ES2866126T3 - Evento transgénico de soja MON 87708 y procedimientos de uso del mismo - Google Patents

Evento transgénico de soja MON 87708 y procedimientos de uso del mismo Download PDF

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Abstract

Una molécula de ADN recombinante que comprende una molécula nucleotídica que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 7 y 8.

Description

DESCRIPCIÓN
Evento transgénico de soja MON 87708 y procedimientos de uso del mismo
Campodela invención
La memoria descriptiva se refiere al evento transgénico de Glycine max MON 87708. El evento presenta tolerancia al herbicida dicamba. La memoria descriptiva también se refiere a plantas, partes de plantas, semillas de plantas, células vegetales, productos agrícolas y procedimientos relacionados con el evento MON 87708 y proporciona moléculas nucleotídicas que son exclusivas para el evento y se crearon en conexión con la inserción de ADN transgénico en el genoma de una planta de Glycine max.
Antecedentesdelainvención
La soja (Glycine max) es un cultivo importante en muchas áreas del mundo y se han aplicado a este cultivo procedimientos de biotecnología para producir soja con rasgos convenientes. Uno de tales rasgos convenientes es la tolerancia a herbicidas. La expresión de un transgén de tolerancia a un herbicida en una planta puede conferir el rasgo deseable de tolerancia a un herbicida en la planta, pero la expresión del transgén puede estar influenciada por la ubicación cromosómica y el resultado genómico de la inserción del transgén. Por ejemplo, se ha observado en plantas que existe, a menudo, variación en el nivel y patrón de expresión transgénica entre eventos individuales que difieren en el sitio de inserción cromosómica del transgén, pero que por lo demás son idénticos. También pueden existir diferencias fenotípicas o agronómicas no deseables y/o deseables entre eventos. Debido a esto, a menudo es necesario producir y analizar una gran cantidad de eventos de transformación vegetal individuales para seleccionar un evento que tiene tanto el rasgo deseable como las características fenotípicas y agrícolas óptimas necesarias para tornarlo adecuado para fines comerciales. Dicha selección a menudo precisa ensayos de invernadero y de campo con muchos eventos en el transcurso de varios años, en varias ubicaciones y en una diversidad de condiciones, de modo que pueda recogerse una cantidad significativa de datos agronómicos, fenotípicos y moleculares. Los datos resultantes y las observaciones deben ser analizados después por equipos de científicos y agrónomos con el objetivo de seleccionar un evento comercialmente adecuado. Dicho evento, una vez seleccionado, puede emplearse después para la introgresión del rasgo deseable en otros acervos genéticos utilizando procedimientos de mejora genética vegetal y, así, producir varias variedades de cultivos distintas que contengan el rasgo deseable y estén adecuadamente adaptadas a condiciones locales específicas de cultivo.
Sumariodela invención
La invención proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende una molécula nucleotídica que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 7 y 8.
La invención proporciona además moléculas de ADN recombinante respectivas, en las que dicha molécula de ADN es un amplicón de diagnóstico para la presencia de ADN procedente de una planta, en la que se han depositado semillas representativas de la planta con el número de referencia de la ATCC pTA-9670.
Brevedescripcióndelos dibujos
La Figura 1 ilustra la organización del inserto transgénico en el genoma del evento de soja MON 87708; [A] corresponde a la posición relativa de la SEQ ID NO: 1, que son sesenta nucleótidos de la unión entre el a Dn genómico de la soja y la porción 5' del ADN del inserto transgénico; [A'] corresponde a la posición relativa de la SEQ ID NO: 7, que son cien nucleótidos de la unión entre el ADN genómico de la soja y la porción 5' del ADN del inserto transgénico; [B] corresponde a la posición relativa de la SEQ ID NO: 2, que son sesenta nucleótidos de la unión entre el ADN genómico de la soja y la porción 3' del ADN del inserto transgénico; [B'] corresponde a la posición relativa de la SEQ ID NO: 8, que son cien nucleótidos de la unión entre el ADN genómico de la soja y la porción 3' del ADN de inserto transgénico; [C] corresponde a la posición relativa de la SEQ ID NO: 3, que es la secuencia del genoma de la soja que flanquea el extremo 5' asignado/designado arbitrariamente del casete de expresión integrado en el genoma en el evento MON 87708; [D] corresponde a la posición relativa de la SEQ ID NO: 4, que es la secuencia del genoma de la soja que flanquea el extremo 3' asignado/designado arbitrariamente del casete de expresión integrado en el genoma en el evento MON 87708; [E] representa los diversos elementos que comprenden la SEQ ID NO: 5 y es la secuencia del casete de expresión insertado en el genoma del evento MON 87708 y [F] representa la secuencia contigua (proporcionada como la SEQ ID NO: 6) que comprende, según lo representado en la figura de izquierda a derecha, la s Eq ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 4, en que la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8 están incluidas, ya que estas secuencias están presentes en el genoma en el evento MON 87708.
Brevedescripcióndelassecuencias
La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de sesenta nucleótidos que representa la unión en 5' entre el ADN genómico de la soja y el casete de expresión transgénico integrado. La SEQ ID NO: 1 está posicionada en la SEQ ID NO: 6 en la posición nucleotídica 1097-1156.
La SEQ ID NO: 2 es una secuencia de sesenta nucleótidos que representa la unión en 3' entre el ADN genómico de la soja y el casete de expresión transgénico integrado. La SEQ ID NO: 2 está posicionada en la SEQ ID NO: 6 en la posición nucleotídica 4100-4159.
La s E q ID NO: 3 es la secuencia en 5' que flanquea el ADN insertado del evento de soja MON 87708 hasta e incluyendo una región de la inserción de ADN transgénico.
La SEQ ID NO: 4 es la secuencia en 3' que flanquea el ADN insertado del evento de soja MON 87708 hasta e incluyendo una región de inserción de ADN transgénico.
La SEQ ID NO: 5 es la secuencia del casete de expresión transgénico integrado.
La SEQ ID NO: 6 es la secuencia nucleotídica que representa el cóntigo de la secuencia en 5' que flanquea el ADN insertado del evento de soja MON 87708 (SEQ ID NO: 3), la secuencia del ADN insertado (SEQ ID NO: 5) y la secuencia en 3' que flanquea el ADN insertado del evento de soja MON 87708 (SEQ ID NO: 4) e incluye la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8.
La SEQ ID NO: 7 es una secuencia de cien nucleótidos que representa la unión en 5' entre el ADN genómico de la soja y el casete de expresión transgénico integrado.
La SEQ ID NO: 8 es una secuencia de cien nucleótidos que representa la unión en 3' entre el ADN genómico de la soja y el casete de expresión transgénico integrado.
La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de un cebador denominado Cebador SQ13570 y utilizado para identificar el evento de soja MON 87708. Es complementaria al casete de expresión insertado en la región cercana al borde en 3' de la inserción transgénica. Un amplicón de PCR producido a partir de un ensayo TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando la combinación de los cebadores SQ13570 y SQ13571 (SEQ ID n O : 10) es un resultado positivo para la presencia del evento MON 87708.
La SEQ ID NO: 10 es la secuencia de un cebador denominado Cebador SQ13571 y utilizado para identificar el evento de soja MON 87708. Es complementaria a una región en 3' que flanquea el casete de expresión insertado y cercana al borde de la inserción del ADN transgénico. Un amplicón de PCR producido a partir de un ensayo TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando la combinación de cebadores SQ13570 (SEQ ID NO: 9) y SQ13571 es un resultado positivo para la presencia del evento MON 87708.
La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de una sonda denominada Sonda PB4655 y utilizada para identificar el evento de soja MON 87708. Es complementaria a una región que abarca la unión en 3' del casete de expresión insertado y el ADN genómico. Esta sonda es un oligonucleótido sintético marcado con 6-FAM™. La liberación de una señal fluorescente en una reacción de amplificación utilizando los cebadores SQ13570 y SQ13571 (SEQ ID NO: 9-10) en combinación con la sonda marcada con 6-FAM™ PB4655 es diagnóstico del evento MON 87708 en un ensayo TAQMAN®.
La SEQ ID NO: 12 es la secuencia de un cebador denominado Cebador SQ20632 y utilizado para identificar la cigosis del evento MON 87708.
La SEQ ID NO: 13 es la secuencia de un cebador denominado Cebador SQ20636 y utilizado para identificar la cigosis del evento MON 87708 y de tipo silvestre de la soja.
La SEQ ID NO: 14 es la secuencia de un cebador denominado Cebador SQ20637 y utilizado para identificar la cigosis de tipo silvestre de la soja.
La SEQ ID NO: 15 es la secuencia de una sonda denominada Sonda PB10130 y utilizada para un ensayo de cigosis del evento MON 87708.
La SEQ ID NO: 16 es la secuencia de una sonda denominada Sonda PB10131 y utilizada para un ensayo de la cigosis de tipo silvestre de la soja.
Descripcióndetallada
Las siguientes definiciones y procedimientos se proporcionan para una mejor definición de la invención y para guiar a los expertos en la materia en la práctica de la invención. A menos que se indique otra cosa, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la materia pertinente.
La memoria descriptiva proporciona un evento de soja transgénico MON 87708 que presenta tolerancia comercialmente aceptable a aplicaciones del herbicida dicamba. El evento comprende una única inserción de ADN transgénico en el cromosoma/genoma del germoplasma de soja. Un "evento" se produce por: (i) transformación de una célula vegetal con una construcción de ácido nucleico que incluye un transgén de interés, (ii) regeneración de una población de plantas que es el resultado de la inserción del transgén en el genoma de la planta y (iii) selección de una planta en particular caracterizada por la inserción del transgén en una ubicación en particular en el genoma de la planta. El término "evento" se refiere al transformante original que incluye el transgén insertado en la ubicación particular en el genoma de la planta. El término "evento" se refiere además a la progenie del transformante que incluye el transgén insertado en la ubicación en particular en el genoma de la planta. Dicha progenie puede producirse mediante exogamia sexual entre el transformante, o su progenie, y otra planta. Dicha otra planta puede ser una planta transgénica que comprende el mismo transgén o un transgén distinto y/o una planta no transgénica, tal como una de una variedad distinta. Incluso después de retrocruzamiento repetido a un progenitor recurrente, el ADN insertado y ADN flanqueante del progenitor transformado está presente en la progenie del cruce en la misma ubicación genómica.
Como se usa en el presente documento, el término "soja" significa Glycine max e incluye todas las variedades vegetales que pueden cruzarse con la soja, incluyendo especies de soja silvestres, así como las plantas que pertenecen a Glycine que permiten la reproducción entre especies.
El término "evento" se refiere además a una molécula de ADN del transformante original que comprende el ADN insertado y el ADN genómico de la soja flanqueante inmediatamente adyacente a cualquiera de los lados del ADN insertado. Esta molécula de ADN se crea mediante el acto de insertar el ADN transgénico en el genoma de la planta de soja, es decir, mediante el acto de transformación. Por lo tanto, esta molécula de ADN comprende una secuencia nucleotídica que es específica para el evento y que es exclusiva para el genoma de la planta de soja en la cual se ha insertado el ADN transgénico, en el sentido de que esta secuencia nucleotídica contiene la secuencia tanto de una región en particular de ADN genómico de la soja como del inserto de ADN transgénico. La disposición del ADN insertado en el evento de soja MON 87708 con respecto al ADN genómico de la planta de soja circundante es, por lo tanto, específica y exclusiva para el evento de soja MON 87708. Esta molécula de ADN es también una parte integral del cromosoma de la soja del evento MON 87708 y, como tal, es estática en la planta y puede pasarse a la progenie de la planta.
El evento MON 87708 comprende un transgén que confiere tolerancia a aplicaciones del herbicida dicamba a la planta de soja. "Dicamba" se refiere al ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico. Dicamba es un herbicida de auxina sintética útil para controlar malas hierbas de hoja ancha. Se transformaron plantas de soja con dicamba mono-oxigenasa (DMO), una enzima clonada de Stenotrophomonas maltophilia, la cual se encuentra comúnmente en la rizosfera del suelo. Dicamba mono-oxigenasa es una enzima que cataliza la desactivación de dicamba por medio de una reacción de O-desmetilación al compuesto no herbicida ácido 3,5-diclorosalicílico. En algunas áreas del mundo, las semillas de especies de malas hierbas tóxicas pueden contaminar las semillas de soja cosechadas, lo que puede afectar la salud y nutrición de los animales alimentados con los productos básicos de soja contaminados. Estas plantas pueden eliminarse de un campo de soja mediante el tratamiento con un herbicida dicamba. Los miembros de este grupo de malas hierbas tóxicas incluyen Cardaría spp, Heliotropium spp, Centaurea spp., Senecio spp., Crotalaria spp., Solanum spp., Xanthium spp., Amsinckia spp., Cassia spp., Sesbania spp., Datura spp., Ricinus spp., Argemone spp., Corchorus spp., Impomoea spp. y Echium spp.
Como se usa en el presente documento, el término "recombinante" se refiere a una forma de ADN y/o de proteína, y/o a un organismo que no se encuentra normalmente en la naturaleza, y como tal se creó por intervención humana. Dicha intervención humana puede producir una molécula de ADN recombinante y/o una planta recombinante. Como se usa en el presente documento, una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que comprende una combinación de moléculas de ADN que no aparecerían naturalmente en forma conjunta y es el resultado de la intervención humana, por ejemplo, una molécula de ADN que está compuesta por una combinación de al menos dos moléculas de ADN heterólogas entre sí, y/o una molécula de ADN que se sintetiza de forma artificial y comprende una secuencia polinucleotídica que se desvía de la secuencia polinucleotídica que existiría normalmente en la naturaleza, y/o una molécula de ADN que comprende un transgén artificialmente incorporado en un ADN genómico de la célula hospedadora y el ADN flanqueante asociado del genoma de la célula hospedadora. Un ejemplo de una molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN descrita en el presente documento que es el resultado de la inserción del transgén en el ADN genómico de la soja, lo que puede finalmente dar como resultado la expresión de una molécula de ARN y/o proteica recombinante en ese organismo. Como se usa en el presente documento, una "planta recombinante" es una planta que normalmente no existiría en la naturaleza, es el resultado de la intervención humana y contiene un transgén y/o una molécula de ADN heterólogo incorporada en su genoma. Como resultado de dicha alteración genómica, la planta recombinante es inequívocamente distinta de la planta de tipo silvestre relacionada. Un ejemplo de una planta recombinante es una planta de soja descrita en el presente documento como Evento MON 87708.
Como se usa en el presente documento, el término "transgén" se refiere a una molécula nucleotídica incorporada artificialmente en un genoma de la célula hospedadora. Dicho transgén puede ser heterólogo para la célula hospedadora. La expresión "planta transgénica" se refiere a una planta que comprende tal transgén.
Como se usa en el presente documento, el término "heterólogo" se refiere a una primera molécula no encontrada normalmente en combinación con una segunda molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una molécula puede proceder de una primera especie y estar insertada en el genoma de una segunda especie. La molécula sería, por tanto, heteróloga para el hospedadory se incorporaría artificialmente en el genoma de una célula hospedadora.
Como se usa en el presente documento, el término "quimérico" se refiere a una molécula de ADN individual producida mediante la fusión de una primera molécula de ADN con una segunda molécula de ADN, en que ni la primera ni la segunda molécula de ADN se encontrarían normalmente en esa configuración, es decir, fusionada a la otra. La molécula de ADN quimérica es, por tanto, una nueva molécula de ADN que normalmente no se encuentra en la naturaleza.
La memoria descriptiva proporciona moléculas de ADN y sus correspondientes secuencias nucleotídicas. Como se usa en el presente documento, el término "ADN", "molécula de ADN", "molécula nucleotídica" se refiere a una molécula de ADN de origen genómico o sintético, es decir, un polímero de bases de desoxirribonucleótidos o una molécula polinucleotídica, leído desde el extremo 5' (corriente arriba) hasta el extremo 3' (corriente abajo). Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de ADN", "secuencia nucleotídica" o "secuencia polinucleotídica" se refiere a la secuencia nucleotídica de una molécula de ADN. La nomenclatura utilizada en el presente documento es la requerida por el Título 37 del United States Code of Federal Regulations § 1.822 (Código de los Estados Unidos de América de Reglamentos Federales) y expuesta en las tablas de la Norma ST.25 de la OMPI (1998), Apéndice 2, Tablas 1 y 3. Por convención, las secuencias nucleotídicas proporcionadas como las SEQ ID NO: 1-8 y fragmentos de las mismas se desvelan con referencia a solamente una cadena de las dos cadenas de secuencias nucleotídicas complementarias. Como consecuencia, las secuencias complementarias (es decir, las secuencias de la cadena complementaria), también denominadas en la técnica secuencias complementarias inversas, están dentro del ámbito de la invención y se pretende expresamente que estén dentro del ámbito descrito en le presente documento.
La secuencia nucleotídica correspondiente a la secuencia nucleotídica completa del ADN transgénico insertado y los segmentos sustanciales del a D n genómico de la soja que flanquean cualquiera de los extremos del ADN transgénico insertado se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 6. Una subsección de esta es el ADN transgénico insertado proporcionado como la SEQ ID NO: 5. La secuencia nucleotídica del ADN genómico de la soja físicamente ligado por ligación por enlace fosfodiéster a, y por lo tanto que flanquea, el extremo 5' del ADN transgénico insertado, se expone como se muestra en la SEQ ID NO: 3. La secuencia nucleotídica del ADN genómico de la soja físicamente ligado mediante ligación por enlace fosfodiéster a y, por lo tanto, que flanquea el extremo 3' del ADN transgénico insertado se expone como se muestra en la SEQ ID NO: 4.
El evento de soja MON 87708 comprende, además, dos regiones, una que abarca la ubicación 5' y una que abarca la ubicación 3' donde el ADN transgénico se inserta en el ADN genómico, denominadas respectivamente en el presente documento la unión 5' y 3'. Una "secuencia de unión" o "región de unión" se refiere a la secuencia de ADN y/o molécula de ADN correspondiente que abarca el ADN transgénico insertado y el ADN genómico flanqueante adyacente. Las secuencias de unión pueden representarse arbitrariamente por las dos secuencias de 60 nucleótidos proporcionadas como la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, representando, cada una, 30 nucleótidos del ADN genómico flanqueante adyacente a, y contiguo con, 30 nucleótidos del ADN insertado. Alternativamente, las secuencias de unión pueden representarse arbitrariamente por las dos secuencias de 100 nucleótidos proporcionadas como la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, representando, cada una, 50 nucleótidos del ADN genómico flanqueante adyacente a, y contiguo con, 50 nucleótidos del ADN insertado. Estos nucleótidos están conectados por ligación fosfodiéster y en el evento de soja MON 87708 están presentes como parte del genoma. En la soja, la identificación de una o más de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8 en una muestra procedente de una planta, semilla o parte de planta de soja es determinante de que el ADN se obtuvo del evento de soja MON 87708 y es diagnóstico de la presencia en una muestra de ADN del evento de soja MON 87708. La invención, por tanto, proporciona una molécula de ADN que contiene al menos la secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 7 y/o la SEQ ID NO: 8. Cualquier segmento de ADN procedente del evento de soja transgénico MON 87708 que sea suficiente para incluir la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID N o : 2, la SEQ ID NO: 7 y/o la SEQ ID NO: 8 está dentro del ámbito de la invención. Además, cualquier polinucleótido que comprende una secuencia complementaria con cualquiera de las secuencias descritas dentro de este párrafo está dentro del ámbito de la invención. La Figura 1 ilustra la disposición física de las SEQ ID NO: 1-5 y 7-8 con respecto a la SEQ ID NO: 6 dispuesta de 5' a 3'.
La memoria descriptiva proporciona moléculas de ADN de ejemplo que pueden utilizarse ya sea como cebadores o sondas para el diagnóstico de la presencia de ADN procedente del evento de planta de soja MON 87708 en una muestra. Dichos cebadores o sondas son específicos para una secuencia de ácido nucleico diana y como tales son útiles para la identificación de la secuencia de ácido nucleico del evento de soja MON 87708 mediante los procedimientos descritos en el presente documento.
Un "cebador" es, normalmente, un polinucleótido aislado, altamente purificado que está diseñado para su uso en procedimientos de hibridación y apareamiento específicos que implican la amplificación térmica. Puede utilizarse un par de cebadores con ADN de molde, tal como una muestra de ADN genómico de soja, en una amplificación térmica, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para producir un amplicón, en que el amplicón producido a partir de dicha reacción tendría una secuencia de ADN correspondiente a la secuencia del ADN molde situada entre los dos sitios en que los cebadores hibridaron con el molde. Como se usa en el presente documento, un "amplicón" es un trozo o fragmento de ADN que se ha sinterizado utilizando técnicas de amplificación. Un amplicón de la invención comprende al menos la s E q ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 7 y/o la SEQ ID NO: 8. Un cebador está normalmente diseñado para hibridar con una cadena de ADN diana complementaria para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN diana, y la presencia del cebador es un punto de reconocimiento por parte de una polimerasa para comenzar la extensión del cebador (es decir, la polimerización de nucleótidos adicionales en una molécula nucleotídica de alargamiento) utilizando como un molde la cadena de ADN diana. Pares de cebadores, como se usa en la invención, pretende hacer referencia al uso de dos cebadores que se unen a cadenas opuestas de un segmento de nucleótidos bicatenario, para amplificar linealmente el segmento de polinucleótido entre las posiciones que son la diana para la unión de los miembros individuales del par de cebadores, normalmente en una reacción de amplificación térmica u otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos convencionales. Las moléculas de ADN de ejemplo útiles como cebadores se proporcionan como la SEQ ID NO: 9-10. El par de cebadores proporcionado como la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10 son útiles como una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN que es distinta de la primera molécula de ADN, y ambas tienen una longitud suficiente de nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID n O : 6 para actuar como cebadores de ADN que, cuando se utilizan juntos en una reacción de amplificación térmica con ADN de molde precedente del evento de soja MON 87708, producen un amplicón que comprende la SEQ ID NO: 2.
Una "sonda" es un ácido nucleico aislado que es complementario a una cadena de un ácido nucleico diana. Las sondas de acuerdo con la invención incluyen no solo ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos sino también poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN diana y la detección de dicha unión puede ser útil para diagnosticar, discriminar, determinar o confirmar la presencia de la secuencia de ADN diana en una muestra en particular. Una sonda puede estar unida a una molécula informadora o marcador detectable convencional, por ejemplo, un isótopo radioactivo, un ligando, un agente quimiluminiscente o una enzima. Una molécula de ADN de ejemplo útil como sonda se proporciona como la SEQ ID NO: 11.
Las sondas y cebadores pueden tener identidad de secuencia completa con la secuencia diana, si bien pueden diseñarse mediante procedimientos convencionales cebadores y sondas que difieren de la secuencia diana que conservan la capacidad de hibridar preferentemente con las secuencias diana. Para que una molécula de ácido nucleico funcione como un cebador o sonda, necesita solo ser suficientemente complementaria en secuencia para poder formar una estructura bicatenaria estable en las concentraciones de disolvente y de sal particulares empleadas. Para identificar la presencia de ADN transgénico procedente del evento de soja MON 87708 en una muestra puede utilizarse cualquier procedimiento de hibridación o amplificación de ácidos nucleicos convencional. Las sondas y cebadores tienen en general al menos aproximadamente 11 nucleótidos, al menos aproximadamente 18 nucleótidos, al menos aproximadamente 24 nucleótidos o al menos aproximadamente 30 nucleótidos o más de longitud. Dichas sondas y cebadores hibridan específicamente con una secuencia de ADN diana en condiciones de hibridación rigurosas. Las condiciones de rigurosidad convencionales se describen en Sambrook y col., 1989 y en Haymes y col., en: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Como se usa en el presente documento, dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridar específicamente entre sí, si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico bicatenaria, antiparalela. Una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si presentan complementariedad completa. Como se usa en el presente documento, las moléculas presentan "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario a un nucleótido de la otra. Dos moléculas son "mínimamente complementarias" si pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitirles permanecer apareadas entre sí en, al menos, condiciones "de baja rigurosidad" convencionales. De manera similar, las moléculas son "complementarias" si pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitirles permanecer apareadas entre sí en condiciones de "alta rigurosidad" convencionales. Por lo tanto, se permiten desviaciones de la complementariedad completa, siempre que tales desviaciones no excluyan por completo la capacidad de las moléculas para formar una estructura bicatenaria.
Como se usa en el presente documento, el término "aislado" se refiere a al menos separar parcialmente una molécula de otras moléculas normalmente asociadas con la misma en su estado nativo o natural. En una realización, el término "aislado" se refiere a una molécula de ADN que se separa al menos parcialmente de los ácidos nucleicos que normalmente flanquean la molécula de ADN en su estado nativo o natural. Por tanto, las moléculas de ADN fusionadas a secuencias reguladoras o codificantes con las cuales no están normalmente asociadas, por ejemplo, como resultado de técnicas recombinantes, se consideran aisladas en la presente invención. Dichas moléculas se consideran aisladas incluso cuando están integradas en el cromosoma de una célula hospedadora o presentes en una solución de ácido nucleico con otras moléculas de ADN.
Para aislar y manipular una molécula de ADN, o un fragmento de la misma, desvelada en el presente documento puede emplearse cualquier cantidad de procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, puede utilizarse la tecnología de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para amplificar una molécula de ADN de partida en particular y/o para producir variantes de la molécula original. También pueden obtenerse moléculas de ADN o un fragmento de las mismas mediante otras técnicas, tales como sintetizando directamente el fragmento por medios químicos, como es práctica común, utilizando un sintetizador de oligonucleótidos automatizado.
Las moléculas de ADN y las secuencias de nucleótidos correspondientes proporcionadas en el presente documento son, por lo tanto, útiles para, entre otras cosas, identificar el evento de soja MON 87708, seleccionar variedades vegetales o híbridos que comprendan el evento de soja MON 87708, detectar la presencia de ADN procedente del evento de soja transgénico m On 87708 en una muestra y controlar muestras en cuanto a la presencia y/o ausencia del evento de soja MON 87708 o partes de planta procedentes del evento de soja MON 87708.
La invención proporciona plantas, progenie, semillas, células vegetales, partes de planta (tales como polen, óvulo, vaina, tejido floral, tejido radicular, tejido de tallo y tejido foliar) y productos básicos de soja. Estas plantas, progenie, semillas, células vegetales, partes de planta y productos básicos contienen una cantidad detectable de un polinucleótido de la invención, es decir, tal como un polinucleótido que tiene al menos una de las secuencias proporcionadas como las SEQ ID NO: 1-8. Las plantas, progenie, semillas, células vegetales y partes de planta de la invención también pueden contener uno o más transgenes adicionales. Dicho transgén puede ser cualquier secuencia nucleotídica que codifique una proteína o molécula de ARN que confiera una rasgo deseable incluyendo, pero sin limitación, resistencia aumentada a insectos, eficacia en el uso del agua aumentada, rendimiento aumentado, resistencia a la sequía aumentada, calidad de semilla aumentada, calidad nutritiva mejorada y/o tolerancia a herbicidas aumentada, en que el rasgo deseable se mide con respecto a una planta de soja que carece de tal transgén adicional.
La memoria descriptiva proporciona plantas, progenie, semillas, células vegetales y partes de planta de soja tales como polen, óvulo, vaina, flor, tejido radicular o de tallo, y hojas procedentes de un evento de planta de soja transgénico MON 87708. Una muestra representativa de semilla del evento de soja MON 87708 se ha depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest con el fin de hacer posible la invención. El repositorio seleccionado para recibir el depósito es la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, forma siglada de American Type Culture Collection) que tiene un domicilio en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia USA, Código Postal 20110. El repositorio de la ATCC ha asignado el N.° de referencia PTA-9670 a la semilla del evento MON 87708.
La memoria descriptiva proporciona un microorganismo que comprende una molécula de ADN que tiene la SEQ ID NO: 1 y la SEQ Id nO: 2 presente en su genoma. Un ejemplo de tal microorganismo es una célula vegetal transgénica. Los microorganismos, tales como una célula vegetal, son útiles en muchas aplicaciones industriales, incluyendo (i) su uso como herramienta de investigación para indagación científica o investigación industrial; (ii) su uso en cultivo para producir productos de carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos o proteicos endógenos o recombinantes o moléculas pequeñas que pueden utilizarse para la posterior investigación científica o como productos industriales y (iii) su uso con técnicas modernas de cultivo de tejidos vegetales para producir plantas o cultivos de tejidos vegetales transgénicos que después puedan utilizarse para investigación o producción agrícola. La producción y el uso de microorganismos tales como células vegetales transgénicas utilizan técnicas microbiológicas modernas e intervención humana para producir un microorganismo exclusivo artificial. En este procedimiento, el ADN recombinante se inserta en el genoma de una célula vegetal para crear una célula vegetal transgénica que está separada y es exclusiva, a partir de células vegetales de origen natural. Después, esta célula vegetal transgénica puede cultivarse en forma muy parecida a las células bacterianas y de levadura utilizando técnicas modernas de microbiología, y pueden existir en un estado unicelular, indiferenciado. La nueva composición genética de la célula vegetal y el fenotipo es un efecto técnico creado por la integración del ADN heterólogo en el genoma de la célula. Otro aspecto es un procedimiento de uso de un microorganismo. Los procedimientos de uso de microorganismos, tales como células vegetales transgénicas, incluyen (i) procedimientos para producir células transgénicas integrando ADN recombinante en el genoma de la célula y después utilizando esta célula para obtener células adicionales que posean el mismo ADN heterólogo; (ii) procedimientos de cultivo de células que contienen ADN recombinante utilizando técnicas modernas de microbiología; (iii) procedimientos para producir y purificar productos de carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos o proteicos endógenos o recombinantes a partir de células cultivadas; y (iv) procedimientos de uso de técnicas modernas de cultivo de tejidos vegetales con células vegetales transgénicas para producir plantas transgénicas o cultivos de tejido vegetales transgénicos.
Las plantas descritas en el presente documento pueden transmitir el ADN del evento, incluyendo el transgén, a la progenie. Como se usa en el presente documento, "progenie" incluye cualquier planta, semilla, célula vegetal y/o parte de planta regenerable que comprenda al a Dn del evento procedente de una planta ancestro y/o un polinucleótido que tenga al menos una de las secuencias proporcionadas como la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. Las plantas, progenie y semillas pueden ser homocigóticas o heterocigóticas para el transgén. La progenie puede cultivarse a partir de semillas producidas mediante una planta con el evento de soja MON 87708 y/o a partir de semillas producidas por una planta fertilizada con polen de una planta con el evento de soja MON 87708.
Las plantas progenie pueden autopolinizarse (también conocido como "autofecundación") para generar una línea de mejora génica verdadera de plantas, es decir, plantas homocigóticas para el transgén. La autofecundación de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigóticas para ambos genes exógenos añadidos.
Alternativamente, las plantas progenie pueden cruzarse por cruzamiento exogámico, por ejemplo, cruzarse con otra planta no relacionada, para producir una semilla o planta varietal o híbrida. La otra planta no relacionada puede ser transgénica o no transgénica. Una semilla o planta varietal o híbrida puede, por tanto, obtenerse por cruzamiento de un primer progenitor que carece del ADN específico y exclusivo del evento de soja MON 87708 con un segundo progenitor que comprende el evento de soja MON 87708, dando como resultado un híbrido que comprende el ADN específico y exclusivo del evento de soja MON 87708. Cada progenitor puede ser un híbrido o un endógamo/varietal, siempre y cuando el cruzamiento o la reproducción de como resultado una planta o semilla de la invención, es decir, una semilla que tiene al menos un alelo que contiene el ADN exclusivo y específico del evento de soja MON 87708 y/o la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. Por tanto, dos plantas transgénicas distintas pueden aparearse para producir una descendencia híbrida que contienen dos genes exógenos, añadidos, de segregación independiente. Por ejemplo, la soja tolerante a dicamba MON 87708 puede cruzarse con otra planta de soja transgénica para producir una planta que tenga las características de ambos progenitores transgénicos. Un ejemplo de esto sería un cruce de la soja tolerante a dicamba MON 87708 con una planta que tiene uno o más rasgos adicionales tales como tolerancia a un herbicida (por ejemplo, evento de soja 40-3-2 o evento de soja MON89788 (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 20060282915)), control de insectos (por ejemplo, evento de soja MON87701 (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 20090130071)) y/u otros rasgos deseables (por ejemplo, composición oleosa potenciada tal como el evento de soja MON87769 (Publicación de Patente PCT WO2009102873)), dando como resultado una planta progenie o semilla que es tolerante a dicamba y tiene uno o más rasgos adicionales. Los herbicidas para los cuales se ha demostrado tolerancia de plantas transgénicas y para los cuales se puede aplicar el procedimiento de la invención, incluyen, pero sin limitación: glifosato, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinilo, delapon, ciclohexanodiona, inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa y herbicidas de isoxasflutol. Las moléculas nucleotídicas que codifican proteínas implicadas en la tolerancia a herbicidas son conocidas en la técnica e incluyen, pero sin limitación, una molécula nucleotídica que codifica: 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) tolerante al glifosato (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.627.061; 5.633.435; 6.040.497; 5.094.945; 5.804.425; 6.248.876; 7.183.110; documento RE39.247); la glifosato oxidorreductasa (GOX) (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5.776.760); glifosato-nacetiltransferasa (GAT); una acetolactato sintasa (ALS, también conocida como acetohidroxiácido sintasa (AHAS)) tolerante a herbicidas para tolerancia a sulfonilureas, imidazolinonas, triazolopirimidinas, pirimidinil oxibenzoatos, sulfonilamino carbonil triazolinonas y/o heteroariléteres; una acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa) tolerante a herbicidas o R-2,4-diclorofenoxipropionato dioxigenasa (rdpA) para tolerancia a un ariloxifenoxipropionato (AOPP) (tal como haloxifop, quizalofop, diclorofop y diclofop); una proteína de destoxificación tal como una 2,4-D dioxigenasa (tfdA), R-2,4-diclorofenoxipropionato dioxigenasa (rdpA), ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD) y/o S-2,4-diclorprop dioxigenasa (sdpA) para tolerancia a herbicidas de auxina sintética; una bromoxinilo nitrilasa (Bxn) para tolerancia a Bromoxinilo (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 4.810.648); una fitoeno desaturasa (crtI) para tolerancia a norflurazón; la resistencia a bialafos (bar) o la proteína fosfinotricina acetiltransferasa (PAT) (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 5.646.024 y 5.276.268) para tolerancia a glufosinato y bialafos; y una proteína para tolerancia al herbicida tricetona (mezotriona, tembotriona, topromezona, isoxazol) tal como 4-hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa (HPPD) tolerante, un citocromo P450 destoxificante o un desvío de la ruta de HPPD tal como Artbrobacter globiformis HPP oxidasa (HPPO) y Pseudomonas acidovorans 4-HPA 1-hidroxilasa (HPAH) y NADH oxidorreductasa (HPAC).
El retrocruzamiento a una planta parental y el cruzamiento exogámico con una planta no transgénica también se contemplan, como lo es la propagación vegetativa. Las descripciones de otros procedimientos de mejora génica que se utilizan comúnmente para distintos rasgos y cultivos pueden encontrarse en una de diversas referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).
La memoria descriptiva proporciona una parte de planta que procede del evento de soja MON 87708. Como se usa en el presente documento, una "parte de planta" se refiere a cualquier parte de una planta que está compuesta por material procedente de una planta con el evento de soja MON 87708. Las partes de planta incluyen, pero sin limitación, polen, óvulo, vaina, flor, tejido radicular o de tallo, fibras y hojas. Las partes de planta pueden ser viables, no viables, regenerables y/o no regenerables.
La invención proporciona un producto básico que se obtiene del evento de soja MON 87708. Como se usa en el presente documento, un "producto básico" se refiere a cualquier composición o producto que está compuesto por material procedente de una planta, semilla, célula vegetal o parte de planta con el evento de soja MON 87708. Los productos básicos pueden venderse a los consumidores y pueden ser viables o no viables. Los productos básicos no viables, semillas y granos no viables; semillas procesadas, partes de semillas y partes de planta; tejido vegetal deshidratado, tejido vegetal congelado y tejido vegetal procesado; semillas y partes de planta procesadas para piensos para el consumo de animales terrestres y/o acuáticos, aceite, sémola, harina, copos, salvado, fibra, leche, queso, papel, nata, vino y cualquier otro alimento para consumo humano; y biomasas y productos combustibles. Los productos básicos viables incluyen, pero sin limitación, semillas y células vegetales. El evento de soja MON 87708 puede, por tanto, utilizarse para fabricar cualquier producto básico normalmente obtenido de la soja. Cualquier producto básico de ese tipo que se obtiene del evento de soja MON 87708 puede contener al menos una cantidad detectable del ADN específico y exclusivo correspondiente al evento de soja MON 87708 y puede contener específicamente una cantidad detectable de un polinucleótido que contiene al menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. Puede utilizarse cualquier procedimiento convencional de detección para moléculas nucleotídicas, incluyendo procedimientos de detección desvelados en el presente documento. Se describe un producto básico si hay alguna cantidad detectable de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 en el producto básico.
Las plantas, progenie, semillas, células vegetales, partes de planta (tales como polen, óvulo, vaina, flor, tejido radicular o de tallo y hojas) y los productos básicos son, por lo tanto, útiles para, entre otras cosas, cultivar plantas para producir semilla y/o partes de planta del evento de soja MON 87708 para fines agrícolas, producir progenie del evento de soja MON 87708 para mejora génica vegetal e investigación, el uso con técnicas microbiológicas para aplicaciones industriales y de investigación, y la venta a consumidores.
La memoria descriptiva proporciona procedimientos para controlar malas hierbas y procedimientos para producir plantas utilizando el herbicida dicamba y el evento de soja MON 87708. Se proporciona un procedimiento para controlar malas hierbas en un campo y consiste en plantar plantas varietales o híbridas del evento de soja MON 87708 en un campo y aplicar una dosis eficaz desde un punto de vista herbicida de dicamba al campo para controlar malas hierbas en el campo sin lesionar a las plantas MON 87708. Dicha aplicación del herbicida dicamba puede ser preemergencia, es decir, en cualquier momento después de que la semilla MON 87708 se planta y antes de que emerjan las plantas MON 87708, o posemergencia, es decir, en cualquier momento después de que emerjan las plantas MON 87708. Además, se proporciona otro procedimiento para controlar malas hierbas en un campo y consiste en aplicar una dosis eficaz del herbicida dicamba para controlar malas hierbas en un campo y después plantar el evento de soja MON 87708 en el campo. Dicha aplicación del herbicida dicamba sería preplantado, es decir, antes de plantar la semilla MON 87708, y podría realizarse en cualquier momento preplantado incluyendo aproximadamente 14 días preplantado a aproximadamente 1 día preplantado. La memoria descriptiva también proporciona un procedimiento para producir una semilla de soja esencialmente exenta de las semillas de especies de malas hierbas tóxicas plantando semillas de una variedad de soja tolerante a dicamba MON 87708 en un campo, aplicando una dosis eficaz posemergencia de herbicida dicamba suficiente para destruir las especies de malas hierbas tóxicas en el campo y cosechando la semilla del campo. Una dosis eficaz desde el punto de vista herbicida de dicamba para su uso en el campo debería consistir en un intervalo de aproximadamente 0,0056 kilogramos por hectárea a aproximadamente 8,98 kilogramos de dicamba por hectárea durante una temporada decultivo. Pueden utilizarse múltiples aplicaciones de dicamba durante una temporada de cultivo, por ejemplo, dos aplicaciones (tal como una aplicación preplantado y una aplicación posemergencia, o una aplicación preemergencia y una aplicación posemergencia) o tres aplicaciones (tales como una aplicación preplantado, una aplicación preemergencia y una aplicación posemergencia).
Se proporcionan procedimientos para producir una planta de soja tolerante a un herbicida que comprende las secuencias de ADN específicas y exclusivas para el evento transgénico MON 87708. Las plantas transgénicas utilizadas en estos procedimientos pueden ser homocigóticas o heterocigóticas para el transgén. Las plantas progenie producidas mediante estos procedimientos pueden ser plantas varietales o híbridas; pueden cultivarse a partir de semillas producidas por una planta con el evento de soja MON 87708 y/o a partir de semillas producidas por una planta fertilizada con polen procedente de una planta con el evento de soja MON 87708; y pueden ser homocigóticas o heterocigóticas para el transgén. Las plantas progenie pueden posteriormente autopolinizarse para generar una línea reproductiva verdadera de plantas, es decir, plantas homocigóticas para el transgén, o alternativamente pueden cruzarse exogámicamente, por ejemplo, reproducirse con otra planta no relacionada, para producir una semilla o planta varietal o híbrida.
Una planta de soja que tolera la aplicación del herbicida dicamba puede producirse por cruzamiento sexual de una planta con el evento MON 87708 que comprende una molécula nucleotídica que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 con otra planta de soja y de ese modo producir la semilla, que después se cultiva para dar lugar a plantas progenie. Estas plantas progenie tratarse después con el herbicida dicamba para seleccionar plantas progenie que sean tolerantes al herbicida dicamba. Alternativamente, estas plantas progenie pueden analizarse utilizando procedimientos de diagnóstico para seleccionar plantas progenie que contengan el ADN del evento MON 87708. La otra planta utilizada en el cruzamiento puede ser o no tolerante al herbicida dicamba y puede ser o no transgénica. La planta progenie y/o semilla producida puede ser una semilla varietal o híbrida. En la práctica de este procedimiento, la etapa de cruzar sexualmente una planta con otra planta, es decir, polinización cruzada, puede lograrse o facilitarse mediante la intervención humana, por ejemplo: por manos humanas que recogen el polen de una planta y ponen en contacto este polen con el estilo o estigma de una segunda planta; por manos y/o acciones humanas que retiran, destruyen o cubren el estambre o las anteras de una planta (por ejemplo, por despenachado o por aplicación de un gametocida químico) de modo que se impida la autopolinización natural y para que se produzca la fertilización debería tener lugar la polinización cruzada; mediante colocación humana de insectos polinizadores en una posición para la "polinización dirigida" (por ejemplo, colocando colmenas en huertas o campos o encerrando a las plantas con insectos polinizadores); por apertura o eliminación por un ser humano de partes de la flor para permitir la colocación o contacto de polen extraño en el estilo o el estigma (por ejemplo, en soja que tiene naturalmente flores que dificultan o impiden la polinización cruzada, haciéndolos autopolinizadores naturalmente obligados sin intervención humana); mediante colocación selectiva de plantas (por ejemplo, plantado intencional de plantas en proximidad de polinización) y/o mediante la aplicación de productos químicos para provocar la floración o para fomentar la receptividad (del estigma para el polen).
Una planta de soja que tolera la aplicación del herbicida dicamba puede producirse por autofecundación de una planta con el evento MON 87708 que comprende una molécula nucleotídica que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 y de ese modo producir la semilla, la cual se cultiva después para dar lugar a plantas progenie. Después, estas plantas progenie pueden tratarse con el herbicida dicamba para seleccionar plantas progenie que son tolerantes al herbicida dicamba. Alternativamente, estas plantas progenie pueden analizarse utilizando procedimientos de diagnóstico para seleccionar plantas progenie que contengan el ADN del evento MON 87708. Al poner en práctica este procedimiento, la etapa de cruzar sexualmente una planta consigo misma, es decir, autopolinización o autofecundación, puede lograrse o facilitarse por intervención humana, por ejemplo: por manos humanas que recolectan el polen de la planta y ponen en contacto a este polen con el estilo o estigma de la misma planta y después evitando opcionalmente la fertilización adicional de la planta; por manos humanas y/o acciones que retiran, destruyen o cubren el estambre o anteras de otras plantas cercanas (por ejemplo, por despenachado o por aplicación de un gametocida químico) de modo que se impida la polinización cruzada y tenga que tener lugar autopolinización para que se produzca la fertilización; por colocación humana de insectos polinizadores en una posición para la "polinización dirigida" (por ejemplo, encerrando una planta sola con insectos polinizadores); por manipulación humana de la flor o de sus partes para permitir la autopolinización; mediante colocación selectiva de plantas (por ejemplo, plantando intencionadamente plantas más allá de la proximidad de polinización) y/o por aplicación de productos químicos para provocar la floración o para fomentar la receptividad (del estigma para el polen).
Las plantas y semillas de soja progenie abarcadas por estos procedimientos y producidas utilizando estos procedimientos serán distintas a otras plantas de soja, por ejemplo debido a que las plantas y semillas de soja progenie: son recombinantes y como tales creadas por intervención humana; son tolerantes al herbicida dicamba; contienen al menos un alelo que consiste en el ADN transgénico de la invención y/o contienen una cantidad detectable de una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. Se puede seleccionar una semilla de una planta de progenie individual, siempre que la semilla comprenda la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.
Se pueden cruzar dos plantas transgénicas distintas para producir una descendencia híbrida que contenga dos genes heterólogos que se segregan independientemente. La autofecundación de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigóticas para ambos genes. También se contemplan el retrocruzamiento con una planta progenitora y el cruzamiento exogámico con una planta no transgénica, al igual que la propagación vegetativa. Las descripciones de otros procedimientos que se utilizan comúnmente para distintos rasgos y cultivos se pueden encontrar en una de varias referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).
Las plantas y semillas utilizadas en los procedimientos desvelados en el presente documento también pueden contener uno o más transgenes adicionales. Dicho transgén puede ser cualquier secuencia nucleotídica que codifique una proteína o molécula de ARN que confiera un rasgo deseable, incluyendo, pero sin limitación, una resistencia a insectos aumentada, una eficacia en el uso del agua aumentada, un rendimiento aumentado, resistencia a la sequía aumentada, un calidad de semillas aumentada, una calidad nutricional mejorada y/o tolerancia a herbicidas aumentada, en que el rasgo deseable se mide con respecto a una planta de soja que carece de tal transgén adicional.
Por lo tanto, los procedimientos son útiles para, entre otras cosas, controlar malas hierbas en un campo mientras se cultivan plantas para producir semilla y/o partes de planta del evento de soja MON 87708 con fines agrícolas o de investigación, seleccionar la progenie del evento de soja MON 87708 para fines de mejora génica vegetal o de investigación, y producir plantas progenie y semillas del evento de soja MON 87708.
Las plantas, progenie, semillas, células vegetales, partes de planta (tales como polen, óvulo, vaina, flor, tejido radicular o de tallo, y hojas) y productos básicos de la invención pueden evaluarse en cuanto a la composición de ADN, expresión génica y/o expresión proteica. Dicha evaluación puede realizarse utilizando cualquier procedimiento convencional tal como PCR, transferencia de northern, análisis de southern, transferencia de western, inmunoprecipitación y ELISA, o utilizando los procedimientos de detección y/o los kits de detección proporcionados en el presente documento.
Se proporcionan procedimientos de detección de la presencia de ADN procedente de una célula, tejido, semilla o planta de soja del evento de soja MON 87708 en una muestra. Un procedimiento consiste en (i) extraer una muestra de ADN de al menos una célula, tejido, semilla o planta de soja, (ii) poner en contacto la muestra del ADN con un par de cebadores que es capaz de producir un amplicón a partir del ADN del evento MON 87708 en condiciones apropiadas para la amplificación de ADN, (iii) realizar una reacción de amplificación de ADN y a continuación (iv) detectar la molécula amplicón y/o confirmar que la secuencia nucleotídica del amplicón comprenda una secuencia nucleotídica específica para el evento MON 87708, tal como una seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1-8. El amplicón debería ser uno que es específico para el evento MON 87708, tal como un amplicón que comprende la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. La detección de una secuencia nucleotídica específica para el evento MON 87708 en el amplicón es determinante y/o diagnóstica de la presencia del ADN específico del evento de soja MON 87708 en la muestra. Un ejemplo de un par de cebadores que es capaz de producir un amplicón a partir del ADN del evento MON 87708 en condiciones apropiadas para la amplificación de ADN se proporciona como la SEQ ID NO: 10-11. Un experto en la materia puede diseñar fácilmente otros pares de cebadores y comprenderían al menos un fragmento de la SEQ ID NO: 6. Otro procedimiento de detección de la presencia de ADN procedente de una célula, tejido, semilla o planta de soja del evento de soja MON 87708 en una muestra consiste en (i) extraer una muestra de ADN de al menos una célula, tejido, semilla o planta de soja, (ii) poner en contacto la muestra de ADN con una sonda de ADN específica para el ADN del evento MON 87708, (iii) permitir que la sonda y la muestra de ADN hibriden en condiciones de hibridación rigurosas y a continuación (iv) detectar la hibridación entre la sonda y la muestra de ADN diana. Un ejemplo de la secuencia de una sonda de ADN que es específica para el ADN del evento MON 87708 se proporciona como la SEQ ID NO: 11. Un experto en la materia podría diseñar fácilmente otras sondas y comprenderían al menos un fragmento de la SEQ ID NO: 6. La detección de la hibridación de la sonda con la muestra de ADN es diagnóstica de la presencia del ADN específico para el evento de soja MON 87708 en la muestra. La ausencia de hibridación es diagnóstica, alternativamente, de la ausencia de ADN específico para el evento de soja MON 87708 en la muestra.
Se proporcionan kits de detección de ADN que son útiles para la identificación de ADN del evento de soja MON 87708 en una muestra y también pueden aplicarse a procedimientos para la mejora génica de plantas de soja que contengan el ADN del evento apropiado. Dichos kits contienen cebadores y/o sondas de ADN que comprenden fragmentos de la SEQ ID NO: 1-8. Un ejemplo de tal kit comprende al menos una molécula de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 6 para actuar como una sonda de ADN útil para detectar la presencia y/o ausencia de ADN procedente del evento de soja transgénico MON 87708 en una muestra. El ADN procedente del evento de soja transgénico MON 87708 comprendería la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 7 y/o la SEQ ID NO: 8. Se proporciona una molécula de ADN suficiente para su uso como una sonda de ADN que es útil para determinar, detectar o diagnosticar la presencia y/o ausencia del ADN del evento de soja MON 87708 en una muestra como la SEQ ID NO: 11. Un experto en la materia podría diseñar fácilmente otras sondas y deberían comprender al menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 6 y ser suficientemente exclusivas para el ADN del evento de soja MON 87708, para identificar ADN procedente del evento. Otro tipo de kit comprende un par de cebadores útil para producir un amplicón útil para detectar la presencia y/o ausencia de ADN procedente del evento de soja transgénico MON 87708 en una muestra. Dicho kit emplearía un procedimiento que comprende poner en contacto una muestra de ADN diana con un par de cebadores como se describe en el presente documento, después realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos suficiente para producir un amplicón que comprenda la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 7 y/o la SEQ ID NO: 8, y a continuación detectar la presencia y/o ausencia del amplicón. Dicho procedimiento puede incluir también la secuenciación del amplicón o de un fragmento del mismo, lo que sería determinante de, es decir, diagnóstico de, la presencia del ADN específico para el evento de soja MON 87708 en la muestra de ADN diana. Un experto en la materia podría diseñar fácilmente otros pares de cebadores y deberían comprender al menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 6 y ser suficientemente exclusivos para el ADN del evento de soja MON 87708, para identificar ADN procedente del evento. La amplificación de ácidos nucleicos puede lograrse mediante cualquiera de los diversos procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica, incluyendo procedimientos de amplificación térmica. Se conocen en la técnica muchas técnicas para detectar, cuantificar y/o secuenciar el amplicón producido mediante estos procedimientos. Una técnica de ejemplo útil en la práctica de la presente invención es TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).
Los kits y procedimientos de detección son útiles para, entre otras cosas, identificar al evento de soja MON 87708, seleccionar variedades o híbridos vegetales que comprendan al evento de soja MON 87708, detectar la presencia de ADN procedente del evento de soja transgénico m On 87708 en una muestra y controlar las muestras en cuanto a la presencia y/o ausencia del evento de soja MON 87708 o partes de planta procedentes del evento de soja MON 87708.
La secuencia del inserto de ADN heterólogo, las secuencias de unión o las secuencias flanqueantes del evento de soja MON 87708 (con muestras de semillas representativas depositadas como ATCC PTA-9670) pueden verificarse (y corregirse en caso necesario) amplificando tales secuencias a partir del evento, utilizando cebadores obtenidos de las secuencias proporcionadas en el presente documento seguido de secuenciación de ADN convencional del amplicón o del ADN clonado.
Como se usa en el presente documento, la expresión "que comprende" significa "que incluye".
Se incluyen los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo1:TransformacióndeSojaA3525yseleccióndeeventoMON87708
La planta de soja MON 87708 se produjo por transformación de soja mediada por Agrobacterium. Las células de soja se transformaron y regeneraron dando lugar a plantas de soja intactas y se seleccionaron plantas individuales de la población de plantas que mostraron integridad del casete de expresión vegetal y resistencia a dicamba. De esta población, se seleccionó y caracterizó el evento de planta de soja MON 87708.
La planta de soja tolerante a dicamba transgénica MON 87708 se desarrolló a través de transformación mediada por Agrobacterium de tejido meristemático de soja utilizando el vector de transformación PV-GMHT4355. El procedimiento se describió en la Patente de Estados Unidos N.° 6.384.301, el cual permite la generación de plantas transformadas sin la utilización de callos. Brevemente, se cortaron tejidos meristemáticos de los embriones de una semilla de soja A3525 germinada (Asgrow, St Louis, MO). Después del cocultivo con la Agrobacterium portando el vector, los meristemas se colocaron en medio de selección que contenía glifosato (Monsanto, St Louis, MO), sal disódica de carbenicilina, sal sódica de cefotaxima y mezcla de sal disódica de ticarcilina/clavulanato potásico para inhibir el crecimiento de células vegetales no transformadas y el exceso de Agrobacterium. A continuación, los meristemas se colocaron en medios que conducen al desarrollo de brotes y raíces. se seleccionaron plantas enraizadas con características fenotípicas normales y se transfirieron al suelo para el crecimiento y la evaluación adicional.
Las plantas R0 generadas a través de la transformación anterior se transfirieron al suelo para crecimiento y después se autofertilizaron para producir la semilla R1. Durante la posterior autofecundación de las plantas R0 para producir la generación R1, se segregaron las inserciones no ligadas de T-DNA I (casete de expresión dmo) y T-DNA II (casete de expresión cp4 epsps). Se aplicó una dosis no letal de glifosato a las plantas de R1. Las plantas con lesiones menores se seleccionaron para análisis adicionales, mientras que las plantas que no mostraban lesión, es decir, que contenían el T-DNA II (casete de expresión cp4 epsps) se eliminaron del desarrollo posterior. Posteriormente, se identificaron plantas de R0 que contenían solamente un único inserto de T-DNA I (es decir, el casete génico dmo). El casete de expresión T-DNA I comprendía el promotor del Virus del Rayado Clorótico del Maní (PC1SV, forma siglada de Peanut Chlorotic Streak Virus) con una región potenciadora duplicada (P-PC1SV.FLt-enh); unido operativamente a un líder de ADN obtenido de transcripto de ARN del Virus del Grabado del Tabaco (L de VGT); unido operativamente a una molécula de ADN que codifica un péptido de tránsito a cloroplastos N-terminal de la subunidad pequeña (SSU, forma siglada de small subunit) de la ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa de Pisum sativum (TS-RbcS-3C); unido operativamente a parte de la proteína madura de la subunidad pequeña (SSU) de la ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa (SSU) de Pisum sativum (CR-RbcS-3C); unido operativamente a una molécula de ADN que codifica una dicamba monooxigenasa (DMO) de Stenotrophomonas maltophilia (Pseudomonas maltophilia era el nombre original de la fuente del gen de la DMO. Este organismo fuente se reclasificó posteriormente en primer lugar como Xanthomonas maltophilia y después como Stenotrophomonas maltophilia); unido operativamente a una molécula de ADN 3' UTR procedente del gen de la subunidad pequeña de la ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa de Pisum sativum (T-Ps.RbcS2-E9). Se seleccionaron plantas mediante una combinación de técnicas analíticas, que incluían TaqMan, análisis por PCR y pulverización del herbicida. El evento MON 87708 se seleccionó de entre aproximadamente 2.400 eventos transgénicos individuales basándose en sus características fenotípicas superiores, un análisis detallado del perfil molecular y su asociación de haplotipos deseable. A continuación, el evento MON 87708 se cruzó con el evento MON 89788 (tolerante al glifosato). La progenie de este cruce se trató con dicamba (Clarity®, BASF, Research Triangle Park, NC), glifosato (Roundup WeatherMAX®, Monsanto Co., St Louis, MO) o una combinación de dicamba y glifosato. Se realizaron tratamientos en etapa preplanta, posplanta en la fase de crecimiento vegetativo 3 (V3) y posplanta en la fase de reproducción 1 (R1). Las plantas tratadas se puntuaron en cuanto a la inhibición del crecimiento porcentual a los 14 días después del tratamiento (DDT) para el tratamiento preplanta con el herbicida, 3 DDT para el tratamiento posemergencia en la fase VE y 3 DDT del tratamiento posemergencia en la fase R1. El herbicida (o herbicidas) se aplicaron en diversas cantidades por hectárea según lo mostrado en la Tabla 1. Las mediciones de la inhibición porcentual representan un promedio de las repeticiones.
Tabla 1: Análisis de tolerancia a Dicamba y/o Roundup WeatherMAX® con MON89788 x MON 87708
Figure imgf000012_0001
Se mapeó el transgén de tolerancia a dicamba en el evento de soja MON 87708 en el grupo de ligamiento 9 en aproximadamente la posición del mapa 143.5. La ventana de haplotipo asociado 19743 y 19767 no tiene efecto sobre el rendimiento, madurez, altura o encamado. Se proporciona información de asociación de haplotipos en la Tabla 2, en que GM_A92205 indica el evento MON 87708.
Tabla 2: Asociación del ha loti LG9 Pos 143.5
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Ejemplo2:CaracterizacióndesecuenciasdeADNdeMON87708
El ADN insertado en el genoma de la planta de soja MON 87708 y la secuencia flanqueante se caracterizaron mediante análisis moleculares detallados. Estos análisis incluyeron: la secuencia del inserto, el número de insertos (número de sitios de integración dentro del genoma de la soja), el número de copias (número de copias del ADN transgénico dentro de un locus), la integridad del casete génico insertado, las secuencias flanqueantes y la asociación de la inserción con regiones de haplotipo del genoma de la soja.
Se utilizaron sondas de ADN molecular que incluían la región codificante intacta y sus elementos reguladores respectivos, los promotores, intrones y secuencias de poliadenilación de los casetes de expresión vegetal. El análisis demostró que MON 87708 contiene una única inserción de ADN transgénico con una copia del casete de expresión. Se realizaron análisis de secuencias de ADN y de PCR inversa para determinar las uniones en 5' y 3' del genoma de la planta y el inserto, confirmar la organización de los elementos dentro del inserto (Figura 1) y determinan la secuencia de ADN completa del inserto en la planta de soja MON 87708 (proporcionada en el presente documento como la SEQ ID NO: 5). Es un aspecto de la invención una planta de soja que comprende en su genoma los elementos genéticos transgénicos ligados mostrados en la Figura 1 y es resistente a dicamba.
Las secuencias que flanquean la inserción de ADN transgénico en MON 87708 se determinaron utilizando PCR inverso como se describe en Ochman y col., 1990 (PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.) y/o técnicas de avance genómico (genome walker). Se aisló ADN genómico vegetal de A3525 y de las líneas de soja transgénica, de tejido cultivado en condiciones de invernadero convencionales. Se combinó aproximadamente 1 gramo de tejido foliar joven con nitrógeno líquido y se molió hasta un polvo fino utilizando un mortero y una maja. Se extrajo ADN utilizando un kit de extracción de ADN Genómico Nucleon™ PhytoPure™ (RPN8511, Amersham, Piscataway, NJ) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la etapa final de precipitación, se resuspendió el ADN en 0,5 ml de TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM). Un experto en la materia puede modificar este procedimiento para extraer ADN de cualquier tejido de soja, incluyendo, pero sin limitación, de semilla. Se digirió una alícuota de ADN con endonucleasas de restricción seleccionadas en un análisis de restricción del ADN transgénico. Después de la autoligación de los fragmentos de restricción, se realizó PCR utilizando cebadores diseñados a partir de la secuencia de ADN transgénico que amplificarían secuencias que se extienden alejándose de los extremos 5' y 3' del ADN transgénico. Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron utilizando un kit de purificación de gel QIAGEN (Qiagen, Valencia, CA). Se secuenciaron directamente los productos de ADN posteriores utilizando protocolos de secuenciación de ADN convencionales. La secuencia flanqueante en 5' que se extiende en la secuencia del borde derecho del ADN transgénico del casete de expresión se presenta como la SEQ ID NO: 3 ([C], véase la Figura 1). La secuencia flanqueante en 3' que se extiende en la secuencia de borde izquierdo del ADN transgénico del casete de expresión es presentada como la SEQ ID NO: 4 ([D], véase la Figura 1). La porción del ADN del casete de expresión que estaba totalmente integrada en el ADN genómico A3525 es presentada como la SEQ ID NO: 5 ([E], véase la Figura 1).
Se compararon las secuencias de las moléculas de ADN aisladas con la secuencia del ADN transgénico para identificar la secuencia flanqueante y el fragmento de ADN transgénico coaislado. La confirmación de la presencia del casete de expresión se logró mediante PCR con cebadores diseñados basándose en los datos de secuencias flanqueantes deducidos y la secuencia de ADN transgénico conocida. La secuencia del tipo silvestre correspondiente a la misma región en la cual se integró el ADN transgénico en la línea transformada se aisló utilizando cebadores diseñados a partir de las secuencias flanqueantes en MON 87708. Las reacciones de PCR se realizaron utilizando el sistema de amplificación Elongase® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se analizaron las secuencias de ADN flanqueantes en MON 87708 y la secuencia del tipo silvestre A3525 contra múltiples bases de datos de nucleótidos y proteínas. Esta información se utilizó para examinar la relación del transgén con el genoma de la planta y para buscar la integridad del sitio de inserción. La secuencia flanqueante y las secuencias de tipo silvestre se utilizaron para diseñar cebadores para ensayos de punto final TAQMAN® utilizados para identificar los eventos. Los ensayos de cigosis se desarrollaron utilizando esta información.
Ejemplo3:EnsayosTAQMAN®depuntofinalespecíficosparaelevento.
Este ejemplo describe un procedimiento de amplificación térmica TAQMAN® de punto final específico para el evento desarrollado para identificar el evento MON 87708 en una muestra. Los ejemplos de condiciones útiles con el procedimiento TAQMAN® de punto final específico para el evento MON 87708 son los siguientes: Etapa 1: agua con 18 megahomios ajustada a un volumen final de 10 pl. Etapa 2: 5,0 pl de Mezcla Maestra Universal 2X (dNTPs, enzima, tampón) hasta una concentración final 1X. Etapa 3: 0,5 pl de mezcla de Cebador del Evento 1 (SQ13570) y Cebador del Evento 2 (SQ13571) (resuspendida en agua con 18 megahomios a una concentración de 20 uM para cada cebador) hasta una concentración final de 1,0 pM (por ejemplo en un tubo de microcentrifugación, se debe añadir lo siguiente para lograr 500 pl a una concentración final de 20 uM: 100 pl de Cebador SQ13570 (SEQ ID NO: 9) a una concentración de 100 pM; 100 pl de Cebador SQ13571 (SEQ ID NO: 10) a una concentración de 100 pM; 300 pl de agua con 18 megahomios). Etapa 4: 0,2 pl de Sonda MGB 6-FAMTM PB4655 del evento (resuspendidos en agua con 18 megahomios hasta una concentración de 10 pM (SEQ ID NO: 11) hasta una concentración final de 0,2 pM. Etapa 5: 0,5 pl de mezcla de Cebador de Control Interno 1 y Cebador de Control Interno 1 (resuspendidos en agua con 18 megahomios hasta una concentración de 20 pM para cada cebador) hasta una concentración final de 1,0 |jM. Etapa 6: 0,2 |jl de Sonda de Control Interno VIC™ hasta una concentración final de 0,2 j M (resuspendido en agua con 18 megahomios hasta una concentración de 10 j M) Etapa 7: 3,0 j l de ADN extraído (molde) para cada muestra comprendiendo cada una uno de los siguientes 1. Muestras de hojas a analizar; 2. Control negativo (ADN no transgénico); 3. Control de agua negativo (sin molde); 4. ADN de MON 87708 de control positivo. Etapa 8: Las condiciones del termociclador son las siguientes: un ciclo a 50 °C durante 2 minutos; un ciclo a 95 °C durante 10 minutos; diez ciclos de 95 °C durante 15 segundos, a continuación 64 °C durante 1 minuto con -1 °C/ciclo; treinta ciclos de 95 °C durante 15 segundos, a continuación 54 °C, 1 minuto; ciclo final de 10 °C.
Los cebadores de ADN utilizados en el ensayo de punto final son los cebadores SQ13570 (SEQ ID NO: 9), SQ13571 (SEQ ID NO: 10) y la sonda marcada con 6-FAMtM PB4655 (SEQ ID NO: 11). 6-FAM™ es un producto de colorante fluorescente de Applied Biosystems (Foster City, CA) unido a la sonda de ADN. Para las sondas MGB™ para TAQMAN®, la actividad de 5' exonucleasa de la polimerasa de ADN Taq escinde la sonda del extremo 5', entre el fluoróforo y el extintor. Cuando se hibridan con la cadena de ADN diana, el extintor y el fluoróforo están separados suficientemente como para producir una señal fluorescente, liberando así la fluorescencia. SQ13570 (SEQ ID NO: 9) y SQ13571 (SEQ ID NO: 10), cuando se utilizan con estos procedimientos de reacción con PB4655 (SeQ ID NO: 11) producen un amplicón de ADN que es diagnóstico del ADN del evento MON 87708. Los controles para este análisis deberían incluir un control positivo procedente de soja que contiene ADN del evento MON 87708, un control negativo procedente de soja no transgénica y un control negativo que no contiene ADN molde. Adicionalmente, un control para la reacción de PCR incluye cebadores de control interno y una sonda de control interno, específicos para un gen de copia única en el genoma de Glycine. Un experto en la materia sabrá cómo diseñar cebadores específicos para un gen de copia única en el genoma de Glycine. Estos ensayos están optimizados para su uso ya sea con el termociclador GeneAmp® PCR System 9700 de Applied Biosystems (operado a velocidad máxima) o con el DNA Engine PTC-225 de MJ Research. Otros procedimientos y aparatos conocidos por los expertos en la materia, que producen amplicones que identifican el ADN del evento Mo N 87708, se encuentran dentro del conocimiento en la técnica.
Se dejaron desarrollar las plantas R0 que demostraron la presencia del casete de expresión a plantas totalmente maduras. Se utilizaron sondas diseñadas basándose en las secuencias del casete del transgén de tolerancia a dicamba para explorar transferencias de Southern para determinar la ligación. Además, se evaluaron las plantas de R0 en cuanto al número de copias del casete de expresión utilizando una combinación de análisis de Southern y TAQMAN® de punto final.
Un ensayo de cigosis es útil para determinar si una planta que comprende un evento es homocigótica para el ADN del evento; es decir, que comprende el ADN exógeno en la misma ubicación en cada cromosoma de un par cromosómico; o es heterocigótica para un ADN del evento, es decir, que comprende el ADN exógeno en solo un cromosoma de un par cromosómico; o es nula para el ADN del evento, es decir, de tipo silvestre. Además, se utilizó el procedimiento de amplificación térmica TAQMAN® de punto final para desarrollar ensayos de cigosis para el evento MON 87708. Este ejemplo describe un procedimiento de amplificación térmica TAQMAN® de punto final específico para el evento, desarrollado para determinar la cigosis del evento MON 87708 en una muestra. Para este ensayo, se utilizó un ensayo de tres cebadores en el que el cebador SQ20632 (SEQ ID NO: 12) hibrida y se extiende específicamente desde la unión a 3' del ADN exógeno insertado al ADN genómico, el cebador SQ20636 (SEQ ID NO: 13) hibrida y se extiende específicamente desde el ADN que flanquea el lado 3' del ADN exógeno insertado, y el cebador SQ20637 (SEQ ID NO: 14) hibrida y se extiende específicamente desde el ADN genómico en el cual se integró el ADN exógeno insertado. Los tres cebadores son diagnóstico del evento. En este ejemplo, el cebador SQ20636 (SEQ ID NO: 13) y el cebador SQ20632 (SEQ ID NO: 12), y la sonda oligonucleotídica marcada con 6-FAM™ PB10130 (SEQ ID NO: 15) son diagnósticos cuando existe una copia del ADN exógeno insertado. En este ejemplo, SQ20636 (SEQ ID NO: 13) y el cebador SQ20637 (SEQ ID NO: 14), y la sonda oligonucleotídica marcada con VIC™ PB10131 (SEQ ID NO: 16) son diagnósticos cuando no hay copia alguna del ADN exógeno insertado presente en el ADN genómico, es decir, el tipo silvestre. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se mezclan en una reacción de PCR con ADN extraído de una planta homocigótica para el evento MON 87708, hay una señal fluorescente solamente a partir de la sonda oligonucleotídica marcada con 6-FAM™ PB10130 (SEQ ID NO: 15), lo que es indicativo de, y diagnóstico de, una planta homocigótica para el evento MON 87708. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se mezclan en una reacción de PCR con ADN extraído de una planta heterocigótica para el evento MON 87708, hay una señal fluorescente tanto de la sonda oligonucleotídica marcada con 6-FAM™ PB10130 (SEQ ID NO: 15) como de la sonda oligonucleotídica marcada con VIC™ PB10131 (SEQ ID NO: 16), lo que es indicativo de, y diagnóstico de, una planta heterocigótica para el evento MON 87708. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se mezclan en una reacción de PCR con ADN extraído de una planta que es nula para el evento MON 87708 (es decir, el tipo silvestre), hay una señal fluorescente solo desde la sonda oligonucleotídica marcada con VIC™ PB10131 (SEQ ID NO: 16), lo que es indicativo de, y diagnóstico de, una planta nula para el evento MON 87708, es decir, el tipo silvestre. Los ejemplos de condiciones útiles con este procedimiento son los siguientes. Etapa 1: agua con 18 megahomios ajustada a un volumen final de 10 jl. Etapa 2: 5,0 j l de Mezcla Maestra Universal 2X (Applied Biosystems n.° de cat. 4304437; dNTPs, enzima, tampón) a una concentración final 1X. Etapa 3: 0,5 j l de Cebadores de Cigosis SQ20632, SQ20636, SQ20637 (resuspendidos en agua con 18 megahomios hasta una concentración de 20 j M para cada cebador) a una concentración final de 1,0 j M. Etapa 4: 0,2 j l de Sonda con 6-FAM™ PB10130 (SEQ ID NO: 15) (resuspendida en agua con 18 megahomios a una concentración de 10 j M) a 0,2 j M concentración final. Etapa 5: 0,2 j l de Sonda con VIC™ PB10131 (SEQ ID NO: 16) (resuspendida en agua con 18 megahomios a una concentración de 10 jM) a una concentración final de 0,2 jM.
Etapa 6: 3,0 j l de ADN extraído (molde) para cada muestra comprendiendo cada una uno de los siguientes 1. Muestras de hojas a analizar (4-80 ng de ADN genómico diluido en agua); 2. Control negativo (ADN de soja no transgénica; 4 ng diluidos en agua); 3. Control de agua negativo (sin molde; solución en la cual se resuspendió el ADN); 4. ADN genómico de MON 87708 de control positivo de un evento heterocigótico conocido (4 ng diluidos en agua); 5. ADN genómico MON 87708 control positivo del evento homocigótico conocido (4 ng diluidos en agua). Etapa 7: Mezclar suavemente. Etapa 8: Las condiciones del termociclador cuando se utiliza el termociclador GeneAmp® PCR System 9700 de Applied Biosystems (operado a velocidad máxima) o el DNA Engine PTC-225 de MJ Research son las siguientes: un ciclo a 50 °C durante 2 minutos; un ciclo a 95 °C durante 10 minutos; diez ciclos de (95 °C durante 15 segundos, a continuación 64 °C durante 1 minuto (-1 °C/ciclo); treinta ciclos de (95 °C durante 15 segundos, a continuación 54 °C durante 1 minuto); 10 a 20 ciclos adicionales opcionales (95 °C durante 15 segundos, a continuación 64 °C durante 1 minuto (-1 °C/ciclo) pueden proporcionar una separación de la población más distintiva durante el análisis de TaqMan®de punto final; un ciclo manteniendo a 10 °C.
Ejemplo4:IdentificacióndeleventoMON87708encualquieractividaddemejoragénicadeMON87708
El siguiente ejemplo describe cómo se puede identificar el evento MON 87708 dentro de la progenie de cualquier actividad de mejora génica utilizando el evento de soja MON 87708.
Se utilizan pares de cebadores del evento de ADN para producir un amplicón diagnóstico del evento de soja MON 87708. Un amplicón diagnóstico de MON 87708 comprende al menos una secuencia de unión, proporcionada como la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, o la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8. Los pares de cebadores del evento que producirán un amplicón de diagnóstico de MON 87708 incluyen pares de cebadores basados en las secuencias flanqueantes y el casete de expresión insertado. Para adquirir un amplicón de diagnóstico en que se encuentra la SEQ ID NO: 1, se diseñaría una molécula de cebador directo basándose en la SEQ ID NO: 3 de las bases 1 a 1126, y una molécula de cebador inverso basándose en la secuencia de ADN del casete de expresión insertado (SEQ ID NO: 5 de las posiciones 1 a 3003), en que las moléculas de cebadores son de suficiente longitud de nucleótidos contiguos para hibridar específicamente con la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 5. Para adquirir un amplicón de diagnóstico en que se encuentra la SEQ ID NO: 2, se diseñaría una molécula de cebador directo basándose en la secuencia de aDn del casete de expresión insertado (SEQ ID NO: 5 de las posiciones 1 a 3003) y una molécula de cebador inverso basándose en la secuencia flanqueante en 3' (SEQ ID NO: 4 de las bases 131 a 1947), en que las moléculas de cebadores son de longitud suficiente de nucleótidos contiguos para hibridar específicamente con la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5. Para fines prácticos, se deberían diseñar cebadores que produzcan amplicones de un intervalo de tamaño limitado, por ejemplo, de entre 100 y 1000 bases. Los amplicones de tamaño más pequeño (longitud más corta de polinucleótido) en general se producen de forma más fiable en reacciones de PCR, permiten tiempos de ciclo más cortos y pueden separarse y visualizarse fácilmente en geles de agarosa o adaptarse para su uso en ensayos del tipo TAQMAN® de punto final. Pueden producirse y detectarse amplicones más pequeños mediante procedimientos conocidos en la técnica de detección de amplicones de ADN. Además, los amplicones producidos utilizando los pares de cebadores pueden clonarse en vectores, propagarse, aislarse y secuenciarse, o pueden secuenciarse directamente con procedimientos bien establecidos en la técnica. Cualquier par de cebadores obtenido de la combinación de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 5, o la combinación de la SEQ iD NO: 4 y la SEQ ID NO: 5, que sea útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico de MON 87708 o la progenie del mismo, es un aspecto de la invención. Cualquier molécula de cebador polinucleotídico de ADN aislada individual que comprenda al menos 11 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 3, o su complemento, que sea útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico de MON 87708 o la progenie del mismo, es un aspecto de la invención. Cualquier molécula de cebador polinucleotídico de ADN aislada individual que comprenda al menos 11 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 4, o su complemento, que sea útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico de MON 87708 o la progenie del mismo, es un aspecto de la invención. Cualquier molécula de cebador polinucleotídico de ADN aislada individual que comprenda al menos 11 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 5, o su complemento, que sea útil en un procedimiento de amplificación de ADN para producir un amplicón de diagnóstico de MON 87708 o la progenie del mismo, es un aspecto de la invención.
Un ejemplo de las condiciones de amplificación para este análisis se ilustra en el Ejemplo 3. Sin embargo, cualquier modificación de estos procedimientos o del uso de cebadores de ADN homólogos o complementarios a la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4, o secuencias de ADN de los elementos genéticos contenidos en el inserto transgénico (SEQ ID NO: 5) de MON 87708 que produzcan un amplicón de diagnóstico de MON 87708, está dentro de la técnica. Un amplicón de diagnóstico comprende una molécula de ADN homóloga o complementaria a al menos un ADN de unión genómico/transgénico (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8), o una porción sustancial del mismo.
Un análisis para una muestra de tejido vegetal del evento MON 87708 debería incluir un control tisular positivo procedente del evento MON 87708, un control negativo procedente de una planta de soja que no sea el evento MON 87708 (por ejemplo, pero sin limitación, A3525) y un control negativo que no contenga ADN genómico de soja. Un par de cebadores que amplifique una molécula de ADN endógena de soja actuará como un control interno para las condiciones de amplificación de ADN. Los expertos en la técnica de los procedimientos de amplificación de ADN pueden seleccionar secuencias de cebadores adicionales de la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5 y

Claims (2)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ADN recombinante que comprende una molécula nucleotídica que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 2, 7 y 8.
2. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ADN es un amplicón de diagnóstico para la presencia de ADN procedente de una planta, en la que se han depositado semillas representativas de la planta con el número de referencia de la ATCC PTA-9670.
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