KR102089938B1 - 케피어 그레인 유래 미세소포체의 용도 - Google Patents

케피어 그레인 유래 미세소포체의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102089938B1
KR102089938B1 KR1020170177443A KR20170177443A KR102089938B1 KR 102089938 B1 KR102089938 B1 KR 102089938B1 KR 1020170177443 A KR1020170177443 A KR 1020170177443A KR 20170177443 A KR20170177443 A KR 20170177443A KR 102089938 B1 KR102089938 B1 KR 102089938B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
microvesicles
present
culture
kefir
lactobacillus
Prior art date
Application number
KR1020170177443A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180072589A (ko
Inventor
박병순
강석우
최은욱
이원종
Original Assignee
(주)프로스테믹스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)프로스테믹스 filed Critical (주)프로스테믹스
Publication of KR20180072589A publication Critical patent/KR20180072589A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102089938B1 publication Critical patent/KR102089938B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/324—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the immune system

Abstract

본 발명은 케피어 그레인(Kefir grain) 유래 미세소포체(extracellular vesicles)를 이용한 다양한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 케피어 그레인 유래 미세소포체를 이용하여 염증성 질환, 장 질환 및 정신 장애 등을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

케피어 그레인 유래 미세소포체의 용도{Use of extracellular vesicles from kefir grain}
본 발명은 케피어 그레인(Kefir grain) 유래 미세소포체(extracellular vesicles)를 이용한 다양한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 케피어 그레인 유래 미세소포체를 이용하여 염증성 질환, 장 질환 및 정신 장애 등을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
염증은 물리적인 외상, 유해한 화학물질, 미생물에 의한 감염이나 생체 내 대사 산물 중의 자극성 물질에 의하여 야기되는 조직 손상에 대하여 국소적으로 나타나는 정상적이고 보호적인 생체 내 방어기전의 발현이다. 이러한 염증은 손상 조직과 이동하는 세포(migrating cells)로부터 생산되는 다양한 화학매개인자에 의하여 촉발되며, 이들 화학매개인자들은 염증 과정의 형태에 따라 다양한 것으로 알려져 있다. 정상적인 경우에 생체는 염증반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만, 그렇지 못한 경우에는 만성 염증과 같은 질병 상태로 진행되기도 한다. 또한, 꽃가루와 같이 무해한 물질이나 천식, 류마티스성 관절염과 같은 자가면역반응에 의해 부적절하게 염증이 촉발되는 경우에는 방어 반응 자체가 오히려 조직을 손상시키므로 염증성 질환 예방 또는 치료용제가 필요하게 된다. 거의 모든 임상질환에서 염증반응을 관찰할 수 있고, 이들 염증 질환 중에는 항생제 투여로 원인적 치료가 가능한 세균성 질환도 있지만, 대부분은 그 발병이 자가면역반응에 의한 조직 손상에 기인하므로 특이적 치료법이 없는 난치병으로 알려져 있다.
이러한 염증 질환을 치료하기 위한 가장 일반적인 염증성 질환 예방 또는 치료용제는 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 염증성 질환 예방 또는 치료용제로 구분되며, 이중 대부분의 합성 염증성 질환 예방 또는 치료용제는 주작용 이외에 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많은 단점이 있다. 즉, 염증 질환을 치료하기 위하여 적당한 비스테로이드성 염증성 질환 예방 또는 치료용 약물(NSAIDs)을 사용하여 염증을 완화시키며, 염증이 심하거나 NSAIDs의 효능이 없으면 스테로이드 제제를 사용하며, 난치성인 경우 면역 억제제나 수술요법을 실시하게 된다. 이 경우 사용되는 NSAIDs는 주로 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase; COX)를 억제하여 염증반응에 관여하는 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생성을 억제함으로써 염증성 질환 예방 또는 치료용 작용을 나타내지만, 위장 장애, 간장애, 신장기능 장애 등의 부작용을 야기하여 장기간의 사용이 어려운 문제점이 있다.
한편, 과민성 대장 증후군(Irritable Bowel Syndrome:IBS)은 공통적인 대장 기능성 장애로서, 일반적으로 지속적이거나 반복적인 복통, 복부 불쾌감, 및 변화된 배변 습관에 의해 특징 지워진다. 과민성 대장 증후군은 환자의 사회적 및 개인적 생활을 손상시켜 삶의 질을 떨어뜨리고, 증상이 심할수록 삶의 질을 더 떨어뜨린다.
상기한 과민성 대장 증후군의 발병 원인은 아직까지 명확하게 밝혀지지 않았지만, 스트레스, 예민한 성격, 불규칙한 식습관, 만성피로 및 자극적이고 기름진 음식이 주요 원인으로 알려져 있다. 하지만, 현재까지 제시되고 있는 치료 방법의 효과는 크지 않고, 아직까지 본 질환에 대한 근본적 치료법은 알려진 바 없으며, 오로지 증상 완화에 초첨을 둔 대증적인 치료 방법에 의존하고 있다.
최근 과민성 대장 증후군의 진료 인원이 2012년 162만명으로 5년새 약 8.7%(13만명) 증가하여 연평균 1.7%씩 증가하는 것으로 조사되고 있으며 대부분의 환자(전체 환자의 99.4%)가 외래 방문하여 대증적인 요법으로 치료하고 있다. 따라서 대증적인 치료법 외에 장 기능을 활성화 시킬 수 있는 식품바이오 신소재의 개발이 시급한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 케피어 그레인(Kefir grain) 유래 미세소포체(extracellular vesicles)를 이용하여 염증성 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 케피어 그레인 유래 미세소포체를 이용하여 장 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 케피어 그레인 유래 미세소포체를 이용하여 정신 장애를 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 케피어 그레인(Kefir grain) 유래 미세소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "케피어(kefir)"란 코카서스 산간 지방에서 유래한 발효유의 일종으로, 티벳 지방 승려들이 건강을 위해 음용하던 것이 대중화된 음료이다. 케피어의 구성 영양소로는 단백질 및 다당류가 포함되어 있고 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 비타민 D, 비타민 K2, 엽산, 니코틴산 및 칼슘, 철분, 요오드 등을 고루 포함하고 있다. 이러한 케피어는 유산균 및/또는 효모의 복합체인 케피어 그레인으로 불리우는 균종(케피어 과립균이라고도 한다)을 개시제로 하여 우유를 발효시켜 얻어진 요구르트상의 음료이다.
본 발명에서 상기 "케피어 그레인(kefir grain)"이란 케피어의 제조 과정에서 사용되는 발효원으로, 유산균을 필수적으로 포함하고, 효모를 추가로 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 상기 케피어 그레인에 속하는 유산균으로는 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속 및 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 등에 속하는 유산균일 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) 및 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것이 다른 균주에 비하여 항염증 효과 및 유해균 억제 효과가 현저히 뛰어나 바람직하고, 보다 바람직하게는 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens)를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 케피어 그레인에 포함될 수 있는 효모로는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 라칸세아(Lachancea) 속, 한세니아오스포라(Hanseniasospora) 속, 지고토루라스포라(Zygotorulaspora) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 토룰라(Torula) 속 및 캔디다(Candida) 속 등에 속하는 효모일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 미세소포체는 케피어 그레인의 배양물 유래 미세소포체일 수 있다.
본 발명에서 상기 케피어 그레인의 배양물은 상기 케피어 그레인을 배지에 배양하여 얻은 것으로, 배지, 케피어 그레인 및 배양으로 인하여 얻어진 모든 물질을 총칭할 수 있다. 또한, 상기 배양물은 액체 배양물 또는 고체 배양물일 수 있으며, 그 형상은 특별히 제한하지 않다. 여기서, 상기 배지의 종류 역시 특별히 제한하지 않으며, 예를 들면, MRS 배지, 우유, 치즈 등의 유제품을 사용할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 상기 케피어 그레인의 배양물은, (a) 케피어 그레인을 고체 배지에 12~48시간 동안 1차로 배양하는 단계; 및 (b) 1차 배양한 뒤 액체 배지에 1~48시간 동안 2차로 현탁 배양하는 단계에 의하여 얻어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 (b) 단계에 후속적으로 얻어진 배양물을 (c) 액체 배지에 추가로 1~14일 동안 현탁 배양하는 단계를 수행할 수 있다. 여기서, 상기 (c) 배양 시 3~7일 동안 현탁 배양하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 (c) 배양 시 3~4일 동안 현탁 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 케피어 그레인의 배양물은 미세소포체(extracellular vesicles)를 포함할 수 있으며, 상기 미세소포체는 상기 케피어 그레인에 속하는 유산균으로부터 자연적으로 또는 인공적으로 분비된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "미세소포체(extracellular vesicles)"란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하며, 나노베지클(nanovesicle)로도 정의된다. 미세소포체의 직경은 대략 30~1,000 nm이고, 바람직하게는 평균 직경이 100~300 nm이며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다.
본 발명에서 상기 약학 조성물 내에 포함되는 상기 미세소포체의 양은 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 1 X 103 내지 1 X 109 입자수로 포함할 수 있다. 상기 미세소포체의 함량이 1 X 103 입자수 미만인 경우 그 효과가 미미할 수 있고, 1 X 109 입자수를 초과하는 경우 인체에 독성을 유발시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 미세소포체는 케피어 그레인의 배양물을 원심 분리하여 얻을 수 있다. 보다 상세하게는 상기 미세소포체를 얻기 위하여, 상기 케피어 그레인의 배양물을 100~1,000g로 0 초과 20℃ 이하의 온도에서 5분 내지 1시간 동안 1차 원심 분리하는 단계; 및 상기 1차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 1,000~5,000g로 0 초과 20℃ 이하의 온도에서 10분 내지 1시간 동안 2차 원심 분리하는 단계에 의하여 얻어진 상등액을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 미세소포체를 얻기 위하여, 상기 2차 원심 분리 후 얻어진 상등액을 5,000~20,000g로 0 초과 20℃ 이하의 온도에서 10분 내지 1시간 동안 3차 원심 분리하여 얻어진 상등액을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 미세소포체는, 상기 3차 원심 분리 후 얻어진 상등액을 초원심분리기(ultracentrifuge)를 이용하여 100,000~150,000g로 0 초과 20℃ 이하의 온도에서 1시간 내지 3시간 동안 4차 원심 분리하여 얻어진 펠렛일 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같은 4단계의 원심 분리 공정을 통하여 항염증 효과가 뛰어난 미세소포체를 높은 순도 및 함량으로 획득할 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 미세소포체는 상기 케피어 그레인의 배양물로부터 침전시켜 얻을 수 있다. 보다 상세하게는 상기 미세소포체를 얻기 위하여 상기 케피어 그레인의 배양물을 3,000~5,000g로 5분 내지 1시간 동안 1차 원심 분리하는 단계; 1차 원심 분리 후 얻어진 농축 배양물에 대하여 0.5~2N 소디움 아세테이트를 0.1 내지 1.5 부피비, 바람직하게는 0.1 내지 1 부피비, 보다 바람직하게는 0.1 내지 0.5 부피비로 첨가한 뒤 -10℃ 이상 0℃ 이하의 온도에서 30~60분 동안 배양하는 단계에 의하여 얻어진 침전 배양물을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 미세소포체는, 상기 배양 후 얻어진 침전 배양물을 3,000~5,000g로 5분 내지 1시간 동안 2차 원심 분리하여 얻어진 펠렛일 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 미세소포체의 정제 효율을 높이기 위하여 추가적으로 상기 2차 원심 분리 후 얻어진 펠렛을 필요에 따라 0.05~0.2N 소디움 아세테이트로 세척한 뒤 3,000~5,000g로 5분 내지 1시간 동안 원심 분리하여 얻어진 펠렛을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 미세소포체는 상기 케피어 그레인의 배양물을 원심 분리하여 얻어진 것이 상기한 치료 효과를 높일 수 있어 바람직하지만, 제조 공정의 효율을 고려하여 침전법에 의해 얻어진 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기한 케피어 그레인의 배양물 유래 미세소포체는 항염증 효과와, 유해균의 증식 억제 및 사멸 효과가 현저히 뛰어나, 염증성 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 염증성 질환은 패혈증, 원형탈모증, 여드름, 알레르기, 천식, 천포창, 전신성 경피증(Progressive systemic sclerosis, Scleroderma), 결막염, 치주염, 아프타구내염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 만성 갑상선염(하시모토氏 갑상선염 Hashimoto's thyroiditis), 폐렴, 실리코시스(규소 폐증), 아스베스토시스(석면 폐증), 위궤양, 위염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 관절염, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 연쇄상구균감염후 사구체신염(post-streptococcal glomerulonephritis), 죽상동맥경화증, 퇴행성 신경관절염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 다발성 근염(polymyositis), 피부근염(dermatomyositis), 결절성 다발성 동맥염(Polyarteritis nodosa), 강직성 척추염 (Ankylosing spondylitis), 섬유조직염 (Fibromyalgia syndrome), 측두동맥염(Temporal arteritis), 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 자가면역성 용혈성 빈혈(Autoimmune hemolytic anemia), 자가면역성 뇌척수염, 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 그레이브씨 갑상선 항진증(Grave's disease) 및 염증성 요통으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 케피어 그레인 유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 케피어 그레인으로는 유산균을 필수적으로 포함하고, 효모를 추가로 더 포함할 수 있으며, 상기 유산균으로는 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속 및 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 등에 속하는 유산균일 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) 및 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것이 다른 균주에 비하여 항염증 효과, 배변 활동 개선, 장내 면역 증진 및 장내 유해균 억제 효과가 현저히 뛰어나 바람직하고, 보다 바람직하게는 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens)를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 효모로는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 라칸세아(Lachancea) 속, 한세니아오스포라(Hanseniasospora) 속, 지고토루라스포라(Zygotorulaspora) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 토룰라(Torula) 속 및 캔디다(Candida) 속 등에 속하는 효모일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 미세소포체는 케피어 그레인의 배양물 유래 미세소포체일 수 있다.
본 발명에서 상기 케피어 그레인의 배양물은 상기 케피어 그레인을 배지에 배양하여 얻은 것으로, 배지, 케피어 그레인 및 배양으로 인하여 얻어진 모든 물질을 총칭할 수 있다. 또한, 상기 배양물은 액체 배양물 또는 고체 배양물일 수 있으며, 그 형상은 특별히 제한하지 않다. 여기서, 상기 배지의 종류 역시 특별히 제한하지 않으며, 예를 들면, MRS 배지, 우유, 치즈 등의 유제품을 사용할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 상기 케피어 그레인의 배양물은, (a) 케피어 그레인을 고체 배지에 12~48시간 동안 1차로 배양하는 단계; 및 (b) 1차 배양한 뒤 액체 배지에 1~48시간 동안 2차로 현탁 배양하는 단계에 의하여 얻어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 (b) 단계에 후속적으로 얻어진 배양물을 (c) 액체 배지에 추가로 1~14일 동안 현탁 배양하는 단계를 수행할 수 있다. 여기서, 상기 (c) 배양 시 3~7일 동안 현탁 배양하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 (c) 배양 시 3~4일 동안 현탁 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 케피어 그레인의 배양물은 미세소포체(extracellular vesicles)를 포함할 수 있으며, 상기 미세소포체는 상기 케피어 그레인에 속하는 유산균으로부터 자연적으로 또는 인공적으로 분비된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 약학 조성물 내에 포함되는 상기 미세소포체의 양은 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 1 X 103 내지 1 X 109 입자수로 포함할 수 있다. 상기 미세소포체의 함량이 1 X 103 입자수 미만인 경우 그 효과가 미미할 수 있고, 1 X 109 입자수를 초과하는 경우 인체에 독성을 유발시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 미세소포체는 케피어 그레인의 배양물을 원심 분리하여 얻을 수 있다. 보다 상세하게는 상기 미세소포체를 얻기 위하여, 상기 케피어 그레인의 배양물을 100~1,000g로 0 초과 20℃ 이하의 온도에서 5분 내지 1시간 동안 1차 원심 분리하는 단계; 및 상기 1차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 1,000~5,000g로 0 초과 20℃ 이하의 온도에서 10분 내지 1시간 동안 2차 원심 분리하는 단계에 의하여 얻어진 상등액을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 미세소포체를 얻기 위하여, 상기 2차 원심 분리 후 얻어진 상등액을 5,000~20,000g로 0 초과 20℃ 이하의 온도에서 10분 내지 1시간 동안 3차 원심 분리하여 얻어진 상등액을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 미세소포체는, 상기 3차 원심 분리 후 얻어진 상등액을 초원심분리기(ultracentrifuge)를 이용하여 100,000~150,000g로 0 초과 20℃ 이하의 온도에서 1시간 내지 3시간 동안 4차 원심 분리하여 얻어진 펠렛일 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같은 4단계의 원심 분리 공정을 통하여 항염증, 배변 활동 개선, 장내 면역 증진, 장내 유해균의 증식 억제 및 사멸 효과가 뛰어난 미세소포체를 높은 순도 및 함량으로 획득할 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 미세소포체는 상기 케피어 그레인의 배양물로부터 침전시켜 얻을 수 있다. 보다 상세하게는 상기 미세소포체를 얻기 위하여 상기 케피어 그레인의 배양물을 3,000~5,000g로 5분 내지 1시간 동안 1차 원심 분리하는 단계; 1차 원심 분리 후 얻어진 농축 배양물에 대하여 0.5~2N 소디움 아세테이트를 0.1 내지 1.5 부피비, 바람직하게는 0.1 내지 1 부피비, 보다 바람직하게는 0.1 내지 0.5 부피비로 첨가한 뒤 -10℃ 이상 0℃ 이하의 온도에서 30~60분 동안 배양하는 단계에 의하여 얻어진 침전 배양물을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 미세소포체는, 상기 배양 후 얻어진 침전 배양물을 3,000~5,000g로 5분 내지 1시간 동안 2차 원심 분리하여 얻어진 펠렛일 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 미세소포체의 정제 효율을 높이기 위하여 추가적으로 상기 2차 원심 분리 후 얻어진 펠렛을 필요에 따라 0.05~0.2N 소디움 아세테이트로 세척한 뒤 3,000~5,000g로 5분 내지 1시간 동안 원심 분리하여 얻어진 펠렛을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 미세소포체는 상기 케피어 그레인의 배양물을 원심 분리하여 얻어진 것이 상기한 치료 효과를 높일 수 있어 바람직하지만, 제조 공정의 효율을 고려하여 침전법에 의해 얻어진 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기한 케피어 그레인의 배양물 유래 미세소포체는 항염증 효과, 배변 활동 개선, 장내 면역 증진, 장내 유해균의 증식 억제 및 사멸 효과가 현저히 뛰어나, 장 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 장 질환은 과민성 대장 증후군 또는 염증성 장 질환일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 과민성 대장 증후군은 설사 우세형 과민성 대장 증후군(d-IBS), 변비 우세형 과민성 대장 증후군, 또는 설사-변비 혼합형 과민성 대장 증후군일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 염증성 장 질환은 크론병, 베체트병에 수반되는 장 병변, 궤양성 대장염, 출혈성 직장 궤양 및 회장 낭염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 케피어 그레인 유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 정신 장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 케피어 그레인으로는 유산균을 필수적으로 포함하고, 효모를 추가로 더 포함할 수 있으며, 상기 유산균으로는 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속 및 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 등에 속하는 유산균일 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) 및 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것이 다른 균주에 비하여 스트레스에 기한 사이토카인의 발현 억제 효과가 현저히 뛰어나 바람직하고, 보다 바람직하게는 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens)를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 효모로는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 라칸세아(Lachancea) 속, 한세니아오스포라(Hanseniasospora) 속, 지고토루라스포라(Zygotorulaspora) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 토룰라(Torula) 속 및 캔디다(Candida) 속 등에 속하는 효모일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 미세소포체는 케피어 그레인의 배양물 유래 미세소포체일 수 있다.
본 발명에서 상기 케피어 그레인의 배양물은 상기 케피어 그레인을 배지에 배양하여 얻은 것으로, 배지, 케피어 그레인 및 배양으로 인하여 얻어진 모든 물질을 총칭할 수 있다. 또한, 상기 배양물은 액체 배양물 또는 고체 배양물일 수 있으며, 그 형상은 특별히 제한하지 않다. 여기서, 상기 배지의 종류 역시 특별히 제한하지 않으며, 예를 들면, MRS 배지, 우유, 치즈 등의 유제품을 사용할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 상기 케피어 그레인의 배양물은, (a) 케피어 그레인을 고체 배지에 12~48시간 동안 1차로 배양하는 단계; 및 (b) 1차 배양한 뒤 액체 배지에 1~48시간 동안 2차로 현탁 배양하는 단계에 의하여 얻어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 (b) 단계에 후속적으로 얻어진 배양물을 (c) 액체 배지에 추가로 1~14일 동안 현탁 배양하는 단계를 수행할 수 있다. 여기서, 상기 (c) 배양 시 3~7일 동안 현탁 배양하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 (c) 배양 시 3~4일 동안 현탁 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 케피어 그레인의 배양물은 미세소포체(extracellular vesicles)를 포함할 수 있으며, 상기 미세소포체는 상기 케피어 그레인에 속하는 유산균으로부터 자연적으로 또는 인공적으로 분비된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 약학 조성물 내에 포함되는 상기 미세소포체의 양은 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 1 X 103 내지 1 X 109 입자수로 포함할 수 있다. 상기 미세소포체의 함량이 1 X 103 입자수 미만인 경우 그 효과가 미미할 수 있고, 1 X 109 입자수를 초과하는 경우 인체에 독성을 유발시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 미세소포체는 케피어 그레인의 배양물을 원심 분리하여 얻을 수 있다. 보다 상세하게는 상기 미세소포체를 얻기 위하여, 상기 케피어 그레인의 배양물을 100~1,000g로 0 초과 20℃ 이하의 온도에서 5분 내지 1시간 동안 1차 원심 분리하는 단계; 및 상기 1차 원심 분리 후 상등액을 회수하여 1,000~5,000g로 0 초과 20℃ 이하의 온도에서 10분 내지 1시간 동안 2차 원심 분리하는 단계에 의하여 얻어진 상등액을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 미세소포체를 얻기 위하여, 상기 2차 원심 분리 후 얻어진 상등액을 5,000~20,000g로 0 초과 20℃ 이하의 온도에서 10분 내지 1시간 동안 3차 원심 분리하여 얻어진 상등액을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 미세소포체는, 상기 3차 원심 분리 후 얻어진 상등액을 초원심분리기(ultracentrifuge)를 이용하여 100,000~150,000g로 0 초과 20℃ 이하의 온도에서 1시간 내지 3시간 동안 4차 원심 분리하여 얻어진 펠렛일 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같은 4단계의 원심 분리 공정을 통하여 스트레스에 기한 사이토카인의 발현을 억제하는 효과가 뛰어난 미세소포체를 높은 순도 및 함량으로 획득할 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 미세소포체는 상기 케피어 그레인의 배양물로부터 침전시켜 얻을 수 있다. 보다 상세하게는 상기 미세소포체를 얻기 위하여 상기 케피어 그레인의 배양물을 3,000~5,000g로 5분 내지 1시간 동안 1차 원심 분리하는 단계; 1차 원심 분리 후 얻어진 농축 배양물에 대하여 0.5~2N 소디움 아세테이트를 0.1 내지 1.5 부피비, 바람직하게는 0.1 내지 1 부피비, 보다 바람직하게는 0.1 내지 0.5 부피비로 첨가한 뒤 -10℃ 이상 0℃ 이하의 온도에서 30~60분 동안 배양하는 단계에 의하여 얻어진 침전 배양물을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 미세소포체는, 상기 배양 후 얻어진 침전 배양물을 3,000~5,000g로 5분 내지 1시간 동안 2차 원심 분리하여 얻어진 펠렛일 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 미세소포체의 정제 효율을 높이기 위하여 추가적으로 상기 2차 원심 분리 후 얻어진 펠렛을 필요에 따라 0.05~0.2N 소디움 아세테이트로 세척한 뒤 3,000~5,000g로 5분 내지 1시간 동안 원심 분리하여 얻어진 펠렛을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 미세소포체는 상기 케피어 그레인의 배양물을 원심 분리하여 얻어진 것이 상기한 치료 효과를 높일 수 있어 바람직하지만, 제조 공정의 효율을 고려하여 침전법에 의해 얻어진 것을 사용할 수 있다.
최근 연구를 통해 신체적 및 심리적 스트레스는 IL-6 농도를 증가시키고, 그 결과 우울 증상이 유발되는 것으로 알려진 바 있다(Korean J Psychopharmacol 2000;11(4):304-312). 그런데 본 발명에서 상기한 케피어 그레인의 배양물 유래 미세소포체는 부신수질 세포에서 산화스트레스 유발에 의한 스트레스성 사이토카인인 IL-6의 분비를 저하시킬 수 있고, 따라서, 불안, 우울증, 기분 장애, 불면증, 강박 장애 또는 스트레스 등의 정신 장애를 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 상기 열거된 질환들의 증상을 차단하거나, 그 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 상기 열거된 질환들의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 케피어 그레인 유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 케피어 그레인 유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 케피어 그레인 유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 정신 장애의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 각 용도별 식품 조성물에서 상기 케피어 그레인, 미세소포체, 염증성 질환, 장 질환 및 정신 장애에 관한 구체적인 내용은 상기 약학 조성물에서 기재된 바와 중복되어 이하 그 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서, "개선"은 본 발명의 식품 조성물을 이용하여 상기 열거한 질환의 증상이 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 미세소포체가 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.
여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.
그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 케피어 그레인 유래 미세소포체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명에서 상기 케피어 그레인, 바람직하게는 상기 케피어 그레인의 배양물 유래 미세소포체는 항염증 효과가 뛰어나 부종, 피부염, 알레르기 또는 아토피 등의 염증성 질환을 효과적으로 예방 또는 개선할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서 상기 케피어 그레인 및 미세소포체에 관한 구체적인 내용은 상기 약학 조성물에서 기재된 바와 중복되어 이하 그 자세한 기재를 생략한다.
또한, 본 발명에서 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.
상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.
지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.
그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 항염증 효과가 뛰어나 다양한 염증성 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공하는 조성물은 대장세포에서 염증인자의 발현을 억제하는 효과가 뛰어나고, 배변 활동 개선, 장내 면역력 증진 및 장내 유해균의 증식을 억제하고 사멸을 유도하여, 장 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제공하는 조성물은 신체적 또는 정신적 스트레스에 기한 IL-6의 발현 수준을 현저히 감소하여, 스트레스에 기한 정신 장애를 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
도 1의 (a)는 실험예 1에서 락토바실러스 케피리 배양물을 원심분리하여 얻어진 농축 배양물에 포함된 미세소포체의 입자수와 평균 사이즈를 NTA로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 1의 (b)는 실험예 1에서 락토바실러스 케피라노팍시엔스 배양물을 원심분리하여 얻어진 농축 배양물에 포함된 미세소포체의 입자수와 평균 사이즈를 NTA로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 1의 (c)는 실험예 1에서 락토바실러스 케피르그라넘 배양물을 원심분리하여 얻어진 농축 배양물에 포함된 미세소포체의 입자수와 평균 사이즈를 NTA로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2의 (a)는 실험예 2에서 배양 시간 별 락토바실러스 케피리, 락토바실러스 케피라노팍시엔스 및 락토바실러스 케피르그라넘의 배양물 내에 포함된 단백질의 함량을 나타낸 것이다.
도 2의 (b)는 실험예 2에서 배양 시간 별 락토바실러스 케피리, 락토바실러스 케피라노팍시엔스 및 락토바실러스 케피르그라넘의 배양물 내에 포함된 미세소포체의 입자수를 NTA로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 3에서 락토바실러스 케피리, 락토바실러스 케피라노팍시엔스 및 락토바실러스 케피르그라넘의 배양물로부터 분리 방법에 따른 미세소포체의 입자수를 NTA로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 5에서 염증 유도된 대장 세포주 CaCo-2에 본 발명에 따른 미세소포체 처리 후 IL-8과 TNF-α의 mRNA 발현 수준을 측정하여 그 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 6에서 대식 세포(Raw246.7 세포)에 본 발명에 따른 미세소포체를 처리 후 LPS로 자극시킨 뒤 IL-6의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 6에서 대식 세포(Raw246.7 세포)에 본 발명에 따른 미세소포체를 처리 후 LPS로 자극시킨 뒤 TNF-α의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 7에서 Caco-2 세포에 TNF-α를 처리한 뒤 본 발명에 따른 미세소포체를 처리한 후 IL-8의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 7에서 Caco-2 세포에 TNF-α를 처리한 뒤 본 발명에 따른 미세소포체를 처리한 후 TNF-α의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 7에서 Caco-2 세포에 TNF-α를 처리한 뒤 본 발명에 따른 미세소포체를 처리한 후 음성 대조군 대비 IL-8의 분비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실험예 8에서 TNBS 유도 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 미세소포체 처리 후 대장 조직 사진을 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 8에서 TNBS 유도 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 미세소포체 처리 후 대장 조직을 조직학적으로 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 8에서 TNBS 유도 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 혼합 균주 배양물 유래 미세소포체(123_v)의 처리 후 대변 항상성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 실험예 8에서 TNBS 유도 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 혼합 균주 배양물 유래 미세소포체(123_v)의 처리 후 대장 출혈 정도를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 실험예 8에서 TNBS 유도 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 락토바실러스 케피르그라넘의 배양물 유래 미세소포체(1_v)의 처리 후 대변 항상성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 실험예 8에서 TNBS 유도 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 락토바실러스 케피르그라넘의 배양물 유래 미세소포체(1_v)의 처리 후 대장 출혈 정도를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 실험예 8에서 TNBS 유도 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 미세소포체 처리 후 MPO 활성의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 실험예 9에서 아세트산 유도 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 미세소포체를 처리한 후 대장 출혈 정도를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 실험예 10에서 스테필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)에 본 발명에 따른 미세소포체 처리 후 생존 균수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 실험예 11에서 부신수질 유래 PC-12 세포에 과산화수소(H2O2)를 처리한 뒤 본 발명에 따른 미세소포체 처리 후 IL-6의 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 20의 (a)는 실험예 12에서 3T3-L1 세포에 본 발명에 따른 미세소포체 처리 후 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 20의 (b)는 실험예 12에서 CaCo-2 세포에 본 발명에 따른 미세소포체 처리 후 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실험예 1] 케피어 그레인의 배양물 유래 미세소포체의 크기 및 입자수 확인
케피어 그레인에 포함되는 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) 및 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum) 각각을 고상의 MRS 배지에 스트리킹(streaking)하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 액상의 MRS 배지에 적은 규모로 24시간 동안 현탁 배양하였다. 이 후 OD 값을 맞춰서 액상의 MRS 배지에 큰 규모로 현탁 배양하였다. 배양 4일차에 배양물을 수거하여 배양물을 300g로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 취하여 1,200g에서 4℃에서 20분 동안 원심분리한 뒤, 상층액을 취하여 10,000g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 상층액을 취하여 초원심분리기를 이용해 110,000g로 4℃에서 1시간 10분 동안 원심분리한 뒤 상층액을 제거하여 침전물(pellet)을 PBS로 현탁하였다. 이렇게 얻어진 유산균의 농축 배양물 1ml에 포함된 미세소포체의 입자수와 평균 사이즈를 NTA(Nanosight NS300)를 이용하여 측정해 그 결과를 도 1의 (a) 내지 (c) 및 하기 표 1에 나타내었다.
균주 총 개수
(particles/ml)
락토바실러스 케피라노팍시엔스 6.0 X 1011
락토바실러스 케피리 3.0 X 1011
락토바실러스 케피르그라넘 3.0 X 1011
상기 도 1의 (a) 내지 (c) 및 표 1에서 보는 바와 같이, 유산균 배양물 1ml에 대하여 미세소포체가 평균 4.5 X 1011 입자수로 포함되는 것을 확인할 수 있었고, 그 평균 사이즈는 120 내지 190nm로 확인할 수 있었다.
[실험예 2] 유산균의 배양 기간 별 미세소포체의 수득률 변화
케피어 그레인에 포함되는 락토바실러스 케피라노팍시엔스, 락토바실러스 케피리 및 락토바실러스 케피르그라넘 균주 각각을 고상의 MRS 배지에 스트리킹(streaking)하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 액상의 MRS 배지에 적은 규모로 24시간 동안 현탁 배양하였다. 이 후 OD 값을 맞춰서 액상의 MRS 배지에 큰 규모로 현탁 배양하였다. 배양 1일차, 2일차, 3일차, 4일차 및 7일차 각각에 배양물을 수거하여 초원심분리기(ultracentrifuge)로 원심 분리하여 상층액을 버리고 유산균의 농축 배양물을 회수하였다. NTA(Nanosight NS300)를 이용하여 배양물 1ml에 포함된 미세소포체의 입자수와 단백질의 함량을 측정하여 그 결과를 도 2의 (a) 및 (b)에 나타내었다.
도 2의 (a) 및 (b)에서 보는 바와 같이, 배양일 별로 미세소포체를 단백질과 입자수로 확인한 결과, 단백질에 비하여 입자수 개수법이 배양일 별로 일정한 패턴을 갖는 것을 확인할 수 있었고, 특히 입자수 개수법 기준으로 3종의 유산균 모두에서 배양 4일째에 배양물 내에 가장 많은 미세소포체가 포함된 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 3] 미세소포체의 분리 방법 별 수득률 변화
실험예 1에서 얻어진 4일차 배양물로부터 하기 3가지 방안을 이용하여 미세소포체를 분리하였다.
1. 초원심분리기를 이용한 미세소포체의 분리(ultracentrifuge 법)
배양물을 300g로 4℃에서 10분 동안 원심 분리하고, 상층액을 취하여 1,200g에서 4℃에서 20분 동안 원심 분리한 뒤, 상층액을 취하여 10,000g로 4℃에서 30분 동안 원심 분리하고, 상층액을 취하여 초원심분리기를 이용해 110,000g로 4℃에서 1시간 10분 동안 원심 분리한 뒤 상층액을 제거하여 침전물(pellet)을 PBS로 현탁하였다.
2. ExoQuick-TCTM 엑소좀 침전 용액을 이용한 미세소포체의 분리(Exoquick 법)
배양물을 3,000g로 15분 동안 원심 분리하고, ExoQuick-TCTM사의 엑소좀 침전 용액을 배양물 10ml 당 2ml의 비율로 넣은 뒤 4℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후, 1,500g로 30분 동안 원심분리한 뒤 상층액을 제거하고 1,500g에서 30분 동안 원심분리한 뒤 상층액을 제거하여 침전물(pellet)을 PBS로 현탁하였다.
3. 침전법을 이용한 미세소포체의 분리(precipitation 법)
배양물을 5,000g로 10분 동안 원심 분리하고, 1N 소디움 아세테이트를 배양물 10ml 당 1ml의 비율로 넣은 뒤 아이스에서 45분 동안 배양하였다. 배양 후, 5,000g로 10분 동안 원심 분리한 뒤 상층액을 제거하고 침전물을 0.1N 소디움 아세테이트로 세척하였다. 이후, 5,000g에서 10분 동안 원심 분리한 뒤 상층액을 제거하고 침전물(pellet)을 PBS로 현탁하였다.
NTA(Nanosight NS300)을 이용하여 상기 3가지 방법으로 획득한 침전물 내에 포함된 미세소포체의 입자수를 측정해 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보는 바와 같이 초원심분리기를 이용한 방법에 의하는 것이 유산균 배양물로부터 가장 높은 수득률로 미세소포체를 확보할 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 4] 케피어 그레인 유래 미세소포체의 획득
락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) 및 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum)의 혼합 균주를 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 배양하여 배양물을 획득한 뒤, 실험예 3의 초원심분리기를 이용한 방법으로 미세소포체를 분리하였다.
[실험예 5] 케피어 그레인 유래 미세소포체의 항염증 효과 확인(1)
TNF-α 20ng으로 염증 유도된 대장 세포주 CaCo-2를 12-웰 플레이트에 웰당 1 X 106 cell로 플레이팅한 뒤 각각에 상기 실험예 3에서 초원심분리기를 이용하여 분리된 미세소포체를 1 X 103, 1 X 106, 1 X 109 입자수의 양으로 24시간 동안 처리하였다. 이 후, 48시간 배양 후에 각 군의 세포에서 RNA를 추출한 후 인트론 프레믹스(intron premix)를 이용하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성하고 이를 이용하여 실시간 PCR(Real-time PCR, RT-PCR)을 수행하였다. 각각의 처리 군의 세포에서 염증 인자로 IL-8과 TNF-α의 발현량을 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 유산균 배양물 유래 미세소포체를 처리하자 IL-8과 TNF-α의 발현량이 현저히 감소한 것을 볼 수 있고, 특히 락토바실러스 케피라노팍시엔스 유래 미세소포체가 항염 효과가 뛰어난 것을 볼 수 있다.
[실험예 6] 케피어 그레인 유래 미세소포체의 항염증 효과 확인(2)
마우스의 대식 세포인 Raw246.7 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양시킨 후 실험예 4에서 얻어진 미세소포체를 200㎍/ml(1 X 109 나노입자/ml)의 양으로 처리하여 24시간 동안 배양시키고, LPS 100ng/ml을 6시간 동안 처리한 후 RT-PCR 및 ELISA를 이용하여 IL-6 및 TNF-α의 발현 수준을 측정해 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다. 단, 양성 대조군으로는 커큐민(curcumin)을 10μM의 양으로 처리하였다.
도 5 및 6에서 보는 바와 같이, 대식 세포에 본 발명에 따른 미세소포체를 처리하고 LPS를 이용하여 염증을 유도한 경우, 무처리한 경우나 커큐민을 처리한 경우보다 IL-6 및 TNF-α의 발현 수준이 절반 이상으로 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 7] 케피어 그레인 유래 미세소포체의 항염증 효과 확인(3)
MEM 배지에 10% FBS, 100 units/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 0.1 mmol/l 비필수 아미노산, 1 mmol/l 소디움 피루베이트를 첨가하여 37 ℃ 인큐베이터에서 5% CO2-95% 공기 조성으로 Caco-2 세포를 배양하였다. 배양된 세포가 80% 컨플루언시하게 자라면 0.25% 트립신을 이용하여 세포를 떼어내고, 24 웰에 각 웰당 2 X 104 세포를 접종하였다. 이후, 각 웰에 TNF-α를 20ng/ml의 양으로 6시간 동안 처리한 뒤 상기 실험예 4에서 얻어진 미세소포체를 200㎍/ml(1 X 109 나노입자/ml)의 양으로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. RT-PCR 및 ELISA(100㎍/ml)를 이용하여 IL-8 및 TNF-α의 발현 수준 및 음성 대조군 대비 미세소포체 처리군에 있어서 IL-8의 분비율 정도를 측정해 그 결과를 도 7 내지 9에 나타내었다.
도 7 내지 9에서 보는 바와 같이, 장 상피세포에 TNF-α를 처리하여 염증을 유도한 뒤 본 발명에 따른 미세소포체를 처리하자 염증 인자인 IL-8 및 TNF-α의 mRNA 발현 수준이 현저히 감소하였고, IL-8 분비량 또한 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 8] 케피어 그레인 유래 미세소포체의 항염증 효과 확인(4)
BALB/c 마우스에 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)으로 대장염을 유발하였다. 구체적으로 마우스를 에테르로 마취한 후 TNBS(2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid) 용액 2.5g을 50% 에탄올에 혼합한 용액을 끝이 둥근 1㎖ 용량의 주사기를 이용하여 항문을 통해 대장 내로 0.1㎖씩 투여하고 수직으로 들어 30초간 유지하여 염증을 유발하였다. 반면, 정상군에는 생리식염수 0.1㎖를 경구 투여하였다. 이후, 익일부터 매일 1회씩 3일간 상기 실험예 4에서 얻어진 미세소포체를 10㎍/마리 또는 1mg/마리의 용량으로 경구 투여하고 시료 투여가 종료된 다음날에 마우스를 이산화탄소로 질식시켜 안락사시킨 후 대장부위 중 맹장으로부터 항문 직전 부위까지의 대장을 적출하였다. 단, 양성 대조군으로는 대장염 치료제인 프레드니솔론을 2mg/kg의 양으로 경구 투여하였다.
(1) 조직 외관 평가
적출한 대장 조직을 H&E 염색한 후 그 단면 사진을 도 10에 나타내었고, 상기 대장의 길이와 외관을 관찰하여 하기 표 2의 기준(Hollenbach 등, 2005 대장염 정도에 대한 기준)에 따라 점수로 매겨 그 결과를 도 11에 나타내었다.
외관 점수(Macroscopic Score) 기준
0 어떠한 궤양과 염증도 발견되지 않음
1 출혈이 없는 충혈이 발견됨
2 충혈이 있는 궤양이 발견됨
3 한 곳에서만 양과 염증이 발견됨
4 궤양과 염증이 2곳 이상에서 발견됨
5 궤양이 2㎝ 이상으로 확대되어 있음
도 10에서 보는 바와 같이 대장염 마우스 모델의 대장에서는 심각한 상피 괴사, 출혈, 염증 세포의 침윤, 부종 및 궤양 등이 관찰되었으나, 본 발명에 따른 미세소포체를 투여한 경우 농도 의존적으로 상기한 대장염의 증상들이 현저히 완화된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 11에서 보는 바와 같이, 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 미세소포체를 투여한 경우 농도 의존적으로 대장 내 출혈이 감소하였고, 이러한 치료 효과는 양성 대조군으로 프레드니솔론을 2mg/kg의 많은 양으로 투여한 경우보다 우수한 것을 확인할 수 있었다.
(2) DAI 평가
DAI (disease activity index)는 급성 대장염을 유발하는 TNBS로 인한 증상을 점수화하는 방법으로, 본 발명에 따른 미세소포체를 제공하는 시기부터 시작하여 제공하는 동안 매일 같은 시각에 대변(stool)의 농도 및 색을 체크하여 측정하였다. 대변 항상성(consistency)과 출혈 정도(bleeding)를 측정하여 그 결과를 도 12 내지 15에 나타내었다. 단, DAI의 평가 기준은 하기 표 3과 같다. DAI 평가 시에는 상기 실험예 4에서 얻어진 혼합 균주의 배양물 유래 미세소포체(123_v) 외에, 실험예 3에서 초원심분리기를 이용하여 얻어진 락토바실러스 케피르그라넘 배양물 유래 미세소포체(1_v)를 투여하여 추가로 실험하였다.
Stool consistency Stool bleeding
0 Formed 0 Normal color
2 Loose stool 2 fecal occult blood test positive
4 Diarrhea 4 Gross bleeding
도 12 내지 15에서 보는 바와 같이 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 혼합 균주의 배양물 미세소포체(123_v) 또는 락토바실러서 케피르그라넘 배양물 유래 미세소포체(1_v)를 투여한 경우, 양성 대조군으로 프레드니솔론을 투여한 경우와 동등 이상의 수준으로 DAI 값을 낮춰 배변 활동을 개선하는 것을 확인할 수 있었다.
(3) MPO 활성 평가
또한, MPO ELISA kit(Hycult Biotech, HK105)을 이용하여 상기 적출한 대장 조직에서 염증 지표인 Myeloperoxidase (MPO) 활성을 측정하여 그 결과를 도 16에 나타내었다. 단, 상기 MPO 활성은 균질기(Homogenizer)로 균질하게 분쇄된 장 조직을 15분간 원심분리 하여 얻은 상층액과 미리 준비한 표준 용액(standard solution)을 항체가 붙어 있는 웰에 각각 100 μl씩 넣어준 다음, 플레이트에 공기가 들어가지 않도록 커버로 실링한 다음 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 1시간 반응이 끝나면, 세척 버퍼를 이용하여 4회 세척하여 세척 버퍼는 완전히 제거되도록 하였다. 이후 100 μl의 트레이서 용액을 각 웰 마다 넣고 커버를 부착하여 1시간 동안 상온에서 반응시키고 마찬가지로 4회 세척하였다. 그 다음, 희석된 스트렙타비딘-페록시다제(streptavidin-peroxidase) 용액을 100 μl씩 모든 웰에 넣고 커버를 부착하여 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후 각 웰을 4회 세척하고 모든 웰에 TMB 기질을 100 μl씩 넣어준 다음, 차광 하에서 30분간 반응시키고 나서 정지 용액(stop solution)을 동일한 양인 100 μl씩 넣어주었다. 이후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 표 준용액으로 제작된 표준 곡선(standard curve)을 활용하여 시료의 MPO 활성값을 구하였다.
도 16에서 보는 바와 같이, 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 미세소포체를 투여한 경우, 양성 대조군으로 프레드니솔론을 투여한 경우와 동등 이상의 수준으로 MPO 활성이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 9] 케피어 그레인 유래 미세소포체의 항염증 효과 확인(5)
BALB/c 마우스에 아세트산(acetic acid)으로 과민성 대장 증후군을 유발하였다. 구체적으로 마우스를 에테르로 마취한 후 5% 아세트산을 끝이 둥근 1㎖ 용량의 주사기를 이용하여 항문을 통해 대장 내로 0.1㎖씩 투여하고 수직으로 들어 30초간 유지하여 과민성 대장 증후군을 유발하였다. 반면, 정상군에는 생리식염수 0.1㎖를 경구 투여하였다. 이후, 익일부터 매일 1회씩 3일간 상기 실험예 4에서 얻어진 미세소포체를 10㎍/마리의 용량으로 경구 투여하였다. 본 발명에 따른 미세소포체를 제공하는 시기부터 시작하여 제공하는 동안 매일 같은 시각에 대변(stool)의 색을 체크하며 상기 표 3에 나타낸 기준으로 대장의 출혈 정도를 측정하여 그 결과를 도 17에 나타내었다. 단, 양성 대조군으로는 프레드니솔론(2mg/kg), 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) 및 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum)의 혼합 균주(5 X 107 CFU), 시중에 판매되는 기존 유산균 제품(5 X 107 CFU) 및 시중에 판매되는 기존 유산균 제품(5 X 107 CFU)과 본 발명의 미세소포체(10㎍/마리)를 경구 투여하였다.
도 17에서 보는 바와 같이, 아세트산 유도 과민성 대장 증후군 마우스 모델에 본 발명에 따른 미세소포체를 처리한 경우 미세소포체 유래 혼합 균주 자체를 투여한 경우나, 기존에 시중에 판매되던 유산균을 투여한 경우보다 현저히 대장 내 출혈을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 기존에 시중에 판매되던 유산균에 본 발명에 따른 미세소포체를 함께 처리한 경우 대장 출혈 감소 정도가 더욱 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 10] 케피어 그레인 유래 미세소포체의 항균 효과 확인
본 발명에 따른 케피어 그레인 유래 미세소포체의 장내 유해균에 대한 항균 효과를 확인하기 위하여, 장내 유해균에 속하는 스테필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)를 액상의 영양 배지에서 24시간 배양한 후 상기 실험예 4에서 얻어진 미세소포체를 500㎍/ml의 양으로 처리하여 37℃ 하에서 3시간 동안 추가로 배양한 뒤 생존 균수를 측정하여 그 결과를 도 18에 나타내었다. 단, 음성 대조군으로는 증류수를 처리하였고, 양성 대조군으로는 페니실린(Penicillin)을 10㎍/ml의 양으로 처리하였다.
도 18에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 미세소포체를 처리한 경우 양성 대조군인 페니실린을 처리한 경우와 동등한 수준으로 장내 유해균인 스테필로코커스 에피더미디스의 증식을 억제하고 사멸을 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 11] 케피어 그레인 유래 미세소포체의 스트레스 완화 효과 확인
본 발명에 따른 케피어 그레인 유래 미세소포체의 스트레스 완화 효과를 평가하기 위하여, 24 웰 플레이트의 각 웰에 10% 혈청 (FBS: Fetal Bovine Serum)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(streptomycin) 항생제를 포함하는 MEM(Minimal Essential Medium)을 분주하고, 각 웰당 부신수질 유래 PC-12 세포 5 X 104개의 세포를 접종한 뒤 과산화수소(H2O2)를 1시간 동안 처리하며 IL-6의 발현을 유도하였다. 이후, 상기 실험예 4에서 얻어진 미세소포체를 0.1㎍/ml, 1㎍/ml, 10㎍/ml 및 100㎍/ml의 양으로 각각 처리하고, ELISA를 이용하여 IL-6의 발현 수준을 측정해 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 미세소포체를 처리한 경우 무처리 군에 비하여 IL-6의 발현 수준이 현저히 감소되었고, 그 감소 정도는 농도에 비례하여 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 본 발명에 따른 케피어 그레인 유래 미세소포체를 사용하는 경우 스트레스에 의한 IL-6의 발현 수준을 현저히 감소시킴에 따라 우울증 등의 정신 장애 또한 예방 또는 치료할 수 있음을 자명히 예측할 수 있었다.
[실험예 12] 케피어 그레인 유래 미세소포체의 안전성 확인
본 발명에 따른 케피어 그레인 유래 미세소포체의 안전성을 확인하기 위하여, 3T3-L1 및 CaCo-2 정상 세포에 실험예 3에서 초원심분리기를 이용하여 얻어진 미세소포체를 1 X 103 내지 1 X 109 입자수의 양으로 처리한 뒤 MTS 시약(Promega, USA)과 세포의 기본 배지(FBS free, 1% p/s)를 1:5의 비율로 희석하여 각 웰당 500㎕씩 분주하여 1시간 30분 반응 후 490nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율의 변화를 평가해 그 결과를 도 20의 (a) 및 (b)에 그래프로 나타내었다. 단, 대조군으로는 아무런 처리를 하지 않았다.
도 20의 (a) 및 (b)에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 미세소포체를 1 X 109 입자수의 양까지 처리하여도 세포 독성이 없는 것을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 케피어 그레인(Kefir grain) 유래 미세소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로,
    상기 케피어 그레인은 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) 및 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고,
    상기 장 질환은 과민성 대장 증후군 또는 염증성 장 질환인, 약학 조성물.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서,
    상기 미세소포체는 상기 케피어 그레인의 배양물 유래인, 약학 조성물.
  8. 삭제
  9. 제5항에 있어서,
    상기 염증성 장 질환은 크론병, 베체트병에 수반되는 장 병변, 궤양성 대장염, 출혈성 직장 궤양 및 회장 낭염으로 이루어진 군에서 선택되는, 약학 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 케피어 그레인(Kefir grain) 유래 미세소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 장 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물로,
    상기 케피어 그레인은 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) 및 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고,
    상기 장 질환은 과민성 대장 증후군 또는 염증성 장 질환인, 식품 조성물.
  17. 삭제
KR1020170177443A 2016-12-21 2017-12-21 케피어 그레인 유래 미세소포체의 용도 KR102089938B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20160175919 2016-12-21
KR1020160175919 2016-12-21

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200025168A Division KR102247772B1 (ko) 2016-12-21 2020-02-28 케피어 그레인 유래 미세소포체의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180072589A KR20180072589A (ko) 2018-06-29
KR102089938B1 true KR102089938B1 (ko) 2020-03-17

Family

ID=62780849

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170177443A KR102089938B1 (ko) 2016-12-21 2017-12-21 케피어 그레인 유래 미세소포체의 용도
KR1020200025168A KR102247772B1 (ko) 2016-12-21 2020-02-28 케피어 그레인 유래 미세소포체의 용도

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200025168A KR102247772B1 (ko) 2016-12-21 2020-02-28 케피어 그레인 유래 미세소포체의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (2) KR102089938B1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10632161B1 (en) 2019-05-23 2020-04-28 Prostemics Co. Ltd. Method for ameliorating or treating a bowel disease
KR102502978B1 (ko) * 2019-12-11 2023-02-22 한양대학교 산학협력단 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 함유하는 항염증 또는 면역증강용 조성물
KR102257130B1 (ko) * 2020-06-16 2021-05-28 주식회사 엠디헬스케어 락토바실러스 파라카세이 유래 소포를 포함하는 신경질환 또는 정신질환 예방 또는 치료용 조성물
KR20220061555A (ko) * 2020-11-06 2022-05-13 (주)프로스테믹스 신규한 락토바실러스 속 균주 및 상기 균주 유래 세포외 소포의 용도
EP4349354A1 (en) * 2021-06-03 2024-04-10 MD Healthcare Inc. Extracellular vesicles derived from lactobacillus bacteria, and use thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008530034A (ja) * 2005-02-11 2008-08-07 テクノロジー バイオラクティス インコーポレイティド プロバイオティクス及びシンバイオティックとしてのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）の使用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005348698A (ja) * 2004-06-14 2005-12-22 Yonezawa Biru System Service:Kk ケフィア粒から分離された微生物とこの微生物あるいはそれを含む微生物群を培養して得られる微生物培養物ならびにそれらを用いた製品

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008530034A (ja) * 2005-02-11 2008-08-07 テクノロジー バイオラクティス インコーポレイティド プロバイオティクス及びシンバイオティックとしてのラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）の使用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180072589A (ko) 2018-06-29
KR20200024203A (ko) 2020-03-06
KR102247772B1 (ko) 2021-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102089938B1 (ko) 케피어 그레인 유래 미세소포체의 용도
KR102233530B1 (ko) 엑소좀 및 이의 다양한 용도
KR102098067B1 (ko) 락토바실러스 파라카제이 유래 소포 및 이의 용도
KR101987639B1 (ko) 신규 후시디움 코씨네움 균주 및 그 균주 배양액을 포함하는 피부미용 개선용 조성물
KR20180128602A (ko) 나복근 즙을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR102222877B1 (ko) 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 조성물
KR102267796B1 (ko) 천연 추출물 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 진정용 조성물
KR101908678B1 (ko) 천연 추출물을 함유하는 아토피 피부염 개선용 발효 조성물
KR101831883B1 (ko) 이소세코타나파솔라이드를 유효성분으로 함유하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물
KR102342901B1 (ko) 엑소좀 및 이의 다양한 용도
KR101476399B1 (ko) 아라자임을 유효성분으로 하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 조성물
KR101583600B1 (ko) 신규한 바실러스 메가테리움 균주 및 이의 용도
KR102510953B1 (ko) 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR102507470B1 (ko) 스트렙토코커스 피오게네스의 사균체 또는 SpeA 단백질을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101937667B1 (ko) 세포 노화 억제용 조성물
KR101941183B1 (ko) 오미자 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물 및 그 제조방법
KR20160008942A (ko) 발효된 부활초 추출물을 포함하는 조성물 및 이의 용도
KR102120758B1 (ko) 커피 추출물을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
KR102144566B1 (ko) 택란 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물
KR20180082057A (ko) 락토바실러스 발효 추출물을 함유하는 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물
KR20160091593A (ko) 심비디움(cymbidium) 추출물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환 또는 접촉성 피부염 예방 및 치료용 약학조성물
KR20070070303A (ko) 캄페롤을 유효성분으로 함유하는 피지 분비 억제용 및항비만용 조성물
KR102342902B1 (ko) 엑소좀 및 이의 다양한 용도
KR101794695B1 (ko) 항염 효과가 우수한 기능성 식품 조성물
KR20160043621A (ko) 우수한 보습성 및 항염증성을 갖는 괴화 추출물을 포함하는 조성물 및 그 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant