KR101831883B1

KR101831883B1 - 이소세코타나파솔라이드를 유효성분으로 함유하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101831883B1
Application number: KR1020150073206A
Authority: KR
Inventors: 한창성; 김진국; 이강혁; 김건용; 박소연; 장준환; 윤지원
Original assignee: 에스케이바이오랜드 주식회사
Priority date: 2015-05-26
Filing date: 2015-05-26
Publication date: 2018-04-16
Also published as: CN107920974A; WO2016190661A1; KR20160139128A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 [1]로 표시되는 이소세코타나파솔라이드(Isosecotanapartholide)를 유효성분으로 함유하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물에 관한 것이다.
화학식 [1]

본 발명에 따르면, 이소세코타나파솔라이드(Isosecotanapartholide)를 함유하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물의 경우, 세포독성이 발견되지 않아 안전성이 우수하고 다양한 가려움증의 원인이 되는 사이토카인들 중 IL-31(Interleukin-31) 또는 IL-33(Interleukin-33) 억제시킴으로써 가려움증을 억제 및 완화시킬 수 있다.

Description

이소세코타나파솔라이드를 유효성분으로 함유하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물{Cosmetic composition for anti-itching effect comprising isosecotanapartholide}

본 발명은 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 하기 화학식 [1]로 표시되는 이소세코타나파솔라이드(Isosecotanapartholide)를 유효성분으로 함유하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

가려움증이란 많은 피부질환에서 유발되는 감각으로 주로 아토피 피부염, 접촉 피부염, 두드러기, 결절성 양진, 옴, 만성단순태선, 곤충물림, 화폐상 습진 등의 질환과 관련하여 발생한다. 이러한 가려움증은 피부신경이 자극을 받아 생기는 것으로 가려움증을 없애기 위해서 심하게 긁거나 문지르는 경우 홍반, 균열, 궤양, 팽진, 색소침착 등이 나타나며 좀 더 지속되면 피부가 두꺼워지는 상태가 된다.(Greaves et al, The Lancet., 348, pp.938-40, 1996)

임상학적으로 가려움은 두 가지 의미를 갖는데 하나는 원래 가려움증을 야기시키지 못하던 아주 약한 자극에도 가려움증을 느끼는 과민성에 의한 가려움증(hyperknesis)과 다른 하나는 바늘로 찌르는 통증 감각과 같은 가려움증으로 가려움증과는 무관한 이질적인 자극에 대한 과민성(allokness)가려움이 있다. 이러한 두 가지 가려움증의 발병은 다양한 외부요인(아토피 피부염, 접촉 피부염, 두드러기, 결절성 양진, 옴, 만성단순태선, 곤충물림, 화폐상 습진)에 의해 유발되며, 이렇게 유발된 가려움증은 이를 해결하기 위해 피부를 긁게 되고 이는 다시 가려움증으로 이어지는 순환 고리가 형성되어, 가려움증과 이와 동반하는 염증적 질환이 증가하는 악순환이 이어지게 된다.(이갑석, Allergy asthma respir Dis2(1):8-15,March 2014) 가려움증은 피부에서의 염증반응과 복잡하게 얽혀 있으며, 가려움증 억제의 차단은 이로 인해 야기되는 다양한 질병들의 치료의 선행적 과제로 여겨질 수 있다. 현재 가려움증 억제제로 많이 사용되고 있는 항히스타민제는 아토피로 유발되는 가려움증에 효과적이지 못하다. 그 이유는 가려움증을 유발하는 다양한 경로에서 히스타민 단지 하나에 불과하다는 사실에 기인한다.(Buddenkotte J, Steinhoff M. Pathophysiology and therapy of pruritus in allergic and atopic diseases. Allergy 2010;65:805-821.) 가려움증 완화, 염증완화, 물리적 자극에 의한 긁기를 줄이는 복합적 문제 해결은 피부의 가려움증을 유발하는 다양한 질병들의 해결책을 제시할 수 있을 것이다.

사이토카인은 세포 간 상호 기작에서 중요한 역할을 담당하고 있으며 이 중 인터루킨-31(IL-31)은 인터루킨-6 군 류에 속하여 인터루킨-31알에이 (IL-31 receptor A)와 OSMR(Oncostain M receptor)로 구성된 이종수용복합체(Heterodimeric receptor complex)로 구성된다. 인터루킨-31은 환경과 가깝게 접해있는 피부조직에서 선천면역(innate imunity)과 양자면역(adaptive immunity)에서 중요한 역할을 담당한다. 인터루킨-31의 발현증가는 아토피와 같은 가려움증을 포한한 질환뿐만 아니라 알레르기(allergy)나 염증성 장내질병(inflammatory bowel disease)과 연결 되어져 있다. (C. Cornelissen et al. European Journal of Cell Biology 91 (2012) 552?566) 인터루킨-31의 처치는 불완전한 표피두께, 표피조지형성 방해, 배아(stratum basale)의 배열변경 과립층(stratum granulosum) 분화 약화를 유발하며(Cornelissen, C. J. Allergy Clin. Immunol. 2012, 129, 426?33. ) 인터루킨-31의 과발현 마우스를 이용한 실험에서는 심한가려움증(severe pruritus) 탈모(Alopecia)와 피부손상이 야기됨이 밝혀졌다.(Dillon, S.R. Nat. Immunol. 2004, 5,752?760.) 특히 양진결절(Prurigo nodularis), 만성적 두드러기(cronic spontaneous urticaria) 알레르기성 접촉성 피부염 등과 같은 가려움증과 연결된 질환에 중요 역할을 한다.( Sonkoly, E. et al. J. Allergy Clin. Immunol. 2006, 117, 411?17., Raap, U. et al. Exp. Dermatol. 2010, 19, 464?66.)

인터루킨-33(IL-33)은 피부표면의 세포 내에 존재한다. 심하게 긁거나 꽃가루, 진드기 등으로 자극을 받으면 세포로부터 나와 백혈구 등과 결합하고 알레르기를 유발한다. 아토피성 피부염 환자에는 인터루킨-33이 많은 것으로 알려져 있는데, 최근 유전자를 조작해 인터루킨-33을 야생형보다 약 10배 만드는 쥐를 이용한 실험에서 쥐의 얼굴과 다리, 꼬리 등에 가려움을 수반하고 피부가 두꺼워지는 아토피성피부염 증상을 나타냈다. 유전자 조작 쥐는 가려움의 토대가 되는 히스타민을 분비하는 비만세포가 야생형보다 약 3배 증가했다. (Imai et al. PNAS, 2013, vol. 110 , no. 34, 13921-13926)

인터루킨-31과 인터루킨-33은 피부염으로 인한 피부 염증, 가려움증과 관련이 있다는 사실이 최근 여러 연구를 통해 밝혀졌다. 따라서 Human keratinocyte에서 인터루킨-31과 인터루킨-33의 수용체(receptor)발현 감소효과를 조사하여 가려움 완화 및 피부염 치료에 효과가 있는 식품, 의약품 및 화장품 원료를 탐색할 수 있으며, 이는 효과적이면서도 부작용이 적은 안전한 가려움증치료제 개발에 응용될 수 있을 것이다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 천연물 유래 화합물 이소세코타나파솔라이드(Isosecotanapartholide)를 함유하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물의 경우, 세포독성이 발견되지 않아 안전성이 우수하고 다양한 가려움증의 원인이 되는 사이토카인들 중 IL-31(Interleukin-31) 또는 IL-33(Interleukin-33)를 억제시킴으로써 가려움증을 억제 및 완화시킬 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

JP

5307369

B2

따라서, 본 발명의 주된 목적은 다양한 가려움증의 원인이 되는 사이토카인들 중 IL-31(Interleukin-31) 또는 IL-33(Interleukin-33)를 억제시킴으로써 가려움증의 억제 및 완화 효과가 우수한 이소세코타나파솔라이드를 유효성분으로 함유하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 [1]로 표시되는 이소세코타나파솔라이드(Isosecotanapartholide)를 유효성분으로 함유하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물을 제공한다.

화학식 [1]

본 발명에서 동정된 화합물 “이소세코타나파솔라이드”는 다양한 천연물에 함유되어 있다. 예컨대 더위지기(Artemisia iwayomogi), 애엽(Artemisia princeps var. orientalis 'Pampan' Hara), 또는 쑥에 함유되어 있다. 상기 이소세코타나파솔라이드 화합물은 신규 미백제, 미백용화장료 조성물로 응용가능성이 개시된 적이 있다[JP 5307369]. 그러나 아직까지 본 발명에서 동정된 화합물 “이소세코나타파솔라이드”의 가려움증 억제 및 완화에 관한 연구는 진행되어 있지 않은 실정이다.

이에, 본 발명자들은 애엽으로부터 동정한 이소세코타나파솔라이드가 가려움증 억제 및 완화에 효과가 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서의 상기 용어 ‘가려움증’은 소양증이라고도 하며, 다양한 피부염에 의해 발생 되는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 이소세코타나파솔라이드(Isosecotanapartholide)는 화장료 조성물 총 중량 대비 0.00001 내지 5 중량% 함유될 수 있으며, 바람직하게는 0.0001 내지 0.5 중량% 함유되는 것을 특징으로 하며, 이에 제한되지 않는다. 이소세코타나파솔라이드가 0.0001ppm미만으로 함유할 경우, 화장료에 첨가시 너무 극소량으로 유효성분으로 인한 가려움증 개선 효과가 미미하며, 0.5 중량% 초과 시, 피부 안전성이나 효과에서는 문제가 없으나 상기 이소세코타나파솔라이드를 천연물에서 정제하기 때문에 정제물로 대량 얻기 힘들며 생사 단가에서 문제가 발생할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 이소세코타나파솔라이드(Isosecotanapartholide)는 종래 당업계에 알려진 화학합성법으로 제조되거나 천연물에서 분리될 수 있으나, 바람직하게는 애엽으로부터 분리된 것임을 특징으로 한다.

본 발명자들은 애엽(Artemisia princeps)추출물을 박막크로마토그래피하고 각 성분을 분리한 후 이들 성분 중 피부세포에서의 인터루킨-31과 인터루킨-33의 발현을 억제하는 성분인 이소세코타나파솔라이드에 주목하였다. 상기 이소세코타나파솔라이드는 쑥이나 국화과로부터 분리 정제되는 단일화합물로, 가려움증 완화의 용도로 사용된 예는 없었으며, 본 발명에서 처음으로 이소세코타나파솔라이드의 가려움증 억제를 위한 조성물로 사용될 수 있음을 발견한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 가려움증을 유발하는 원인 또는 형태는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 염증성 피부염, 아토피성 피부염, 살갗의 거칠어짐으로 인한 피부염, 땀띠, 진무름, 동상, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 건선 또는 유건선으로 야기되어 발생하는 것을 특징으로 한다. 상기 가려움증의 경우, 계속되는 가려움으로 인해 지속적으로 피부를 문지르거나 긁거나, 또는 꼬집게 된다. 이에 의해, 피부의 진무름, 찰과상, 태선, 양진, 과색소 침착 또는 색소 침착의 감소 등 2차적인 피부손상이 유발되며, 피부에서 염증반응을 유도하는 여러 물질들이 분비되고, 이러한 분비는 다시 가려움을 증가시켜 가려움-긁기의 순환 고리를 형성하게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 이소세코타나파솔라이드(Isosecotanapartholide)는 사이토카인(cytokine)의 방출량을 감소시킴으로써 가려움증 억제 및 완화 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-31(Interleukin-31) 또는 IL-33(Interleukin-33)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실험예에 따르면, 본 발명의 이소세코타나파솔라이드의 경우, 인간 각질형성세포(HaCaT cell)에서 가려움증과 관련이 있는 IL-31 및 IL-33의 발현 억제 효과가 우수하다는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때, 본원발명의 이소세코타나파솔라이드는 가려움증이 발생할 때 방출되는 사이토카인인 IL-31 및 IL-33의 발현을 억제함으로써 가려움증의 억제 및 완화 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다(실험예 2 내지 4 참조).

또한, 본 발명의 이소세코타나파솔라이드는 TNF-알파와 IFN-감마에 의해 유발되는 IL-1베타(IL-1β) 및 인터루킨-6(IL-6) 발현을 억제하여 면역 과민성 반응과 관련된 인터루킨-6, 인터루킨-1베타의 발현 억제를 유의하게 감소시킬 수 있음을 확인하여, 이소세코타나파솔라이드가 매우 우수한 가려움 억제 효과를 나타냄을 확인하였다(실험예 2 참조).

또한, 피부각질세포에서 이소세코타나파솔라이드의 세포독성을 확인하였으며, 세포독성이 발견되지 않아 안전성이 우수하다는 것을 확인할 수 있었다(실험예 1).

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양로션, 영양크림, 아이크림, 마사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우다, 팩, 모발용 화장품류, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스 또는 바디클렌저로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 한다. 상기 모발용 화장품류로는 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어로션, 샴푸, 헤어린스, 트리트먼트, 헤어크림, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어젤, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이 일 수 있으나, 이제 한정되지 않는다.

본 발명이 화장료 조성물로 이용되는 경우에는, 유효 성분으로서의 이소세코타나파솔라이드 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스 등을 포함할 수 있다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 이소세코타나파솔라이드는 상기 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.00001 - 5 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 - 0.5 중량%로 배합될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 화합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 페이스트, 크림, 겔, 파우더, 스프레이 용액, 유탁액, 현탁액, 로션, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 상세하게는, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 샴푸 또는 바디클린저의 제형으로도 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물이 피부외용 약학적 조성물로 이용되는 경우에는, 유효 성분으로서의 이소세코타나파솔라이드를 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.0001 내지 0.5 중량%로 포함한다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 이용되는 경우, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있고, 바람직하게는 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 이용되는 경우 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.

본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 이용되는 경우, 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 액상, 크림상, 페이스트상, 고체상 등의 피부에 적용시킬 수 있는 모든 제형으로 제조가 가능하며, 통상의 첨가제를 가하여 가려움증 완화를 위한 크림, 로션, 액상의 에센스 타입 등의 조성물로 제조될 수 있으며 이들 제형의 에어졸 타입도 포함한다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 이소세코타나파솔라이드는 각질세포에서 인터루킨-31 및 인터루킨-33 receptor의 발현을 억제시킴과 동시에 TNF-알파와 IFN-감마에 의해 유발되는 인터루킨-1 베타 및 인터루킨-6 발현을 억제하여 가려움증의 억제 및 완화에 우수한 효과를 나타낸다. 또한, 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

도 1은 애엽 추출물의 고성능액체크로마토그래피의 분석 도면을 나타낸 것이다.
도 2는 이소세코타나파솔라이드 0.05% 용해액의 고성능액체크로마토그래피의 분석 도면을 나타낸 것이다.
도 3은 이소세코타나파솔라이드의 세포독성을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 이소세코타나파솔라이드의 IL-1beta 분비 조절을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 이소세코타나파솔라이드의 IL-6 분비 조절을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 이소세코타나파솔라이드의 IL-33 분비 조절을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 이소세코타나파솔라이드의 IL-31 분비 조절을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 이소세코타나파솔라이드의 IL-31 및 IL-33 억제 효과를 유전자 수준에서 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 이소세코타나파솔라이드의 IL-31 및 IL-33 억제 효과를 단백질 수준에서 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 이소세코타나파솔라이드의 가려움증 개선 효과를 임상실험을 통해 평가한 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 이소세코타나파솔라이드의 제조

애엽(Artemisia princeps)으로부터 다음과 같이 화합물 이소세코타나파솔라이드를 분리하였다.

먼저, 경동시장에서 구입한 애엽을 건조한 뒤 세절한 전초 5kg에 95%에탄올 50L를 가하여 실온에서 3일 이상 3회 반복 추출한 후 여과하여 얻은 여과액을 감압농축기(EYELA사, N-1000, 일본)로 감압 농축하여 조추출물을 제조한다. 제조된 조추출물 중 200g을 2L 증류수로 현탁시킨 후 동량의 에틸아세테이트를 가하여 6회 반복 추출하고 분액깔때기에서 분획하여 에틸아세테이트층을 회수한 뒤 에틸아세테이트층을 감압농축하여 애엽 에틸아세테이트 가용 추출물 70g을 수득하였다.

상기에서 수득된 애엽의 에틸아세테이트 가용 추출물을 메탄올 용액에 용해시킨 후 디클로로메탄:메탄올=80:1인 혼합용액을 사용하여 칼럼(4.5×40cm)에 충진한 실리카겔(머크사, 상품명:9385)에 분획물을 흡착시키고 디클로로메탄 : 메탄올 (80:1→50:1→30:1→20:1→15:1→5:1→1:1)의 조건으로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 시행하여 용출물을 크게 6개의 분획으로 나누었고 3번 용출물에서 하기 표 1에 기재된 조건의 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 하기 물성치를 갖는 이소세코타나파솔라이드를 수득하였고, 하기 실험예에 사용하였다. 표 2에 기재된 조건으로 애엽추출물의 고성능액체크로마토그래피 분석 도면은 도 1에 나타내었다.

컬럼(Column)	심팍 프렙-ODS(Shim-Pak prep-ODS) 컬럼, 시마즈(Shimadzu)
컬럼온도(Clumn temperature)	30℃
유속(Flowrate)	15mL/min
측정기(Detector)	UV 220nm
주입부피(Injection Volume)	400㎕
이동상(Mobile phase)	15% 메탄올

컬럼(Column)	캅셀팍 C₁₈4.6 × 250㎜ 시세이도사
컬럼온도(Clumn temperature)	30℃
유속(Flowrate)	1.0mL/min
측정기(Detector)	UV 220nm
주입부피(Injection Volume)	20㎕
이동상(Mobile phase)	15% 메탄올

NMR 기기로 H¹-NMR은 바리안사(Varian, GEMINI, 400 MHz), C¹³-NMR은 바리안사(Varian, GEMINI, 100 MHz)로 분리된 화합물의 구조를 분석하였으며, DMSO(알드리치사)를 용매로 사용하였고, NMR 결과는 이미 발표된 자료와 일치함을 확인할 수 있었다.[Hanna Ahn. et al., Arch Pharm Res Vol 26, No4, 301-305, 2003]

¹H-NMR(DMSO-d ₆ ,400MHz):δ1.70(1H,m,H-8),1.85(1H,m,H-8’),2.05(3H,s,H-14),2.08(1H,d,H-2),2.11(3H,s,H-15),2.45(2H,m,H-9),2.66(1H,dd,J=18.2,6.2Hz,H-2’),3.05(1H,m,H-7),4.55(1H,s,H-6),5.02(1H,d,J=5.6Hz,H-3),5.61(1H,brs,-OH),5.73(1H,d,J=2.5Hz,H-13),6.11(1H,d,J=2.9Hz,H-13’)

¹³C-NMR(DMSO-d ₆ ,100MHz):δ13.4(C-15),26.8(C-8),29.7(C-14),39.1(C-9),41.3(C-7),44.3(C-2),69.7(C-3),75.4(C-6),121.6(C-13),135.7(C-5),139.1(C-11),169.6(C-12),175.0(C-4),203.4(C-1),207.6(C-10)

참고예 1: 이소세코타나파솔라이드의 순도 분석

상기 실시예 1에서 수득한 이소세코타나파솔라이드의 순도를 알아보기 위해 상기 표 2에 기재된 조건의 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 순도 분석을 하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

실험물질	이소세코타나파솔라이드 함량(%)
실시예 1	99.9%

분석결과 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 정제물은 고성능 액체 크로마토그래피의 면적 대비 99.9%의 함량으로 정제가 되었음을 알 수 있었다.

실시예 2: 정제된 이소세코타나파솔라이드 0.05% 용해액 제조

상기 실시예 1에서 수득된 화합물 이소세코타나파솔라이드를 0.05 중량% 함유되도록 정제수와 부틸렌글리콜 혼합액(30 중량%)에 상온에서 1시간 교반하여 완전히 용해한 후 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하여 이소세코타나파솔라이드 0.05 중량 % 용해액을 제조하였다.

참고예 2: 이소세코타나파솔라이드 0.05% 용해액의 분석

상기 실시예 2에 용해된 용해액은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 상기 표 2의 방법으로 분석하여 도면은 도 2에 나타내었다.

실험예 1: 인간피부 세포주 HaCaT 세포에서의 세포 독성 측정

실시예 1에서 분리된 이소세코타나파솔라이드에 대한 세포 독성을 평가하기 위해, CCK-8 assay를 진행하였다. 세포 생존율의 측정은 CCK-8 kit를 이용하였다. Cell을 96 well plate에 well당 2.5 x 10⁴×90㎕ media로 분주한 후 37℃ CO₂ incubator에서 24 시간 배양을 하였다. 이 후 HaCaT 세포에 이소세코타나파솔라이드(1.25, 2.5, 5, 10 ng/mL)을 농도별로 희석시켜 24 시간 동안 적용시킨 후 kit sol'n 10㎕를 넣고 차광하여 37 ℃ incubator에 넣고 1 시간 후에 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 이소세코타나파솔라이드를 처리한 모든 농도에서 세포 독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 사이토카인 분비 조절 확인 ( ELISA )

실시예 1에서 분리된 이소세코타나파솔라이드에 대한 사이토카인의 분비 조절을 확인하기 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 실험에 사용된 HaCaT keratinocyte를 60㎜ dish에 2×10⁵ cells/㎖ 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 부착시켰다. 본 발명의 이소세코타나파솔라이드를 농도별로 1시간 동안 전 처리하고 IFN-γ(10 ng/mL)와 TNF-α(10 ng/mL)를 처리한 후, 24시간 후 세포의 상층액을 수거하여 실험에 사용하였다. IL-1beta, IL-6, IL-31, IL-33의 cytokine은 eBioscience (CA, USA)에서 판매하는 ELISA kit를 사용하여 측정하였다. 좀 더 상세히 설명하면, coating buffer로 희석한 capture Ab를 well당 100㎕씩 넣고 4℃ 에서 overnight하였다. 1×assay diluent를 well당 200㎕씩 넣어 실온에서 1시 간 동안 방치한 후, 최고농도부터 단계 희석한 standard와 시료를 well당 100㎕씩 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 계속해서 1×assay diluent로 희석한 detection Ab를 well당 100㎕씩 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 1×assay diluent로 희석한 avidin-HRP를 well당 100㎕씩 넣어 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 마지막으로 substrate solution을 well당 100㎕씩 넣어 실온에서 15분간 방치한 후, stop solution을 well당 50㎕씩 넣어 반응을 정지시키고 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 도 4 내지 7에 나타내었다. 도 4 내지 7에서 나타나는 바와 같이, HaCaT keratinocyte 세포 배양액에서 이소세코타나파솔라이드가 농도 의존적으로 IL-31, IL-33의 방출량을 감소시키는 것을 확인하였다.

실험예 3: 중합효소 연쇄반응 분석 ( Reverse transcription - PCR analysis )

실시예 1에서 분리된 이소세코타나파솔라이드를 시료로 역전사 중합 효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 수행하여, 유전자 수준에서 사이토카인의 방출 억제 정도를 측정하였다. 좀 더 상세히 설명하면, 전체 RNA의 분리는 RNeasy Plus mini kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하였으며 제조자의 프로토콜을 사용하여 정제하였다. DNase의 처리 된 총 RNA의 1㎍ 은 first strand-cDNA를 사용 하였다. 이 반응은 임의의 프라이머 및 M-MLV 역전사 효소(Invitrogen Corp., CA, USA)를 사용하여 수행 하였다. The general PCR conditions : 30 35 cycles at 94 ℃ for 2 10 min, 94 ℃ for 30 s 3 min, 50 ℃ - 58 ℃ for 30 s 1 min, 72 ℃ for 30 s 1 min, and 72 ℃ for 4 7 min 조건으로 진행하였다. 이미지는 Quantity One software (Bio-Rad, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 사용한 primer는 하기 표 4와 같다.

Genes	Forward (5'→3')	Reverse(5'→3')
IL-31	GTCTTGGTATTTATGGAATGC	CCAGGGAGCATTGACAACTCTTAG
IL-33	AGCCTTGTGTTTCAAGCTGG	ATGGAGCTCCACAGACTCTTC

실험에 사용된, IL-31의 경우 HaCaT 세포에 IFN-γ를 20ng/mL의 농도로 24시간 반응시켰고, IL-33은 HaCaT 세포에 TNF-a(20ng/mL)와 IFN-γ(20ng/mL)의 농도로 처리하여 24시간 반응하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 나타나는 바와 같이, 이소세코타나파솔라이드에 대한 IL-31, IL-33의 감소능을 확인한 결과 농도 IL-31, IL-33의 발현을 감소시켜주는 것을 확인하였다.

실험예 4: 단백질 발현 분석 ( Western blot analysis )

본 실험예에서는 실시예 1에서 분리된 이소세코타나파솔라이드를 시료로 사용하여 단백질 수준에서 사이토카인의 방출 억제 정도를 확인하기 위해 Western blot 분석을 수행하였다. 좀 더 상세히 설명하면, hDPCs 를 50mM Tris, pH 8.0, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.5% 데옥시콜릭산(deoxycholic acid), 1mM PMSF를 포함하는 RIPA 완충액으로 용해하고 아이스에서 15분 동안 프로테아제 억제제(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)를 섞어서 4℃에서 10분 동안 20,000 xg로 원심 분리하였다. 상청액을 10분 동안 재 원심분리하였고, BCA protein assay kit(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 단백질(20㎍)을 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하였으며, PVDF (polyvinylidene fluoride) 멤브레인 (Millipore Corp, Bedford, MA)으로 흡착시켰다. 멤브레인을 실온에서 2시간 동안 0.1% Tween-20 및 5%의 skim milk (non-fat milk)가 포함된 PBS에서 반응시키고, 1시간 동안 PBS/0.2% BSA로 희석된 1차 항체 IL-31, IL-33를 사용하여 탐침하였다. 세척한 후, 멤브레인을 2차 HRP가 부착된 항-래빗 (anti-rabbit) 또는 HRP가 부착된 항-마우스(anti-mouse) 항체 (Amersham, Arlington Heights, IL)로 반응하고, 상기 밴드를 ECL Advance kit (Amersham)로 시각화하였다. 로딩 대조군(Actin) 밴드로 표준화하였다. 가려움증과 관련된 사이토카인인 IL-31, IL-33의 단백질 수준의 조절을 확인하기 위하여, IL-31의 경우 HaCaT 세포에 IFN-γ를 20 ng/mL의 농도로 24시간 반응시켰고, IL-33은 HaCaT 세포에 TNF-a (20 ng/mL)와 IFN-γ (20 ng/mL)의 농도로 처리하여 24시간 반응하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 측정결과, 도 9에서 나타나는 바와 같이 이소세코타나파솔라이드가 농도 의존적으로 IL-31, IL-33의 발현을 단백질 수준에서 감소시켜주는 것을 확인하였다.

제형예 1: 영양로션 제조

실시예 2의 용해액을 함유한 화장료 중 영양로션을 하기 표 5의 조성으로 제조하였다.

번호	원 료	제형예 1	비교제형예 1
1	실시예 2	2.0	-
2	시토 스테롤	1.70	1.70
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.50	1.50
4	세라마이드	0.7	0.7
5	세테아레스-4	1.2	1.2
6	콜레스테롤	1.5	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4	0.4
8	농글리세린	5.0	5.0
9	선플라우어오일	10.0	10.0
10	카르복시비닐폴리머	0.2	0.2
11	산탄검	0.3	0.3
12	방부제	미량	미량
13	향료	미량	미량
14	정제수	잔량	잔량
	합계	100	100

제형예 2: 영양크림 제조

실시예 2의 용해액을 함유한 화장료 중 영양크림을 하기 표 6의 조성으로 제조하였다.

번호	원 료	제형예 2	비교제형예 2
1	실시예 2	2.0	-
2	시토 스테롤	4.0	4.0
3	폴리글리세릴 2-올레이트	3.0	3.0
4	세라마이드	0.7	0.7
5	세테아레스-4	2.0	2.0
6	콜레스테롤	3.0	3.0
7	디세틸포스페이트	0.4	0.4
8	농글리세린	5.0	5.0
9	선플라우어오일	22.0	22.0
10	카르복시비닐폴리머	0.5	0.5
11	트리에탄올아민	0.5	0.5
12	방부제	미량	미량
13	향료	미량	미량
14	정제수	잔량	잔량
	합계	100	100

제형예 3: 맛사지 크림 제조

실시예 2의 용해액을 함유한 화장료 중 맛사지 크림을 하기 표 7의 조성으로 제조하였다.

번호	원 료	제형예 3	비교제형예 3
1	실시예 2	2.0	-
2	밀납	10.0	10.0
3	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
4	솔비탄세스퀴올레이트	0.8	0.8
5	유동파라핀	40.0	40.0
6	스쿠알란	5.0	5.0
7	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0	4.0
8	카르복시 비닐폴리머	0.2	0.2
9	글리세린	5.0	5.0
10	부틸렌글리콜	3.0	3.0
11	프로필렌글리콜	3.0	3.0
12	트리에탄올아민	0.2	0.2
13	방부제	미량	미량
14	색소	미량	미량
15	향료	미량	미량
16	정제수	잔량	잔량
	합계	100	100

제형예 4: 헤어토닉 제조

실시예 2의 용해액을 함유한 화장료 중 헤어토닉을 하기 표 8의 조성으로 제조하였다.

번호	원 료	제형예 4	비교제형예 4
1	실시예 2	2.0	-
2	레조시놀	0.1	0.1
3	멘톨	0.05	0.05
4	판테놀	0.2	0.2
5	살리실산	0.1	0.1
6	토코페릴 아세테이트	0.1	0.1
7	염산피리독신	0.1	0.1
8	피마자유	5.0	5.0
9	색소	적량	적량
10	향료	적량	적량
11	에탄올	적량	적량
12	정제수	잔량	잔량
	합 계	100	100

제형예 5: 헤어컨디셔너 제조

실시예 2의 용해액을 함유한 화장료 중 헤어토닉을 하기 표 9의 조성으로 제조하였다.

번호	원 료	제형예 5	비교제형예 5
1	실시예 2	2.0	-
2	세탄올	3.5	3.5
3	자기유화형 모노스테아린산글리세린	1.5	1.5
4	프로필렌 글리콜	2.5	2.5
5	염화스테아릴메틸벤질 암모늄(25%)	7.0	7.0
6	파라옥시안식향산메틸	0.3	0.3
7	색소	적량	적량
8	향료	적량	적량
9	정제수	잔량	잔량
	합 계	100	100

시험예 5: 임상 효과 실험 평가 (가려움증개선)

상기 처방예 2의 제형예 2 및 비교제형예 2을 이용하여, 가려움의 개선도를 평가하였다. 아토피, 습진, 두드러기, 해충에 의한 피부가려움증을 느끼고 있으며, 피험자 중 다른 전신 질환이 없고, 최근 한 달간 경구 항생제 및 면역 억제제를 사용하지 않은 사람 중에서 심한 가려움을 호소하는 40명을 선정하였다. 가려움증의 원인에 대한 구분은 하지 않았으며 단지 피험자가 가렵다고 느끼는 정도가 초기 5이상의 강도를 기준으로 선정하였다. 연령은 20세에서 45세까지였으며, 평균 연령은 31.5세이었고, 남자가 23명, 여자는 17명이었다. 환자들은 실험 시작 전 일주일 이내 스테로이드 외용제를 사용하지 않았으며 실험기간 중에는 스테로이드 외용제의 사용을 제한하였다. 처방예 2의 제형예 2 및 비교예 2를 따라 제조된 영양크림을 환부로 규정된 부위에 비교예 2에 의하여 제조된 시료를 1회 도포 후 30분 후, 1시간 후의 가려움(소양증)의 정도를 주관적인 판단에 따라 수치화하였으며, 이후 동일한 부위에 제형예 2에 의하여 제조된 시료를 1회 도포하여 30분 간격으로 3시간 동안 가려움(소양증)의 정도를 주관적 판단에 따라 수치화하도록 하였다. 가려움증 완화 평가는 가려움증의 강도를 1~10의 수치로 나누어 현재 느끼고 있는 가려움증의 강도를 수치로 나타내게 하였다. 각각의 시간에 따라 얻어진 강도수치를 초기 강도수치로 나누어 백분율로 수치화하여 얻어진 평균값(가려움 활성%)을 시간에 따라 하기 표 10에 나타내었다. 또한, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

내용	Time(min)	가려움 활성(%)	표준편차
비교예 처리전	0	100.0	0.0
비교예 처리 30분 경과	30	91.5	12.4
비교예 처리 60분 경과 제조예 처리 전	60	85.0	13.9
제조예 처리 30분 경과	90	36.2	24.9
제조예 처리 60분 경과	120	7.3	12.4
제조예 처리 90분 경과	150	1.3	4.8
제조예 처리 120분 경과	180	0.9	4.1
제조예 처리 150분 경과	210	1.8	5.4
제조예 처리 180분 경과	240	2.2	5.9

실험결과, 도 7에 나타난 것과 같이, 비교 제형예 2를 병변부위에 도포 후 초기 가려움증 강도보다 30분 경과 후 91.5%, 60분 경과 후 85.0%로 낮아졌으나, 동일한 병변부위에 실시예 2가 함유된 제형예 2를 도포하면 가려움증 강도가 30분 경과 후 36.2%, 60분경과 후 7.3%로 급속하게 줄어들었으며, 90분경과 후에는 거의 가려움증을 느끼지 못하는 수준까지 줄어들었다. 따라서 본 발명에서 제형예 2에 함유된 실시예 2가 가려움증을 완화시키거나 억제하는데 뚜렷한 효과가 있음을 확인하였다.

Claims

하기 화학식 [1]로 표시되는 이소세코타나파솔라이드(Isosecotanapartholide)를 유효성분으로 함유하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물.
화학식 [1]
제 1항에 있어서, 상기 이소세코타나파솔라이드(Isosecotanapartholide)는 화장료 조성물 총 중량 대비 0.0001 내지 0.5 중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 이소세코타나파솔라이드(Isosecotanapartholide)는 애엽으로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 가려움증은 염증성 피부염, 아토피성 피부염, 살갗의 거칠어짐으로 인한 피부염, 땀띠, 진무름, 동상, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 건선 또는 유건선으로 야기되어 발생하는 것을 특징으로 하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 이소세코타나파솔라이드(Isosecotanapartholide)는 사이토카인(cytokine)의 방출량을 감소시킴으로써 가려움증 억제 및 완화 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-31(Interleukin-31) 또는 IL-33(Interleukin-33)인 것을 특징으로 하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양로션, 영양크림, 아이크림, 마사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우다, 팩, 모발용 화장품류, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스 또는 바디 클렌저로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 가려움증 억제 및 완화용 화장료 조성물.