KR102342901B1 - 엑소좀 및 이의 다양한 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 신규한 엑소좀에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 엑소좀은 항염증 효과가 뛰어나 다양한 염증성 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있고, 그 외에도 장 질환의 치료, 피부 개선, 상처 치료 또는 탈모 치료 효과가 뛰어나다.

Description

엑소좀 및 이의 다양한 용도{Exomsome and various uses thereof}
본 발명은 신규한 엑소좀과 이를 이용한 다양한 용도에 관한 것이다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 “세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)”라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, mRNA, miRNA 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
염증성 장 질환(IBD; Inflammatory Bowel Disease)이란 장관 내 비정상적인 만성 염증이 호전과 재발을 반복하는 질환으로 흔히 궤양성 대장염과 크론병이 대표적이다. 아직까지 염증성 장 질환의 명확한 발병기전은 밝혀져 있지 않지만, 유전적, 면역학적 이상 및 스트레스나 약물 등과 같은 환경적 요인 등이 관련 있을 것으로 알려져 있다.
궤양성 대장염(ulcerative colitis)은 직장에서 대장의 근위부로 이어지는 대장 점막의 염증을 특징으로 하며 점액이 섞인 혈변이 나오고, 설사가 수회에서 수십 회에 이르는 경우도 있으며 심한 경우에는 발열을 동반하기도 한다.
크론병(Crohn's disease)은 구강에서 항문까지 위장관 전체에서 발생할 수 있으며 대개 복통, 설사, 전신 무력감, 체중 감소나 항문 통증, 심한 경우에는 장관 협착, 천공, 농양, 누공 등으로 인해 삶의 질이 저하되고 경우에 따라서 반복적인 수술이 필요하다.
장염(enteritis)은 장점막의 염증. 원인에 따라 바이러스성, 세균성, 진균성, 기생충성, 중독성 및 사료성 등으로 구분되며, 병리학적 소견에 따라 카탈성, 출혈성, 화농성, 괴사성 및 디프테리아성 등으로 구분된다.
또한, 염증성 장 질환의 증상은 위장관에 한정되지 않고, 전신 질환이 될 수 있다. 장 조직의 손상으로 인하여, 심각한 식품 알레르기 및 과민을 일으킬 수 있으며, 면역 질환을 발생시킬 수 있을 뿐 아니라, 염증성 장 질환을 앓고 있는 환자는 관절, 신장, 입, 눈, 구강 궤양 및 포도막염과 같은 여러 장기에 영향을 미치는 관련 장외증상(Extra-intestinal manifestations)을 가지고 있다.
현재 염증성 장 질환을 치료하기 위해 사용되는 치료제는 직접적인 치료보다 증상을 관해함으로써, 이러한 상태를 가능한 한 장기간 유지하기 위하여, 주로 면역 억제제, 아미노살리실산 제제, 부신피질 스테로이드제 등이 사용되고 있으며, 이에 따른 일부의 환자에서 구역질, 속쓰림, 두통, 어지러움, 빈혈 및 피부발진 등의 다양한 부작용이 보고되고 있다.
이에, 상기와 같은 문제를 해소하고자, 새로운 염증성 장 질환 치료제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나(한국등록특허 10-1145751) 아직 미비한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 항염증 효과가 있는 신규 엑소좀을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기한 엑소좀을 이용한 다양한 용도의 조성물을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "엑소좀(exosome)"은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미한다. 엑소좀의 직경은 대략 30-100 nm이며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다.
본 발명에서 상기 엑소좀은 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함한다.
본 발명에서 상기 글루코사민(C6H13ON5)은 헥소사민의 일종이며, 대표적인 천연 아미노당으로 키토사민이라고도 한다.
본 발명에서 글루코사민의 유도체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 글루코사민의 유도체란 상기 글루코사민의 하나 이상의 하이드록시기의 수소가 아실(acyl)기 또는 알킬기로 치환된 것으로, 예를 들면 탄소수가 2 내지 18인 아실기 또는 1 내지 5인 직쇄 또는 측쇄 알킬로서, 아세틸(acetyl), 프로피오닐(propionyl), 부티릴(butyryl), 펜타노일(pentanoyl), 헥사노일(hexanoyl), 헵타노일(heptanoyl), 옥타노일(octanoyl), 노나노일(nonanoyl), 데카노일(decanoyl), 운데카노일(undecanoyl), 라우릴(lauryl), 트리데카노일(tridecanoyl), 미리스틸(myristyl), 펜타데카노일(pentadecanoyl), 팔미토일(palmitoyl), 마가릴(margaryl) 또는 스테아릴(stearyl)기 등의 아실기이거나, 또는 메틸(methyl), 에틸(ethyl), 프로필(propyl), 부틸(butyl), 펜틸(pentyl), 이소프로필(isopropyl), 이소부틸(isobutyl) 또는 세크부틸(secbutyl) 기 등의 알킬기로 치환된 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 글루코사민 또는 그 유도체의 염 형태 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 염이란 글루코사민 또는 그 유도체의 염산염, 브롬산염, 황산염, 인산염, 아세트산염, 시트르산염, 푸마르산염, 락트산염, 말레산염, 숙신산염, 타르타르산염 등의 유기 또는 무기산과의 염, 나트륨염, 칼륨염　등의 알칼리금속과의 염 또는 암모늄염, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에타올아민, 사이클로헥실아민, 디사이클로헥실아민 등의 유기 염기 등의 염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 엑소좀은 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을, 이를 포함하는 당단백질, 당지질 또는 다당류의 형태로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염은 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하, 0 초과 19 중량% 이하, 0 초과 18 중량% 이하, 0 초과 17 중량% 이하, 0 초과 16 중량% 이하, 0 초과 15 중량% 이하, 0 초과 14 중량% 이하, 0 초과 13 중량% 이하, 0 초과 12 중량% 이하, 0 초과 11 중량% 이하, 0 초과 10 중량% 이하, 0 초과 9 중량% 이하, 0 초과 8 중량% 이하, 0 초과 7 중량% 이하, 0 초과 6 중량% 이하, 0 초과 5 중량% 이하, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 9 중량%, 0.1 내지 8 중량%, 0.1 내지 7 중량%, 0.1 내지 6 중량%, 또는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 엑소좀은 세포로부터 유래된 것으로, 이때 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 본 발명에서 상기 원핵 세포는 박테리아 세포일 수 있고, 이때 박테리아는 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아일 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 진핵 세포는 식물 세포, 동물 세포, 또는 곰팡이 세포일 수 있다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 엑소좀은 예를 들면, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 에어로코커스(Aerococcus) 속, 카르노박테리움(Carnobacterium) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 오에노코커스(Oenococcus) 속, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속, 스포로락토바실러스(Sporolactobacillus) 속, 테트라제노코커스(Tetragenococcus) 속, 바고코커스(Vagococcus) 속, 바이셀라(Weisella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 펩토스트레포코커스(Peptostrepococcus) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 미크로코커스(Micrococcus) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 데바로마이세스(Debaromyces) 속, 칸디다(Candida) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 피치아(Pichia) 속, 토룰롭시스(Torulopsis) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 리조푸스(Rhizopus) 속, 뮤코(Mucor) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 박테로이데스(Bacteroides) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 푸소박테리움(Fusobacterium) 속 및 멜리소코커스(Melissococcus) 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 엑소좀은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtilis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인팬티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 애니몰리스(Bifidobacterium animalis), 엔테로코쿠스 패시움(Enterococcus Faecium), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus Faecalis), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidopilus), 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum), 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루키이(Lactobacillus delbrukii), 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 파르시미누스(Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 김치(Lactobacillus kimchi), 락토바실러스 컨푸수스(Lactobacillus confusus), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 스트렙토코쿠스 패시움(Streptococcus faecium), 스트렙토코쿠스 패칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 아가락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis), 바이셀라 컨푸사(Weissella confusa), 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis), 바이셀라 김치(Weissella kimchii), 바이셀라 시바리아(Weissella cibaria), 바이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens), 페디오코커스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 할로필러스(Pediococcus halophilus), 스타필로코커스 카르노서스(Staphylococcus carnosus), 스타필로코커스 자일로서스(Staphylococcus xylosus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 테트라제노코커스 할로필러스(Tetragenococcus halophilus), 사카로마이세스 세레비지애(Sacharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii), 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii) 및 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogens)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 엑소좀을 포함하는 세포 배양물 또는 세포 배양액에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "배양물"이란 상기 세포를 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 세포가 포함되는 개념이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "배양액"이란 상기 세포를 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 상기 세포가 포함되지 않는 개념이다. 즉, 본 발명에서 배양액은 소정의 세포를 배지에서 배양시킨 후 여과 또는 원심분리 등을 통해 균체를 제거한 액상의 산물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 포함하는 줄기세포의 증식 촉진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 매우 우수한 줄기세포 증식 촉진능을 갖기 때문에, 동물성 혈청을 대신하여 무혈청 배지에서도 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있다.
본 발명에서 용어, "줄기세포(stem cell)"란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다.
본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 성체 줄기세포이다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 상기 "성체 줄기세포"는 성체 세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 포함한다.
상기 성체 줄기세포로서, 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입 과정에서 폐기되는 지방조직을 사용하여 얻을 수 있어, 침습적 시술이 필요 없는 지방 유래 줄기세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 지방 유래 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 지방조직 또는 지방세포로부터 공지의 방법(예를 들어, 국제특허공개 제WO2000/53795호 및 제WO2005/042730호)에 개시된 바에 따라, 지방흡입(liposuction) 및 침강, 콜라게나제(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유 세포 제거 등의 과정을 통하여 얻을 수 있다. 상기 지방조직은 피하, 그물막, 내장, 유방 생식선 또는 그 밖의 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 조직을 포함하며, 통상의 지방흡입술로부터 손쉽게 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 포함하는 줄기세포의 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 배양용 배지는 이 기술분야의 통상의 기술자들에게 널리 알려진 배지라면 제한없이 사용될 수 있다. 상기 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α―MEM(α―Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), MEF을 예로 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "염증"은 세포나 조직이 어떠한 원인에 의해 손상을 받으면 그 반응을 최소화 하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키려는 일련의 방어 목적으로 나타나는 현상으로, 신경 및 혈관, 림프관, 체액 반응, 세포 반응을 일으켜 결과적으로 통증, 부종, 발적, 발열 등을 일으켜 기능장애를 유발한다. 염증을 유발하는 원인으로 외상, 동상, 화상, 방사능 등에 의한 물리적 요인과 산 (acid)과 같은 화학물질에 의한 화학적 요인 및 항체 반응에 의한 면역학적 요인들이 있으며, 그 외에 혈관이나 호르몬 불균형에 의해서도 발생된다. 외부 자극으로 손상된 세포들은 염증 유발 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine) 류 및 케모카인 (chemokine), 인터루킨 (interleukine), 인터페론 (interferon) 등의 다양한 생물학적 매개 물질을 분비하여 혈관 확장이 일어나고 투과성이 높아짐에 따라 항체, 보체, 혈장(plasma), 식균 세포들이 염증 부위로 몰려들게 된다. 이러한 현상이 홍반의 원인이 된다.
본 발명에서 용어, "항염증용 조성물(항염증제)"란 염증을 소실시키기 위해 염증원의 제거, 생체 반응 및 증상을 감소시키는 작용을 하는 약물을 의미한다.
본 발명에서 제공하는 엑소좀은 염증성 사이토카인(cytokine)의 발현 또는 활성을 억제하여 항염증 효과가 뛰어나며, 인체에 안전성이 우수하다.
본 발명에서 상기 항염증용 조성물은 염증성 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 데 사용될 수 있다.
일반적으로 염증성 질환 등은 다양한 염증성 사이토카인에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. IL-2 (Interleukin-2), IL-1β (Interleukin-1beta), IL-6, TNF-α (Tumor necrosis factor-alpha)는 골반염 [Clin Chem Lab Med. 2008;46(11):1609-1616, Significant elevation of a Th2 cytokine, interleukin-10, in pelvic inflammatory disease; Clin Chem Lab Med. 2008;46(7):997-1003, Plasma interleukin-1beta, -6, -8 and tumor necrosis factor-alpha as highly informative markers of pelvic inflammatory disease], IL-2 또는 IL-8 (Interleukin-8)은 건선 [Iranian J Publ Health, Vol. 36, No.2, 2007, pp.87-91, Th1/Th2 Cytokines in Psoriasis (REVIEW); Clin Exp Immunol. 1995 Feb;99(2):148-54, IL-8/IL-8 receptor expression in psoriasis and the response to systemic tacrolimus (FK506) therapy], IL-2 또는 IL-10은 이식편대 숙주 질환 (Graft-Versus-Host Disease) [Curr Pharm Des. 2004;10(11):1195-205, Anti-cytokine therapy for the treatment of graft-versus-host disease. (REVIEW); Blood. 2002 Oct 1;100(7):2650-8, Cytokine and chemokine profiles in autologous graft-versus-host disease (GVHD): interleukin 10 and interferon gamma may be critical mediators for the development of autologous GVHD] 등 염증성 질환과 밀접한 관련이 있다. 이상의 결과로 볼 때 상기 염증성 사이토카인 등은 염증성 질환에 있어서 중요한 치료적 표적 분자임을 알 수 있으며, 이와 같은 염증성 사이토카인의 분비를 감소시킬 수 있으면 상기 염증성 질환을 치료할 수 있다.
본 발명에서 "염증성 질환"이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역 세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다.
구체적으로 본 발명에서 상기 염증성 질환에는 아토피, 건선, 피부염, 알레르기, 관절염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 방광염, 신장염, 골반염, 염증성 장 질환, 강직성 척추염, 전신 홍반성 낭창 (systemic lupus erythematodes, SLE), 죽상 동맥경화, 천식, 동맥경화, 부종, 류마티스 관절염, 지연성 알레르기 (IV형 알레르기), 이식거부, 이식편대 숙주 질환, 자가면역 뇌척수염, 다발성 경화증, 관절염, 낭포성 섬유증, 당뇨성 망막증, 비염, 허혈성-재관류 손상, 혈관 재협착, 사구체신염, 위장관 알레르기 등이 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항염증용 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물로도 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 장 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 장 질환은 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD), 과민성 장 증후군(irritable bowel syndrome, IBS), 여행자 설사, 변비, 급성 설사, 장염, 위장관염, 복통 또는 복부 팽만과 같은 장의 정상적인 장벽 기능 손상에 의해 야기되는 질환을 포함한다.
본 발명에서 용어, "염증성 장 질환(IBD)"은 크론병, 베체트병에 수반되는 장 병변, 궤양성 대장염, 출혈성 직장 궤양 및 회장 낭염을 포함하며, 크론병 및 궤양성 결장염을 포함하는 질환 군을 지칭한다. 궤양성 결장염은 단지 대장에만 영향을 미친다. 궤양성 결장염에서의 염증 및 궤양은 대장의 4개 층 중 가장 안쪽에 있는 2개의 층인 점막층 및 점막하층에 제한된다. 크론병에서 염증 및 궤양은 소장 및 대장 둘 다에서 장벽의 모든 층을 통해 확장할 수 있다.
본 발명에서 용어, "과민성 대장 증후군(IBS)"은 기질적 원인이 없이 장기간 반복되는 복부팽만감 등의 복부 불편감 및 복통과 더불어 설사, 변비 등의 배변 습관의 변화를 동반하는 만성 질환이며 그 증상이 정신적인 요인이나 스트레스를 유발하는 사회 환경에 의해서 악화되기도 한다. 우세하는 장 운동 장애 증상의 형태에 따라, IBS에는 변비, 설사 또는 설사와 변비의 교대형 IBS(약어 IBS-C, IBS-D 및 IBS-A 로 알려져 있기도 하다)이 포함된다.
본 발명에서 제공하는 엑소좀은 인터루킨-2(Interelukin-2, IL-2)의 발현을 억제시켜 상기한 장 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다. 인터루킨-2의 발현을 억제하는 경우 장 질환을 치료할 수 있는 것은 이미 당해 분야에서 널리 알려져 있다(Caprioli et al., J Clin Cell Immunol 2013, 4:4).
본 발명의 장 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물로도 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 장 기능 개선 또는 배변 촉진용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 엑소좀은 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD), 과민성 장 증후군(irritable bowel syndrome, IBS), 여행자 설사, 변비, 급성 설사, 장염, 위장관염, 복통 또는 복부 팽만 등을 예방, 개선 또는 치료하여 장의 정상적인 장벽 기능을 유지하거나, 그 손상을 예방, 개선 또는 치료할 수 있을 뿐만 아니라 정상적인 배변을 촉진할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "피부 개선"은 피부의 내재적 요인 또는 외인적인 요인에 의하여 유발되는 피부의 손상을 치료, 경감, 완화시키는 과정 또는 그의 효과 등을 포괄적으로 의미하는 것으로, 보다 상세하게는 피부 미백, 주름 개선, 탄력 증진, 피부 재생, 피부 보습, 노화 방지, 피부 자극 완화, 여드름 예방 또는 개선, 및/또는 아토피 예방 또는 개선 효과를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 매우 우수한 줄기세포 증식 촉진능을 갖기 때문에 이를 인체에 적용하는 경우 피부에 존재하는 성체 줄기세포의 증식을 촉진하거나 활성화시킴으로써 피부 상태를 개선시킬 수 있다. 피부에 존재하는 성체 줄기세포는 예를 들어, 모낭과 모낭사이의 표피(interfollicular epidermis)의 기저층에 존재하는 줄기세포, 모낭(hair follicle)에 존재하는 줄기세포, 또는 피하 지방층에 존재하는 지방유래 줄기세포이다.
본 발명의 피부 개선용 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물로도 제공될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 엑소좀은 상기 피부 상태 개선 활성으로 인해 미용 또는 치료적 목적의 필러용 조성물, 보다 상세하게는 필러 주사용 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 구체적인 예시로서 생물학적 조직의 필링(filling) 또는 대체를 위한 조성물, 주름의 필링(filling wrinkle), 안면의 리모델링(remodeling of the face) 또는 입술 용적(lip volume)의 증가를 위한 조성물, 메조테라피(mesotherapy)에 의한 피부의 재수화(rehydration) 치료에 사용하기 위한 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 상처의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 상처 치유에 있어서 중요한 역할을 하는 케라티노사이트, 섬유아세포와 피부 줄기세포에서 세포의 증식을 촉진하는 효과를 갖는다.
본 발명의 상처의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물로도 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 탈모의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "탈모"는 정상적으로 모발이 존재해야 하는 부위에 모발이 결손된 상태를 의미하며, 일반적으로 두피의 성모가 빠지는 것을 의미한다. 성모는 색이 없고 굵기가 가는 연모와는 달리 결손 시 미용상의 문제를 일으킬 수 있다.
본 발명에서 상기 탈모는 임상적으로 흉터가 형성되는 것과 그렇지 않은 두 종류로 구분될 수 있으며, 흉터가 형성되는 탈모(반흔성)는 모낭이 파괴되므로 모발이 재생되지 않는 반면, 흉터가 형성되지 않는 탈모(비반흔성)는 모낭이 유지되므로 증상 부위가 사라진 후에 모발이 재생된다.
본 발명에서 상기 탈모는 원형 탈모(alopecia areata), 전두 탈모(alopecia totalis), 범발성 탈모(alopecia universalis), 남성형 탈모(androgenic alopecia), 휴지기 탈모(telogen effluvium), 성장기 탈모(anagen effluvium), 또는 화학치료-유발 탈모(chemotherapy-induced alopecia)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 모유두 세포(dermal papilla cells; DPC)의 증식을 현저히 촉진시키고, 발모 또는 육모 관련 마커의 발현 수준을 높여 탈모를 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 탈모의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 약학적 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물로도 제공될 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물을 이용하여 각종 질환의 증상을 차단하거나, 질환 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서, "치료"는 본 발명의 조성물을 이용하여 각종 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명에서 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용 목욕물 첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.
상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.
지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.
그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.
본 발명의 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 엑소좀이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.
여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.
그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (1) 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
(2) 상기 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 항염증제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 세포는 이때 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 본 발명에서 상기 원핵 세포는 박테리아 세포일 수 있고, 이때 박테리아는 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아일 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 진핵 세포는 식물 세포, 동물 세포, 또는 곰팡이 세포일 수 있다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 세포는 예를 들면, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 에어로코커스(Aerococcus) 속, 카르노박테리움(Carnobacterium) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 오에노코커스(Oenococcus) 속, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속, 스포로락토바실러스(Sporolactobacillus) 속, 테트라제노코커스(Tetragenococcus) 속, 바고코커스(Vagococcus) 속, 바이셀라(Weisella), 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 펩토스트레포코커스(Peptostrepococcus) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 미크로코커스(Micrococcus) 속, 리스테리아(Listeria) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 데바로마이세스(Debaromyces) 속, 칸디다(Candida) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 피치아(Pichia) 속, 토룰롭시스(Torulopsis) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 리조푸스(Rhizopus) 속, 뮤코(Mucor) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 박테로이데스(Bacteroides) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 푸소박테리움(Fusobacterium) 속 및 멜리소코커스(Melissococcus) 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 세포는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtilis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 인팬티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 애니몰리스(Bifidobacterium animalis), 엔테로코쿠스 패시움(Enterococcus Faecium), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus Faecalis), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidopilus), 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum), 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri), 락토바실러스 알리멘타리우스(Lactobacillus alimentarius), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루키이(Lactobacillus delbrukii), 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 파르시미누스(Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 김치(Lactobacillus kimchi), 락토바실러스 컨푸수스(Lactobacillus confusus), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 스트렙토코쿠스 패시움(Streptococcus faecium), 스트렙토코쿠스 패칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코쿠스 아가락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코쿠스 락티스(Streptococcus lactis), 바이셀라 컨푸사(Weissella confusa), 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis), 바이셀라 김치(Weissella kimchii), 바이셀라 시바리아(Weissella cibaria), 바이셀라 비리데스켄스(Weissella viridescens), 페디오코커스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici), 페디오코커스 할로필러스(Pediococcus halophilus), 스타필로코커스 카르노서스(Staphylococcus carnosus), 스타필로코커스 자일로서스(Staphylococcus xylosus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 테트라제노코커스 할로필러스(Tetragenococcus halophilus), 사카로마이세스 세레비지애(Sacharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii), 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii) 및 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogens)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 방법은 특별히 제한하지 않으며, 예를 들면, 크로마토그래피(예, 고성능 액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피(TLC) 등), 질량 분석기, 헥소사민 분석(hexosamine assay) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기와 같이 분리된 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 존재하거나, 혹은 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하, 0 초과 19 중량% 이하, 0 초과 18 중량% 이하, 0 초과 17 중량% 이하, 0 초과 16 중량% 이하, 0 초과 15 중량% 이하, 0 초과 14 중량% 이하, 0 초과 13 중량% 이하, 0 초과 12 중량% 이하, 0 초과 11 중량% 이하, 0 초과 10 중량% 이하, 0 초과 9 중량% 이하, 0 초과 8 중량% 이하, 0 초과 7 중량% 이하, 0 초과 6 중량% 이하, 0 초과 5 중량% 이하, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 9 중량%, 0.1 내지 8 중량%, 0.1 내지 7 중량%, 0.1 내지 6 중량%, 또는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 포함되는 경우, 상기 엑소좀을 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 항염증제로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 염증성 질환에는 아토피, 건선, 피부염, 알레르기, 관절염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 방광염, 신장염, 골반염, 염증성 장 질환, 강직성 척추염, 전신 홍반성 낭창 (systemic lupus erythematodes, SLE), 죽상 동맥경화, 천식, 동맥경화, 부종, 류마티스 관절염, 지연성 알레르기 (IV형 알레르기), 이식거부, 이식편대 숙주 질환, 자가면역 뇌척수염, 다발성 경화증, 관절염, 낭포성 섬유증, 당뇨성 망막증, 비염, 허혈성-재관류 손상, 혈관 재협착, 사구체신염, 위장관 알레르기 등이 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (1) 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
(2) 상기 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 장 질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 세포의 정의와, 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 방법은 상기 항염증제의 스크리닝 방법에서 기재된 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기와 같이 분리된 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 존재하거나, 혹은 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하, 0 초과 19 중량% 이하, 0 초과 18 중량% 이하, 0 초과 17 중량% 이하, 0 초과 16 중량% 이하, 0 초과 15 중량% 이하, 0 초과 14 중량% 이하, 0 초과 13 중량% 이하, 0 초과 12 중량% 이하, 0 초과 11 중량% 이하, 0 초과 10 중량% 이하, 0 초과 9 중량% 이하, 0 초과 8 중량% 이하, 0 초과 7 중량% 이하, 0 초과 6 중량% 이하, 0 초과 5 중량% 이하, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 9 중량%, 0.1 내지 8 중량%, 0.1 내지 7 중량%, 0.1 내지 6 중량%, 또는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 포함되는 경우, 상기 엑소좀을 장 질환의 예방 또는 치료제로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 장 질환은 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease; IBD), 과민성 장 증후군(irritable bowel syndrome, IBS), 여행자 설사, 변비, 급성 설사, 장염, 위장관염, 복통 또는 복부 팽만과 같은 장의 정상적인 장벽 기능 손상에 의해 야기되는 질환을 포함한다. 여기서, 상기 염증성 장 질환(IBD)은 크론병, 베체트병에 수반되는 장 병변, 궤양성 대장염, 출혈성 직장 궤양 또는 회장 낭염을 포함하고, 상기 과민성 대장 증후군(IBS)은 변비, 설사 또는 설사와 변비의 교대형 IBS(약어 IBS-C, IBS-D 및 IBS-A 로 알려져 있기도 하다)이 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (1) 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
(2) 상기 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 피부 개선제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 세포의 정의와, 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 방법은 상기 항염증제의 스크리닝 방법에서 기재된 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기와 같이 분리된 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 존재하거나, 혹은 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하, 0 초과 19 중량% 이하, 0 초과 18 중량% 이하, 0 초과 17 중량% 이하, 0 초과 16 중량% 이하, 0 초과 15 중량% 이하, 0 초과 14 중량% 이하, 0 초과 13 중량% 이하, 0 초과 12 중량% 이하, 0 초과 11 중량% 이하, 0 초과 10 중량% 이하, 0 초과 9 중량% 이하, 0 초과 8 중량% 이하, 0 초과 7 중량% 이하, 0 초과 6 중량% 이하, 0 초과 5 중량% 이하, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 9 중량%, 0.1 내지 8 중량%, 0.1 내지 7 중량%, 0.1 내지 6 중량%, 또는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 포함되는 경우, 상기 엑소좀을 피부 개선제로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (1) 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
(2) 상기 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 상처 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 세포의 정의와, 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 방법은 상기 항염증제의 스크리닝 방법에서 기재된 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기와 같이 분리된 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 존재하거나, 혹은 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하, 0 초과 19 중량% 이하, 0 초과 18 중량% 이하, 0 초과 17 중량% 이하, 0 초과 16 중량% 이하, 0 초과 15 중량% 이하, 0 초과 14 중량% 이하, 0 초과 13 중량% 이하, 0 초과 12 중량% 이하, 0 초과 11 중량% 이하, 0 초과 10 중량% 이하, 0 초과 9 중량% 이하, 0 초과 8 중량% 이하, 0 초과 7 중량% 이하, 0 초과 6 중량% 이하, 0 초과 5 중량% 이하, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 9 중량%, 0.1 내지 8 중량%, 0.1 내지 7 중량%, 0.1 내지 6 중량%, 또는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 포함되는 경우, 상기 엑소좀을 상처 치료제로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (1) 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
(2) 상기 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 탈모의 예방 도는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 세포의 정의와, 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 방법은 상기 항염증제의 스크리닝 방법에서 기재된 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.
본 발명에서 상기와 같이 분리된 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 존재하거나, 혹은 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하, 0 초과 19 중량% 이하, 0 초과 18 중량% 이하, 0 초과 17 중량% 이하, 0 초과 16 중량% 이하, 0 초과 15 중량% 이하, 0 초과 14 중량% 이하, 0 초과 13 중량% 이하, 0 초과 12 중량% 이하, 0 초과 11 중량% 이하, 0 초과 10 중량% 이하, 0 초과 9 중량% 이하, 0 초과 8 중량% 이하, 0 초과 7 중량% 이하, 0 초과 6 중량% 이하, 0 초과 5 중량% 이하, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 9 중량%, 0.1 내지 8 중량%, 0.1 내지 7 중량%, 0.1 내지 6 중량%, 또는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 포함되는 경우, 상기 엑소좀을 탈모의 예방 또는 치료제로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀은 항염증 효과가 뛰어나 다양한 염증성 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있고, 그 외에도 장 질환의 치료, 피부 개선, 상처 치료 또는 탈모 치료 효과 또한 우수하다.
도 1은 실험예 1에서 Jurkat 세포에 각 미생물 균주로부터 분리된 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 처리한 뒤 컨트롤 대비 염증성 사이토카인(IL-2)의 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 실험예 2에서 Jurkat 세포에, 락토바실러스 케피르그라넘의 조정 배지, 상기 조정 배지로부터 분리된 글루코사민을 포함하는 엑소좀, 또는 상기 엑소좀이 제거된 조정 배지를 처리한 뒤 컨트롤 대비 염증성 사이토카인(IL-2)의 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 3에서 Jurkat 세포에 글루코사민을 포함하는 엑소좀, 글루코사민을 포함하는 리포좀 또는 글루코사민을 처리한 뒤 컨트롤 대비 염증성 사이토카인(IL-2)의 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 4에서 대장염 마우스 모델에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 처리한 뒤 마우스의 대장 조직을 H&E 염색한 후 그 단면 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 4에서 대장염 마우스 모델에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 처리한 뒤 대장의 길이와 외관을 관찰하여 평가한 점수를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 4에서 대장염 마우스 모델에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 처리한 뒤 대변의 항상성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 4에서 대장염 마우스 모델에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 처리한 뒤 대변 내 출혈 정도를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 4에서 대장염 마우스 모델에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 처리한 뒤 마우스의 몸무게 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 5에서 각질형성세포(HaCaT)에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 농도별로 처리한 뒤 세포 증식률의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실험예 5에서 피부섬유아세포(HDF)에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 농도별로 처리한 뒤 세포 증식률의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 6에서 지방 유래 줄기세포(ASC)에 글루코사민을 포함하는 엑소좀을 농도별로 처리한 뒤 세포 증식률의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[실시예 1] 엑조솜 내 글루코사민 확인
1. 엑소좀의 분리
락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum), 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri), 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis), 테트라제노코커스 할로필러스(Tetragenococcus halophilus) 및 비피도박테리움 애니몰리스(Bifidobacterium animalis)는의 균주를 MRS 배지(프로테오스 펩톤(Proteose peptone) 10g, 육 추출물(Beef extract) 10g, 효모 추출물(Yeast extract) 5g, D-글루코스(D-glucose) 20g, 트윈 80(Tween 80) 1 ml, K2HPO4 2g, 소디움 아세테이트(Sodium acetate) 5g, 디암모늄 하이드로젠시트레이트(Diammonium hydrogencitrate) 2g, MgSO4·7H2O 0.2g, Mn SO4H2O 0.2g, 증류수(Distilled water) 1L, pH 6.2-6.5)에 접종한 뒤, 30℃에서 0rpm으로 정치 배양하였다. 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogens) 및 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)는 LB 배지(Tryptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 5g, Distilled water 1L, pH 6.8~7.2)에 접종하고, 30℃에서 0rpm으로 정치 배양하였다.
이렇게 얻어진 각 균주별 배양액을 300g로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 취하여 1,200g에서 4℃에서 20분 동안 원심분리한 뒤, 상층액을 취하여 10,000g로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 상층액을 취하여 초원심분리기를 이용해 110,000g로 4℃에서 1시간 10분 동안 원심분리한 뒤 상층액을 제거하여 침전물(pellet)을 PBS로 현탁하여 엑소좀을 수득하였다.
2. 글루코사민(glucosamine) 함량 측정
상기와 같이 각 균주로부터 분리된 엑소좀 내 글루코사민의 함량을 헥소사민 분석법(Hexosamine assay)으로 측정하였다. 구체적으로는, 헥소사민의 함량은 3-메틸-2-벤조티아-졸리논 하이드라존 하이드로클로라이드(MBTH) 법으로 측정하였다(Frederik et al., 2000). 즉 100 ㎕의 상기 시료를 포함하는 캡 튜브(cap tube)에 1M HCl 용액을 100 ㎕의 양으로 첨가하여 110℃의 Reacti-thermometer에서 2시간 가열 후 냉각하고, 400 ㎕의 2.5% 소디움 니트레이트(sodium nitrite)를 첨가한 후 실온에서 15분 방치하였다. 4M 암모늄 설파믹산(ammonium sulfamate) 200 ㎕를 혼합 용액에 가하고 실온에서 5분 동안 방치한 다음 0.25% MBTH 200 ㎕를 가하고 37℃의 수조(water bath)에서 30분 동안 항온처리 하였다. 1.0% 염화제2철(ferric chloride) 200 ㎕를 가하고 37℃의 수조에서 5분 동안 항온한 후 냉각하여 650 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 헥소사민의 함량은 D-글루코사민으로 작성한 표준곡선에 따라 구하였고, 각 엑소좀 내 글루코사민의 함량 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
구분 글루코사민 함량(중량%)
P1 컨트롤(Control) -
P2 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum) 2.61
P3 락토바실러스 케피라노팍시엔스(Lactobacillus kefiranofaciens) 2.50
P4 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) 2.76
P5 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 1.85
P6 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogens) 0.75
P7 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 실질적 미검출
P8 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis) 실질적 미검출
P9 테트라제노코커스 할로필러스(Tetragenococcus halophilus) 실질적 미검출
P10 비피도박테리움 애니몰리스(Bifidobacterium animalis) 2.74
P11 사이클로스포린 A(Cyclosporin A) -
표 1에서 보는 바와 같이, P2 내지 P6 및 P10의 엑소좀에서는 글루코사민이 존재하는 것으로 측정되었지만, P7 내지 P9의 엑소좀에서는 글루코사민이 실질적으로 검출되지 않았다.
[실험예 1] 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 항염증 효과 확인(1)
Jurkat 세포를 96웰 플레이트의 각 웰당 4x104 세포/웰로 접종한 뒤, 상기 실시예 1에서 준비한 각 엑소좀을 100μl/웰의 양으로 처리하고, 24시간 동안 배양한 뒤, 염증성 장 질환의 원인으로 작용하는 T 세포의 증식 및 분화와 관계하는 사이토카인인 IL-2의 발현 수준을 ELISA로 측정한 뒤, 무처리한 컨트롤 대비 IL-2의 발현 수준의 변화를 측정하여 그 결과를 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다. 단, 양성 대조군(P11)으로는 염증성 장 질환의 치료제로 사용되고 있는 사이클로스포린 A(Cyclosporin A)를 상기 엑소좀과 동일한 양으로 처리하였다.
구분 IL-2 (%)
P1 100
P2 48
P3 61
P4 57
P5 50
P6 67
P7 106
P8 106
P9 98
P10 48
P11 71
상기 표 2 및 도 1에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따라 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2~P6 및 P10)을 처리한 경우 IL-2의 발현 수준이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 염증성 장 질환의 치료제로 사용되는 사이클로스포린 A를 처리한 경우보다도 우수한 결과를 확인할 수 있었다.
이를 통하여 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 항염증제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 2] 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 항염증 효과 확인(2)
상기 실험예 1의 항염증 효과가 글루코사민을 포함하는 엑소좀만의 효과인지를 입증하기 위하여, 상기 실시예 1의 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum)의 배양액(P2-W)과, 상기 배양액으로부터 분리된 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2-V)과, 상기 엑소좀이 제거된 배양액(P2-R)을 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 Jurkat 세포에 처리한 뒤 IL-2의 발현 수준을 측정하여 그 결과를 하기 표 3 및 도 2에 나타내었다.
구분 IL-2(%)
P1 컨트롤(Control) 100
P2-W 락토바실러스 케피르그라넘의 조정 배지 62
P2-V 락토바실러스 케피르그라넘 유래 글루코사민을 포함하는 엑소좀 53
P2-R 엑소좀이 제거된 락토바실러스 케피르그라넘 조정 배지 88
상기 표 3 및 도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따라 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2-V) 또는 이를 포함하는 배양액(P2-W)을 처리한 경우 IL-2의 발현 수준이 현저히 감소하였고, 특히 상기 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2-V)의 경우 IL-2의 발현 수준의 감소 정도가 배양액 대비 더욱 뛰어난 것을 볼 수 있었다. 그런데, 상기 엑소좀을 제거한 배양액(P2-R)을 처리한 경우 IL-2 발현 감소 효과가 미미한 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 항염증제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 3] 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 항염증 효과 확인(3)
상기 실험예 1 및 2의 항염증 효과가 단순 글루코사민에 의한 것이 아니라, 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 효과인지를 입증하기 위하여, 상기 실시예 1의 락토바실러스 케피르그라넘(Lactobacillus kefirgranum)의 배양액으로부터 분리된 글루코사민을 포함하는 엑소좀과, 글루코사민을 포함하는 리포좀(리포펙타민 2000) 및 글루코사민 자체를 상기 실험예 1과 같이 Jurkat 세포에 4㎍/ml의 용량으로 처리한 뒤 IL-2의 발현 수준을 측정하여 그 결과를 하기 표 4 및 도 3에 나타내었다.
구분 IL-2(%)
P1 컨트롤(Control) 100
P2 락토바실러스 케피르그라넘 유래 글루코사민을 포함하는 엑소좀 62
L1 글루코사민을 포함하는 리포좀 89
G1 글루코사민 94
상기 표 4 및 도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따라 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2)을 처리한 경우 IL-2의 발현 수준이 현저히 감소하였지만, 글루코사민을 포함하는 리포좀(L1)이나 글루코사민(G1)을 직접 처리한 경우 IL-2 발현 감소 효과가 거의 없는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 항염증제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 4] 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 장 질환 치료 효과 확인
BALB/c 마우스에 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)으로 대장염을 유발하였다. 구체적으로 마우스를 에테르로 마취한 후 TNBS(2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid) 용액 2.5g을 50% 에탄올에 혼합한 용액을 끝이 둥근 1㎖ 용량의 주사기를 이용하여 항문을 통해 대장 내로 0.1㎖씩 투여하고 수직으로 들어 30초간 유지하여 염증을 유발하였다. 반면, 정상군에는 생리식염수 0.1㎖를 경구 투여하였다. 이후, 익일부터 매일 1회씩 10일간 상기 실시예 1에서 얻어진 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2)을 600㎍/마리(30mg/kg)의 용량으로 경구 투여하고 시료 투여가 종료된 다음날에 마우스를 이산화탄소로 질식시켜 안락사시킨 후 대장부위 중 맹장으로부터 항문 직전 부위까지의 대장을 적출하였다. 단, 양성 대조군으로는 대장염 치료제인 프레드니솔론(P12)을 2mg/kg의 양으로 경구 투여하였다.
(1) 조직 외관 평가
적출한 대장 조직을 H&E 염색한 후 그 단면 사진을 도 4에 나타내었고, 상기 대장의 길이와 외관을 관찰하여 하기 표 5의 기준(Hollenbach 등, 2005 대장염 정도에 대한 기준)에 따라 점수로 매겨 그 결과를 도 5에 나타내었다.
외관 점수(Macroscopic Score) 기준
0 어떠한 궤양과 염증도 발견되지 않음
1 출혈이 없는 충혈이 발견됨
2 충혈이 있는 궤양이 발견됨
3 한 곳에서만 궤양과 염증이 발견됨
4 궤양과 염증이 2곳 이상에서 발견됨
5 궤양이 2㎝ 이상으로 확대되어 있음
도 4에서 보는 바와 같이 대장염 마우스 모델의 대장에서는 심각한 상피 괴사, 출혈, 염증 세포의 침윤, 부종 및 궤양 등이 관찰되었으나, 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2)을 투여한 경우 프레드니솔론(P12)을 투여한 경우와 동등 또는 그 이상의 수준으로 대장염의 증상들이 현저히 완화된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 5에서 보는 바와 같이, 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2)을 투여한 경우 대장 내 출혈이 감소하였고, 이러한 치료 효과는 양성 대조군으로 프레드니솔론을 2mg/kg의 많은 양으로 투여한 경우와 동등한 수준 인 것을 확인할 수 있었다.
(2) DAI 평가
DAI (disease activity index)는 급성 대장염을 유발하는 TNBS로 인한 증상을 점수화하는 방법으로, 본 발명에 따른 엑소좀을 제공하는 시기부터 시작하여 제공하는 동안 매일 같은 시각에 대변(stool)의 농도 및 색을 체크하여 측정하였다. 대변 항상성(consistency) 및 출혈 정도(bleeding)와 마우스의 몸무게를 측정하여 그 결과를 각각 도 6 내지 8에 나타내었다. 단, DAI의 평가 기준은 하기 표 6과 같다.
Stool consistency Stool bleeding
0 Formed 0 Normal color
2 Loose stool 2 fecal occult blood test positive
4 Diarrhea 4 Gross bleeding
도 6 내지 8에서 보는 바와 같이 대장염 마우스 모델에 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀(P2)을 투여한 경우, 양성 대조군으로 프레드니솔론(P12)을 투여한 경우와 동등 이상의 수준으로 DAI 값을 낮춰 배변 활동을 개선하는 것을 확인할 수 있었고, 마우스의 체중에는 큰 변화를 보이지 않았다.
이를 통하여 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 장 질환의 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
[실험예 5] 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 피부세포 증식 촉진 효과
각질형성세포(human keratinocyte cell line, HaCaT) 및 피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblast, HDF) 3,000개를 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 접종한 뒤, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따른 엑소좀, EGF 또는 FBS를 처리하였다. 48 시간 후 세포 생존율의 변화를 측정하여 그 결과를 하기 표 8 및 9과, 도 9 및 10에 나타내었다.
구분 처리군 농도
P1 음성 대조군 -
P2(L) P2 엑소좀 1x10^8/ml
P2(M) P2 엑소좀 1x10^9/ml
P2(H) P2 엑소좀 1x10^10/ml
E1 EGF 500 ng/ml
구분 HaCaT 증식률(%)
P1 93.84
P2(L) 107.25
P2(M) 114.20
P2(H) 116.68
E1 160.38
구분 HDF 증식률(%)
P1 97.18
P2(L) 101.39
P2(M) 120.95
P2(H) 134.62
E1 143.04
상기 표 8 및 9와 도 9 및 10에서 보는 바와 같이, 각질형성세포(HaCaT) 및 피부섬유아세포(HDF)에 본 발명에 따른 엑소좀을 처리한 경우 농도 의존적으로 세포 증식률이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 6] 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 줄기세포의 증식 촉진 효과
인간 지방 유래 줄기세포(Adipocyte derived stem cells, ADC)를 10% 우태아혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM 배지(Invitrogen) 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였으며, 3일마다 배지를 갈아주었다. 세포를 24시간 배양한 후에 하기 표 10에 나타낸 조건으로 처리한 뒤 24시간 동안 추가로 배양하였다. 각 세포에 처리된 물질을 제거하고 CCK-8 용액을 분주하여 37℃, CO2 배양기에서 2시간 배양한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 11 및 도 11에 나타내었다.
구분 처리군 농도
CONT 음성 대조군 -
P2(L) P2 엑소좀 1x10^(n-1)/ml
P2(M) P2 엑소좀 1x10^(n)/ml
P2(H) P2 엑소좀 1x10^(n+1)/ml
F1 FBS 배지 내 10중량%
구분 ASC 증식률(%)
P1 99.61
P2(L) 136.54
P2(M) 140.91
P2(H) 174.44
E1 186.10
상기 표 11과 도 11에서 보는 바와 같이, 지방 유래 줄기세포(ASC) 본 발명에 따른 엑소좀을 처리한 경우 농도 의존적으로 세포 증식률이 현저히 증가하였으며, 그 증가 정도가 소태아 혈청(FBS)를 처리한 것과 동등한 수준 정도인 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 7] 글루코사민을 포함하는 엑소좀의 모유두 세포의 증식 촉진 효과
96 well의 마이크로플레이트에 모유두 세포(Dermal papilla cells, DPC) 10,000 cells/well와 혈청 배지를 분주한 후 37℃, CO2 배양기에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양 후 상기 모유두 세포에 하기 표 12에 나타낸로 처리한 뒤 24시간 동안 추가로 배양하였다. 각 세포에 처리된 물질을 제거하고 CCK-8 용액을 분주하여 37℃, CO2 배양기에서 2시간 배양한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.
구분 처리군 농도
P1 음성 대조군 -
P2(M) P2 엑소좀 1x10^(n)/ml
P2(H) P2 엑소좀 1x10^(n+1)/ml
M1 미녹시딜 10 μM
구분 DPC 증식률(%)
P1 97.98
P2(M) 108.86
P2(H) 126.75
M1 118.97
상기 표 13에서 보는 바와 같이, 모유두 세포(DPC)에 본 발명에 따른 엑소좀을 처리한 경우 농도 의존적으로 세포 증식률이 현저히 증가하였으며, 그 증가 정도는, 발모 치료제로 흔히 사용되고 있는 미녹시딜을 처리한 경우보다 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 본 발명에 따른 글루코사민을 포함하는 엑소좀은 탈모 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (13)

  1. 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물로,
    상기 글루코사민 유도체는 글루코사민의 하나 이상의 하이드록시기의 수소가 아실(acyl)기 또는 알킬기로 치환된 것이고,
    상기 엑소좀은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 리스테리아(Listeria) 속 및 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 원핵 세포로부터 유래된 것인, 피부 개선용 화장료 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염은 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하의 양으로 포함되는, 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 피부 개선은 피부 미백, 주름 개선, 탄력 증진, 피부 재생, 피부 보습, 피부 자극 완화, 여드름 예방 또는 개선, 또는 아토피 예방 또는 개선인, 화장료 조성물.
  5. 글루코사민(glucosamine), 글루코사민 유도체 또는 이의 염을 포함하는 엑소좀을 유효 성분으로 포함하는 상처의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로,
    상기 글루코사민 유도체는 글루코사민의 하나 이상의 하이드록시기의 수소가 아실(acyl)기 또는 알킬기로 치환된 것이고,
    상기 엑소좀은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 리스테리아(Listeria) 속 및 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 원핵 세포로부터 유래된 것인, 상처의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서,
    상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염은 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하의 양으로 포함되는, 약학적 조성물.
  8. (1) 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 리스테리아(Listeria) 속 및 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 원핵 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
    (2) 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 글루코사민 유도체는 글루코사민의 하나 이상의 하이드록시기의 수소가 아실(acyl)기 또는 알킬기로 치환된 것인, 피부 개선제의 스크리닝 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서 상기 엑소좀 내에 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 존재하거나, 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하의 양으로 포함되는 경우, 상기 엑소좀을 피부 개선제로 판단하는 단계를 더 포함하는, 스크리닝 방법.
  10. 삭제
  11. (1) 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 리스테리아(Listeria) 속 및 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 원핵 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
    (2) 엑소좀 내 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 글루코사민 유도체는 글루코사민의 하나 이상의 하이드록시기의 수소가 아실(acyl)기 또는 알킬기로 치환된 것인, 상처 치료제의 스크리닝 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서 상기 엑소좀 내에 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 존재하거나, 상기 글루코사민, 글루코사민 유도체 또는 이의 염이 상기 엑소좀 내에 0 초과 20 중량% 이하의 양으로 포함되는 경우, 상기 엑소좀을 상처 치료제로 판단하는 단계를 더 포함하는, 스크리닝 방법.
  13. 삭제
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