백질 및 하나의 중성 단백질의 정전기적 반발력을 통해 유사한 크기의 단백질을 분리하기 위해 고정 양전하를 갖는 자가-조립 멀티블록이고 이소포러스인 대전된 재료가 개시된다.
본 명세서에는 하나의 양전하 단백질 및 하나의 중성 단백질의 정전기적 반발력을 통해 유사한 크기의 단백질을 분리하기 위한, 고정 음전하를 갖는 자가-조립 멀티블록이고 이소포러스인 대전된 재료가 개시된다.
본 명세서에는 전하 상호작용을 통해 핵산을 분리하기 위한, 고정 양전하를 갖는 자가-조립 멀티블록이고 이소포러스인 대전된 재료가 개시된다.
본 명세서에는 전하 상호작용을 통해 생체 분자를 분리하기 위한, 고정 양전하를 갖는 자가-조립 멀티블록이고 이소포러스인 대전된 재료가 개시된다.
본 명세서에는 전하 상호작용을 통해 생체 분자를 분리하기 위한, 고정 음전하를 갖는 자가-조립 멀티블록이고 이소포러스인 대전된 재료가 개시된다.
5-100 nm 크기의 포어들의 이소포러스 특성과 이들 사이의 모든 단위 크기 및 범위는 전하 분리(charge separation)에 특히 유리한데, 이는 이소포러스 분리층(isoporous separation layer)과 접촉하는 모든 종들이 동일한 정전기 환경을 경험하도록 강요되기 때문이다. 상기 포어들이 크기내에서 매우 다분산성(polydisperse)인 경우 용질들이 상이한 전하 환경을 경험하는 것이 가능하며, 어떠한 전하 분리 효과도 없이 큰 포어의 중심을 통과하는 것을 예를 들 수 있는데, 이는 정전기적 상호작용이 거리의 함수에 따라 극적으로 떨어지기 때문이다. 높은 공극율(porosity) 및 일부 경우에서의 계층적 구조는 높은 표면적에 기여하며, 따라서 분리를 위해 이용가능한 큰 전하량에 기여한다. 결합 및 용리 메커니즘 작동시, 이는 또한 큰 결합 용량(binding capacity)을 제공한다.
도 1은 큰 포어 크기 분포를 갖는 멤브레인을 통과하는 흐름 경로의 개략도이다. 이 구조의 흐름은 불균일한 흐름 분포를 초래한다. 큰 포어 크기의 영역(5)은 보다 작은 포어 크기의 영역(10)보다 더 많은 유체 흐름을 전달하며, 이는 화살표(35)로 나타낸 것보다 흐름의 더 큰 영역을 나타내는 화살표(30)에 의해 표시된 바와 같다.
도 2는 멤브레인의 다운스트림 표면 상에, 아래에 기술된 본 발명의 재료를 사용한, 거의 동일한 포어들의 단일 층(15)을 포함하는 멤브레인을 통과하는 흐름 경로의 개략도이다. 이 층은 멤브레인의 업스트림 영역에서의 포어 크기 분포에 관계없이, 동일한 크기의 흐름 화살표(20) 및 (25)로 표시된 바와 같이, 흐름이 균일하게 분포되도록 하는 흐름에 대한 저항의 대부분에 기여한다.
도 3은 본 발명에 따른 트리블록 삼원 중합체(triblock terpolymer) ISV (폴리(이소프렌-b-스티렌-b-4-비닐피리딘))의 화학 구조이다. 폴리(이소프렌) 블록 (I)은 파선, 폴리(스티렌) 블록 (S)은 회색, 폴리(4-비닐피리딘) 블록 (V)은 흑색으로 표시되었다. 상기 피리딘은 V 블록 상에 양전하를 도입하기 위해 4차화될 수 있다.
도 4는 4차화된 폴리(4-비닐피리딘)의 화학 구조식으로, 여기서 -R은 아래에서 정의되는 바와 같은 임의의 화학 그룹이고, X는 음의 반대이온(negative counterion)이다.
도 5는 본 발명에 따른, 폴리(4-비닐 피리딘) (P4VP) 및 요오도아세트아미드의 화학 구조식(왼쪽)으로, 양으로 대전된 피리디늄 및 펜던트 아미드 그룹을 갖는 요오도아세트아미드-4차화된 P4VP(오른쪽)를 형성하기 위해 반응한다.
도 6은 미처리된 이소포러스 재료(왼쪽)와, 본 발명에 따라 상기 이소포러스 재료 표면에 화학 그룹(구 형태) 및 고정 양전하("+")가 부착된 기능화된 재료(오른쪽)을 나타낸 재료 기능화의 개략도이다.
도 7은 본 발명에 따른 다중 폴리(4-비닐피리딘) (P4VP) 단위 및 디요오도부탄의 화학 구조(왼쪽)이며, 가교결합된 P4VP(오른쪽)를 형성하기 위해 반응한다.
도 8은 본 발명에 따른 비4차화된(Unquat.)(상부, 파선) 및 4차화된(Quat.)(하부, 실선의 회색 라인) 멤브레인의 FTIR 특성이다. 1640 cm-1에서의 특성 증가는 헤테로시클릭 아민(heterocyclic amine)의 대전된 피리디늄으로의 변환을 나타낸다. 1700 cm-1에서의 밴드의 외관은 4차화동안 도입된 아미드 C=O 결합으로부터 유도된다.
도 9는 비 4차화(Unquat.) 및 4차화(Quat.) 멤브레인을 사용한 단일 용질 단백질 (A)-(C) (흑색) 및 2성분 단백질 혼합물 (D) 및 (E)의 거부(rejection) 거동을 도시한 A-E 5개의 차트를 그래프로 비교한 것이다. Mgb는 흑색 막대로 표시되고 Lys 및 CytC는 빗금으로 표시된 흑백 막대로 표시된다. 단백질 용액들의 농도는 0.1mg/mL였다.
도 10은 하기에 기재된 바와 같이 요오도아세트아미드(본 발명의 재료)에 의해 4차화된 4개의 ISV 멤브레인에 결합되고 이로부터 용리되는 400 bp (흑색 바) 및 200 bp (빗금친 흑백 바) DNA 단편 수율을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따라 0.6x 완충액으로 용리된 200bp(흑색 바) 및 600bp(빗금친 흑백 바) DNA 단편의 상대적인 회수(relative recovery)를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른, 음으로 대전된 핵산 단편 (65), 작은 대전되지 않은 용질 및 용매 분자(55) 및 큰 세포 구성물질 (60)을 포함하는 용액으로 챌린지(challenge)된, 양으로 대전된(50) 이소포러스 재료층(15)의 개략도이다. 비-핵산 성분은 크기-배제 메커니즘으로 인해 멤브레인을 통과 또는 멤브레인에 의해 유지되고 버려지는 반면, 핵산은 멤브레인에 정전기적으로 결합하고 그 후에 크기-선택적으로 용리된다.
도 13은 본 발명에 따라 양으로 대전된 분자 (70), 작은 대전되지 않은 용질 및 용매 분자(55)를 포함하는 용액으로 챌린지(challenge)된, 양으로 대전된(50) 이소포러스 재료(15)의 개략도이다. 대전되지 않은 분자들은 크기 배제로 인해 상기 재료를 통과하거나 상기 재료에 보유된다. 양으로 대전된 분자들은 전하 반발로 인해 거부된다.
이하의 설명에서, 본 명세서의 일부를 형성하고, 실시될 수 있는 특정 실시예를 도시하여 나타낸 첨부 도면을 참조할 수 있다. 이들 실시예는 본 기술분야의 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 상세히 기재되고, 다른 실시예들이 이용될 수 있으며 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 구조적, 논리적 및 전기적 변화가 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 임의의 예시, 실시예 또는 실험적 절차의 설명은 제한된 의미로 해석되어서는 안된다.
표적 분자 용액 및 표적 분자 그 자체 중 어느 하나 또는 모두의 복잡성은 종종 여러 단계를 필요로 하며, 시간이 오래 걸리고 비용이 많이 드는 과정이며, 효과적인 분리와 높은 처리량의 균형에 대한 필요를 모두 악화시킨다. 이소포러스 멤브레인의 화학적 기능화를 통해 향상될 두 가지 중요한 성능 파라미터는 체질 계수(sieving coefficient)로, S는 다음과 같이 정의된다:
Figure 112018117603045-pct00001
여기서, C F 및 C F 는 각각 투과 및 공급과 관련된 단백질의 농도이고, 수분 투과율 L P 는 다음과 같이 정의된다:
Figure 112018117603045-pct00002
여기서, J V 는 체적 여과 플럭스(volumetric filtrate flux)이며, ΔP는 막 차압(transmembrane pressure)이다.
나노 다공성 또는 한외여과 멤브레인을 포함하는 분리는 일반적으로 크기-선택성에 초점을 맞추어왔지만, 정전기적 상호작용은 단백질 용리에 대한 선택성 및 투과성에 중요한 영향을 미친다. 단백질의 등전점(isoelectric point, pI)은 생체 분자가 순 전하(net charge)를 나타내지 않는 pH이다. 상기 단백질 pI의 pH보다 낮은 용액에서 상기 분자는 양전하를 띄고, 반면 단백질 pI보다 높은 pH에서는 상기 분자는 음전하를 띈다. 이러한 전하 특성은 용액 pH뿐만 아니라 이온 강도까지 조정함으로써 나노다공성 또는 한외여과 멤브레인을 이용한 단백질 여과에 활용되어 선택성 및 처리량을 최대 수준까지 향상시킨다. 또한 단백질 크기와 전하간에 강한 상관 관계가 있으며, 정전 차폐(electrostatic shielding)가 감소하여 이온 강도가 감소함에 따라 유효한 단백질 크기가 증가한다. 보다 최근에는, 대전된 나노 다공성 또는 한외여과 멤브레인과 처리 조건의 조합이 단백질 선택성을 더욱 개선시키는 것으로 나타났다.
종래의 전하-기반 멤브레인 분리에 비해 본 발명의 한 가지 구별되는 특징은 이소포러스 멤브레인 구조에서의 집중된 포어 분포의 사용으로, 이는 넓은 포어 크기 분포를 갖는 나노 다공성 또는 한외여과 멤브레인과는 반대되는 것이다. 이는 단순화된 공정 조건 및 보다 높은 작동 압력을 가능하게 하여 전체적으로 더 높은 투과성을 나타낸다.
공급물이 멤브레인 표면에 평행하게 통과되는 접선(tangential) 흐름 구성에 최적화된 대전된 한외여과 멤브레인 분리에 대한 이전의 연구는, ~15-200 L m-2 hr-1의 평균 투과 플럭스를 나타냈다(Zydney and Kuriyel, High-Performance Tangential Flow Filtration for Protein Separations. Downstream Processing of Proteins, Springer, 35-46, (2000)). 이에 반해, 본 발명의 자가-조립 멤브레인은 좁은 "집중된(focused)" 포어 크기 분포를 가짐으로써 850 L m-2 hr-1까지의 투과 플럭스를 나타낸다.9 높은 플럭스에서 특정 성능 제한 인자, 예를 들어 농도 분극화(concentration polarization) 및 멤브레인 오염이 강화되는 반면(Shukla and Thommes, Trends Biotechnol., 28, 253-261, (2010)), 정전기적 성질과 물리적 멤브레인 특성의 결합은 기존 멤브레인-기반의 단백질 분리를 능가하는 성능을 가능하게 한다.
본 발명에 적합한 이소포러스 BCP 재료 멤브레인은 자가-조립인 것이다. 일반적으로, 이러한 이소포러스 유기 멤브레인의 제조는 적어도 부분적으로 휘발성인 용매(들)에 상기 BCP (또는 MBP) 중합체를 용해시키고, 상기 용매의 적어도 일부가 증발되도록 규정된 조건 하에 용액을 주조(casting)하고, 이어서 상기 결과 재료(material), 예를 들어 멤브레인/필름을 상 분리 용매 시스템과 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 절차는 일반적으로 예를 들어 미국 특허 제 5,700,902 호; 미국 특허 제 6,565,782 호; 미국 특허 공개 제 20110240550 호; 미국 특허 공개 제 20130193075호; 국제 특허 공개 제WO2005082501호; 미국 특허 공개 제 20090173694 호; 국제 특허 공개 제 WO 2012/151482호; EP2705077A2; Clodt et al, Macromol. Rapid Commun., 34, 190-194 (2013), Nunes et al, Langmuir, DOI 10.1021/Ia20439p, web published 28 June 2011; Phillip et al, Nano Letters, 11, 2892-2900 (2011); 및 Rangou et al, J. Membrane Sci., 451, 22662-2275 (2014)에 기재되어 있으며, 그 각각의 전체가 본 명세서에 참조로서 포함된다.
적합한 블록 중합체로부터 다공성 멤브레인을 형성하기 위한 또 다른 방법은 Sai et al, Science, 341, 530 (2013)에 기재된 "SIM2PLE" (세척(rinse)에 의해 스피노달 분리가 유도된 매크로- 및 메조 상 분리 및 추출) 공정이다. 이 공정에서, 적절한 BCP가 먼저 제조되고, 적절한 유기 용매 내에서 별도의 올리고머 중합체와 혼합되고, 승온에서 부분적 용매 증발에 의해 계층적으로 다공성인 멤브레인을 형성하도록 상기 혼합 용액을 주조한다. 최종 단계에서, 상기 (BCP의) 결과물 멤브레인으로부터 세척(rinsing)에 의해 상기 올리고머 중합체가 제거된다. 상기 멤브레인의 두께, 포어 크기 및 구조는 용매 및 중합체 농도의 선택, 용매 제거 시간 및 온도뿐만 아니라 다른 실험 인자들에서도 목적에 따라 조절될 수 있다. 상기 "SIM2PLE" 공정에 적합한 제 2 올리고머 중합체는 수용성이며 물로 세척하여 BCP로부터 제거될 수 있는 것이다. 일 실시예에서, 폴리(아크릴산) 또는 PAA가 제2 올리고머 중합체로서 사용되며, 폴리(에틸렌 옥사이드) PEO와 같은 다른 가용성 올리고머 중합체도 또한 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 자가-조립 블록 공중합체는 낮은 Tg (≤25 ℃)를 갖는 중합체 블록을 포함한다. 상기 낮은 Tg 블록은 기계적 인성(toughness)을 제공하고 재료의 가공성 및 취급 용이성을 완화한다. 또하나의 블록은 기계적 안정성을 제공하는 Tg> 25℃를 가져야 한다. 상기 블록들 중 적어도 하나는 재료에 정전하를 도입하기 위해 화학적으로 변형될 수 있거나 이미 대전된 적어도 하나의 기능성 그룹을 포함하는 중합체이어야 한다.
일 실시예에서, 상기 기능성 중합체 블록은 화학적으로 변형가능한 기능성 그룹으로서 방향족 질소 헤테로사이클을 포함한다. 이 실시예에서, 적합한 방향족 헤테로사이클은 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 퀴놀론, 이소퀴놀린, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 페나진, 이속사졸, 이소티아졸, 이미다졸, 벤조이미다졸, 트리아졸 및 테트라졸 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 방향족 질소 헤테로사이클은 상기 질소 상에 이온화 가능한 수소를 갖지 않는 것들이며; 즉, 상기 질소는 방향족 고리의 완전한 부분이다. 피리딘 및 이의 유도체는 특히 바람직한 헤테로사이클이다. 방향족 헤테로시클릭 그룹을 포함하는 중합체의 다른 예는 폴리(2-비닐피리딘) 또는 폴리(4-비닐피리딘) (P2VP 또는 P4VP)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 자가-조립된 이소포러스 재료, 예를 들어 멤브레인을 형성하는데 사용되는 블록은 ISV, 트리블록 또는 삼원 중합체 폴리(이소프렌-b-스티렌-b-4-비닐 피리딘)이며, 블록(일반 구조 A-B-C에 대응하는 I, S, V)을 도시하는 도 3을 참조로 한다.
일 실시예에서, 상기 트리블록 삼원 중합체 구조물은 약 0.30 부피율의 폴리이소프렌(PI), 0.55 부피율의 폴리스티렌(PS) 및 0.15 부피율의 폴리(4-비닐 피리딘)(P4VP)을 포함한다. 상기 PI, PS 및 P4VP의 부피율은 0.20 = PI ≤= 0.40 (예: block A); 0.45 = PS ≤= 0.65 (예: block B); 0.05 = P4VP ≤= 0.35 (예: block C)의 범위를 가진다. 상기 재료의 구조는 우수한 기계적 특성을 제공하는 동시에 작은 포어 크기를 허용한다. 상기 ISV 삼원 중합체 출발 물질은 음이온 중합을 통해 합성될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 이소포러스 (좁은 포어 크기 분포) 필름은 표면 층(본 명세서에서 또한 상부층으로 지칭됨) 및 벌크 층을 갖는다. 상기 적합한 표면층은 두께 범위를 갖는다. 예를 들어, 상기 표면층은 5nm 내지 500 nm의 두께를 가지며 상기 범위 사이의 nm에 대한 모든 값과 범위를 포함한다. 상기 표면 층은 상기 표면 층의 깊이까지 연장되는 다수의 포어들을 갖는다. 상기 표면층의 포어 크기(예: 직경)는 1nm 내지 200nm의 범위를 가지며, 상기 범위 사이의 nm에 대한 모든 값과 범위를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 명세서에 기재된 멤브레인의 표면 포어들의 밀도는 1014 포어수/ ㎡ 이상, 또는 1015 포어수/㎡ 이상이다. (최소 포어 직경에 대한 최대 포어 직경의 비율(dmax/dmin)로 정의된) 협소하거나 집중된 포어 크기 분포는 1 내지 3이며, 상기 범위 사이의 모든 0.1에서의 값 및 범위를 포함한다.
다양한 실시예에서, (dmax/dmin)은 3 미만, 예를 들어, 1, 1.5, 2, 2.5 또는 3 및 이의 모든 범위이다. 예를 들어, 상기 필름은 거의 단분산 메조포어를 갖는 표면층을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 이소포러스 표면층은 적어도 1x1014 포어수/m2의 포어 밀도 및 3 미만의 포어 크기 분포(dmax/dmin)를 갖는다.
상기 실시예들 중 일부에서, P4VP의 pKa 부근의 변곡점을 나타내는 멤브레인의 pH 의존적 수분 투과성뿐만 아니라 각 블록의 나노 미터-스케일의 상 분리를 나타내는 스테인드 투과 전자 현미경 이미지 모두에 의해 확인된 바에 따르면, 상기 ISV 삼원 중합체의 P4VP 물질은 주조된 재료 매트릭스의 표면 상에 존재한다.
상기 실시예 중 일부에서 기재된 바와 같이, 상기 이소포러스 재료는 멤브레인의 표면 상에 존재하며, 4차화 작용제가 접근가능한 질소 헤테로사이클을 갖는 중합체 블록을 포함하고, 상기 표면은 포어들 사이의 표면을 포함한다. 예를 들어, 상기 공중합체가 P4VP (약염기)를 포함하는 상기 일 실시예에서, 상기 P4VP는 다양한 화학물질을 사용하여 4차화되어, 도 4에 도시된 바와 같이 멤브레인상에 고정 양전하를 만든다.
상기 실시예에서 4차화 작용제는 표적화되는 특정 용질의 정제를 최적화하기 위해 선택된다. 상기 작용제의 많은 특성들은 유용한 방법으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 대전된 재료의 친수성/소수성 정도는 일부 단백질에서 중요한 고려 사항이 될 수 있다. 친수성/소수성을 조절하기 위해, 상기 4차화 작용제는 예를 들어 잔여물의 ClogP의 값 또는 범위 (친수성/소수성 정도를 반영하는 측정치)에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 보다 친수성인 환경이 바람직한 경우, 상대적으로 낮은 ClogP를 갖는 재료를 남기는 요오도아세트아미드, 요오도아세트산 또는 크로톤산과 같은 4차화 작용제가 선택될 수 있다. 만약 보다 소수성인 환경이 바람직한 경우, 비교적 높은 ClogP를 갖는 재료를 남기는 도데실 요오드화물과 같은 4차화 작용제가 선택될 수 있다. ClogP 이외에도 친수성/소수성 정도에 다른 측정법이 사용될 수 있다. 예를 들어 4차화 이후 재료의 접촉각에 대한 최적 값 또는 범위가 있을 수 있다. 상기 도입된 기능화 그룹(예: 카르복실산, 아미드)이 또한 후속 화학 반응 또는 유용한 기능성(예: pH 반응, 열 반응, 용매 저항성)에 유용할 수 있다.
상기 실시예의 4차화 작용제는 BCP의 질소 헤테로사이클과 반응하여 양전하를 띤 헤테로사이클을 형성하는 임의의 적합한 화합물이다. 본 발명의 일 특징은 양전하의 양을 조절하기 위해 전하도 또는 전하량이 변화될 수 있다는 것이다. 이는 정제되는 단백질을 위한 전체 전하를 최적화할 수 있게 한다. 4차화 후의 멤브레인의 전하 밀도(4차화 정도에 상응함)는 FTIR 및 NMR에 의해 결정될 수 있다.
상기 실시예의 4차화 작용제의 한 그룹은 화학식 R-X에 의해 정의된 화합물이며, 여기서, R은 C1-C24, 보다 바람직하게는 C1-C20의 치환 또는 비치환된 직쇄, 환형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐 그룹이고, X는 예를 들어 할로겐화물(F-, Cl-, I-, Br-), 또는 --OSO2CH3 등인 이탈 그룹(leaving group)이다. 일반적으로, 상기 이탈 그룹은 반응성을 최대화하기 위해 알킬 또는 알킬렌 그룹상의 말단 그룹(즉, 말단에 위치)이고 비치환된 sp3 탄소(즉, --CH2-X)에 부착된다. 상기 알킬 또는 알킬렌 그룹은 골격 내에 1 내지 24 개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 직쇄 알킬 그룹의 예는 메틸, 에틸, 부틸, 헥실, 옥틸, 데실 및 도데실을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 환형 알킬 그룹의 한 예는 -CH2-시클로헥산이다.
상기 실시예의 분지형 알킬 그룹의 예는 -CH2-CH(CH3)2 및 -CH2CH2-CH(CH3)2이다. 알케닐 그룹의 예는 게라닐(트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-X)일 수 있다. 치환된 알킬그룹의 예는 벤질(X-CH2-C6H5)일 수 있다. 치환 반응에 의한 4차화가 바람직하지만, 적합한 올레핀에 대한 부가 반응에 의해 헤테로사이클을 4차화하는 것이 가능할 것이다. 예를 들어, Q가 전자-흡인성 그룹인 H2C=CHQ 화합물과의 반응은 Het+-CH2-CHQ 형태의 4차화된 헤테로사이클을 야기하며, 여기서 Q는 전자-흡인성 그룹이다. 이러한 부류의 작용제의 예는 에틸 메타크릴레이트 또는 메틸 아크릴아마이드를 포함할 수 있다.
상기 실시예의 4차화 작용제의 다른 부류는 화학식 R-W-(R)-CH2-X에 의해 정의되며, 여기서 R은 C1-C24, 보다 바람직하게는 C1-C12의 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐 또는 아릴 그룹이고, W는 헤테로원자로 예를 들어 산소, 규소, 황 또는 질소이며, X는 상술된 바와 같은 이탈 그룹이다. 4차화 작용제의 상기 부류의 일부 예는 X-CH2-O-C2H5, X-CH2CH2-O-CH3 및 X-CH2CH2-모르폴린일 수 있다.
4차화 작용제의 또다른 부류는 화학식 R-(W)-COCH2-X의 아실 화합물로, 여기서 R은 C1-C24, 보다 바람직하게는 C1-C10 알킬 또는 알케닐, 또는 C6-C10 아릴 그룹이고, W는 헤테로원자로 예를 들어 산소 또는 질소이며, X는 상술된 바와 같은 이탈 그룹이다. 아실화제의 상기 부류의 적합한 예는 X-CH2-CO-C6H5, X-CH2-CO2CH3, X-CH2-CONH2 및 X-CH2CON(CH3)2를 포함한다.
상기 실시예의 적합한 4차화 화합물은 4차화에 제한되지 않으나, 브로모부탄, 브로모-PEG, 브로모프로피온산, 브로모발릭산, 클로로아세트아미드, 클로로부탄, 클로로부티르산, 크로톤산, 디요오도부탄, 요오도부탄, 요오도아세트아미드 및 요오도프로피온산을 포함한다. 요오드아세트아미드는 많은 바람직한 특성들: 낮은 증기압, 상대적으로 낮은 위험성, 저렴하고 용이한 이용가능성, 수용성, 제어가능한 4차화, 친수성 및 멤브레인의 선택층의 보존성으로 인해 특히 중요하다. 이러한 특성들로 인해 정전기적으로 대전된 멤브레인의 대규모 생산을 위해 상기 4차화 공정을 쉽게 확장할 수 있다. 아래 나타낸 멤브레인을 4차화하는데 사용되는 최종 조건은: 6.6 mM 수용성 요오드아세트아미드, 60℃, 1 시간이다. 친핵성 치환 반응은 하기에 나타낸 바와 같이 재료에 펜던트 아세트아미드 그룹을 갖는, 양으로 대전된 피리디늄을 생성한다:
상기 실시예에서, 상기 요오도아세트아미드는 폴리(4-비닐피리딘)과 반응하여 멤브레인 상에 고정 전하를 생성한다. 이 반응은 멤브레인 상의 말단 아미드 및 지속되는 양전하를 제공한다.
감쇠된 총 반사 푸리에 변환 적외선 분광법 (Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared Spectroscopy, ATR-FTIR)이 비 4차화된 및 4차화된 멤브레인을 특성화하는데 사용되었다. 도 8에 나타난 바와 같이, 요오도아세트아미드-처리된 멤브레인에서 상기 4차화 공정의 특징적인 피크가 관찰되었다. 1640 cm-1에서의 특성화 증가는 헤테로시클릭 아민이 대전된 피리디늄으로 변환되었음을 나타낸다. 1700 cm-1에서의 밴드의 외관은 4 차화동안 도입된 아미드 C=O 결합으로부터 유도된다. 15.9%의 비닐피리딘 양성자를 나타내는 1H 핵자기공명(NMR) 분광학 측정은 화학적 환경을 변화시키지 않았으며, 표준화된 조건을 사용하여 84.1%의 4 차 변환을 나타낸다. 온도, 시약 농도 및 반응 시간이 변화되는 요오도아세트아미드 처리된 멤브레인뿐만 아니라 상기에 기술된 다른 화학 그룹에 대하여도 유사한 실험이 수행되었음을 주목할 가치가 있다. 요오도아세트아미드의 반응 시간을 증가시키면 1640 cm-1 및 1700 cm-1에서 피크 강도가 증가하지만, 1 시간의 반응은 4-비닐피리딘 단량체의 상당 부분을 변환시키고 멤브레인에 매우 대전된 특성을 전달하기에 충분했다.
상기 실시예의 적합한 이기능성 4차화 작용제는 헤테로사이클과의 2 개의 반응 부위를 가지며 가교 결합제로서 작용하고, 화학식 X-R-X, X-CH2-CO-(W)-R-(W)-COCH2-X 또는 X-CH2-(R)-W-(R)-CH2-X 로 정의되는 가교 결합제를 포함하며, 여기서 R은 알킬, 알케닐 또는 아릴 그룹이고, W는 헤테로원자로 예를 들어 산소 또는 질소이고, X는 상술된 바와 같은 이탈 그룹이다. 상기 가교 결합제는 대칭이 아닐 수 있다; 즉, 하나의 반응성 그룹은 제 2 반응성 그룹과 다른 것일 수 있다. 이기능성 4차화 그룹의 예는 X-(CH2)4-X, X-CH2CH2-O-CH2CH2-X, 에틸렌 글리콜 디(메트)아크릴레이트, 메틸렌비스아크릴아미드의 유도체 및 N-1-하이드록시-2,2-디메톡시에틸 아크릴아미드의 유도체를 포함한다. 가교 결합제, 예를 들어 1,4-디요오도부탄은 증가된 멤브레인 기계적 보전성(integrity) 및 향상된 화학적 저항성에 대한 잠재성으로 인해 특히 중요하다.
상기 실시예의 적합한 4차화 작용제는 또한 재료의 전체 전하뿐만 아니라 친수성/소수성의 정도를 조절하기 위해 양전하 또는 음전하를 가질 수 있는 부가적인 기능성 그룹을 포함한다. 예를 들어, 상기 4차화 작용제는 음이온성 화합물 또는 수성 정제 조건 하에 음이온을 형성하기 위해 이온화하는 화합물일 수 있다. 이것은 전체 전하가 중성인 양성 이온 헤테로사이클을 형성하고, 높은 극성 특성을 여전히 유지하면서 재료의 양전하를 감소시킬 수 있다. 이러한 종류의 작용제의 예들은 카르복시산 또는 술폰산 그룹을 갖는 화합물, 예를 들어 -CH2CH2CO2H 또는 -CH2CH2SO3H를 포함할 수 있다. 또는, 상기 4차화 작용제는 양이온성 화합물 또는 상기 정제 조건 하에서 양성자화된 화합물이다. 이러한 종류의 예는 -CH2CONHCH2CH2-NH(CH3)2 + 또는 -CH2CH2-N(CH3)3 +를 포함할 수 있다. 이는 상기 재료의 전반적인 양전하를 증가시킬 수 있다. 이러한 종류의 전하 조절 4차화 작용제는 필요에 따라 멤브레인 특성을 조절하기 위해 친수성/소수성 조절제와 함께 사용된다.
단백질 및 다른 종류의 생물학적 물질들은 종종 광학적 활성을 갖기 때문에, 상기 기능화제는 키랄성일 수 있다. 이것은 그와 관련된 키랄성이 어느 정도 있는 재료를 제공할 것이다. 적합한 광학 활성 알킬화제의 예는 Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry Vol. E 21a, 4th Edition Supplement, Stereoselective Synthesis, H. Ahlbrecht et al, Ed., Thieme, 1995에서 발견할 수 있다. 예를 들어, 상기 실시예의 적합한 키랄 4차화 작용제는 광학 활성 1 급 알킬 할라이드 또는 메실레이트를 포함 할 수 있다.
전하를 도입하기 위한 재료의 변형은 상기 변형 작용제를 포함하는 용액에 제조된 멤브레인 담금으로써 수행된다. 일부 실시예에서, 상기 전하의 도입은 정량적, 모든 이용 가능한 반응 부위의 >20%, >30%, >40%, >50%, >60%, >70%, >80% 또는 >90%인 것일 것이나, 다른 실시예에서는, 상기 4 차화의 정도는 정량적 미만일 수 있다. 상기 4차화에 적합한 용매는 물이다. 그러나, 일부 작용제는 물에 대한 용해도가 제한될 수 있으므로 물과 유기 보조용매(예: 알코올)의 조합이 사용된다. 경우에 따라, 비 수용성 유기 용매 또는 유기 용매의 혼합물의 사용이 필요할 수 있다. 이 공정의 일반적인 조건은 4차화 작용제를 적절한 용매 시스템에 용해시키고 2 및 100 mM의 시약 농도에서 20 내지 30℃의 온도에서 1 내지 24시간의 반응 시간으로 멤브레인을 처리하는 것일 수 있다. 반응성이 적은 작용제의 경우, 반응 시간이 더 길고 온도를 더 높이는 것이 필요할 수 있다. 이 공정의 진행은 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광학 및 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 모니터링 할 수 있다.
일부 실시예들에서, 가능한 가장 높은 전하 밀도는 대전된 용질의 가장 선택적인 전하-기반 분리에 바람직하다. 그러나, 이러한 경우에도, 상기 멤브레인은 다양한 pH에서 공급 용액의 높은 플럭스를 유지해야 한다. 멤브레인 성능은 가압된 데드-엔드 교반-셀 장치(dead-end stirred-cell apparatus)를 사용하여 측정할 수 있다. 이 장치는 10 내지 50mL 공급 저장소와 ~4 cm2 내지 ~13 cm2의 멤브레인 영역을 사용할 수 있다.
본 발명의 대전된 이소포러스 멤브레인에 의해 정제되거나 농축되는 단백질 또는 기타 생물학적 기반의 물질의 형태 또는 종류는 제한되지 않는다. 특히, 공급 원료는 포유류, 박테리아, 곤충, 바이러스 또는 곰팡이 세포주에서 유래된 단백질 일 수 있다. 이들은 일반적으로 다른 공정에 의해 이미 부분적으로 정제된 수성 공급 원료에 사용된다. 발효액을 상기 공급원료로 사용하는 것 또한 가능하다. 상기 공급 원료는 전혈, 희석된 혈액, 혈장, 혈청일 수 있다. 상기 공급 원료는 상기 재료를 사용하여 분리될 수 있는 핵산을 포함할 수 있다.
관심있는 3 가지 모델의 단백질은 미오글로빈(Mgb), 라이소자임(Lys), 시토크롬 C(CytC)를 포함한다. 이들 단백질의 전형적인 몰 질량 및 등전점(isoelectric point)을 표 1에 나타내었고, 이들은 세포 배양액에서 볼 수 있는 단백질을 대표한다. 단백질 용질을 포함한 공급물을 포함하는 플럭스는 상술된 것과 동일한 방법을 사용하여 측정될 수 있는 반면, 단백질 거부(protein rejection)은 공급물 및 투과 용액에서 자외선-가시광선 분광기 및 수성 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 정량적으로 측정할 수 있다. 계산된 거부, R은 다음과 같은 체질 계수와 연관된다:
Figure 112018117603045-pct00003
단백질 등전점 MW (kg/mol)
미오글로빈 (Mgb) 7.0 16.7
라이소자임 (Lys) 11.4 14.3
시토크롬 C (CytC) 10.5 12.4
전하-기반 분리를 위한 표준 유사 크기 단백질 분자의 특성
HPLC를 이용한 UV-Vis 검출은 단백질 혼합물을 분리하고 단백질 농도를 정량적으로 측정하는 간단하고 신속한 방법이다.
그러나, 본 발명의 일부 실시예에서, 상기 공급 원료는 2가 (또는 더욱 복잡한) 용질 혼합물, 예를 들어 단백질 Mgb/Lys 또는 Mgb/CytC를 포함할 수 있다. 그러한 혼합물에 대한 하나의 핵심 성능 파라미터는 반 레이스 및 삭세나(van Reis and Saksena)에 의해 정의된 선택성, ψ 이다:
Figure 112018117603045-pct00004
여기서 S1 및 S2는 더 적은 보유 단백질 및 더 많은 보유 단백질을 위한 체질계수이다(van Reis and Saksena, J. Membrane Sci. 129, 19-29 (1997)). 이 파라미터는 대전된 멤브레인 및 미처리된 멤브레인 사이의 관련 성능 특성을 간단하게 직접 비교할 수 있다.
상기 예에서, Mgb/Lys 및 Mgb/CytC 성분은 크기면에서 매우 유사하고 단순한 한외여과로는 분리될 수 없다. 본 발명의 멤브레인을 중성 pH에서 상기 혼합물과 함께 사용하면, 상기 Mgb는 (등전점으로 인해) 중성으로 대전되고, Mgb가 혼합물 내에 없는 경우에 상응하는 선택성을 갖는 멤브레인을 통과한다. 상기 Lys 또는 CytC는 중성 pH에서 (이들의 등전점으로 인해) 양으로 대전될 것으로 예상되며, 이와 같이 대전된 멤브레인에 의해 거부될 것이다. 본 발명의 멤브레인은 50LMH/bar 이상의 유속일 때 데드-엔드 시스템에서 이러한 멤브레인 쌍들 사이의 선택성을 적어도 10 이상으로 달성하도록 설계된다.
비4차화된 멤브레인 , 혼합된 용질 Mgb / Lys , pH 7.0
%Rej 투과도(permeability) (LMH/bar)
Mgb 10.3 1123
Lys 20.4
4차화된 멤브레인, 혼합된 용질 Mgb/Lys, pH 7.0
%Rej 투과도 (LMH/bar)
Mgb 4.2 54
Lys 97.4
비4차화된 멤브레인, 혼합된 용질 Mgb/CytC, pH 7.0
%Rej 투과도 (LMH/bar)
Mgb 4.6 1445
CytC 24.5
4차화된 멤브레인, 혼합된 용질 Mgb/CytC, pH 7.0
%Rej 투과도 (LMH/bar)
Mgb 11.8 65
CytC 94.2
Ψ Mgb/Lys
비4차화된 멤브레인, 혼합된 용질 Mgb/Lys 1.20
4차화된 멤브레인, 혼합된 용질 Mgb/Lys 36.85
비4차화된 멤브레인, 혼합된 용질 Mgb/CytC 1.26
4차화된 멤브레인, 혼합된 용질 Mgb/CytC 15.21
비4차화 및 4 차화된 ISV 멤브레인의 Mgb/Lys 및 Mgb/CytC 단백질 쌍에 대한 거부(rejection), 플럭스 및 선택도에 대한 도표화된 결과. 상기 결과는 4차화된 멤브레인의 양으로 대전된 단백질의 전하 거부(rejection)를 보여준다. 한 단백질이 양으로 대전되고 다른 한 단백질이 중성인 단백질 혼합물에서 높은 선택성 > 10이 관찰된다.
일부 실시예에서, 대전된 이소포러스 멤브레인을 사용하는 상기 정제 공정은 원하는 물질의 등전점, 등전점 아래 및 등전점 위의 생물학적 물질을 포함하는 가압 완충 공급물 스트림을 사용하는 것을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 상기 대전된 이소포러스 재료는 핵산을 분리하는데 사용된다. ISV 이소포러스 재료의 P4VP의 4차화 이후, 상기 실시예에서와 같이, 상기 이소포러스 재료는 양전하를 갖는다. DNA 단편의 혼합물에 노출되면, 음전하의DNA가 멤브레인에 결합한다. 이어서, 소량의 용리 완충액을 사용하여 상기 멤브레인으로부터 DNA를 용리시킬 수 있다. 4 개의 상이한 멤브레인의 200 및 400 염기쌍(bp)에 대한 회수 수율을 도 10에 나타내었다. 상기 용리된 DNA 수율을 겔 전기 영동을 사용하여 정량화하고, 네 개의 4 차화 멤브레인에 대한 200 및 400 bp 단편 수율을 정량화하였다. 200bp의 경우, 수율은 71-85%에서 다양했으며, 변동 계수(SD/mean)는 8.8%였다. 상기 400 bp의 수율은 67-86%로 매우 유사하게 다양했고, 변동 계수는 10.6%였다. 상업적으로 이용 가능한 키트가 가장 좋은 경우 ~10%에서 다른 상업적 키트의 경우 49%까지 범위의 상대 표준 편차를 갖는 것과 비교하여(Devonshire et al., Anal. Bioanal. Chem. 406, 6499-6512 (2014); Breitbach et al., PLOS ONE 9, e87838 (2014)), 이들 결과가 이소포러스하고 대전된 중합체 재료로 매우 빠른 공정을 사용한 매우 일관되고 높은 DNA 회수임을 증명한다.
이 실시예에서, DNA 단편의 크기-선택적인 용리 또한 가능하다. 용리 완충액의 상이한 희석액(0.6x, 0.3x)이 용리에 사용된다. 도 11은 200 및 600 bp 단편들 사이의 0.6x 완충액 용리의 상대 수율을 보여준다. 더 큰 600 bp의 수율은 4 배 이상 감소했으며, 600 bp보다 큰 모든 밴드들은 검출되지 않아, 상기 대전된 이소포러스 멤브레인 시스템이 DNA 추출, 농축 및 크기 선택에 사용될 수 있음을 증명하였다. 0.3X 완충액 농도에서 200 bp 단편도 용리되지 않았다. 이 결과는 상기 대전된 멤브레인이 매우 특이적인 DNA 단편 크기를 표적으로 하고, 단일 생성물을 단순히 용리 조건을 조정함으로써 수많은 DNA 분리 용도에 사용할 수 있다는 강력한 이점을 보여준다.
또 다른 실시예에서, 상기 블록 공중합체는 일반 구조 A-B-A-C에 상응하는 폴리(스티렌-b-이소프렌-b-스티렌-b-4비닐피리딘)이다. 상기 P4VP는 상기 실시예들에서와 같이 고정 전하를 생성하기 위해 4차화된다. 일부 실시예에서, 상기 이소포러스인 대전된 재료는 2-차원 구조로 형성된다. 다른 실시예에서, 상기 이소포러스인 대전된 재료는 3-차원 구조로 형성된다.
일 실시예에서, 상기 이소포러스 재료 상에 고정 전하를 생성시키는 반응은 상기 재료의 친수성을 변화시킨다. 또 다른 실시예에서, 상기 이소포러스 재료 상에 고정 전하를 생성시키는 반응은 상기 재료에 기능성 그룹을 도입하여 추가적 화학 반응 또는 재료 기능성을 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 이소포러스인 대전된 재료 상의 고정 전하는 양전하이며, 예를 들어. 4차화 피리딘 그룹, 4차화 디에틸아미노에틸 그룹, 4차화 디메틸아미노에틸 그룹이 있다. 다른 실시예에서, 상기 이소포러스인 대전된 재료의 고정 전하는 음전하이며, 예를 들어 술포네이트 그룹이다. 일부 실시예에서, 상기 이소포러스 재료는 아민 그룹(예: 피리딘, 디에틸아미노에틸, 디메틸아미노 에틸)을 포함하며, 상기 아미노 그룹은 화학 작용제로 4차화될 수 있어 상기 재료상에 양 전하를 생성할 수 있다. 일 실시예에서, 아민은 요오드, 염소 및 브롬으로부터 선택된 하나의 할로겐을 갖는 단일 기능성 알킬화제, 예를 들어 2-요오도아세트아미드, 2-브로모에탄올로 4차화된다. 일 실시예에서, 상기 단일 기능성 알킬화제는 화학식 R-X를 가진다: 여기서 R은 C1-C24의 치환 또는 비치환된 직쇄, 환형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐 그룹이고, X는 할로겐 그룹이다.
또다른 실시예에서, 상기 단일 기능성 알킬화제는 화학식 R-W-(R)-CH2-X를 가진다: 여기서 R은 C1-C24 의 알킬, 알케닐 또는 아릴 그룹이고, W는 헤테로원자, 예를 들어 산소, 규소, 황 또는 질소이고, X는 할로겐 그룹이다. 또 다른 실시예에서, 상기 단일 기능성 알킬화제는 화학식 R-(W)-COCH2-X 를 가진다: 여기서 R은 C1-C24의 알킬, 알케닐 또는 아릴 그룹이고, W는 헤테로원자, 예를 들어 산소 또는 질소이고, X는 할로겐 그룹이다.
또다른 실시예에서, 다수의 아민은 요오드, 염소 및 브롬으로부터 선택된 2 이상의 할로겐을 갖는 다기능성 알킬화제, 예를 들어 1,4-디요오도부탄으로 4차화된다.
또다른 실시예에서, 아민은 적어도 하나 이상의 반응성 이중 결합을 포함하는 알킬화제, 예를 들어 크로톤산으로 4차화된다.
일부 실시예에서, 상술된 아민-알킬화제 중 하나 이상은 상기 이소포러스 재료에 전하를 도입하는데 사용된다.
일부 실시예에서, 상기 이소포러스인 대전된 재료 상의 전하도는 적어도 20% 내지 90%이다. 다른 실시예에서, 상기 이소포러스인 대전된 재료 상의 전하도는 모든 이용가능한 단위의 = 90%이다.
일 실시예에서, 상기 대전된 이소포러스 재료는 항균제로 더 처리 또는 기능화된다.
일부 실시예에서, 고정 전하를 포함하는 상기 이소포러스 재료의 기하학적 구조 및 면적이 조절된다. 일부 실시예에서, 상기 대전된 영역의 기하학적 구조 및 면적은 리소그래피로 패턴화되거나 전하 변형된 재료의 일부 또는 일부들을 변형되지 않은 재료 또는 또다른 기판에 부착시킴으로써 얻어지거나, 또는 프린팅 또는 사출을 통해 상기 변형되지 않은 재료의 일부 또는 일부들 상에 패터닝되어 얻어진다.
일부 실시예에서, 상기 이소포러스인 대전된 재료는 분리 매질로서 사용된다. 일부 실시예에서, 상기 이소포러스인 대전된 재료는 생체 분자를 다른 생체 분자로부터 분리하는데 사용된다. 일 실시예에서, 상기 표적 생체 분자는 단백질이다. 또 다른 실시예에서, 상기 표적 생체 분자는 핵산이다.
일부 실시예에서, 분리 매질로서 상기 대전된 이소포러스 재료를 사용하는 분리 메커니즘은 결합 및 용리 메커니즘을 포함하며, 여기서 표적 종(target species)은 정전기 상호작용에 의해 상기 재료에 결합되어 그것을 분리(isolate)시키며, 이때 상기 표적 종은 상기 재료로부터 분리(unbound)되어 표적 종을 회수할 수 있다.
일 실시예에서, 분리 매질로서 상기 대전된 이소포러스 재료를 사용한 분리 메커니즘은 전하 반발 메커니즘, 크기 선택 메커니즘 및/또는 농도 메커니즘을 포함한다.
일 실시예에서, 결합 및 용리 메커니즘과 함께 분리 매질로서 상기 대전된 이소포러스 재료를 사용한 분리 메커니즘은 또한 화학 선택적 또는 크기 선택적 용리를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 대전된 이소포러스 재료는 구배 분리, 등용매 분리 또는 단계 분리에 사용된다.
일 실시예에서, 대전된 이소포러스 재료는 상처에 대한 드레싱 또는 붕대로 사용되거나, 바이오 필름의 성장을 조절하는데 사용된다.
일 실시예에서, 대전된 이소포러스 재료는 하나 이상의 대전된 재료와 결합되어 장치 내에 패키징되거나, 대전된 이소포러스 재료는 대전되지 않은 이소포러스 재료와 결합되어 장치로서 패키징된다.
일 실시예에서, 상기 대전된 재료는 주름형 팩, 직교류 카세트, 중공 섬유 모듈, 주사기 필터, 캡슐, 피펫 팁, 원심분리 튜브, 나선형 모듈 또는 센서 장치에 패키징된다.
또다른 실시 예에서, 상기 대전된 재료는 편평한 시트로서 패키징된다.
일 실시예에서, 상기 대전된 이소포러스 재료는 지지체 재료 상에 고정되거나 직물과 직접 일체화된다.
일 실시예에서, 둘 이상의 대전된 이소포러스 재료가 키트로서 함께 패키징된다.
또다른 실시예에서, 상기 대전된 이소포러스 재료를 포함하는 둘 이상의 장치가 키트로서 함께 패키징된다.
또다른 실시예에서, 적어도 하나의 대전된 이소포러스 재료가 하나 이상의 화학 용액과 함께 패키징되어 결합후 결합된 표적 종을 용리시킨다.
5 큰 포어 크기 영역
10 작은 포어 크기 영역
15 거의 동일한 포어 크기층
20 균일한 흐름을 나타낸 화살표
25 불균일한 흐름을 나타낸 화살표
30 보다 큰 흐름량을 나타낸 화살표
35 보다 작은 흐름량을 나타낸 화살표
40 전하를 도입하기 위한 기능화 반응
45 기능화 반응으로 도입된 기능화 그룹
50 양으로 대전된 재료
55 대전되지 않은 용질/용매 분자
60 세포 잔해물과 같은 큰 용질
65 음으로 대전된 핵산 용질
70 양으로 대전된 용질

Claims (31)

  1. 대전된, 자가-조립 폴리(이소프렌-b-스티렌-b-4-비닐 피리딘) 트리블록 공중합체 재료로서, 용질을 분리하기 위한 것이며, 상기 재료는,
    매크로(macro), 메조(meso) 또는 마이크로(micro) 포어들(pores) 중 하나 이상이고, 이들 중 적어도 일부는 이소포러스(isoporous)인 포어들을 포함하고,
    4-비닐 피리딘 블록의 적어도 일부는 4차화되어 상기 재료에 고정 양전하를 제공하며,
    상기 재료는 pH 7.0에서 50 내지 200 L·m-2·hr-1·bar-1의 수분 투과도를 나타내는, 재료.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재료는 비대칭 구조 또는 대칭 구조를 갖는, 재료.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 재료는 1-200nm의 크기를 포함하는 메조포어들 및 적어도 50nm의 크기를 포함하는 매크로포어들을 포함하는, 재료.
  6. 제5항에 있어서, 상기 4-비닐 피리딘 블록은 기능화 반응에 의해 4차화되고, 상기 기능화 반응은 상기 고정 양전하를 제공하는, 재료.
  7. 제1항에 따른 대전된, 이소포러스 블록 중합체 재료를 형성하는 방법으로, 상기 방법은 상기 폴리(이소프렌-b-스티렌-b-4-비닐 피리딘) 트리블록 공중합체의 4-비닐 피리딘 블록을 상기 4-비닐 피리딘 블록의 적어도 일부와 반응하는 화학 작용제와 접촉시켜 상기 고정 양전하를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 이소포러스이고, 대전된, A-B-C 트리블록 공중합체 재료로서, 매크로, 메조 또는 마이크로 포어들 중 하나 이상을 포함하고 이들 중 일부는 이소포러스이며,
    상기 트리블록 공중합체의 한 중합체 블록은 ≤25℃의 Tg를 가지며,
    상기 트리블록 공중합체의 한 중합체 블록은 상기 재료에 고정 양전하를 제공하기 위해 4차화되는 방향족 헤테로사이클을 포함하고, 상기 방향족 헤테로사이클은 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 퀴놀론, 이소퀴놀린, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 페나진, 이소아졸, 이소티아졸, 이미다졸, 벤조이미다졸, 트리아졸 및 테트라졸로 이루어진 군에서 선택된 것이며,
    상기 재료는 pH 7.0에서 50 내지 200 L·m-2·hr-1·bar-1의 수분 투과도를 나타내는, 재료.
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서,
    a. 상기 ≤ 25℃의 Tg를 갖는 중합체 블록은 폴리이소프렌 블록이고; 및
    b. 상기 방향족 헤테로사이클을 포함하는 상기 중합체 블록은 폴리(2-비닐 피리딘) 블록 또는 폴리(4-비닐 피리딘) 블록인, 재료.
  13. 제10항에 있어서, 상기 트리블록 공중합체 재료는 폴리(이소프렌-b-스티렌-b-4-비닐 피리딘) 트리블록 공중합체이고, 상기 고정 전하는 하나의 상기 4-비닐 피리딘 블록인, 재료.
  14. 삭제
  15. 제10항에 따른 대전된, 이소포러스 블록 중합체 재료를 형성하는 방법으로, 상기 방법은 상기 A-B-C 트리블록 공중합체를 상기 방향족 헤테로사이클과 반응하는 화학 작용제와 접촉시켜 상기 고정 양전하를 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  16. 표적 생체 분자를 다른 생체 분자 또는 상기 표적 생체 분자를 포함하는 다른 용질의 혼합물로부터 분리시키는 방법으로, 상기 방법은 상기 혼합물을 제1항, 제2항, 제5항, 제6항, 제10항 및 제12항 중 어느 한 항에 따른 재료와 접촉시키고 상기 표적 생체 분자를 상기 혼합물로부터 분리 및/또는 제거하는 것을 포함하는, 방법.
  17. 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4-비닐 피리딘 블록은 상기4-비닐 피리딘 블록과 화학식 R-X에 의해 정의되는 4차화 작용제의 반응에 의해 4차화되며, 여기서 R은 C1-C24의 치환 또는 비치환된 직쇄, 환형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐 그룹이고, X는 이탈 그룹(leaving group)인, 재료.
  18. 제17항에 있어서, 상기 R은 C1-C12의 치환 또는 비치환된 직쇄, 환형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐 그룹인, 재료.
  19. 제17항에 있어서, 상기 X는 할로겐화물 또는 -OSO2CH3인, 재료.
  20. 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4-비닐 피리딘 블록은 상기4-비닐 피리딘 블록과 화학식 R-W-(R)-CH2-X 를 갖는 4차화 작용제의 반응에 의해 4차화되고, 여기서 R은 C1-C24의 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐 또는 아릴 그룹이고, W는 헤테로 원자이며, X는 이탈 그룹인, 재료.
  21. 제20항에 있어서, 상기 R은 C1-C12의 치환 또는 비치환된 알킬, 알케닐 또는 아릴 그룹인, 재료.
  22. 제20항에 있어서, 상기 W는 산소, 규소, 황 또는 질소인, 재료.
  23. 제20항에 있어서, 상기 X는 할로겐화물 또는 -OSO2CH3인, 재료.
  24. 제20항에 있어서, 상기 4차화 작용제는 X-CH2-O-C2H5, X-CH2CH2-O-CH3 및 X-CH2CH2-모르폴린인, 재료.
  25. 제24항에 있어서, 상기 X는 할로겐화물 또는 -OSO2CH3인, 재료.
  26. 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 4-비닐 피리딘 블록은 상기4-비닐 피리딘 블록과 4차화 작용제의 반응에 의해 4차화되고, 상기 4차화 작용제는 화학식 R-(W)-COCH2-X의 아실 화합물이며, 여기서 R은 C1-C24의 알킬 또는 알케닐 그룹 또는 C6-C10의 아릴 그룹이고, W는 헤테로 원자이며, X는 이탈 그룹인, 재료.
  27. 제26항에 있어서, 상기 R은 C1-C10의 알킬 또는 알케닐 그룹인, 재료.
  28. 제26항에 있어서, 상기 W는 산소 또는 질소인, 재료.
  29. 제26항에 있어서, 상기 X는 할로겐화물 또는 -OSO2CH3인, 재료.
  30. 제26항에 있어서, 상기 아실 화합물은 X-CH2-CO-C6H5, X-CH2-CO2CH3, X-CH2-CONH2 또는 X-CH2CON(CH3)2인, 재료.
  31. 제30항에 있어서, 상기 X는 할로겐화물 또는 -OSO2CH3인, 재료.
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