JP2004528001A

JP2004528001A - インビトロにおけるフコシル化組換えグリコペプチド

Info

Publication number: JP2004528001A
Application number: JP2001585325A
Authority: JP
Inventors: ロバートジェイ．ベイヤー，
Original assignee: ネオーズテクノロジーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2001-05-14
Publication date: 2004-09-16
Also published as: EP1285072A2; HUP0302299A2; US20030180835A1; US20100322940A1; WO2001088117A3; US20030003529A1; US20020019342A1; MXPA02011016A; US20030040037A1; AU2001263149A1; WO2001088117A2; NZ522320A; CA2407707A1

Abstract

本発明は、グリコペプチド（組換えにより産生されたグリコペプチドを含む）のグリコシル化パターンを改変するための方法を提供する。このグリコペプチドが均一なグリコシル化パターンを有する、グリコペプチド組成物もまた提供する。本発明は、第１フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分を含むグリコペプチドのグリコシル化パターンを改変するための方法であって、この方法は、以下：フコースのドナー部分からこのアクセプター部分にこのフコースを移動するのに適切な条件下で、このフコースのドナー部分とこの第１フコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物と該グリコペプチドとを接触させ、その結果、このグリコペプチドが、実質的に均一なフコシル化パターンを有する、工程、を包含する、方法、を提供する。

Description

【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国仮出願第６０／２０３，８５１号（２０００年３月１２日出願）の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、グリコペプチドのグリコシル化パターンを改変するための方法の分野に関する。
【０００３】
（背景）
（Ａ．タンパク質のグリコシル化）
多くの糖タンパク質の生物学的活性は、その糖タンパク質に結合した特定のオリゴ糖構造の存在または非存在に大きく依存する。不適切にグリコシル化された糖タンパク質は、癌、感染性疾患および炎症に関与する（Ｄｅｎｎｉｓら、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ２１：４１２−４２１（１９９９））。さらに、治療的糖タンパク質のグリコシル化パターンは、治療的有効性の多数の局面（例えば、溶解性、タンパク質分解性攻撃および熱不活性化に対する抵抗性、免疫原性、半減期、生物活性および安定性に影響し得る（例えば、Ｒｏｔｏｎｄａｒｏら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１１７−１２８（１９９９）；Ｌｉｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１−２７（１９９３）；Ｏｎｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３０Ａ（Ｓｕｐｐｌ．３），Ｓ７−Ｓ１１（１９９４）；およびＨｏｔｃｈｋｉｓｓら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６０：２５５−２６１（１９８８）を参照のこと）。治療的糖タンパク質の調節の許可は、グリコシル化が均質であり、かつバッチごとに一致していることを必要とする。
【０００４】
グリコシル化は、高度に細胞依存性の複雑な翻訳後改変である。翻訳後、タンパク質は、小胞体（ＥＲ）に輸送され、グリコシル化され、そしてさらなるプロセシングのためにゴルジに送られる。得られる糖タンパク質は、次いで、様々な細胞小器官に標的化されて、膜成分になるか、またはこれらはペリプラズム内に分泌される。
【０００５】
グリコシル化の間、Ｎ結合糖タンパク質またはＯ結合糖タンパク質が形成される。Ｎグリコシル化は、高度に保存された代謝プロセスであり、このＮグリコシル化は、真核生物の生存のために不可欠である。Ｎ結合グリコシル化はまた、発生およびホメオスタシスに関与し；Ｎ結合糖タンパク質は、増殖および発生の間に高度に調節される、細胞表面タンパク質および分泌タンパク質の大部分を構成する（Ｄｅｎｎｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：５８２−５８５（１９８７））。Ｎグリコシル化はまた、形態発生、増殖、分化およびアポトーシスに関連すると考えられる。
【０００６】
真核生物において、Ｎ結合グリコシル化は、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ_ａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｘ_ａａは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）のアスパラギン上で生じる（Ｋｏｒｎｆｅｌｄら、ＡｎｎＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ５４：６３１−６６４（１９８５）；Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２１４５−２１４９（１９８７）；Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓら、ＦＡＳＥＢＪ７：５４０−５５０（１９９３）；およびＯｒｌｅａｎ，ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＶｏｌ．３（１９９６））。Ｏ結合グリコシル化はまた、セリン残基またはスレオニン残基で生じる（Ｔａｎｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９０６：８１−９１（１９８７）；およびＨｏｕｎｓｅｌｌら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１３：１９−２６（１９９６））。他のグリコシル化パターンは、グリコシルホスファチジルイノシトールをタンパク質のカルボキシル末端カルボキシル基に結合することによって形成される（Ｔａｋｅｄａら、ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：３６７−３７１（１９９５）；およびＵｄｅｎｆｒｉｅｎｄら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：５９３−５９１（１９９５））。
【０００７】
Ｎ結合糖タンパク質の生合成は、小胞体におけるドリコール経路で始まる（Ｂｕｒｄａ，Ｐ．ら、ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ１４２６：２３９−２５７（１９９９）；Ｋｏｒｎｆｅｌｄら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：６３１−６６４（１９８５）；Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：９１５−９４４（１９８７）；Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓら、ＦＡＳＥＢＪ．７：５４０−５５０（１９９３））。ポリイソプレノールキャリア脂質に結合したオリゴ糖の合成は、このドリコール経路の中心にある。オリゴ糖、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_９Ｇｌｃ_３は、グリコシルトランスフェラーゼ触媒下で、単糖類を滴下することによって構築される。このドリコール経路は、酵母と哺乳類との間で高度に保存されている。
【０００８】
ドリコール−オリゴ糖結合体の構築の後、このオリゴ糖は、この結合体からタンパク質コンセンサス配列のアスパラギン残基に転移する。このオリゴ糖の転移は、多サブユニット酵素のオリゴサッカリルトランスフェラーゼにより触媒される（Ｋａｒａｏｇｌｕら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐｏｓｉａｏｎＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＢｉｏｌｏｇｙＬＸ：８３−９２（１９９５ｂ）；およびＳｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎら、ＦＡＳＥＢＪ．１０：８４９−８５８（１９９６））。タンパク質へのオリゴ糖の転移に続いて、このオリゴ糖を短縮する一連の反応が起こる。これらの反応は、グルコシダーゼＩおよびＩＩ、ならびにα−マンノシダーゼにより触媒される（Ｋｉｌｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５２９９−５３０３（１９８１）；Ｓａｕｎｉｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１４１５５−１４１６１（１９８２）；およびＢｙｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１４６５７−１４６６６（１９８２））。
【０００９】
小胞体のＮ結合糖タンパク質の合成およびプロセシングに続いて、この糖タンパク質は、ゴルジに転移し、ここで様々なプロセシング工程により、成熟Ｎ結合オリゴ糖構造が形成する。ドリコール経路は真核生物において高度に保存されるが、ゴルジで産生される成熟Ｎ結合糖タンパク質は、種にわたって有意な構造的変化を示す。例えば、酵母糖タンパク質は、９〜１３個のマンノース残基の高級マンノースコア、または２００個までの残基からなる伸長分枝マンナン外鎖を構成するオリゴ糖構造を含む（Ｂａｌｌｏｕら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６６：３６３−３７９（１９９２）；Ｔｒｉｍｂｌｅら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ２：５７−７５（１９９２））。高等真核生物において、Ｎ結合オリゴ糖は、代表的に、高級マンノースであり、これは酵母において産生されるＮ結合オリゴ糖とは有意に異なる複雑かつ混合されたタイプの構造である（Ｋｏｒｎｆｅｌｄら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：６３１−６６４（１９８５））。さらに、酵母において、単一のα−１，２−マンノースは、オリゴ糖の中心アームから除去され、高等真核生物において、マンノースの除去は、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５構造を生成するいくつかのマンノシダーゼの作用を含む（Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａら、ＣｒｉｔＲｅｖＯｒａｌＢｉｏｌＭｅｄ．９（４）：４１５−４４８（１９９８））。複雑なオリゴ糖の分枝は、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_５構造へのオリゴ糖の切断後に生じる。分枝構造（例えば、二触角（ｂｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）、三触角および四触角）は、オリゴ糖残基の領域への、ＧｌｃＮＡｃのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ触媒付加によって合成される。これらの形成に続いて、この触角構造は、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃおよびシアル酸残基を含む異なる糖で終結される。
【００１０】
Ｎ−グリコシル化と同様に、Ｏ−グリコシル化もまた、哺乳動物と酵母との間で顕著に異なる。Ｏ−グリコシル化の開始に際し、哺乳動物細胞は、グリコシルドナーとしてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを使用して、ＳｅｒまたはＴｈｒに直接ＧａｌＮＡｃ残基を付加する。この糖単位を、Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、ＦｕｃおよびＮｅｕＮＡｃを付加することによって、伸長させる。哺乳動物細胞とは対照的に、下等真核生物（例えば、酵母および他の真菌）は、グリコシルドナーとしてＭａｎ−Ｐ−ドリコールを使用して、ＳｅｒまたはＴｈｒにマンノースを付加する。これらの糖を、Ｍａｎおよび／またはＧａｌの付加によって伸長させる。一般には、Ｇｅｍｍｉｌｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１４２６：２２７−２３７（１９９９）を参照のこと。
【００１１】
タンパク質のグリコシル化および糖タンパク質のグリコシル化パターンの生物学的機構を解明するための試みは、多くの分析技術によって補助されてきた。例えば、組換えアスパラギン酸プロテアーゼのＮ−結合オリゴ糖は、質量分析法、２Ｄクロマトグラフィー方法、化学的および酵素的方法の組み合わせを使用することによって、特徴付けられた（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ９：１０３７−１０４３（１９９９））。同じ研究者らはまた、発蛍光団補助糖質電気泳動（ＦＡＣＥ）と組み合わせて放出されたオリゴ糖の蛍光標識誘導体を使用する、精製した糖タンパク質から酵素的に放出されたオリゴ糖の特徴付けを報告している（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ１４：１９７−２０７（１９９８））。
【００１２】
クローニングしたエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼは、糖タンパク質から、単糖およびＮ−グリカンを放出するために標準的に使用される。このエンドグリコシダーゼは、Ｎ−結合グリカンとＯ−結合グリカンとの間、およびＮ−グリカンの分類の間での識別を可能にする。分離されたグリカン上の糖タンパク質を分離する方法もまた、進歩的に、より洗練されかつ選択的になった。糖タンパク質と***されたグリカンとの混合物を分離する方法もまた、改善され続け、そして高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）のような技術は、オリゴ糖の複雑な混合物から個々のオリゴ糖異性体を分離するために慣用的に使用される。最近、グリコサッカライドから放出された糖を同定するための、大規模の有機溶媒（アセトン）沈降を基礎とする方法が、Ｖｅｒｏｓｔｅｋら（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７８：１１１−１２２（２０００）によって報告された。糖タンパク質から放出されるオリゴ糖を単離および特徴付けする多くの他の方法が、当該分野で公知である。一般には、Ｆｕｋｕｄａら、ＧＬＹＣＯＢＩＯＬＯＧＹ：ＡＰＲＡＣＴＩＣＡＬＡＰＰＲＯＡＣＨ、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ１９９３；およびＥ．Ｆ．Ｈｏｕｎｓｅｌｌ（編）ＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮＡＮＡＬＹＳＩＳＩＮＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＥ、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１９９３を参照のこと。
【００１３】
（Ｂ．糖タンパク質の合成）
糖の調製およびこれらの糖から誘導される糖タンパク質のための新たな戦略の同定ならびに最適化に対して、かなりの試みが向けられてきた。多くの有望な方法の中には、所望のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生する細胞宿主の操作、化学的合成、酵素的合成、形成された糖タンパク質の酵素的リモデリング、およびこれらの技術の１以上の混成である方法が包含される。
【００１４】
目的の糖タンパク質を、薬剤として、商業的に実現可能な量で産生し得る細胞宿主系が、調査されてきた。原則として、哺乳動物、昆虫、酵母、真菌、植物または原核生物の細胞培養系を、ほとんどの治療的糖タンパク質および他の糖タンパク質の産生のために使用し得る。しかし、実際には、組換え的に産生されたタンパク質の所望のグリコシル化パターンは、達成が困難である。例えば、細菌はドリコール経路を介してＮ−グリコシル化せず、そして、酵母は、一般にヒトにおいて見出されないオリゴマンノース型Ｎ−グリカンのみを作製する（例えば、Ａｉｌｏｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１：８３７−８４７（２０００）を参照のこと）。同様に、植物細胞は、ヒト糖タンパク質の一般的な成分であるシアリル化オリゴ糖を産生しない（一般には、Ｌｉｕ、ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１０：１１４−２０（１９９２）；およびＬｅｒｏｕｇｅら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：３１−４８（１９９８）を参照のこと）。最近再検討されたように、組換え哺乳動物糖タンパク質の産生のために現在利用可能な昆虫細胞系はいずれも、哺乳動物中で産生される場合に通常見出されるグリカンと同じグリカンを有する糖タンパク質を産生しない。さらに、組換え糖タンパク質のグリコシル化パターンは、異なる細胞培養条件下で産生される場合に、しばしば異なる（Ｗａｔｓｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１０：３９−４４（１９９４）；およびＧａｗｌｉｔｚｅｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．４２：１１７−１３１（１９９５））。現在、組換え糖タンパク質のグリコシル化パターンは、２つの異なるバイオリアクタにおける名目上同一な細胞培養条件下で産生される糖タンパク質の間で異なり得るようである（Ｋｕｎｋｅｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０００：４６２−４７０（２０００））。最後に、多くの細菌系において、組換え的に産生されたタンパク質は、完全に非グリコシル化状態である。
【００１５】
組換え的に産生された糖タンパク質のグリコシル化における異質性は、細胞の機構（例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）が、種間で、細胞間で、またはさらに個体間で変化し得ることに起因して生じる。種々の酵素によって認識される基質は、十分に異なり得、その結果、グリコシル化はいくつかの部位で生じなくても、ネイティブのタンパク質の部位から大きく改変されてもよい。異種の真核生物宿主において産生された組換えタンパク質のグリコシル化は、しばしば、ネイティブのタンパク質のグリコシル化とは異なる。例えば、酵母および昆虫は、ヒトにおいては一般に見られない、高度なマンノース構造を代表的に含む糖タンパク質を発現した。
【００１６】
非常に興味のある分野は、適切にグリコシル化された組換えヒト糖タンパク質を調製するために必要なグリコシル化装置を有する、宿主細胞の設計である。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、特によく研究されたモデル細胞系である。なぜなら、ＣＨＯ細胞は、ヒトにおいて見出される機構と非常に類似したグリコシル化機構を備えるからである（Ｊｅｎｋｉｎｓら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４；９７５−９８１（１９９６））。ヒト細胞由来の糖タンパク質のグリコシル化パターンと、ＣＨＯ細胞由来の糖タンパク質のグリコシル化パターンとの間の多くの類似性とは対照的に、重要な差異が存在する；ＣＨＯ細胞によって産生される糖タンパク質は、α−２，３−末端シアリン酸残基のみを有するが、ヒト細胞によって産生される糖タンパク質は、α−２，３−末端シアリン酸残基およびα−２，６−末端シアリン酸残基の両方を含む（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３８４８−１３８５５（１９８９））。
【００１７】
特定の宿主細胞のグリコシル化の欠損を改善するための試みは、ヒトグリコシル化経路に不可欠な１以上の失われた酵素を発現するように、細胞を操作することに力点を置いてきた。例えば、Ｂｒａｇｏｎｚｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１４７４：２７３−２８２（２０００））は、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する「普遍的宿主」細胞として働くＣＨＯ細胞を生成した。普遍的宿主を生成するため、ＣＨＯ細胞に、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼの発現をコードする遺伝子をトランスフェクトした。次いで、得られた宿主細胞に、他のタンパク質（ヒトインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を含む）をコードする遺伝子の、第二の安定なトランスフェクションを行った。α−２，３−シアリン酸残基およびα−２，６−シアリン酸残基の両方を備えたタンパク質を回収した。さらに、ＩＦＮ−γについてのインビボの薬物動態データは、ＩＦＮ−γ ｃＤＮＡでトランスフェクトされた通常のＣＨＯ細胞によって分泌されたＩＦＮ−γと比較して、普遍的宿主によって産生されたＩＦＮ−γの改善された薬物動態を実証した。
【００１８】
酵素の必要な補充（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）を含むように宿主細胞を操作することによって適切にグリコシル化された糖タンパク質を調製することに加えて、糖タンパク質の新規の合成、および糖タンパク質のグリコシル化を調節するインビトロの酵素的方法の両方の開発に対する試みが向けられてきた。Ｏ−結合糖ペプチドおよびＮ−結合糖ペプチドの両方を合成する方法は、最近再検討された（それぞれ、Ａｒｓｅｑｕｅｌｌら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｓｙｍｅｔｒｙ８：２８３９（１９９７）；およびＡｒｓｅｑｕｅｌｌら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｓｙｍｅｔｒｙ１０：２８３９（１９９７））。
【００１９】
２つの広範な合成モチーフを使用して、Ｎ−結合糖ペプチドを合成する：収束性のアプローチ；および段階的ビルディングブロックアプローチ。この段階的なアプローチは、一般に、グリコシルアスパラギン中間体で開始する、固相ペプチド合成方法論を使用する。収束性のアプローチにおいて、このペプチドおよび糖質は、別々に組み立てられ、そしてこれら２つの成分の間のアミド結合が、合成の後期に形成される。糖タンパク質の糖質化学および合成の両方は、近年、大きく進歩してきたが、糖タンパク質の化学的合成、特に、哺乳動物のオリゴ糖において見出される、遍在するβ−１，２−シス−マンノシド結合の形成に関する実質的な困難がいまだ存在する。さらに、部位および立体化学的障害が、糖質の新規合成の各工程で解決されなければならない。従って、有機合成の分野は、他の生体分子（例えば、オリゴヌクレオチドおよびペプチド）の新規合成よりも、実質的に立ち遅れている。
【００２０】
糖質の化学的合成に関する困難性の観点から、糖タンパク質の糖質部分を合成するための酵素の使用は、糖タンパク質の調製のための、有望なアプロ−チである。酵素ベースの合成は、部位選択性および立体選択性の利点を有する。さらに、酵素的合成は、保護されていない基質を使用して実施され得る。３つの主要な分類の酵素（グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）、グリコアミニダーゼ（例えば、ＰＮＧａｓｅＦ）およびグリコシダーゼ）を、糖質の合成において使用する。グリコシダーゼはさらに、エキソグリコシダーゼ（例えば、β−マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼ）およびエンドグリコシダーゼ（例えば、Ｅｎｄｏ−Ａ、Ｅｎｄｏ−Ｍ）として分類される。これらの分類の酵素の各々は、糖質を調製するために、首尾よく合成的に使用されてきた。一般的な総説については、Ｃｒｏｕｔら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：９８−１１１（１９９８）およびＡｒｓｅｑｕｅｌｌ、前出を参照のこと。
【００２１】
グリコシルトランスフェラーゼは、糖タンパク質上のオリゴ糖構造を改変するために使用されてきた。グリコシルトランスフェラーゼは、良好な立体化学的および部位化学的制御を用いて特定の産物を生成するために、非常に有効であることが示されている。グリコシルトランスフェラーゼは、オリゴ糖を調製し、末端Ｎ−結合およびＯ−結合糖質構造（特に、哺乳動物細胞において産生される糖タンパク質上の）を改変するために使用されてきた。例えば、末端のオリゴ糖は、完全にシアリル化および／またはフコシル化されて、より一貫した糖構造を提供し、この構造は、糖タンパク質の薬力学および種々の他の生物学的特性を改善する。例えば、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ラクトサミンを合成するために使用され、糖質の合成におけるグリコシルトランスフェラーゼの有用性の最初の例示であった（例えば、Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：５４１６−５４１８（１９８２）を参照のこと）。さらに、多くの合成手順が、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸から、ガラクトースの３−ＯＨまたは６−ＯＨにシアリル酸を転移するためにα−シアリルトランスフェラーゼを使用した（例えば、Ｋｅｖｉｎら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２：１３５９−１３６２（１９９６）を参照のこと）。治療的使用のための糖結合体（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）合成における最近の進歩の考察については、Ｋｏｅｌｌｅｒら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１８：８３５−８４１（２０００）を参照のこと。
【００２２】
グリコシダーゼは、通常、グリコシド結合の加水分解を触媒するが、適切な条件下では、この結合を形成するために使用され得る。糖質合成のために使用されるほとんどのグリコシダーゼは、エキソグリコシダーゼであり；グリコシル転移は、基質の非還元末端で生じる。このグリコシダーゼは、水によって妨害されて加水分解産物を提供するか、またはアクセプターによって妨害されて新規グリコシドまたはオリゴ糖を提供するかのいずれかであるグリコシル−酵素中間体において、グリコシルドナーを利用する。エキソグリコシドを使用する例示的経路は、全てのＮ−結合糖タンパク質（公知の扱いにくいβ−マンノシド結合を含み、これは、β−マンノシダーゼの作用によって形成される）のコアの三糖の合成である（Ｓｉｎｇｈら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．９９３−９９４（１９９６））。
【００２３】
エンドグリコシダーゼの使用は、エキソグリコシダーゼの使用よりも一般的でないが、エンドグリコシダーゼもまた、糖質を調製するために利用されてきた。エンドグリコシダーゼの使用に基づく方法は、単糖ではなくオリゴ糖が転移されるという利点を有する。オリゴ糖フラグメントは、ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミン（例えば、ｅｎｄｏ−Ｆ、ｅｎｄｏ−Ｍ）を使用して、基質に付加された（Ｗａｎｇら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３７：１９７５−１９７８）；およびＨａｎｅｄａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２９２：６１−７０（１９９６））。
【００２４】
糖質を調製する際の使用に加えて、上記で考察した酵素は、同様に、糖タンパク質の合成に適用されてきた。リボヌクレアーゼＢの均質な糖形態の合成は、公開されている（ＷｉｔｔｅＫ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２１１４−２１１８（１９９７））。リボヌクレアーゼＢの高マンノースコアを、エンドグリコシダーゼＨで糖タンパク質を処理することによって、切断した。この切断は、ＧｌｃＮＡｃ残基の２つのコアの間で特異的に生じる。次いで、四糖シアリルＬｅｗｉｓＸを、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα−１，３−フコシルトランスフェラーゼＶの連続的な使用によって、この均質な糖タンパク質上の残ったＧｌｃＡＮｃアンカー部位上に、酵素的に再構築した。各々の酵素的触媒工程は、優れた収率で進行した。
【００２５】
化学的合成要素および酵素的合成要素の両方を組み合わせる方法もまた、公知である。例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏおよび共同研究者ら（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０５：４１５−４２２（１９９８））は、エンドグリコシダーゼを使用する、糖ペプチド（グリコシル化ペプチドＴ）の化学酵素的合成を報告した。このＮ−アセチルグルコサミニルペプチドを、純粋に化学的な手段によって合成した。引き続いて、このペプチドを、ヒトトランスフェリン糖ペプチドのオリゴ糖を用いて、酵素的に合成した。この糖部分を、ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで処理することによって、ペプチドに付加した。得られたグリコシル化ペプチドは、ペプチドＴおよびＮ−アセチルグルコサミニルペプチドＴと比較した場合、高度に安定であり、そしてタンパク分解に対して耐性であった。
【００２６】
糖タンパク質を形成および再構築するための酵素の使用における目的物との結合において、所望のグリコシル化パターンを生成するために操作される酵素の生成における目的が存在する。糖タンパク質を生成する際に使用する酵素の変異を生成および特徴付ける方法が、報告されている。例えば、Ｒａｏら（ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ８：２３３８−２３４６（１９９９））は、基質結合を減少させ、そして酵素機能を変更する構造的変化によって規定されるｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの変異体を調製した。Ｗｉｔｈｅｒｓら（米国特許第５，７１６，８１２号）は、活性部位内の正常な求核アミノ酸が非求核アミノ酸に変化した、変異体グリコシダーゼ酵素を調製した。この変異酵素は、二糖産物を加水分解することができないが、なお二糖産物を形成し得る。
【００２７】
変異酵素およびネガティブ酵素の両方の、全体構造および活性部位の構造は、Ｘ線結晶学によって特徴付けられている。例えば、ｖａｎＲｏｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：１３９８９−１３９９６（１９９４）；およびＮｏｒｒｉｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１０４９−１０５９（１９９４）を参照のこと。
【００２８】
（Ｃ．フコシル化）
多くの糖ペプチドは、生物学的な活性を示すために、特定のフコシル化構造の存在を必要とする。細胞間認識機構は、しばしば、フコシル化オリゴ糖を必要とする。例えば、細胞接着分子として機能する多くのタンパク質（Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチンおよびＥ−セレクチンを含む）は、特定の細胞表面フコシル化糖質構造（例えば、シアリルＬｅｗｉｓｘ構造およびシアリルＬｅｗｉｓａ構造）に結合する。さらに、ＡＢＯ血液型系を形成する特定の糖質構造は、フコシル化されている。３つの型の各々における糖質構造は、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１二糖単位を共有する。血液型Ｏの構造においては、この二糖は末端構造である。血液型Ａの構造は、この二糖に末端ＧａｌＮＡｃ残基を付加するα１，３ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼによって形成される。血液型Ｂの構造は、末端ガラクトース残基を付加するα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼによって形成される。
【００２９】
Ｌｅｗｉｓ血液型構造もまた、フコシル化されている。例えば、Ｌｅｗｉｓｘ構造およびＬｅｗｉｓａ構造は、それぞれ、Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮａｃおよびＧａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮａｃである。これら両方の構造は、さらにシアリル化（ＮｅｕＡｃα２，３−）されて、対応するシアリル化構造を形成し得る。目的の他のＬｅｗｉｓ血液型構造は、Ｌｅｗｉｓｙ構造およびＬｅｗｉｓｂ構造であり、これらは、それぞれ、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲおよびＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲである。ＡＢＯ血液型構造およびＬｅｗｉｓ血液型構造の構造ならびにこれらの合成に関与する酵素の記載については、ＥｓｓｅｎｔｉａｌｓｏｆＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖａｒｋｉら編、第１６章（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９９）を参照のこと。
【００３０】
フコシルトランスフェラーゼは、グアノシン−５’−ジホスホフコースから糖アクセプターの特定のヒドロキシルにフコース単位を転移するための合成経路において使用されてきた。例えば、Ｉｃｈｉｋａｗａは、クローニングされたフコシルトランスフェラーゼを用いるシアリル化ラクトサミンのフコシル化を含む方法によって、シアリルＬｅｗｉｓ−Ｘを調製した（Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２８３−９２９８（１９９２））。Ｌｏｗｅは、細胞中で非ネイティブフコシル化活性を発現し、それによってフコシル化糖タンパク質、細胞表面などを生成するための方法を記載した（米国特許第５，９５５，３４７号）。
【００３１】
上記に示された酵素的合成方法の多くの利点にもかかわらず、いくつかの場合において、欠陥が残っている。多くの商業的に重要な、組換え的に生成された糖ペプチド、およびトランスジェニック的に生成された糖ペプチドの生物学的活性は、特定の糖形態の存在または特定の糖形態の非存在に依存することから、このような糖ペプチド上のグリコシル化パターン、特に、フコシル化パターンを酵素的に改変するためのインビトロ手順の必要性が存在する。本発明は、これらおよび他の必要性を満たす。
【００３２】
（発明の要旨）
本発明は、糖ペプチドのフコシル化パターンを改変するための方法を提供する。これらの方法は、フコシルトランスフェラーゼのためのアクセプター部分を有する糖ペプチドを提供する工程、およびフコースドナー部分からアクセプター部分にフコースを転移するために適切な条件下で、この糖ペプチドをフコースドナー部分およびフコシルトランスフェラーゼを含む反応混合物に接触させる工程を包含し、その結果、この糖ペプチドは実質的に均一なフコシル化パターンを有する。
【００３３】
代表的には、本発明の方法において、標的化されたアクセプター部分の少なくとも約６０％がフコシル化され、そしてしばしば、この糖ペプチド上の標的化されたアクセプター部分の少なくとも約８０％がフコシル化される。いくつかの実施形態において、この糖ペプチドは、固体支持体（例えば、親和性クロマトグラフィー媒体）上に可逆的に固定化される。
【００３４】
本発明はまた、公知の糖ペプチドのフコシル化パターンと実質的に同一なフコシル化パターンを有する糖ペプチドを生成するための方法を提供する。この方法は、フコシルトランスフェラーゼについてのアクセプターを有する糖ペプチドを、フコースドナーおよびフコシルトランスフェラーゼに接触させる工程を包含する。糖ペプチドへのフコースの転移は、所望のレベルのフコシル化に達した場合に終了する。本発明のこれらの局面の使用の間には、ヒトでの使用に関する監督官庁によって認可されたかまたはほとんど認可されている治療的に適切な糖ペプチド構造の複製がある。従って、より完全にフコシル化されたペプチドは改善された特性を有し得るが、すでに認可された糖ペプチド構造を複製する能力は、完全に調節された検討プロセス（ｆｕｌｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｅｖｉｅｗｐｒｏｃｅｓｓ）に対して、本方法によって調製された特定の糖ペプチドを提出する必要性を不要にし、それによって重要な経済的利点を提供する。これは、適切なグリコシル化能力を有するが発現レベルが限定された産生細胞株から、有意に大量の産物を生成する能力を有するが劣ったグリコシル化パターンを生じる産生細胞株への切り替えを可能にする。次いで、このグリコシル化パターンは、インビトロで所望の産物のパターンと一致するように改変され得る。次いで、この所望のグリコシル化産物の収率は、所定のバイオリアクタのサイズに対して実質的に増加され、生産経済能力および生産設備能力の両方に影響を与え得る。本発明の方法において使用される特定の糖ペプチドは、一般に、本発明の重要な局面ではない。この糖ペプチドは、フラグメントでもよいし、または全長糖ペプチドでもよい。代表的には、この糖ペプチドは、治療的用途を有する糖ペプチド（例えば、ホルモン、増殖因子、酵素、インヒビター、サイトカイン、レセプター、ＩｇＧキメラまたはモノクローナル抗体）である。
【００３５】
フコシルトランスフェラーゼは、真核生物または原核生物のフコシルトランスフェラーゼであり得、そして通常は哺乳動物または細菌のフコシルトランスフェラーゼである。いくつかの実施形態において、好ましい酵素は、細菌性である。他の実施形態において、好ましいフコシルトランスフェラーゼは、ＦｕｃＴ−ＶＩであり、通常は哺乳動物ＦｕｃＴ−ＶＩである。あるいは、このフコシルトランスフェラーゼはＦｕｃＴ−ＶＩＩであり、通常は、哺乳動物ＦｕｃＴ−ＶＩＩである。このフコシルトランスフェラーゼは、天然の供給源生物から単離され得るか、または組換え的に生成され得る。組換え的に生成される場合、このフコシルトランスフェラーゼは、膜結合ドメインを欠き得る。
【００３６】
使用される特定の酵素に依存して、多くのアクセプター部分が使用され得る。例示的なアクセプター部分としては、Ｇａｌβ１−ＯＲ、Ｇａｌβ１，３／４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３／４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲが挙げられ、ここで、Ｒは、アミノ酸、糖、オリゴ糖または少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基であり、そして、糖ペプチドに連結されるかまたは糖ペプチドの一部である。
【００３７】
実質的に均一なフコシル化パターンを有するフコシル化糖ペプチドの大規模生成のための方法、および公知のフコシル化パターンを有するフコシル化糖ペプチド産生のための大規模方法がまた提供される。
【００３８】
本発明はまた、本発明の方法によってフコシル化される糖ペプチドを含む組成物、ならびに治療および診断においてこの組成物を使用する方法を提供する。
【００３９】
本発明のさらなる目的および利点は、以下の詳細な記載から明らかである。
【００４０】
（発明の詳細な説明および好ましい実施形態）
（略語）
Ａｒａ、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクト；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮａｃ、Ｎ−アセチルグルコ；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、マンノシルアセテート；Ｘｙｌ、キシロース；およびＮｅｕＡｃ、シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）；ＦｕｃＴ、フコシルトランスフェラーゼ。
【００４１】
（定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的用語および科学的用語は、一般的に、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に、本明細書中に使用される命名法および細胞培養における実験室手順、分子遺伝学、有機化学および核酸化学および下記のハイブリダーゼーションは、周知のものであり、そして、当該分野で一般的に使用される。標準的な技術は、核酸合成およびペプチド合成のために使用される。一般的に、酵素反応および精製工程は、製造業者の仕様書に従って実施される。この技術および手順は、当該分野において慣習的な方法および種々の一般的な参考文献（一般的に、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ、第２版（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）（本文書中いたるところに提供される）に従って一般的に実施される。本明細書中で使用される命名法ならびに下記の分析化学および有機合成における実験室手順は、周知であり、そして一般的に当該分野で使用される。標準的技術、またはその改変は、化学合成および化学分析のために使用される。
【００４２】
「ペプチド」は、モノマーがアミノ酸であり、そしてアミド結合を介して一緒に結合されたポリマーをいい、あるいは、ポリペプチドといわれるポリマーをいう。アミノ酸がαアミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれかが使用され得る。さらに、非天然のアミノ酸（例えば、β−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニン）もまた、含まれる。遺伝子コードされないアミノ酸はまた、本発明に使用され得る。さらに、反応基を含むように改変されているアミノ酸はまた、本発明に使用され得る。本発明に使用される全てのアミノ酸は、Ｄ−またはＬ−異性体のいずれかであり得る。Ｌ−異性体が、一般的に好ましい。さらに、他のペプチド模倣物はまた、本発明に有用である。一般的な論評については、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹＡＮＤＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹＯＦＡＭＩＮＯＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳＡＮＤＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）を参照のこと。
【００４３】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合されるα炭素）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホキシド）をいう。このようなアナログは、Ｒ基を修飾している（例えば、ノルロイシン）か、またはペプチド骨格を修飾しているが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能する化学化合物をいう。
【００４４】
グリコシルトランスフェラーゼに対する「アクセプター部分」は、特定のグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプターとして作用し得るオリゴ糖構造である。このアクセプター部分が、対応するグリコシルトランスフェラーゼおよび糖ドナー部分、および他の必要な反応混合成分と接触し、そしてこの反応混合が十分な期間インキュベートされる場合、このグリコトランスフェラーゼは、糖残基を糖ドナー部分からアクセプター部分へ転移する。このアクセプター部分は、しばしば異なる型の特定のグリコシルトランスフェラーゼに対して変わる。例えば、哺乳動物ガラクトシド２−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ（α１，２−フコシルトランスフェラーゼ）に対するアクセプター部分は、オリゴ糖の非還元末端でＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを含み；このフコシルトランスフェラーゼは、α１，２結合を介してフコース残基をＧａｌへ結合する。末端Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−ＲおよびＧａｌβ１，３−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそのシアリル化アナログは、それぞれα１，３およびα１，４−フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分である。しかし、これらの酵素は、フコースをアクセプターのＧｌｃＮＡｃ残基へ結合する。従って、用語「アクセプター部分」は、特定の適用のための目的の特定のグリコシルトランスフェラーゼに関連する。さらなるフコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分、および他のグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分は、本明細書中に記載される。
【００４５】
「実質的に一様な糖型」または「実質的に一様なグリコシル化パターン」とは、糖ペプチド種をいう場合、目的のグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）によってグリコシル化されたアクセプター部分のパーセンテージをいう。例えば、上記のα１，２フコシルトランスフェラーゼの場合、実質的に全ての（下に定義されるように）Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびそのシアリル化されたアナログが目的の糖ペプチドを含む組成物においてフコシル化された部分である場合、実質的に一様なフコシル化パターンの存在が計算される。開始物質がグリコシル化アクセプター部分（例えば、フコシル化されたＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を含み得ることは、当業者によって理解される。従って、計算されたグリコシル化パーセントは、本発明の方法によってグリコシル化されたアクセプター部分および開始物質中ですでにグリコシル化されているアクセプター部分を含む。
【００４６】
上の定義「実質的に一様な」中の用語「実質的に」は、一般的に、特定のグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはより好ましくは少なくとも約９０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも約９５％がグリコシル化されることを意味する。
【００４７】
用語「実質的に同一なフコシル化パターン」とは、既知の糖タンパク質のフコシル化に少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、いっそうより好ましくは少なくとも約９５％およびさらにより好ましくは少なくとも約９８％同一である本発明の方法によって生成された糖ペプチドのグリコシル化パターンをいう。「既知のフコシル化パターン」とは、任意の既知のレベルのフコシル化を有する任意の供給源由来の既知の糖ペプチドのフコシル化パターンをいう。
【００４８】
用語「シアリン酸」とは、９炭素カルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーをいう。シアリン酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース−１−酸（ｇａｌａｃｔｏｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓ−１−ｏｎｉｃａｃｉｄ）（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略される））である。このファミリーの第２のメンバーは、Ｎ−グリコシル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、ここで、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基はヒドロキシル化される。第３のシアリン酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ｎｏｎｕｌｏｓｏｎｉｃａｃｉｄ）（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９（１９９０））。９位置換シアリン酸（例えば、９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ_１−Ｃ_６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ）もまた、含まれる。シアリン酸ファミリーの総説に関して、例えば、Ｖａｒｋｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ２：２５−４０（１９９２）；ＳｉａｌｉｃＡｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＭｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２））を参照のこと。シアリル化手順におけるシアリン酸化合物の合成および使用は、国際出願ＷＯ９２／１６６４０（１９９２年１０月１日公開）に開示される。
【００４９】
用語「組換え」は、細胞に関して使用される場合、この細胞は異種核酸を複製するか、または異種核酸によってコードされるペプチドもしくはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、ネイティブな（非組換え）形態の細胞中に見出されない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた、ネイティブな形態の細胞に見出される遺伝子を含み得、ここで、この遺伝子は、改変され、そして人工的な手段によって細胞へ再導入される。この用語はまた、細胞から核酸を除去しないで改変されている細胞に対して内因性の核酸を含む細胞を包含する；このような改変体は、遺伝子置換、部位特異的変異、および関連技術によって得られたものを含む。「組換えポリペプチド」は、組換え細胞によって産生されているものである。
【００５０】
「異種配列」または「異種核酸」は、本明細書中で使用される場合、特定の宿主細胞に対して外来の供給源から生じるか、または同じ供給源由来である場合、その本来の形態から改変されるものである。従って、真核生物宿主細胞中の異種糖ペプチド遺伝子は、改変されている特定の宿主細胞に対して内因性である糖ペプチド−コード遺伝子を含む。異種配列の改変は、例えば、制限酵素を用いてＤＮＡを処理して、プロモーターに作動可能に連結し得るＤＮＡフラグメントを産生することによって生じ得る。部位指向変異誘発などの技術はまた、異種配列を改変するために有用である。
【００５１】
「部分配列」とは、それぞれ、核酸またはアミノ酸のより長い配列の一部を含む核酸またはアミノ酸（例えば、ポリペプチド）の配列をいう。
【００５２】
「組換え発現カセット」または単純に「発現カセット」は、このような配列に適合可能な宿主中の構造遺伝子の発現に影響を及ぼし得る核酸エレメントを用いて、組換え的にかまたは合成的に産生される核酸構造である。発現カセットは、少なくともプロモーターおよび必要に応じて転写終結シグナルを含む。代表的には、この組換え発現カセットは、転写されるべき核酸（例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸）、およびプロモーターを含む。発現を生じさせるのに必要な、または有用なさらなる因子はまた、本明細書中に記載されるように使用され得る。例えば、発現カセットはまた、宿主細胞から発現タンパク質の分泌を指向するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。転写終結シグナル、エンハンサー、および遺伝子発現に影響を及ぼす他の核酸配列はまた、発現カセットに含まれ得る。
【００５３】
用語「単離された」は、酵素の活性を妨害する成分が実質的または本質的にない材料をいう。本発明の細胞、糖類、核酸、およびポリペプチドに関して、用語「単離された」は、そのネイティブな状態において見出される場合に材料に通常付随する成分が実質的または本質的にない材料をいう。代表的には、本発明の単離された糖類、タンパク質または核酸は、銀染色したゲル上のバンドの強度または純度を決定するための他の方法によって測定される場合、少なくとも約８０％純粋、通常は少なくとも約９０％、そして好ましくは、少なくとも約９５％純粋である。純度または均質性は、当該分野において周知の多くの方法（例えば、タンパク質サンプルまたは核酸サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動、引き続く染色による可視化）によって示され得る。特定の目的に関して、高分解能が必要とされ、そしてＨＰＬＣまたは類似の精製方法が利用される。
【００５４】
本発明の実施は、組換え核酸の構築およびトランスフェクトされた宿主細胞中の遺伝子の発現を含み得る。これらの目的を達成するための分子クローニング技術が、当該分野で公知である。発現ベクターのような組換え核酸の構築に適切である広範な種々のクローニング方法およびインビトロ増幅方法は、当業者に周知である。これらの技術および多くのクローニングの実施を介しての当業者のための有意な説明の例は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａ（Ｂｅｒｇｅｒ）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９９年補遺）との合弁（Ａｕｓｕｂｅｌ）に見出される。組換えポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、当業者に公知であり、例えば、真核生物細胞（昆虫細胞、哺乳動物細胞および真菌細胞を含む）を含む。
【００５５】
当業者にインビトロの増幅方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβレプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術を含む）を介して指示するのに十分なプロトコールの例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；ＡｒｎｈｅｉｍおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ３６−４７；ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌＯｆＮＩＨＲｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４；Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７−１０８０；ＶａｎＢｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ４：５６０；ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ８９：１１７に見出される。インビトロで増幅された核酸をクローニングする改善された方法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載される。
【００５６】
オリゴ糖は、還元末端での糖類が実際に還元糖であるか否かにかかわらず、還元末端および非還元末端を有することが意図される。容認された命名法に従って、オリゴ糖は、左に非還元末端および右に還元末端を有して本明細書中に示される。
【００５７】
本明細書中に記載される全てのオリゴ糖は、非還元糖類に対する名前または略語（例えば、Ｇａｌ）、次いでグリコシド結合の立体配置（αまたはβ）、環結合（１または２）、結合に関する還元糖類の環位置（２、３、４、６または８）、次いで還元糖類の名前または略語（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ）で記載される。各糖類は、好ましくはピラノースである。標準的な糖生物学（ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）の命名法の総説に関しては、ＥｓｓｅｎｔｉａｌｓｏｆＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙＶａｒｋｉら編、ＣＳＨＬＰｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。
【００５８】
（導入）
グリコシル化パターンが改変された糖ペプチドは、一般的に、非変更グリコシル化状態、または特定の適用に対して最適未満のグリコシル化状態にあるペプチドよりも重要な利点を有する。このような非最適グリコシル化パターンは、例えば、組換え糖ペプチドが、所望のグリコシル化パターンを産生するためのグリコシル化機構の適切な補充を有さない細胞において産生される場合に、生じ得る。最適なまたは好ましいグリコシル化パターンは、そのネイティブな細胞において産生される場合、糖ペプチドのネイティブなグリコシル化パターンであってもよいし、なくてもよい。
【００５９】
いくつかの糖ペプチドの生物学的活性は、特定の糖型の存在または非存在に依存する。例えば、アクセプター部分で増加したグリコシル化は、糖ペプチドを高い多価性にし、それによって変更された糖ペプチドの生物学的活性を増加する。グリコシル化パターンが変更された糖ペプチド組成物の他の利点は、例えば、浄化速度の減少に起因して糖ペプチドの治療的半減期を増加することを含む。このグリコシル化パターンを変更することがまた、外来タンパク質上の抗原決定基をマスクし得、従ってこのタンパク質に対する免疫応答を減少または排除する。糖ペプチド結合糖類の糖型の変化はまた、タンパク質を特定の組織または細胞表面レセプター（変更されたオリゴ糖に特異的な）に対する標的にするために使用され得る。変更されたオリゴ糖はまた、天然のリガンドを有するレセプターのインヒビターとして使用され得る。本発明は、糖ペプチドのフコシル化パターンを改変する酵素的方法を提供する。
【００６０】
（方法）
本発明は、選択されたグリコシル化パターンを有する糖ペプチド種を産生する方法を提供する。
【００６１】
第１の局面において、本発明は、糖ペプチドの集団のメンバーが実質的に一様なグリコシル化パターンを有する糖ペプチドの集団を産生する方法を提供する。特に、本発明は、実質的に一様なフコシル化パターンを有する糖ペプチドを調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、他のグリコシルトランスフェラーゼは、所望のグリコシル化パターンを産生するためにフコシルトランスフェラーゼと組み合わせて使用され得る。本発明の方法を実施するための方法およびキットもまた、提供される。本発明の方法は、その初期発現の際に糖ペプチドに存在するグリコシル化パターンから糖ペプチドのグリコシル化パターンを変更するために有用である。特に好ましい実施形態において、糖タンパク質のコピーの収集物のフコシル化パターンは、均質であり；各コピーは、実質的に同じフコシル化パターンを有する。
【００６２】
糖類残基を糖ペプチドに結合するために本発明によって提供される方法は、以前に記載されたグリコシル化方法とは異なり、メンバーが実質的に一様なグリコシル化パターンを有する糖ペプチドの集団を提供し得る。従って、好ましい実施形態において、糖ペプチドの集団は、この集団の各メンバーのフコシル化パターンに関して実質的に単分散である。本発明の方法の適用後、所望の糖類残基（例えば、フコシル残基）は、高いパーセンテージのアクセプター部分に結合される。
【００６３】
本発明はまた、ペプチド基質上に既知のグリコシル化パターンを再生成するための方法を提供する。この方法は、予め選択された（すなわち、既知）レベルまで基質をグリコシル化し、その時点でこのグリコシル化を停止する工程を包含する。特に好ましい実施形態において、このペプチド基質は、既知のレベルまでフコシル化される。本発明の方法は、現在臨床的に使用されるか、または臨床試験において進められている治療タンパク質の複製である糖タンパク質を調製する際の特定の使用である。
【００６４】
上記方法の両方はまた、改変された糖ペプチドの大スケール生成に対して実用的である（パイロットスケール調製および工業スケール調製の両方を含む）。従って、本発明の方法は、変更されたフコシル化パターンを有する糖ペプチドの大スケール調製について実用的な手段を提供する。この方法は、細胞（例えば、哺乳動物細胞またはトランスジェニック動物）における産生の間に不完全にまたは不適切にグリコシル化された治療的糖ペプチドの改変について十分に適合される。このプロセスは、組成物中に存在する糖ペプチド上の増加した、および一貫したレベルの所望の糖型を提供する。
【００６５】
（ａ．基質）
本発明の方法は、フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分を含む任意のフコシル化基質を使用して実行され得る。例示的な基質としては、本発明の方法によって改変され得るペプチド、ガングリオシドおよび他の生物学的構築物（例えば、糖脂質、全細胞など）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の方法によって改変され得る例示的な構築物としては、表１に示されるような当業者にとって公知の細胞上の任意の多数の糖ペプチドおよび炭水化物構築物が挙げられる。
【００６６】
【表１】

本発明の方法によって改変されたペプチドとしては、以下を含むが、これらに限定されない：免疫グロブリンファミリー（例えば、抗体、ＭＨＣ分子、Ｔ細胞レセプターなど）のメンバー，細胞間レセプター（例えば、インテグリン、ホルモンまたは増殖因子のレセプターなど）レクチン、およびサイトカイン（例えば、インターロイキン）。他の例としては、組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、レニン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子）、ボンベシン、トロンビン、造血増殖因子（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、コロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ）、ウイルス抗原、グリコシルトランスフェラーゼなどが挙げられる。本発明を使用する組換え発現およびその後の改変のための目的のポリペプチドとしてはまた、特に、補体タンパク質、α１−抗トリプシン、エリトロポイエチン、Ｐ−セレクチングリコペプチドリガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、抗トロンビンＩＩＩ、インターロイキン、インターフェロン、プロテインＡおよびプロテインＣ、フィブリノーゲン、ヘルセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、グリコシダーゼが挙げられる。ポリペプチドのこの一覧は、例示的なものであって限定的なものではない。
【００６７】
この方法はまた、キメラタンパク質（免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）由来の部分を含むキメラタンパク質を含むがこれに限定されない）のグリコシル化パターンの改変について有用である。ＩｇＧキメラの調製方法は当該分野で公知である。（例えば、ＳｔｅｖｅｎＭ．ＣｈａｍｏｗおよびＡｖｉＡｓｈｋｅｎａｚｉ編、ＡＮＴＩＢＯＤＹＦＵＳＩＯＮＰＲＯＴＥＩＮＳを参照のこと）。
【００６８】
免疫グロブリンならびに免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリン重鎖定常領域）の全部または部分を含むキメラペプチドのグリコシル化を改変することはまた、生物学的活性の増大を提供する。ヒト血清から精製されたＩｇＧ分子に結合したオリゴサッカリド、特にＩｇＧのＡｓｎ２９７に結合したオリゴサッカリドは、ＩｇＧの構造および機能について重要である（Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒら、Ｐｒｏｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ５：９５−１１２（１９８３））。これらのオリゴサッカリドの非存在によって、単球Ｆｃレセプターへの結合の欠如、補体活性化の低下、タンパク質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）に対する感受性の上昇、および抗体−抗原複合体循環からのクリアランスの減少を生じる。免疫グロブリンオリゴサッカリド、特にＩｇＧの免疫グロブリンオリゴサッカリドは、天然には、これらの構造における高い微小不均一性（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を示す（Ｋｏｂａｔａ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１：５〜８（１９９０））。従って、より一様なグリコペプチドを提供する本発明の方法の使用によって、１つ以上のこれらの生物学的活性の改善という結果（例えば、増大された補体活性化、単球Ｆｃレセプターに対する増大された結合、減少したタンパク質分解、および抗体−抗原複合体の増大したクリアランス）を生じる。本発明の方法はまた、他の免疫グロブリン上のオリゴサッカリドを改変するために有用であり、１つ以上の生物学的活性を増強する。例えば、高マンノースオリゴサッカリドは、一般にＩｇＭおよびＩｇＤに結合する。このようなオリゴサッカリドは、本明細書に記載されたように改変され得、特性を増強された抗体を産生し得る。
【００６９】
（ｂ．グリコシルトランスフェラーゼおよび選択されたグリコシル化パタ−ンを有するグリコペプチド組成物の調製方法）
本発明の方法は、選択されたグリコシル化パターンを有するグリコペプチドを産生する能力について選択されるグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ））を利用する。例えば、所望の特異性を有するだけではなく、グリコペプチド調製物の中で高い割合の所望のアクセプターグループをグリコシル化することが可能なグリコシルトランスフェラーゼが選択される。可溶性オリゴサッカリドまたは比較的短いペプチドに結合したオリゴサッカリドとは対照的に、グリコペプチドに結合したオリゴサッカリドアクセプター部分を用いるアッセイ系を使用して得られた結果に基づいて、グリコシルトランスフェラーゼを選択することが好ましい。グリコペプチド結合オリゴサッカリドに基づいたグリコシル化アッセイ結果の使用は、有利である。なぜならば、短いペプチドまたは可溶性のオリゴサッカリドを使用して得た結果は、しばしば、グリコペプチド結合オリゴサッカリドについてのグリコシルトランスフェラーゼ活性を予測するのに役立たないからである。適切なグリコシルトランスフェラーゼを同定するために、アッセイにおける目的の特定グリコペプチドを使用し得る。しかし、また、結合オリゴサッカリドを有する、「標準」グリコペプチド、すなわち容易に入手可能なグリコペプチドを使用し得る。この「標準」グリコペプチドは、目的のグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分を含む。
【００７０】
特定の実施形態において、このグリコシルトランスフェラーゼは、融合タンパク質である。例示的な融合タンパク質としては、２つの異なるグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼ）の活性を示すグリコシルトランスフェラーゼが挙げられる。他の融合タンパク質としては、同一のトランスフェラーゼ活性の２つの異なるバリエーション（例えば、ＦｕｃＴ−ＶＩおよびＦｕｃＴ−ＶＩＩ）が挙げられる。さらに他の融合タンパク質は、トランスフェラーゼ活性の有用性（例えば、増大した可溶性、安定性、代謝回転、増大した発現、トランスフェラーゼ除去のための親和性タグなど）を増強するドメインを含む。
【００７１】
本発明の組成物の調製の使用に適切なグリコシルトランスフェラーゼの例は、本明細書中に記載される。様々な量の各酵素（例えば、１〜１００ｍＵ／ｍｇのタンパク質）をグリコペプチド（例えば、１〜１０ｍｇ／ｍｌ）と反応させることによってグ他の適切なリコシルトランスフェラーゼを容易に同定し得る。このグリコペプチドに対して、目的のグリコシルトランスフェラーゼに対する潜在的なアクセプター部位を有するオリゴサッカリドが結合する。所望の部位に糖残基を付加するグリコシルトランスフェラーゼの能力を比較し、そして所望の性質を有するグリコシルトランスフェラーゼが、本発明の方法の用途のために選択される。
【００７２】
いくつかの実施形態において、グリコペプチドに対して低い割合の酵素単位を使用する所望の糖形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）を提供するグリコシルトランスフェラーゼを使用することは有利である。いくつかの実施形態において、所望のグリコシル化は、１ｍｇのグリコペプチド当たり約５０ｍＵ以下のグリコシルトランスフェラーゼを使用して得られる。好ましくは、約４０ｍＵ未満のグリコシルトランスフェラーゼが、１ｍｇのグリコペプチドに対して使用され、なおより好ましくは、グリコペプチドに対するグリコシルトランスフェラーゼの割合が約３５ｍＵ／ｍｇ以下であり、そして、より好ましくはその割合は約２５ｍＵ／ｍｇ以下である。酵素にかかるコストの見地から最も好ましいのは、１ｍｇのグリコペプチド当たり約１０ｍＵ／ｍｇ未満のグリコシルトランスフェラーゼを使用して、所望のグリコシル化が得られることである。代表的な反応条件としては、約５〜２５ｍＵ／ｍｇグリコペプチドの範囲で存在するグリコシルトランスフェラーゼ、または少なくとも約１〜２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するグリコペプチドとの１０〜５０ｍＵ／ｍｌの反応混合物を有することである。複数の酵素反応において、これらの量の酵素は、グリコシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、またはトランス−シアリダーゼの数に比例して増加し得る。
【００７３】
他の実施形態において、より多くの量の酵素を使用することが所望される。例えば、より速い反応速度を得るために、酵素の量を約２〜１０倍増加し得る。この反応の温度はまた、より速い反応速度を得るために上昇され得る。しかし、一般に、例えば、約３０℃〜約３７℃の温度が適切である。
【００７４】
本発明の方法の効力は、組換え的に作製されたグリコシルトランスフェラーゼの使用を通して増強され得る。組換え技術は、大規模グリコペプチド改変に必要な多量のグリコシルトランスフェラーゼの産生を可能にする。グリコシルトランスフェラーゼの膜アンカードメインの欠失は、グリコシルトランスフェラーゼを可溶性にし、従って、グリコシルトランスフェラーゼの大量の産生および精製を促進する。このグリコシルトランスフェラーゼの膜アンカードメイン欠失は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする改変された遺伝子の組換え発現によって達成され得る。グリコシルトランスフェラーゼの組換え産生についての適切な方法の説明については、米国特許第５，０３２，５１９号を参照のこと。
【００７５】
標的グリコペプチドが固体支持体に固定化される、グリコシル化方法がまた、本発明によって提供される。用語「固体支持体」はまた、半固体支持体を含む。好ましくは、この標的グリコペプチドが可逆的に固定化され、その結果、グリコシル化反応が完結した後、グリコペプチドが放出され得る。多くの適切なマトリクスが、当業者にとって公知である。例えば、イオン交換が、グリコペプチドを適切な樹脂上に一時的に固定するために使用され得、その一方で、グリコシル化反応が進行する。目的のグリコペプチドに特異的に結合するリガンドがまた、親和性に基づいた固定化のために使用され得る。目的のグリコペプチドに結合する抗体は適切であり、ここで、目的のグリコペプチドは、それ自体抗体であるか、またはそのフラグメントを含み、プロテインＡまたはプロテインＧを親和性樹脂として使用し得る。グリコシル化される目的のタンパク質に特異的に結合する色素および他の分子はまた、適切である。
【００７６】
組換え的に作製されたタンパク質はしばしば、融合タンパク質として発現される。この融合タンパク質は、「タグ」を１つの末端に有しており、このタグは、グリコペプチドの精製を促進する。このようなタグはまた、グリコシル化反応が達成される間、タンパク質の固定化ために使用し得る。適切なタグとしては、「エピトープタグ」が挙げられる。このエピトープタグは抗体に特異的に認識されるポリペプチド配列である。エピトープタグは、一般に融合タンパク質に組み込まれ、融合タンパク質を曖昧なところなく検出するためかまたは融合タンパク質を単離するための容易に入手可能な抗体の使用を可能にする。「ＦＬＡＧタグ」は一般に使用されるエピトープタグであり、モノクローナル抗ＦＬＡＧ抗体によって特異的に認識される。このＦＬＡＧタグは、配列ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓからなるかまたはその実質的に同一な改変体である。他の適切なタグが当業者にとって公知であり、そして、例えば、ヘキサヒスチジンペプチドのような親和性タグを含む。このタグは金属イオン（例えば、ニッケルイオンまたはコバルトイオン）に結合する。
【００７７】
好ましくは、グリコペプチドのペプチド部分が全長ペプチドの短縮型である場合、これは好ましくは、全長グリコペプチドの生物学的に活性な部位を含む。例示的な生物学的活性部位としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：酵素活性部位、レセプター結合部位、リガンド結合部位、抗体の相補性決定領域、および抗原の免疫原性領域。
（１．フコシルトランスフェラーゼ反応）
本発明は、グリコペプチドの作製方法を提供する。このグリコペプチドは、実質的に一様なパターンを有する。例えば、いくつかの実施形態において、本方法によって作製された糖タンパク質は、１つ以上のオリゴサッカリド基を有する。このオリゴサッカリド基は、フコシルトランスフェラーゼに対して標的化されたアクセプター部分である。ここで、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％そして尚より好ましくは少なくとも９５％の、この組成物において標的化されたアクセプター部位がフコシル化（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅ）される。
【００７８】
本発明の方法は、複数のコピーのグリコペプチド種を含む組成物と反応混合物とを接触することによって実施される。これらのオリゴペプチド種の主要な部分は、好ましくは１つ以上の結合したオリゴサッカリド基を有する。このオリゴサッカリド基としては、フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分が挙げられる。この反応混合物は、フコース（ｆｕｃｏｓｅ）ドナー部位、フコシルトランスフェラーゼ、およびフコシルトランスフェラーゼ活性に必要な他の試薬が含まれる。このグリコペプチドをこの反応混合物中で、フコースドナー部位からコシルトランスフェラーゼアクセプター部位へと、フコースを転移するのに十分時間かつ適切な条件下でインキュベーションする。
【００７９】
本発明の方法で使用されるフコシルトランスフェラーゼは、選択した割合の目的のフコシルトランスフェラーゼアクセプター部位をフコシル化する能力に基づいて選択される。好ましくは、このフコシルトランスフェラーゼは、グリコペプチドに結合するフコシルトランスフェラーゼアクセプター部位を使用する本発明の方法の適切性についてアッセイされる。可溶性オリゴサッカリドの部分であるアクセプター部位というよりむしろグリコペプチド結合アクセプター部位の使用が、フコシルトランスフェラーゼ活性を決定するアッセイにおいて、グリコペプチド上の選択されたフコシル化パターンを生成するフコシルトランスフェラーゼを選択することを可能にする。
【００８０】
多くのフコシルトランスフェラーゼが、当業者にとって公知である。簡潔には、フコシルトランスフェラーゼとしては、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースからアクセプターである糖のヒドロキシ位へ転移する酵素のいずれかが挙げられる。いくつかの実施形態において、例えば、このアクセプターである糖は、オリゴサッカリドグリコシド中のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃ基のＧｌｃＮＡｃである。この反応について適切なフコシルトランスフェラーゼとしては、（ヒトの母乳由来である）公知のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ−ＩＩＩＥ．Ｃ．番号２．４．１．６５）（例えば、Ｐａｌｃｉｃら、ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓ．１９０：１−１１（１９８９）；Ｐｒｉｅｅｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６−１０４６３（１９８１）；およびＮｕｎｅｚら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６−２０９５（１９８１）を参照のこと）および（ヒト血清で見出された）βＧａｌ（１→４）βＧｌｃＮＡｃα（１→３）フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ−ＩＶ、ＦｕｃＴ−Ｖ、ＦｕｃＴ−ＶＩ、およびＦｕｃＴ−ＶＩＩ，Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）が挙げられる。βＧａｌ（１→３，４）βＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換え形態はまた、利用可能である（Ｄｕｍａｓ，ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１：４２５−４２８（１９９１）およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ４：１２８８−１３０３（１９９０）を参照のこと）。他の例示的なフコシルトランスフェラーゼとしては、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６９）が挙げられる。酵素的フコシル化は、Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９−１７６（１９９０）または米国特許第５，３７４，６５５号；Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｍａｎｓｏｎｉ由来のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（Ｔｒｏｔｔｅｉｎら（２０００）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１０７：２７９−２８７）の方法によって実施され得る；そしてα１，３フコシルトランスフェラーゼＩＸ（ヒトＦｕｃＴ−ＩＸおよびマウスＦｕｃＴ−ＩＸのヌレクオチド配列は、Ｋａｎｅｋｏら、（１９９９）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．４５２：２３７〜２４２に記載されており、そしてこのヒト遺伝子の染色体上の位置は、Ｋａｎｅｋｏら（１９９９）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．ＣｅｌｌＧｅｎｅｔ．８６：３２９−３３０に記載されている。カタツムリ（Ｌｙｍｎａｅａｓｔａｇｎａｌｉｓ）由来およびマングビーン（ｍｕｎｇｂｅａｎ）由来のＮ−結合ＧｌｃＮＡｃをアクセプターとして使用する最近報告されたα１，３−フコシルトランスフェラーゼは、ｖａｎＴｅｔｅｒｉｎｇら（１９９９）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．４６１：３１１−３１４およびＬｅｉｔｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１８３０−２１８３９にそれぞれ記載されている。さらに、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉのα（１，３／４）フコシルトランスフェラーゼような細菌性のフコシルトランスフェラーゼは、Ｒａｓｋｏら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：４９８８−９４に記載され、ならびにＨ．Ｐｙｌｏｒｉのα１，２−フコシルトランスフェラーゼ（Ｗａｎら、（１９９９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４５：３２４５−５３）も記載されている。本発明において有用なフコシルトランスフェラーゼの列挙および説明として、Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ，Ｅ．（１９９６）ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＧｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：３９１−４０８、ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／〜ｐｅｄｒｏ／ＣＡＺＹ／ｇｔｆ．ｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｉ．ｃｏ．ｕｋ／ＴＧＮ／ｇｔ＿ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍもまた参照のこと。
【００８１】
本発明における使用の例示的なフコシルトランスフェラーゼは表２に提供される。
【００８２】
【表２】

いくつかの実施形態において、本発明の方法において使用されるフコシルトランスフェラーゼは、少なくとも約１単位／ｍｌの活性を有し、通常は少なくとも約５単位／ｍｌを有する。
【００８３】
他の実施形態において、本発明の方法における使用のためのフコシルトランスフェラーゼとしては、ＦｕｃＴ−ＶＩＩおよぼＦｕｃＴ−ＶＩが挙げられる。これらの酵素の各々は、好ましくは、グリコペプチド集団に存在する、少なくとも６０％のこれらが標的化したグリコペプチド結合フコシルトランスフェラーゼアクセプター部位のフコシル化を触媒する。
【００８４】
これまでの、インビトロのフコシル化についての研究のほとんどは、低分子基質のフコシル化に焦点をあててきた。これの技術によって、様々なフコシルトランスフェラーゼのフコシル化の効率間の実質的な差異のいずれかも認識されなかった。しかし、発明者らは、グリコペプチドをフコシル化することにおいて特定のＦｕｃＴ分子が驚く程効率的にであることを発見した。例えば、ＦｕｃＴ−ＶＩは、グリコペプチドのフコシル化においてＦｕｃＴ−Ｖより約８倍以上も効率的ある。従って、好ましい実施形態において、本発明は、フコシルトランスフェラーゼを使用してグリコペプチド上のアクセプターをフコシル化する方法を提供する。このフコシルトランスフェラーゼは、同一条件下のＦｕｃＴ−Ｖを使用して達成されるよりも、少なくとも約２倍を超える、より好ましくは少なくとも約４倍を超える、さらにより好ましくは少なくとも約６倍を超える、そして尚さらにより好ましくは少なくとも約８倍を超えるフコシル化の程度を提供する。現在の好ましいフコシルトランスフェラーゼとしては、ＦｕｃＴ−ＶＩおよびＦｕｃＴ−ＶＩＩが挙げられる。
【００８５】
選択された基質に対する特異性は、フコシルトランスフェラーゼが、好ましくは、満たす唯一の最初の基準である。尚さらに好ましい実施形態において、フコシルトランスフェラーゼは、市販の重要な組換えグリコペプチドまたはトランスジェニックグリコペプチドをフコシル化する方法において有用である。本発明の方法において用いられるフコシルトランスフェラーゼはまた、好ましくは効率的に様々なグリコペプチドをフコシル化し得、そしてこの反応のスケールアップを支持し、少なくとも約５００ｍｇの糖タンパク質のフコシル化を可能にする。より好ましくは、フコシルトランスフェラーゼは、少なくとも約１ｋｇ、より好ましくは少なくとも１０ｋｇの組換えグリコペプチドの合成を、低コストおよび低い設備的要求を用いて可能にするフコシル化反応を補助する。
【００８６】
例示的な実施形態において、本発明の方法は、グリコペプチド上にセレクチンに対する少なくとも１つのリガンドの形成を生じる。例示的なＯ結合セレクチンリガンドを図１に示す。例示的なＮ−結合セレクチンリガンドは図２に示される。
このリガンド形成の確認は、セレクチンと相互作用するグリコペプチドの能力をプローブすることによる操作様式においてアッセイされる。グリコペプチドと特定のセレクチンとの間の相互作用は、当業者とって慣用的な方法によって測定可能である。（例えば、Ｊｕｔｉｌａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３９１７−２８（１９９４）；Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ４３（３）：２１１−６（２００１）；Ｓｔａｈｎら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ８：３１１−３１９（１９９８）；Ｌｕｏら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ．８０（４）：５２２−３１（２００１）；Ｄｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．３３（１）：３５−４３（２０００）；Ｊｕｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１１）：６７５５−６２（１９９９）；Ｋｅｒａｍｉｄａｒｉｓら、Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７（４）：７３４−８（２００１）；Ｆｉｅｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１５２４（１）：７５−８５（２００１）；Ｂｒｕｅｈｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４２）：３２６４２−８（２０００）；Ｔａｎｇｅｍａｎｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（７）：９３５−４２（１９９９）；Ｓｃａｌｉａら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８４（１）：９３−１０２（１９９９）；Ａｌｏｎら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３８（５）：１１６９−８０（１９９７）；Ｓｔｅｅｇｍａｉｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（６）：１３３９−４５（１９９７）；Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４４（６）：９８８−１００２（２００１）；Ｓｃｈｕｒｍａｎｎら、Ｇｕｔ３６（３）：４１１−８（１９９５）；Ｂｕｒｒｏｗｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４７（１０）：９３９−４４（１９９４）を参照のこと）。
【００８７】
フコース残基のフコシルトランスフェラーゼ触媒結合についての適切なアクセプター部分としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ，Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、ここでＲは、少なくとも１つの炭素原子を有する、アミノ酸、サッカリド、オリゴサッカリドまたはアグリコン基である。Ｒは、グリコペプチドに結合されるか、またはグリコペプチドの一部である。特定反応に対して適切なフコシルトランスフェラーゼは、所望されるフコース結合の型（例えば、α２、α３、またはα４）、目的の特定のアクセプター、および高収率の所望のフコシル化のを達成するフコシルトランスフェラーゼの能力に基づいて選択される。適切なフコシルトランスフェラーゼおよびこれらの性質は上に記載される。
【００８８】
組成物中の十分な割合のグリコペプチド結合オリゴサッカリドが、フコシルトランスフェラーゼアクセプター部分を含まない場合、適切なアクセプターを合成し得る。例えば、フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプターを合成するための１つの好ましい方法は、ＧｌｃＮＡｃ残基をＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼアクセプタ部分に結合するためのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼの使用を含む。このＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼアクセプタ部分は、グリコペプチド結合オリゴサッカリド上に存在する。好ましい実施形態において、目的のアクセプター部分の多くの画分をグリコシル化する能力を持つトランスフェラーゼが選択される。次いで、得られたＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲは、フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプターとして使用し得る。
【００８９】
得られたＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲ部分はグリコシル化され得、その後フコシルトランスフェラーゼ反応が起き、例えば、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ残基またはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ残基を生じる。いくつかの実施形態において、グリコシル化工程およびフコシル化工程は、同時に実施され得る。グリコシル化されたアクセプターを必要とするフコシルトランスフェラーゼを選択することによって、所望の生成物のみが形成される。従って、この方法は、以下を含む：
（ａ）式ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲの化合物を、化合物Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲまたはＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲを形成するのに十分な条件のもとＵＤＰ−ガラクトースの存在下でグリコシルトランスフェラーゼを用いてグリコシル化する工程；および
（ｂ）以下から選択される化合物を形成するのに十分な条件のもとＧＤＰ−フコースの存在下でフコシルトランスフェラーゼを使用して（ａ）で形成された化合物をフコシル化する工程：
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ１β−Ｏ１Ｒ；
Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ；
Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃ１，α３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲ；または
Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ。
【００９０】
フコシル化ペプチドをフコシルトランスフェラーゼで処理して、フコシル化されたグリコペプチドにさらなるフコース残基を付加し得る。このフコシルトランスフェラーゼは所望の活性を有する。例えば、この方法は、オリゴサッカリド決定因子（例えば、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲおよびＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ）を形成し得る。従って、別の好ましい実施形態において、この方法は、少なくとも２つのフコシルトランスフェラーゼの使用を含む。複数のフコシルトランスフェラーゼを、同時または連続のいずれかで使用する。フコシルトランスフェラーゼを連続的に使用した場合、糖タンパク質が複数のフコシル化工程の間で精製されないことが一般に好ましい。複数のフコシルトランスフェラーゼを同時に使用する場合、この酵素活性は、２つの別個の酵素から誘導され得るか、または１つ以上のフコシルトランスフェラーゼ活性を有する単一の酵素から誘導され得る。
【００９１】
（２．多重酵素オリゴサッカライド（オリゴ糖）合成）
上で議論されるように、幾つかの実施形態において、２つ以上の酵素を、使用して、所望のオリゴサッカライド（オリゴ糖）決定基を形成する。例えば、特定のオリゴサッカライド決定基は、所望の活性を示すために、ガラクトース、シアル酸およびフコースの付加を必要とし得る。従って、本発明は、２つ以上の酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、トランス−シアリダーゼまたはスルホトランスフェラーゼ）を使用して、所望のオリゴサッカライド（オリゴ糖）決定基の高収率合成を得る方法を提供する。
【００９２】
特に好ましい実施形態において、使用される酵素の１つは、サッカライドまたはペプチドをスルホン化するスルホトランスフェラーゼである。セクレチンに対するリガンドを調製するためのスルホトランスフェラーゼの使用は、なおさらに好ましい（Ｋｉｍｕｒａら，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９６（８）：４５３０−５（１９９９））。
【００９３】
幾つかの場合において、グリコペプチド結合オリゴサッカライド（オリゴ糖）は、グリコペプチドのインビボ生合成における目的の特定のグリコシルトランスフェラーゼのためのアクセプター部分を含む。このようなグリコペプチドは、グリコペプチドのグリコシル化パターンの事前の改変なしで、本発明の方法を使用してグリコシル化され得る。しかし、他の場合において、目的のグリコペプチドは、適切なアクセプター部分を欠いている。このような場合において、グリコペプチド結合オリゴサッカライド（オリゴ糖）が、所望のオリゴサッカライド（オリゴ糖）決定基を形成するために目的の事前に選択されたサッカライドユニットのグリコシルトランスフェラーゼ触媒結合のためのアクセプター部分を次に含むように、本発明の方法を、使用して、グリコペプチドのグルコシル化のパターンを改変し得る。
【００９４】
グリコペプチド結合オリゴサッカライド（オリゴ糖）は、必要に応じて、全体または部分のいずれかが、最初に「切り取とられて」、グリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分か、または１つ以上の適切な残基が、適切なアクセプターを獲得するために付加され得る部分かのいずれかが露出され得る。グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼのような酵素は、反応物を結合および切り取るのに有用である。例えば、「高マンノース」型オリゴサッカライドを示すグリコペプチドは、マンノシダーゼによる切り取りに供されて、１つ以上の事前に選択されたサッカライドユニットが結合したら所望のオリゴサッカライド（オリゴ糖）決定基を形成するアクセプター部分が獲得され得る。
【００９５】
この方法はまた、天然の形態ではグリコシル化されていないタンパク質における所望のオリゴサッカライド（オリゴ糖）部分を合成するのに有用である。対応するグリコシルトランスフェラーゼに対する適切なアクセプターは、本発明の方法を使用するグルコシル化の前にこのようなタンパク質に結合し得る。例えば、グリコシル化のための適切なアクセプターを有するポリペプチドの獲得の方法に関する米国特許第５，２７２，０６６号を参照のこと。
【００９６】
従って、幾つかの実施形態において、本発明は、グリコペプチドを改変して、適切なアクセプターを作製する工程を最初に包含する、グリコペプチドに存在するサッカライド基のインビトロシアル化のための方法を提供する。所望のオリゴサッカライド決定基の多重酵素合成の好ましい方法の例は、以下の通りである。
【００９７】
（（ｉ）．フコシル化オリゴサッカライド（オリゴ糖）決定基およびシアル化オリゴサッカライド決定基）
グリコペプチドに所望の生物学的活性を与えるオリゴサッカライド決定基は、しばしば、フコシル化されることに加えてシアル化される。従って、本発明は、グリコペプチド結合オリゴサッカライドを、高収率でシアル化およびフコシル化する方法を提供する。
【００９８】
シアル化は、シアリルトランスフェラーゼを使用して、特定の決定基が、α２，６結合シアル酸を必要とする場合を除いて、トランス−シアリダーゼまたはシアリルトランスフェラーゼのいずれかを使用して達成され得る。酵素の各型の適切な例は、上記される。これらの方法は、適切なドナー部分の存在下で適切な酵素とアクセプターを接触させることによって、シアリルトランスフェラーゼまたはトランス−シアリダーゼに対するアクセプターをシアル化する工程を包含する。シアリルトランスフェラーゼに関して、ＣＭＰ−シアル酸は、好ましいドナー部分である。しかし、好ましくは、トランス−シアリダーゼは、トランス−シアリダーゼが、シアル酸を付加できない脱離基を含むドナー部分を使用する。
【００９９】
例えば、目的のアクセプター部分は、Ｇａｌβ−ＯＲを含む。幾つかの実施形態において、アクセプター部分を、シアル酸が、アクセプター部分の非還元末端に転移される条件下でＣＭＰ−シアル酸の存在下でシアリルトランスフェラーゼと接触させて、化合物ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ−ＯＲまたはＮｅｕＡｃα２，６Ｇａｌβ−ＯＲを形成する。この式において、Ｒは、少なくとも１つの炭素原子を有するアミノ酸、サッカライド、オリゴサッカライドまたはアグリコン基である。Ｒは、グリコペプチドに結合されるか、またはグリコペプチドの一部である。α２，８−シアリルトランスフェラーゼをまた、使用して、上記の構造に第２のシアル酸残基または複数のシアル酸残基を結合させ得る。
【０１００】
シアル化およびフコシル化の両方をされたオリゴサッカライド決定基を得るために、シアル化アクセプターを、上で議論されるようにフコシルトランスフェラーゼと接触させる。大部分のシアリルトランスフェラーゼは、フコシル化アクセプターに対して不活性であるので、シアリルトランスフェラーゼ反応およびフコシルトランスフェラーゼ反応は、一般に、連続して実施される。しかし、ＦｕｃＴ−ＶＩＩは、シアル化されたアクセプターにのみ作用する。従って、ＦｕｃＴ−ＶＩＩは、シアリルトランスフェラーゼと共に同時反応において使用され得る。
【０１０１】
トランス−シアリダーゼが、シアル化を達成するために使用される場合、フコシル化反応およびシアル化反応は、いずれの順番においても、同時にまたは連続的に実施され得る。改変されるペプチドは、適切な量のトランス−シアリダーゼ、適切なシアル酸ドナー基質、フコシルトランスフェラーゼ（α１，３結合またはα１，４結合を形成し得る）および適切なフコシルドナー基質（例えば、ＧＤＰ−フコース）を含む反応混合物と共にインキュベートされる。
【０１０２】
（（ｉｉ）．ガラクトシル化、フコシル化およびシアル化オリゴサッカライド決定基）
本発明はまた、ガラクトシル化、フコシル化およびシアル化されるオリゴサッカライド決定基を合成するための方法を提供する。シアリルトランスフェラーゼまたはトランス−シアリダーゼのいずれか（α２，３−結合シアル酸のみに対する）は、これらの方法に使用され得る。
【０１０３】
トランス−シアリダーゼ反応は、適切な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）、適切なガラクトシルドナー（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）、トランス−シアリダーゼ、適切なシアル酸ドナー基質、フコシルトランスフェラーゼ（α１，３結合またはα１，４結合を形成し得る）、適切なフコシルドナー基質（例えば、ＧＤＰ−フコース）および二価の金属イオンを含む反応混合物と共に、改変されるタンパク質をインキュベートする工程を包含する。これらの反応は、連続してまたは同時に実施され得る。
【０１０４】
シアリルトランスフェラーゼを使用する場合、この方法は、適切な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）、適切なガラクトシルドナー（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）、シアリルトランスフェラーゼ（α２，３またはα２，６）および適切なシアル酸ドナー基質（例えば、ＣＭＰ−シアル酸）を含む反応混合物と共に、改変されるタンパク質をインキュベートする工程を包含する。この反応を、完了するまで実質的に進行させ、次いでフコシルトランスフェラーゼ（α１，３結合またはα１，４結合を形成し得る）および適切なフコシルドナー基質（例えば、ＧＤＰ−フコース）を使用する。シアル化された基質を必要とするフコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＦｕｃＴＶＩＩ）を使用する場合、この反応は、同時に実施され得る。
【０１０５】
（ａ．シアリルトランスフェラーゼ反応）
上で議論されるように、幾つかの実施形態において、本発明は、グリコペプチドをフコシル化し、その後にグリコペプチドをシアル化する方法を提供する。好ましい実施形態において、この方法は、メンバーが、実質的に均一のシアル化パターンを有するグリコペプチドの集団を生じた。次いで、このシアル化グリコペプチドは、フコシル化され、それによって、メンバーが、実質的に均一なフコシル化パターンを有するフコシル化ペプチドの集団を生成する。
【０１０６】
本発明の方法は、シアル酸ドナー部分からサッカライド基にシアル酸を転移するのに十分な時間および適切な反応条件下で、シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸ドナー部分をグリコペプチドと接触させる工程を包含する。シアリルトランスフェラーゼは、ドナー基質のＣＭＰ−シアル酸からアクセプターオリゴサッカライド基質にシアル酸を転移するグリコシルトランスフェラーゼのファミリーを含む。好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるシアリルトランスフェラーゼは、組換え的に生成される。適切なシアリルトランスフェラーゼ反応は、１９９７年１月１６日に出願された米国仮出願第６０／０３５，７１０号および１９９８年１月１５日に出願された米国仮出願第０９／００７，７４１号に記載される。
【０１０７】
典型的には、本発明の方法によって改変されたシアル化パターンを有するグリコペプチドにおけるサッカライド鎖は、改変されていないグリコペプチドよりもより大きな割合のシアル化末端ガラクトース残基を有する。好ましくは、グリコペプチド結合オリゴサッカライドに存在する、約８０％より大きな末端ガラクトース残基は、この方法の使用後にシアル化される。より好ましくは、本発明の方法は、約９０％より大きな末端ガラクトース残基のシアル化を生じ、そしてなおさらに好ましくは、約９５％より大きな末端ガラクトース残基のシアル化を生じる。最も好ましくは、組成物におけるグリコペプチドに存在する本質的に１００％の末端ガラクトース残基は、本発明の方法を使用する改変の後にシアル化される。この方法は、典型的には、約４８時間以下、そしてさらに好ましくは、約２４時間以下で所望のレベルのシアル化を達成し得る。
【０１０８】
アンカードメインが欠失した、組換えシアリルトランスフェラーゼを含む、組換えシアリルトランスフェラーゼおよび組換えシアリルトランスフェラーゼの生成方法の例は、例えば、米国特許第５，５４１，０８３号において見出される。少なくとも１５種の異なる哺乳動物のシアリルトランスフェラーゼが、実証され、そしてこれらのうち１３種のｃＤＮＡが、今日までにクローンされている（本明細書中において使用される系統的な命名法に関して、Ｔｓｕｊｉら（１９９６）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ６：ｖ〜ｘｉｖを参照のこと）。これらのｃＤＮＡは、シアリルトランスフェラーゼの組換え生成のために使用され得、次いで、これは本発明の方法に使用され得る。
【０１０９】
好ましくは、グリコペプチドのＮ結合型糖質および／またはＯ結合型糖質のグリコシル化に関して、シアリルトランスフェラーゼは、末端配列Ｇａｌβ１，４−ＯＲまたはＧａｌＮＡｃ−ＯＲにシアル酸を転移する。ここでＲは、少なくとも１つの炭素原子を有するアミノ酸、サッカライド、オリゴサッカライドまたはアグリコン基であり、そしてグリコペプチドに結合しているか、またはグリコペプチドの一部である。Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃは、完全にシアル化された糖質構造における末端シアル基の基礎となる最も共通の終わりから２番目の配列である。少なくとも３つのクローン化された哺乳動物シアリルトランスフェラーゼは、このアクセプター特異性の必要条件を満たし、そしてこれらのそれぞれは、グリコペプチドのＮ結合型糖質基およびＯ結合型糖質基にシアル酸を転移することが実証される。アクセプターとしてＧａｌβ−ＯＲを使用するシアリルトランスフェラーゼの例を、表３に示す。
【０１１０】
【表３】

幾つかの実施形態において、組換え的に生成するか、または天然の細菌細胞において生成するかのいずれかである細菌のシアリルトランスフェラーゼの使用を介して商業的な実用性を増大させた本発明のシアル化法。以下の２種の細菌のシアリルトランスフェラーゼは、最近報告された：Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｄａｍｓｅｌａ由来のＳＴ６ＧａｌＩＩ（Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：１０４〜１１０）およびＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＳＴ３ＧａｌＶ（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２７１〜２８２７６）。この２種の最近記載された細菌の酵素は、オリゴサッカライド基質におけるＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ配列にシアル酸を転移する。表４は、これらのアクセプター特異性および本発明の方法において有用な他のシアリルトランスフェラーゼを示す。
【０１１１】
【表４】

最近報告されたウイルスのα２，３−シアリルトランスフェラーゼもまた、本発明のシアル化法における試験および可能な使用に適切である（Ｓｕｊｉｎｏら（２０００）ＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙＢ１０：３１３〜３２０）。この酵素（ｖ−ＳＴ３ＧａｌＩ）は、Ｍｙｘｏｍａウイルス感染した細胞から入手された。そしてこの酵素は、それぞれのアミノ酸配列の比較によって示されるように哺乳動物ＳＴ３ＧａｌＩＶに明らかに関連している。ｖ−ＳＴ３ＧａｌＩは、Ｉ型（Ｇａｌβ１，３−ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ）アクセプター、ＩＩ型（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−β１−Ｒ）アクセプターおよびＩＩＩ型（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１−Ｒ）アクセプターのシアル化を触媒する。この酵素はまた、フコシル化アクセプター部分（例えば、Ｌｅｗｉｓ^ｘおよびＬｅｗｉｓ^ａ）にシアル酸を転移し得る。
【０１１２】
本願方法において有用なシアリルトランスフェラーゼの例は、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩである。これはまた、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）と称される。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグルコシドのＧａｌへのシアル酸の転移を触媒する（例えば、Ｗｅｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１；ＶａｎｄｅｎＥｉｊｎｄｅｎら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９を参照のこと）。シアル酸は、２つのサッカライド間のα結合の形成によってＧａｌに結合される。サッカライド間の結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）（結合（ｌｉｎｋａｇｅ））は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位との間にある。この特定の酵素は、ラット肝臓から単離され得（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５）；ヒトｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２〜２２７８７；ＫｉｔａｇａｗａおよびＰａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４〜１４０１）およびゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１〜９３８）ＤＮＡ配列は公知であり、組換え発現によるこの酵素の生成を容易にする。好ましい実施形態において、本願シアル化法は、ラットＳＴ３ＧａｌＩＩＩを使用する。
【０１１３】
他のシアリルトランスフェラーゼ（上記に列挙されるシアリルトランスフェラーゼを含む）はまた、商業的に重要なグリコペプチドのシアル化のための経済的にかつ効率的な大規模プロセスにおいて有用である。上記されるように、これらの他の酵素の有用性を見つけるための単純な試験は、容易に入手可能なグリコペプチドタンパク質（例えば、アシアロ−α_１−ＡＧＰ（１〜１０ｍｇ／ｍｌ））と種々の量の各酵素（１〜１００ｍＵ／ｍｇタンパク質）とを反応させて、目的のシアリルトランスフェラーゼがグリコペプチドをシアリル化する能力を比較することである。例えば、この結果は、所望される特定のシアル酸結合に依存して、ＳＴ６ＧａｌＩまたはＳＴ３ＧａｌＩＩＩのいずれかまたは両方（例えば、ウシ酵素またはヒト酵素）と比較され得る。あるいは、他のグリコペプチドまたはグリコペプチドあるいはペプチド骨格から酵素的に遊離されたＮ結合型オリゴサッカライドまたはＯ結合型オリゴサッカライドは、この評価のためにアシアロ−α_１ＡＧＰの代わりに使用され得るか、あるいは他の方法によって生成されるか、または乳汁のような天然の生成物から生成されるサッカライドを使用し得る。しかし、好ましくは、シアリルトランスフェラーゼは、グリコペプチドに結合されるオリゴサッカライドを使用してアッセイされる。例えば、ＳＴＧａｌＩよりもより効率よくグリコペプチドのＮ結合型オリゴサッカライドまたはＯ結合型オリゴサッカライドをシアル化する能力を示すシアリルトランスフェラーゼは、グリコペプチドシアル化のための実用的な大規模のプロセスにおいて有用である。
【０１１４】
本発明はまた、α２，６Ｇａｌ結合およびα２，３Ｇａｌ結合（この両方は、ヒト血漿グリコペプチドのＮ結合型オリゴサッカライドに見出される）でシアル酸を付加することによってフコシル化の前にグリコペプチドのシアル化パターンを改変する方法を提供する。この実施形態において、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩシアリルトランスフェラーゼおよびＳＴ６ＧａｌＩシアリルトランスフェラーゼは両方とも反応物中に存在し、そして再シアル化反応において形成される再現可能な割合の２つの結合を有するタンパク質を提供する。従って、２つの酵素の混合物は、両方の結合が最終生成物において所望である場合、価値があり得る。
【０１１５】
シアリルトランスフェラーゼのためのアクセプター部分は、本明細書中に記載されるシアル化法によって改変されるグリコペプチドに存在する。適切なアクセプターとしては、例えば、ガラクトシル化アクセプター（例えば、Ｇａｌβ１、４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）、ＧａｌＮＡｃ−Ｏ−Ｓｅｒ、ＧａｌＮＡｃ−Ｏ−Ｔｈｒおよび当業者に公知の他のアクセプター）が挙げられる（例えば、Ｐａｕｌｓｏｎら（１９７８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７〜５６２４を参照のこと）。典型的には、アクセプターは、タンパク質に存在するアスパラギン残基、セリン残基またはスレオニン残基に結合するオリゴサッカライド鎖中に含まれる。
【０１１６】
（Ｂ．グリコシルトランスフェラーゼ反応混合物）
上記されるグルコシルトランスフェラーゼ、グリコペプチドおよび他の反応混合物成分を、水性の反応媒体（溶液）中の混合によって合わせる。この媒体は、一般的に約５〜約８．５のｐＨ値を有する。媒体の選択は、媒体が、所望のレベルでｐＨ値を維持する能力に基づく。従って、幾つかの実施形態において、この媒体は、約７．５のｐＨ値に緩衝化される。緩衝液が使用されない場合、媒体のｐＨは、使用される特定のグリコシルトランスフェラーゼに依存して、約５〜８．５に維持されるべきである。フコシルトランスフェラーゼに関して、ｐＨの範囲は、好ましくは、約７．２〜７．８に維持される。シアリルトランスフェラーゼに関して、範囲は、好ましくは、約５．５〜約６．５である。適切な塩基は、ＮａＯＨ、好ましくは、６ＭのＮａＯＨである。
【０１１７】
酵素量または酵素濃度は、活性ユニットにおいて示される。これは、触媒作用の初速度の尺度である。１活性ユニットは、所定の温度（典型的には３７℃）およびｐＨ値（典型的には７．５）で１分間あたり１μｍｏｌの生成物の形成を触媒する。従って、１０ユニットの酵素は、１０μｍｏｌの基質が、温度３７℃および７．５のｐＨ値で１分間に１０μｍｏｌの生成物に変換される、酵素の触媒量である。
【０１１８】
反応混合物は、二価金属カチオン（Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋）を含み得る。反応媒体はまた、必要な場合、可溶化界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎまたはＳＤＳ）および有機溶媒（例えば、メタノールまたはエタノール）を含み得る。酵素は、溶液中で遊離して利用され得るか、またはポリマーのような支持体に結合され得る。従って、反応混合物は、開始時に実質的に同質であるが、幾つかの沈殿物が、反応の間に形成され得る。
【０１１９】
上のプロセスを実行する温度は、凍結する温度の直ぐ上の温度から最も感受性の酵素が変性する温度までの範囲であり得る。この温度範囲は、好ましくは、約０℃〜約４５℃、そしてさらに好ましくは、約２０℃〜約３７℃である。
【０１２０】
このようにして形成された反応混合物は、グリコシル化されるグリコペプチドに結合したオリゴサッカライド基に存在する所望のオリゴサッカライド決定基の所望の高収率を獲得するのに十分な時間維持される。大規模な調製に関して、反応を、しばしば、約８〜２４０時間進行させ、約１２時間と７２時間との間の時間がより典型的である。
【０１２１】
１つより多くのグリコシルトランスフェラーゼが、実質的に均一なグリコペプチドを有するグリコペプチドの組成物を獲得するために使用される実施形態において、一旦、第１のグリコシルトランスフェラーゼ反応が、終了間近になると、第２のグリコシルトランスフェラーゼ反応のための酵素および試薬は、反応媒体に添加される。酵素の幾つかの組み合わせに関して、グリコシルトランスフェラーゼおよび対応する基質は、単一の初反応混合物において合わされ得る；このような同時反応における酵素は、好ましくは、他の酵素に対するアクセプターとして役立ち得ない生成物を形成しない。例えば、大部分のシアリルトランスフェラーゼは、フコシル化アクセプターをシアル化せず、それゆえ、シアル化アクセプターのみに作用するフコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＦｕｃＴＶＩＩ）を使用しない限り、両方の酵素による同時反応は、所望のオリゴサッカライド決定基の所望の高収率をおそらく生じないようである。単一の容器中で２つのグリコシルトランスフェラーゼ反応を順番に実施することによって、全体の収率は、中間体種が、単離される手順よりも改善される。さらに、余分な溶媒および副生成物の浄化および処分が減少する。
【０１２２】
１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ反応が、グリコシルトランスフェラーゼサイクルの一部として実施され得る。グリコシルトランスフェラーゼサイクルの好ましい条件および詳細が記載されている。多くのグリコシルトランスフェラーゼサイクル（例えば、シアリルトランスフェラーゼサイクル、ガラクトシルトランスフェラーゼサイクル、およびフコシルトランスフェラーゼサイクル）は、米国特許第５，３７４，５４１号およびＷＯ９４２５６１５Ａに記載される。他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルは、Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２８３（１９９２）、Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：４３４３（１９９２）、ＤｅＬｕｃａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：５８６９−５８７０（１９９５）、およびＩｃｈｉｋａｗａら、ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓａｎｄＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ、Ｙａｌｔａｍｉ編（ＡＴＬＰｒｅｓｓ、１９９３）に記載される。
【０１２３】
他のグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼについて詳細に記載されているように、類似のトランスフェラーゼで置換され得る。特に、このグリコシルトランスフェラーゼはまた、例えば、グルコシルトランスフェラーゼ、例えば、Ａｌｇ８（Ｓｔａｇｌｊｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：５９７７（１９９４））またはＡｌｇ５（Ｈｅｅｓｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：７１（１９９４））、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（例えば、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８９（１９９２）およびＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４））およびポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３））であり得る。適切なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとして、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ１７６：６０８（１９９１））、ＧｎＴＩＩおよびＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：６９２（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））、Ｏ−結合Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９３２６（１９９２））、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ（Ｒａｊｐｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：９８５（１９９２））、およびヒアルロナンシンターゼが挙げられる。適切なマンノシルトランスフェラーゼとして、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈ１、およびＰｍｔ１が挙げられる。
【０１２４】
上記のグリコシルトランスフェラーゼサイクルについて、種々の反応物質の濃度および量が、反応条件（例えば、温度およびｐＨ値）ならびにグリコシル化されるアクセプター糖の選択および濃度を含む、多くの因子に依存するプロセスにおいて用いられた。グリコシル化プロセスは、活性化ヌクレオチド、活性化されたドナー糖、および触媒量の酵素の存在下で産生されたＰＰｉの掃除作用（ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ）の再生を可能にするので、このプロセスは、先に議論された化学量論的基質の濃度および量により制限される。本発明の方法に基づいて用いられ得る反応物質の濃度の上限は、このような反応物質の溶解度により決定される。
【０１２５】
好ましくは、活性化ヌクレオチド、リン酸ドナー、ドナー糖、および酵素の濃度は、そのアクセプターが消費されるまでグリコシル化が進行するように選択される。以下で議論される考慮は、シアリルトランスフェラーゼの関係においてであるが、一般的に、他のグリコシルトランスフェラーゼサイクルに適用可能である。
【０１２６】
各々の酵素は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度に従って、および反応条件（例えば、温度、時間、およびｐＨ値）に従って変化する。予め選択された基質濃度および反応条件下での所定の酵素についての触媒量を決定するための手段は、当業者に周知である。
【０１２７】
（Ｃ．精製）
上述のプロセスにより生成される生成物は、精製することなく使用され得る。しかし、いくつかの適用のために、糖ペプチドを精製することが望ましい。糖ペプチドの精製のための標準的な、周知の技術が適切である。アフィニティークロマトグラフィーは、適切な精製方法の１つの例である。特定の糖ペプチドまたは糖ペプチド上の特定のオリゴ糖決定基に対する親和性を有するリガンドは、クロマトグラフィーマトリクスに取り付けられ、そして糖ペプチド組成物を、そのマトリクスを通して通過させる。任意の洗浄工程の後、糖ペプチドはマトリクスから溶出される。
【０１２８】
濾過もまた、糖ペプチドの精製のために使用され得る（例えば、米国特許第５，２５９，９７１号および同第６，０２２，７４２号を参照のこと）。
【０１２９】
糖ペプチドの精製が所望される場合、糖ペプチドは、実質的に精製された形態で回収されることが好ましい。しかし、いくつかの適用について、精製が必要とされないか、または中間レベルの糖ペプチドの精製のみが必要とされる。
【０１３０】
（組成物）
いくつかの実施形態において、本発明は、実質的に均一なグリコシル化パターンを有する糖ペプチド組成物を提供する。この組成物は、糖形態の変更が所望されるタンパク質または糖タンパク質に取り付けられた糖またはオリゴ糖を含む。糖またはオリゴ糖は、グリコシルトランスフェラーゼのような酵素またはトランスシアリダーゼまたはスルホトランスフェラーゼのような他の酵素に対してアクセプターとして機能し得る構造を含む。アクセプター部分がグリコシル化またはスルホン化されている場合、所望のオリゴ糖構造が形成される。所望の構造は、その糖またはオリゴ糖が取り付けられた糖ペプチドに所望の生物学的活性を与える構造である。本発明の組成物において、予め選択された糖ユニットは、目的の潜在的なアクセプター部分の少なくとも約６０％に連結される。より好ましくは、予め選択された糖ユニットは、目的の潜在的なアクセプター部分の少なくとも約８０％に連結され、そしてなおより好ましくは、目的の潜在的なアクセプター部分の少なくとも約９５％に連結される。出発糖ペプチドが目的のオリゴ糖構造において異質性を示す（例えば、出発糖ペプチド上のいくつかのオリゴ糖が、すでに、目的のアクセプター部分に取り付けられた予め選択された糖ユニットを有する）場合、示される割合は、このような予め取り付けられた糖ユニットを含む。
【０１３１】
用語「変更された」とは、本発明の方法の適用後に、元来産生される糖ペプチドにおいて観察されたグリコシル化パターンと異なるグリコシル化パターンを有する糖ペプチドをいう。例えば、本発明は、糖ペプチドの糖形態が、糖ペプチドがネイティブである生物の細胞により産生される場合に糖ペプチドにおいて見出される糖形態と異なるような、糖ペプチド組成物およびこのような組成物を形成する方法を提供する。組み換え産生された糖ペプチドのグリコシル化パターンが、宿主細胞（ネイティブの糖ペプチドが産生される細胞と同一かまたは異なる種の細胞であり得る）により元来産生されるような糖ペプチドのグリコシル化パターンと比較して改変されている組成物およびこのような組成物を形成する方法もまた提供される。
【０１３２】
構造的な分析によってだけでなく、そのタンパク質の１つ以上の生物学的活性の比較によってもグルコシル化パターンにおける差異を評価し得る。「変更された糖形態」を有する糖ペプチドとしては、改変されていない糖ペプチドと比較して、グリコシル化反応後に糖ペプチドの１つ以上の生物学的活性における改善を示す糖ペプチドが挙げられる。例えば、変更された糖ペプチドとして、本発明の方法を用いたグリコシル化後に、目的のリガンドに対するより大きな結合親和性、より長い治療的半減期、減少した抗原性、特定の組織への標的化などを示す糖ペプチドが挙げられる。観察される改善の量は、好ましくは、統計的に有意であり、そしてより好ましくは、少なくとも約２５％の改善であり、そしてなおより好ましくは、少なくとも約５０％であり、そしてさらになおより好ましくは、少なくとも８０％である。
【０１３３】
（Ｄ．糖ペプチド組成物の使用）
次いで、上述される所望のオリゴ糖決定基を有する糖ペプチドは、種々の適用において（例えば、抗原として、診断試薬として、または治療剤として）使用され得る。従って、本発明はまた、種々の状態を処置する際に使用され得る効率的組成物を提供する。この薬学的組成物は、上述の方法に従い作製された糖ペプチドから構成される。
【０１３４】
本発明の薬学的組成物は、種々の薬物送達システムにおける使用に適切である。本発明における使用のために適切な処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版（１９８５）に見出される。薬物送達についての方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照のこと。
【０１３５】
薬学的組成物は、予防的処置および／または治療的処置のために、非経口投与、鼻腔内投与、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与、経口投与、または局所（ｌｏｃａｌ）投与（例えば、エアロゾルにより、または経皮的に）が意図される。一般的に、薬学的組成物は、非経口的に（例えば、静脈内に）投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア、好ましくは、水性キャリア（例えば、水、緩衝化された水、生理食塩水、ＰＢＳなど）中に溶解または懸濁された糖ペプチドを含む非経口投与のための組成物を提供する。この組成物は、生理学的状態に近づけるために必要とされる薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調節および緩衝試薬、張度調整試薬、湿潤剤、界面活性剤など）を含み得る。
【０１３６】
これらの組成物は、従来の滅菌技術により滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られる水溶液は、そのままでかまたは凍結乾燥された状態での使用のために包装され得る（凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性キャリアと合わせられる）。調製物のｐＨは、代表的に、３〜１１の間であり、より好ましくは、５〜９であり、そして最も好ましくは７〜８である。
【０１３７】
糖ペプチドを含む組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与され得る。治療的な適用において、組成物は、上述のように、すでに疾患に罹患している患者に、その疾患およびその合併症の症候を治療するかまたは少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療的有効用量」と規定される。この使用のために効果的な量は、疾患の重篤度ならびに患者の体重および一般的な状態に依存するが、一般的に、７０ｋｇの患者に対して１日あたり約０．５ｍｇ〜約２，０００ｍｇの糖ペプチドの範囲であり、１日あたり約５ｍｇ〜約２００ｍｇの化合物の投薬量が一般的に使用される。
【０１３８】
予防的な適用において、本発明の糖ペプチドを含む組成物は、特定の疾患に感受性を有するか、そうでなければその危険性のある患者に投与される。このような量は、「予防的有効用量」であると規定される。この用途において、この正確な量もまた、患者の健康状態および体重に依存するが、一般的に、７０ｋｇの患者あたり約０．５ｍｇ〜約１，０００ｍｇの範囲であり、より一般的には、７０ｋｇの体重あたり約５ｍｇ〜約２００ｍｇである。
【０１３９】
組成物の単回の投与または複数回の投与は、処置する医師により選択された用量レベルおよびパターンで実施され得る。いずれの場合においても、薬学的処方物は、患者を効果的に処置するのに十分な量の本発明の糖ペプチドを提供するべきである。
【０１４０】
糖ペプチドはまた、診断試薬としての使用を見出し得る。例えば、標識された糖ペプチドが、所望のオリゴ糖決定基と、対応するリガンドとの間の相互作用に起因してこの糖ペプチドが体内に濃縮される位置を決定するために使用され得る。この用途のために、化合物は、適切な放射性同位体（例えば、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、またはトリチウム）かまたは当業者に公知の他の標識で標識され得る。
【０１４１】
本発明の糖ペプチドは、本発明の化合物に特異的に反応するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の生成のための免疫原として使用され得る。種々の免疫グロブリン分子の生成および操作のための当業者に利用可能な多くの技術が、本発明において使用され得る。抗体は、当業者に周知の種々の手段により生成され得る。
【０１４２】
非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス、ウサギ、ウマなど）の生成は周知であり、そして例えば、本発明の糖ペプチドを含む調製物を用いて動物を免疫することにより達成され得る。免疫された動物から獲得される抗体産生細胞は不死化され、そしてスクリーニングされるか、または所望の抗体の産生について最初にスクリーニングされ、次いで不死化される。モノクローナル抗体生成の一般的な手順の議論については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照のこと。
【０１４３】
（実施例）
本実施例は、本発明の方法を例証する。実施例１は、インビトロでのシアリル化およびフコシル化を用いて、ペプチドへのシアリルルイスｘ構造の導入を示す。実施例２は、２つのフコシルトランスフェラーゼ、ＦｕｃＴ−ＶおよびＦｕｃＴ−ＶＩの基質特異性およびフコシル化活性を示す。実施例３は、フコシル化のための基質としてタンパク質ＲｓＣＤ４を用いる、本発明の例示的なフコシル化プロセスを示す。このフコシル化工程は、シアリル化工程の前に行なわれる。実施例４は、特定の糖タンパク質に作用するフコシルトランスフェラーゼの能力を決定するための例示的なアッセイを示す。
【０１４４】
（実施例１）
実施例１は、インビトロでのシアリル化およびフコシル化を用いて、ペプチドへのシアリルルイスｘ構造の導入を示す。
【０１４５】
（１．１組換え糖ペプチドのシアリル化）
糖ペプチドを５０ｍＭＴｒｉｓ、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ_３中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解させた。この溶液を、５ｍＭＣＭＰ−シアル酸および０．１Ｕ／ｍＬＳＴ３Ｇａｌ３と共に３２℃にて２日間インキュベートした。シアル酸の組込みをモニターするために、この反応の少量のアリコートに^１４Ｃ−ＣＭＰＳＡを添加し；４５％ＭｅＯＨ、０．１％ＴＦＡ中のＴｏｓｏＨａａｓＧ２０００ＳＷｘｌカラムでのゲル濾過により、遊離の標識からペプチドへ組込まれた標識を分離した。ペプチドに組込まれた放射活性を、インラインシンチレーションディテクターを用いて定量化した。組込まれた標識の画分は１日後に０．０７３、２日後に０．０７１であることを見出した。これは、シアリル化反応が２４時間以内に完了したことを示した。
【０１４６】
（１．２シアリル化ペプチドのフコシル化）
実施例１．１に記載されるようにして調製された糖ペプチドに、ＧＤＰ−フコースを５ｍＭ、ＭｎＣｌ_２を５ｍＭ、およびＦｕｃＴ−ＶＩを０．０５Ｕ／ｍＬ添加した。この反応物を３２℃にて２日間インキュベートした。フコースの組込みをモニターするために、この反応の少量のアリコートに^１４Ｃ−ＧＤＰ−ｆｕｃを添加し；４５％ＭｅＯＨ、０．１％ＴＦＡ中のＴｏｓｏＨａａｓＧ２０００ＳＷｘｌカラムでのゲル濾過により、遊離の標識からペプチドへ組込まれた標識を分離した。ペプチドに組込まれた放射活性を、インラインシンチレーションディテクターを用いて定量化した。組込まれた標識の画分は１日後に０．１５、２日後に０．１３５であることを見出した。これは、フコシル化反応が２４時間以内に完了したことを示した。反応の完了の後に、ＧＬＹＫＯマニュアルに従い、ＦＡＣＥゲルでのＮ−グリカンのプロファイリングを実施した。
【０１４７】
（１．３結果）
グリコシル化反応の結果物を、ＦＡＣＥ分析を用いてアッセイした。ＰＮＧａｓｅＦを用いて組換え糖タンパク質から放出されたＮ−グリカンのプロフィールを図３に提供する。左から右へ：ラダー（ｌａｄｄｅｒ）、ネイティブ；ＳＴ３Ｇａｌ３でのシアリル化後；ＳＴ３Ｇａｌ３でのシアリル化およびＦｕｃＴ−ＶＩでのフコシル化後。ネイティブの物質は、二触角（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）のコアがフコシル化されたグリカン：アシアロ（ＤＰ８．５）、モノシアリル化（ＤＰ約７）、およびジシアリル化（ＤＰ６．２）の混合物を含む。シアリル化後、優性のグリカンは、フコシル化反応後にジシアリル化される（Ｄｐ６．２３）。フコシル化後、ＤＰ６．８８のバンドへの量的変化が見られる。
【０１４８】
（実施例２）
実施例２は、２つのフコシルトランスフェラーゼ、ＦｕｃＴ−ＶおよびＦｕｃＴ−ＶＩの基質特異性およびフコシル化活性を示す。
【０１４９】
（２．１ＦｕｃＴ−ＶおよびＦｕｃＴ−ＶＩを用いたフコシル化の比較）
実施例１．１由来のシアリル化タンパク質を、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させ、そして５ｍＭＧＤＰ−フコース、５ｍＭＭｎＣｌ_２、２ｍＵ／ｍＬのアルカリホスファターゼ、および０．０５Ｕ／ｍＬのＦｕｃＴ−ＶおよびＦｕｃＴ−ＶＩのいずれかと共に３２℃にてインキュベートした。一晩のインキュベーション後、組込まれたフコースを、上述のように概算した。
【０１５０】
（２．２結果）
タンパク質中に組込まれたＧＤＰ−フコースのモル画分は、ＦＴＶについて０．０１６、そしてＦＴＶＩについて０．１３であった。従って、ＦＴＶと比較して、ＦＴＶＩを用いておよそ８倍以上のフコースが組込まれた。
【０１５１】
（実施例３）
実施例３は、フコシル化のための基質としてタンパク質ＲｓＣＤ４を用いる、本発明の例示的なフコシル化プロセスを示す。このフコシル化工程は、シアリル化工程の前に行なわれる。
【０１５２】
（３．１ＲｓＣＤ４のシアリル化）
ＲｓＣＤ４（２．５ｍｇ／ｍＬ）を、２５ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ_３中に溶解させ、そして５ｍＭＣＭＰＳＡおよび０．１Ｕ／ｍＬＳＴ３Ｇａｌ３と共に２日間、３２℃にてインキュベートした。ＣＭＰＳＡを除去するための透析後、アリコートを、ＧＬＹＣＯプロトコルに従いＦＡＣＥによるＮ−グリカンプロファイリングに供した。
【０１５３】
（３．２シアリル化の結果）
シアリル化反応の結果を図４に示す。図４において、ネイティブの物質は、０、１、または２つのシアル酸を有し、コアフコースを有する二触角グリカンおよび有さない二触角グリカンに対応する種々の糖形態を含む。シアリル化後、優性のバンドはＤＰ６．２に存在し、これは、コアがフコシル化、ジシアリル化された二触角グリカンに対応する。より下のバンド（ＤＰ約５．９）は、コアがフコシル化されていない、ジシアリル化された二触角グリカンである。
【０１５４】
（３．３シアリル化産物のフコシル化）
実施例３．１由来のシアリル化ｒｓＣＤ４（２ｍｇ／ｍＬ）を０．０５％ＮａＮ_３を含む０．１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）中で透析した。得られた溶液を５ｍＭＧＤＰ−フコース、５ｍＭＭｎＣｌ_２、および０．０４Ｕ／ｍＬのＦＴＶＩと共に２日間、３２℃にてインキュベートした。ＧＤＰ−フコースを除去するための透析後、アリコートを、ＧＬＹＣＯプロトコルに従いＦＡＣＥによるＮ−グリカンプロファイリングに供した。
【０１５５】
（３．４結果）
実施例３．３由来の生成物のＦＡＣＥゲルを図５に提供する。図５において、ＤＰ５．９および６．２での二重のバンドは、ＦｕｃＴ−ＶＩを用いたフコシル化後に、６．８２および７．１５の二重のバンドにシフトした。
【０１５６】
（実施例４）
実施例４は、特定の糖タンパク質に作用するフコシルトランスフェラーゼの能力を決定するための例示的なアッセイを示す。
【０１５７】
適切な緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓで緩衝化された生理食塩水、ｐＨ７．２）中の標的糖タンパク質（１〜５ｍｇ／ｍＬ）を、５ｍＭＣＭＰＳＡおよびＳＴ３Ｇａｌ３（０．０２Ｕ／ｍｇ糖タンパク質）と共に、３２℃にて１日間インキュベートし、潜在的なアクセプター部位を完全にシアリル化した。次いで、ＧＤＰ−フコースを５ｍＭまで、ＭｎＣｌ_２を５ｍＭまで添加し、そして追跡量の放射標識ＧＤＰ−フコースと共に適切なフコシルトランスフェラーゼ（０．０２Ｕ／ｍｇ糖タンパク質）を添加した。２４時間後、タンパク質に組込まれた放射標識フコースの量を、４５％ＭｅＯＨ、０．１％ＴＦＡ中のＴｏｓｏＨａａｓＧ２０００ＳＷｘｌカラムでのゲル濾過により、組込まれていない標識から組込まれた標識を分離した。放射活性を、インラインシンチレーションディテクターを用いて定量するか、または画分を回収し、シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）を添加し、そしてシンチレーションカウンターを用いて定量した。次いで、組込まれた標識（タンパク質／総ｃｐｍに関連するｃｐｍ）の画分を、各フコシルトランスフェラーゼについて算出した。
【０１５８】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示のみの目的のためであって、それらに照らして種々の改変または変更が当業者に示唆され、そしてそれらが本明細書の意図および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることが理解される。本明細書中で列挙される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために本明細書により参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、例示的なＯ結合型セレクチンリガンドの構造を示す。
【図２】
図２は、例示的なＮ結合型セレクチンリガンドの構造を示す。
【図３】
図３は、本発明の方法によって調製された糖ペプチドから放出されたＮ−グリカンのＦＡＣＥ分析によって生成されたプロフィールである。
【図４】
図４は、本発明の方法によってフコシル化の前に実施されるシアリル化反応のＦＡＣＥ分析である。
【図５】
図５は、本発明の方法によってフコシル化された糖ペプチドのＦＡＣＥ分析である。

Claims

第１フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分を含むグリコペプチドのグリコシル化パターンを改変するための方法であって、該方法は、以下：
フコースのドナー部分から該アクセプター部分に該フコースを移動するのに適切な条件下で、該フコースのドナー部分と該第１フコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物と該グリコペプチドとを接触させ、その結果、該グリコペプチドが、実質的に均一なフコシル化パターンを有する、工程、
を包含する、方法。
請求項１に記載の方法であって、前記グリコペプチドは、第２フコシルトランスフェラーゼに対する第２のアクセプター部分を含み、該方法は、以下：
前記フコースのドナー部分から該アクセプター部分に該フコースを移動するのに適切な条件下で、フコースのドナー部分と該第２フコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物と該グリコペプチドとを接触させ、その結果、該グリコペプチドが、実質的に均一なフコシル化パターンを有する、工程、
をさらに包含する、方法。
請求項２に記載の方法であって、前記グリコタンパク質が、前記第１フコシルトランスフェラーゼと前記第２フコシルトランスフェラーゼとに同時に接触される、方法。
請求項２に記載の方法であって、前記グリコタンパク質が、前記第１フコシルトランスフェラーゼと前記第２フコシルトランスフェラーゼとに、該第１フコシルトランスフェラーゼとの接触から得られた産物を単離することなく、連続的に接触される、方法。
請求項１に記載の方法であって、前記第１フコシルトランスフェラーゼが、ＦｕｃＴ−ＩＶ、ＦｕｃＴ−ＶＩ、ＦｕｃＴ−ＶＩＩおよびそれらの組み合わせから選択されるメンバーである、方法。
請求項２に記載の方法であって、前記第２フコシルトランスフェラーゼが、ＦｕｃＴ−ＩＶ、ＦｕｃＴ−ＶＩ、ＦｕｃＴ−ＶＩＩおよびそれらの組み合わせから選択されるメンバーである、方法。
前記フコシルトランスフェラーゼが細菌である、請求項１に記載の方法。
前記フコシルトランスフェラーゼが組換えにより産生される、請求項１に記載の方法。
前記フコシルトランスフェラーゼが、膜付着ドメインを欠く、請求項１に記載の方法。
前記グリコペプチド上の前記アクセプター部分の少なくとも約８０％がフコシル化されている、請求項１に記載の方法。
前記グリコペプチドが固体支持体上に可逆的に固定されている、請求項１に記載の方法。
前記固体支持体がアフィニティークロマトグラフィーの媒体である、請求項１に記載の方法。
前記グリコペプチドが全長グリコペプチドである、請求項１に記載の方法。
前記グリコペプチドが、前記全長グリコペプチドの活性部位を含む、全長グリコペプチドのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
前記グリコペプチドがＩｇＧキメラである、請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法であって、前記グリコペプチドが、ホルモン、成長因子、酵素、酵素インヒビター、サイトカイン、レセプター、リガンド、またはモノクローナル抗体である、方法。
前記グリコペプチドが細胞上にある、請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法であって、前記アクセプター部分は、Ｇａｌβ１−ＯＲ、Ｇａｌβ１，３／４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３／４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲを含み、ここで、Ｒは、アミノ酸、糖、オリゴ糖または少なくとも１種の炭素原子を有するアグリコン基であり、かつグリコペプチドに連結されるか、もしくはその一部である、方法。
前記フコースドナー部分がＧＤＰフコースである、請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法であって、工程（ａ）の前に、フコシルトランスフェラーゼ以外のグルコシルトランスフェラーゼおよびフコースドナー部分以外のドナー部分と前記グリコタンパク質とを接触させ、これにより、フコース単位以外のグリコシル部分を有するグリコタンパク質をグリコシル化する工程、をさらに包含する、方法。
請求項２０に記載の方法であって、前記フコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーである、方法。
請求項１に記載の方法に従ってフコシル化されたグリコペプチドを含む、組成物。
前記グリコペプチド上の前記アクセプター部分の少なくとも８０％が、フコシル化されている、請求項２２に記載の組成物。
前記グリコペプチドが固体支持体に付着されている、請求項２２に記載の組成物。
前記固体支持体がアフィニティークロマトグラフィーの媒体である、請求項２４に記載の組成物。
前記グリコペプチドが全長グリコペプチドである、請求項２２に記載の組成物。
請求項２２に記載の組成物であって、前記グリコペプチドは、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１−ＯＲ、Ｇａｌβ１，３／４（Ｆｕｃα１，４／３）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３／４（Ｆｕｃα１，３／４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３／４（Ｆｕｃα１，４／３）ＧｌｃＮＡｃβ−ＯＲを含み、ここで、Ｒは、アミノ酸、糖、オリゴ糖または少なくとも１種の炭素原子を有するアグリコン基であり、かつグリコペプチドに連結されるか、もしくはその一部である、組成物。
請求項２２に記載の組成物であって、前記グリコペプチドは、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３／４（Ｆｕｃα１，３／４）ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲを含み、ここで、Ｒは、アミノ酸、糖、オリゴ糖または少なくとも１種の炭素原子を有するアグリコン基であり、かつグリコペプチドに連結されるか、もしくはその一部である、組成物。
請求項２２に記載の組成物であって、前記グリコペプチドが、ホルモン、成長因子、酵素、酵素インヒビター、サイトカイン、レセプター、リガンド、またはモノクローナル抗体である、組成物。
前記グリコペプチドが細胞上にある、請求項２２に記載の組成物。
公知のフコシル化パターンを有するフコシル化されたグリコペプチドと実質的に同一である、フコシル化パターンを有する組換えグリコペプチド産生する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該組換えグリコペプチド上において、フコースのドナー部分からアクセプター部分にフコースを移動するのに適切な条件下で、該フコースのドナー部分とフコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物と該組換えグリコペプチドとを接触させ、それにより、フコシル化された組換えグリコペプチドを産生する、工程；および
（ｂ）該既知のフコシル化パターンと実質的に同一の該フコシル化パターンが得られる場合に、該フコースのアクセプターへの該フコースの移動を終結させる、工程、
を包含する、方法。
請求項３１に記載の方法であって、該方法は、以下：
（ｃ）前記フコシル化された組換えグリコペプチドのフコシル化パターンをアッセイし、これにより、該フコシル化パターンが該既知のフコシル化パターンと実質的に同一であるか否かを決定する、工程、
をさらに包含する、方法。
請求項３１に記載の方法であって、前記終結させる工程は、前記反応混合物中において、前記フコシルトランスフェラーゼ、前記フコースのドナー部分、キレート剤でクエンチする該フコースのアクセプターおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、メンバーを使用尽くしたことに起因する、方法。
請求項３１に記載の方法であって、前記グリコペプチドが、第２フコシルトランスフェラーゼに対する第２アクセプター部分を含み、そして該方法は、前記フコースのドナー部分から該第２のアクセプター部分にフコースを移動するのに適切な条件下で、該フコースのドナー部分と該第２フコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物と該グリコペプチドとを接触させる工程、
をさらに包含する、方法。
請求項３４に記載の方法であって、前記グリコタンパク質が、前記第１フコシルトランスフェラーゼと前記第２フコシルトランスフェラーゼとに同時に接触される、方法。
請求項３４に記載の方法であって、前記グリコタンパク質が、前記第１フコシルトランスフェラーゼと前記第２フコシルトランスフェラーゼとに、該第１フコシルトランスフェラーゼとの接触から得られた産物を単離することなく、連続的に接触される、方法。
請求項３１に記載の方法であって、前記第１フコシルトランスフェラーゼが、ＦｕｃＴ−ＩＶ、ＦｕｃＴ−ＶＩ、ＦｕｃＴ−ＶＩＩおよびそれらの組み合わせから選択されるメンバーである、方法。
請求項３４に記載の方法であって、前記第２フコシルトランスフェラーゼが、ＦｕｃＴ−ＩＶ、ＦｕｃＴ−ＶＩ、ＦｕｃＴ−ＶＩＩおよびそれらの組み合わせから選択されるメンバーである、方法。
前記フコシルトランスフェラーゼが細菌である、請求項３１に記載の方法。
前記フコシルトランスフェラーゼが組換えにより産生される、請求項３１に記載の方法。
前記フコシルトランスフェラーゼが、膜付着ドメインを欠く、請求項３１に記載の方法。
前記グリコペプチド上の前記アクセプター部分の少なくとも約８０％がフコシル化されている、請求項３１に記載の方法。
前記グリコペプチドが固体支持体上に可逆的に固定されている、請求項３１に記載の方法。
前記固体支持体がアフィニティークロマトグラフィーの媒体である、請求項３１に記載の方法。
前記グリコペプチドが全長グリコペプチドである、請求項３１に記載の方法。
前記グリコペプチドが、前記全長グリコペプチドの活性部位を含む、全長グリコペプチドのフラグメントである、請求項３１に記載の方法。
前記グリコペプチドがＩｇＧキメラである、請求項３１に記載の方法。
請求項３１に記載の方法であって、前記グリコペプチドが、ホルモン、成長因子、酵素、酵素インヒビター、サイトカイン、レセプター、リガンド、またはモノクローナル抗体である、方法。
前記グリコペプチドが細胞上にある、請求項３１に記載の方法。
請求項３１に記載の方法であって、前記アクセプター部分は、Ｇａｌβ１−ＯＲ、Ｇａｌβ１，３／４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲ、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３／４ＧｌｃＮＡｃ−ＯＲを含み、ここで、Ｒは、アミノ酸、糖、オリゴ糖または少なくとも１種の炭素原子を有するアグリコン基であり、かつグリコペプチドに連結されるか、もしくはその一部である、方法。
前記フコースドナー部分がＧＤＰフコースである、請求項３１に記載の方法。
請求項３１に記載の方法であって、工程（ａ）の前に、フコシルトランスフェラーゼ以外のグルコシルトランスフェラーゼおよびフコースドナー部分以外のドナー部分と前記グリコタンパク質とを接触させ、これにより、フコース単位以外のグリコシル部分を有するグリコタンパク質をグリコシル化する工程、をさらに包含する、方法。
請求項５２に記載の方法であって、前記グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーである、方法。
第１フコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分を含むグリコペプチドのグリコシル化パターンを改変するための大規模な方法であって、該方法は、以下：
フコースのドナー部分から該アクセプター部分にフコースを移動するのに適切な条件下で、該フコースのドナー部分と該第１フコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物と少なくとも約５００ｍｇのグリコペプチドとを接触させ、その結果、該グリコペプチドが、実質的に均一なフコシル化パターンを有する、工程、
を包含する、方法。
既知のフコシル化パターンを有するフコシル化されたグリコペプチドと実質的に同一である、フコシル化パターンを有する組換えグリコペプチド産生する大規模な方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該組換えグリコペプチド上において、フコースのドナー部分からアクセプター部分にフコースを移動するのに適切な条件下で、該フコースのドナー部分とフコシルトランスフェラーゼとを含む反応混合物と少なくとも５００ｍｇの組換えグリコペプチドとを接触させ、それにより、フコシル化された組換えグリコペプチドを産生する、工程；および
（ｂ）該既知のフコシル化パターンと実質的に同一の該フコシル化パターンが得られる場合に、該フコースのアクセプターへの該フコースの移動を終結させる、工程、
を包含する、方法。