KR102502978B1 - 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 함유하는 항염증 또는 면역증강용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)를 함유하는 항염증 또는 면역증강용 기능성 식품 및 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 기능성 식품 또는 약학 조성물로서 적용되어, NF-κB p65의 억제를 통해 염증 반응을 억제하는 효과를 발휘할 수 있으며, 선천적 면역 기능성 증진의 효능을 나타낸다. 또한, 케피어 유래 유산균의 활성 성분만을 분리하여 기존의 가공식품의 경우 가공, 포장 과정에서 프로바이오틱스를 생균 상태로 유지하기 어려웠던 단점을 보완할 수 있는 기능성 대체 소재로서 활용이 가능하다.

Description

케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 함유하는 항염증 또는 면역증강용 조성물{Composition for Anti-inflammation or Enhancing Immunity Comprising Surface Layer Protein of Lactic Acid Bacteria from Kefir}
본 발명은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)를 함유하는 항염증 또는 면역증강용 기능성 식품 및 약학 조성물에 관한 것이다.
프로바이오틱스(probiotics)는 건강에 도움이 되는 장내 세균총 즉, 숙주의 건강에 이로움을 제공하는 살아있는 미생물 즉 생균류를 의미한다. 일반적으로 프로바이오틱스는 요거트 등의 발효식품의 일부 또는 식이보충제로서 소비된다. 프로바이오틱스로 알려진 미생물에는 유산균(lactic acid bacteria; LAB), 비피도박테리아(bifidobacteria), 바실러스 등이 있다. 상기 프로바이오틱스 중 일부는 비만, 인슐린 저항, 비알코올성 지방간 등에 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 최근에는 프로바이오틱스가 내놓는 대사산물인 ‘포스트바이오틱스(postbiotics)’가 치료제나 질병 진단에 효율적이라는 주장이 주목받고 있다. 프로바이오틱스와 포스트바이오틱스는 장내 건강뿐 아니라 면역과 순환, 호흡, 항상성 등 다양한 인체의 활성에 관여한다는 주장이 제기되고 있지만 아직 포스트바이오틱스에 대한 연구 및 개발은 미흡한 실정이다.
예를 들어, 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0033433호에서는 상업용 가축 및 반려동물의 건강 및 영양을 향상시키기 위한 프리바이오틱(prebiotic), 프로바이오틱(probiotic) 및 포스트바이오틱(postbiotic) 조성물 및 이의 사용 방법에 대해서 기재하고 있지만, 포스트바이오틱 소재로 쓰인 배양 상층액은 대사부산물로 추정되는 물질을 사료 조성물에 이용한 것으로서 성장 촉진 기능성을 제외한 다른 기능성에 대한 연구는 전무하였다.
한편, 케피어(Kefir)는 코카서스 산간 지방에서 유래한 발효유의 일종으로, 티벳지방 승려들이 건강을 위해 음용하던 것이 대중화된 음료이다. 케피어의 구성영양소로는 단백질 및 다당체가 포함되어 있고, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민B2, 비타민B6, 비타민D, 비타민K2, 엽산, 니코틴산 및 칼슘, 철분, 요오드 등을 고루 포함하고 있다. 이러한 케피어는 유산균과 효모 복합체인 케피어 그레인으로 불리우는 균종(케피어 과립균이라고도 한다)을 개시제로 하여 우유를 발효시켜 얻어진 요구르트상의 음료이다.
케피어는 유산균(Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Acetobacter, 및 Streptococcus 종), 초산균 및 효모(Saccharomyces, Kluyveromyces, Torula 및 Candida 종)를 포함하는 다양한 미생물을 함유하고 있다. 케피어는 항돌연변이성, 콜레스테롤 저하, 항비만성, 지방간 예방 등의 효과를 갖는 것으로 알려지고 있지만 케피어 또는 케피어 유래 유산균, 초산균, 효모 등의 활성 성분을 추출하여 보다 우수한 효능을 달성하기 위하여 연구는 부족한 상황이다.
예를 들어, 대한민국 등록특허 제10-2037897호에서는 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말을 이용한 항비만 조성물을 기재하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-2037898호에서는 케피어 유래 유산균과 포도씨 분말을 이용한 지방간 개선용 조성물을 기재하고 있으나, 케피어 유래 유산균을 그대로 이용하고 있어 활성 성분의 활용에 대한 개선의 여지가 남아 있다.
본 발명의 발명자들은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 분리하여 사용할 경우 우수한 항염증 또는 면역증강 효과를 발휘한다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 유효성분으로 함유하는 항염증 또는 면역증강용 기능성 식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 케피어(kefir) 유래 유산균의 세포표면단백질(surface layer protein, SLP)을 포함하는 항염증 또는 면역증강용 기능성 식품을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 케피어리(Lactobacillus kefiri) 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중 1종 이상인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 커피어리 DH5, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1607, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1608 및 류코노스톡 메센테로이데스 DH1609로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 세포표면단백질은 SDS-PAGE 측정시 약 70kDa에서 밴드를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 기능성 식품은 NF-κB p65 활성을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 케피어(kefir) 유래 유산균의 세포표면단백질(surface layer protein, SLP)을 포함하는 염증 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 염증 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 근무력증, 대장염, 당뇨병, 비만, 뇌염 또는 알러지일 수 있다.
본 발명에 따른 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 기능성 식품 또는 약학 조성물로서 적용되어, NF-κB p65의 억제를 통해 염증 반응을 억제하는 효과를 발휘할 수 있으며, 선천적 면역 기능성 증진의 효능을 나타낸다. 또한, 케피어 유래 유산균의 활성 성분만을 분리하여 기존의 가공식품의 경우 가공, 포장 과정에서 프로바이오틱스를 생균 상태로 유지하기 어려웠던 단점을 보완할 수 있는 기능성 대체 소재로서 활용이 가능하다.
도 1(a)는 락토바실러스 케피어리의 세포표면단백질(SLP)의 세포생존율 실험 결과를 나타낸다.
도 1(b)는 류코노스톡 메센테로이데스의 세포표면단백질의 세포생존율 실험 결과를 나타낸다.
도 2는 다양한 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 처리한 경우의 IL-6 생성량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3(a)은 류코노스톡 메센테로이데스 DH1608의 사균체를 처리한 경우의 IL-6 생성량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3(b)은 류코노스톡 메센테로이데스 DH1609의 사균체를 처리한 경우의 IL-6 생성량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질의 NF-κB p65 활성 억제를 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 케피어 발효유에서 새롭게 분리된 유산균의 세포 구성성분 중에서 세포표면단백질(surface layer protein, SLP)의 항염증 및 면역증강 활성을 규명한 것으로서, 케피어(kefir) 유래 유산균의 세포표면단백질을 함유하는 항염증 또는 면역증진용 기능성 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 케피어(kefir)는 코카서스 산간 지방에서 유래한 발효유의 일종으로, 케피어는 유산균과 효모 복합체인 케피어 그레인으로 불리우는 균종을 개시제로 하여 우유를 발효시켜 얻어진 요구르트상의 음료를 의미한다.
또한, 본 발명에서, 케피어 유래 유산균은 락토바실러스 케피어리(Lactobacillus kefiri) 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 케피어 유래 유산균은 생균 또는 사균의 형태일 수 있으며, 사균인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에서는, 상기 케피어 유래 유산균의 세포 성분 중 세포표면단백질을 대식세포에 처리한 결과, 전염증 사이토카인인 IL-6 생성을 농도 의존적으로 억제하고, NF-κB 염증 기전의 구성성분인 NF-κB p65 단백질의 발현 정도를 통계적으로 유의하게 감소시킴으로써 과면역 반응을 억제하여 염증성 질환을 개선할 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 과면역 반응에 의해 유발되는 염증성 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 근무력증, 대장염, 당뇨병, 비만, 뇌염, 알러지 등이 있으며, 비만, 알러지, 당뇨에 특히 효과적이다.
바람직하게는, 본 발명에서 적용 가능한 케피어 유래 유산균은 락토바실러스 케피어리 DH1, 락토바실러스 케피어리 DH3, 락토바실러스 케피어리 DH5, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1604, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1606, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1607, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1608 및 류코노스톡 메센테로이데스 DH1609로부터 선택된 1종 이상이다. 이들은 모두 건국대학교 수의학대학 식품안전연구센터에서 입수할 수 있으며, 이 중 락토바실러스 케피어리 DH5는 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM11837P(수탁일자: 2016년 4월 29일)로 기탁되어 있고, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1604는 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM12117P(수탁일자: 2017년 9월 21일)로 기탁되어 있다.
본 발명에서, 항염증 활성을 위하여 특히 바람직한 케피어 유래 유산균은, 락토바실러스 커피어리 DH5, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1607, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1608 및 류코노스톡 메센테로이데스 DH1609이다. 본 발명의 실시예에서는 류코노스톡 메센테로이데스 DH1609이 가장 우수한 IL-6 생성 억제 활성을 나타낸다는 것을 확인하였다.
본 발명에서, 면역 증강을 위하여 특히 바람직한 케피어 유래 유산균은 락토바실러스 케피어리 DH1 또는 류코노스톡 메센테로이데스 DH1606이다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 유산균 유래 세포표면단백질을 처리한 군에서 IL-6 생성량의 증가가 나타나 선천적 면역 증진의 효과를 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 케피어 유래 유산균 중 우수한 항염증 활성을 나타내는 세포표면단백질은 SDS-PAGE에 의해 측정시 약 70kDa에서 밴드를 갖는 것을 확인하였다. 본 발명의 일 실시예에서는 다양한 종류의 케피어 유래 유산균으로부터 분리한 세포표면단백질 중에서 우수한 항염증 활성을 나타낸 세포표면단백질의 경우 SDS-PAGE 측정시 약 70kDa에서 밴드가 나타나지만, 항염증 활성이 나타나지 않은 단백질의 경우 약 70kDa에서 밴드가 나타나지 않는다는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 항염증 또는 면역 증강용 기능성 식품으로 적용될 수 있다.
상기 기능성 식품은 발효식품인 것이 바람직하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어서, 상기 기능성 식품은 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류일 수 있으며, 더욱 자세히는, 유제품, 제과물, 조미료, 음료 및 드링크제, 스낵, 캔디류, 젤리류, 아이스크림 및 냉동용 디저트, 아침 곡물류, 영양바, 스낵 바 초콜렛 제품, 가공 식품, 곡물 제품 및 파스타, 스프, 소스 및 드레싱, 과자 제품, 오일 및 지방 제품, 유제품 음료 (dairy drink) 및 우유 음료, 차, 두유 및 콩 유제품 (soy dairy-like product), 냉동식품, 조리 음식 및 대체 음식, 육류 제품, 치즈, 요구르트, 빵 및 롤빵, 케이크, 쿠키 및 크래커로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품은 케피어 유래 유산균 중 하나 이상의 세포표면단백질을 포함하는 캡슐, 정제, 분말, 액상 현탁액, 환제 및 과립제 등의 제형으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질 외에도 유효성분으로서 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 과일주스나 야채 음료 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질은 또한, 염증 질환 또는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 적용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 유효성분으로서 함유하며, 통상의 방법에 따른 적절한 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)]에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여 모두 가능하며, 비경구 투여는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함한다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리 식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 지식을 가진 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
제조예 1: 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질 분리
아래 표 1에 나열한 케피어 유래 유산균 균주 8종을 각각 Man Rogosa Sharpe(MRS) 액체배지에서 48시간 동안 배양하였다. 이 때, 락토바실러스 케피어리는 37℃에서, 류코노스톡 메센테로이데스는 30℃에서 배양하였다.
액체배지에 배양된 각 균을 1,000×g로 10분간 4℃에서 원심분리한 후 멸균 Phosphate buffered saline(PBS)로 2회 세척하고, 1시간 동안 5M Lithium chloride(LiCl)로 200rpm에서 단백질을 분리시켰다.
LiCl 현탁액을 16,000×g, 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 분리시킨 뒤 0.45um 필터에서 여과시킨 다음 6-8kDa의 cellulose membrane에 넣어 24시간 동안 투석시켜 세포표면단백질(SLP)를 수득하였다.
수득된 SLP를 -80℃에서 동결시킨 뒤 동결건조를 하여 얻은 분말을 멸균 3차 증류수에 용해시켜 실험에 사용하였다.
균주 단축명 출처
락토바실러스 케피어리 DH1 DH1 건국대학교 수의학대학 식품안전연구센터
락토바실러스 케피어리 DH3 DH3
락토바실러스 케피어리 DH5 DH5
류코노스톡 메센테로이데스 DH1604 LCM4
류코노스톡 메센테로이데스 DH1606 LCM6
류코노스톡 메센테로이데스 DH1607 LCM7
류코노스톡 메센테로이데스 DH1608 LCM8
류코노스톡 메센테로이데스 DH1609 LCM9
실험예 2: SLP의 세포독성 평가
Raw 264.7 세포를 한국 세포주 은행에서 구입하여 사용하였다. 세포를 96 well plate(Corning Inc.)를 이용하여, high glucose, pyruvate(Gibco), 10% 소태아혈청(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신(P/S, Gibco)을 함유하는 둘베코수정이글 배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium; DMEM)에서 1 x 104Cells/well 농도로 24시간 배양한 후, 10 또는 20μg/mL의 SLP 용액 또는 대조군인 PBS(Gibco) 용액으로 처리하였다.
24시간 후, PBS 내의 0.5mg/mL MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(Sigma-Aldrich) 20μL를 첨가하고, 어두운 조건에서 4시간 유지하였다. 이후, Well 플레이트를 1,500rpm으로 5시간 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. Well 내에 남은 포르마잔(formazan) 결정을 150μL의 디메틸 설폭사이드(대정화학)로 15분간 녹여내었다. 540nm에서의 흡광도를 Synergy HT Multi-microplate Reader(BioTek Instruments)로 측정하여 포르마잔 함량을 측정하였다. 결과를 세포생존율로 계산하여 도 1에 나타내었다.
도 1에서, 모든 SLP 농도에서 80% 이상의 생존율을 보여 케피어 유래 유산균으로부터 분리한 SLP가 독성을 가지지 않는 것을 확인하였다.
실험예 3: SLP의 염증 억제 및 면역 증진 특성 평가
Raw 264.7 세포를 24well plate(Corning Inc.)에서 10% FBS 1% P/S 처리된 DMEM배지에서 2.5 x 105cells/well 농도로 24시간 배양한 후, 10 또는 20μg/mL의 SLP 용액을 단독으로 또는 LPS(0.1μg/mL)와 복합적으로 처리하였다.
24시간 후, 상층 배지를 채취해 Mouse IL-6 ELISA Ready-SET-Go Kit를 이용하여 전염증 사이토카인 IL-6의 생성량을 측정하여 도 2에 나타내었다.
도 2(a) 및 (e)에서, DH1 및 LCM6의 경우 LPS 처리 없이 SLP만 단독으로 처리한 군에서 IL-6의 생성량 증가를 나타내어 선천적 면역 증진 효과가 나타난 것을 확인할 수 있다.
또한, DH5, LCM4, LCM7, LCM8 및 LCM9의 경우 LPS와 복합적으로 처리한 군에서 SLP를 처리함에 따라 IL-6가 감소되는 경향을 나타내었다. 특히, LCM7, LCM8 및 LCM9에서는 IL-6 생성량이 크게 감소하였으며, LCM9는 99% 이상의 IL-6 생성량 감소를 나타내어 가장 우수한 염증 억제 효과를 나타내었다.
실험예 4: 케피어 유래 유산균의 사균체의 염증 억제 활성 평가
본 발명의 SLP의 IL-6 생성 억제 효능을 비교하기 위하여, 실험예 4에서 우수한 IL-6 생성 억제 효능을 나타낸 LCM8 및 LCM9의 사균과의 비교시험을 수행하였다.
LCM8과 LCM9 사균은 Man Rogosa Sharpe (MRS) agar media에서 30℃에서 24시간 배양 후 생긴 콜로니를 saline용액을 넣어 모은 후 70℃에서 30분 열처리하여 사균화 하였다. 사균화한 후 saline용액을 넣어 9,900×g 4℃에서 5분간 원심분리를 한 후 동결건조하여 사용하였다.
상기 사균체를 실험예 3과 동일한 방법으로 실험한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서, LCM8 사균의 경우 10 및 20μg/mL의 농도에서 각각 약 41% 및 28%의 감소율을 나타내었으며, LCM9 사균에서는 20μg/mL에서 유의적으로 27%의 감소율을 나타내었다.
즉, 본 발명의 SLP는 사균체에 비하여 2배 내지 4배 이상의 IL-6 생성 억제 효능을 나타낸다는 것을 확인하였다.
실험예 5: SLP의 항염증 기전 규명
Raw 264.7 세포를 12well plate(Corning Inc.)에서 10% FBS 1% P/S 처리된 DMEM배지에서 5 x 105cells/well 농도로 24시간 배양한 후, 10 또는 20μg/mL의 LCM9 SLP 용액을 단독으로 또는 LPS(0.1μg/mL)와 복합적으로 처리하였다.
24시간 후, 상층액을 제거한 후 PBS로 두 번 세척하고 Lysis buffer를 넣고 스크랩퍼로 긁어모아 30분간 교반 배양한 뒤 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 pellet은 버리고 상층액만 새로운 튜브로 옮겨주었다.
Bradford assay로 단백질 농도를 정량분석한 뒤 SDS-PAGE로 분리해주고, 막을 5분 동안 메탄올에 활성화시킨 뒤 단백질이 분리된 gel과 겹쳐놓고 Transfer buffer와 cool pack을 채운 후 100V에서 1시간 동안 transfer 하였다.
단백질이 옮겨진 막을 5% 탈지우유 용액에서 30분 동안 블록킹해준 뒤 NF-κB p65 항체를 4℃에서 하루동안 반응시키고 HRP-연결된 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시켜 주었다.
막에 ECL 용액을 묻혀주고 Chemi Doc MP imaging system(Bio-Rad, USA)을 이용하여 반응정도를 측정하여 도 4에 나타내었다.
도 4에서, IL-6 생성량 감소율이 가장 높았던 LCM9의 NF-κB p65의 반응 측정 결과, LPS와 복합적으로 반응시킨 군에서 10 및 20μg/mL의 농도에 따라 각각 63% 및 94.3%의 억제를 나타내었다.
즉, 케피어 유래 유산균 LCM9에서 분리한 SLP가 NF-κB 염증경로에서 핵 내 전사인자인 p65의 억제를 통해 염증반응을 억제함으로써 염증 관련 질병을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 확인하였다.
실험예 6: SLP의 염증 억제 활성 물질확인
제조예 1에서 분리한 SLP 중에서 DH1, DH5, LCM6, LCM8 및 LCM9로부터 분리된 SLP를 3차 증류수에 용해시킨 후 SDS-PAGE를 통해 분자량을 확인하였다.
분리된 SLP를 3차 증류수에 용해시켜 Bradford assay를 이용하여 단백질 농도를 정량 분석한 후 시료를 동일한 농도로 희석하고 2x Laemmli sample buffer에 1:1 비율로 섞은 뒤 95℃에서 5분 동안 가열하고 SDS-PAGE를 이용하여 분리하였다. 분리된 단백질들을 Coomassie brilliant blue G-250를 사용하여 염색한 후 단백질 밴드를 확인하여 도 5에 나타내었다.
도 5에서, IL-6 생성 억제 활성이 우수한 것으로 나타난 DH5, LCM8 및 LCM9는 공통적으로 70kDa 부근에서 밴드를 갖는다는 것을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 케피어(Kefir) 유래 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유산균의 세포표면단백질(surface layer protein, SLP)을 포함하는 항염증용 기능성 식품으로서,
    NF-κp65 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항염증용 기능성 식품.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포표면단백질이 SDS-PAGE 측정시 약 70kDa에서 밴드를 갖는 것을 특징으로 하는, 항염증용 기능성 식품.
  5. 삭제
  6. 케피어(Kefir) 유래 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유산균의 세포표면단백질(surface layer protein, SLP)을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    NF-κp65 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 염증 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 근무력증, 대장염, 당뇨병, 비만, 뇌염 또는 알러지인 것을 특징으로 하는, 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.

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