KR101476399B1

KR101476399B1 - 아라자임을 유효성분으로 하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101476399B1
Application number: KR1020120084184A
Authority: KR
Inventors: 박호용; 손광희; 신동하; 이지숙; 김인식; 조한영
Original assignee: 주식회사 인섹트 바이오텍
Priority date: 2012-07-31
Filing date: 2012-07-31
Publication date: 2014-12-24
Also published as: KR20140017761A

Abstract

본 발명은 아라자임(Arazyme)을 유효성분으로 하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)가 생산하는 아라자임이 아토피 피부염에 관여하는 다양한 세포주에서 염증성 사이토카인 및 케모카인 분비, 세포고사, ROS 생성 및 부착분자 생성에 대해 억제 효과가 있어 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 화장품으로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

아라자임을 유효성분으로 하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 조성물 {A composition containing Arazyme for the prevention and treatment of Atopic Dermatitis}

본 발명은 아라자임(Arazyme)을 유효성분으로 하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)로부터 유래된 아라자임을 함유하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

아토피(atopy)는 '괴상한'의 의미의 라틴어 아토피아(atopia)에서 유래된 말로 1925년 코카(Coca)가 선천적으로 음식물과 흡입성 물질에 대한 알레르기 반응의 결과로 피부염이나 천식, 고초열이 나타나는 경향을 아토피라고 기술한 이후부터 쓰이게 된 피부질환으로서 아토피성 질환에는 아토피 피부염 이외에 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염 등이 있다. 아토피 피부염(Atopic dermatitis)은 전세계적으로 퍼져있는 일반적이고, 건조증, 강화 및 가려움증을 수반하는 만성적인 염증성의 피부 질환이다.

아토피 피부염의 정확한 병태생리는 아직까지 완전히 이해되고 있지 않으나 유전적 소인과 함께 면역학적, 환경학적 요인이 관여하리라고 생각되고 있으며, 특히 면역학적 관점에서 많은 연구가 진행되고 있다. 아토피 피부염을 앓고 있는 사람이 집 먼지, 진드기, 동물의 털, 음식물, 꽃가루 또는 곰팡이 등과 같이 외부환경의 이물질에 대해 알러지 반응을 나타내는 점과 또한 알러지성 비염, 천식 및 결막염 등을 동반한다는 점에서 면역 체계의 교란에 의해 발생하는 것으로 추정하고 있다.

아토피피부염은 특이적 알러지원(allergen)에 노출되는 경우 즉각 과민반응을 일으키는 IgE 항체를 형성할 수 있는 특징을 가지고 있다. 이러한 표현형의 발현은 복수 개의 유전적 인자가 관여하는 것으로 알려져 있다. 아토피 민감성 유전자에는 여러 HLA 클라스 II 분자들, IL-4 수용체 단백질 및 IgG 고친화성 수용체 단백질이 포함된다.

면역반응성 관점으로 각종 면역세포와 사이토카인이 관여한다. 아토피 피부염 환부에 침투한 알러지 유발물질을 섭취한 수지상 세포가 CD4+T 세포를 Th1 세포 또는 Th2 세포로 분화시킨다. 일반적으로 Th1 세포는 INF-γ를 분비하여 지연성 면역반응을 일으키며, Th2 세포는 IL-4를 분비하여 급성 면역반응을 일으킨다. Th2 세포에서 분비된 IL-4는 B 세포에 작용해 Ig 동종전환을 유도하여 IgE 생산을 촉진하여 IgE 세포는 비만세포를 자극하여 히스타민 분비를 증가시킨다. 아토피 피부염이 발생한 환부에는 대식세포, 비만세포 및 Th 림프구 등 면역관련 세포의 침윤이 크게 증가한다. 아토피 피부염 환자 중에서는 혈중 IgE 농도가 크게 상승하는데 그 이유는 Th2 세포의 수가 증가하며 이 세포가 분비한 IL-4가 B 림프구를 자극해 IgE 분비를 촉진하기 때문이다.

유전적인 소인은 약 70%의 아토피 피부염 환자는 아토피의 가족이 병력을 가지고 있다. 아기의 부모 중 한 사람이 알레르기를 앓으면 아기의 50%는 알레르기를 앓고 만일 부모 두 사람 모두 알레르기를 앓으면 아기는 75%로 증가한다.

아토피 피부염과 관련 증상으로는 얼굴이 창백해지는 것(facial pallor), 백색피부묘기증(white dermatographism), 각화증(keratosis), hyperlinear palm, 비늘버즘(ichthyosis) 및 눈과 눈 주위의 변화(ocular/periobital change) 등이 나타나며 그 외에도 입과 귀주위에 병변(perioral, periauricular lesion), 모낭주위가 두드러짐(perifollicular accentuation), 태선화(lichenification) 및 양진 병변(prurigo lesion)을 들 수 있다.

1995년 대한 소아과 알레르기 및 호흡기학회에서 시행한 전국적 역학 조사에 의하면 초등학생의 경우 12 ~ 24%, 중학생의 경우 6 ~ 8%에서 아토피 피부염으로 진단받은 적이 있으며, 2000년도에는 초등생의 24.9%, 중학생의 경우 6 ~ 8%에서 아토피 피부염을 진단받은 것을 비롯하여 성인 아토피 피부염도 국내에서 그 빈도가 점증하고 있다.

국내의 경우 아토피 피부염은 전체 인구의 0.5 ~ 1% 수준이며 특히 어린이의 경우 5 ~ 10%에게 고통을 주며 요즘은 아토피 피부염 관련 환자의 수는 더욱 증가하는 추세이다. 증상은 대체로 생후 2 ~ 6개월이며, 1세 미만에서 많이 나타나고 다섯 살 안에 85%가 나타난다. 보통 어릴 때 잠시 앓는 병이라고 알려져 있으며 50%는 두돌 이내에 없어지나 25%는 청소년까지 가며 나머지 25%는 성인이 되어도 나타난다. 최근 어린이는 물론 성인 아토피 피부염의 증가도 심각해지고 있으며, 심한 경우에는 취업 및 결혼 등 사회생활에 지장을 초래하기까지 하여 심각한 사회문제가 되고 있다. 이러한 경우 심하면 심각한 정신적 스트레스로 대인기피 및 우울증을 유발하기도 한다.

상기 아토피 피부염은 환자에게 육체적 및 정신적 고통과 함께 많은 경제적 피해를 끼치지만 아직까지 상기 질환을 치료하기 위한 특효약이 발견되어 있지 않으며 현재는 아토피 피부염 치료제로서는 스테로이드제 및 항히스타민제 등이 사용되나 이러한 약물을 장기간 사용하는 경우 심각한 부작용이 유발되므로 이들에 대체할 만한 천연물이 필요한 실정이다.

국내에서 알러지 질환 치료를 위해 소요된 비용이 2001년 1억 1천 6백만 달러이고, 상기에서 의료 보험으로 지급된 금액은 7천 3백만 달러에 달한다. 결과적으로 향후 아토피 피부염과 관련된 산업은 지속적으로 성장할 수 있다고 볼 수 있다.

아토피 때문에 생기는 다른 영향을 생각해서 여러 가지 새로운 치료방법이 연구되고 있는데, 국부적인 면역조절제로 타크리로무스(tacrolimus, Protopic) 또는 피메크로리무스(pimecrolimus, Elidel) 같은 것이 적용되고 있다. 그리고 카시뉴린 저해제(calcineurin inhibitors, TCIs)는 스테로이드보다 면역 억제 효과가 더 있어 보인다. 그리고 타크리로무스 또는 피메크로리무스도 2세 이상의 아기들에게 적용하여 효과가 있는 것으로 나타나고 있다.

기존의 아토피 피부염 치료제는 카시뉴린을 억제하여, 사이토카인(cytokine) 발현을 줄이는 시클로스포린(cyclosporin) 및 FK506 등이 개발되어 사용되고 있으나, 이들은 장기 사용 시 면역체계를 약화시켜 이차 감염증의 저항력이 떨어지고, 피부 가려움 및 소양증을 완화시키는 스체로이드(steroid) 계열의 외용 치료제들도 소아가 장기간 사용할 경우 면역력이 감소되어 성장이 저해되는 문제점이 있다. 현재 일부 학교 및 기업에서 아토피 피무염 치료제의 개발되고 있지만 병리학적 기전에 대응되는 물질 및 제품 개발보다는 막연히 피부의 보습효과를 강화하거나 피부에 저자극성 화장품 관련 아토피 개선 제품으로 개발되고 있는 실정이다.

한편, 본 발명자들은 새로운 단백질 분해효소를 개발하고자 노력한 결과, 한국산 무당거미(Nephila clavata)로부터 신규 미생물인 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3 균주(수탁번호: KCTC 0268BP; WO 01/57222호)를 분리하였으며, 본 균주로부터 신규한 단백질 분해효소인 아라자임을 분리하였다.　 아라자임은 저온과 높은 염 농도에서 안정된 단백질 분해 활성을 나타낼 뿐만 아니라 사람의 체온인 37 ℃에서 가장 높은 활성을 보였으며 넓은 pH 범위에서도 안정된 활성을 나타내는 것을 발견하고 본 단백질 분해효소의 유전자를 확인하였다(WO 01/57222호).

이에, 본 발명자들은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 균주에서 유래한 아라자임의 효과를 조사한 결과, 아라자임이 아토피 피부염에 관여하는 다양한 세포주에서 염증성 사이토카인 및 케모카인 분비, 세포고사, ROS 생성 및 부착분자 생성에 대해 억제 효과가 있음을 확인하여, 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 화장품으로서 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아라자임(Arazyme)을 유효성분으로 하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물, 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물 또는 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아라자임(Arazyme)을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 (Aranicola proteolyticus)가 생산하는 아라자임(Arazyme)은 THP-1, EoL-1 및 HaCaT 세포의 사이토카인 분비에 대한 탁월한 억제 효과와 HUVEC 세포에 대한 염증반응을 억제하므로 아토피 피부염의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 사람의 단핵구(monocyte)인 THP-1(human acute monocytic leukemia cell)에서 아라자임(Arazyme)에 대한 세포독성을 측정한 결과 아라자임을 처리하였을 때 80% 이상의 생존율을 보임을 확인한 그림이다.
도 2는 THP-1 세포에 아라자임을 처리하여 MCP-1을 확인한 결과 농도의존적으로 MCP-1의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 3은 THP-1 세포에 아라자임을 처리하여 IL-8을 확인한 결과 농도의존적으로 IL-8의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 4는 사람의 호산구(eosinophil)인 EoL-1(human eosinophilic leukemia cell)에서 아라자임에 대한 세포독성을 측정한 결과 아라자임을 처리하였을 때 80% 이상의 생존율을 보임을 확인한 그림이다.
도 5는 EoL-1 세포에 아라자임을 처리하여 MCP-1을 확인한 결과 농도의존적으로 MCP-1의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 6은 EoL-1 세포에 아라자임을 처리하여 IL-8을 확인한 결과 농도의존적으로 IL-8의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 7은 사람의 각질형성세포인 HaCaT 세포에서 아라자임에 대한 세포독성을 측정한 결과 아라자임을 처리하였을 때 80% 이상의 생존율을 보임을 확인한 그림이다.
도 8은 HaCaT 세포에 아라자임을 처리하여 TARC을 확인한 결과 농도의존적으로 TARC의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 9는 HaCaT 세포에 아라자임을 처리하여 MCP-1을 확인한 결과 농도의존적으로 MCP-1의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 10은 HaCaT 세포에 아라자임을 처리하여 IL-8을 확인한 결과 농도의존적으로 IL-8의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 11은 HaCaT 세포에 아라자임을 처리하여 IL-6을 확인한 결과 농도의존적으로 IL-6의 분비가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 12는 사람의 제대정맥내피세포인 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)에서 아라자임에 대한 세포독성을 측정한 결과 아라자임을 처리하였을 때 세포독성효과가 나타나지 않았음을 확인한 그림이다.
도 13은 HUVEC 세포에 아라자임을 처리하여 ROS를 확인한 결과 농도의존적으로 ROS의 생산이 억제됨을 확인한 그림이다.
도 14는 HUVEC 세포에 아라자임을 처리하여 세포고사를 확인한 결과 농도의존적으로 세포고사가 억제됨을 확인한 그림이다.
도 15는 HUVEC 세포에 아라자임을 처리하여 부착분자를 측정한 결과 아라자임에 의하여 VCAM01(A) 및 ICAM-1(B)의 발현이 억제됨을 확인한 그림이다.
도 16은 HUVEC 세포에 아라자임을 처리하여 NF-κB를 측정한 결과 아라자임에 의하여 활성화된 NF-κB가 VCAM01(A) 및 ICAM-1(B)에 의해 발현이 억제됨을 확인한 그림이다.
도 17은 HUVEC 세포에 아라자임을 처리하여 사이토카이닌 분비를 측정한 결과 아라자임에 의하여 VCAM01(A) 및 ICAM-1(B)의 분비량이 감소함을 확인한 그림이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 아라자임은

(a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(b) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 단백질;

(c) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질; 및

(d) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA에 의해 코딩되는 단백질이며, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 어느하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 혼성화를 엄격한 조건하에서 실시하면 상동성이 높은 염기 서열을 가진 DNA가 선별되어 결과적으로 분리되는 단백질에는 아라자임과 기능적으로 동일한 단백질이 포함될 가능성이 높아진다. 상동성이 높은 염기 서열이란 예를 들면, 서열번호 2에 기재된 염기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가진 서열을 의미한다. 또한 아미노산 서열은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 높은 상동성의 서열이라면 가능하다. 상기의 상동성 비율은 당업계의 당업자에 의해 선택된 보통의 알고리즘으로 결정될 수 있다. 상기 혼성화는 당해업계에 잘 알려진 엄격한 조건(Hames and Higgins, Eds . Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, U.K. , 1985)의 DNA-DNA 혼성화로 제공되며, 혼성화에서 엄격한 조건은 상기에서 언급하였듯이 혼성화 후 세정 시에 결정되나 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 아라자임은 다음과 같은 제조방법으로 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

1) 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 균주를 배양하여 배양액을 얻는 단계;

2) 상기 배양액을 여과하여 상등액을 얻는 단계; 및

3) 상등액 내에 포함된 상기 아라자임을 수지를 이용하여 정제하는 단계,

상기 제조방법에 있어서, 아라자임을 생산하는 미생물로서 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주를 이용하는 것이 바람직하며, 한국생명공학연구원 유전자은행에 1996년 7월 29일자로 기탁된 수탁번호 KCTC 0268BP호의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3를 이용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주는 거미 장내에서 분리한 호기성의 그람 음성 세균으로서, 0.5 ~ 0.8 ㎜ 크기의 구형이고 운동성을 가지고 있으며 카탈라아제(catalase)에는 양성 반응을, 옥시다아제(oxidase)에는 음성반응을 나타낸다(WO 01/57222호).

본 발명에서는 상기와 같은 방법으로 수득된 아라자임을 이용하는 것이 바람직하며, 하기와 같은 방법으로 생산된 아라자임을 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 아라니콜라 프로테오리티쿠스 균주의 배양을 위해서 사용하는 원료는 순수 정제시 보다 편하고 고순도의 결과물이 나올 수 있는 의약품 수준의 것이 바람직하며, 배양 후, 암모늄설페이트 침전(또는 아세톤 침전)을 수행한다. 이러한 암모늄설페이트 또는 아세톤 침전 후, 원심분리 및 여과를 통하여 아라자임만을 회수한다. 이는 미생물에서 생산이 되는 다른 대부분의 단백질은 아라자임과 침전 농도가 다른 것을 이용한 것이다. 아라자임을 회수한 후, 막여과를 이용한 1차 불순물의 정제 및 한외 여과기를 이용하여 마지막으로 순수 분리 정제하고 이렇게하여 수득된 용액 상태의 고농도 아라자임을 동결 건조기를 통해 파우더 타입으로 제조한 것을 이용한다.

또한, 본 발명은 하기와 같은 방법으로 제조된 아라자임을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

1) 아라자임의 코딩 영역을 포함하는 염기 서열의 DNA를 발현 벡터에 클로닝하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 클로닝된 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계;

3) 상기 단계 2)에서 형질전환된 숙주 세포를 선별하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)에서 선별된 숙주 세포에서 발현된 아라자임을 수득하는 단계,

상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 아라자임의 코딩 영역을 포함하는 염기 서열은 서열번호 2에 기재된 것, 서열 번호 2에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA라면 바람직하다. 엄격한 조건은 혼성화 후 세정 시에 결정된다. 엄격한 조건 중의 하나는 상온에서 6 × SSC, 0.5% SDS로 15분 세정한 뒤 45℃에서 2 × SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정하고, 50 ℃에서 0.2 × SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정을 두 번 반복한다. 더 바람직한 엄격한 조건은 더 높은 온도를 이용하는 것이다. 상기 엄격한 조건의 다른 부분은 동일하게 수행하되 마지막의 두 번의 30분은 60℃에서 0.2 × SSC, 0.5% SDS로 세정한다. 또 다른 엄격한 조건은 상기 엄격한 조건에서 마지막 두 번을 65 ℃에서 0.1 × SSC, 0.1% SDS로 세정하는 것이다. 당업자라면 필요한 엄격한 조건을 얻기 위하여 이러한 조건을 명백히 설정할 수 있다. 또한, 발현 벡터로는 당업계에 널리 알려진 그람 음성세균 또는 그람 양성세균 등, 상업적으로 이용가능한 벡터를 이용할 수 있으며 스크리닝을 위한 약제 내성 유전자가 도입되면 바람직하다. 아라자임 유전자에 어떤 영향을 주지 않는다면, 어떠한 벡터라도 무방하다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 2)의 숙주 세포로는 세균인 E. coli 및 Bacillus subtilis 등이 있으며, 효모인 Saccharomyces cerevisiae , Candia 및 Phicia로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 3)의 형질전환된 숙주 세포의 선별은 벡터로 도입한 약제 내성 유전자를 이용한 스크리닝과 서던 블랏팅(Southern blotting) 또는 PCR을 이용한 스크리닝을 병용하여 선별하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 4)에서 수득된 아라자임은 단백질의 어떠한 정제 방법에 따라서 정제된 것이더라도 실질적으로 정제된 단백질이라면 모두 포함될 수 있다. 상기 정제된 단백질은 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴 아마이드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석 또는 재결정 등을 적절히 선택 또는 조합하여 실질적으로 정제된 단백질인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 DNA로부터 코딩되는 아라자임은 당업자에게 널리 알려진 단백질 발현계를 이용하여 얻을 수 있다. 또한, 아라자임을 발현하는 세포의 배양물로부터 회수·정제될 수 있다.

본 발명자들은 아라자임이 세포독성이 있는지 알아보기 위하여 아토피 피부염에 관여하는 세포주인 THP-1, EoL-1, HeCaT 및 HUVEC에 아라자임을 처리하여 THP-1, EoL-1, HeCaT 및 HUVEC에 처리하여 배지에 배양한 후 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 80% 이상의 세포생존율을 나타냄으로써 세포독성이 거의 없는 안전한 물질임을 확인하였다(도 1, 도 4, 도 7 및 도 12 참조).

또한, 본 발명자들은 아토피 피부염에 관여하는 세포주인 THP-1, EoL-1 및 HeCaT에 아라자임을 처리하여 염증성 사이토카인 및 케모카인 분비를 확인하였다. 그 결과, 농도 의존적으로 MCP-1 및 IL-8의 분비가 억제되어 염증성 사이토카인 및 케모카인의 억제 효과를 확인하였다(도 2, 도 3, 도 5, 도 6, 도 9 및 도 10 참조). 추가적으로 HeCaT에서 농도 의존적으로 TARC 및 IL-6의 분비가 억제되어 염증성 사이토카인 및 케모카인의 억제 효과도 확인하였다(도 8 및 도 11 참조).

또한, 본 발명자들은 아토피 피부염에 관여하는 세포주인 HUVEC에 아라자임을 처리하여 효과 분석하기 위하여 ROS, 세포고사, 부착분자 및 NF-kB 측정을 하였다. 그 결과, ROS 및 세포고사가 억제되었고, 부착분자의 발현을 측정한 결과 VCAM-1(A)와 ICAM-1(B)의 발현이 억제되었으며, 활성화된 NF-kB가 VCAM-1(A)와 ICAM-1(B)에 의해 발현이 감소하였고, 사이토카이닌 분비을 측정한 결과 VCAM-1(A)와 ICAM-1(B)의 분비량이 감소함을 확인하여 염증성 사이토카인, 케모카인 분비, 세포고사, ROS 생성 및 부착분자 생성에 있어 억제 효과를 확인하였다(도 13, 도 14, 도 15, 도 16 및 도 17 참조).

따라서, 본 발명의 아라자임은 아토피 피부염에 관여하는 세포주에서 사이토카이닌 분비에 대한 탁월한 억제 효과 및 염증반응을 억제하므로 아토피 피부염의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 아라자임에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 산제, 정제, 캡슐제, 환, 과립 또는 주사액제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 아라자임의 일일 투여량은 0.01 ~ 5000 ㎎/㎏ 이며, 바람직하게는 0.01 ~ 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물 건강식품을 제공한다.

본 발명의 아라자임을 식품 첨가물로 이용할 경우, 상기의 아라자임을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 이용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 이용될 수 있다. 아라자임은 상기와 같은 동일한 방법으로 수득하여 이용한다. 유효성분의 혼합양은 이용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 아라자임은 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량부, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량부의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 이용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 이용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 음료 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 아라자임은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 이용되는 탄산화제 등에 첨가할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육에도 아라자임을 첨가할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 이용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 아라자임 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 피부외용제를 제공한다.

상기 피부외용제로 사용되는 적합한 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고 또는 스프레이의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

상기 피부외용제는 아라자임에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

아울러, 본 발명은 아라자임을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C 또는 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염(티아민염산염 또는 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염 또는 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 및, 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파 토코페롤, 니코틴산 dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올 또는 판토테닐에틸에테르 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴 또는 케라틴이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염(나트륨염 등)이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 갈조 엑기스, 홍조 엑기스 또는 녹조 엑기스이 바람직하고, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨 또는 아르긴산칼륨이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있다. 상기 다른 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제 또는 정제수가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지 또는 식물 유지가 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴 또는 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스 또는 와셀린 등의 탄화 수소계 유지가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유 또는 아미노 변성 실리콘유가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린 또는 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자 또는 지용성 고분자가 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n=2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n=2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n=2 이상), 락트산 또는 락트산염이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤 또는 콜레스테롤에스테르가 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산 또는 덱스트린 이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르 또는 고분자 실리콘이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산 또는 라놀린지방산콜레스테릴에스테르가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제 또는 양성 계면 활성제가 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEPOP (폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드 또는 수소첨가대두인지질이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염 또는 퍼플루오로알킬인산에스테르가 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드 또는 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형 또는 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우 또는 CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산; 또는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠스티렌 공중합체 또는 사불화에틸렌가 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-3차-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진 또는 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301호, 모노니트로과이어콜나트륨 또는 운데시렌산이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필 또는 엘리소르빈산이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨 또는 인산일수소나트륨이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 0.01 ~ 5% 중량 백분율로 배합되는 것이 바람직하고, 0.01 ~ 3% 중량 백분율로 배합되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물은 용액, 유화물 또는 점성형 혼합물의 형상을 취할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 본 발명의 화합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액 또는 모발화장료로 제조될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 또는 바디클린저의 제형을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연이 이용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트가 이용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유도체, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 아라자임 ( Arazyme )의 제조

본 발명의 유효성분인 아라자임(Arazyme)을 제조하기 위하여, 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주(KCTC 0268BP)를 배양배지(박토 트립톤 0.5%, 효모 추출물 0.5%, 염화 나트륨 0.1%, 염화 칼륨 0.05%, 염화 칼슘 0.02% 및 황산 마그네슘 0.02%에서 22℃로 18 시간 동안 배양하였다. 배양액을 2 ㎛ 막여과를 이용해서 균체와 상등액을 분리한 다음 분리된 상등액을 10 kDa의 막 여과를 이용하여 농축하였다.　 본 발명의 아라자임은 기본적으로 음이온의 특성을 가지므로 농축액을 50 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 전처리한 DEAE-셀룰로오즈(DEAE-cellulose)를 이용한 이온 교환 수지(ion exchange resin)와 20 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 전처리한 세파덱스 G-75(Sephadex G-75)를 이용한 젤 여과 교환수지(gel filtration exchange resin)를 이용해 정제를 했다.　 정제된 효소액은 10% SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)로 전기영동(electrophoresis)을 하여 밴드 경향을 확인하였는데 그 결과 본 발명의 아라자임은 소단위를 갖지 않는 단일체(monomer)로서 약 51.5 kDa의 분자량을 갖는 밴드를 나타냄을 확인하였다.　 단, 아라자임 생산을 위한 아라니콜라 프로테오리티쿠수 HY-3 균주(KCTC 0268BP)는 다양한 산업용 배지에서 생산을 할 수 있으며 생산된 배양액 또한 다양한 방법으로 분리 및 정제하여 이용할 수 있다. 본 발명의 아라자임은 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드 서열을 가지며, 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 가진다.

< 실험예 1> 아라자임의 세포주 THP -1에 대한 효과 분석

<1-1> THP -1 세포 배양 및 세포 독성 측정

사람의 단핵구(monocyte)인 THP-1(human acute monocytic leukemia cell; 미국세포주은행)를 2.0 x 10⁵/ml로 RPMI 1640 배지, 항생물질[페니실린(penicillinm) 104 U/㎖, 스트렙토마이신(streptomycin) 10 mg/㎖, 암포테리신(amphotericin) B 25 ㎍/㎖]과 10% FBS를 넣고, 배양기에서 3일간 배양하였다. THP-1 세포에 아라자임을 1, 10, 20 및 50 μg/ml 로 각각 처리한 후, 24시간 뒤 MTT assay를 이용하여 세포 독성을 측정하였다.

THP-1, EoL-1, HaCaT 및 HUVEC 세포에서 <실시예 1>을 이용하여 제조한 아라자임(Arazyme)이 세포 독성 및 증식에 관여하는지 확인하기 위해 MTT 측정법(Roche, Penzberg, Germany)을 이용하였다. 세포는 5×10⁴ cells/100 ㎕의 농도로 배양액에 부유하여 96 웰 플레이트에 분주한 다음 다양한 농도의 <실시예 1>을 이용하여 제조한 아라자임(Arazyme)(1 μM ~ 50 μM)을 24시간 동안 처리하였다. 이후 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 10 ㎕ 첨가하여 37℃ 및 5% CO₂ 배양기에서 4시간을 배양한 다음 100 ㎕의 MTT 용해액을 추가로 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO₂ 배양기에서 하루 동안 방치한 다음 550 nm에서 흡광도를 측정하였다

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 약 80% 이상의 생존률을 보임을 확인하였다(도 1).

<1-2> THP -1 세포에서의 MCP -1 및 IL -8 측정

아토피 피부염에 관여하는 THP-1 세포주에 사이토카인 및 염증성 마커(maker)인 MCP-1 및 IL-8을 처리하여 효과를 분석하였다.

THP-1 세포를　0. 5% FBS가 든 RPMI에 2.0 x 10⁶/m로 24 웰 플레이트에 분주한 후 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 16시간 배양하였다. 배양 후 아라자임의 최종 농도 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖을 1시간 동안 처리한 후 HDE(1 ㎍/㎖)를 각각 24시간 동안 처리한 다음, ELISA를 이용하여 상층액에서 MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1) 및 IL-8의 양을 측정하였다.

그 결과, THP-1에 마이트(Mite) 20 μg/ml를 처리하면 MCP-1이 분비되었고, THP-1에 아라자임을 1, 10, 20 및 50 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 마이트로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 MCP-1을 측정한 결과 농도의존적으로 MCP-1의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 2).

또한, THP-1 세포에서의 아라자임에 대한 IL-8 분비 측정한 결과 THP-1(사람의 단핵구세포)에 마이트 20 μg/ml를 처리하면 MCP-1이 분비되었다. THP-1에 아라자임을 1, 10, 20 및 50 μg/ml 로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 마이트로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 IL-8를 측정한 결과 농도의존적으로 IL-8의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 3).

< 실험예 2> 아라자임의 세포주 EoL -1에 대한 효과 분석

<2-1> EoL -1 세포배양 및 독성 측정

사람의 호산구(eosinophil)인 EoL-1(human eosinophilic leukemia cell; Riken Cell Bank, Japan)를 2.0 x 10⁵/ml로 RPMI 1640 배지, 항생물질[페니실린(penicillinm) 104 U/㎖, 스트렙토마이신(streptomycin) 10 mg/㎖, 암포테리신(amphotericin) B 25 ㎍/㎖]과 10% FBS를 넣고, 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 3일간 배양하였다. EoL-1 (사람의 호산구 세포) 세포에 아라자임을 1, 10, 20 및 50 μg/ml로 각각 처리한 후, 24시간 뒤 MTT assay를 이용하여 세포 독성을 측정하였다.

그 결과 도 4에 나타난 바와 같이 약 80% 이상의 생존률을 보임을 확인하였다(도 4).

<2-2> EoL -1 세포에서의 MCP -1 및 IL -8 측정

EoL-1세포를　10% FBS가 든 RPMI에 7.0 x 10⁵/ml로 24 웰 플레이트에 분주한 후 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 16시간 배양하였다. 배양 후 <실시예 1>을 이용하여 제조한 아라자임(최종 농도 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖)를 1시간 동안 처리한 후 마이트(20 ㎍/㎖)를 각각 24시간 동안 처리한 다음, ELISA를 이용하여 상층액에서, MCP-1, IL-6 및 IL-8의 양을 측정하였다.

그 결과, EoL-1에 마이트 20 μg/ml를 처리하면 MCP-1이 분비되었다. EoL-1에 아라자임을 1, 10, 20 및 50 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 마이트로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 MCP-1을 측정한 결과 농도의존적으로 MCP-1의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 5).

또한, EoL-1(사람의 호산구세포)에 마이트 20 μg/ml를 처리하면 IL-8이 분비되었다. EoL-1에 배양 후 <실시예 1>을 이용하여 제조한 아라자임(Arazyme)을 1, 10, 20 및 50 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 마이트로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 IL-8을 측정한 결과 농도의존적으로 IL-8의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 6).

< 실험예 3> 아라자임의 세포주 HaCaT 에 대한 효과 분석

<3-1> HaCaT 세포배양 및 세포독성 테스트

사람의 각질형성세포인 HaCaT(오비엠랩)를 2.0 x 10⁵/ml로 DMEM 배지, 항생물질[페니실린(penicillinm) 104 U/㎖, 스트렙토마이신(streptomycin) 10 mg/㎖, 암포테리신(amphotericin) B 25 ㎍/㎖]과 10% FBS를 넣고, 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 3일간 배양하였다. HaCaT (사람의 각질형성세포)세포에 배양 후 <실시예 1>을 이용하여 제조한 아라자임(Arazyme)을 1, 5, 10 및 20 μg/ml로 각각 처리한 후, 24시간 뒤 MTT assay를 이용하여 세포 독성을 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 아라자임은 5 μg/ml 이하의 농도에서 약 80% 이상의 생존하였다(도 7).

<3-2> HaCaT 세포에서의 MCP -1, IL -6, IL -8 및 TARC 측정

HaCaT 세포를　10% FBS가 든 DMEM에 1.5 x 10⁵/ml로 24 웰 플레이트에 분주한 후 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 16시간 배양하였다. 배양 후 <실시예 1>을 이용하여 제조한 아라자임(Arazyme)(최종 농도 1 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖)를 1시간 동안 처리한 후 IFN-γ(10 ng/ ㎖)과 TNF-α(10 ng/ ㎖)를 각각 24시간 동안 처리한 다음, ELISA를 이용하여 상층액에서, MCP-1, IL-6, IL-8 및 TARC의 양을 측정하였다.

그 결과, HaCaT cells에 IFN-γ와 TNF-α를 처리하면 TARC가 분비되었다. HaCaT 세포에 아라자임을 1, 2 및 5 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 IFN-γ와 TNF-α 로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 TARC를 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 TARC의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 8).

또한, HaCaT 세포에 IFN-γ와 TNF-α를 처리하면 MCP-1이 분비되었다. HaCaT 세포에 아라자임을 1, 2 및 5 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 IFN-γ와 TNF-α로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 MCP-1을 측정한 결과 농도의존적으로 MCP-1의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 9).

또한, HaCaT 세포에 IFN-γ와 TNF-α를 처리하면 IL-8이 분비되었다. HaCaT 세포에 아라자임을 1, 2 및 5 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 IFN-γ와 TNF-α로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 IL-8을 측정한 결과 농도의존적으로 IL-8의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 10).

아울러, HaCaT 세포에 IFN-γ와 TNF-α를 처리하면 IL-6가 분비되었다. HaCaT 세포에 아라자임을 1, 2 및 5 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤 IFN-γ와 TNF-α로 활성화시켜 24시간 뒤 ELISA를 이용하여 상층액에서 IL-6를 측정한 결과 농도의존적으로 IL-6의 분비가 억제됨을 확인하였다(도 11).

< 실험예 4> 아라자임의 세포주 HUVEC 에 대한 효과 분석

<4-1> HUVEC 세포배양 및 세포독성 결과

사람의 제대정맥내피세포인 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell, ATCC)를 5 x 10⁴ cells/ml로 EGM-2 배지에 2% FBS를 넣고, 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 배양하였다. HUVEC에 아라자임을 1, 5, 10 및 20 μg/ml로 각각 처리한 후, 24시간 뒤 MTT assay를 이용하여 세포생존율을 측정하였다.

그 결과 도 12에 나타낸 바와 같이 세포독성효과가 나타나지 않았음을 확인하였다(도 12).

<4-2> HUVEC 의 ROS 측정

HUVEC 세포를 2% FBS가 든 EGM-2 배지에 4 x 10⁴/ml로 24 웰 플레이트에 분주한 다음 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 24시간 배양하였다. 배양 후 아라자임의 최종 농도 20 ㎍/㎖을 1시간 동안 처리한 후 LPS (10 ㎍/㎖)를 각각 1 시간 동안 처리한 다음 10 μM 2’,7'-dichlorofluorescein diacetate(DCFCA)를 첨가하였다. 실온에서 5분 방치한 다음 525 nm의 파장에서 형광세기를 측정하였다. HUVEC에 LPS을 10 μg/ml로 처리하면 ROS가 생산되었다. HUVEC에 <실시예 1>을 이용하여 제조한 아라자임(Arazyme)을 20 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤에 LPS를 첨가하여 다시 1시간 배양한 다음 유세포분석기를 이용하여 생산된 ROS의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 아라자임에 의하여 ROS 생산이 억제됨을 확인하였다(도 13).

<4-3> HUVEC 의 세포고사 측정

HUVEC 세포를 2% FBS가 든 EGM-2 배지에 4x 10⁴/ml로 24 웰 플레이트에 분주한 다음 배양기(37 ℃ 및5% CO₂)에서 24시간 배양하였다. 배양 후 A, B (최종 농도 1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 및 20 ㎍/㎖)을 1시간 동안 처리한 후 LPS (10 ㎍/㎖)를 각각 24 시간 동안 처리한 다음 아넥신(annexin)-V-FITC와 요오드화 프리미디엄(propidium iodide, PI) 염색하였다. 세포고사는 유세포분석기(FACS)를 통해 아넥신-V-FITC가 염색된 세포의 비율로 확인하였다. HUVEC에 LPS (10 μg/ml)를 처리하면 세포고사가 유도된다. HUVEC에 아라자임을 20 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤에 LPS를 첨가하여 다시 24시간 배양한 다음 유세포분석기를 이용하여 세포고사를 측정하였다.

그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이 세포고사가 억제됨을 확인하였다(도 14).

<4-4> HUVEC 의 부착분자 측정

HUVEC 세포를 2% FBS가 든 EGM-2 배지에 4 x 10⁴/ml로 24 웰 플레이트에 분주한 다음 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 24시간 배양하였다. 배양 후 아라자임의 최종 농도 20 ㎍/㎖를 1시간 동안 처리한 후 LPS(10 ㎍/㎖)를 각각 24 시간 동안 처리한 다음 부착분자인 VCAM-1과 ICAM-1의 항체를 첨가하여 반응시키고 유세포 분석기를 통해 각각의 항체가 결합된 세포를 측정하였다. HUVEC에 LPS(10 μg/ml)를 처리하면 부착분자인 VCAM-1과 ICAM-1의 발현이 증가하였다. HUVEC에 아라자임 20 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤에 LPS를 첨가하여 다시 24 시간 배양한 다음 유세포분석기를 이용하여 부착분자의 발현을 측정하였다.

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 아라자임에 의해 VCAM-1(A)와 ICAM-1(B)의 발현이 억제됨을 확인하였다(도 15).

<4-5> HUVEC 의 NF - kB 활성화 측정

HUVEC 세포를 2% FBS가 든 EGM-2 배지에 4 x 10⁴/ml로 24 웰 플레이트에 분주한 다음 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 24시간 배양하였다. 배양 후 아라자임의 최종 농도 20 ㎍/㎖을 1시간 동안 처리한 후 LPS (10 ㎍/㎖)를 각각 24 시간 동안 처리한 다음 세포 핵막 내에서 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질에서 NF-kB 효소 활성도를 측정하기 위해 형광물질이 표지된 기질을 이용하여 형광분석기를 통해 측정하였다. HUVEC에 LPS (10 μg/ml)를 처리하면 NF-kB가 활성화가 증가하였다. HUVEC에 아라자임을 20 μg/ml로 처리한 후, 1시간 뒤에 LPS를 첨가하여 다시 24시간 배양한 다음 형광분석기를 이용하여 NF-kB의 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이 활성화된 NF-kB가 VCAM-1(A)와 ICAM-1(B)에 의해 감소함을 확인하였다(도 16).

<4-6> HUVEC 의 사이토카인 분비 측정

HUVEC 세포를 2% FBS가 든 EGM-2 배지에 4 x 10⁴/ml로 24 웰 플레이트에 분주한 다음 배양기(37 ℃ 및 5% CO₂)에서 24시간 배양하였다. 배양 후 아라자임의 최종 농도 20 ㎍/㎖을 1시간 동안 처리한 후 LPS (10 ㎍/㎖)를 각각 24 시간 동안 처리한 다음 사이토카인 양을 측정하였다. HUVEC에 LPS(10 μg/ml)를 처리하면 MCP-1과 IL-6의 분비가 증가하였다. HUVEC에 아라자임을 20 μg/ml로 각각 처리한 후, 1시간 뒤에 LPS를 첨가하여 다시 24시간 배양한 다음 ELISA를 실시하여 MCP-1과 IL-6의 분비량을 측정하였다.

그 결과 도 17에 나타낸 바와 같이 MCP-1(A)과 IL-6(B)에서 모두 감소함을 확인하였다(도 17).

< 제제예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

아라자임 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

아라자임 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

아라자임 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

아라자임 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

아라자임 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

<1-6> 주사액제의 제조

아라자임 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지

주이용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 아라자임을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

< 제제예 2> 식품의 제조

상기 제제예 1의 산제, 정제, 캡슐제, 환 및 과립을 식품에 응용하여도 무방하며, 상기의 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

<2-1> 밀가루 식품의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 10.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 통상의 방법으로 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

<2-2> 스프 및 육즙( gravies )의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 1.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

<2-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 10 중량부를 그라운 비프에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

<2-4> 유제품( dairy products )의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 ~ 1.0 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 통상의 방법으로 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-5> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 진공 농축기에서 감압, 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 통상의 방법으로 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임의 건조분말(1 중량부),

영지(0.5 중량부),

지황(0.5 중량부)

< 제제예 3> 음료의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임을 포함하는 음료를 다음과 같이 제조하였다.

<3-1> 건강음료의 제조

액상과당(0.5 중량부), 올리고당(2 중량부), 설탕(2 중량부), 식염(0.5 중량부), 물(75 중량부)과 같은 부재료와 아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임(0.5 중량부)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후, 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

<3-2> 야채쥬스의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.5 g을 토마토 또는 당근 등의 야채의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

<3-3> 과일쥬스의 제조

아라니콜라 프로테오리티쿠스의 배양액 또는 이로부터 분리된 아라자임 0.1 g을 사과 또는 포도 등의 과일의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

< 제조예 4> 화장품의 제조

<4-1> 유화 제형의 화장품 제조

하기 [표 1]에 기재된 조성으로 유화제형의 화장품을 제조하였다. 제조 방법은 하기와 같다.

1) 1 내지 9의 원료를 혼합한 혼합물을 65∼70℃로 가열하였다.

2) 10의 원료를 상기 단계 1)의 혼합물에 투입하였다.

3) 11 내지 13의 원료의 혼합물을 65∼70℃로 가열하여 완전히 용해시켰다.

4) 상기 단계 3)을 거치면서, 상기 2)의 혼합물을 서서히 첨가하여 8,000 rpm에서 2∼3분간 유화시켰다.

5) 14의 원료를 소량의 물에 용해시킨 후 상기 단계 4)의 혼합물에 첨가하고 2분간 더 유화시켰다.

6) 15 내지 17의 원료를 각각 평량한 후 상기 단계 5)의 혼합물에 넣고 30초간 더 유화시켰다.

7) 상기 단계 6)의 혼합물을 유화 후 탈기과정을 거쳐 25∼35℃로 냉각시킴으로써 유화제형의 화장품을 제조하였다.

유화 제형 1, 2, 3의 조성

조성		유화제형 1	유화제형 2	유화제형 3
1	스테아린 산	0.3	0.3	0.3
2	스테알리 알콜	0.2	0.2	0.2
3	글리세릴 모노스테아레이트	1.2	1.2	1.2
4	밀납	0.4	0.4	0.4
5	폴리옥시에틸렌솔비탄 모노라우린산 에스테르	2.2	2.2	2.2
6	파라옥시안식향산 메틸	0.1	0.1	0.1
7	파라옥시안식향산 프로필	0.05	0.05	0.05
8	세틸에틸헥사노에이트	5	5	5
9	트리글리세라이드	2	2	2
10	사이클로메티콘	3	3	3
11	증류수	~ 100	~ 100	~ 100
12	농글리세린	5	5	5
13	트리에탄올아민	0.15	0.15	0.15
14	폴리아크릴산 중합체	0.12	0.12	0.12
15	색소	0.0001	0.0001	0.0001
16	향	0.10	0.10	0.10
17	아라자임	0.0001	1	10

<4-2> 가용화 제형의 화장품 제조

하기 [표 2]에 기재된 조성으로 가용화 제형의 화장품을 제조하였다. 제조 방법은 하기와 같다.

1) 2 내지 6의 원료를 1의 원료(정제수)에 넣고 아직믹서를 이용하여 용해시켰다.

2) 8 내지 11의 원료를 7의 원료(알코올)에 넣고 완전용해시켰다.

3) 상기 단계 2)의 혼합물을 상기 단계 1)의 혼합물에 서서히 첨가하면서 가용화시켰다.

가용화 제형 1, 2, 3의 조성

조성		가용화 제형 1	가용화 제형 2	가용화 제형 3
1	정제수	~ 100	~ 100	~ 100
2	농글리세린	3	3	3
3	1,3-부틸렌글리콜	2	2	2
4	EDTA-2Na	0.01	0.01	0.01
5	색소	0.0001	0.0002	0.0002
6	아라자임	0.1	5	5
7	알코올(95%)	8	8	8
8	파라옥시안식향산 메틸	0.1	0.1	0.1
9	폴리옥시에틸렌 하이드로제네이디트에스테르	0.3	0.3	0.3
10	향	0.15	0.15	0.15
11	사이클로메티콘	-	-	0.2

<110> Insect Biotech Co., Ltd. <120> A composition containing Arazyme for the prevention and treatment of Atopic Dermatitis <130> 12p-05-54 <160> 2 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 487 <212> PRT <213> Aranicola proteolyticus <220> <221> BINDING <222> (192) <223> Zn binding site <220> <221> BINDING <222> (196) <223> Zn binding site <220> <221> BINDING <222> (323) <223> Zn binding site <400> 1 Met Gln Ser Thr Lys Lys Ala Ile Glu Ile Thr Glu Ser Ser Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ser Ser Ala Tyr Asn Ala Val Asp Asp Leu Leu His Tyr His 20 25 30 Glu Arg Gly Asn Gly Ile Gln Val Asn Gly Lys Asp Ser Phe Ser Thr 35 40 45 Glu Gln Ala Gly Leu Phe Ile Thr Arg Glu Asn Gln Thr Trp Asn Gly 50 55 60 Tyr Lys Val Phe Gly Gln Pro Val Lys Leu Thr Phe Ser Phe Pro Asp 65 70 75 80 Tyr Lys Phe Ser Ser Thr Asn Val Ala Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys 85 90 95 Phe Ser Ala Glu Gln Gln Gln Gln Ala Lys Leu Ser Leu Gln Ser Trp 100 105 110 Ser Asp Val Ala Asn Ile Thr Phe Thr Glu Val Gly Ala Gly Gln Lys 115 120 125 Ala Asn Ile Thr Phe Gly Asn Tyr Ser Gln Asp Arg Pro Gly His Tyr 130 135 140 Asp Tyr Asp Thr Gln Ala Tyr Ala Phe Leu Pro Asn Thr Ile Tyr Gln 145 150 155 160 Gly Gln Asn Leu Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Asn Val Asn Gln Ser Asn 165 170 175 Val Lys His Pro Ala Ser Glu Asp Tyr Gly Arg Gln Thr Phe Thr His 180 185 190 Glu Ile Gly His Ala Leu Gly Leu Ser His Pro Gly Asp Tyr Asn Ala 195 200 205 Gly Glu Gly Asn Pro Thr Tyr Arg Asp Ala Ser Tyr Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Arg Glu Phe Ser Leu Met Ser Tyr Trp Ser Glu Thr Asn Thr Gly Gly 225 230 235 240 Asp Asn Gly Gly His Tyr Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp Asp Ile Ser 245 250 255 Ala Ile Gln His Leu Tyr Gly Ala Asn Gln Thr Thr Arg Thr Gly Asp 260 265 270 Thr Val Tyr Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Ser Thr 275 280 285 Thr Ser Asn Pro Gln Lys Val Ile Phe Ala Ala Trp Asp Ala Gly Gly 290 295 300 Asn Asp Thr Phe Asp Phe Ser Gly Tyr Thr Ala Asn Gln Arg Ile Asn 305 310 315 320 Leu Asn Glu Lys Ser Phe Ser Asp Val Gly Gly Leu Lys Gly Asn Val 325 330 335 Ser Ile Ala Ala Gly Val Thr Ile Glu Asn Ala Ile Gly Gly Ser Gly 340 345 350 Asn Asp Val Ile Val Gly Asn Ala Ala Asn Asn Val Leu Lys Gly Gly 355 360 365 Ala Gly Asn Asp Val Leu Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Glu Leu Trp 370 375 380 Gly Gly Ala Gly Lys Asp Thr Phe Val Phe Ser Ala Val Ser Asp Ser 385 390 395 400 Ala Pro Gly Ala Ser Asp Trp Ile Lys Asp Phe Gln Lys Gly Ile Asp 405 410 415 Lys Ile Asp Leu Ser Phe Phe Asn Gln Gly Ala Gln Gly Gly Asp Gln 420 425 430 Ile His Phe Val Asp His Phe Ser Gly Ala Ala Gly Glu Ala Leu Leu 435 440 445 Ser Tyr Asn Ala Ser Asn Asn Val Ser Asp Leu Ala Leu Asn Ile Gly 450 455 460 Gly His Gln Ala Pro Asp Ile Leu Val Lys Ile Val Gly Gln Val Asp 465 470 475 480 Val Ala Thr Asp Phe Ile Val 485 <210> 2 <211> 2481 <212> DNA <213> Aranicola proteolyticus <400> 2 cgagcgcgaa agacccggaa ggcacgaggt gattagtcaa aaaaagaaaa tgttattcct 60 gcgggaacta aaaagtaccg gcggctaata ataaagagtt attaatctat aacgctttag 120 ccaaatttaa cttttagccg tctaaatccc agcacgattc gcttggctct gcaggccgca 180 tttttgttgg agtttgttac caactcatgg catttaagtt tcattaatat tgtaaataat 240 gcaaaaaacc agcataaatc cccttcgtaa cgataataaa tggctgatta ttttatgtgc 300 agttttacac cgctgcctat aattggaatc gattaccatt tatggtggta atcttatttg 360 ctgatatata tgcattaatt ctctctaaca cactgccggt ancggcgcat aaactccttc 420 ccgtaagcgt gcggttcgtt ctccgtggct tcctggcagg ttatgtctat ctgtctgatt 480 gaaaccaatc agctaatgag tggaatcgaa ccaatgcaat ctactaaaaa ggcaattgaa 540 attactgaat ccagccttgc ggctgcgagc tccgcttaca atgcagtaga tgatttgctg 600 cattatcatg agcgaggcaa cgggattcag gttaatggca aggactcatt ttctaccgaa 660 caagccgggc tgtttattac ccgcgagaac caaacctgga acggttataa agtttttggc 720 caaccggtta aattaacgtt ctctttcccg gattataaat tctcttccac caacgtcgcc 780 ggcgataccg gactgagcaa attcagcgcg gaacagcagc agcaggctaa gctgtcgctg 840 cagtcctggt ctgacgtggc caatatcacc tttaccgaag ttggtgccgg ccagaaggcc 900 aatatcacct tcggtaacta cagccaggat cgtcccggcc attatgacta cgatacccag 960 gcttacgcct tcctgccgaa caccatttat cagggccaaa acctgggcgg gcagacttgg 1020 tacaacgtca accagtccaa cgtgaaacat ccggccagcg aagactacgg ccgccagacc 1080 tttacccacg agattggcca tgcgttgggc ttgagccatc cgggcgatta caacgccggc 1140 gaaggcaacc cgacttacag agatgccagc tacgccgaag atactcgtga gttcagcctg 1200 atgagttact ggagcgaaac caacaccggt ggcgacaacg gcgggcacta cgctgcggcg 1260 ccactgctgg atgacatttc cgctattcag catctgtatg gtgccaacca gaccacccgt 1320 accggcgata ccgtgtatgg cttcaactca aataccggac gtgacttcct cagtaccacc 1380 agcaatccgc aaaaagtgat ctttgcggcc tgggatgcgg gtggtaatga caccttcgat 1440 ttctccggtt acaccgctaa ccagcgtatt aatctgaacg agaaatcttt ctccgacgtg 1500 ggtgggctga aaggcaacgt gtccattgcc gcaggtgtga ccatcgagaa cgcgattggc 1560 ggttcaggca atgacgtgat cgtcggcaat gcggccaaca acgtgctgaa aggtggcgcg 1620 ggcaacgacg tgctgttcgg cggtggtggg gctgatgagc tgtggggcgg tgcgggcaaa 1680 gacacctttg tcttctctgc ggtcagcgat tctgcgccgg gtgcctccga ctggatcaag 1740 gatttccaga aaggcatcga taaaatcgac ctgtcattct tcaatcaggg cgcgcagggt 1800 ggcgatcaga tccacttcgt cgatcatttc agtggcgcag cgggcgaagc cttgctgtct 1860 tacaatgcgt cgaataacgt cagcgatctg gccctgaata tcggcggcca tcaggccccg 1920 gacatcctgg tgaagatcgt cggccaggtt gatgtcgcca ctgactttat cgtttaacag 1980 tgcaggtgct aacgcccggc gccggttggc cgggcgttat acaggagacg atatgaaggg 2040 cagcttagcg cacgccgcct tagtggcagg cggcatgatg gttacggggg cagttatggc 2100 cagcagtttg gttcttccca gcgcgcaatc attggcgggg caatggctgg tcgccaatgc 2160 cgaacaacaa tgtcagattg agtttttggc cggtgaacag agtgaaatca acggctactc 2220 attggttgat cggcagcact gtttggaaaa ggtgttaacc gccgaggtgg tcggttggcg 2280 ccctgcaccg gacggcatcg ctttgctgcg ggcggatggc agtacgctgg cgttcttctc 2340 gcgcgatggc gatatttacc gcaaccagct tggcgcggat gacggactga cgctgaaagc 2400 gctggtataa caacagcggg ttcggcagtc gaacccgccc tgagcagcct tacagataca 2460 gcgaacgtac gatcaggaaa t 2481

Claims

하기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 아라자임(Arazyme)을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물:
(a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및
(b) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 단백질.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 아라자임은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 배양액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3(수탁번호: KCTC 0268BP)인 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 예방 및 치료용 약학적 조성물.
하기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 아라자임(Arazyme)을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물:
(a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및
(b) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 단백질.
삭제
제 5항에 있어서, 상기 아라자임은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 배양액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3(수탁번호: KCTC 0268BP)인 것을 특징으로 하는 아토피 예방 및 개선용 화장료 조성물.
하기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 아라자임(Arazyme)을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 및 개선용 건강식품:
(a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및
(b) 서열 번호 2에 기재된 염기 서열의 코딩 영역을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 단백질.
삭제
제 9항에 있어서, 상기 아라자임은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) 배양액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 아토피 예방 및 개선용 건강식품.
제 11항에 있어서, 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3(수탁번호: KCTC 0268BP)인 것을 특징으로 하는 아토피 예방 및 개선용 건강식품.