KR101582841B1 - 콘쥬게이트된 인자 ｖｉｉｉ 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 변화된 순환 반감기를 갖는 B-도메인 절단된 인자 VIII 분자에 관한 것이며, 상기 분자는 친수성 폴리머와 공유적으로 결합한다. 또한 본 발명은 이러한 분자를 얻는 방법 및 이러한 분자의 사용에 관한 것이다 .

Description

콘쥬게이트된 인자 ＶＩＩＩ 분자{CONJUGATED FACTOR VIII MOLECULES}
본 발명은 콘쥬게이트된 응고 인자 VIII 분자에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 변화된 순환 반감기를 갖는 콘쥬게이트된 인자 VIII 분자에 관한 것이다.
혈우병 A는 응고 인자 VIII (FVIII) 활성의 결핍 또는 기능장애에 의해 유발되는 유전성 출혈 장애이다. 임상 징후는 1차 지혈에 있는 것이 아니고 - 혈병의 형성이 정상적으로 발생하지만 - 2차 트롬빈 형성의 결여로 인하여 혈병이 불안정하다. 이 질환은 혈액으로부터 분리되거나 재조합적으로 생성되는 응고 인자 FVIII의 정맥내 주입에 의해 치료된다.
현재 치료 권고는 전통적인 필요시 치료로부터 예방으로 이동하고 있다. 내인성 FVIII의 순환 반감기는 12-14시간이며 따라서 사실상 환자에 대해 증상이 없는 생활을 달성하기 위해 예방적 치료를 일주일에 수회 행한다. IV 투여는 많은, 특히 중대한 불편 및/또는 통증과 연관된 어린이 및 청소년을 위한 것이다. 따라서, 일주일 당 인자 VIII 투여의 수를 감소시키기 위해서 바람직하게는 구조가 균일하고, 바람직하게는 안전하고, 바람직하게는 현저하게 연장된 순환 반감기를 갖는 인자 VIII 활성을 갖는 신규의 인자 VIII 생성물에 대한 요구가 본 기술분야에 존재한다. 또한 이러한 분자를 얻고 제조하기 위한 비교적 간단한 방법에 대한 요구가 본 기술분야에 존재한다.
순환 반감기를 연장하기 위한 인자 VIII의 PEG화가 본 기술분야에 공지되어 있다. 그러나 균일한 구조 및 현저하게 개선된 순환 반감기를 갖는 안전한 생성물을 얻는데 장애물이 있었다. 콘쥬게이트된 인자 VIII 분자를 제조하는 이용가능한 방법은 종종 곤란하고, 및/또는 낮은 수율 및/또는 구조가 균일하지 않은 생성물을 야기하는 경향이 있다. 치료 단백질의 연장된 순환 반감기를 갖는 치료 단백질을 얻기 위해서 인위적으로 가공된 O-연결된 글리코실화 부위를 사용하는 것이 WO2008011633에 제안되었지만, 그곳에 콘쥬게이트된 인자 VIII 분자는 개시되어 있지 않다.
발명의 개요
제1 양태에서, 본 발명은 변화된 순환 반감기를 갖는 B 도메인 절단된(truncated) 인자 VIII 분자에 관한 것이며, 상기 분자는 절단된 B 도메인에서 O-연결된 올리고당을 통해 친수성 폴리머와 공유적으로 콘쥬게이트되고, 상기 인자 VIII 활성화는 공유적으로 콘쥬게이트된 측기의 제거를 가져온다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 이러한 분자를 얻는 방법, 이러한 분자의 사용 및 이러한 분자를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
변화된 순환 반감기를 갖는 콘쥬게이트된 인자 VIII 분자가 제공되고, 여기서 콘쥬게이트된 측기(예컨대 친수성 폴리머)가 활성화시 제거된다. 본 발명에 따른 분자는 바람직하게는 구조가 균일하고 - 적어도 절단된 B-도메인에서 친수성 폴리머의 위치에 관하여 - 바람직하게는 유리한 안전성 프로파일을 갖는다. 마찬가지로, 이러한 분자를 얻기 위한 비교적 간단한 방법이 본원에 제공된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 활성화된 인자 VIII 분자는 내인성 활성화된 인자 VIII와 유사하다.
발명의 상세한 설명
정의:
인자 VIII 분자: FVIII/인자 VIII는 간세포에 의해 주로 생성되는 대형의 복합 당단백질이다. FVIII는 신호 펩티드를 포함하는 2351 아미노산으로 구성되며, 상동성에 의해 한정되는 여러 별개 도메인을 포함한다. 3개의 A-도메인, 고유의 B-도메인, 및 2개의 C-도메인이 있다. 도메인 순서는 NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH로 열거될 수 있다. FVIII는 B-A3 경계에서 분리되는 두개의 쇄로서 혈장에서 순환한다. 쇄들은 2가 금속 이온-결합에 의해 연결된다. A1-A2-B 쇄는 중쇄(HC)로 불리는 한편 A3-C1-C2는 경쇄(LC)로 불린다.
내인성 인자 VIII 분자는 다양한 크기의 B 도메인을 갖는 분자의 풀(pool)로서 생체내 순환한다. 아마도 생체내 발생하는 것은 B 도메인의 점진적 효소 제거이며 다양한 크기의 B-도메인을 갖는 분자의 풀을 야기한다. 일반적으로 B-도메인의 마지막 부분이 제거되는 위치 740에서의 분열이 트롬빈 활성화와 연관되어 발생하는 것으로 생각된다. 그러나, 예컨대 위치 740에서 분열 부위가 손상된 인자 VIII 변이체가 활성일 수 있다는 것을 배재할 수 없다.
본원에 사용된 "인자 VIII" 또는 "FVIII"는 내재성 응고 경로의 구성원이고 혈액 응고에 필수적인 사람 혈장 당단백질을 말한다. "천연 FVIII"는 SEQ ID NO. 1 (아미노산 1-2332)에 나타낸 전장 사람 FVIII 분자이다. B-도메인은 SEQ ID NO 1에서 아미노산 741-1648에 걸쳐져 있다.
Figure 112010054481872-pct00001
본 발명에 따른 인자 VIII 분자는 B 도메인 절단된 인자 FVIII 분자이며, 여기서 나머지 도메인은 SEQ ID NO. 1에 아미노산 넘버 1-740 및 1649-2332에 나타낸 서열에 상응한다. 따라서 본 발명에 따른 분자는 바람직하게는 포유동물 기원의 변형된 숙주 세포에서 생성된 재조합 분자이다. 그러나, 나머지 도메인(즉 3개의 A-도메인 및 2개의 C-도메인)은 SEQ ID NO 1에 나타낸 아미노산 서열 (아미노산 1-740 및 1649-2332)과 약간, 예컨대 약 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5% 다르다. 특히, 나머지 도메인에 아미노산 변화 (치환, 결실 등)가 도입되어, 예컨대 인자 VIII의 다양한 다른 성분, 예컨대 vW 인자, LPR, 다양한 수용체, 다른 응고 인자, 세포 표면 등과의 결합 성능을 변화시키는 것으로 보인다. 또한, 본 발명에 따른 인자 VIII 분자는 예컨대 절단된 B-도메인 및/또는 분자의 다른 도메인 중 하나 이상에서 다른 번역 후 변형을 포함하는 것으로 보인다. 이들 다른 번역 후 변형은 본 발명에 따른 인자 VIII 분자에 콘쥬게이트된 다양한 분자, 예컨대 폴리머 화합물, 펩티드 화합물, 지방산 유래 화합물 등의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 인자 VIII 분자는 그들이 B 도메인 이외에 변형되었는지 여부에 상관없이 다른 번역 후 변형을 갖고, 모두 FVIII와 기능적으로 유사하거나 동등한 방식으로 응고 연속단계에서 기능하는 능력을 의미하는 인자 VIII 활성을 갖고, 활성화된 혈소판 상에서 FIXa와의 상호작용을 통해 FXa의 형성을 유도하고, 혈전의 형성을 지원한다. 활성은 혈병 분석, 내인성 트롬빈 포텐셜 분석 등과 같은 그 기술분야에 잘 알려진 기술에 의해 시험관내 평가될 수 있다. 본 발명에 따른 인자 VIII 분자는 천연 사람 FVIII의 적어도 약 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 및 100% 또는 100% 이상의 FVIII 활성을 갖는다.
B 도메인: 인자 VIII에서 B-도메인은 SEQ ID NO 1에서 아미노산 741 - 1648에 걸쳐져 있다. B-도메인은 여러 상이한 부위에서 분열되어 순환하는 혈장 FVIII 분자에서 큰 이질성을 발생시킨다. 매우 글리코실화된 B-도메인의 정확한 기능은 공지되어 있지 않다. 공지된 것은 이 도메인이 응고 연속단계에서 FVIII 활성에 불필요하다는 것이다. 이 명백한 기능의 결핍은 B 도메인 결실된/절단된 FVIII가 전장 천연 FVIII에서 목격되는 것과 동일한 생체내 특성을 갖는 것으로 보인다는 사실에 의해 지지된다. 그래도 B-도메인은 적어도 혈청이 없는 조건에서 세포막과의 연관을 감소시킬 수 있다는 지표가 있다.
B 도메인 절단된/결실된 인자 VIII 분자: 내인성 전장 FVIII는 단일쇄 전구체 분자로서 합성된다. 분비 전에, 전구체는 중쇄와 경쇄로 분열된다. 재조합 B 도메인-결실된 FVIII는 두개의 다른 전략으로 생성될 수 있다. B-도메인이 없는 중쇄 및 경쇄는 두개의 다른 폴리펩티드 쇄로서 개별적으로 합성되거나 (2-쇄 전략), 또는 B-도메인 결실된 FVIII는 전장 FVIII 전구체와 동일한 방식으로 중쇄와 경쇄로 분열되는 단일 전구체 폴리펩티드 쇄로서 합성된다 (단일-쇄 전략).
B 도메인-결실된 FVIII 전구체 폴리펩티드에서, 중쇄 및 경쇄 부분은 일반적으로 링커에 의해 분리된다. B 도메인-결실된 FVIII에서 면역성 에피토프 도입의 위험을 최소화하기 위해서, 링커의 서열은 바람직하게 FVIII B-도메인으로부터 유래된다. 링커는 B 도메인-결실된 FVIII 전구체 폴리펩티드를 중쇄와 경쇄로 분리하는 프로테아제를 위한 인식 부위를 포함하여야 한다. 전장 FVIII의 B 도메인에서, 아미노산 1644-1648이 이 인식 부위를 구성한다. B 도메인-결실된 FVIII의 활성화에서 링커의 제거를 유도하는 트롬빈 부위는 중쇄에 위치한다. 따라서, 링커의 크기 및 아미노산 서열은 트롬빈 활성화에 의해 나머지 FVIII 분자로부터의 제거에 영향을 미치지 않을 것 같다. B 도메인의 결실은 FVIII의 생성에 유리하다. 그럼에도 불구하고, B 도메인의 부분은 생산성 감소 없이 링커에 포함될 수 있다. 생산성에 대한 B 도메인의 부정적 효과는 B 도메인의 어떤 특정 크기 또는 서열에 기인하지 않았다.
절단된 B-도메인은 여러 O-글리코실화 부위를 함유할 수 있다. 그러나, 바람직한 실시형태에 따르면, 분자는 절단된 B-도메인에 오직 하나, 대안적으로 두개, 세개 또는 네개의 O-연결된 올리고당을 포함한다.
바람직한 실시형태에 따르면, 절단된 B 도메인은 오직 하나의 잠재적 O-글리코실화 부위를 포함하고, 친수성 폴리머는 이 O-글리코실화 부위에 공유적으로 콘쥬게이트된다.
본 발명에 따른 B-도메인 절단된 분자에서 O-연결된 올리고당은 재조합 수단 및/또는 B-도메인의 절단에 의한 "숨은" O-글리코실화 부위의 노출에 의해 인위적으로 생성된 O-글리코실화 부위에 부착될 수 있다. 두 경우 모두, 이러한 분자는 B-도메인 절단된 인자 VIII 아미노산 서열 설계 및 이어서 아미노산 서열에 절단된 B-도메인에서 O-글리코실화 부위의 가능성을 예측하는 인실리코 분석을 행함으로써 만들어질 수 있다. 이러한 글리코실화 부위를 가질 가능성이 비교적 높은 분자는 적합한 숙주 세포에서 합성될 수 있고 이어서 글리코실화 패턴을 분석하고 절단된 B-도메인에서 O-연결된 글리코실화를 갖는 분자를 후속 선택한다. 재조합 인자 VIII 단백질을 제조하는데 적합한 숙주 세포는 분자가 글리코실화되는 것을 확보하기 위해서 포유동물 기원이 바람직하다. 본 발명을 수행함에 있어서, 세포는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 확립된 포유동물 셀라인이며, CHO (예컨대, ATCC CCL 61), COS-1 (예컨대, ATCC CRL 1650), 베이비 햄스터 신장 (BHK), 및 HEK293 (예컨대, ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) 셀라인을 제한 없이 포함한다. 바람직한 BHK 셀라인은 tk-ts13 BHK 셀라인이며 (Waechter and Baserga, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1106-1110, 1982), 이하 BHK 570 세포라고 한다. BHK 570 셀라인은 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852로부터, ATCC 수탁 번호 CRL 10314로 입수가능하다. tk-ts13 BHK 셀라인은 또한 ATCC로부터 수탁 번호 CRL 1632로 입수가능하다. 바람직한 CHO 셀라인은 ATCC로부터 수탁 번호 CC161로 입수가능한 CHO K1 셀라인과 셀라인 CHO-DXB11 및 CHO-DG44이다.
다른 적합한 셀라인은 Rat Hep I (Rat 헤파토마; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (Rat 헤파토마; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), 사람 폐 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1); DUKX 세포 (CHO 셀라인) (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) (DUKX 세포는 DXB11 세포라고도 함), 및 DG44 (CHO 셀라인) (Cell, 33: 405, 1983, and Somatic Cell and Molecular Genetics 12: 555, 1986)을 제한 없이 포함한다. 또한 3T3 세포, Namalwa 세포, 골수종 및 골수종과 다른 세포의 융합체가 유용하다. 일부 실시형태에서, 세포는 돌연변이 또는 재조합 세포, 예컨대 번역 후 단백질의 변화를 촉매하는 효소(예컨대, 글리코실 트랜스페라제 및/또는 글리코시다아제와 같은 글리코실화 효소, 또는 프로펩티드와 같은 처리 효소)의, 그들이 유래된 세포 종류와 정량적으로 또는 정성적으로 상이한 스펙트럼을 나타내는 세포일 수 있다. DUKX 세포 (CHO 셀라인)가 특히 바람직하다.
현재 바람직한 세포는 HEK293, COS, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 및 골수종 세포, 특히 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.
본 발명의 발명자들은 따라서 B-도메인을 절단함으로써 인자 VIII B-도메인에서 "숨은" O-글리코실화 부위를 활성화하는 것이 가능하다는 것을 나타내었다. 어떤 이론에 구속되지 않고, 이 현상은 변형되는 절단된 B-도메인에서 분자의 3차 구조에 기인할 수 있다. "숨은" O-글리코실화 부위는 따라서 절단된 B-도메인에서 글리코실화에 "접근가능하게 만들어"진다. 이 어프로치의 한가지 이점은 예컨대 알레르기 유발성에 관하여 유리한 안전성 프로파일을 갖는 재조합 분자의 제공이다. 또 다른 이점은 B-도메인 중 글리코실화 부위의 고유의 풍부함 때문에 B-도메인에 0-연결된 올리고당을 갖는 B-도메인 절단된 변이체를 얻는 더욱 간단한 어프로치를 제시할 수 있다는 것일 수 있고, 이것은 재조합 단백질에서 인위적 O-글리코실화 부위를 가공하는 것이 이전에는 어려웠기 때문이다.
wt FVIII 분자에서 B 도메인의 길이는 약 907 아미노산이다. 본 발명에 따른 분자에서 절단된 B 도메인의 길이는 약 10 아미노산 내지 약 700 아미노산으로 다양할 수 있고, 예컨대 약 12-500 아미노산, 12-400 아미노산, 12-300 아미노산, 12-200 아미노산, 15-100 아미노산, 15-75 아미노산, 15-50 아미노산, 15-45 아미노산, 20-45 아미노산, 20-40 아미노산, 또는 20-30 아미노산이다. 절단된 B-도메인은 중쇄 및/또는 경쇄의 단편 및/또는 wt FVIII 분자에서 발견되지 않는 인위적으로 도입된 서열을 포함할 수 있다. 용어 "B-도메인 절단된" 및 "B-도메인 결실된"은 본원에서 서로 교환적으로 사용될 수 있다.
변화된 순환 반감기: 본 발명에 따른 분자는 야생형 인자 VIII 분자에 비해서 바람직하게는 증가된 순환 반감기를 갖는다. 순환 반감기는 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 35%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 45%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 55%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 100%, 더욱 바람직하게는 적어도 125%, 더욱 바람직하게는 적어도 150%, 더욱 바람직하게는 적어도 175%, 더욱 바람직하게는 적어도 200%, 가장 바람직하게는 적어도 250% 또는 300% 증가된다. 더욱 더 바람직하게는, 이러한 분자는 야생형 FVIII의 순환 반감기에 비해서 적어도 400%, 500%, 600%, 또는 700% 증가된 순환 반감기를 갖는다.
친수성 폴리머: 본 발명에 따른 변형기/친수성 폴리머는 바람직하게는 비자연 발생한다. 한 예에서, "비자연 발생 변형기"는 폴리머 변형기이며, 여기에서 적어도 하나의 폴리머 부분이 비자연 발생한다. 또 다른 예에서, 비자연 발생 변형기는 변형된 카르보히드레이트이다. 변형기로의 기능화의 좌위는 "변형된 당"이 효소적으로 폴리펩티드에 첨가되는 것을 방지하지 않도록 선택된다. "변형된 당"은 또한 변형기로 기능화된 임의의 글리코실 미메틱 부분을 말하며 이것은 글리코실트랜스페라아제와 같은 자연 또는 변형된 효소를 위한 기질이다.
폴리펩티드에 추가된 폴리머 변형기는 이러한 폴리펩티드의 특성, 예컨대 그것의 생체이용성, 생물학적 활성 또는 그것의 신체에서의 반감기를 변경시킬 수 있다. 본 발명에 따른 예시적 폴리머는 직쇄 또는 분기일 수 있는 수용성 폴리머를 포함하고, 폴리(알킬렌 글리콜) 및 그것의 유도체와 같은 하나 이상의 독립적으로 선택된 폴리머 부분을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리머 변형기는 수용성 폴리머, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) 및 그것의 유도체 (PEG, m-PEG), 폴리(프로필렌 글리콜) 및 그것의 유도체 (PPG, m-PPG) 등을 포함할 수 있다.
용어 "수용성"은 물에서 어떤 검출가능한 정도의 용해도를 갖는 부분을 말한다. 수용해도의 검출 및/또는 정량 방법은 그 분야에 잘 알려져 있다. 본 발명에 따른 예시 수용성 폴리머는 펩티드, 당류, 폴리(에테르), 폴리(아민), 폴리(카르복실산) 등을 포함한다. 펩티드는 혼합된 서열을 갖고 단일 아미노산, 예컨대, 폴리(리신)으로 구성될 수 있다. 예시 다당류는 폴리(시알산)이다. 예시 폴리(에테르)는 폴리(에틸렌 글리콜), 예컨대, m-PEG이다. 폴리(에틸렌 이민)은 예시 폴리아민이고 폴리(아크릴) 산은 대표적인 폴리(카르복실산)이다.
본 발명에 따른 수용성 폴리머의 폴리머 백본은 폴리(에틸렌 글리콜) (즉 PEG)일 수 있다. 본 발명과 관련하여 용어 PEG는 임의의 그것의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하며, 알콕시 PEG, 이관능 PEG, 다수 가지의 PEG, 분지된 PEG, 분기 PEG, 펜던트 PEG (즉 폴리머 백본에 매달린 하나 이상의 관능기를 갖는 PEG 또는 관련된 폴리머), 또는 그 안에 분열가능한 연결을 갖는 PEG를 포함한다.
폴리머 백본은 직쇄 또는 분기일 수 있다. 분기 폴리머 백본은 일반적으로 그 분야에 알려져 있다. 통상적으로, 분기 폴리머는 중심 분기 코어 부분 및 중심 분기 코어에 연결된 복수의 직쇄 폴리머쇄를 갖는다. PEG는 일반적으로 글리세롤, 펜타에리스리톨 및 소르비톨과 같은 다양한 폴리올에 에틸렌 옥사이드를 첨가함으로써 제조될 수 있는 분기 형태로 사용된다. 중심 분기 부분은 또한 리신 또는 시스테인과 같은 여러 아미노산으로부터 유래될 수 있다. 한 예에서, 분기 폴리(에틸렌 글리콜)은 R(-PEG-OH)m으로서 일반적인 형태로 나타내어질 수 있고, 여기서 R은 글리세롤 또는 펜타에리스리톨과 같은 코어 부분을 나타내고, m은 팔(arm)의 수를 나타낸다. 본원에 그 전체로 참조로 포함되는 미국 특허 No. 5,932,462에 설명되어 있는 것과 같은 다수-팔이 있는 PEG 분자가 또한 폴리머 백본으로서 사용될 수 있다.
도 8은 본 발명의 실시형태에서 사용되는 대표적인 분기 PEG 폴리머를 나타내며, 본원에서 "SA-글리세롤-PEG"라고 한다. 도 8a는 글리칸 또는 폴리펩티드의 아미노산에 연결된 CMP-SA-글리세롤-PEG, 또는 SA-글리세롤-PEG의 예시 SA-글리세롤-PEG 부분을 나타낸다. 도 8b는 Gal 잔기를 통해 글리칸 또는 폴리펩티드에 연결된 SA-글리세롤-PEG 부분을 나타낸다. 도 8c는 Gal-GalNAc 잔기를 통해 글리칸 또는 폴리펩티드에 연결된 SA-글리세롤-PEG 부분을 나타낸다. 도 8d는 Gal-GalNAc 부분을 통해 폴리펩티드의 아미노산에 연결된 SA-글리세롤-PEG 부분을 나타낸다. 다양한 실시형태에서, AA는 트레오닌 또는 세린이다. 예시 실시형태에서, AA는 FVIII 폴리펩티드의 B-도메인의 결실에 의해 O-연결된 글리코실화 부분으로 전환된다. 아래 단락에서 폴리머의 분자량에 관한 논의는 일반적으로 도 8에 나타낸 분기 PEG에 적용가능하다. 도 8에서, 지수 "n"은 아래 단락에서 논의되는 원하는 분자량의 직쇄 (및 따라서 분기) m-PEG를 제공하는 임의의 정수를 나타낸다. 다양한 실시형태에서, "n"은 직쇄 m-PEG 부분이 약 20 KDa 내지 약 40 KDa, 예컨대 약 20 KDa, 약 30 KDa 또는 약 40 KDa이도록 선택된다. 이들 m-PEG 분자량에 상당하는 정수는 약 400 (예컨대 약 455) 내지 약 900 (예컨대 약 910)에 상당한다. 따라서, "n"은 약 40 KDa 내지 약 80 KDa, 예컨대, 약 40 KDa, 약 50 KDa, 약 60 KDa, 약 70 KDa, 또는 약 80 KDa인 분기 PEG를 제공하도록 선택된다.
많은 다른 폴리머 또한 본 발명에 적합하다. 비-펩티드성이고 수용성인 폴리머 백본이 본 발명에 특히 유용하다. 적합한 폴리머의 예는 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 코폴리머 등, 폴리(옥시에틸렌화된 폴리올), 폴리(올레핀성 알콜), 폴리비닐피롤리돈, 폴리(히드록시프로필메타크릴아미드), 폴리([알파] - 히드록시 산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 예컨대 본원에 그 전체로 참조로 포함되는 미국 특허 No. 5,629,384에 설명됨, 및 코폴리머, 터폴리머, 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
폴리머 백본의 각 쇄의 분자량이 변할 수 있지만, 통상적으로 약 100 Da 내지 약 160,000 Da, 예컨대, 약 5,000 Da 내지 약 100,000 Da의 범위에 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 각 콘쥬게이트된 친수성 폴리머의 크기는 약 500 Da 내지 약 80,000 Da, 예컨대 약 1000 Da 내지 약 80,000 Da; 약 2000 Da 내지 약 70,000 Da; 약 5000 내지 약 70,000 Da; 약 5000 내지 약 60,000 Da; 약 10,000 내지 약 70,000 Da; 약 20,000 내지 약 60,000 Da; 약 30,000 내지 약 60,000 Da; 약 30,000 내지 약 50,000 Da; 또는 약 30,000 내지 약 40,000 Da로 다양할 수 있다. 이들 크기는 정확한 측정치라기 보다는 추정치를 나타낸다는 것을 이해하여야 한다. 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 분자는 이종 집단의 친수성 폴리머, 예컨대 크기가 예컨대 10,000, 40,000, 또는 80,000 Da +/- 약 5000, 약 4000, 약 3000, 약 2000, 또는 약 1000 Da인 PEG와 콘쥬게이트된다.
O-연결된 올리고당: N-글리칸과 O-글리칸은 모두 단백질을 생성하는 세포에 의해 단백질에 부착된다. 세포 N-글리코실화 기구는 초기 단백질이 리보솜으로부터 소포체로 전위됨에 따라 아미노산 쇄에서 N-글리코실화 신호 (N-X-S/T 모티프)를 인지하고 글리코실화한다. (Kiely et al. 1976; Glabe et al. 1980).
마찬가지로, O-글리칸은 아미노산 쇄에서 특정 O-글리코실화 부위로 부착되지만, O-글리코실화를 야기하는 모티프는 N-글리코실화 신호보다 더욱 이종이고, 아미노산 서열에서 O-글리코실화 부위를 예측하는 우리의 능력은 아직 불충분하다 (Julenius et al. 2004). 따라서 인위적 O-글리코실화 부위의 구조는 일부 불확실성과 관련된다. 일반적 가정은 천연 FVIII 분자가 임의의 O-글리코실화 부위를 포함하지 않는다는 것이고, 그러므로 당업자는 적어도 하나의 인위적 O-글리코실화 부위가 구성되고 본 발명의 실행과 관련하여 B 도메인으로 삽입될 수 있다는 것을 예측할 수 있다.
따라서 절단된 인자 VIII B 도메인에서 O-연결된 올리고당은 자연 발생 O-연결된 글리코실화 서열 또는 재조합 기술에 의해 인위적으로 구성된 O-연결된 글리코실화 서열에 공유적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, O-연결된 올리고당은 야생형 인자 VIII 인자 분자에서 글리코실화에 노출되지 않지만 B 도메인의 절단 결과로서 O-글리코실화에 이용가능하게 되는 자연 발생 O-연결된 글리코실화 서열에 연결된다. 그것의 예가 실시예 및 SEQ ID NO 2에 나타나 있다(절단된 B-도메인은 아미노산 742-763에 상응). SEQ ID NO 2에서 "숨은" O-글리코실화 부위는 또한 B-도메인이 다소 상이한 위치에서 절단되었더라도, 즉 절단된 B 도메인이 SEQ ID NO 2에 비하여 다소 더 짧거나 (예컨대 SEQ ID NO 2 보다 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산 더 짧음) 더 길더라도 (예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 아미노산) 글리코실화될 것이라는 것이 타당하다. 이 접근은 인위적 O-글리코실화 부위의 생성보다는 B-도메인의 절단에 의해 "숨은" O-글리코실화 부위를 활성화함으로써 유리한 안전성 프로파일(즉 감소된 알레르기 유발성 등)을 갖는 분자를 생성하는데 이점을 갖는다. 인자 VIII B-도메인에서 다른 O-글리코실화 부위는 마찬가지로 상이한 방식으로 분자를 절단함으로써 활성화될 수 있다.
O-연결된 올리고당의 글리코-PEG화: O-글리칸의 생합성은 변형되고 생합성의 비교적 초기에 시알산 잔기의 첨가로 종료될 수 있다. 특정한 시알릴트랜스페라아제 효소는 GalNAcα-Ser/Thr, 또는 코어 1 GalT 작용 후 초기 O-글리칸 코어 아형에 작용할 수 있다. 용어 T 항원은 Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr 이당류의 존재와 연관된다. 이들 구조체의 생성은 동일한 기질에 대한 글리코실트랜스페라아제 중의 경쟁을 포함하고, 따라서 Golgi 장치 내의 글리코실트랜스페라아제의 발현 수준 및 세포이하 분포는 O-글리칸 생합성 및 다양성에서 구조적 결과를 결정한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 오직 Galβ1-3 GalNAcα- Ser/Thr 이당류가 글리코PEG화를 처리할 수 있다.
그러나, 이 구조체의 이용가능한 양은 시알리다아제 또는 Corel GalT 또는 이들의 조합으로 단백질을 처리하여 크게 향상될 수 있다. 글리코PEG화 공정의 결과로, 타겟 단백질의 Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr 이당류에 대한 α3 결합을 통해 천연 구조에 시알산 PEG가 첨가된다 (도 1).
다른 친수성 폴리머 또한 O-연결된 올리고당에 부착된다. O-글리칸을 통해 FVIII에 다른 친수성 폴리머를 효소적으로 결합시키기 위한 기본 요건은 WO03031464에 개시된 바와 같이 자유 아미노기를 통해 글리실-시알산 유도체에 이들을 커플링하는 능력이다. 이것은 당업자에게 알려진 매우 다양한 커플링 화학에 의해 달성될 수 있다. 활성화된 생체적합성 폴리머의 예는 폴리알킬렌 옥사이드, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 2-(메타크릴로일옥시)에틸 포스포릴콜린 (mPC) 폴리머 (WO03062290에 설명된), 덱스트란, 콜로민산 또는 다른 카르보히드레이트 기반 폴리머, 아미노산 또는 특정 펩티드 서열의 폴리머, 비오틴 유도체, 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말산 무수물, 폴리옥사졸린, 폴리-아크릴로일모르폴린, 헤파린, 알부민, 셀룰로오스, 키토산의 가수분해물, 전분, 예컨대 히드록시에틸-전분 및 히드록시프로필-전분, 글리코겐, 아가로스 및 그것의 유도체, 구아검, 풀룰란, 이뉼린, 잔탄검, 카라기난, 펙틴, 알긴산 가수분해물, 다른 생폴리머 및 그것의 임의의 동등물을 제한 없이 포함한다.
약학적 조성물: 약학적 조성물은 본원에서 바람직하게는 비경구 투여에 적합한 본 발명에 따른 인자 VIIII 분자를 포함하는 조성물, 예컨대 사용 준비 멸균 수성 조성물 또는 예컨대 물 또는 수성 버퍼에서 재구성될 수 있는 건조 멸균 조성물을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 조성물은 다양한 약학적으로 허용가능한 부형제, 안정화제 등을 포함할 수 있다.
이러한 조성물 중 추가의 성분은 습윤제, 에멀젼화제, 항산화제, 벌크제, 독성 변화제, 킬레이팅제, 금속 이온, 지방질 비히클, 단백질(예컨대 사람 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및 쯔비터 이온(예컨대 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 리신 및 히스티딘과 같은 아미노산)을 포함할 수 있다. 이러한 추가의 성분들은 물론 본 발명의 약학적 제제의 총 안정성에 불리한 효과를 미치지 않아야 한다. 비경구 투여는 주사기, 선택적으로 펜형 주사기를 사용하여 피하, 근육내, 복막내 또는 정맥 주사에 의해 행해질 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여는 인퓨전 펌프를 사용하여 행할 수 있다. 다른 선택은 비강 또는 폐 스프레이의 형태로 FVIII 화합물의 투여를 위한 용액 또는 현탁물일 수 있는 조성물이다. 또 다른 선택으로서, 본 발명의 FVIII 화합물을 함유하는 약학적 조성물은 경피 투여, 예컨대 바늘이 없는 주입에 의해 또는 패치, 선택적으로 이온토포레시스 패치로부터, 또는 경점막, 예컨대 구강 투여에 적합하게 될 수 있다.
제1 양태에서 따라서 본 발명은 변화된 순환 반감기를 갖는 B-도메인 절단된 인자 VIII 분자에 관한 것이며, 상기 분자는 절단된 B 도메인에서 O-연결된 올리고당을 통해 친수성 폴리머와 공유적으로 콘쥬게이트되고, 여기서 인자 VIII 활성화 (분자의 활성화)는 공유적으로 콘쥬게이트된 친수성 폴리머의 제거를 가져온다.
한 실시형태에 따르면, 친수성 폴리머는 PEG이다. PEG 폴리머의 크기는 약 10,000 내지 약 160,000 Da; 예컨대 10,000 내지 80,000 Da, 예컨대 약 10,000; 15,000, 20,000; 25,000; 30,000; 35,000; 40,000; 45,000; 50,000; 55,000; 60,000; 65,000, 70,000; 75,000; 또는 80,000 Da로 다양할 수 있다. 바람직하게는, O-연결된 올리고당은 B-도메인의 절단에 의해 만들어진 O-글리코실화 부위에 부착되며 wt FVIII 분자에서 발견되지 않는 인위적 O-글리코실화 부위의 삽입에 의해서가 아니다.
특히 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 분자는 SEQ ID NO 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 분자는 활성화된 FVIII 분자가 천연 활성 FVIII 분자와 동일하다는 점에서 고유한 특징을 갖는다. 이 특징은 안전성 평가에서 유리한 특성을 갖는 것으로 보인다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 분자를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 분자를 얻는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 방법은 B-도메인 절단된 인자 VIII 분자를 예컨대 PEG 기와 같은 친수성 폴리머와 절단된 B 도메인에서 0-연결된 올리고당을 통해 콘쥬게이트시키는 것을 포함한다. 그래서 본 발명은 또한 이러한 방법에 의해 얻어진 분자 또는 얻을 수 있는 분자에 관련된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 분자의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 혈우병 질환의 치료방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 그것의 필요로 하는 임의의 사람 또는 다른 동물 피험체의 의료 요법을 의미한다. 상기 피험체는 의사에 의해 신체 검사를 받을 것으로 예상되고, 이들은 상기 특정 치료의 사용이 상기 사람 또는 다른 동물 피험체의 건강에 이롭다는 것을 나타낼 수 있는 잠정적인 또는 확정적인 진단을 제공한다. 상기 치료의 시기 및 목표는 피험체의 건강 상태에 따라 개체마다 다양할 수 있다. 따라서, 상기 치료는 예방적, 경감적, 징후적 및/또는 치료적일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 의약품으로서 본 발명에 따른 분자의 사용 및 혈우병의 치료를 위한 의약품의 제조를 위한 본 발명에 따른 분자의 사용에 관한 것이다.
마지막 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 B-도메인 절단된 인자 VIII 분자를 가공하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (i) B-도메인을 절단하고 선택적으로 이 절단된 인자 VIII 분자의 아미노산 서열에 대해 잠재적 O-연결된 글리코실화 부위를 확인하는 분석을 행하는 단계, (ii) 적합한 숙주 세포에서 분자를 생성하는 단계 및 (iii) 절단된 B-도메인에서 O-연결된 글리칸을 갖는 분자를 선택하는 단계를 포함한다.
도면에서, 콘쥬게이트된 기의 크기는 때때로 "K"로 언급하며, 이것은 본원에서 KDa (킬로 달톤)과 동일한 것으로 의미된다.
도 1: O-연결된 올리고당의 글리콜 PEG화 공정의 개략도. 도면은 실시예에서 얻어진 생성물에 도달하기 위한 가능한 방식의 완전한 목록을 나타내지 않는다.
도 2: Source 15Q (A) 상에서 반응 혼합물의 이온 교환 크로마토그래피. 수집된 분획(B)의 분자 마커(좌측)를 갖는 SDS-PAGE.
도 3: superdex 200 크기-배재 크로마토그래피 상의 캡핑된 생성물의 정제.
도 4: 다양한 aPTT 시약을 사용하는 O-글리코PEG화된 rFVIII의 응고 활성. (A)는 응고 활성과 크로모제닉 활성 간의 관계를 나타냄. (B)는 특정 응고 활성을 나타냄.
도 5: 40K-PEG-[O]-N8의 FVIII KO 마우스에서 생체내 작용(폐색 시간).
도 6: 본 발명에 따른 글리코 PEG화된 인자 FVIII의 생성에 포함되는 공정 단계를 나타내는 플로우 다이어그램.
도 7: 실시예에서 생성된 본 발명에 따른 인자 VIII 분자의 개략도.
실시예
실시예 1
재조합 B 도메인 절단된 O-글리코실화된 인자 VIII의 제조
B-도메인 결실된 인자 VIII 분자의 아미노산 서열의 예가 SEQ ID NO 2에 주어진다. 이 폴리펩티드는 또한 "N8"로서 언급할 수 있다. 이 분자는 21 아미노산 잔기 링커 서열 (SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR - 밑줄친 S는 실시예 2에서 페그화되는 O-글리칸을 갖는 세린 잔기임)을 포함한다.
본 발명에 따른 인자 VIII 분자는 실시예에서 다양한 방식으로 언급될 수 있고 - 그러나 인자 VIII 분자에 대한 모든 언급은 본 발명에 따른 인자 VIII 분자, 또는 대안적으로 본 발명에 따른 인자 VIII 분자로 전환되는 과정의 인자 VIII 분자를 말한다.
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셀라인 및 배양 과정:
인자 VIII cDNA를 사용하여, SEQ ID NO 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 B-도메인 결실된 인자 VIII를 암호화하는 포유동물 발현 플라스미드를 구축하였다. 플라스미드는 전장 사람 인자 VIII의 아미노산 1-740을 포함하는 인자 VIII 중쇄 및 전장 사람 인자 VIII의 아미노산 1649-2332을 포함하는 인자 VIII 경쇄를 암호화한다. 중쇄 및 경쇄 서열은 21 아미노산 링커에 의해 전장 사람 인자 VIII의 아미노산 741-750 및 1638-1648의 서열과 연결된다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포는 BDD 인자 VIII 암호화 플라스미드로 트랜스펙션되고 디히드로폴레이트 리덕타아제 시스템으로 선택되어 결국 동물 성분이 없는 배지에서 배양된 클론 현탁 생성자 세포로 되었다.
과정에서 제1 단계는 제조용 세포 은행 바이알로부터 화학적으로 정의된 동물 성분이 없는 성장 배지로 세포 바이알의 접종이다. 초기에 해동 후, 세포는 T-플라스크에서 인큐베이션된다. 해동 후 1일 또는 2일에, 세포는 쉐이커 플라스크로 이동되고, 연속 희석에 의해 배양물 부피가 확장되어 세포 밀도가 0.2 - 3.0 x 106 세포/ml로 유지된다. 다음 단계는 종자 생물반응기로 쉐이커 플라스크 배양물의 이동이다. 여기서 배양물 부피는 제조 생물반응기로의 최종 이동 전에 더욱 확장된다. 모든 접종물 확장 단계에 동일한 화학적으로 정의된 동물 성분이 없는 배지가 사용된다. 제조 생물반응기로 이동 후, 배지는 생성물 농도를 증가시키는 성분들로 보충된다. 제조 생물반응기에서 세포는 3일의 사이클 시간으로 반복된 배치 공정에서 배양된다. 수확시, 배양물 부피의 80 - 90 %가 수확 탱크로 이동된다. 나머지 배양액은 그 다음 새로운 배지로 희석되어 초기 세포 밀도를 얻고, 그 다음 새로운 성장 주기가 시작된다.
수확 배치는 원심분리 및 여과에 의해 정화되고 정제 공정의 시작 전에 홀딩 탱크로 이동된다. 홀딩 탱크에서 세포 프리 수확물에 버퍼를 첨가하여 pH를 안정화한다.
제조 수행의 마지막에, 세포를 수집하고 냉동시켜서 세포 은행 제조를 종료한다. 이 세포 은행을 마이코플라즈마, 생식 및 바이러스 오염에 대하여 테스트한다.
정제:
세포 배양 배지로부터 B-도메인-결실된 인자 VIII의 분리를 위해서, Capto MMC 컬럼 상의 농축 단계, 면역흡착 크로마토그래피 단계, 음이온 교환 크로마토그래피 및 마지막으로 겔여과 단계를 포함하는 4단계 정제 과정을 사용하였다. 통상적으로, 하기 과정을 사용하였다: 11리터의 멸균 여과된 배지를 버퍼 A: 20 mM 이미다졸, 10 mM CaCl2, 50 mM NaCl, 0.02 % Tween 80, pH = 7.5에서 평형화된 Capto MMC (GE Healthcare, Sweden)의 컬럼으로 15 ml/분의 유속으로 펌핑하였다. 컬럼을 75 ml의 버퍼 A로 세정한 다음 1.5 M NaCl을 함유하는 75 ml의 버퍼 A로 세정하였다. 단백질을 20 mM 이미다졸, 10 mM CaCl2, 0.02 % Tween 80, 2.5 M NaCl, 8M 에틸렌글리콜, pH = 7.5로 1 ml/min의 유속으로 용리하였다. 8 ml의 분획을 수집하고 인자 VIII 활성에 대하여 분석하였다 (CoA-테스트). 분획을 함유하는 인자 VIII를 모으로 정상적으로 약 50 ml의 풀(pool) 부피가 얻어졌다.
인자 VIII에 대한 단일클론 항체가 발현되었다(Kjalke Eur J Biochem 234 773). 에피토프 매핑에 의해 (결과는 나타내지 않음), 이 항체, F25는 아미노산 잔기 725 내지 740으로부터 중쇄의 먼 C-말단 서열을 인식하는 것으로 발견되었다. F25 항체는 NHS-활성화된 Sepharose 4 FF (GE Healthcare, Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)에 제조자에 의해 설명된 바와 같이 기본적으로 ml 겔 당 2.4 mg의 밀도로 커플링되었다. 이전 단계로부터의 풀을 20 mM 이미다졸, 10 mM CaCl2, 0.02 % Tween 80, pH = 7.3로 10배 희석하고 20 mM 이미다졸, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 0.02 % Tween 80, 1 M 글리세롤 pH = 7.3로 평형화된 F25 Sepharose 컬럼 (1.6 x 9.5 cm)에 0.5 ml/min의 유속으로 적용하였다. UV 신호가 일정할 때까지 컬럼을 평형 버퍼로 세정한 다음 20 mM 이미다졸, 10 mM CaCl2, 0.65 M NaCl, pH = 7.3로 UV 신호가 다시 일정해질 때까지 세정하였다. 인자 VIII를 20 mM 이미다졸, 10 mM CaCl2, 0.02 % Tween 80, 2.5 M NaCl, 50% 에틸렌글리콜, pH = 7.3로 1 ml/min의 유속으로 용리하였다. 1 ml의 분획을 수집하고 인자 VIII 활성에 대하여 분석하였다(CoA-테스트). 분획을 함유하는 인자 VIII를 모으로 정상적으로 약 25 ml의 풀 부피가 얻어졌다.
버퍼 A: 20 mM 이미다졸, 10 mM CaCl2, 0.02 % Tween 80, 1 M 글리세롤, pH = 7.3 및 버퍼 B: 20 mM 이미다졸, 10 mM CaCl2, 0.02 % Tween 80, 1 M 글리세롤, 1 M NaCl, pH = 7.3를 이온 교환 단계를 위해 제조하였다. Macro-Prep 25Q Support (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)의 컬럼 (1 x 10 cm)을 85% 버퍼 A/15% 버퍼 B로 2 ml/min의 유속으로 평형화하였다. 이전 단계로부터의 풀을 버퍼 A로 10배 희석하고 2 ml/min의 유속으로 컬럼으로 펌핑하였다. 컬럼을 85% 버퍼 A/15% 버퍼 B로 2 ml/min의 유속으로 세정하고 인자 VIII를 15 % 버퍼 B로부터 70 % 버퍼 B의 선형 구배로 120 ml 이상으로 2 ml/min의 유속으로 용리하였다. 2 ml의 분획을 수집하고 인자 VIII 활성에 대하여 분석하였다 (CoA-테스트). 분획을 함유하는 인자 VIII를 모으로 정상적으로 약 36ml의 풀 부피가 얻어졌다.
이전 단계로부터의 풀을 평형화된 Superdex 200, prep grade (GE Healthcare, Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden) 컬럼 (2.6 x 60 cm)에 적용하고 1 ml/min으로 20 mM 이미다졸, 10 mM CaCl2, 0.02 % Tween 80, 1 M 글리세롤, 150 mM NaCl, pH = 7.3로 용리하였다. 3 ml의 분획을 수집하고 인자 VIII 활성에 대하여 분석하였다 (CoA-테스트). 분획을 함유하는 인자 VIII를 모으로 정상적으로 약 57 ml의 풀 부피가 얻어졌다. 인자 VIII를 함유하는 풀을 -80℃에서 저장하였다.
상기 4단계 정제 과정을 사용하여 CoA 활성 및 ELISA 측정에 의해 판단된 바와 같이 대략 15 %의 전체 수율이 얻어졌다.
N8의 제조에 사용된 셀라인은 F8-500 단백질을 암호화하는 cDNA를 함유하는 삽입물을 갖는 pTSV7 발현 벡터로 구성된 pTSV7에서 발현 플라스미드 #814 F8-500로 안정하게 트랜스펙션된 재조합 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 셀라인이다. "N8"은 본원에서 SEQ ID NO 2에 열거한 아미노산 서열을 갖는 단백질에 상응한다는 것을 의미한다. N-말단에서 출발하여, F8-500 단백질 (N8)은 FVIII 신호 펩티드 (아미노산 -19 내지 -1) 그 다음 B 도메인이 없는 FVIII 중쇄 (아미노산 1-740), 21 아미노산 링커 (SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR), 및 FVIII 경쇄 (야생형 사람 FVIII의 아미노산 1649-2332)로 구성된다. 21 아미노산 링커의 서열은 FVIII B 도메인으로부터 유래하고 전장 FVIII의 아미노산 741-750 및 1638-1648로 구성된다.
CHO 세포는 pTSV7에서 814 F8-500로 트랜스펙션되고 디히드로폴레이트 리덕타아제 시스템으로 선택되어 결국 동물 성분이 없는 배지에서 배양된 클론 현탁물 생성자 세포로 된다. 제조용 세포 은행 바이알을 해동하고 제조 생물반응기로 이동시까지 세포를 확장시킴으로써 제조 수행을 개시한다. 모든 접종물 확장 단계에 동일한 화학적으로 정의된 동물 성분이 없는 배지가 사용된다. 제조 생물반응기로 이동 후, 배지는 생성물 농도를 증가시키는 성분들로 보충된다. 제조 생물반응기에서 세포는 3일의 사이클 시간으로 반복된 배치 프로세스에서 배양된다. 수확시, 배양 부피의 80 - 90 %가 수확 탱크로 이동된다. 나머지 배양액은 그 다음 새로운 배지로 희석되어 초기 세포 밀도를 얻고, 그 다음 새로운 성장 주기가 시작된다. 수확 배치는 원심분리 및 여과에 의해 정화되고 정제 공정의 개시 전에 홀딩 탱크로 이동된다. 홀딩 탱크 내의 세포 프리 수확물에 버퍼를 첨가하여 pH를 안정화한다.
실시예 2
재조합 B 도메인 절단되고 O-글리코실화된 인자 VIII의 PEG화:
실시예 1에서 얻어진 재조합 인자 VIII 분자를 하기 과정을 사용하여 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 결합하였다:
효과적인 실시예 1에서 얻어진 재조합 인자 VIII 분자의 글리코PEG화를 위해서 FVIII 농도 > 5mg/ml가 바람직하다. FVIII는 이 농도에서 보통 가용성이 아니므로 선택한 버퍼 조성물의 스크리닝을 행하였다(표 1에서 이들 결과의 일부 참조).
이들 고찰에 기초하여, 50 mM MES, 50 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 20% 글리세롤, pH 6.0을 함유하는 버퍼가 적합한 반응 버퍼인 것으로 확인되었다.
Figure 112010054481872-pct00003
상기 설명한 바와 같이 정제된 재조합 FVIII를 Sartorius Vivaspin (PES) 필터, 10 kDa 컷-오프 또는 Amicon 10 kDa MWCO PES 필터 상에서, 단계 용리를 사용하는 Poros 50 HQ 컬럼 상에서 이온 교환에 의해 6-10 mg/mL의 농도로 반응 버퍼에서 농축하였다. 인자 VIII (BDD) (~4.7 mg/mL 최종)를 시알리다아제 (A. urifaciens) (159 mU/mL), CMP-SA-글리세롤-PEG-40 kDa (5 mol.eq.) 및 MBP-ST3Gall (540 mU)과 함께 반응 버퍼 (50 mM MES, 50 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 20% 글리세롤, 0.5 mM 안티파인, pH 6.0)에서 혼합함으로써 FVIII의 글리코PEG화를 시작하였다. 반응 혼합물을 전체의 ~20-30%의 전환 수율까지 32℃에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 샘플을 버퍼 A (25 mM Tris, 5 mM CaCl2, 20 mM NaCl, 20% 글리세롤, pH 7.5)로 희석하고 Source 15Q 컬럼 (1 cm id x 6 cm, 4.7 mL, 1 mL/min, 280 nm)에 적용하였다. 콘쥬게이트된 물질을 버퍼 A로 세정하고 단계 구배를 사용하여 버퍼 B (25 mM Tris, 5 mM CaCl2, 1M NaCl, 20% 글리세롤, pH 7.5)로 용리하였다. 글리코PEG화된 인자 VIII-(O)-SA-글리세롤-PEG-40 kDa를 컬럼으로부터 ~25% 버퍼 B에서 용리하였다. 도 2는 Source 15Q 상에서 반응 혼합물의 이온-교환 크로마토그래피를 나타낸다.
시알리다아제 처리 동안 N-글리칸에 노출된 프리 갈락토오스 부분을 차단하기 위해서, 인자 VIII-SA-글리세롤-PEG-40 kDa (1.0 mg/mL 최종)의 모아진 분획을 CMP-SA (2,000 mol eq) 및 MBP-SBD-ST3Gal3 (400 mU/mL)와 함께 반응 버퍼 50 mM MES, 20 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 10 mM MnCl2, 20% 글리세롤, pH 6.0에서 혼합하고 32℃에서 11시간 동안 인큐베이션하였다.
얻어진 캡핑된 글리코PEG화된 인자 VIII-SA-글리세롤-PEG-40 kDa를 50 mM MES, 5OmM CaCl2, 150 mM NaCl, 10 % 글리세롤, pH 6.0로 평형화된 Superdex 200 컬럼 (10 cm id x 300 mm; 280 nm) 상에서 0.25 mL/min의 유속으로 겔-여과에 의해 CMP-SA 및 ST3GalIII으로부터 분리하였다. 인자 VIII-SA-글리세롤-PEG-40 kDa의 생성물을 38 min에서 용리하였다. 도 3은 Superdex 200 크기-배재 크로마토그래피를 사용하는 캡핑된 생성물의 정제를 나타낸다. 피크 분획을 수집하고, 분액하고, 후속 분석하였다.
캡핑 과정의 목적은 콘쥬게이트된 인자 VIII 분자의 생체내 클리어런스를 감소시키는 것이다.
실시예 3
크로모제닉 FVIII 활성 분석에서 O-글리칸 PEG화된 rFVIII의 활성:
실시예 2에서 얻어진 O-글리코PEG화된 rFVIII의 활성을 크로모제닉 FVIII 분석에서 Coatest SP 시약 (Chromogenix)을 사용하여 하기와 같이 평가하였다: rFVIII 샘플 및 캘리브레이터 (NIBSC로부터 7th 국제 FVIII 표준)를 Coatest 분석 버퍼 (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% BSA, pH 7.3, 보존제와 함께)에 희석하였다. 15 μl의 샘플, 표준 및 버퍼 음성 대조군을 96-웰 마이크로티터 플레이트 (Nunc)에 2회분 첨가하였다. Coatest SP 키트로부터 인자 IXa/인자 X 시약, 포스포리피드 시약 및 CaCl2을 5:1:3 (vol:vol:vol)로 혼합하고 이것 75 μl를 웰에 첨가하였다. 상온에서 15분 인큐베이션 후, 50 μl의 인자 Xa 기질 S-2765/트롬빈 억제제 I-2581 믹스를 첨가하고 반응을 상온에서 10 min 인큐베이션한 후 25 μl 1M 시트르산, pH 3을 첨가하였다. Spectramax 마이크로티터 리더 (Molecular Devices)에서 기준 파장으로서 사용된 620 nm에서의 흡광도를 가지고 415 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군의 값을 모든 샘플로부터 차감하고 흡광도 값의 직선 회귀에 의해 작성된 교정 곡선을 FVIII 농도에 대하여 플롯하였다. HPLC 크로마토그램에서 경쇄 피크를 적분함으로써 크기 배재 HPLC에 의해 결정된 단백질 농도로 샘플의 활성을 나눔으로써 특정 활성을 계산하였고, 즉 PEG-부분을 포함되지 았았다. 표 2에서의 데이타는 특정 크로모제닉 활성이 O-글리코PEG화된 rFVIII 화합물에 대하여 유지되었다는 것을 나타내며, 인자 VIII 활성이 PEG화된 변이체에서 유지되는 것으로 보인다는 것을 의미한다.
Figure 112010054481872-pct00004
실시예 4
FVIII 응고 활성 분석에서 O-글리칸 PEG화된 rFVIII의 활성
O-글리코PEG화된 rFVIII의 활성을 FVIII 응고 분석에서 더욱 평가하였다. rFVIII 샘플을 HBS/BSA (20 mM hepes, 150 mM NaCl, pH 7.4 1% BSA와 함께)에 대략 10 U/ml로 희석한 다음 VWF (Dade Behring)를 함유하는 FVIII-결핍 플라즈마에 10배 희석하였다. 샘플 및 교정된 혈장 표준 (Instrumentation Laboratory로부터 HemosIL Calibration Plasma)을 HBS/BSA에서 4개 (샘플) 또는 6개 (캘리브레이터) 상이한 농도로 희석하였다. 단일 인자 프로그램을 사용하여 ACL9000 기구 (Instrumentation laboratory) 상에서 응고 시간을 측정하였으며, 이때 샘플/표준은 VWF (Dade Behring), 칼슘 및 aPTT 시약과 함께 동일한 부피의 FVIII-결핍 혈장과 혼합하였으며, 응고 시간을 측정하였다. 하기 시약을 사용하였다: Synthasil (HemosIL, Instrumentation Laboratory), Actin FS (Activated PTT Reagent, Dade Behring) Stago (STA® PTT-A, Stago) 및 dAPPTin (DAPPTIN®TC, Technoclone). 응고 시간 대 캘리브레이터의 농도의 세미-로그 플롯에 기초하여 샘플의 활성을 계산하였다.
O-글리코PEG화된 rFVIII 화합물 (각각 대조군, 10, 40, 및 80 kDA PEG)의 응고 활성(도 4)이 PEG 크기 및 사용한 aPTT 시약에 따라서 다양한 정도로 감소하였다. aPTT 시약으로서 Synthasil 또는 dAPPTin를 사용하는 것은 PEG-크기와 함께 응고 활성의 점진 감소를 가져온다. Stago's aPTT 시약을 사용하여, 50% 더 낮은 특정 응고 활성이 평가한 모든 3가지 O-글리코PEG화된 N8 화합물에서 관찰되었다. aPTT 시약으로서 Actin FS을 사용하는 경우 10,000 IU/mg 근방의 특정 응고 활성이 유지되었다. 데이타는 aPTT 분석이 PEG 부분의 존재에 의해 영향을 받지만, 선택한 aPTT 시약, 예컨대 Actin FS를 사용하여 rFVIII의 특정 응고 활성은 O-글리코PEG화를 손상시키지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 5:
보조인자 활성에 대한 rFVIII의 O-연결된 PEG화의 효과 및 FVIII 활성화의 속도
활성화된 FVIII의 FIXa-FVIIIa 복합체로의 조합은 FIXa-촉매화된 FX 활성화의 촉매 효율을 5등급 향상시키고 (van Dieijen et al. (1981) J Biol Chem 256:3433) FIXa-FVIIIa 복합체 조립 및 FX 활성화 키네틱의 특징은 FVIIIa 분자의 기능 통합의 민감한 측정이다. 트롬빈-활성화된 rFVIII 또는 PEG-rFVIII의 보조인자 활성은 포스포리피드 및 트롬빈-활성화된 rFVIII 또는 PEG-rFVIII의 존재하에서 FIXa-촉매화된 FX 활성화의 키네틱 파라미터를 측정함으로써 특징화된다. FVIIIa 활성 분석 (FIXa-보조인자 활성 분석)을 사용하여, rFVIIIa 또는 FIXa의 고정 농도 (0.1 nM)에 대한 FIXa 및 FVIIIa의 상호 적정을 각각 행하여 rFVIIIa에 대한 FIXa의 겉보기 친화성 (K1/2FIXa) 및 기능적 FVIIIa 농도를 얻었다. FX 활성화의 미셸 상수 (km) 및 전환수 (kcat)를 FIXa-FVIIIa 복합체의 고정 농도에 대한 FX의 적정으로부터 얻었다.
하기와 같이 FIXa-보조인자 활성 분석을 행하였다: rFVIII (대개 0.7 nM, 1 U/mL)을 5 nM 사람 α-트롬빈과 정확히 30초 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 각 테스트에 대하여 새로운 트롬빈-활성화된 rFVIII 및 PEG-rFVIII 변이체를 제조하였다. 이어서, 상기 활성화 반응을 FIXa, 포스포리피드 비히클 (Rossix [Molndal, Sweden]으로부터 Phospholipid TGT), 히루딘, Pefabloc Xa 및 CaCl2의 제조 혼합물로 서브샘플링함으로써 FX 활성화의 속도를 정량하였고; FX의 첨가에 의해 FX 활성화를 시작하였고 30초 또는 60초 동안 37℃에서 진행하도록 하였다. FX 활성화 반응을 EDTA을 함유하는 얼음 냉각 버퍼에 희석하여 활성화를 중지하였다. FXa 특정 크로모제닉 기질을 사용하여, ELISA 리더에서 405 nM에서의 흡광도를 판독함으로써 FXa의 농도를 정량하였다. 정제된 FXa를 사용하여 작성된 참조 곡선을 사용하여 흡광도를 FXa 농도로 전환하였다. 활성화된 rFVIII 또는 PEG-rFVIII 변이체로부터 조립된 FIXa-rFVIIIa 복합체의 전환수를 사용하여 FX 활성화 속도를 rFVIIIa 농도로 전환하였다.
0.7 nM rFVIII 또는 PEG-rFVIII 및 0.13 nM 사람 α-트롬빈을 함유하는 혼합물에서 rFVIIIa의 초기 (0 내지 3분) 형성을 정량함으로써 트롬빈-촉매화된 rFVIII 활성화의 속도를 측정하였다. FVIIIa의 형성은 시간 내에 선형이었다. FVIIIa 활성화 속도는 초기 존재하는 rFVIII의 몰당 분당 형성된 몰 rFVIIIa로서 표시되었다 (v/[rFVIII]o).
rFVIII의 O-연결된 글리코PEG화는 트롬빈-촉매된 rFVIII 활성화의 속도, 또는 활성화된 rFVIII 존재하의 FX의 FIXa-촉매된 활성화의 km 또는 kcat에 영향을 미치지 않았다 (표 3 참조). 또한, 0-연결된 글리코PEG화는 rFVIIIa-FIXa 상호작용의 겉보기 Kd에 영향을 미치지 않았다 (K1/2FIXa).
도 4는 다양한 aPTT 시약을 사용하는 O-글리코PEG화된 rFVIII의 응고 활성을 나타낸다. 데이타는 응고 활성과 크로모제닉 활성 간의 비로서 (A) 또는 특정 응고 활성으로서 (b) 나타낸다. 3개 독립된 실험으로부터 값의 평균 및 표준편차를 나타낸다.
Figure 112010054481872-pct00005
실시예 6
FVIII KO 마우스 및 vWF KO 마우스에서 글리코PEG화된 B-도메인 결실된 (BDD)-FVIII의 약물동태학
다양한 PEG 크기로 글리코PEG화된 BDD-FVIII의 약물동태학을 FVIII KO 마우스에 대하여 280 IU/kg의 i.v. 투여에 따라 연구하였다.
하기 화합물을 연구하였다: BDD-FVIII, BDD-FVIII-10K PEG (O-글리칸, 0129-0000-1005), BDD-FVIII-40K PEG (O-글리칸, 0129-0000-1003), BDD-FVIII-2x40K PEG (O 및 N-글리칸 0129-0000-1008-1A), BDD-FVIII-80K PEG (N-글리칸, 0129-0000-1012, O-글리칸 0129-0000-1009).
동물 연구의 설계:
C57B1/6 백그라운드에서 엑손 16 KO에 기초하여 Taconic M&B에서 인자 VIII 녹아웃(FVIII KO) 마우스를 사육하였다. 중량이 대략 25 g이고 연령 범위가 19-26주인 암컷과 수컷의 혼합(약 1:1)을 사용하였다. 마우스들을 완전히 역교배시키지 않았다. 이 마우스 균주에서 FVIII이 검출되지 않는다.
마우스는 꼬리 정맥에 상기 열거한 화합물을 갖는 280 IU/kg의 단일 i.v. 주사를 투여받았다. 만약 마우스가 정맥 주변으로 투약되었다면, 마우스를 다른 마우스로 교체하였다. 투약 후, 투약 이전으로부터 투약 후 64시간까지 코팅되지 않은 미세유리관을 사용하여 안와정맥총 혈액 샘플을 수집하였다. 각 마우스로부터 3개의 샘플을 채취하고, 2, 3 또는 4 샘플을 각 시점에 수집하였다. 혈액을 소듐 시트레이트에서 안정화시키고 (9:1) FVIII COA SP 버퍼에 희석(1:4)한 다음 4000g에서 5분 동안 원심분리하였다. 희석된 혈액에서 얻어진 혈장을 드라이 아이스에서 냉동시키고 -80℃에서 유지한 다음 FVIII 크로모제닉 활성을 사용하여 정량 분석 및/또는 FVIII 항원 분석을 행하였다.
정량 혈장 분석:
Coatest SP 키트 (Chromogenix)로부터의 시약을 사용하여 FVIII 크로모제닉 활성을 결정하였다. 희석된 혈장 샘플, Coatest SP-버퍼 내의 캘리브레이터 (ILS 교정 혈장), 및 버퍼 음성 대조군 (50 μl)을 96-웰 마이크로티터 플레이트 (Nunc)에 2회분 첨가하였다. Coatest SP 키트로부터 인자 IXa/인자 X 시약, 포스포리피드 시약 및 CaCl2를 5:1:3 (vol:vol:vol)로 혼합하고 이것의 75 μl를 웰에 첨가하였다. 상온에서 15 min 인큐베이션 후, 50 μl의 인자 Xa 기질 S-2765/트롬빈 억제제 I-2581 믹스를 첨가하고 반응을 10분 동안 상온에서 인큐베이션한 후 25 μl 2% 시트르산을 첨가하였다. Spectramax 마이크로티터 플레이터 리더 (Molecular Devices) 상에서 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 혈장 샘플 내의 FVIII 활성을 교정된 국제 혈장 표준 (ILS)의 희석에 의해 만들어진 교정 곡선으로부터 계산하였다.
FVIII 항원 분석은 사람 FVIII의 경쇄에 대하여 지시된 두개의 단일클론 항체를 사용하는 Diagnostica Stago (Asserachrom VIII:CAg)로부터 시중에서 입수가능한 ELISA 키트였다. 캘리브레이터 (화합물의 희석) 또는 혈장 샘플을 키트에 의해 적용된 coatest SP 희석 버퍼에 적어도 50배 희석하고 미리 코팅된 웰에 적용하고 제조자 지시에 따라 ELISA를 행하였다. 약물동력학 연구를 보고하기 위해 사용되는 값은 화합물 자체로부터 만들어진 표준 곡선에 기초한다.
약물동력학 파라미터 추정:
캘리브레이터로서 ILS를 사용하는 데이타 (크로모제닉 활성에 기초한 데이타), 캘리브레이터로서 화합물 자체를 사용하는 (ELISA에 기초한 데이타)의 비-구획 방법(NCA)에 의해 약물동력학 분석을 행하였다. 데이타로부터, 하기 파라미터를 추정하였다: Cmax (최대 농도, i.v. 투여 후 이것은 제1 샘플링 시점임), Tmax (최대 농도 시간, i.v. 투여 후 이것은 제1 시점임), AUC0-∞(0시부터 무한대까지 곡선 아래의 면적), T½, (말기 반감기), CL (클리어런스) 및 Vss (정상상태에서 분배 부피). WinNonlin Pro version 4.1을 사용하여 모든 계산을 행하였다.
FVIII KO 마우스에 280 IU/Kg BDD-FVIII, BDD-FVIII-IOKDa PEG, BDD-FVIII-40KDa PEG , BDD-FVIII-2x40KDa PEG 및 BDD-FVIII-80KDa PEG의 i.v. 주사 후, 반감기는 7.8 h (BDD-FVIII) 내지 15-16 h의 범위에서 PEG 크기 증가와 함께 증가하였으며 (표 4), 이것은 2-배 증가에 상응한다. 유사하게, 클리어런스가 감소하였고, MRT는 PEG 크기 증가와 함께 증가하였다 (표 4).
Figure 112010054481872-pct00006
결론:
BDD-FVIII의 글리코PEG화는 FVIII KO 마우스에게 280 IU/kg의 i.v. 투여 후 BDD-FVIII에 비하여 T½ 1.3-2.1배 증가하였다. PEG기의 크기가 10KDa 내지 80KDa PEG 범위 내에서 증가함에 따라 증가하는 T½가 관찰되었다.
실시예 7
혈우병 A 마우스에서 FeCl 3 유도된 손상 모델에서 Advate과 비교하여 40K-PEG-[O]-N8의 연장된 지혈 효과
40K-PEG-[O]-N8 대 재조합 FVIII (Advate)의 작용의 지속기간을 혈우병 A (F8-KO) 마우스에서 FeCl3 유도된 손상 모델에서 조사하였다.
마우스를 마취하고 가열 패드 (37℃)에 놓아 체온을 유지시켰다. 경동맥을 노출시키고 초음파에 의해 혈류를 측정하는 혈류-프로브 (0.5PSB Nanoprobe)를 동맥 주변에 위치시켰다. 노출된 경동맥 주변에 10% FeCl3 용액에 간단히 흡수된 여과지(2 x 5 mm)를 적용함으로써 손상 (철-매개된 화학적 산화)을 유도하였다. 3분 후 여과지를 제거하였다. 그 다음 동맥을 0.9% NaCl로 3회 세정하고 마지막으로 Surgilube (음향 커플러)를 적용하여 혈류-프로브에 공기를 제거하고 최적화된 혈류의 측정을 확보하였다. FeCl3 포화 여과지를 제거한 후 혈류(ml/min)를 25분 동안 기록하였고, FeCl3 포화 여과지의 제거로부터 혈류가 0 ml/min일 때까지 시간(분)을 측정함으로써 폐색 시간을 결정하였다. 25분 후 폐색이 일어나지 않았다면 관찰 기간 동안 폐색이 발생하지 않았더라도 25분으로 보고하였다. F8-KO 마우스 (n = 6-10)를 Advate (280 U/kg), 40K-PEG-[O]-N8 (280 U/kg), 또는 비히클로 처리하였다. FeCl3 유도된 손상은 투약 후 5분 (급성 작용) 또는 24, 48, 60, 및 72 시간에 만들어졌다. FeCl3의 제거 후 25분 동안 혈류 (ml/min)를 기록하였고, 이어서 폐색 시간을 결정하였다.
비히클 처리한 F8-KO 마우스에서 폐색이 발생하지 않은 반면, 투약 후 5분에(급성 작용) 4.3±0.4 min 및 5.2±0.7 min의 평균 폐색 시간으로 40KDa-PEG-[O]-N8 및 Advate로 처리한 모든 마우스에서 폐색이 각각 발생하였다. 40KDa-PEG-[O]-N8 처리한 F8-KO 마우스에서 평균 폐색 시간은 투여 후 72시간에 13.8±3.4 min으로 증가하였다. 반대로 Advate 처리한 F8-KO 마우스는 각각 24 및 48 시간 후 13.0±3.4 min 및 15.9±2.9 min의 폐색 시간을 가졌다. 중요하게는 Advate의 투여 후 60 및 72시간에 폐색이 관찰되지 않았다. 40KDa-PEG-[O]-N8로 처리한 모든 마우스에서 투여 후 24시간에 폐색이 관찰된 반면, Advate로 처리한 마우스의 67%만이 폐색되었다. 72시간 후, 40KDa-PEG-[O]-N8로 처리한 마우스의 63%에서 폐색이 여전히 관찰된 반면, Advate의 투여 후 60 및 72 시간에 폐색이 관찰되지 않았다.
F8-KO 마우스에서 40KDa-PEG-[O]-N8의 연장 효과.
FeCl3 유도된 손상이 280 IU/kg 40KDa-PEG-[O]-N8, 280 IU/kg Advate, 또는 비히클 투여 후 5 분 (급성 작용), 24, 48, 60, 및 72 시간에 만들어졌다. FeCl3의 제거 후 25분 동안 혈류 (ml/min)를 기록하고, 이어서 폐색 시간을 결정하였다. 투여 후 60 및 72 시간에 Advate 투여한 마우스에서 폐색이 발생하지 않았다. 그룹당 6-10 마우스의 평균 및 SEM을 나타낸다. 상이한 그룹 간의 폐색 시간을 Dunn's 포스트 테스트를 포함하는 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 비교하였다. *: p<0.05; **: p<0.01.
결론적으로, 40KDa-PEG-[O]-N8의 지혈 효과는 F8-KO 마우스에서 FeCl3 유도된 손상 모델에서 Advate에 비하여 현저하게 연장된다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S DeFrees, Shawn <120> Conjugated Factor VIII Molecules <130> 101961-5191WO <140> <141> 2009-02-25 <150> US 61/032,006 <151> 2008-02-27 <150> US 61/043,354 <151> 2008-04-08 <150> US 61/058,869 <151> 2008-06-04 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125 Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn 130 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Ile 435 440 445 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495 His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560 Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe 565 570 575 Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln 580 585 590 Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605 Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 610 615 620 Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640 Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720 Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735 Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Gln Asn 740 745 750 Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu 755 760 765 Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu 770 775 780 Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser 785 790 795 800 Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val 805 810 815 Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg 820 825 830 Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe 835 840 845 Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu 850 855 860 Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val 865 870 875 880 Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr 885 890 895 Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly 900 905 910 Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr 915 920 925 Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp 930 935 940 Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val 945 950 955 960 His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu 965 970 975 Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe 980 985 990 Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met 995 1000 1005 Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro 1010 1015 1020 Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile 1025 1030 1035 Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile 1040 1045 1050 Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser 1055 1060 1065 Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu 1070 1075 1080 Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr 1085 1090 1095 Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys 1100 1105 1110 Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu 1115 1120 1125 Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly 1130 1135 1140 His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln 1145 1150 1155 Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn 1160 1165 1170 Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu 1175 1180 1185 Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg 1190 1195 1200 Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr 1205 1210 1215 Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr 1220 1225 1230 Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile 1235 1240 1245 Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg 1250 1255 1260 Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu 1265 1270 1275 Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met 1280 1285 1290 Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr 1295 1300 1305 Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu 1310 1315 1320 His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn 1325 1330 1335 Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val 1340 1345 1350 Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met 1355 1360 1365 Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln 1370 1375 1380 Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly 1385 1390 1395 Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro 1400 1405 1410 Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His 1415 1420 1425 Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp 1430 1435 1440 Leu Tyr 1445 戇剃傲璃蔔??

Claims (15)

  1. 야생형 인자 VIII 분자에 비해 적어도 10% 증가된 순환 반감기를 갖는 B-도메인 절단된(truncated) 인자 VIII 분자로서, 상기 분자는 SEQ ID NO 1의 750 위치에 상응하는 세린 잔기에 O-결합 올리고당(O-linked oligosaccharide)을 통해 친수성 폴리머와 공유적으로 콘쥬게이트되고,
    (i) 인자 VIII 활성화는 상기 공유적으로 콘쥬게이트된 친수성 폴리머의 제거를 가져오고;
    (ii) FVIII 전구체 폴리펩티드의 중쇄 및 경쇄 부분은 링커에 의해서 분리되고, 상기 링커의 서열은 FVIII B 도메인으로부터 유래되고; 그리고
    (iii) 상기 링커는 B-도메인-절단된 FVIII 전구체 폴리펩티드를 중쇄와 경쇄로 분리하는 프로테아제를 위한 인식 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 B-도메인 절단된 인자 VIII 분자.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 B 도메인의 길이는 20-30 아미노산인 것을 특징으로 하는 B-도메인 절단된 인자 VIII 분자.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 친수성 폴리머는 PEG인 것을 특징으로 하는 B-도메인 절단된 인자 VIII 분자.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 PEG의 크기는 10,000 내지 160,000 Da인 것을 특징으로 하는 B-도메인 절단된 인자 VIII 분자.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 PEG의 크기는 40,000 Da인 것을 특징으로 하는 B-도메인 절단된 인자 VIII 분자.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 친수성 폴리머는 다당류인 것을 특징으로 하는 B-도메인 절단된 인자 VIII 분자.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 다당류는 폴리시알산(poly sialic acid)인 것을 특징으로 하는 B-도메인 절단된 인자 VIII 분자.
  8. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO 2에 나타난 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 B-도메인 절단된 인자 VIII 분자.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 절단된 B 도메인은 SEQ ID NO 2 보다 하나의 아미노산이 더 짧은 것을 특징으로 하는 B-도메인 절단된 인자 VIII 분자.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 분자를 포함하는 혈우병 치료를 위한 약학적 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 분자의 제조방법으로서, 상기 방법은 B-도메인 절단된 인자 VIII 분자와 친수성 폴리머를 SEQ ID NO 1의 750 위치에 상응하는 세린 잔기에 O-결합 올리고당을 통해 콘쥬게이트하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제 11 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 분자.
  13. 혈우병 치료를 위한 의약품으로서 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 분자.
  14. 피하 투여 또는 정맥 투여에 의한 혈우병 치료에 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 분자.
  15. 피하 투여 또는 정맥 투여에 의한 혈우병 치료에 사용하기 위한, 제 10 항에 따른 약학적 조성물.
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