KR101376028B1 - 대두 트랜스제닉 사건 ｍｏｎ 87708 및 그의 사용 방법 - Google Patents

대두 트랜스제닉 사건 ｍｏｎ 87708 및 그의 사용 방법

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Abstract

본 발명은 트랜스제닉 대두 사건 MON 87708 식물 및 식물, 식물 세포, 종자, 식물의 일부분, 및 사건 MON 87708로부터 유도된 제품을 제공한다. 본 발명은 또한 사건 MON 87708에 대해 특이적인 폴리뉴클레오티드 및 사건 MON 87708에 대해 특이적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물, 식물 세포, 종자, 식물의 일부분 및 제품을 제공한다. 본 발명은 또한 사건 MON 87708에 관련된 방법을 제공한다.

Description

대두 트랜스제닉 사건 ＭＯＮ 87708 및 그의 사용 방법 {SOYBEAN TRANSGENIC EVENT MON 87708 AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2009년 9월 17일에 제출된 미국 가출원 제61/243,227호에 대한 이득을 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열목록의 삽입
19.5 킬로바이트 (마이크로소프트 윈도우 (Microsoft Windows)(등록상표)에서 측정된 크기)이고, 2010년 8월 13일에 제작된 파일명 "55544-0001_seqlisting.txt"에 함유된 서열 목록을 전자 제출에 의해 본원에 제출하였으며, 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 트랜스제닉 글라이신 맥스 (Glycine max) 사건 MON 87708에 관한 것이다. 사건은 디캄바 제초제에 내성을 나타낸다. 본 발명은 또한 사건 MON 87708에 관련된 식물, 식물의 일부분, 식물 종자, 식물 세포, 농산물 및 방법에 관련되며, 사건에 대해 특유하고, 글라이신 맥스 식물의 게놈에의 트랜스제닉 DNA의 삽입에 관련되어 생성된 뉴클레오티드 분자를 제공한다.
발명의 배경
대두 (글라이신 맥스)는 세계의 많은 지역에서 중요한 작물이고, 이 작물에 원하는 특성을 갖는 대두를 생산하기 위해 생명공학 방법이 적용되어 왔다. 하나의 상기 원하는 특성은 제초제 내성이다. 식물에서의 제초제 내성 전이유전자 (transgene)의 발현은 식물에 대한 제초제 내성의 원하는 특성을 부여할 수 있지만, 전이유전자의 발현은 전이유전자 삽입의 염색체 상의 위치 및 게놈 결과에 의해 영향받을 수 있다. 예를 들면, 식물에서 발현 전이유전자의 염색체 상의 삽입 부위가 상이하지만, 그 외에는 동일한 개별 사건 사이에서 종종 전이유전자의 수준 및 패턴의 변형이 있다는 것이 관찰되었다. 또한 사건 사이에 바람직하지 않고/않거나 바람직한 표현형 또는 농경학적 차이가 있을 수 있다. 이것 때문에, 종종 상업적 목적을 위해 적합하게 만들기 위해 필요한 원하는 특성, 및 최적의 표현형 및 농업적 특징 모두를 갖는 사건을 선택하기 위해 다수의 개별 식물 형질전환 사건을 생성하고 분석하는 것이 필요하다. 이러한 선택은 종종 의미있는 양의 농경학적, 표현형적 및 분자적 데이터가 수집될 수 있도록 수년에 걸쳐, 다수의 지역에서, 및 다양한 조건하의 여러 사건으로의 온실 및 경작지 시험을 요구한다. 생성된 데이터 및 관찰은 이어서 상업적으로 적합한 사건을 선택하는 목표로 과학자 및 농경학자의 팀에 의해 분석되어야 한다. 이러한 사건은 선택된 후, 이어서 원하는 특성을 식물 육종 방법을 사용하여 다른 유전적 배경으로 침투하기 위해 사용될 수 있으며, 따라서 원하는 특성을 함유하는 다수의 상이한 작물 품종을 생성하고, 특정 지역의 성장 환경에 대해 적합하게 개질된다.
발명의 요약
본 발명은 디캄바 제초제의 적용에 대해 상업적으로 허용되는 내성을 나타내고, 대표적인 종자가 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American 유형 Culture Collection, ATCC)에 등록 번호 PTA-9670로 기탁된 트랜스제닉 대두 식물 지정된 사건 MON 87708을 제공한다. 본 발명은 또한 대두 사건 MON 87708에 관련된 신규한 DNA 분자 및 이들 분자의 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 대두 사건 MON 87708의 종자, 자손, 식물의 일부분, 세포 및 제품을 제공한다. 본 발명은 또한 대두 사건 MON 87708의 사용 방법 및 디캄바 내성 대두의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 대두 사건 MON 87708에 관련된 재조합 DNA 분자를 제공한다. 이들 재조합 DNA 분자는 전이유전자 삽입의 측면에 위치한 게놈 DNA의 영역을 나타내는 뉴클레오티드 서열 및/또는 전이유전자 삽입의 영역, 및/또는 임의의 이들 영역의 인접 서열, 예를 들면 대두 사건 MON 87708의 전이유전자 삽입 및 측면에 위치한 게놈 DNA 사이의 접합부의 영역을 갖는 뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 대두 사건 MON 87708에 대해 진단적인 프라이머 및 프로브로서 유용한 DNA 분자 및 대두 사건 MON 87708의 존재에 대해 진단적인 앰플리콘을 제공한다. 이들 분자를 포함하는 대두 식물, 식물 세포, 식물의 일부분, 제품, 자손 및 종자는 또한 개시되었다.
본 발명은 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 DNA의 존재 및/또는 부재, 및 따라서 사건의 존재 및/또는 부재를 검출하는데 유용한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 본 발명은 DNA를 포함하는 샘플을 대두 사건 MON 87708로부터의 게놈 DNA와 핵산 증폭 반응에서 사용된 경우 대두 사건 MON 87708에 대해 진단적인 증폭된 DNA를 생성하는 프라이머 세트와 접촉시키고, 핵산 증폭 반응의 수행에 따른 증폭된 DNA를 생성하고, 증폭된 DNA의 존재 및/또는 부재를 검출함으로써 MON 87708의 검출 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 DNA를 포함하는 샘플을 대두 사건 MON 87708로부터의 DNA와 혼성화 반응에서 사용된 경우 대두 사건 MON 87708에 대해 특이적인 DNA 분자에 혼성화하는 프로브와 접촉시키고, 혼성화 반응을 수행하고, DNA 분자에의 프로브의 혼성화를 검출함으로써 MON 87708의 검출 방법을 제공한다. 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 DNA의 존재를 검출하는데 유용한 본 발명의 방법 및 조성물을 포함하는 키트가 또한 제공된다.
본 발명은 대두 사건 MON 87708의 식물, 식물 세포 또는 종자로부터 유도된 대두 식물, 종자, 식물 세포, 자손 식물, 식물의 일부분 또는 제품을 제공한다. 본 발명은 또한 서열 1-8 및 그의 상보적인 서열 및 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 DNA 분자를 포함하는 대두 식물, 종자, 식물 세포, 자손 식물, 식물의 일부분 또는 제품을 제공한다. 본 발명은 또한 대두 사건 MON 87708의 식물 또는 종자로부터 유도되고, DNA 증폭 방법에서 서열 1, 서열 2, 서열 7 및/또는 서열 8을 포함하는 증폭된 DNA 분자를 생성하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 대두 식물, 종자, 식물 세포, 자손 식물, 식물의 일부분 또는 제품을 제공한다.
본 발명은 대두 사건 MON 87708을 심고, 이어서 대두 사건 MON 87708 식물에 해를 입히지 않으면서 잡초를 조절할 수 있는 유효 용량의 디캄바 제초제를 적용함으로써 경작지에서 잡초를 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 경작지에서 잡초를 조절하기 위해 유효 용량의 디캄바 제초제를 적용하고, 이어서 경작지에서 대두 사건 MON 87708을 심음으로써 경작지에서 잡초를 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 경작지에서 디캄바 내성 대두 품종 MON 87708의 종자를 심고, 독성 잡초 종을 사멸시키기에 충분한 발아후 유효 용량의 디캄바 제초제를 경작지에 적용하고, 경작지로부터 종자를 수확함으로써 독성 잡초 종의 종자가 본질적으로 없는 대두 종자의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 서열 1, 서열 2, 서열 7 및/또는 서열 8을 포함하는 대두 사건 MON 87708 식물을 제2 대두 식물과 유성 교배시키고, 따라서 종자를 생성하고, 자손 식물을 생성하기 위해 종자를 성장시키고, 디캄바로 자손 식물을 처리하고, 디캄바에 내성인 자손 식물을 선택함으로써 디캄바 제초제의 적용에 내성이 있는 대두 식물 및/또는 종자의 생산 방법을 제공한다. 방법은 또한 복수의 제2 세대 자손 식물을 생성하기 위해 선택된 자손 식물을 자가수정하고, 이들로부터 디캄바 내성 식물을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 또한 종자를 생성하기 위해 선택된 자손 식물을 또다른 대두 식물과 유성 교배시키고, 제2 세대 자손 식물을 생성하기 위해 종자를 성장시키고, 제2 세대 자손 식물을 디캄바로 처리하고, 디캄바에 내성인 제2 세대 자손 식물을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 서열 1, 서열 2, 서열 7 및/또는 서열 8을 포함하는 디캄바 내성 대두 사건 MON 87708 식물을 자가수정하고, 따라서 종자를 생성하고, 자손 식물을 생성하기 위해 종자를 성장시키고, 자손 식물을 디캄바로 처리하고, 디캄바에 내성인 자손 식물을 선택함으로써 디캄바 제초제의 적용에 내성이 있는 대두 식물 및/또는 종자의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 서열 12, 서열 13 및 서열 14를 포함하는 프라이머 세트 및 서열 15 및 서열 16을 포함하는 프로브 세트와, 대두 DNA 샘플을 접촉시키는 단계; 이어서 샘플, 프라이머 세트 및 프로브 세트로 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계; 이어서 핵산 증폭 반응에서, 사건 MON 87708에 대해 진단적인 제1 형광 신호 및 제1 형광 신호와 상이하며 사건 MON 87708 전이유전자의 삽입 위치에 상응하는 천연 대두 게놈 DNA에 대해 진단적인 제2 형광 신호를 검출하는 단계; 및 상기 핵산 증폭 반응에서의 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호의 존재 및/또는 부재를 분석하는 단계를 포함하며, 여기서 두 형광 신호 모두의 존재는 샘플이 사건 MON 87708에 대해 이형접합인 것을 나타내고, 제1 형광 신호 만의 존재는 샘플이 사건 MON 87708에 대해 동형접합인 것을 나타내는 것인, 대두 사건 MON 87708 식물 또는 종자의 접합성을 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 디캄바 내성 유전자를 포함하며 일배체형 윈도우 (haplotype window) 19743 및 19767에 의해 추가로 정의된, 대략 지도 위치 (map position) 143.5에서의 연결 그룹 9 상의 대두 일배체형 영역을 포함하는 대두 식물, 종자, 식물 세포 또는 식물의 일부분, 및 이의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 언급된 내용 및 다른 측면은 하기 상세한 설명으로부터 더 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 대두 사건 MON 87708의 게놈에서의 트랜스제닉 삽입의 조직을 나타내고; [A]는 대두 게놈 DNA 및 전이유전자 삽입 DNA의 5' 부분 사이의 접합부의 60 뉴클레오티드인 서열 1의 상대적 위치에 상응하고; [A']은 대두 게놈 DNA 및 전이유전자 삽입 DNA의 5' 부분 사이의 접합부의 100 뉴클레오티드인 서열 7의 상대적 위치에 상응하고; [B]는 대두 게놈 DNA 및 전이유전자 삽입 DNA의 3' 부분 사이의 접합부의 60 뉴클레오티드인 서열 2의 상대적 위치에 상응하고; [B']은 대두 게놈 DNA 및 전이유전자 삽입 DNA의 3' 부분 사이의 접합부의 100 뉴클레오티드인 서열 8의 상대적 위치에 상응하고; [C]는 사건 MON 87708에서의 게놈에 통합된 발현 카세트의 임의로 배치/지정된 5' 말단의 측면에 위치한 대두 게놈 서열인 서열 3의 상대적 위치에 상응하고; [D]는 사건 MON 87708에서의 게놈에 통합된 발현 카세트의 임의로 배치/지정된 3' 말단의 측면에 위치한 대두 게놈 서열인 서열 4의 상대적 위치에 상응하고; [E]는 서열 5를 포함하는 다양한 요소를 나타내며, 사건 MON 87708의 게놈에 삽입된 발현 카세트의 서열이고; [F]는 이들 서열이 사건 MON 87708에서의 게놈에 존재하는 바와 같이, 좌측에서 우측으로 도면에 나타낸 바와 같이, 서열 1, 서열 2, 서열 7 및 서열 8이 포함된 서열 3, 서열 5 및 서열 4를 포함하는 인접 서열 (서열 6으로서 제공됨)을 나타낸다.
서열의 간단한 설명
서열 1은 대두 게놈 DNA 및 통합된 트랜스제닉 발현 카세트 사이의 5' 접합부를 나타내는 60 뉴클레오티드 서열이다. 서열 1은 뉴클레오티드 위치 1097-1156에서의 서열 6에 위치한다.
서열 2는 대두 게놈 DNA 및 통합된 트랜스제닉 발현 카세트 사이의 3' 접합부를 나타내는 60 뉴클레오티드 서열이다. 서열 2는 뉴클레오티드 위치 4100-4159에서의 서열 6에 위치한다.
서열 3은 전이유전자 DNA 삽입의 영역 이하 및 이를 포함하는 대두 사건 MON 87708의 삽입된 DNA의 측면에 위치한 5' 서열이다.
서열 4는 전이유전자 DNA 삽입의 영역 이하 및 이를 포함하는 대두 사건 MON 87708의 삽입된 DNA의 측면에 위치한 3' 서열이다.
서열 5는 통합된 트랜스제닉 발현 카세트의 서열이다.
서열 6은 대두 사건 MON 87708의 삽입된 DNA의 측면에 위치한 5' 서열의 인접 서열 (서열 3), 삽입된 DNA의 서열 (서열 5), 및 대두 사건 MON 87708의 삽입된 DNA의 측면에 위치한 3' 서열 (서열 4)을 나타내는 뉴클레오티드 서열이고, 서열 1, 서열 2, 서열 7 및 서열 8을 포함한다.
서열 7은 대두 게놈 DNA 및 통합된 트랜스제닉 발현 카세트 사이의 5' 접합부를 나타내는 100 뉴클레오티드 서열이다.
서열 8은 대두 게놈 DNA 및 통합된 트랜스제닉 발현 카세트 사이의 3' 접합부를 나타내는 100 뉴클레오티드 서열이다.
서열 9는 프라이머 SQ13570으로 지칭되며 대두 사건 MON 87708을 확인하기 위해 사용된 프라이머의 서열이다. 이는 3' 전이유전자 삽입 경계에 근접한 영역에서의 삽입된 발현 카세트에 상보적이다. 프라이머 SQ13570 및 SQ13571 (서열 10)의 조합을 사용하여 타크맨 (TAQMAN)(등록상표) (피이 어플라이드 바이오시스템즈 (PE Applied Biosystems), 포스터 시티, 캘리포니아 (Foster City, CA)) 검정으로부터 생성된 PCR 앰플리콘은 사건 MON 87708의 존재에 대한 양성 결과이다.
서열 10은 프라이머 SQ13571로 지칭되며 대두 사건 MON 87708을 확인하기 위해 사용된 프라이머의 서열이다. 이는 삽입된 발현 카세트의 측면에 위치한 3' 영역에 상보적이며 전이유전자 DNA 삽입 경계에 근접하다. 프라이머 SQ13570 (서열 9) 및 SQ13571의 조합을 사용하여 타크맨(등록상표) (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 포스터 시티, 캘리포니아) 검정으로부터 생성된 PCR 앰플리콘은 사건 MON 87708의 존재에 대한 양성 결과이다.
서열 11은 프로브 PB4655로 지칭되며 대두 사건 MON 87708을 확인하기 위해 사용된 프로브의 서열이다. 이는 삽입된 발현 카세트 및 게놈 DNA의 3' 접합부를 포괄하는 영역에 상보적이다. 이 프로브는 6-FAM(상표명)-표지된 합성 올리고뉴클레오티드이다. 프라이머 SQ13570 및 SQ13571 (서열 9-10)을 6-FAM(상표명)-표지된 프로브 PB4655와 조합하여 사용한 증폭 반응에서의 형광 신호의 방출은 타크맨(등록상표) 검정에서의 사건 MON 87708에 대해 진단적이다.
서열 12는 프라이머 SQ20632로 지칭되며 MON 87708 사건 접합성을 확인하기 위해 사용된 프라이머의 서열이다.
서열 13은 프라이머 SQ20636으로 지칭되며 대두 야생형 및 MON 87708 사건 접합성을 확인하기 위해 사용된 프라이머의 서열이다.
서열 14는 프라이머 SQ20637로 지칭되며 대두 야생형 접합성을 확인하기 위해 사용된 프라이머의 서열이다.
서열 15는 프로브 PB10130으로 지칭되며 MON 87708 사건 접합성 검정을 위해 사용된 프로브의 서열이다.
서열 16은 프로브 PB10131로 지칭되며 대두 야생형 접합성 검정을 위해 사용된 프로브의 서열이다.
상세한 설명
이하의 정의 및 방법은 본 발명에 대한 보다 나은 정의를 위해 및 본 발명의 실시에 있어 당업자에게 지침이 되도록 하기 위해 제공되는 것이다. 달리 언급되지 않는 한, 용어들은 관련 업계의 통상의 지식을 가진 자들에 의한 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다.
본 발명은 디캄바의 적용에 대해 상업상 허용되는 내성을 나타내는 트랜스제닉 대두 사건 MON 87708을 제공한다. 상기 사건은 대두의 생식질의 염색체/게놈 내로의 트랜스제닉 DNA의 단일 삽입을 포함한다. "사건"은 (i) 관심 전이유전자를 포함하는 핵산 구조체를 이용하여 식물 세포를 형질전환시키고, (ii) 상기 식물의 게놈 내로 전이유전자가 삽입되어 발생된 식물 집단을 재생성하고, (iii) 전이유전자가 해당 식물 게놈 내의 특정 위치 내로 삽입된 것을 특징으로 하는 특정 식물을 선별함에 의해 생산된다. 용어 "사건"은 식물의 게놈 내의 특정 위치 내로 삽입된 전이유전자를 포함하는 최초의 형질전환체를 지칭한다. 용어 "사건"은 또한 해당 식물의 게놈 내의 특정 위치 내로 삽입된 전이유전자를 포함하는 형질전환체의 자손을 지칭한다. 그러한 자손은 상기 형질전환체, 또는 그의 자손, 및 또 다른 식물 간의 이종 교배에 의해 생산된 것일 수 있다. 상기 다른 식물은 동일 또는 상이한 전이유전자를 포함하는 트랜스제닉 식물 및/또는 비-트랜스제닉 식물, 예컨대 상이한 품종의 식물일 수 있다. 반복친 (recurrent parent)에 대한 여러 번의 역교배 (back-crossing) 후에도, 형질전환된 부모로부터의 삽입된 DNA 및 측면에 위치한 DNA는 교배 자손 내에서 동일한 게놈 상의 위치에 존재한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대두"는 글라이신 맥스 (Glycine max)를 의미하며, 야생 대두 종 및 종 간의 생식을 허용하는 글라이신에 속하는 식물을 포함한, 대두와 생식할 수 있는 모든 식물 품종을 포함한다.
용어 "사건"은 또한 삽입된 DNA 및 삽입된 DNA의 양측에 바로 인접한 측면에 위치한 대두 게놈 DNA를 포함하는 최초의 형질전환체로부터의 DNA 분자를 지칭한다. 이 DNA 분자는 대두 식물의 게놈 내로 트랜스제닉 DNA를 삽입하는 행위, 즉, 형질전환 행위에 의해 생성된다. 따라서, 이 DNA 분자는, 대두 게놈 DNA의 특정 영역의 서열 및 트랜스제닉 DNA 삽입체의 서열을 모두 함유한다는 점에서 트랜스제닉 DNA가 삽입된 대두 식물의 게놈에 특유한 것이면서도 상기 사건에 특이적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 주위의 대두 식물 게놈 DNA와 비교하여 대두 사건 MON 87708에서 삽입된 DNA의 배열은 대두 사건 MON 87708에 특이적이면서도 특유하다. 이 DNA 분자는 또한 사건 MON 87708의 대두의 염색체의 불가분한 부분이며, 그렇기 때문에 대두에서 정적인 상태로 존재하며, 자손 대두에게로 전달될 수 있다.
사건 MON 87708은 대두 식물에의 디캄바 제초제의 적용에 대해 내성을 부여하는 전이유전자를 포함한다. "디캄바"는 3,6-디클로로-2-메톡시벤조산을 지칭한다. 디캄바는 광엽 잡초의 조절을 위해 유용한 합성 옥신 제초제이다. 대두 식물을 일반적으로 토양 근권에서 발견되는 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia)로부터 클로닝한 효소인 디캄바 모노-옥시게나제 (DMO)로 형질전환하였다. 디캄바 모노-옥시게나제는 비제초제 화합물 3,5-디클로로살리실산에의 O-탈메틸화 반응을 통한 디캄바의 불활성화를 촉매하는 효소이다. 세계의 일부 지역에서 독성 잡초 종 종자는 오염된 대두 제품을 먹인 동물의 건강 및 영양에 영향을 줄 수 있는 수확한 대두 종자를 오염시킬 수 있다. 이들 식물은 디캄바 제초제로의 처리에 의해 대두 경작지로부터 제거될 수 있다. 독성 잡초의 이 군의 구성원은 카르다리아 종 (Cardaria spp), 헬리오트로프 종 (Heliotropium spp), 센토레아 종 (Centaurea spp .), 세네시오 종 (Senecio ssp.), 크로탈라리아 종 (Crotalaria spp.), 솔라눔 종 (Solanum spp.), 크잔티움 종 (Xanthium spp .), 암신키아 종 (Amsinckia spp .), 카시아 종 (Cassia spp .), 세스바니아 종 (Sesbania spp .), 다투라 종 (Datura spp .), 리시누스 종 (Ricinus spp .), 아르게몬 종 (Argemone spp .), 코르코러스 종 (Corchorus spp .), 임포모에아 종 (Impomoea spp .) 및 에치움 종 (Echium spp.)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 천연에서는 정상적으로 발견되지 않으며, 따라서 인간의 개입에 의해 생성된 것인 DNA 및/또는 단백질 및/또는 유기체의 형태를 지칭한다. 이러한 인간의 개입은 재조합 DNA 분자 및/또는 재조합 식물을 생산할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "재조합 DNA 분자"는 천연적으로는 함께 발생하지 않으며 인간의 개입의 결과인 DNA 분자의 조합물을 포함하는 DNA 분자, 예를 들면, 서로에 대해 이종인 2개 이상의 DNA 분자의 조합물로 구성된 DNA 분자, 및/또는 천연에서 정상적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 벗어난 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 인공적으로 합성된 DNA 분자, 및/또는 숙주 세포의 게놈 DNA 및 상기 숙주 세포의 게놈의 관련된 측면 위치 DNA 내로 인공적으로 편입된 전이유전자를 포함하는 DNA 분자이다. 재조합 DNA 분자의 예는, 대두 게놈 내로의 전이유전자의 삽입으로부터 생성된 본원에 기재된 DNA 분자로서, 이는 궁극적으로는 상기 유기체에서 재조합 RNA 및/또는 단백질 분자의 발현을 일으킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "재조합 식물"은 인간의 개입의 결과로서 그의 게놈 내로 전이유전자 및/또는 이종 DNA 분자가 편입되어 있는, 천연에서 정상적으로는 존재하지 않는 식물이다. 그러한 게놈상의 변화의 결과로서, 재조합 식물은 관련된 야생형 식물과는 명백히 상이하다. 재조합 식물의 예는 사건 MON 87708로서 본원에 기재된 대두 식물이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전이유전자"는 숙주 세포의 게놈 내로 인공적으로 편입된 뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 그러한 전이유전자는 숙주 세포에 대해 이종일 수 있다. 용어 "트랜스제닉 식물"은 상기와 같은 전이유전자를 포함하는 식물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종"은 천연에서 정상적으로는 제2의 분자와 조합되어 발견되지 않는 제1 분자를 지칭한다. 예를 들면, 분자는 제1의 종으로부터 유도되어 제2의 종의 게놈 내로 삽입될 수 있다. 즉, 이 분자는 숙주에 대해 이종으로서 숙주 세포의 게놈 내로 인공적으로 편입된 것일 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라"는 제1 DNA 분자를 제2 DNA 분자에 융합시켜 생성하며, 여기서 제1 DNA 분자나 제2 DNA 분자 어느 것도 정상적으로는 그러한 형태로, 즉, 서로 융합된 형태로 발견되지 않는, 단일 DNA 분자를 지칭한다. 즉, 키메라 DNA 분자는 다른 방식으로는 천연에서 정상적으로 발견되지 않는 신규한 DNA 분자이다.
본 발명은 DNA 분자 및 그의 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "DNA", "DNA 분자", "뉴클레오티드 분자"는 5' (상류) 말단에서 3' (하류) 말단으로 판독되는, 게놈 또는 합성 기원의 DNA 분자, 즉, 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 폴리뉴클레오티드 분자의 중합체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "DNA 서열", "뉴클레오티드 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드 서열"은 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에서 사용된 명명법은 WIPO 표준 ST.25 (1998)에서의 표, 즉 부록 2, 표 1 및 3에 개시되어 있으며 미국 연방규정집 § 1.822의 표제 37에서 요구하고 있는 명명법이다. 관례적으로, 서열 1-8 및 그의 절편으로서 제공된 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 2개의 상보적인 뉴클레오티드 서열 가닥 중 1개의 가닥만을 참조하여 개시되었다. 함축적으로, 또한 당업계에서 역상보적인 서열로도 지칭되는 상보적인 서열 (즉, 상보적인 가닥의 서열)도 본 발명의 범주 내에 속하며, 청구되는 대상의 범주 내에 분명히 포함시키고자 한다.
삽입된 트랜스제닉 DNA의 완전한 뉴클레오티드 서열 및 삽입된 트랜스제닉 DNA의 양 말단의 측면에 위치한 대두 게놈 DNA의 실질적 절편에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 6으로 제시되어 있다. 이의 하위 부분은 서열 5로 제시된 삽입된 트랜스제닉 DNA이다. 포스포디에스테르 결합에 의해 물리적으로 연결되어, 삽입된 트랜스제닉 DNA의 5' 말단의 측면에 위치하는 대두 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있으며 서열 3에 나타나 있다. 포스포디에스테르 결합에 의해 물리적으로 연결되어, 삽입된 트랜스제닉 DNA의 3' 말단의 측면에 위치하는 대두 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있으며 서열 4에 나타나 있다.
대두 사건 MON 87708은 2개의 영역을 더 포함하는데, 즉, 트랜스제닉 DNA가 삽입된 게놈 DNA의 5' 위치를 포괄하는 서열 및 3' 위치를 포괄하는 서열로서, 본원에서는 각각 5' 및 3' 접합부로 지칭된다. "접합부 서열" 또는 "접합부 영역"은 삽입된 트랜스제닉 DNA 및 인접한 측면 게놈 DNA를 포괄하는 DNA 서열 및/또는 상응하는 DNA 분자를 지칭한다. 접합부 서열은 임의로 서열 1 및 서열 2로서 제공된 2개의 60 뉴클레오티드 서열로 나타낼 수 있으며, 이들 각각은 삽입 DNA의 30 뉴클레오티드에 근접하고 인접한 측면 게놈 DNA의 30개의 뉴클레오티드를 나타낸다. 별법으로, 접합부 서열은 임의로 서열 7 및 서열 8로서 제공된 2개의 100 뉴클레오티드 서열에 의해 나타낼 수 있으며, 이들 각각은 삽입 DNA의 50 뉴클레오티드에 근접하고 인접한 측면 게놈 DNA의 50 뉴클레오티드를 나타낸다. 이들 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 결합으로 연결되어 있으며, 대두 사건 MON 87708에서 게놈의 일부로서 존재한다. 대두에서 대두 식물, 종자 또는 식물의 일부분으로부터 유도된 샘플에서의 하나 이상의 서열 1, 서열 2, 서열 7 및 서열 8의 확인은 DNA가 대두 사건 MON 87708로부터 수득되었다는 것을 결정짓는 것이며, 대두 사건 MON 87708로부터의 DNA의 샘플에서의 존재에 대해 진단적이다. 본 발명은 따라서 적어도 서열 1, 서열 2, 서열 7 및/또는 서열 8에 제시된 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 분자를 제공한다. 서열 1, 서열 2, 서열 7 및/또는 서열 8을 포함하기에 충분한 트랜스제닉 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 DNA의 임의의 절편은 본 발명의 범주 내에 속한다. 또한, 본 단락 내에 기재된 임의의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 범주 내에 속한다. 도 1은 5'에서 3'으로 정렬된 서열 6에 대한 서열 1-5 및 7-8의 물리적 정렬을 나타낸다.
본 발명은 샘플에서 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 DNA의 존재를 진단하기 위한 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있는 예시적인 DNA 분자를 제공한다. 그러한 프라이머 또는 프로브는 표적 핵산 서열에 특이적이며, 따라서 본원에 기재된 본 발명의 방법에 의한 대두 사건 MON 87708 핵산 서열의 확인에 유용하다.
"프라이머"는 전형적으로 열적 증폭을 수반한 특정 어닐링 또는 혼성화 방법에서의 사용을 위해 디자인된 고도로 정제된, 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 열적 증폭, 예를 들면 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에서, 프라이머쌍을 주형 DNA, 예를 들면 대두 게놈 DNA의 샘플과 함께 사용하여 앰플리콘을 생성할 수 있으며, 여기서 상기 반응으로부터 생성된 앰플리콘은 프라이머가 주형에 혼성화된 두 부위 사이에 위치한 주형 DNA의 서열에 상응하는 DNA 서열을 가질 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, "앰플리콘"은 증폭 기술을 사용하여 합성된 DNA의 조각 또는 단편이다. 본 발명의 앰플리콘은 적어도 서열 1, 서열 2 서열 7 및/또는 서열 8을 포함한다. 프라이머는 전형적으로 상보적인 표적 DNA 가닥에 혼성화하여 상기 프라이머와 표적 DNA 가닥 간의 혼성체를 형성하도록 디자인되며, 프라이머의 존재는 중합효소가 상기 표적 DNA 가닥을 주형으로서 사용하여 프라이머의 확장 (즉, 확장 중인 뉴클레오티드 분자 내로의 추가 뉴클레오티드의 중합)을 시작하는, 중합효소의 인식 지점이다. 본 발명에서 사용되는 프라이머쌍은, 전형적으로 열적 증폭 반응 또는 다른 통상의 핵산 증폭 방법에서, 프라이머쌍의 개별 구성원의 결합 표적이 되는 위치 사이의 폴리뉴클레오티드 절편을 선형적으로 증폭시키기 위해 사용되는, 이중 가닥 뉴클레오티드 절편의 반대 가닥에 결합하는 2개의 프라이머를 지칭하는 것으로 의도되었다. 프라이머로서 유용한 예시적인 DNA 분자는 서열 9-10으로 제시되어 있다. 서열 9 및 서열 10으로서 제시된 프라이머쌍은 제1 DNA 분자 및 상기 제1 DNA 분자와 상이한 제2 DNA 분자로서 유용하며, 이들 모두는 각각 열적 증폭 반응에서 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 주형 DNA와 함께 사용될 때, 서열 2를 포함하는 앰플리콘을 생성하는 DNA 프라이머로서 기능하기에 충분한 길이의 서열 4, 서열 5 또는 서열 6 중 하나의 인접한 뉴클레오티드로 이루어져 있다.
"프로브"는 표적 핵산의 가닥에 상보적인 단리된 핵산이다. 본 발명에 따른 프로브는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산뿐 아니라, 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하는 폴리아미드 및 기타 프로브 물질을 포함하며, 그러한 결합의 검출은 특정 샘플에서 상기 표적 DNA 서열의 존재를 진단, 확인, 결정 또는 확인하는데 유용할 수 있다. 프로브는 통상의 검출가능한 표지 또는 리포터 분자, 예를 들면, 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광 시약, 또는 효소에 부착될 수 있다. 프로브로서 유용한 예시적인 DNA 분자는 서열 11로서 제시되어 있다.
본 발명에 따른 프로브 및 프라이머는 표적 서열에 대해 완전한 서열 동일성을 갖는 것일 수 있으나, 표적 서열과 상이하지만 표적 서열에 우선적으로 혼성화하는 능력을 보유한 프라이머 및 프로브도 통상의 방법으로 디자인할 수 있다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로 기능하기 위해서 유일하게 요구되는 것은, 서열이 충분히 상보적이어서 이용되는 특정 용매 및 염 농도 하에서 안정적인 이중-가닥 구조를 형성할 수 있어야 한다는 것이다. 샘플에서 대두 사건 MON 87708로부터의 트랜스제닉 DNA의 존재를 확인하기 위해서는 통상의 임의의 핵산 혼성화 또는 증폭 방법을 이용할 수 있다. 프로브 및 프라이머는 일반적으로 길이가 약 11개 이상의 뉴클레오티드, 약 18개 이상의 뉴클레오티드, 약 24개 이상의 뉴클레오티드, 또는 약 30개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 이상이다. 그러한 프로브 및 프라이머는 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 DNA 서열에 특이적으로 혼성화한다. 통상의 엄격도 조건은 문헌 [Sambrook et al., 1989], 및 [Haymes et al., In: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)]에 기재되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 분자는 역평행의 이중-가닥 핵산 구조를 형성할 수 있다면 서로 특이적으로 혼성화할 수 있다. 핵산 분자 및 또 다른 핵산 분자가 완전한 상보성을 나타내는 경우 상기 핵산 분자는 또다른 핵산 분자의 "상보체"이다. 본원에 사용된 바와 같이, 분자 중 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 분자의 뉴클레오티드에 상보적인 경우 이들 분자는 "완전한 상보성"을 나타낸다. 2개의 분자가 적어도 통상의 "저-엄격도" 조건 하에서 충분한 안정성으로 서로에 혼성화하여 서로에 어닐링(annealing)한 상태를 유지할 수 있는 경우 이들은 "최소한도로 상보적"이다. 유사하게, 분자들이 통상의 "고-엄격도" 조건 하에서 충분한 안정성으로 서로에 혼성화하여 서로에 어닐링(annealing)한 상태를 유지할 수 있는 경우 이들은 "상보적"이다. 따라서, 이중-가닥 구조를 형성하는 분자의 능력을 완전히 제한하는 것이 아닌 한, 완전한 상보성에서 벗어나는 것은 허용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"이란 어떤 분자가 그의 본래적 상태 또는 천연 상태에서 정상적으로는 결합되어 있는 다른 분자로부터 적어도 부분적으로 분리되는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 용어 "단리됨"은 DNA 분자가 그의 본래적 상태 또는 천연 상태에서 정상적으로는 그의 측면에 위치해 있는 핵산으로부터 적어도 부분적으로 분리되는 것을 지칭한다. 따라서, 정상적으로는 결합되어 있지 않은 조절 서열 또는 코딩 서열에 (예를 들면 재조합 기술의 결과로서) 융합된 DNA 분자는 본원에서 단리된 것으로 간주된다. 그러한 분자는 숙주 세포의 염색체 내로 통합되거나 또는 다른 DNA 분자를 함유한 핵산 용액 중에 존재할 때도 단리된 것으로 간주된다.
본 발명에 개시된 DNA 분자, 또는 그의 단편을 단리 및 조작하기 위해서 당업자에 익히 공지된 임의 수의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, PCR (중합효소 쇄 반응) 기술을 사용하여, 특정 출발 DNA 분자를 증폭하고/하거나 본래의 분자의 변이체를 생성할 수 있다. DNA 분자, 또는 그의 단편은 또한 다른 기술에 의해, 예를 들면 화학적 수단에 의한 단편의 직접 합성으로 수득할 수 있으며, 이는 통상은 자동화 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 실시된다.
따라서, 본원에 제시된 DNA 분자 및 상응하는 뉴클레오티드 서열은 무엇보다도 대두 사건 MON 87708의 확인, 대두 사건 MON 87708 식물 품종 또는 혼성체의 선별, 샘플에서 트랜스제닉 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 DNA의 존재의 검출, 및 대두 사건 MON 87708 또는 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 식물의 일부분의 존재 및/또는 부재를 판별하기 위한 샘플의 모니터링에 유용하다.
본 발명은 대두 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 식물의 일부분 (예를 들면, 화분, 배주, 꼬투리, 꽃 조직, 뿌리 조직, 줄기 조직 및 잎 조직), 및 제품을 제공한다. 이들 대두 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 식물의 일부분, 및 제품은 검출가능한 양의 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 즉, 예를 들면 서열 1-8로 제시된 서열 중 하나 이상을 갖는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 본 발명의 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 및 식물의 일부분은 또한 하나 이상의 추가적인 전이유전자를 함유할 수도 있다. 그러한 전이유전자는, 이들로 한정되지는 않지만 내충성의 증가, 용수 효율 증가, 수확량 증가, 내건성 증가, 종자 품질 증가, 영양 품질 향상, 및/또는 제초제 내성 증가를 비롯한 바람직한 속성을 부여하는 단백질 또는 RNA 분자를 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 여기서 상기 바람직한 속성은 그러한 추가의 전이유전자를 결여한 대두 식물과 비교하여 측정된다.
본 발명은 트랜스제닉 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 대두 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 및 식물의 일부분, 예를 들면 화분, 배주, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 및 잎을 제공한다. 본 발명을 유효하게 하기 위해 대두 사건 MON 87708 종자의 대표적인 샘플을 부다페스트 조약에 따라 기탁하였다. 상기 기탁물의 수령을 위해 선택된 기탁기관은 우편번호 20110 미국 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801에 주소를 가진 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)이다. 상기 ATCC 기탁기관은 사건 MON 87708 종자에 대해 등록 번호 PTA-9670을 배정하였다.
본 발명은 그의 게놈 내에 서열 1 및 서열 2를 가진 DNA 분자를 포함하는 미생물을 제공한다. 그러한 미생물의 예는 트랜스제닉 식물 세포이다. 미생물, 예를 들면 본 발명의 식물 세포는 다수의 산업적 용처에서 유용한데, 그것으로서는 이들로 한정되지는 않지만, (i) 과학적 조사 또는 산업 연구를 위한 연구 도구로서 사용하는 것; (ii) 후속 과학적 연구에 또는 산업 제품으로서 사용될 수 있는 내인성 또는 재조합 탄수화물, 지질, 핵산, 또는 단백질 생성물 또는 소분자를 생산하기 위한 배양에서 사용하는 것; 및 (iii) 이후에 농업적 연구 또는 생산에 사용될 수 있는 트랜스제닉 식물 또는 식물 조직 배양물을 생산하기 위해 현대의 식물 조직 배양 기술과 함께 사용하는 것이 있다. 인공적인 독특한 미생물을 생산하기 위해 미생물, 예를 들면 트랜스제닉 식물 세포를 생산 및 사용하는 것은 현대의 미생물학 기술 및 인간의 개입을 이용한다. 이 방법에서는, 재조합 DNA를 식물 세포의 게놈 내로 삽입하여 천연 식물 세포로부터 분리된 독특한 트랜스제닉 식물 세포를 생성한다. 이어서, 이 트랜스제닉 식물 세포를 현대의 미생물학 기술을 이용하여 박테리아 및 효모 세포처럼 다량으로 배양할 수 있으며, 이는 미분화의 단세포 상태로 존재할 수도 있다. 상기 신규한 식물 세포의 유전적 조성 및 표현형은 상기 세포의 게놈 내로 이종 DNA를 통합함으로써 생성된 기술적 효과이다. 본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 미생물을 사용하는 방법이다. 본 발명의 미생물, 예를 들면 트랜스제닉 식물 세포를 사용하는 방법은, (i) 재조합 DNA를 상기 세포의 게놈 내로 통합시킨 후 이 세포를 사용하여 동일한 이종 DNA를 지닌 추가의 세포를 유도해 냄으로써 트랜스제닉 세포를 생산하는 방법; (ii) 현대의 미생물학 기술을 사용하여 재조합 DNA를 함유한 세포를 배양하는 방법; (iii) 배양된 세포로부터 내인성 또는 재조합 탄수화물, 지질, 핵산, 또는 단백질 생성물을 생산 및 정제하는 방법; 및 (iv) 현대의 식물 조직 배양 기술을 트랜스제닉 식물 세포와 함께 사용하여 트랜스제닉 식물 또는 트랜스제닉 식물 조직 배양물을 생산하는 방법을 포함한다.
본 발명의 식물은 전이유전자를 비롯한 상기 사건 DNA를 자손에 전달할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "자손"에는, 선조 식물로부터 유도된 상기 사건 DNA 및/또는 서열 1 및 서열 2로 제시된 서열 중 하나 이상을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 식물, 종자, 식물 세포, 및/또는 재생가능한 식물의 일부분이 포함된다. 식물, 자손, 및 종자는 전이유전자에 대해 동형접합이거나 또는 이형접합일 수 있다. 자손은 대두 사건 MON 87708 식물에 의해 생산된 종자로부터 및/또는 대두 사건 MON 87708 식물로부터의 화분으로 수정된 식물에 의해 생산된 종자로부터 성장할 수 있다.
자손 식물을 자가수분 (또한 "자가수정"으로도 공지됨)시켜, 순계의 식물, 즉, 전이유전자에 대해 동형접합인 식물을 생성할 수도 있다. 적절한 자손의 자가수정은 첨가된 두 외인성 유전자에 대해 동형접합인 식물을 생산할 수 있다.
별법으로, 자손 식물을 이종교배, 예를 들면, 관련없는 또 다른 식물과 생식시켜, 변종 또는 혼성체 종자 또는 식물을 생산할 수 있다. 관련없는 다른 식물은 트랜스제닉이거나 또는 트랜스제닉이 아닐 수 있다. 즉, 본 발명의 변종 또는 혼성체 종자 또는 식물은 대두 사건 MON 87708의 특이적이고도 특유한 DNA를 결여한 제1 부모를 대두 사건 MON 87708을 포함한 제2 부모와 교배하여 대두 사건 MON 87708의 특이적이고도 특유한 DNA를 포함하는 혼성체를 산출함으로써 도출할 수 있다. 교배 또는 생식에 의해 본 발명의 식물 또는 종자, 즉, 대두 사건 MON 87708 및/또는 서열 1 및 서열 2의 특이적이고도 특유한 DNA를 함유한 하나 이상의 대립유전자를 가진 종자가 산출되는 한, 각각의 부모는 혼성체이거나 순계교배/변종일 수 있다. 따라서, 2가지의 상이한 트랜스제닉 식물을 교배하여 독립적으로 구분되는 2가지의 부가된 외인성 유전자를 함유한 혼성체 자손을 생산할 수 있다. 예를 들면, MON 87708 디캄바 내성 대두를 다른 트랜스제닉 대두 식물과 교배하여, 상기 트랜스제닉 부모 둘 모두의 특징을 갖는 식물을 생산할 수 있다. 이의 한 가지 예는 MON 87708 디캄바 내성 대두를 하나 이상의 추가적인 속성, 예를 들면 제초제 내성 (예를 들면, 대두 사건 40-3-2 또는 대두 사건 MON89788 (미국 특허 출원 공개 번호 20060282915)), 곤충 구제 (예를 들면, 대두 사건 MON87701 (미국 특허 출원 공개 번호 20090130071)) 및/또는 다른 원하는 특성 (예를 들면, 향상된 오일 조성물, 예를 들면 대두 사건 MON87769 (WO2009102873))을 가진 대두와 교배하여 디캄바에 대해 내성이 있으며 하나 이상의 추가적인 속성을 갖는 자손 식물 또는 종자를 산출하는 것이다. 트랜스제닉 식물 내성이 입증되어 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 제초제는 글리포세이트, 글루포시네이트, 술포닐우레아, 이미다졸리논, 브로목시닐, 델라폰, 시클로헥산디온, 프로토포르피리노겐 옥시다제 억제제, 및 이속사플루톨 제초제를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 제초제 내성에 관여하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 분자는 당업계에 공지되어 있으며, 글리포세이트-내성 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) (예를 들면, 미국 특허 제5,627,061호; 제5,633,435호; 제6,040,497호; 제5,094,945호; 제5,804,425호; 제6,248,876호; 제7,183,110호; 제RE39,247호 참조); 글리포세이트 옥시도리덕타제 (GOX) (예를 들면, 미국 특허 제5,776,760호 참조); 글리포세이트-n-아세틸트랜스퍼라제 (GAT); 술포닐우레아, 이미다졸리논, 트리아졸로피리미딘, 피리미디닐 옥시벤조에이트, 술포닐아미노 카르보닐 트리아졸리논, 및/또는 헤테로아릴 에테르에 대한 내성의 경우, 제초제-내성 아세토락테이트 신타제 (ALS, 또한 아세토히드록시산 신타제 (AHAS)로도 공지되어 있음); 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (AOPP) (예를 들면 할록시포프, 퀴잘로포프, 디클로로포프, 및 디클로포프)에 대한 내성의 경우, 제초제-내성 아세틸 조효소 A 카르복실라제 (ACCase) 또는 R-2,4-디클로로페녹시프로피오네이트 디옥시게나제 (rdpA); 합성 옥신 제초제에 대한 내성의 경우, 해독 단백질, 예를 들면 2,4-D 디옥시게나제 (tfdA), R-2,4-디클로로페녹시프로피오네이트 디옥시게나제 (rdpA), 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제 (AAD), 및/또는 S-2,4-디클로르프로프 디옥시게나제 (sdpA); 브로목시닐 내성의 경우, 브로목시닐 니트릴라제 (Bxn) (예를 들면, 미국 특허 제4,810,648호 참조); 노르플루라존에 대한 내성의 경우, 피토엔 탈포화효소 (phytoene desaturase, crtI); 글루포시네이트 및 비알라포스에 대한 내성의 경우, 비알라포스 저항성 (bar) 또는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT) 단백질 (예를 들면, 미국 특허 제5,646,024호 및 제5,276,268호 참조); 및 트리케톤 (메조트리온, 템보트리온, 토프로메존, 이속사졸) 제초제-내성에 대한 단백질, 예를 들면 내성 4-히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD), 해독 시토크롬 P450, 또는 HPPD 경로 우회, 예를 들면 아트로박터 글로비포르미스 HPP 옥시다제 (HPPO) 및 슈도모나스 애시도보란스 4-HPA 1-히드록실라제 (HPAH) 및 NADH 옥시도리덕타제 (HPAC)를 코딩하는 뉴클레오티드 분자가 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다.
모 식물에 대한 역교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종-교배 또한 고려되며, 영양 번식도 마찬가지로 고려된다. 상이한 속성 및 작물에 통상적으로 사용되는 다른 육종 방법에 대한 설명은 여러 참조문헌 중 하나, 예를 들면 문헌 [Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)]에서 찾을 수 있다.
본 발명은 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 식물의 일부분을 제공한다. 본원에 사용된 "식물의 일부분"은 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 물질로 이루어진 식물의 임의의 부분을 지칭한다. 식물의 일부분은, 이들로 한정되지는 않지만, 화분, 배주, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 섬유, 및 잎을 포함한다. 식물의 일부분은 생육가능하고/거나, 생육가능하지 않고/거나, 재생가능하고/거나, 재생가능하지 않을 수 있다.
본 발명은 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 제품을 제공한다. 본원에 사용된 "제품"은 대두 사건 MON 87708 식물, 종자, 식물 세포 또는 식물의 일부분으로부터 유도된 물질로 이루어진 임의의 조성물 또는 생성물을 지칭한다. 제품은 소비자에게 판매될 수 있고, 생육가능하거나 생육가능하지 않을 수 있다. 생육가능하지 않은 제품은, 이들로 한정되지는 않지만, 생육불능 종자 및 낟알; 가공된 종자, 종자의 일부분 및 식물의 일부분; 탈수화 식물 조직, 냉동 식물 조직 및 가공된 식물 조직; 지상 및/또는 수중 동물 소비를 위한 동물 사료, 인간 소비를 위한 오일, 분 (meal), 가루, 박편, 겨, 섬유, 밀크, 치즈, 종이, 크림, 와인 및 임의의 다른 식품용으로 가공된 종자 및 식물의 일부분; 및 바이오매스 및 연료 제품을 포함한다. 생육가능한 제품은, 이들로 한정되지는 않지만, 종자 및 식물 세포를 포함한다. 따라서, 대두 사건 MON 87708은 대두로부터 전형적으로 획득되는 임의의 제품을 제조하는데 사용될 수 있다. 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 상기와 같은 임의의 제품은 대두 사건 MON 87708에 상응하는 하나 이상의 검출가능한 양의 특이적이고도 특유한 DNA를 함유할 수 있으며, 특히 서열 1 또는 서열 2의 15개 이상의 인접한 뉴클레오티드를 함유하는 검출가능한 양의 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 뉴클레오티드 분자에 대한 임의의 표준 검출 방법 (본원에 개시된 검출 방법 포함)이 사용될 수 있다. 제품은 그 안에 임의의 검출가능한 양의 서열 1 또는 서열 2가 존재한다면 본 발명의 범주 내에 속한다.
따라서, 본 발명의 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 식물의 일부분 (예를 들면 화분, 배주, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 및 잎), 및 제품은 특히 농업용으로 대두 사건 MON 87708의 종자 및/또는 식물의 일부분을 생산하기 위해 식물을 성장시키고, 식물 육종 및 조사 목적을 위해 대두 사건 MON 87708의 자손을 생산하고, 산업 및 조사 용도를 위해 미생물학 기술과 함께 사용하고, 소비자에게 판매하는데 유용하다.
본 발명은 디캄바 제초제 및 대두 사건 MON 87708을 사용하여 잡초를 조절하는 방법 및 식물을 생산하는 방법을 제공한다. 경작지에서 잡초를 조절하는 방법이 제공되며, 본 방법은 경작지에서 대두 사건 MON 87708 변이 또는 혼성 식물을 심고, MON 87708 식물에는 해를 입히지 않으면서 경작지에 있는 잡초를 조절할 목적으로 경작지에 제초 유효 용량의 디캄바를 적용하는 것으로 이루어진다. 이러한 디캄바 제초제의 적용은 발아-전, 즉 MON 87708 종자를 심은 후 및 MON 87708 식물이 발아하기 전의 임의의 시간에 이루어질 수 있거나, 또는 발아-후, 즉 MON 87708 식물이 발아한 후의 임의의 시간에 이루어질 수 있다. 경작지에서 잡초를 조절하는 또다른 방법이 또한 제공되며, 본 방법은 경작지에서 잡초를 조절하기 위해 유효 용량의 디캄바 제초제를 적용한 다음 경작지에 대두 사건 MON 87708을 심는 것으로 이루어진다. 이러한 디캄바 제초제의 적용은 심기-전, 즉 대두 사건 MON 87708을 심기-전에 이루어질 것이며, 심기-전 약 14일 내지 심기-전 약 1일을 포함하는 (이로 한정되지 않음) 심기-전의 임의의 시간에 행해질 수 있다. 본 발명은 또한 경작지에서 디캄바 내성 대두 품종 MON 87708의 종자를 심고, 독성 잡초 종을 사멸시키기에 충분한 발아후 유효 용량의 디캄바 제초제를 경작지에 적용하고, 경작지로부터 종자를 수확함으로써 독성 잡초 종의 종자가 본질적으로 없는 대두 종자의 생산 방법을 제공한다. 경작지에서 사용하기 위한 디캄바의 제초 유효 용량은 성장 시즌에 걸쳐서 1 에이커 당 약 0.005 파운드 내지 1 에이커 당 디캄바 약 8 파운드의 범위로 이루어져야 한다. 디캄바의 다중 적용, 예를 들면 2회 적용 (예를 들면 심기-전 적용 및 발아-후 적용 또는 발아-전 적용 및 발아-후 적용) 또는 3회 적용 (예를 들면 심기-전 적용, 발아-전 적용 및 발아-후 적용)이 성장 시즌에 걸쳐서 사용될 수 있다.
본 발명의 트랜스제닉 사건 MON 87708에 특이적이며 특유한 DNA 서열을 포함하는 제초제 내성 대두를 생산하는 방법이 제공된다. 이들 방법에 사용된 트랜스제닉 식물은 전이유전자에 대해 동형접합 또는 이형접합일 수 있다. 이들 방법에 의해 생산된 자손 식물은 변이 또는 혼성 식물일 수 있고; 대두 사건 MON 87708 식물에 의해 생산된 종자, 및/또는 대두 사건 MON 87708 식물의 화분으로 수정된 식물에 의해 생산된 종자로부터 성장한 것일 수 있고; 전이유전자에 대해 동형접합 또는 이형접합일 수 있다. 자손 식물은 이후 자가-수분하여 순계의 식물, 즉 전이유전자에 대해 동형접합인 식물을 생성할 수 있거나, 또는 별법으로 이종교배, 예를 들면 관련없는 또다른 식물과 생식되어 변이 또는 혼성 종자 또는 식물을 생산할 수 있다.
디캄바 제초체의 적용에 대해 내성이 있는 대두는 서열 1 및 서열 2의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 사건 MON 87708 식물을 또다른 대두 식물과 유성 교배시키고, 이에 의해 종자를 생산한 다음, 자손 식물로 성장시킴으로써 생산할 수 있다. 이어서, 이들 자손 식물을 디캄바 제초제로 처리하여 디캄바 제초제에 내성이 있는 자손 식물을 선별할 수 있다. 별법으로, 이들 자손 식물을 진단학적 방법을 사용하여 분석함으로써 사건 MON 87708 DNA를 함유하는 자손 식물을 선별할 수 있다. 교배에 사용된 다른 식물은 디캄바 제초제에 대해 내성이 있거나 없을 수 있으며, 트랜스제닉될 수 있거나 안될 수 있다. 생산된 자손 식물 및/또는 종자는 변이 또는 혼성 종자일 수 있다. 본 방법을 실시하는데 있어서, 한 식물을 또다른 식물과 유성 교배하는 단계, 즉 타화-수분은 인간 개입에 의해, 예를 들면 한 식물의 화분을 인간 손으로 수집하고 이 화분을 제2의 식물의 암술대 또는 암술머리와 접촉시키커고/거나; 인간 손 및/또는 작용으로 식물의 수술 또는 꽃밥을 제거, 파괴 또는 회수하여 (예를 들면, 수술제거(detasseling) 또는 화학적 생식자소멸제의 적용에 의함) 천연 자가-수분을 방지하고 수정되려면 타화-수분이 일어나야만 하도록 하고/거나; 인간이 "방향성 수분(directed pollination)"을 위한 위치에 수분 곤충을 배치하고/거나 (예를 들면, 과수원 또는 경작지에 벌집을 배치하거나 식물을 수분 곤충과 함께 보관함에 의함); 인간이 꽃의 일부분을 개방 또는 제거하여 암술대 또는 암술머리 상에 외래 화분의 배치 또는 접촉을 가능하게 하고/거나 (예를 들면, 본래 타화-수분을 방해 또는 방지하므로 자연적으로 인간 개입없이 의무적인 자가-수분자가 되는 꽃을 갖는 대두에서); 식물의 선택적인 배치에 의해 (예를 들면, 의도적으로 수분 근접지에 식물을 심음); 및/또는 개화를 촉진시키거나 (화분에 대한 암술머리의) 수용성을 증진시키는 화학물질의 적용에 의해 달성 또는 용이해질 수 있다.
디캄바 제초제의 적용에 내성이 있는 대두는 서열 1 및 서열 2의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 대두 사건 MON 87708 식물을 자가수정하고, 이에 의해 종자를 생산한 다음, 이를 자손 식물로 성장시켜 생산할 수 있다. 이어서, 이들 자손 식물을 디캄바 제초제로 처리하여 디캄바 제초제에 내성이 있는 자손 식물을 선별할 수 있다. 별법으로, 이들 자손 식물을 진단학적 방법을 사용하여 분석함으로써 사건 MON 87708 DNA를 함유하는 자손 식물을 선별할 수 있다. 본 방법을 실시하는데 있어서, 한 식물을 그 자체와 유성 교배하는 단계, 즉 자가-수분 또는 자가수정은 인간 개입에 의해, 예를 들면 인간 손으로 식물의 화분을 수집하고 이 화분을 같은 식물의 암술대 또는 암술머리와 접촉시킨 다음 임의로 식물의 추가 수정을 방지하고/거나; 인간 손 및/또는 작용으로 다른 근처 식물의 수술 또는 꽃밥을 제거, 파괴 또는 회수하여 (예를 들면 수술제거 또는 화학적 생식자소멸제의 적용에 의함) 천연 타화-수분을 방지하고 수정되려면 자가-수분이 일어나야만 하도록 하고/거나; 인간이 "방향성 수분"을 위한 위치에 수분 곤충을 배치하고/거나 (예를 들면, 식물 단독을 수분 곤충과 함께 보관함에 의함); 인간이 자가-수분되도록 꽃 또는 그의 일부분을 조작하고/거나; 식물의 선택적인 배치에 의해 (예를 들면, 의도적으로 수분 근접지 너머에 식물을 심음); 및/또는 개화를 촉진시키거나 (화분에 대한 암술머리의) 수용성을 증진시키는 화학물질의 적용에 의해 달성 또는 용이해질 수 있다.
이들 방법에 포함되며 이들 방법을 사용하여 생산되는 자손 대두 식물 및 종자는 다른 대두와 상이할 것인데, 이는 예를 들면 자손 대두 식물 및 종자가 재조합되어 인간 개입에 의해 생성되고/거나; 디캄바 제초제 내성이고/거나; 본 발명의 전이유전자 DNA로 이루어진 하나 이상의 대립유전자를 함유하고/거나; 서열 1 및 서열 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 양의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하기 때문이다. 종자는 개별 자손 식물로부터 선택될 수 있으며, 종자가 서열 1 및 서열 2를 포함하는 한, 이는 본 발명의 범위 안에 속할 것이다.
본 발명을 실시하는데 있어서, 2개의 상이한 트랜스제닉 식물은 2개의 독립적으로 분리된 이형접합 유전자를 함유하는 혼성체 자손을 생산하도록 교배될 수 있다. 적절한 자손의 자가수정은 두 유전자에 대해 동형접합인 식물을 생산할 수 있다. 모 식물에 대한 역-교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종-교배 또한 고려되며, 영양 번식도 마찬가지로 고려된다. 상이한 속성 및 작물에 통상적으로 사용되는 다른 방법에 대한 설명은 여러 참조문헌 중 하나, 예를 들면 문헌 [Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)]에서 찾을 수 있다.
본원에 개시된 방법에 사용된 식물 및 종자는 또한 하나 이상의 추가 전이유전자를 함유할 수 있다. 이러한 전이유전자는 내충성 증가, 용수 효율 증가, 수확량 증가, 내건성 증가, 종자 품질 증가, 영양 품질 향상, 및/또는 제초제 내성 증가를 포함하는 (이들로 한정되지는 않음) 바람직한 속성을 부여하는 단백질 또는 RNA 분자를 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 바람직한 속성은 상기 추가의 전이유전자가 결핍된 대두와 비교하여 측정된다.
따라서, 본 발명의 방법은 특히, 농업 또는 조사 목적으로 대두 사건 MON 87708의 종자 및/또는 식물의 일부분을 생산하기 위해 식물을 성장시키고, 식물 육종 또는 조사 목적으로 대두 사건 MON 87708의 자손을 선별하고, 대두 사건 MON 87708의 자손 식물 및 종자를 생산하는 동안 경작지에서 잡초를 조절하는데 유용하다.
본 발병의 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 식물의 일부분 (예를 들면 화분, 배주, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 및 잎), 및 제품은 DNA 조성, 유전자 발현, 및/또는 단백질 발현에 대해 평가될 수 있다. 이러한 평가는 임의의 표준 방법, 예를 들면 PCR, 노던 블롯팅, 서던 분석, 웨스턴 블롯팅, 면역-침전, 및 ELISA를 사용하거나 본원에 제공된 검출 방법 및/또는 검출 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
대두 세포, 조직, 종자 또는 샘플에서의 대두 사건 MON 87708의 식물로부터 유도된 DNA의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 하나의 방법은 (i) 하나 이상의 대두 세포, 조직, 종자 또는 식물로부터의 DNA 샘플을 추출하는 단계, (ii) DNA 샘플을 DNA 증폭을 위해 적절한 조건하에 사건 MON 87708 DNA로부터의 앰플리콘을 생성할 수 있는 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계, (iii) DNA 증폭 반응을 수행하는 단계, 이어서 (iv) 앰플리콘 분자를 검출하고/하거나 앰플리콘의 뉴클레오티드 서열이 사건 MON 87708에 대해 특이적인 뉴클레오티드 서열, 예를 들면 서열 1-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 확인하는 단계로 이루어진다. 앰플리콘은 사건 MON 87708에 대해 특이적인 앰플리콘, 예를 들면 서열 1 또는 서열 2를 포함하는 앰플리콘이어야 한다. 앰플리콘에서의 사건 MON 87708에 대해 특이적인 뉴클레오티드 서열의 검출은 샘플에서의 대두 사건 MON 87708 특정 DNA의 존재에 대해 결정적이고/이거나 진단적이다. DNA 증폭을 위한 적절한 조건하에 사건 MON 87708 DNA로부터 앰플리콘을 생성할 있는 프라이머 쌍의 예는 서열 10-11로서 제공된다. 다른 프라이머 쌍은 당업자에 의해 쉽게 설계될 수 있으며, 서열 6의 하나 이상의 단편을 포함할 것이다. 대두 세포, 조직, 종자 또는 샘플에서의 대두 사건 MON 87708의 식물로부터 유도된 DNA의 존재의 또다른 검출 방법은 (i) 하나 이상의 대두 세포, 조직, 종자 또는 식물로부터의 DNA 샘플을 추출하는 단계, (ii) DNA 샘플을 사건 MON 87708 DNA에 대해 특이적인 DNA 프로브와 접촉시키는 단계, (iii) 엄격한 혼성화 조건 하에 프로브 및 DNA 샘플을 혼성화하도록 하는 단계, 이어서 (iv) 프로브 및 표적 DNA 샘플 사이의 혼성화를 검출하는 단계로 이루어진다. 사건 MON 87708 DNA에 대해 특이적인 DNA 프로브의 서열의 예는 서열 11로서 제공된다. 다른 프로브는 당업자에 의해 쉽게 설계될 수 있으며, 서열 6의 하나 이상의 단편을 포함할 것이다. DNA 샘플에 대한 프로브 혼성화의 검출은 샘플에서의 대두 사건 MON 87708 특정 DNA의 존재에 대해 진단적이다. 혼성화의 부재는 이와 달리 샘플에서의 대두 사건 MON 87708 특정 DNA의 부재에 대해 진단적이다.
샘플에서의 대두 사건 MON 87708 DNA의 확인을 위해 유용하며, 또한 적절한 사건 DNA를 함유하는 대두 식물을 번식시키기 위한 방법에 적용될 수 있는 DNA 검출 키트가 제공된다. 이러한 키트는 서열 1-8의 단편을 포함하는 DNA 프라이머 및/또는 프로브를 함유한다. 상기 키트의 하나의 예는 샘플에서의 트랜스제닉 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 DNA의 존재 및/또는 부재를 검출하기 위해 유용한 DNA 프로브로서 기능하기 위한 서열 6의 충분한 길이의 인접한 뉴클레오티드의 하나 이상의 DNA 분자를 포함한다. 트랜스제닉 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 DNA는 서열 1, 서열 2, 서열 7 및/또는 서열 8을 포함한다. 샘플에서의 대두 사건 MON 87708 DNA의 존재 및/또는 부재를 결정하거나, 검출하거나 또는 진단하기 위해 유용한 DNA 프로브로서 사용하기 위해 충분한 DNA 분자는 서열 11로서 제공된다. 다른 프로브는 당업자에 의해 쉽게 설계될 수 있으며, 서열 6의 적어도 15 인접한 뉴클레오티드를 포함해야 하며, 사건으로부터 유도된 DNA를 확인하기 위해 대두 사건 MON 87708 DNA에 충분히 특유하여야 한다. 또다른 유형의 키트는 샘플에서의 트랜스제닉 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 DNA의 존재 및/또는 부재를 검출하기 위해 유용한 앰플리콘을 생성하기 위해 유용한 프라이머 쌍을 포함한다. 이러한 키트는 표적 DNA 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 프라이머 쌍과 접촉시키고, 이어서 서열 1, 서열 2, 서열 7 및/또는 서열 8을 포함하는 앰플리콘을 생성하기 위해 충분한 핵산 증폭 반응을 수행하고, 이어서 앰플리콘의 존재 및/또는 부재를 검출하는 것을 포함하는 방법을 사용한다. 이러한 방법은 또한 표적 DNA 샘플에서의 대두 사건 MON 87708 특정 DNA의 존재에 대해 결정적, 즉 진단적인 앰플리콘 또는 그의 단편을 서열분석하는 것을 포함할 수 있다. 다른 프라이머 쌍은 당업자에 의해 쉽게 설계될 수 있으며, 서열 6의 적어도 15 인접한 뉴클레오티드를 포함해야 하며, 사건으로부터 유도된 DNA를 확인하기 위해 대두 사건 MON 87708 DNA에 충분히 특유하여야 한다.
핵산 증폭은 열 증폭 방법을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 다양한 핵산 증폭 방법에 의해 달성될 수 있다. 이들 방법에 의해 생성된 앰플리콘을 검출, 정량화 및/또는 서열분석하기 위한 여러 기술이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 하나의 예시적인 기술은 타크맨(등록상표) (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 포스터 시티, 캘리포니아)이다.
본 발명의 키트 및 검출 방법은 무엇보다도, 대두 사건 MON 87708의 확인, 대두 사건 MON 87708을 포함하는 식물 품종 또는 혼성체의 선택, 샘플에서의 트랜스제닉 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 DNA의 존재의 검출, 및 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 대두 사건 MON 87708 또는 식물의 일부분의 존재 및/또는 부재에 대한 샘플의 모니터링을 위해 유용하다.
대두 사건 MON 87708로부터의 이종 DNA 삽입의 서열, 접합부 서열 또는 측면에 위치한 서열 (대표적인 종자 샘플이 ATCC PTA-9670로 기탁됨)은 본원에 제공된 서열로부터 유도된 프라이머를 사용하여 사건으로부터의 상기 서열을 증폭시키고, 이어서 앰플리콘 또는 클로닝된 DNA를 표준 DNA 서열분석함으로써 확인될 수 있다 (필요한 경우 정정될 수 있음).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 "포함하지만, 이들에 한정되지는 않는"을 의미한다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 실시양태의 예를 입증하기 위해 포함된다. 당업자는 하기 실시예에 개시된 기법들이, 본 발명자들에 의해 본 발명의 실시에서 잘 기능하는 것으로 발견된 접근법을 나타내고, 따라서 그의 실시를 위해 바람직한 방식의 예를 구성하는 것으로 고려될 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 당업자는 본 개시에 비추어, 개시된 특정 실시양태에서 많은 변화가 이루어질 수 있으며, 본 발명의 취지 및 범위에 벗어남 없이 비슷하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있음을 이해할 것이다.
실시예
실시예 1: 대두 A3525 및 MON 87708 사건 선택의 형질전환
대두 식물 MON 87708을 대두의 아그로박테리움-매개된 형질전환에 의해 생성하였다. 대두 세포를 형질전환시키고, 무손상 대두 식물로 재생시키고, 개별 식물을 식물 발현 카세트의 온전함 및 디캄바에 대한 내성을 나타낸 식물의 집단으로부터 선택하였다. 이 집단으로부터, 대두 사건 MON 87708을 선택하고, 특징화하였다.
트랜스제닉 디캄바 내성 대두 식물 MON 87708을 형질전환 벡터 PV-GMHT4355를 이용하여 대두 분열조직 조직의 아그로박테리움-매개된 형질전환을 통해 발달시켰다. 방법은 미국 특허 제6,384,301호 (본원에 참조로 포함됨)에 기재되었고, 이는 가골의 이용 없이 형질전환된 식물의 생성을 가능하게 한다. 간단히, 분열조직 조직을 발아된 A3525 대두 종자 (아스그로 (Asgrow), 세인트 루이스, 미주리 (St Louis, MO))의 배아로부터 절단하였다. 아그로박테리움을 갖는 벡터로의 공동-배양 후, 형질전환되지 않은 식물 세포 및 잉여 아그로박테리움의 성장을 억제하기 위해 분열조직을 글리포세이트 (몬산토 (Monsanto), 세인트 루이스, 미주리), 카르베니실린 디나트륨 염, 세포탁심 나트륨 염 및 티카르실린 디나트륨 염/칼륨 클라불라네이트 혼합물을 함유하는 선택 배지 상에 놓았다. 분열조직을 이어서 싹 (shoot) 및 뿌리 발달에 도움이 되는 배지에 놓았다. 정상 표현형 특징을 갖는 고정된 식물을 선택하고, 성장 및 추가의 평가를 위해 토양으로 운반하였다.
상기 형질전환을 통해 생성된 R0 식물을 성장을 위해 토양으로 운반하고, 이어서 R1 종자를 생성하기 위해 자가수정시켰다. R0 식물의 후속적인 자가수정 중 R1 세대를 생성하기 위해, T-DNA I (dmo 발현 카세트) 및 T-DNA II (cp4 epsps 발현 카세트)의 연결되지 않은 삽입을 분리하였다. 글리포세이트의 비-치사량을 R1 식물에 적용하였다. 작은 손상을 갖는 식물을 추가의 분석을 위해 선택한 반면, 손상을 나타내지 않은 식물, 즉 T-DNA II (cp4 epsps 발현 카세트)를 함유하는 식물을 후속적인 발달로부터 제거하였다. 후속적으로, 단일 T-DNA I 삽입 (즉, dmo 유전자 카세트) 만을 함유하는 R0 식물을 확인하였다. T-DNA I 발현 카세트는 2벌 인핸서 영역 (P-PClSV.FLt-enh)을 갖는 피너트 클로로틱 스트리크 바이러스 (Peanut Chlorotic Streak Virus) (PClSV) 프로모터를 포함하였고; 토바코 에치 바이러스 (Tobacco Etch Virus) (L-TEV)의 RNA 전사체로부터 유도된 DNA 선도자에 실시할 수 있게 연결하였고; 피숨 사티붐 (Pisum sativum) (TS-RbcS-3C)으로부터의 리불로스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제 소단위체 (SSU)로부터의 N-말단 엽록체 통과 펩티드를 코딩하는 DNA 분자에 실시할 수 있게 연결하였고; 피숨 사티붐 (Pisum sativum) (CR-RbcS-3C)으로부터의 리불로스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제 소단위체 (SSU)로부터의 성숙 단백질의 부분에 실시할 수 있게 연결하였고; 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia) (수도모나스 말토필리아 (Pseudomonas maltophilia)가 DMO 유전자의 공급원의 원래 명칭이었다. 이 공급원 생물을 후속적으로 크잔토모나스 말토필리아 ( Xanthomonas maltophilia)로서 초기에 재분류하였고, 이어서 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia)로서 재분류하였음)로부터의 디캄바 모노-옥시게나제 (DMO)를 코딩하는 DNA 분자에 실시할 수 있게 연결하였고; 피숨 사티붐 (Pisum sativum) (T-Ps.RbcS2-E9)의 리불로스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제 소단위체 유전자로부터 유도된 3' UTR DNA 분자에 실시할 수 있게 연결하였다. 식물을 타크맨, PCR 분석 및 제초제 스프레이를 포함하는 분석적 기술의 조합에 의해 선택하였다. MON 87708 사건을 그의 우수한 표현형 특징, 포괄적인 분자적 프로파일 분석 및 그의 바람직한 일배체형 연관성을 기반으로 하여 대략 2,400개 개별 트랜스제닉 사건 사이에서 선택하였다. 사건 MON 87708을 이어서 사건 MON 89788 (글리포세이트 내성)과 교배하였다. 이 교배의 자손을 디캄바 (클래리티 (Clarity)(등록상표), 바스프 (BASF), 리서치 트라이앵글 파크, 노스 캐롤라이나 (Research Triangle Park, NC)), 글리포세이트 (라운드업 웨더맥스 (Roundup WeatherMAX)(등록상표), 몬산토 코. (Monsanto Co.), 세인트 루이스, 미주리) 또는 디캄바 및 글리포세이트의 조합물로 처리하였다. 처리를 증식형 3개 성장 단계 (V3)에서의 식물-전, 식물-후, 및 생식 1 단계 (R1)에서의 식물-후에 수행하였다. 처리된 식물을 식물-전 제초제 처리에 대한 처리 후 14일 (DAT), VE 단계에서의 발아후 처리에 대한 3 DAT 및 R1 단계에서의 3 DAT 발아후 처리에서의 퍼센트 성장 억제에 대해 점수를 매겼다. 제초제(들)을 표 1에 나타낸 바와 같이 에이커 당 다양한 비율로 적용하였다. 퍼센트 억제 측정은 반복의 평균을 나타낸다.
Figure 112012029779551-pct00001
디캄바 내성 전이유전자를 대두 사건 MON 87708에서 대략 지도 위치 143.5에서의 연결 그룹 9에 매핑 (map)하였다. 연과된 일배체형 윈도우 19743 및 19767은 수율, 성숙도, 높이 또는 도복에 대해 효과가 없다. 일배체형 연관성 정보를 표 2에 나타내며, GM_A92205는 사건 MON 87708을 나타낸다.
Figure 112012029779551-pct00002
실시예 2: MON 87708 DNA 서열의 특징
대두 식물 MON 87708의 게놈에 삽입된 DNA 및 측면에 위치한 서열을 상세한 분자적 분석에 의해 특징지었다. 이들 분석은 삽입 서열, 삽입 수 (대두 게놈 내의 통합 부위의 수), 복제 수 (1개 좌위 내의 전이유전자 DNA의 복제의 수), 삽입된 유전자 카세트의 온전함, 측면에 위치한 서열 및 삽입과 대두 게놈의 일배체형 영역의 연관성을 포함하였다.
식물 발현 카세트의 무손상 코딩 영역 및 그의 각각의 조절 요소, 프로모터, 인트론 및 폴리아데닐화 서열을 포함한 분자적 DNA 프로브를 사용하였다. 분석은 MON 87708이 발현 카세트의 1개 복제를 갖는 단일 전이유전자 DNA 삽입을 함유하는 것을 나타낸다. 5' 및 3' 삽입-대-식물 게놈 접합부를 결정하고, 삽입 내의 요소의 조직을 확인하고 (도 1), 대두 식물 MON 87708에서의 삽입의 완전한 DNA 서열 (본원에 서열 5로서 제공됨)을 결정하기 위해 역 PCR 및 DNA 서열 분석을 수행하였다. 게놈에 도 1에 나타낸 연결된 전이유전자 유전적 요소를 포함하며, 디캄바에 내성인 대두 식물은 본 발명의 측면이다.
MON 87708에서 전이유전자 DNA 삽입의 측면에 위치한 서열을 문헌 [Ochman et al., 1990 (PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.)]에 기재된 바와 같은 역 PCR 및/또는 게놈 워커 (walker) 기술을 사용하여 결정하였다. 식물 게놈 DNA를 표준 온실 조건하에 성장시킨 조직으로부터의 A3525 및 트랜스제닉 대두 주 (line) 모두로부터 단리하였다. 대략 1 그램의 어린 잎 조직을 액체 질소와 합하고, 약연 및 막자를 사용하여 미세한 분말로 분쇄하였다. DNA를 제조자의 프로토콜에 따라 뉴클레온 (Nucleon)(상표명) 파이토퓨어 (PhytoPure)(상표명) 게놈 DNA 추출 키트 (RPN8511, 아머샴 (Amersham), 피스카타웨이, 뉴저지 (Piscataway, NJ))를 사용하여 추출하였다. 최종 침전 단계 후, DNA를 0.5 ml의 TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) 중에 재현탁하였다. 이 방법은 종자를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는 대두의 임의의 조직으로부터의 DNA를 추출하기 위해 당업자에 의해 변형될 수 있다. DNA의 분취액을 전이유전자 DNA의 제한 분석을 기반으로 선택된 제한 엔도뉴클레아제로 소화하였다. 제한 단편의 자가-라이게이션 후, PCR을 전이유전자 DNA의 5' 및 3' 말단으로부터 바깥쪽으로 확장되는 서열을 증폭시키는 전이유전자 DNA 서열로부터 설계된 프라이머를 사용하여 수행하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, 퀴아젠 (Qiagen) 겔 정제 키트 (퀴아젠, 발렌시아, 캘리포니아 (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다. 후속적인 DNA 생성물을 표준 DNA 서열분석 프로토콜을 사용하여 직접 서열분석 하였다. 발현 카세트 전이유전자 DNA의 우측 경계 서열 내로 확장되는 5' 측면 서열은 서열 3 ([C], 도 1을 참조함)으로서 제시된다. 발현 카세트 전이유전자 DNA의 좌측 경계 서열 내로 확장되는 3' 측면 서열은 서열 4 ([D], 도 1을 참조함)로서 제시된다. A3525 게놈 DNA에 완전히 통합된 발현 카세트 DNA의 부분은 서열 5 ([E], 도 1을 참조함)로서 제시된다.
단리된 DNA 분자 서열을 측면에 위치한 서열 및 동시-단리된 전이유전자 DNA 단편을 확인하기 위해 전이유전자 DNA 서열에 비교하였다. 발현 카세트의 존재의 확인은 추론된 측면에 위치한 서열 데이터 및 알려진 전이유전자 DNA 서열을 기반으로 하여 설계된 프라이머로의 PCR에 의해 달성하였다. 전이유전자 DNA가 형질전환된 주에서 통합된 동일한 영역에 상응하는 야생형 서열을 MON 87708에서의 측면에 위치한 서열로부터 설계된 프라이머를 사용하여 단리하였다. PCR 반응을 엘롱가제 (Elongase)(등록상표) 증폭 시스템 (인비트로젠 (Invitrogen), 칼스바드, 캘리포니아 (Carlsbad, CA))을 사용하여 수행하였다. MON 87708에서의 측면에 위치한 DNA 서열 및 A3525 야생형 서열을 다중 뉴클레오티드 및 단백질 데이터베이스에 대해 분석하였다. 이 정보를 전이유전자와 식물 게놈의 관계를 검사하고, 삽입 부위 온전함을 찾기 위해 사용하였다. 사건을 확인하기 위해 사용된 타크맨(등록상표) 종점 검정을 위한 프라이머를 설계하기 위해 측면에 위치한 서열 및 야생형 서열을 사용하였다. 이 정보를 사용하여 접합성 검정을 개발하였다.
실시예 3: 사건 특이적인 종점 타크맨(등록상표) 검정.
이 실시예는 샘플에서의 사건 MON 87708을 확인하기 위해 개발된 사건 특이적인 종점 타크맨(등록상표) 열 증폭 방법을 기재한다. 사건 MON 87708 특이적인 종점 타크맨(등록상표) 방법에 유용한 조건의 예는 다음과 같다: 단계 1: 10 μl의 최종 부피에 대해 조정된 18 메그옴 물. 단계 2: 1X 최종 농도로의 5.0 μl의 2X 유니버설 마스터 믹스 (Universal Master Mix) (dNTPs, 효소, 완충제). 단계 3: 1.0 μM의 최종 농도 (예를 들면, 마이크로원심분리 관에서, 20 uM의 최종 농도에서 500 μl를 달성하기 위해 다음이 첨가되어야 함: 100 μM의 농도에서의 100 μl의 프라이머 SQ13570 (서열 9); 100 μM의 농도에서의 100 μl의 프라이머 SQ13571 (서열 10); 300 μl의 18 메그옴 물)로의 0.5 μl 사건 프라이머-1 (SQ13570) 및 사건 프라이머-2 (SQ13571) 믹스 (각각 프라이머에 대해 20 uM의 농도로 18 메그옴 물 중에 재현탁됨). 단계 4: 0.2 μl 사건 6-FAM(상표명) MGB 프로브 PB4655 (10 μM의 농도 (서열 11)로 0.2 μM의 최종 농도로 18 메그옴 물 중에 재현탁됨). 단계 5: 1.0 μM 최종 농도로의 0.5 μl 내부 대조군 프라이머-1 및 내부 대조군 프라이머-2 믹스 (각각 프라이머에 대해 20 μM의 농도로 18 메그옴 물 중에 재현탁됨). 단계 6: 0.2 μM 최종 농도로의 0.2 μl 내부 대조군 VIC (상표명) 프로브 (10 μM의 농도로 18 메그옴 물 중에 재현탁됨). 단계 7: 1. 분석되어야 하는 잎 샘플; 2. 음성 대조군 (비-트랜스제닉 DNA); 3. 음성 물 대조군 (주형 없음)을 포함하는 각각 하나를 갖는 각각 샘플에 대한 3.0 μl 추출된 DNA (주형); 4. 양성 대조군 MON 87708 DNA. 단계 8: 다음과 같은 열순환기 조건: 50℃에서 2분 동안 1개 주기; 95℃에서 10분 동안 1개 주기; 15초 동안 95℃의 10개 주기, 이어서 -1℃/주기로 1분 동안 64℃; 15초 동안 95℃의 30개 주기, 이어서 1분 동안 54℃; 10℃의 최종 주기.
종점 검정에서 사용된 DNA 프라이머는 프라이머 SQ13570 (서열 9), SQ13571 (서열 10) 및 6-FAM(상표명) 표지된 프로브 PB4655 (서열 11)이다. 6-FAM(상표명)은 DNA 프로브에 부착된 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) (포스터 시티, 캘리포니아)의 형광 색소 제품이다. 타크맨(등록상표) MGB(상표명) 프로브에 대해, 타크 (Taq) DNA 폴리머라제의 5' 엑소뉴클레아제 활성은 형광단 및 켄처 사이에서 5'-말단으로부터 프로브를 절단한다. 표적 DNA 가닥에 혼성화된 경우, 켄처 및 형광단은 충분히 분리되어 형광 신호를 생성하며, 따라서 형광을 방출한다. SQ13570 (서열 9) 및 SQ13571 (서열 10)이 PB4655 (서열 11)로 이들 반응 방법과 사용된 경우, 사건 MON 87708 DNA에 대해 진단적인 DNA 앰플리콘을 생성한다. 이 분석을 위한 대조군은 사건 MON 87708 DNA를 함유하는 대두로부터의 양성 대조군, 비-트랜스제닉 대두로부터의 음성 대조군, 및 주형 DNA를 함유하지 않는 음성 대조군을 포함하여야 한다. 또한, PCR 반응을 위한 대조군은 글라이신 게놈에서의 단일 복제 유전자에 대해 특이적인 내부 대조군 프라이머 및 내부 대조군 프로브를 포함한다. 당업자는 글라이신 게놈에서의 단일 복제 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 어떻게 설계하는지 알 것이다. 이들 검정은 어플라이드 바이오시스템즈 진앰프 (GeneAmp)(등록상표) PCR 시스템 9700 (최대 속도에서 수행됨) 또는 엠제이 리서치 DNA 엔진 (MJ Research DNA Engine) PTC-225 열순환기 중 하나로의 사용에 대해 최적화되었다. 당업자에게 공지된 사건 MON 87708 DNA를 확인하는 앰플리콘을 생성하는 다른 방법 및 기구는 당업계의 기술 내에 있다.
발현 카세트의 존재를 입증하는 R0 식물을 완전히 성숙한 식물로 발달하도록 하였다. 디캄바 내성 전이유전자 카세트의 서열을 기반으로 하여 설계된 프로브를 연결을 결정하기 위해 써던 블럿을 프로브하기 위해 사용하였다. R0 식물을 써던 분석 및 종점 타크맨(등록상표)의 조합을 사용하여 발현 카세트의 복제 수에 대해 또한 평가하였다.
접합성 검정은 사건을 포함하는 식물이 사건 DNA에 대해 동형접합인지를 결정하기 위해 유용하거나; 즉, 염색체 쌍의 각각 염색체 상의 동일한 위치에 외인성 DNA를 포함하거나; 또는 사건 DNA에 대해 이형접합이거나, 즉 염색체 쌍의 1개 염색체 상에만 외인성 DNA를 포함하거나; 또는 사건 DNA에 대해 무효, 즉 야생형이다. 종점 타크맨(등록상표) 열 증폭 방법을 또한 사건 MON 87708에 대한 접합성 검정을 개발하기 위해 사용하였다. 이 실시예는 샘플에서의 사건 MON 87708의 접합성을 결정하기 위해 개발된 사건 특이적인 종점 타크맨(등록상표) 열 증폭 방법을 기재한다. 이 검정을 위해, 3개의 프라이머 검정을 사용하였으며, 여기서 프라이머 SQ20632 (서열 12)는 삽입된 외인성 DNA 및 게놈 DNA의 3' 접합부로부터 특이적으로 혼성화 및 확장되고, 프라이머 SQ20636 (서열 13)은 삽입된 외인성 DNA의 3' 측의 측면에 위치한 DNA로부터 구체적으로 혼성화 및 확장되고, 프라이머 SQ20637 (서열 14)은 삽입된 외인성 DNA가 통합된 게놈 DNA으로부터 구체적으로 혼성화 및 확장된다. 3개 프라이머는 사건에 대해 진단적이다. 이 실시예에서, 프라이머 SQ20636 (서열 13) 및 프라이머 SQ20632 (서열 12) 및 6-FAM(상표명)-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 PB10130 (서열 15)은 삽입된 외인성 DNA의 복제가 있는 경우 진단적이다. 이 실시예에서, SQ20636 (서열 13) 및 프라이머 SQ20637 (서열 14) 및 VIC(상표명)-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 PB10131 (서열 16)은 게놈 DNA에 삽입된 외인성 DNA의 복제가 존재하지 않는 경우, 즉 야생형인 경우 진단적이다. 사건 MON 87708에 대한 식물 동형접합으로부터 추출된 DNA로의 PCR 반응에서 3개 프라이머 및 2개 프로브가 함께 혼합된 경우, 6-FAM(상표명)-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 PB10130 (서열 15)로부터의 형광 신호만 있으며, 이는 사건 MON 87708에 대한 식물 동형접합을 나타내며 이에 대해 진단적이다. 사건 MON 87708에 대한 식물 이형접합으로부터 추출된 DNA로의 PCR 반응에서 3개 프라이머 및 2개 프로브가 함께 혼합된 경우, 6-FAM(상표명)-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 PB10130 (서열 15) 및 VIC(상표명)-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 PB10131 (서열 16) 모두로부터의 형광 신호가 있으며, 이는 사건 MON 87708에 대한 식물 이형접합을 나타내며 이에 대해 진단적이다. 사건 MON 87708에 대해 무효 (즉, 야생형)인 식물로부터 추출된 DNA로의 PCR 반응에서 3개 프라이머 및 2개 프로브가 함께 혼합된 경우, VIC(상표명)-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 PB10131 (서열 16)로부터의 형광 신호만 있으며, 이는 사건 MON 87708에 대해 무효, 즉 야생형인 식물을 나타내며 이에 대해 진단적이다. 이 방법에 유용한 조건의 예는 다음과 같다. 단계 1: 10 μl의 최종 부피에 대해 조정된 18 메그옴 물. 단계 2: 1X 최종 농도로의 5.0 μl의 2X 유니버설 마스터 믹스 (어플라이드 바이오시스템즈 목록 번호 4304437; dNTPs, 효소, 완충제). 단계 3: 1.0 μM의 최종 농도로의 0.5 μl의 접합성 프라이머 SQ20632, SQ20636, SQ20637 (각각 프라이머에 대해 20 μM의 농도로의 18 메그옴 물 중에 재현탁됨). 단계 4: 0.2 μM의 최종 농도로의 0.2 μl 6-FAM(상표명) 프로브 PB10130 (서열 15) (10 μM의 농도로의 18 메그옴 물 중에 재현탁됨). 단계 5: 0.2 μM의 최종 농도로의 0.2 μl VIC(상표명) 프로브 PB10131 (서열 16) (10 μM의 농도로의 18 메그옴 물 중에 재현탁됨). 단계 6: 1. 분석되어야 하는 잎 샘플 (물 중에 희석된 4-80 ng의 게놈 DNA); 2. 음성 대조군 (비-트랜스제닉 대두 DNA; 4 ng의 물 중에 희석됨); 3. 음성 물 대조군 (주형 없음; DNA가 재현탁된 용액); 4. 알려진 이형접합 사건으로부터의 양성 대조군 MON 87708 게놈 DNA (4 ng의 물 중에 희석됨); 5. 알려진 동형접합 사건으로부터의 4. 양성 대조군 MON 87708 게놈 DNA (4 ng의 물 중에 희석됨)를 포함하는 각각 하나를 갖는 각각 샘플에 대한 3.0 μl의 추출된 DNA (주형). 단계 7: 부드럽게 혼합한다. 단계 8: 어플라이드 바이오시스템즈 진앰프(등록상표) PCR 시스템 9700 (최대 속도에서 수행됨) 또는 엠제이 리서치 DNA 엔진 PTC-225 열순환기를 사용하는 경우의 열순환기 조건은 다음과 같다: 50℃에서 2분 동안 1개 주기; 95℃에서 10분 동안 1개 주기; (15초 동안 95℃ 이어서 1분 동안 64℃ (-1℃/주기)의 10개 주기; (15초 동안 95℃ 이어서 1분 동안 54℃)의 30개 주기; 임의의 추가의 10 내지 20개 주기 (15초 동안 95℃ 이어서 1분 동안 64℃ (-1℃/주기)는 종점 타크맨(등록상표) 분석 중에 더 분명한 집단 분리를 제공할 수 있음; 10℃에서 고정한 1개 주기.
실시예 4: 임의의 MON 87708 번식 활성에서의 사건 MON 87708의 확인
다음 실시예는 당업자가 대두 사건 MON 87708을 사용한 임의의 번식 활성의 자손 내의 MON 87708 사건을 어떻게 확인할 수 있는지를 기재한다.
DNA 사건 프라이머 쌍을 사용하여 사건 MON 87708에 대해 진단적인 앰플리콘을 생성한다. MON 87708에 대해 진단적인 앰플리콘은 서열 1 또는 서열 2 또는 서열 7 또는 서열 8로서 제공된 하나 이상의 접합부 서열을 포함한다. MON 87708에 대한 진단적 앰플리콘을 생성할 사건 프라이머 쌍은 측면 서열 및 삽입된 발현 카세트를 기반으로 한 프라이머 쌍을 포함한다. 서열 1이 발견되는 진단적 앰플리콘을 얻기 위해, 서열 3의 염기 1에서 1126까지를 기반으로 정방향 프라이머 분자를 설계하고, 삽입된 발현 카세트 DNA 서열 (서열 5의 위치 1에서 3003까지)을 기반으로 역방향 프라이머 분자를 설계할 것이며, 여기서 프라이머 분자는 서열 3 및 서열 5에 특이적으로 혼성화되는 충분한 길이의 인접한 뉴클레오티드이다. 서열 2가 발견되는 진단적 앰플리콘을 얻기 위해, 삽입된 발현 카세트 DNA 서열 (서열 5의 위치 1에서부터 3003까지)을 기반으로 정방향 프라이머 분자를 설계하고, 3' 측면 서열 (서열 4의 염기 131에서 1947까지)을 기반으로 역방향 프라이머 분자를 설계할 것이며, 여기서 프라이머 분자는 서열 4 및 서열 5에 특이적으로 혼성화되는 충분한 길이의 인접한 뉴클레오티드이다. 실시를 위해, 제한된 크기 범위, 예를 들면 100 내지 1000개의 염기의 앰플리콘을 생성하는 프라이머를 설계하여야 한다. 보다 작은 크기 (보다 짧은 폴리뉴클레오티드 길이)의 앰플리콘은 일반적으로 PCR 반응에서 보다 신뢰할 만하게 생성되고, 보다 짧은 주기 시간을 허용하며, 아가로스 겔 상에서 용이하게 분리 및 가시화되거나 종말점 타크맨(등록상표)-유사 검정에서의 사용에 용이하게 적용될 수 있다. 보다 작은 앰플리콘은 DNA 앰플리콘 검출 분야에 공지된 방법에 의해 생성 및 검출될 수 있다. 또한, 프라이머 쌍을 사용하여 생성된 앰플리콘은 백터 내로 클로닝, 증식, 단리 및 서열분석될 수 있거나, 당업계에 널리 확립된 방법으로 직접 서열분석될 수 있다. MON 87708에 대해 진단적인 앰플리콘 또는 그의 자손을 생성하기 위한 DNA 증폭 방법에 유용한 서열 3과 서열 5의 조합 또는 서열 4와 서열 5의 조합으로부터 유도된 임의의 프라이머 쌍은 본 발명의 한 측면이다. MON 87708 또는 그의 자손에 대해 진단적인 앰플리콘을 생성하기 위한 DNA 증폭 방법에 유용한, 서열 3의 11개 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 한 단리된 DNA 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자 또는 그의 상보체는 본 발명의 한 측면이다. MON 87708 또는 그의 자손에 대해 진단적인 앰플리콘을 생성하기 위한 DNA 증폭 방법에 유용한, 서열 4의 11개 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 한 단리된 DNA 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자 또는 그의 상보체는 본 발명의 한 측면이다. MON 87708 또는 그의 자손에 대해 진단적인 앰플리콘을 생성하기 위한 DNA 증폭 방법에 유용한, 서열 5의 11개 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 한 단리된 DNA 폴리뉴클레오티드 프라이머 분자 또는 그의 상보체는 본 발명의 한 측면이다.
이러한 분석을 위한 증폭 조건의 예는 실시예 3에 예시되어 있다. 그러나, 이들 방법의 임의의 변형 또는 MON 87708에 대해 진단적인 앰플리콘을 생성하는 MON 87708의 서열 3 또는 서열 4 또는 전이유전자 삽입에 함유된 유전적 요소의 DNA 서열 (서열 5)에 상동성이거나 상보적인 DNA 프라이머의 사용은 당업계 내에 속한다. 진단적 앰플리콘은 1개 이상의 전이유전자/게놈 접합부 DNA (서열 1 또는 서열 2 또는 서열 7 또는 서열 8) 또는 이의 실질적인 부분에 상동성이거나 상보적인 DNA 분자를 포함한다.
사건 MON 87708 식물 조직 샘플에 대한 분석은 사건 MON 87708으로부터의 양성 조직 대조군, 사건 MON 87708이 아닌 대두 식물로부터의 음성 대조군 (예를 들면, A3525 (이로 한정되지는 않음)), 및 대두 게놈 DNA를 함유하지 않는 음성 대조군을 포함하여야 한다. 내인성 대두 DNA 분자를 증폭시킬 프라이머 쌍은 DNA 증폭 조건에 대한 내부 대조군으로서의 역할을 할 것이다. 추가의 프라이머 서열은 DNA 증폭 방법의 당업자에 의해 서열 3, 서열 4 또는 서열 5로부터 선택될 수 있으며, 실시예 3에 나타낸 방법에 의해 앰플리콘을 생성하기 위한 조건은 상이할 수 있지만, 사건 MON 87708 DNA에 대해 진단적인 앰플리콘을 야기한다. 실시예 3의 방법을 변형하여 이들 DNA 프라이머 서열을 사용하는 것은 본 발명의 범주 내에 속한다. MON 87708에 대해 진단적인 서열 3, 서열 4 또는 서열 5로부터 유도된 1개 이상의 DNA 프라이머 서열에 의해 생성된 앰플리콘은 본 발명의 한 측면이다.
DNA 검출 키트는 서열 3, 서열 4 또는 서열 5로부터 유도된 충분한 길이의 인접한 뉴클레오티드의 1개 이상의 DNA 프라이머를 함유하며, DNA 증폭 방법에 사용될 때 MON 87708 또는 그의 자손에 대한 진단적 앰플리콘을 생성하고, 이는 본 발명의 한 측면이다. DNA 증폭 방법으로 시험시 MON 87708에 대해 진단적인 앰플리콘을 생성할 MON 87708 대두 식물, 식물의 일부분, 식물 세포, 종자 또는 제품은 본 발명의 한 측면이다. MON 87708 앰플리콘에 대한 검정은, 어플라이드 바이오시스템즈 진앰프(등록상표) PCR 시스템 9700 (최대 속도에서 수행됨) 또는 엠제이 리서치 DNA 엔진 PTC-225 열순환기, 또는 실시예 3에 나타낸 MON 87708에 대해 진단적인 앰플리콘을 생성하는데 사용될 수 있는 임의의 다른 증폭 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
상기 개시되고 하기 특허청구범위에 기재된 대두 사건 MON 87708 종자의 대표적인 샘플이 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (미국 20110 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801)에 기탁되었다. 이 기탁물에 대한 ATCC 등록 번호는 PTA-9670이다. 기탁물은 30년 또는 마지막 요청일 후 5년의 기간, 또는 특허 유효일 중 보다 긴 기간 동안 기탁기관에 유지될 것이며, 상기 기간 동안 필요에 따라 대체될 것이다.
본 발명의 원리가 예시 및 기재되어 있으므로, 본 발명이 상기 원리에 벗어나지 않으면서 배열 및 세부사항에서 변형될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명자들은 첨부된 특허청구범위의 취지 및 범주 내에 있는 모든 변형을 청구한다.
ATCC PTA-9670 20081219
서열목록 전자파일 첨부

Claims (30)

  1. 서열 1-8 및 그의 완전한 상보적인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, 서열 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  3. 제1항에 있어서, 서열 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  4. 제1항에 있어서, 서열 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  5. 제1항에 있어서, 서열 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  6. 제1항에 있어서, 서열 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  7. 제1항에 있어서, 서열 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  8. 제1항에 있어서, 서열 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  9. 제1항에 있어서, 서열 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  10. 제1항에 있어서, 서열 1 및 서열 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  11. 제1항에 있어서, 서열 3 및 서열 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  12. 제1항에 있어서, 서열 7 및 서열 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  13. 제1항에 있어서, 재조합 DNA 분자는, 트랜스제닉 대두 사건 MON 87708을 포함하는 종자의 대표적인 샘플이 ATCC PTA-9670으로 기탁된 상기 사건으로부터 유도된 것인 재조합 DNA 분자.
  14. 제1항에 있어서, 재조합 DNA 분자는 대두 식물, 대두 식물 세포, 대두 종자, 대두 식물의 일부분 또는 제품에 존재하는 것인 재조합 DNA 분자.
  15. 서열 6 또는 그의 완전한 상보적인 서열의 인접한 뉴클레오티드의 충분한 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 DNA 프라이머 또는 프로브는 사건 MON 87708에 대해 진단적이며, 상기 DNA 프라이머 또는 프로브는 엄격한 혼성화 조건하에 서열 1-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자와 혼성화하고, 엄격한 혼성화 조건하에 서열 1-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는 DNA 분자와 혼성화하지 않는 것인, DNA 프라이머 또는 프로브.
  16. 제1 DNA 분자 및 제1 DNA 분자와 상이한 제2 DNA 분자를 포함하는 DNA 분자의 쌍이며, 상기 제1 및 제2 DNA 분자는 각각 DNA 프라이머로서 기능하기 위해 서열 6 또는 그의 완전한 상보적인 서열의 인접한 뉴클레오티드의 충분한 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 DNA 프라이머는 사건 MON 87708로부터 유도된 DNA와 증폭 반응에서 함께 사용된 경우 샘플에서의 대두 사건 MON 87708 DNA에 대해 진단적인 앰플리콘을 생성하는 것인, DNA 분자의 쌍.
  17. a. 제15항의 DNA 프로브와 샘플을 접촉시키는 단계;
    b. 엄격한 혼성화 조건에 상기 샘플 및 상기 DNA 프로브를 적용시키는 단계; 및
    c. 상기 샘플에서의 DNA 분자에의 상기 DNA 프로브의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 DNA 분자에의 상기 DNA 프로브의 혼성화는 상기 샘플에서의 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 DNA 분자의 존재를 나타내는 것인,
    샘플에서의 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 DNA 분자의 존재의 검출 방법.
  18. a. 제16항의 DNA 분자의 쌍과 샘플을 접촉시키는 단계;
    b. 서열 1-8 및 그의 완전한 상보적인 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 DNA 앰플리콘을 생성하기 위해 충분한 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
    c. 상기 반응에서의 상기 DNA 앰플리콘의 존재를 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 반응에서의 상기 DNA 앰플리콘의 존재는 상기 샘플에서의 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 DNA 분자의 존재를 나타내는 것인,
    샘플에서의 대두 사건 MON 87708로부터 유도된 DNA 분자의 존재의 검출 방법.
  19. a. 제1 앰플리콘 및 제2 앰플리콘을 생성할 수 있는 프라이머 세트 및 프로브 세트와, 대두 DNA를 포함하는 샘플을 접촉시키는 단계;
    b. 상기 샘플, 프라이머 세트 및 프로브 세트로 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계;
    c. 상기 핵산 증폭 반응에서, 사건 MON 87708에 대해 진단적인 상기 제1 앰플리콘 및 사건 MON 87708을 포함하지 않는 천연 대두 게놈 DNA에 대해 진단적인 상기 제2 앰플리콘을 검출하는 단계; 및
    d. 상기 핵산 증폭 반응에서의 상기 제1 앰플리콘 및 상기 제2 앰플리콘의 존재 및/또는 부재를 분석하는 단계를 포함하며, 여기서 두 앰플리콘 모두의 존재는 상기 샘플이 사건 MON 87708에 대해 이형접합인 것을 나타내고, 상기 제1 앰플리콘 만의 존재는 상기 샘플이 사건 MON 87708에 대해 동형접합인 것을 나타내는 것인,
    사건 MON 87708을 포함하는 대두 식물 또는 종자의 접합성을 결정하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 프라이머 세트가 서열 12, 서열 13 및 서열 14를 포함하는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 프로브 세트가 서열 15 및 서열 16을 포함하는 것인 방법.
  22. DNA 프라이머의 쌍 또는 하나 이상의 DNA 프로브를 포함하는 DNA 검출 키트이며, 여기서 a) DNA 프라이머의 쌍은 서열 6, 또는 그의 완전한 상보적인 서열의 인접한 뉴클레오티드의 충분한 길이의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 DNA 분자를 포함하며, 여기서 DNA 프라이머의 쌍은 사건 MON 87708에 대해 진단적인 앰플리콘을 생성할 수 있으며, b) 하나 이상의 DNA 프로브가 사건 MON 87708에 대해 진단적인 것인, DNA 검출 키트.
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