KR101052996B1 - 박테리아 세포용해소에 대한 정제 공정 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폐렴구균 뉴몰리신과 같은 박테리아 세포용해소를 정제하는 방법에 관한 것이다. 하나의 크로마토그래피 단계로 용해성의 응집된 세포용해소를 세제 및 고염의 존재하에 소수성 상호작용 크로마토그래피 재료에 결합시킴에 의해 세포용해소를 우수하게 정제할 수 있다.

Description

박테리아 세포용해소에 대한 정제 공정{PURIFICATION PROCESS FOR BACTERIAL CYTOLYSIN}

기술분야

본 발명은 박테리아 세포용해소 정제 분야, 특히 뉴몰리신(pneumolysin)의 정제 방법에 관한 것이다. 뉴몰리신은 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 감염증 또는 중이염에 대한 백신 성분으로 적합한 우수한 항원 특성을 가지는 스트렙토코커스 뉴모니애 유래 단백질이다. 본 발명의 방법은 하나의 크로마토그래피 단계로 뉴몰리신을 정제하는 독특하고 이로운 단계를 기술하는데, 이 는 뉴몰리신을 세제(detergent)와 고염(high salt)의 존재하에 소수성 상호작용 컬럼에 결합시킴에 의해 가능하다. 이 공정은, 특히 응집된 상태에 있을 때 콜레스테롤과 유사한 방향족 화합물에 대한 높은 친화도를 가지는 박테리아 세포용해소의 특성을 이용함으로써 상기 독소 패밀리 일원의 정제에 일반적으로 적용될 수 있다는 것이 이점이다.

티올 활성화된 세포용해소는 스트렙토리신 O(streptolysin O)가 프로토타입인 박테리아 독소의 중요한 군을 형성한다(참조: Billington et al FEMS Microbiol. Lett. (2000), 182; 197-205). 이러한 독소는 세포 막에 공극을 형성함으로써 진핵 세포에 대해 용해성이다. 산화제는 이들의 세포용해 활성에 나쁜 영향을 미치는 반면, 환원제는 활성을 복원시킬 수 있다. 이 군의 일원들은 1차 아미노산 서열에서 30 내지 60%의 유사성을 나타내며, C 말단 근처에 거의 불변인 운데카펩티드(undecapeptide) 서열을 함유한다. 콜레스테롤은 이러한 독소들에 대한 주요 표적 세포 수용체이다. 세포용해소는 콜레스테롤 함유 막에 결합하고 올리고머화되어 지름이 30nm 이하이고 40 내지 80개의 모노머 서브유닛으로 구성된 막관통(transmembrane) 공극을 형성한다. 막 콜레스테롤의 결합은 독소 모노머에 형태적 변화를 유발하고 후속 사건인 올리고머화, 막 삽입 및 공극 형성을 유도한다.

스트렙토코커스 뉴모니애는 페렴, 균혈증, 수막염, 중이염 및 부비동염을 포함하는 수개의 인간 질병의 원인이 되는 균이다. 때때로 이러한 질병은 항생제의 이용가능성에도 불구하고 죽음에 이르게 할 수 있다. S. 뉴모니애의 항생제 내성 균주의 출현은 이 병원체에 의해 유발되는 문제를 악화시켰다. 이러한 정황으로, S. 뉴모니애에 대한 효과적인 백신이 개발되는 것이 중요하다.

정제된 협막성(capsular) 다당류를 함유하는 다가 폐렴구균 백신이 수년간 이용되어 왔다. 이들의 적용은 유아, 노인, 겸상 적혈구 빈혈증, 다발성 골수종, 간경변, 또는 알코올 중독증을 앓고 있는 이들을 포함하는 고위험군에서 특히 나타나는 불량한 면역원성에 의해 제한된다. 이들은 또한 혈청형 특이적 보호를 제공하고 알려진 90개의 혈청형중 단지 23개만이 기존의 제형에 의해 보호된다. 이는 미국 인구에서 발견되는 혈청형의 90%에 대한 보호를 제공하지만 아시아 인구에서 발견되는 혈청형의 약 70%에 대해서만 보호를 제공할 것이다. 최근에 컨쥬게이션된 7가 백신을 이용할 수 있게 되었는데, 이 백신도 유사하게 모든 폐렴구균 균주에 대해 보호하는 데는 문제를 가진다.

뉴몰리신(Ply)는 S. 뉴모니애의 모든 균주에서 발견되는 53kDa의 티올-활성화된 세포용해소이고, 이는 자기분해(autolysis)로 방출되고 S. 뉴모니애 발병기전(pathogenesis)의 원인이 된다. 뉴몰리신은 다양한 혈청형의 Ply 단백질 간에 나타나는 단지 수개의 아미노산 치환체를 가지며 매우 보존되어 있다. 뉴몰리신의 고도의 보존성과 이의 면역원성은 뉴몰리신을 백신 성분으로서 유력한 후보자가 되도록 한다. 그러나, 야생형 Ply는 이의 독성 때문에 인간용 백신에 혼입되기에는 부적합하다. Ply는 막 결합된 콜레스테롤과 상호작용하고 올리고머화되어 막에 공극을 형성함으로써 세포 막에 손상을 유발한다. C-말단 근처에서 발견되는 보존된 시스테인 함유 모티프는 용해 활성과 관련이 있다. Ply의 돌연변이는 이의 독성을 저감시키는 것으로 제안된 바 있다(WO90/06951, WO99/03884).

뉴몰리신의 정제를 위한 두 단계 방법이 문헌(Lock et al., Microbial Pathogenesis, 1996, 21: 71-83)에 기술되어 있다. 재조합 뉴몰리신이 이온 교환 및 겔 여과 크로마토그래피의 조합을 사용하여 대장균(E. coli) 배양물로부터 정제된다. 이 방법은 추출물을 제조하는 단계 및 이를 DEAE-세파로스 컬럼, 후속하여 세파크릴 S200-HR 컬럼을 통과하도록 하는 단계를 포함한다. 이 방법은 재조합 또는 천연 뉴몰리신을 정제하는 데 사용될 수 있다.

쿠오 등(Kuo et al)은 재조합 GST-뉴몰리신 융합 단백질을 정제하는 방법을 기술한다(참조: Infection and Immunity, 1995, 63: 2706-2713). 융합 단백질은 대장균 배양물에서 발현되고 세포 용해물이 굴루타티온 아가로스 겔상으로 로딩된다. 융합 단백질은 글루타치온과 함께 용리되고 트롬빈이 융합단백질을 절단하는 데 사용될 수 있다. 단백질은 글루타치온-아가로스 컬럼을 다시 통과하여 GST가 제거되었다. 친화성 정제된 뉴몰리신은 하이드록시아파타이트 컬럼을 사용하여 추가로 정제되었다.

미첼 등(Mitchell et al)(BBA, 1989, 1007: 67-72)는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여 뉴몰리신을 정제하는 방법을 기술한다. 이들을 사용하는 조건하에서(250mM 염), 뉴몰리신은 이의 진행이 지연되고 뉴몰리신이 넓은 피크로 용리되는데도 불구하고 컬럼에 강하게 결합하지 못하였다. 어느 분획이 순수한 뉴몰리신을 함유하는 지를 결정하고, 양성인 분획을 농축하고, 컬럼에 로딩하여 소량의 물로 용리하는 추가의 단계가 뉴몰리신이 컬럼 재료에 강하게 결합하지 않는 문제를 극복하기 위하여 필요하였다.

스트렙토코커스 뉴모니애에 대한 개선된 백신에 대한 필요가 지속되고 있다. Ply 성분의 혼입이 단백질의 독성이 여전히 문제인 데도 불구하고 가망을 가진다. 빠르고 효과적인 뉴몰리신의 대량 정제를 위한 방법의 개발이 또한 필요하다. 앞서 기술된 방법은 중간의 검정 및 농축 단계를 구비한 다단계의 정제 과정의 사용을 포함한다. 본 발명은 많은 배치(batch)의 뉴몰리신을 정제하는 데 사용될 수 있는 하나의 크로마토그래피 단계를 유리하게 사용하는 보다 효과적인 정제 방법을 제공한다.

도면의 간단한 설명

도 1 - 뉴몰리신의 정제를 도시하는 SDS-PAGE 겔. 하기 샘플들을 SDS-PAGE 겔 상에서 영동시켰다: 레인 1 - 분자량 기준물질, 레인 2 - 세포 추출물의 상청액, 레인 3 - 페닐-세파로오스 흐름 통과물, 레인 4 - 페닐 세파로오스 제 1 세척물, 레인 5 - 페닐-세파로오스 제 2 세척물, 레인 6 - 페닐-세파로오스 0.5M NaCl 세척물, 레인 7 - 저염 완충액을 이용한 페닐-세파로오스 용리물, 레인 8 - 변성/재폴딩 단계 후의 뉴몰리신, 레인 9 - 멸균 여과 후의 뉴몰리신.

패널 A는 쿠마시 블루 염색 후의 겔을 도시한다. 패널 B는 오염 단백질을 탐침하기 위한 항-대장균 항체를 사용하는 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 후의 겔을 도시한다.

도 2 - GMBS (N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르)-개질된 뉴몰리신의 SDS-PAGE 분석-쿠마시 블루로 염색됨.

하기 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 영동시켰다: 레인 1 - 분자량 표준물질, 레인 2- 개질되지 않은 뉴몰리신, 레인 3 - 4/1의 GMBS/리신의 몰 비의 GMBS로 처리된 PLY, 레인 4 - 4/1의 GMBS/리신의 몰 비의 GMBS로 처리되고 37℃에서 7일 동안 인큐베이션된 PLY, 레인 5 - 8/1의 GMBS/리신의 몰 비의 GMBS로 처리된 PLY, 레인 6 - 37℃에서 7일 동안 인큐베이션 한 후에 8/1의 GMBS/리신의 몰 비의 GMBS로 처리된 PLY, 레인 7 - 10/1의 NHS/리신의 몰 비의 설포-NHS 아세테이트로 처리된 PLY, 레인 8 - NEM으로 처리된 PLY, 레인 9 - 37℃에서 7일 동안 인큐베이션한 후에 NEM으로 처리된 PLY.

도 3 - 마우스에 비강내 투여된 GMBS 처리된 뉴몰리신의 독성. 다이아몬드로 표시된 선은 2㎍ 천연 뉴몰리신으로 공격(challenged)된 마우스에 대한 생존율을 나타낸다. 네모로 표시된 선은 10㎍ GMBS 처리 뉴몰리신으로 공격된 마우스에 대한 생존율을 나타낸다.

도 4 - 천연 뉴몰리신으로 비강내 공격된 마우스에서 GMBS 처리 뉴몰리신에 의해 유도된 보호. 직사각형으로 표시된 선은 애쥬번트만을 접종한 마우스의 생존율을 도시한다. 다이아몬드로 표시된 선은 천연 뉴몰리신을 접종한 마우스의 생존율을 나타낸다. 네모로 표시된 선은 GMBS 처리 뉴몰리신을 접종한 마우스의 생존율을 나타낸다.

도 5 - 타입 2 D39 폐렴구균 균주로 비강내로 공격한 마우스에서 PhtD 및 GMBS 처리 뉴몰리신을 접종하여 유도된 보호. 직사각형으로 표시된 선은 애쥬번트만을 접종한 마우스의 생존율을 나타낸다. 다이아몬드로 표시된 선은 PhtD를 접종한 마우스의 생존율을 나타낸다. 네모로 표시된 선은 PhtD 및 GMBS 처리 뉴몰리신을 접종한 마우스의 생존율을 나타낸다.

상세한 설명

공정

본 발명의 공정은 뉴몰리신과 같은 박테리아 세포용해소를 정제하기 위한 방법이다. 세포용해소, 예를 들어 뉴몰리신은 컬럼에 재로딩함 없이 하나의 컬럼 크로마토그래피 단계만을 사용하여 정제된다. 단백질은 응집된 형태로 세제 및 염의 존재하에 소수성 상호작용 컬럼에 결합된다. 단백질은 세포용해소를 하나의 단계로 정제되도록 하는 이러한 조건하에서 컬럼에 거의 결합하지 않는다.

본 발명의 목적을 위하여, 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신의 용해성 응집체는 20분 동안 30,000g로 원심분리한 후에 상청액에 잔류하는 세포용해소의 응집된 형태이다. 용해성 응집체는 고염, 바람직하게는 1M의 염의 존재하에 소수성 상호작용 크로마토그래피 재료, 바람직하게는 페닐-세파로오스 상에 보유된다. 임의로, 용해성 응집체는 콜로이드성이다.

세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신은 용해성 응집체로서 컬럼에 결합한다. 필터 또는 컬럼 막힘 및 재료의 소실을 포함하는 다양한 이유로 컬럼 상에 응집체를 로딩하는 것은 드문 일이다. 그러나, 세제를 사용하여 응집체의 크기를 감소시켜 용해성 응집체를 형성시킴에 의해, 이러한 응집체가 세제 조건 하에 컬럼에 강하게 결합하면서도, 컬럼 필터에 악 영향을 미치지 않고 SDS-PAGE 분석에 의해 평가했을때 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 바람직하게는 90%, 95%, 보다 바람직하게는 97%, 98%, 또는 99%의 순도로 용리될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이 공정은 바람직하게는 발효 리터 당 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신을 적어도 100, 200, 500, 700, 보다 바람직하게는 1000, 1500, 1700, 또는 1900mg의 수득량을 발생시킨다. 바람직하게는 발효 배양물로부터의 적어도 1%, 2%, 5%, 7%, 9% 또는 10%의 단백질이 정제된 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신으로 회수된다.

본 공정은 뉴몰리신과 같은 세포용해소가 콜레스테롤 및 다른 방향족 화합물에 결합할 수 있는 능력을 이용한다. 이러한 결합은 세포용해소가 응집되어 세포용해소가 세제의 존재하에 결합하도록 하는 경우에 특히 강하다. 본 공정은 세포용해소 패밀리의 다른 일원들에까지 확장될 수 있는데, 이는 모든 일원이 방향족 화합물에 결합하여 공극을 형성할 수 있는 능력을 공유하기 때문이다. 사실, 본 방법은 콜레스테롤 또는 다른 방향족 화합물에 결합하고/거나 공극을 형성하는, 바람직하게는 결합과 공극 형성을 모두 하는 다른 패밀리의 단백질을 정제하는 데 사용될 수도 있다.

따라서, 제 1 구체예에서, 박테리아 세포용해소 정제 공정은 하기 단계를 포함한다:

a) 박테리아 세포용해소를 발현하는 세포 배양물을 증식시키는 단계;

b) 박테리아 세포용해소를 함유하는 배양물로부터 추출물을 제조하는 단계;

c) 세제(바람직하게는 지방성 세제)의 존재하에 추출물에 함유된 용해성 응집 박테리아 세포용해소를 소수성 상호작용 크로마토그래피 재료에 고염(바람직하게는 0.5-2M 염) 조건하에서 결합시키는 단계;

d) 세제(바람직하게는 지방성 세제)의 존재하에 저염(바람직하게는 0-0.2M 염) 조건하에서 박테리아 세포용해소를 용리시키는 단계.

제 2 구체예에서, 박테리아 세포용해소 정제 공정은 하기의 단계를 포함한다:

a) 박테리아 세포용해소를 발현하는 세포 배양물을 증식시키는 단계;

b) 박테리아 세포용해소를 함유하는 배양물로부터 추출물을 제조하는 단계;

c) 0.5-2M 염 및 0.1%-5% 세제를 함유하는 용액의 존재하에 소수성 상호작용 크로마토그래피 재료에 추출물에 함유된 박테리아 세포용해소를 결합시키는 단계;

d) 0.1-5% 세제를 함유하는 저염(바람직하게는 0-0.2M 염) 용액을 사용하여 박테리아 세포용해소를 용리시키는 단계.

상기 구체예 중 어느 하나에서, 본 발명의 공정은 바람직하게는 하기의 추가 단계를 포함한다:

e) 박테리아 세포용해소로부터 세제를 제거하는 단계;

f) 변성제의 첨가에 의해 박테리아 세포용해소를 용해시키는 단계;

g) 박테리아 세포용해소로부터 변성제를 제거하는 단계.

본 발명의 공정은 폐렴구균 뉴몰리신을 정제하는 데 이롭게 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 정제될 수 있는 다른 세포용해소는 A. 피오게네스(A. pyogenes)로부터의 피올리신(pyolysin), B. 세레우스(B. cereus)로부터의 세레올리신(cereolysin), B. 쑤린지엔시스(B. thuringiensis)로부터의 쑤린지올리신 O(thuringiolysin O), B. 라터스포러스(B. latersporus)로부터의 라터로스포롤리신(laterosporolysin), C. 비퍼멘탄스(C. bifermentans)로부터의 비퍼멘톨리신(bifermentolysin), C. 보튤리눔(C. botulinum)으로부터의 보튜키놀리신(botukinolysin), C. 카우보엘(C. chauvoel)으로부터의 카우베올리신(chauveolysin), C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)으로부터의 히스톨리티콜리신(histolyticolysin), C. 노비이(C. novyi) 타입 A로부터의 오에데마톨리신(oedematolysin), C. 퍼프린겐스(C. perfringens)로부터의 퍼프린골리신(perfringolysin), C. 셉티쿰(C. septicum)으로부터의 셉티콜리신 O(septicolysin O), C. 소르델리이(C. sordellii)로부터의 소르델리리신(sordellilysin), C. 테타니(C. tetani)로부터의 테타놀리신(tetanolysin), L. 이바노비(L. ivanovi)로부터의 이바놀리신 O(ivanolysin O), L. 모노사이토게네스(L. monocytogenes)로부터의 리스테리올리신 O(listeriolysin O), L. 세엘리게리(L. seeligeri)로부터의 세엘리게릴리신 O(seeligerilysin O), P. 알베이(P. alvei)로부터의 알베올리신(alveolysin), S. 피오게네스(S. pyogenes), S. 캐니스(S. canis) 또는 S. 에퀴시밀리스(S. equisimillis)로부터의 스트렙토리신 O(streptolysin O), S. 인터메디우스(S. intermedius)로부터의 인터메딜리신(intermedilysin), S. 수이스(S. suis)로부터의 수일리신(suilysin), 또는 S. 뉴모니애(S. pneumoniae)로부터의 뉴몰리신을 포함하며, 이들은 야생형이거나 상기 기술된 PdA 및 PdB와 같은 낮은 수준의 독성을 가진 유전적으로 개질된 독소일 수 있다.

뉴몰리신 또는 Ply는 폐렴구균으로부터의 천연 뉴몰리신 또는 재조합 뉴몰리신, 야생형 뉴몰리신 또는 뉴몰리신의 돌연변이체(예를 들어, WO90/06951 및 WO99/03884)을 의미한다. 임의로, 뉴몰리신은 또한 당업자에 의해 용이하게 결정되는, 야생형 뉴몰리신 서열과 적어도 70, 80, 90 또는 95% 아미노산 서열을 공유하며, 본 발명의 방법에 의해 정제되는 능력을 여전히 보유하는 뉴몰리신의 단편 또는 뉴몰리신의 변이체를 의미할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 동일한 세제가 단계 b) 및 c), b) 및 d), c) 및 d)에서, 보다 바람직하게는 단계 b), c) 및 d)에서, 바람직하게는 0.1%-5%(w/v)의 농도로 존재한다. 본 발명의 목적을 위해서 지방성 세제는 단계 c)에서 컬럼에 세포용해소가 결합하는 것을 방지하기 위해, 불충분한 방향족 특성을 가지는 실질적으로 지방성인 세제로서 정의된다. 바람직하게는, 세제는 하나 이하의 방향족 고리를 가지고 가장 바람직하게는 방향족 고리를 가지지 않는다. 단계 b)의 과정에서, 세제가 보다 큰 세포용해소 응집체를 보다 작은 응집체로 쪼개어 용해성 응집체로 만드는 것이 유리하다. 단계 c) 및 d)의 과정에서, 세제는 용해성의 응집된 상태의 세포용해소를 보유하여, 높은 친화도로 고염 조건하의 컬럼에 결합하는 것을 가능하게 하는 것이 유리하다.

세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신은 박테리아 세포, 바람직하게는 S. 뉴모니애(S. pneumoniae), 대장균의 배양물에서, 또는 대안적으로 이의 발현에 적합한 효모 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포, 또는 임의의 다른 발현 시스템에서 발현된다. 고수율의 뉴몰리신을 생성하는 발현 시스템에서, 뉴몰리신은 종종 저절로 응집되고 본 발명의 공정은 이의 정제를 위해 이상적이다. 바람직하게는, 뉴몰리신은 고수율로 발현되어 발현 시스템에서 전체 단백질의 2, 3, 4, 5, 7, 또는 10% 이상을 차지한다. 바람직하게는, 뉴몰리신은 응집된 형태이고 따라서 대개 용혈 활성이 없다. 예를 들어, 고발현을 가능하게 하는 파지 λ프로모터 또는 다른 프로모터 하에서 발효기에서 대장균에서의 발현은 당업자에 널리 공지되어 있다.

바람직하게는, 세포용해소는 응집체로서 발현 시스템으로부터 추출된다. 대안적으로, 보다 낮은 수율의 발현 시스템이 용해성 세포용해소를 제공할 수 있다. 이러한 경우에, 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신을 함유하는 추출물은 세포용해소가 적어도 8시간, 바람직하게는 적어도 24시간의 기간에 걸쳐 응집되는 것을 가능하게 하는 7.5 미만의 pH로 조절된다.

단계 b)에서의 추출물의 제조는 바람직하게는 세포를 기계적으로 파쇄하고/거나 세제로 세포를 처리하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 고수율 방법으로 수행되는 경우에, 뉴몰리신은 응집체의 형태로 남아있지만 응집체가 불용성 세포 파쇄물을 펠릿화하기 위해 필요한 조건하에서 샘플의 원심분리 후에 상청액에 남아있도록 충분하게 작아야 한다. 바람직하게는 본 발명에 사용된 세제는 방향족 고리, 바람직하게는 이온성 세제, 보다 바람직하게는 양이온성 또는 음이온성 세제를 함유하지 않은 지방족 세제이고, 가장 바람직하게는 세제는 소듐 라우로일 사르코시네이트(sodium lauroly sarcosinate)이다. 바람직한 세제는 뉴몰리신을 용해시킬 수 있으면서 이를 컬럼에 부착된 필터의 막힘을 유발함 없이 소수성 상호작용 컬럼에 결합하는 작은 응집체의 형태로 남아 있도록 해야 한다. 바람직한 세제는 뉴몰리신 응집체의 크기를 감소시켜 뉴몰리신 응집체가 이들이 20분 동안 30,000g에서 샘플을 원심분리한 후에 상청액에 남아 있기에 충분히 작도록 할 수 있다. 이러한 용해성 응집체는 그 자체로서 소수성 상호작용 컬럼 상에서 정제될 수 있다. 세제는 0.1% 내지 5%의 농도로, 바람직하게는 0.5% 내지 3%(w/v)의 농도로, 바람직하게는 0.75% 내지 2%의 농도로, 보다 바람직하게는 약 1%의 농도로 존재한다. 바람직하게는 세제는 투석가능하다.

단계 b)에서 배양물의 기계적 및/또는 세제 파쇄 후에, 본 발명의 공정은 세포 물질의 원심분리를 포함하고, 추출물로서 상청액을 수집하여 단계 c)의 과정에서 크로마토그래피 재료 상에 로딩되는 것을 포함한다. 뉴몰리신은 바람직하게는 용해성 응집체로서 상청액에 존재한다.

본 발명의 공정은 하나의 단계로 뉴몰리신을 정제하는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용한다. 단계 c)에서 사용된 컬럼 재료는 바람직하게는 방향족 기, 바람직하게는 페닐 기, 보다 바람직하게는 페닐-세파로오스를 함유한다.

컬럼의 로딩 및 용리 과정 동안 단계 c) 및/또는 d)에서 사용된 용액은 이온성 세제, 바람직하게는 양이온성 또는 음이온성 세제, 바람직하게는 0.5M 초과의 염 농도에서 용해성인 세제를 포함하고, 가장 바람직하게는 세제는 소듐 라우로일 사르코시네이트이다. 사용된 세제는 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신의 크기를 감소시켜 세포용해소가 샘플에 용해성 응집체로 존재하여 컬럼에 비가역적으로 고착됨 없이 소수성 상호작용 컬럼 재료에 결합하는 것이다. 세제는 바람직하게는 0.1% 내지 5%의 농도로, 바람직하게는 0.5% 내지 3%(w/v)의 농도로, 보다 바람직하게는 0.75% 내지 2%의 농도로, 가장 바람직하게는 약 1%의 농도로 존재한다.

단계 c) 및/또는 d)에 사용된 용액은 염, 바람직하게는 염화나트륨, 염화마그네슘, 염화암모늄, 황산나트륨, 황산마그네슘, 황산암모늄, 인산나트륨, 인산마그네슘, 인산암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된 염을 함유하고, 이는 pH 6-8에서, 바람직하게는 약 pH 7에서 완충작용된다. pH를 pH 5 내지 9로 유지할 수 있는 어느 완충액이든지 사용될 수 있다.

본 발명의 공정에서 뉴몰리신을 컬럼에 결합시키기 위해 사용된 용액은 고염 농도, 바람직하게는 0.6 내지 2M, 보다 바람직하게는 약 1M을 함유한다. 염 농도는 뉴몰리신이 용해성 응집 형태로 존재하고 소수성 크로마토그래피 재료에 결합할 수 있도록 선택된다.

임의로, 단계 c)는 약 0.5M 염의 중간 염 조건 또는 불량하게 결합하는 임의의 불순물을 제거할 수 있는 염 농도로 컬럼을 세척하는 추가의 단계를 함유할 수 있다.

본 발명의 공정은 감소되는 염 농도구배를 사용하여 컬럼으로부터 뉴몰리신을 용리시킨다. 바람직하게는, 단계 d)에서 염 농도구배를 만드는데 사용된 저염 용액은 0-0.1M 염, 보다 바람직하게는 0-40mM 염을 함유한다. 대안적으로, 순차적인 용리가 0-0.2M 염, 보다 바람직하게는 0-40mM 염을 함유하는 단계 d)에서 사용되는 저염 완충액으로 사용될 수 있다.

뉴몰리신을 변성시키고 후속하여 변성제의 제거에 의해 이를 다시 재폴딩하는 것이 바람직한 경우에 임의 단계들이 본 발명의 공정에 추가될 수 있다. 이러한 임의의 단계들은 천연 구조를 가지는 순수한 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신이 수득되는 것을 보증한다. 제 1 임의 단계 e)는 정용여과(diafiltration), 투석, 또는 희석에 의해 세제를 제거하는 것을 포함한다. 이 단계는 바람직하게는 pH 8-10, 바람직하게는 약 9의 완충액에 대한 정용여과/투석을 포함하고, 보다 바람직하게는, 완충액은 염기성 pH 값에서 완충작용할 수 있는 것이고, 가장 바람직하게는, 완충액은 DEA이다. 용액은 바람직하게는 낮은 이온 결합력, 바람직하게는 10-50mM, 가장 바람직하게는 약 25mM이다. 정용여과 또는 투석은 바람직하게는 4℃에서 수행되지만 대안적으로 실온에서 수행된다.

제 2 임의 단계에서, 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신은 변성제의 첨가에 의해 변성되고 용해된다. 바람직하게는 단계 f)에서 사용된 변성제는 구아니딘 하이드로클로라이드이고, 보다 바람직하게는 5-8M 구아니딘 하이드로클로라이드, 가장 바람직하게는 약 6M 구아니딘 하이드로클로라이드이다. 뉴몰리신은 적어도 10분 동안, 바람직하게는 적어도 1시간 동안, 보다 바람직하게는 약 1시간 동안 구아니딘 하이드로클로라이드로 인큐베이션된다.

이후, 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신은 바람직하게는 단계 f)의 과정 동안 5-9M 우레아, 바람직하게는 약 8M 우레아와 접촉된다. 이는 우레아에 대하여 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신의 정용여과 또는 투석에 의해 달성된다. 바람직하게는, 동일한 완충액 및 pH가 변성제의 교환 동안에 유지된다. 바람직하게는 환원제(DTT, 2-머캅토에탄올 또는 글루타치온)이 변성제의 교환 동안 첨가된다.

바람직하게는, 단계 f)는 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신을 5-8M 구아니딘 하이드로클로라이드와 접촉시키고, 구아니딘 하이드로클로라이드를 5-9M 우레아로 교환하는 것을 포함한다.

세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신이 변성되면서 형성된 부적절한 이황화결합이 형성되는 것을 예방하기 위하여, 환원제가 단계 f) 및 g)의 적어도 일부의 과정 동안에 존재하는 것을 보장하는 것이 유리하다. 바람직한 환원제는 0.1-10mM DTT, 바람직하게는 약 1mM DTT이다. 대안적으로, 글루타치온 또는 2-머캅토에탄올이 사용된다. 바람직한 농도의 글루타치온은 1-50mM, 보다 바람직하게는 10-30mM이다.

임의의 단계 g)는 pH 6-11, 바람직하게는 약 pH 9의 저염 완충액에 대한 정용여과 또는 투석에 의해 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신을 재폴딩하도록 변성제를 제거하는 것을 포함한다. 바람직하게는 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신 농도는 적어도 100㎍/㎖, 바람직하게는 100㎍/㎖ 내지 1000㎍/㎖, 보다 바람직하게는 약 500㎍/㎖로 유지된다. 임의로, 정용여과 또는 투석은 10 내지 30%, 바람직하게는 약 15%로 프로필렌 글리콜을 함유하는 완충액에 대한 것이다. 바람직하게는, 상기 기술된 환원제가 단계 g)의 과정 동안 유지된다. 정용여과 또는 투석은 바람직하게는 4℃에서 수행되지만, 대안적으로 실온에서 수행된다.

추가의 임의의 단계 h)는 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신이 재폴딩된 후 환원제의 제거를 포함한다. 이는 바람직하게는 pH 6-11, 바람직하게는 약 pH 9의 저염 완충액에 대한 정용여과 또는 투석에 의해 달성된다. 임의로, 정용여과 또는 투석은 10 내지 30%, 바람직하게는 약 15%로 프로필렌 글리콜을 함유하는 완충액에 대한 것이다. 정용여과 또는 투석은 바람직하게는 4℃에서 수행되지만, 대안적으로 실온에서 수행된다.

본 발명의 바람직한 방법에서, 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신은 이의 용혈 활성이 적절하게 폴딩된 단백질의 용혈 활성의 25%, 50%, 75% 초과, 가장 바람직하게는 90% 초과로 회복되도록 재폴딩된다. 본 발명의 목적을 위하여 '폴딩된' 단백질은 비변성 과정에 의해 만들어진 단백질의 3차 구조를 가지는 단백질이다. 야생형 뉴몰리신의 경우에, 재폴딩된 뉴몰리신의 기대된 용혈 활성은 뉴몰리신 mg 당 500,000-1,000,000 용혈 유닛일 것이다. 낮은 용혈 활성을 가지는 점돌연변이된 뉴몰리신의 경우에, 재폴딩된 뉴몰리신의 용혈활성은 대응하여 낮아질 것이다.

독소의 무독화

본 발명의 방법에 의해 정제된 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신은 화학적 처리에 의한 무독화의 추가의 임의 단계를 거칠 수 있다. 이러한 추가 단계는 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신이 동물 또는 인간에게 투여된 경우에 특히 유리하다. 야생형 뉴몰리신은 매우 독성을 가진다. 감소된 독성을 가지는 수개의 돌연변이된 뉴몰리신 단백질이 분리되었지만, 이들은 여전히 뉴몰리신이 체내에 투여되는 경우에 문제가 될 수 있는 잔류 독성을 보유한다(참조: WO99/03884, WO90/06951). 대안적으로, 이는 다당류로의 컨쥬게이션에 의해 무독화될 수 있다(WO96/05859).

본 발명의 공정은 화학적 처리에 의해 야생형 또는 돌연변이된 세포용해소, 예를 들어 뉴몰리신을 무독화할 수 있다. 바람직한 구체예는 가교제, 보다 바람직하게는 포름알데하이드, 글루타르알데하이드 및 N-하이드록시숙시노미도 에스테르 및/또는 말레이미드 기(예를 들어, GMBS)를 함유하는 가교제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학물질을 함유하는 가교제를 사용한다.

무독성 공정 그 자체가 본 발명의 한 측면이고, 이는 박테리아 독소, 바람직하게는 다른 방법에 의해 제조된 뉴몰리신을 무독화하는 데 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 무독화 방법은 화학적 화합물, 바람직하게는, 반응성인, 바람직하게는 선택적으로 반응성인, 가장 바람직하게는 아민기, 보다 바람직하게는 1차 아민기와 특히 반응성인 가교제로 독소를 처리하는 것을 포함하는 박테리아 독소의 무독화를 기술한다.

본 출원의 목적을 위해서, 가교제는 적어도 2개의 반응성 기를 가지며 이둘 중 적어도 하나가 박테리아 독소 상에 하나 이상의 기와 반응할 수 있는 화합물로서 정의된다. 추가의 반응성 기는 박테리아 독소 또는 분리된 화합물(예를 들어, 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 당 또는 다당류) 상의 하나 이상의 기와 반응할 수 있다.

바람직하게는, 화학적 화합물 또는 가교제는 반응성이고, 보다 바람직하게는 선택적으로 반응성이고, 가장 바람직하게는 아민 및 설프하이드릴기와 특이적으로 반응성이다. 바람직하게는, 화학적 화합물은 리신의 1차 아민 기와 반응하고, 보다 바람직하게는 가교제는 리신의 1차 아민 기 및 시스테인의 설프하이드릴 기와 반응한다. 시스테인 및 리신 잔기 둘 모두의 개질이 가교제가 단지 리신 또는 시스테인과 반응하는 경우에 잔여 용혈 활성과 비교하여 용혈의 수준을 상승작용적으로 감소시키기 때문에, 뉴몰리신이 무독화되는 경우 특히 유리한 이점을 가진다.

따라서, 대안적인 구체예는 박테리아 독소를 무독화하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 독소의 독성(바람직하게는 용해 활성)과 관련된 시스테인 잔기(임의로 독소의 C-말단 근처에 위치)를 개질하는 것을 포함하고, 이는 설프하이드릴 기를 독소의 다른 아미노산, 바람직하게는 1차 구조에서 시스테인으로부터 아미노산이 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40개 이상 떨어져 있는 위치의 다른 아미노산과 가교결합시키는 가교제(바람직하게는 헤테로이작용성 가교제)로 독소를 처리하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 다른 아미노산은 1차 아민기를 포함하고, 보다 바람직하게는 아미노산은 리신이다.

일부 구체예에서, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%를 초과하는 독소는 SDS-PAGE에 의해 평가되는 경우에 처리 후에 원래 분자량의 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%, 보다 바람직하게는 1 내지 50%, 가장 바람직하게는 5 내지 10% 이내의 분자량을 보유한다. 바람직하게는, 독소는 화학적 화합물에 공유 결합함에 의해 개질되는 수개의 아미노산 잔기로 인하여 무독성 처리 후에 다소 더 높은 분자량을 가진다. 그러나, 본 발명의 방법은 바람직하게는 독소를 다른 독소 분자에 공유 결합시켜 다량체 4차 구조를 가진 독소가 형성되도록 하거나, 독소를 다른 큰 단백질, 다당류, 또는 지질다당류에 공유결합시킴에 의해 과도한 독소의 컨쥬게이션을 포함하지 않는다. 가장 바람직하게는 WO96/05859에 개시된 방법, 단백질 또는 생성물은 본 발명에 포함되지 않는다.

본 발명의 방법은 박테리아 독소를 무독화하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 독소는 티올-활성화된 세포용해소, A. 피오제네스(A. pyogenes)로부터의 피올리신, B. 세레우스(B. cereus)로부터의 세레올리신, B. 쑤린지엔시스(B. thuringiensis)로부터의 쑤린지올리신 O, B. 라터스포러스(B. latersporus)로부터의 라터스포로리신, C. 비퍼멘탄스(C. bifermentans)로부터의 비퍼멘톨리신, C. 보튤리눔(C. botulinum)으로부터의 보튜키놀리신, C. 카우보엘(C. chauvoel)으로부터의 카우보엘리신, C. 히스톨리티쿰(C. histolyticum)으로부터의 히스톨리티콜리신, C. 노비이(C. novyi) 타입 A로부터의 오에데마토리산, C. 퍼프린겐스(C. perfringens)로부터의 퍼프린고리신 O, C. 셉티쿰(C. septicum)으로부터의 셉티콜리신 O, C. 소르델리이(C. sordellii)로부터의 소르델리리신, C. 테타니(C. tetani)로부터의 테타놀리신, L. 이바노비(L. ivanovi)로부터의 이바놀리신 O, L. 모노사이토게네스로부터(L. monocytogenes)의 리스테리올리신 O, L. 세엘리게리(L. seeligeri)로부터의 세엘리게릴리신 O, P. 알베이(P. alvei)로부터의 알베올리신, S. 피오게네스(S. pyogenes), S. 캐니스(S. canis), 또는 S. 에퀴시밀리스(S. equisimillis)로부터의 스트렙토리신 O, S. 인터메디우스(S. intermedius)로부터의 인터메딜리신, S. 수이스(S. suis)로부터의 수일리신, 또는 S. 뉴모니애(S. neumoniae)로부터의 뉴몰리신을 포함하며, 이들은 야생형이거나 상기 기술된 PdA 및 PdB와 같은 낮은 수준의 독성을 가진 유전적으로 개질된 독소일 수 있다(WO90/06951, WO99/03884).

본 방법은 또한 나이세리아 독소 FrpA, FrpC(WO92/01460), FrpB(참조: Microbiology 142; 3269-3274, 1996; J. Bacteriol. 181; 2895-2901, 1999), NM-ADPRT(13^th International Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani et al p135)를 무독화하는 데 사용될 수 있다. FrpA 및 FrpC는 이러한 두개의 단백질 사이에 보존되는 영역을 함유하고 독소의 바람직한 단편은 이러한 보존된 단편을 함유하는 폴리펩티드, 바람직하게는 FrpA/C의 서열의 아미노산 227번 내지 1004번을 함유하는 폴리펩티드일 것이다.

본 발명의 방법은 또한 아데닐레이트 사이클라제(CyaA)(Glaser, 1988, Mol. Microbiol. 2: 19-30), 피부괴사성 독소(Livey, 1984, J. Med, Microbiol. 17: 91-103) 및 백일해 독소(PT)(Munoz et al., 1981, Infect Immun 33: 820-826)를 포함하는 보르데텔라 독소(Bordetella toxins)을 무독화하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 테타누스 독소(TT) 및 디프테리아 독소(DT) 및 오토리신 및 헤모리신을 포함하는 S. 아우레우스(S. aureus) 및 S. 에피덜미디스(S. epidermidis)로부터의 독소를 무독화하는데 유용하다(WO01/98499, WO02/59148).

본 발명의 방법은 적어도 90%, 바람직하게는 95%, 96%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 99.99%의 독소의 독성 및/또는 용혈 활성의 양을 감소시킨다. (용혈 활성은 실시예 3의 방법을 사용하여 측정되고, 독성은 실시예 5의 방법에 의해 측정될 수 있다). 천연 뉴몰리신은 뉴몰리신 mg 당 500,000 내지 1,000,000 유닛의 용혈 활성을 가진다. 일부 점 돌연변이된 뉴몰리신 변이체는 독성 및 용혈 활성을 감소시켰다. 변이체 뉴몰리신의 무독화는 용혈 활성이 감소되는 보다 낮은 출발점으로 인하여 용혈 활성과 같은 높은 백분율 감소를 달성할 수 없을 수 있으나, 이는 남아 있는 용혈 활성의 대부분이 본 발명의 방법에 의해 제거되는 것이 예견된다.

본 발명의 방법의 무독화 단계는 바람직하게는 실질적으로 비가역적인 가교반응을 제공한다. 가역성은 무독화하고 적어도 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 동안 25℃ 초과, 바람직하게는 30℃ 초과, 보다 바람직하게는 35℃ 초과, 가장 바람직하게는 37℃ 초과의 온도에서 인큐베이션 한 후에 바로 무독화된 독소의 용혈 활성의 수준을 모니터링함에 의해 평가된다. 실질적으로 비가역적인 반응은 실질적으로 비가역적인 무독화로 귀착되고, 이는 상기 기술된 바와 같이 상승된 온도에서 인큐베이션 한 후에 100%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 미만으로 용혈 활성 수준이 상승하는 반응으로서 정의된다. 많은 무독화 방법, 예를 들어 포름알데하이드 처리를 이용하는 많은 방법은 안정적이지 않고 시간에 따라 독성이 증가되는 무독화로 귀착된다.

본 발명의 방법의 바람직한 무독화 단계에서, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 98%를 초과하는 독소가 가교반응 후에 단량체 4차 구조를 보유한다. 많은 가교제는 분자간 가교결합(예를 들어, 포름알데하이드 및 글루타르알데하이드)을 형성한다. 이는 일부 에피토프가 응집체 내에 숨겨질 것이기 때문에 독소의 면역학적 특성에 영향을 줄 수 있다. 본 발명의 방법은 바람직하게는 아미노산 잔기를 단순히 개질하는 것, 바람직하게는 아미노산의 설프하이드릴 및/또는 1차 아민 기를 단순히 개질하는 것 및/또는 주로 분자간 가교결합의 형성을 포함한다. 이렇게 생성된 단량체 4차 구조는 에피토프가 독소의 표면에 노출된 채로 존재하게 한다.

무독화 단계의 바람직한 구체예에서, 가교제는 헤테로이작용성이다. 바람직한 가교제는 1차 아민기와 선택적, 보다 바람직하게는 특이적으로 반응하는 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 기를 함유한다. 바람직하게는, 가교제는 설프하이드릴 기와 선택적, 보다 바람직하게는 특이적으로 반응하는 말레이미드 기를 함유한다. 약 pH 7에서, 말레이미드기는 아민과 반응하는 것 보다 1000배 빠르게 설프하이드릴 기와 반응한다. 바람직하게는, 가교제는 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 기 및 말레이미드 기 둘 모두를 함유한다. 가교제는 바람직하게는 보다 덜 효과적인 무독화를 유발하기 때문에 환원제를 사용하여 절단될 수 없다.

가교제의 반응기 사이의 거리는 무독화의 효율에 영향을 줄 수 있다. 바람직하게는, 아민 및 설프하이드릴 기와 반응성인 가교제의 기 사이의 거리는 본 발명의 방법에서 1.5 내지 20 옹스트롱, 보다 바람직하게는 5 내지 15 옹스트롱, 가장 바람직하게는 약 10 옹스트롱이다. 바람직하게는, 박테리아 독소 상의 아미노산 잔기는 5, 7, 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 500 옹스트롱 이상인 기의 첨가에 의해 개질된다. 바람직하게는 개질 기는 5 내지 100 옹스트롱, 보다 바람직하게는 10 내지 20 옹스트롱 크기이다.

본 발명의 방법의 무독화 단계는 충분한 잔기가 개질되어 입체 간섭 및/또는 형태적 변화가 박테리아 독소의 기능을 억제하도록 한다. 바람직하게는 박테리아 독소의 적어도 5, 7, 10, 12, 14, 15, 20 또는 25개 아미노산 잔기가 개질된다. 미반응 말레이미드기가 가교제 상에 존재하는 경우에, 엘만(Ellman) 반응은 독소의 각 분자에 부착된 가교제 분자의 수를 (간접적으로) 산출하는 데 사용될 수 있다(Ellman 1959 Arch. Biochem. Biophys. 82; 70).

바람직한 가교제는 SMPT, 설포-LC-SMPT, 설포-KMUS, LC-SMCC, KMUA, 설포-LC-SPDP, LC-SPDP, SMPB, 설포-SMPB, SMPH, 설포-SMCC, SMCC, SIAB, 설포-SIAB, GMBS(N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르), 설포-GMBS, MBS, 설포-MBS, 설포-EMCS, EMCA, EMCS, BMPS, SPDP, SBAP, BMPA, AMAS, SATP, 및 SIA(피어스)이다.

본 발명의 바람직한 방법에서, 독소는 5.0 내지 9.0, 바람직하게는 6.5 내지 8.0, 가장 바람직하게는 7.0 내지 7.8의 pH 조건하에서 화학적 화합물 또는 가교제로 처리된다. 말레이미드기의 설프하이드릴기로의 반응이 촉진되는 처리에서, 반응의 바람직한 pH는 6.0 및 8.0이고, 보다 바람직하게는 6.5 및 7.5이다. 반응 동안에 염의 바람직한 농도는 100mM 내지 1M이고, 보다 바람직하게는 150mM 내지 500mM이고, 가장 바람직하게는 200mM 내지 300mM이다. 그러나, 발명자들은 때때로 염화나트륨 또는 다른 염이 첨가되지 않는 낮은 염 농도에서 반응을 수행하는 것이 바람직하다는 것을 발견하였다. 반응이 7.6 내지 7.8의 pH에서 수행되는 경우에, 반응은 임의로 염의 첨가 없이 수행될 수 있다. 유사하게, 보다 높은 비율의 GMBS 대 독소의 사용은 7.0 내지 8.0의 pH 값에서 염의 첨가 없이 수행될 수 있다.

화학적 화합물 또는 가교제는 각 독소에 대해 바람직하게는 50-500, 보다 바람직하게는 130-350 또는 350 내지 900, 가장 바람직하게는 약 250배 몰 과량으로 사용된다. 폐렴구균 뉴몰리신은 31개 리신 잔기를 함유한다. 따라서, 뉴몰리신에 대한 화학적 화합물 또는 가교제의 248배 몰 과량은 각 리신 잔기에 대한 화학적 화합물 또는 가교제의 8배 몰 과량과 등가이다. 화학적 화합물 또는 가교제를 리신 잔기에 대해 바람직하게는 2-20, 보다 바람직하게는 4-15 또는 15-30, 가장 바람직하게는 약 8배 몰 비로 본 발명의 방법에 사용된다.

가교제를 이용한 처리는 적어도 15분 동안, 바람직하게는 적어도 30분 동안, 가장 바람직하게는 약 1시간 동안 4℃ 내지 40℃, 바람직하게는 15℃ 내지 25℃, 가장 바람직하게는 실온에서 진행된다. 본 발명의 방법은 추가로 설포하이드릴 기를 함유하는 화합물을 사용하는 켄칭 단계를 추가로 포함하며, 바람직하게는 켄칭 화합물은 50, 100, 또는 120 초과의 분자량을 가지고, 보다 바람직하게는 켄칭 시약은 시스테인과 같은 아미노산이다. 대안적으로, 기는 말레이미드와 반응할 수 있는 펩티드 또는 다당류 잔기, 예를 들어 시스테인 잔기를 함유하는 펩티드와 반응할 수 있다. 이는 미반응 말레이미드기가 켄칭 단계 전에 존재하는 경우에 특히 적절하다.

무독화 단계는 상기 기술된 바와 같이 박테리아 독소에 사용하기에 적합하다. 바람직하게는 박테리아 독소는 스트렙토코커스 뉴모니애로부터 유래되고, 가장 바람직하게는 독소는 뉴몰리신이다. 뉴몰리신은 (상기 기술된 바와 같이) 천연 또는 재조합 단백질 또는 이의 독성을 감소시키도록 유전적으로 조작된 단백질이다. 독소, 바람직하게는 뉴몰리신, 또는 독소, 바람직하게는 뉴몰리신의 단편의 융합단백질이 본 발명의 방법을 사용하여 무독화될 수 있다.

따라서, 바람직한 구체예에서, 독소(예를 들어, 뉴몰리신)은 리신 및 시스테인 잔기와 반응성이고, 특정 크기인 기, 가장 바람직하게는 하기 중 하나 또는 바람직하게는 둘 모두가 일어나도록 10 내지 20 옹스트롱 떨어져 있는 반응성 기를 가지는 헤테로이작용성인 가교제로 무독화된다:

a) 독소의 5 내지 30개, 바람직하게는 약 12 내지 14개의 아미노산 잔기가 리신 또는 아르기닌 잔기에 바람직하게 공유 결합하는 가교 분자에 의해 개질되고(바람직하게는, 엘만 반응에 의해 간접적으로 측정됨), 다른 말단은 켄칭(바람직하게는, 시스테인으로)되고/되거나;

b) 독소의 독성에 관련된 시스테인 측쇄(바람직하게는, 독소의 C 말단 쪽으로)가 독소의 다른 측쇄(바람직하게는, 리신 또는 아르기닌 잔기)에 가교되고, 이는 바람직하게는 독소의 1차 서열에서 시스테인 잔기로부터 2, 5, 10, 20, 30 또는 40개 초과의 아미노산에 의해 분리된다.

추가의 바람직한 구체예에서, 독소(바람직하게는 뉴몰리신)는 바람직하게는 1차 아민기를 함유하는 아미노산, 보다 바람직하게는 리신과 반응하고, 특정 크기, 가장 바람직하게는 10 내지 100 옹스트롱을 가져 독소가 아미노산 잔기에 결합된 5 내지 30개, 보다 바람직하게는 약 14개의 화학적 화합물에 포함되는 일작용성 화학적 화합물로 무독화된다.

다당류 컨쥬게이트

예방접종에 대한 다당류 접근법과 관련된 문제는 다당류 그 자체가 불량한 면역원이라는 사실이다. 이를 극복하기 위하여, 다당류는 방관자 T-세포(bystander T-cell) 도움을 제공하는 단백질 담체에 컨쥬게이션될 수 있다. 본 발명의 공정은 유리하게는 박테리아 다당류, 예를 들어 지질-올리고당류 또는 바람직하게는 협막 다당류에 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신을 컨쥬게이션하는 추가의 단계를 함유할 수 있다.

본 발명의 바람직한 컨쥬게이트는 스트렙토코커스 뉴모니애로부터 유래된 협막 다당류에 컨쥬게이션된 본 발명의 방법에 의해 수득된 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신을 포함한다. 폐렴구균 협막 다당류 항원은 바람직하게는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F(가장 바람직하게는 혈청형 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 및 23F) 또는 상기 컨쥬게이트(4, 7, 9, 11, 13, 또는 23)의 둘 이상의 혼합물로부터 선택된다.

본 발명의 공정에 의해 정제된 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신은 또한 다른 균주의 박테리아로부터의 협막 다당류에 컨쥬게이션된다. 이러한 다당류는 예를 들어, H. 인플루엔자, H. 인플루엔자 타입 B(Hib), N. 메닝기티디스 그룹 A, C, W, Y, S. 뉴모니애 이외의 스트렙토코커스(예를 들어, 그룹 B 스트렙토코커스, S. 피오게네스, 등), 스태필로코커스(예를 들어, S. 아우레우스, S. 에피덜미디스), 대장균, 엔테로코커스(예를 들어, E. 패칼리스 및 E. 패시움) 등으로부터 분리될 수 있다. 바람직하게는, 다당류는 H. 인플루엔자 타입 B(Hib), 및/또는 N. 메닝기티디스 그룹 A, C, W135, 및/또는 Y로부터 유래된다.

다당류는 임의의 공지된 방법(예를 들어, 문헌[Likhite, US patent 4,372,945] 및 문헌[Armor et al., US patent 4,474,757)에 의해 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신에 연결될 수 있다. 바람직하게는, CDAP 컨쥬게이션이 수행된다(WO 95/08348). 면역원성을 증강시키기 위하여, 다당류는 애쥬번트화(adjuvant)되고/거나 동결건조될 수 있다. 본 발명의 다당류는 완전한 크기이거나 보다 적은 다당류 또는 올리고당류로 정제 후에 크기 조절될 수 있다.

본 발명의 공정은 바람직하게는 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신을 백신으로 제형화하는 추가의 단계를 포함한다.

단백질 및 면역원성 조성물

본 발명의 추가의 구체예는 본 발명의 방법에 의해 정제된 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신이다. 이는 본 발명의 공정에 의해 제조된 뉴몰리신-박테리아 협막 다당류 컨쥬게이트를 포함한다.

본 발명의 추가의 구체예는 (상기 기술된 바와 같이) 본 발명의 방법에 의해 수득된 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신 또는 뉴몰리신-박테리아 협막 다당류를 포함하는 면역원성 조성물이다.

본 발명의 면역원성 조성물은 바람직하게는 폐렴구균 콜린 결합 단백질 패밀리의 하나 이상의 일원, 바람직하게는 콜린 결합 단백질 A 또는 이의 면역원성 단편, 및/또는 폴리히스티딘 트리아드(triad) 패밀리의 하나 이상의 일원(이의 융합 단백질을 포함), 바람직하게는 PhtA, PhtB, PhtD 또는 PhtE 또는 이의 면역원성 단편을 추가로 포함한다.

콜린 결합 단백질 패밀리(CbpX)와 관련하여, 이 패밀리의 일원은 원래 콜린-친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있는 폐렴구균 단백질로서 동정되었다. 콜린 결합 단백질 모두는 세포벽 타이코산(teichoic acid) 및 막-관련 리포타이코산의 포스포릴콜린 잔기에 비공유적으로 결합되어 있다. 구조적으로, 이들은 단백질의 정확한 특성(아미노산 서열, 길이 등)이 다양할 수 있는 데도 불구하고, 전체 패밀리에 걸쳐 공통인 수개의 영역을 가진다. 일반적으로, 콜린 결합 단백질은 N 말단 영역(N), 보존된 반복 영역(R1 및/또는 R2), 프롤린 풍부 영역(P), 및 대략 단백질의 반을 차지하는 여러 반복 영역으로 구성된 보존된 콜린 결합 영역(C)을 포함한다. 이 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "콜린 결합 단백질 패밀리(CbpX)"는 WO97/41151에서 동정된 콜린 결합 단백질, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD 및 CbpG로 구성된 군으로부터 선택된다. CbpA는 WO97/41151에 개시되어 있다. CbpD 및 CbpG는 WO00/29434에 개시되어 있다. PspC는 WO97/09994에 개시되어 있다. PbcA는 WO98/21337에 개시되어 있다. SpsA는 WO98/39450에 개시된 콜린 결합 단백질이다. 바람직하게는, 콜린 결합 단백질은 CbpA, PbcA, SpsA 및 PspC로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 바람직한 구체예는 "CbpX"가 상기 정의된 바와 같고, "트렁케이트(truncate)"가 콜린 결합 단백질 (C)의 50% 이상이 결핍된 CbpX 단백질을 의미하는 CbpX 트렁케이트이다. 바람직하게는, 이러한 단백질은 전체 콜린 결합 영역이 결핍되어 있다. 보다 바람직하게는, 이러한 단백질 트렁케이트는 (i) 콜린 결합 영역 및 (ii) 단백질의 N-말단 절반이 또한 결핍되어 있으나, 하나 이상의 반복 영역(R1 또는 R2)를 보유한다. 보다 바람직하게는, 트렁케이트는 2개 반복 영역(R1 및 R2)를 가지고, 보다 바람직하게는 트렁케이트는 프롤린 풍부 영역(P)를 보유한다. 이러한 바람직한 구체예의 예는 WO99/51266 또는 WO99/51188에 설명된 NR1xR2 및 R1xR2, 및 NR1XR2P이나, 유사한 콜린 결합 영역이 결핍된 다른 콜린 결합 단백질 또한 본 발명의 범위내에서 고려된다.

LytX 패밀리는 세포 용해와 관련된 막 관련 단백질이다. N-말단 도메인은 콜린 결합 도메인(들)을 포함하나, LytX 패밀리는 상기 언급된 CbpA 패밀리에서 발견된 모든 특성을 가지지 않으며, 따라서 LytX 패밀리는 CbpX 패밀리와 별개인 것으로 고려된다. CbpX 패밀리와 대조적으로, C-말단 도메인은 LytX 단백질 패밀리의 촉매성 도메인을 함유한다. 패밀리는 LytA, B, 및 C를 포함한다. LytX 패밀리와 관련하여, LytA는 문헌(Ronda et al., Eur J Biochem, 164: 621-624 (1987))에 개시되어 있다. LytB는 또한 WO98/18930에 개시되어 있고, 이는 또한 Sp46으로서 언급된다. LytC는 또한 WO98/18930에 개시되어 있고, 이는 또한 Sp91로서 언급된다. 이 패밀리의 바람직한 일원은 LytC이다.

다른 바람직한 구체예는 "LytX"가 상기 정의된 바와 같고, "트렁케이트"가 콜린 결합 영역의 50% 이상이 결핍된 LytX 단백질을 의미하는 LytX 트렁케이트이다. 바람직하게는, 이러한 단백질은 전체 콜린 결합 영역이 결핍되어 있다. 이러한 트렁케이트의 예는 본 발명의 실시예 부분에서 발견될 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예는 CbpX 트렁케이트-LytX 트렁케이트 키메라 단백질(또는 융합체)이다. 바람직하게는, 이는 CbpX의 NR1xR2(또는 R1xR2, 또는 NR1XR2P) 및 LytX의 C-말단 부분(Cterm, 즉, 콜린 결합 도메인이 결핍)(예를 들어, LytCCterm 또는 Sp91Cterm)을 포함한다. 보다 바람직하게는, CbpX는 CbpA, PbcA, SpsA 및 PspC로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 이는 CbpA이다. 바람직하게는, LytX는 LytC이다(또한 Sp91로도 언급).

본 발명의 다른 구체예는 PspA 또는 PsaA, 또는 LytX와의 융합 단백질로서 임의로 발현되는 콜린 결합 도메인(C)이 결핍된 트렁케이트이다. 바람직하게는 LytX는 LytC이다.

Pht(폴리히스티딘 트리아드) 패밀리는 단백질 PhtA, PhtB, PhtD, 및 PhtE를 포함한다. 패밀리는 지질화(lipidation) 서열, 프롤린-풍부 영역에 의해 분리된 두개의 도메인, 및 금속 또는 누클레오시드 결합 또는 효소 활성과 관련될 수 있는 수개의 히스티딘 트리아드, (3-5) 코일링된-코일(coiled-coil) 영역, 보존된 N-말단, 및 이종성 C 말단을 특징으로 한다. 시험된 폐렴구균의 모든 균주에 존재한다. 상동성 단백질은 또한 다른 스트렙토코커스 및 나이세리아에서 발견되었다. 패밀리의 바람직한 일원은 PhtA, PhtB, 및 PhtD를 포함한다. 보다 바람직하게는, PhtA 또는 PhtD를 포함한다. 그러나, 용어 Pht A, B, D, 및 E는 하기 인용문헌에 개시된 서열을 가지는 단백질 뿐만 아니라 인용된 단백질과 90% 이상 동일한 서열 상동성을 가지는 이들의 천연(및 인공) 변이체에 관한 것으로 이해된다. 바람직하게는 적어도 95% 동일하고, 가장 바람직하게는 97% 동일하다.

본 발명의 면역원성 조성물은 히스티딘 트리아드 단백질의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 바람직한 융합 단백질은 i) PhtE 또는 이의 단편에 연결된 PhtD 또는 이의 단편, 또는 ii) PhtE 또는 이의 단편에 연결된 PhtB 또는 이의 단편을 함유한다.

PhtX 단백질과 관련하여, PhtA는 문헌(WO98/18930)에 개시되어 있고 이는 또한 Sp36으로 언급된다. 상기에서 알 수 있는 바와 같이, 이는 폴리히스티딘 트리아드 패밀리로부터의 단백질이고 LXXC의 타입 II 시그날 모티프를 가진다.

PhtD는 WO00/37105에 개시되어 있고 이는 또한 Sp036D로서 언급된다. 상기에서 알 수 있는 바와 같이, 이는 또한 폴리히스티딘 트리아드 패밀리로부터의 단백질이고 타입 II LXXC 시그날 모티프를 가진다. PhtB는 WO00/37105에 개시되어 있고, 이는 또한 Sp036B로 언급된다. PhtB 패밀리의 다른 일원은 WO00/17370에 개시되어 있는 C3-분해성 폴리펩티드이다. 이 단백질은 또한 폴리히스티딘 트리아드 패밀리에 속하며 타입 II LXXC 시그날 모티프를 가진다. 바람직한 면역학적 작용 등가물은 WO98/18930에 개시되어 있는 단백질 Sp42이다. PhtB 트렁케이트(대략 79kD)는 WO99/15675에 개시되어 있으며 PhtX 패밀리의 일원으로서 또한 고려된다.

PhtE는 WO00/30299에 개시되어 있고 BVH-3으로서 언급된다.

중이염과 관련된 하나 이상의 병원체에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 본 발명의 면역원성 조성물을 제조하기 위하여, 본 발명의 면역원성 조성물이 S. 뉴모니애, 유형 분류할 수 없는(non-typable) 헤모필루스 인플루엔자, 모락셀라 카타랄리스, RSV, 파라인플루엔자 바이러스, 및/또는 인플루엔자 바이러스의 하나 이상(2, 3, 4, 5, 6)으로부터의 항원을 추가로 포함하는 것이 유리하다.

본 발명은 또한 다양한 서로 다른 병원체에 대한 보호를 제공하는 조합 백신을 포함한다. 많은 소아과 백신은 이제 소아가 주사를 맞는 횟수를 줄이기 위하여 조합 백신으로서 투여된다. 따라서, 소아과 백신을 위하여, 다른 병원체로부터의 다른 항원이 본 발명의 백신과 함께 제형화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 백신은 디프테리아 톡소이드(DT), 테타누스 톡소이드(TT), 및 백일해 성분[임의로 퍼탁틴(pertactin)(PRN) 및/또는 어글루티닌 1+2로 통상적으로 무독화된 백일해 톡소이드(PT) 및 섬유상 헤마글루티닌(FHA)], 예를 들어, DT, TT, PT, FHA, 및 PRN 항원을 함유하는 시판되는 백신 INFANRIX-DTPa^TM(스미스클라인비이참 바이올로지컬스)를 포함하는 널리 공지된 "3가" 조합 백신으로 제형화(되거나 별개로 동시에 투여)되거나, 예를 들어 트리탄릭스(Tritanrix)^TM으로 스미스클라이비이참 바이올로지컬스에 의해 시판되는 전세포 백일해 성분으로 제형화될 수 있다. 조합된 백신은 또한 다른 항원, 예를 들어 B형 간염 표면 항원(HBsAg), 소아마비 바이러스 항원(예를 들어, 불활성화된 3가 소아마비 바이러스-IPV), 모락셀라 카타랄리스 외막 단백질, 유형 분류할 수 없는 헤모필루스 인플루엔자 단백질, N. 메닝기티디스 B 외막 단백질을 포함할 수 있다.

조합 백신(특히 중이염 예방을 위한 백신)에 포함될 수 있는 바람직한 모락셀라 카타랄리스 단백질 항원의 예는 다음과 같다: OMP106[WO97/41731(Antex) & WO96/34960(PMC)]; OMP21; LbpA 및/또는 LbpB[WO98/55606(PMC)]; TbpA 및/또는 TbpB[WO97/13785 & WO97/32980(PMC)]; CopB[Helminen ME et al, 1993 Infect. Immun. 61: 2003-2010]; UspA1 및/또는 UspA2[WO93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR(PCT/EP99/03824); PilQ(PCT/EP99/03823); OMP85(PCT/EP00/01468); lipo06(GB 9917977.2); lipo10(GB 9918208.1); lipo11(GB 9918302.2); lipo18(GB 9918038.2); P6(PCT/EP99/03038); D15(PCT/EP99/03822); OmplA1(PCT/EP99/06781); Hly3(PCT/EP99/03257), 및 OmpE. 조합 백신(특히 중이염 예방을 위한 백신)에 포함될 수 있는 유형 분류할 수 없는 헤모필루스 인플루엔자의 예는 다음을 포함한다: 핌브린(Fimbrin) 단백질[(US5766608-Ohio State Research Foundation)] 및 이로부터의 펩티드를 포함하는 융합체[예. LB1(f) 펩티드 융합체; US 5843464 (OSU) 또는 WO99/64067]; OMP26[WO97/01638(Cortecs)]; P6[EP 281673 (State Unicersity of New York)]; TbpA 및/또는 TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); 단백질 D (EP594610); P2; 및 P5(WO94/26304).

고려되는 다른 조합물은 바이러스 항원, 예를 들어 인플루엔자(약독화된, 스플릿(split) 또는 서브유닛)[예를 들어, 표면 당단백질 뉴라미니다제(NA) 및 헤마글루티닌(HA), 문헌(예를 들어, Chaloupka I. et al, Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15:121-127) 참조], RSV(예를 들어, F 및 G 항원 또는 F/G 융합물, 문헌(예를 들어, Schmidt A. C. et al., J Virol, May 2001, p4594-4603), 바리셀라(예를 들어, 약독화된 당단백질 I-V, 등) 및 MMR(홍역, 유행성 이하선염, 풍진)의 임의의 (또는 모든) 성분으로부터의 바이러스 항원과 조합된 본 발명의 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신이다.

백신

본 발명의 추가의 구체예는 본 발명의 방법에 의해 수득된 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신 또는 뉴몰리신-박테리아 협막 다당류 컨쥬게이트 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 및 임의로 애쥬번트를 포함하는 백신이다.

본 발명의 백신은 상기 기술된 본 발명의 면역원성 조성물 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다.

본 발명의 백신은 S. 뉴모니애 감염증 및/또는 중이염에 대한 보호성 면역 반응을 유발할 수 있다.

본 발명의 추가의 구체예는 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신을 취하고, 이를 약제학적으로 허용되는 부형제 및 임의로 하나 이상의 상기에 기술된 추가의 항원과 함께 백신으로 제형화함으로써 백신을 제조하는 방법을 포함한다.

본 발명의 추가의 구체예는 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물의 투여를 포함하는, 박테리아 감염, 바람직하게는 스트렙토코커스 뉴모니애 감염 또는 중이염의 치료 또는 예방 방법을 포함한다.

본 발명의 추가의 구체예는 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신 및/또는 뉴몰리신-박테리아 협막 다당류 컨쥬게이트(이들 중 어느 하나는 본 발명의 방법에 의해 수득됨)의 박테리아 감염, 바람직하게는 스트렙토코커스 뉴모니애 감염 또는 중이염의 치료 또는 예방을 위한 백신의 제조에서의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 백신은 바람직하게는 애쥬번트화된다. 적합한 애쥬번트는 수산화 알루미늄 겔(백반) 또는 인산 알루미늄과 같은 알루미늄 염을 포함하나, 또한 칼슘, 마그네슘, 철 또는 아연의 염일 수 있거나 아실화된 티로신, 또는 아실화된 당, 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도체화된 다당류 또는 폴리포스파젠의 불용성 현탁액일 수 있다.

애쥬번트가 TH1 타입 반응의 우선적인 유도물질인 것으로 선택되는 것이 바람직하다. Th1-타입 사이토카인의 높은 수준은 주어지 항원의 세포 매개 면역 반응의 유도를 촉진하려는 경항이 있는 반면, 높은 수준의 Th2-타입 사이토카인은 항원에 대한 체액성 면역 반응의 유도를 촉진하려는 경향이 있다.

Th1 및 Th2-타입 면역 반응의 구별은 절대적인 것이 아니라는 것을 기억하는 것이 중요하다. 실제로는, 개인은 Th1 우세 또는 Th2 우세인 것으로 설명되는 면역 반응을 지지할 것이다. 그러나, 모스만 및 코프만(참조: Mosmann, T.R. and Coffman, R. L., 1989, TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties, Annual Review of Immunology, 7, p145-173)에 의해 뮤린 CD4+ve T 세포 클론에 기재된 것의 관점에서 사이토카인 패밀리를 고려하는 것이 편리하다. 전통적으로, Th1-타입 반응이 T-림프구에 의한 INF-γ 및 IL-2 사이토카인의 생성과 관련된다. Th1-타입 면역 반응의 유도와 직접 관련된 다른 사이토카인은 IL-12와 같이 T-세포에 의해 생성되지 않는다. 대조적으로, Th2-타입 반응은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10의 분비와 관련된다. Th1 반응을 우세하게 촉진하는 적합한 애쥬번트 시스템은 하기를 포함한다: 모노포스포릴 지질 A 또는 이의 유도체, 특히 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)(이의 제조를 위해서는 GB 2220211 A 참조); 및 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄 염(예를 들어, 인산 알루미늄 또는 수산화 알루미늄) 또는 수중오일 에멀젼의 조합물. 이러한 조합물에서, 항원 및 3D-MPL은 동일한 미립자 구조체에 함유되고 이는 항원 및 면역자극성 신호의 효율적인 전달을 가능하게 한다. 연구는 3D-MPL이 백반-흡착된 항원의 면역원성을 추가로 증강시킬 수 있다는 것을 증명한다(참조: Thoelen et al., Vaccine, 1998, 16: 708-14; EP 689454-B1).

증강된 시스템은 모노포스포릴 지질 A 및 사포닌 유도체의 조합물, 특히 WO94/00153에 개시된 QS21 및 3D-MPL의 조합물 또는 WO96/33739에 개시된 바와 같이 QS21이 콜레스테롤로 켄칭되는 덜 반응성인 조성물에 관한 것이다.

수중 오일 중에서 QS21, 3D-MPL, 및 토코페롤을 포함하는 특히 효능있는 애쥬번트 제형은 WO95/17210에 기재되어 있고 이는 바람직한 제형이다.

바람직하게는, 백신은 추가적으로 사포닌, 보다 바람직하게는 QS21을 포함한다. 제형은 또한 수중 오일 에멀젼 및 토코페롤을 포함할 수 있다(WO 95/17210).

본 발명은 또한 본 발명의 세포용해소를 3D-MPL과 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 혼합하는 것을 포함하는 백신 제형을 제조하는 방법을 제공한다.

메틸화되지 않은 CpG 함유 올리고누클레오티드(WO96/02555)는 또한 TH1 반응의 바람직한 유도물질이고 본 발명에 사용되기에 적합하다.

본 발명의 추가의 측면에서, 본원에 기술된 백신의 의약용 용도를 제공한다. 일 구체예에서, 안전하고 유효한 양의 본 발명의 백신 및 임의로 Th1 애쥬번트를 노인(55세 이상) 환자에게 투여하는 것을 포함하여 노인의 폐렴을 예방하거나 개선시키는 방법이 있다.

추가의 구체예에서, 본 발명의 세포용해소, 바람직하게는 뉴몰리신을 임의로 상기 기술된 하나 이상의 추가 항원 및 임의로 Th1 애쥬번트와 함께 포함하는 안전하고 유효한 양의 백신을 유아 또는 소아에 투여하는 것을 포함하여 유아(24개월 이하) 또는 소아(통상적으로 24개월 내지 5살)의 중이염을 예방하거나 개선시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 백신 제조물은 상기 백신을 전신성 경로 또는 점막성 경로를 통하여 투여함에 의해, 감염되기 쉬운 포유동물(바람직하게는, 인간 환자)을 보호하거나 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 투여는 근내, 복막내, 피내, 또는 피하 경로를 통한 주사; 또는 구강/소화관, 기도, 비뇨생식관으로의 점막성 투여를 포함할 수 있다. 폐렴 또는 중이염을 치료하기 위해서 백신의 비강내 투여가 바람직하다(폐렴구균의 비인강 보균이 보다 효과적으로 예방되어 초기 단계에서 감염을 약화시킬 수 있음으로 인함). 본 발명의 백신이 1회의 투여량으로 투여될 수 있는 데도 불구하고, 이들의 성분은 또한 동시에 또는 서로 다른 시점에 함께 동시투여될 수 있다(예를 들어, 다당류가 백신에 존재하는 경우에, 이들은 서로에 대한 면역 반응의 최적의 협동을 위해 박테리아 단백질 조합물의 투여 1 내지 2 주 후에 또는 동시에 별개로 투여될 수 있다). 단일 투여 경로에 더해, 2개의 상이한 투여 경로가 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 항원은 ID(피내)로 투여될 수 있는 반면, 박테리아 단백질은 IM(근내) 또는 IN(비강내)로 투여될 수 있다. 다당류가 존재하는 경우에, 이들은 IM(또는 ID)로 투여될 수 있고, 박테리아 단백질은 IN(또는 ID)로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 백신은 감작(priming) 투여를 위하여 IM으로 투여될 수 있고, 부스터(booster) 투여를 위하여 IN으로 투여될 수 있다.

각 백신 용량 중의 컨쥬게이트 항원의 양은 통상적인 백신의 중요한 부작용 없이 면역보호 반응을 유발하는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 어떤 특정 면역원이 적용되느냐 및 어떻게 제시되는지에 따라 다양하다. 백신 중의 단백질 항원의 함량은 통상적으로 1-100㎍, 바람직하게는 5-50㎍, 가장 통상적으로는 5-25㎍일 것이다. 다당류가 포함되는 경우에 일반적으로 각 용량은 0.1-100㎍의 다당류, 바람직하게는 0.1-50㎍, 보다 바람직하게는 0.1-10㎍의 다당류를 포함하고, 1 내지 5㎍의 다당류가 가장 바람직한 범위이다.

특정 백신을 위한 최적량의 성분은 피검체에서 적절한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 예방접종 후에, 피검체는 적절한 간격으로 1회 또는 수회의 부스터(booster) 면역접종을 받을 수 있다. 통상적으로, 백신은 항원(단백질), 애쥬번트, 및 부형제 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 것이다.

백신 제조는 일반적으로 백신 디자인(Vaccine Design)에 관한 문헌("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.)(1995) Plenum Press New York)에 기재되어 있다. 리포솜내에서의 캡슐화는 문헌(Fullerton, US patent 4,235,877)에 기술되어 있다.

본 발명의 백신은 임의의 경로에 의해 투여될 수 있고, 설명된 백신의 피부로(ID)의 투여는 본 발명의 일 구체예를 형성한다. 인간 피부는 표피를 씌우는 각질층이라 불리는 외곽의 "각질"의 큐티클을 포함한다. 이러한 표피 아래에 진피라 불리는 층이 있는데, 이는 다시 피하 조직을 덮는다. 연구자들은 피부로의 백신의 주사, 특히 진피로의 백신의 주사는 많은 추가 이점과 관련될 수 있는 면역 반응을 자극한다는 것을 밝혀내었다. 본원에 기술된 백신을 이용한 피내 예방접종은 본 발명의 바람직한 특징을 형성한다.

피내 주사의 통상적인 기술, "망토(mantoux) 방법"은 피부를 세정하고, 한손으로 피부를 스트레칭하고, 좁은 게이지 주사기(needle)(26-31게이지)의 빗면이 위쪽을 향하도록 하여 주사기를 10 내지 15°의 각으로 주입한다. 주사기의 빗면이 주입되자마자 주사기의 몸통을 낮추고 추가로 진행시켜 피부 하에 약간의 압력을 제공하여 이를 상승시킨다. 그러면, 액체는 매우 천천히 주입되어 피부 표면에 수포 또는 혹을 형성하고 그 후에 주사기를 천천히 회수한다.

보다 최근에 액체 제제를 피부로 또는 피부를 거쳐 투여되도록 특별하게 설계된 장치가 기술되어 있으며, 예를 들어 WO99/34850 및 EP1092444에 기술된 장치, 또한 예를 들어 WO01/13977; US5,480,381; US5,599,302; US5,334,144; US5,993,412; US5,649,912; US5,569,189; US5,704,911; US5,383,851; US5,893,397; US5,466,220; US5,339,163; US5,312,335; US5,503,627; US5,064,413; US5,520,639; US 4,596,556; US4,790,824; US4,941,880; US4,940,460; WO97/37705; 및 WO97/13537에 기재된 제트 주입 장치가 있다. 백신 제조물의 피내 투여를 위한 대안적인 방법은 통상적인 시린지(syringe) 및 주사기 또는 고형 백신(WO99/27961)의 탄도 전달(ballistic delivery) 또는 경피성 패치(WO97/48440; WO98/28037)를 위해 설계된 장치, 또는 피부의 표면에 전달되는 장치(경피성 또는 피부를 통한 전달 WO98/20734; WO98/28037)를 포함한다.

본 발명의 백신이 피부 또는 보다 구체적으로 진피에 투여되는 경우에, 백신은 작은 액체 부피, 특히 약 0.05㎖ 내지 0.2㎖의 부피이다.

본 발명의 피부 또는 피내 백신의 항원의 양은 근내 백신에서 발견되는 경우의 통상적인 용량과 유사할 수 있다. 따라서, 피내 백신에 존재하는 단백질 항원은 1 내지 100㎍, 바람직하게는 5 내지 50㎍일 수 있다. 유사하게, 각 백신 용량에 다당류 컨쥬게이트 항원이 존재하는 경우 이의 양은 일반적으로 0.1-100㎍, 바람직하게는 0.1-50㎍, 바람직하게는 0.1-10㎍의 다당류를 포함하는 것으로 예상되고, 이는 1 내지 5㎍일 수 있다. 그러나, 제형이 "적은 용량"일 수 있는 있다는 것이 피부 또는 피내 백신의 특징이다. 따라서, "적은 용량" 백신 중의 단백질 항원은 바람직하게는 용량 당 0.1 내지 10㎍, 바람직하게는 0.1 내지 5㎍으로 존재하고; 다당류 컨쥬게이트 항원이 존재하는 경우, 이는 용량 당 0.01 내지 1㎍, 바람직하게는 0.01 내지 0.5㎍의 다당류로 존재할 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "피내 전달"은 피부의 진피 영역에 백신을 전달하는 것을 의미한다. 그러나, 백신은 반드시 진피에만 위치하는 것은 아니다. 진피는 인간 피부에서 표면으로부터 약 1.0 내지 약 2.0mm에 존재하는 피부 층을 의미하지만, 개인마다 또 신체의 서로 다른 부위마다 차이가 있을 수 있다. 일반적으로, 피부 표면 아래 1.5mm에서 진피에 도달하는 것을 기대할 수 있다. 진피는 표면의 각질층 및 표피와 아래의 피하층 사이에 위치한다. 전달 방식에 따라, 백신은 궁극적으로 진피 내에만 또는 이에 주로 위치할 수 있거나, 이는 궁극적으로 표피 및 진피 내에 분포될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물 및 백신은 다양한 동물 모델 또는 인간 혈청으로 평가될 수 있다. 실례로서, 폐렴구균 감염을 평가하는데 하기 동물 모델이 사용될 수 있다. C3H/HeJ 마우스(6 내지 8주령)는 50㎕ CFA로 애쥬번트화된 15㎍의 단백질로 s.c.로 면역화될 수 있고, 3 내지 4주 후에 IFA로 15㎍ 단백질로 부스팅될 수 있다. 전신 감염으로부터 수동적 및 능동적 보호를 증명하기 위하여, 8 내지 10주에 15 내지 90 LD50 폐렴구균으로 복강내 주사에 의한 공격 전에 면역 혈청 또는 단백질이 마우스에 복강내 투여될 수 있다. 추가로, 단백질은 문헌(Wu et al Microbial Pathogenesis 1997; 23: 127-137)에 의해 마우스 코인두 집락화 모델에서 시험될 수 있다.

마우스에 더하여, 새끼 래트는 S. 뉴모니애에 의한 집락화 및 감염에 민감하다. 수동적인 보호 연구에서, 마우스 면역 혈청의 투여(100㎕ i.p. 또는 10㎕ i.n.)가 2 내지 5일령 래트 새끼에서 S. 뉴모니애(10㎕)의 비강내 투여에 의한 공격 전에 수행될 수 있다. 집락화는 코 세척물(20 내지 40 ㎕ 주입 및 10㎕ 회수)을 플레이팅하여 결정하였다.

조합 백신의 단백질 (또는 단백질 및 다당류) 성분간의 유리한 상호작용은 1가 백신에서 하위 보호성(sub-protective)일 수 있는 백신의 각 단백질 (또는 단백질 및 다당류)의 용량을 투여함에 의해 증명될 수 있다. 1가 백신과 비교하여 조합 백신의 증가된 보호성 효능은 성분간의 유리한 상호작용에 기인될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에서 예증된다. 실시예는 표준 기술을 사용하여 수행되고, 이러한 표준 기술은 상세하게 달리 기술된 경우를 제외하고는 널리 공지되고 당업자에게 일상적인 것이다. 실시예는 본 발명을 예증하기 위한 것이고, 이를 한정하기 위한 것이 아니다.

실시예

실시예 1. 뉴몰리신의 정제

온도를 39.5℃로 증가시킴에 의해 대장균 배양을 18 시간 유도한 후에, 대장균을 1시간 동안 17,000g에서 원심분리하여 펠릿화하였다. 펠릿을 25mM 디에탄올아민(pH9.0) 중에 재현탁시키고, 대장균을 라니(Rannie) 장치에서 500PSI로 1회 통과시켜 기계적으로 파쇄하였다. 1% 소듐 라우로일 사르코시네이트(SLS)를 파쇄된 대장균에 첨가하고, 혼합물을 세포 파쇄물이 펠릿화되도록 20분 동안 30,000g에서 원심분리 전에 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 2.5배 희석하여 1M NaCl 및 1% SLS를 함유하는 20mM 인산염(pH 7.0)이 되도록 하고, 그 후에 동일한 완충액(1M NaCl 및 1% SLS를 함유하는 20mM 인산염 pH 7.0 = 평형 완충액)으로 평형화된 페닐-세파로오스 HP 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 4 컬럼 부피의 평형 완충액으로 세척한 후, 2 컬럼 부피의 0.5M NaCl 및 1% SLS를 함유하는 20mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 세척하였다. 뉴몰리신을 1% SLS 함유 20mM 인산염 완충액(pH7.0)을 함유하는 저염 완충액을 적용함에 의해 컬럼으로부터 용리시켰다. 뉴몰리신을 함유하는 분획을 SDS-PAGE 분석법을 사용하여 동정하였고, 풀링(pooling)하고 완충액을 정용여과를 사용하여 25mM 디에탄올아민(pH9.0)으로 교환하였다.

뉴몰리신을 최종 6M 농도가 되도록 고체 구아니딘 하이드로클로라이드를 첨가하고 1 시간 동안 인큐베이션함에 의해 변성시켜 가용화하였다. 다음, 1mM DTT를 함유하는 25mM 디에탄올아민(pH9.0) 중의 8M 우레아에 대하여 정용여과하였다. 탈변성(renaturation) 후에 DTT를 20mM 붕산염 완충액(pH 9.0)에 대하여 정용여과시킴에 의해 제거하였다.

달성된 뉴몰리신의 순도는 SDS-PAGE상에서 영동시키고, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색함에 의해 분석하였다. 분리 겔을 대장균에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블랏팅에 의해 분석하여 정제된 뉴몰리신 제조물에 남은 대장균 단백질 수준을 검출하였다. 정제된 뉴몰리신의 생물학적 활성을 생체외 용혈 검정을 사용하여 평가하였다.

결과

도 1에 도시된 바와 같이, 상기 기술된 방법은 하나의 크로마토그래피 단계 후에 뉴몰리신의 매우 효율적인 정제를 발생시킬 수 있었다. 패널 A에서 쿠마시 블루 염색된 겔은 염화나트륨을 첨가하지 않은 저염 완충액을 이용한 컬럼의 용리가 매우 정제된 형태로 컬럼으로부터 뉴몰리신에 해당하는 53kDa 밴드를 용리할 수 있음을 나타내었다. 대략 45kDa의 매우 희미한 밴드가 또한 뉴몰리신으로 생각되는데, 이는 이 두번째 밴드가 항-뉴몰리신 항체에 결합하고(결과는 도시되지 않음) 또한 패널 B에서 도시된 바와 같이 항-대장균 항체에 결합하는데 실패하였기 때문이다. 패널 B의 웨스턴 블랏은 정제된 뉴몰리신에 남은 임의의 오염 단백질을 검출하는 매우 감수성 높은 방법이다. 이 방법은 매우 적은 불순물을 검출할 수 있었고, 존재하는 불순물은 쿠마시 염색 검출 수준 미만의 낮은 수준이었다. 따라서, 뉴몰리신은 90-100% 순도로 정제된다.

정제 방법의 수율은 또한 발효물 리터 당 뉴몰리신 약 1900㎎를 수득하는 통상적인 수행에 우수하다. 발효 배양물로부터 대략 10%의 단백질을 정제된 뉴몰리신으로 회수하였다.

용혈성 검정에서 뉴몰리신의 활성은 뉴몰리신이 구아니디늄 하이드로클로라이드/우레아로 처리된 후에 평가되고, 변성제의 제거에 의해 재폴딩되었다. 용혈 활성은 1.3ng/㎖의 농도로 하향 정제된 뉴몰리신의 희석물에서 검출되었고, 이는 용혈 활성이 재확립되었음을 나타낸다. 이는 ㎎당 500,000 내지 1,000,000 용혈 유닛의 야생형 뉴몰리신에 해당한다.

실시예 2 - GMBS를 이용한 S. 뉴모니애 뉴몰리신의 무독화

정제된 뉴몰리신을 NHS 에스테르-말레이미드 가교제 GMBS(N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르)를 사용하여 설프하이드릴 및 1차 아민기의 개질에 의해 무독화하였다. 0.5㎎/㎖의 농도의 뉴몰리신을 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 대해 투석시켰다. GMBS를 먼저 DMSO 중에 용해하고, 248배 몰 과량의 GMBS로 뉴몰리신에 첨가하였다. 처리를 실온에서 1시간 동안 계속하였다. 과잉 GMBS 및 부산물을 100mM 인산나트륨(pH6.8)에 대해 투석하여 제거하였다. 추가의 말레이미드기를 실온에서 2시간 동안 0.6㎎/㎖ 시스테인과 반응시킴에 의해 켄칭하였다. 과잉의 시스테인을 제거하기 위하여, 샘플을 2mM 인산염 나트륨(pH 7.15)에 대해 투과시켰다.

실시예 3 - 무독화된 뉴몰리신의 특성 규명

용혈 활성

용혈 검정을 무독화된 뉴몰리신의 남은 독성을 평가하기 위하여 사용하였다. 뉴몰리신의 2배 연속 희석물을 양 적혈구 세포와 함께 인큐베이션하였다. 원심분리 후에, 상청액을 면역플레이트에 이전시키고 방출된 헤모글로빈을 405nm에서 광학 밀도 판독하여 측정하였다. 결과를 OD 커브의 중간점에 해당하는 ng/㎖ 뉴몰리신으로서 표현하였다. 검정을 7일 동안 37℃에서 무독화된 뉴몰리신을 인큐베이션하여 무독화의 가역성을 모니터링 한 후에 반복하였다.

표 1에 도시된 바와 같이, GMBS를 이용한 처리로 실질적으로 용혈 활성을 3,000배 이하로 감소시켜 PLY의 용혈 활성을 감소시킬 수 있다. 보다 높은 비율의 GMBS/리신은 이 실험에서 최적인 4/1 및 5/1의 비율로 용혈 활성을 보다 우수하게 제거할 수 있었다. 이러한 처리는 약 14개 리신 잔기를 개질시키는 것으로 추정된다. 보다 적은 리신 잔기가 개질되는 경우에 용혈 활성의 감소가 덜 했다.

ELISA

무독화된 뉴몰리신의 항원성을 ELISA에 의해 평가하였다. ELISA 플레이트를 기니아 피그 항-뉴몰리신 항체로 코팅하였다. 뉴몰리신의 희석물을 함유하는 샘플을 실온에서 1 시간 동안 플레이트에서 인큐베이션하였다. 세척 후에, 결합된 뉴몰리신을 호스라디쉬(horseradish) 페록시다아제에 컨쥬게이션된 뉴몰리신에 대한 토끼 폴리클로날 항체를 사용하여 검출하였다. 플레이트를 세척한 후에, 기질 반응을 사용하여 각 웰에 결합된 뉴몰리신의 양을 평가하였다.

표 1에 도시된 바와 같이, GMBS로 처리하여 항원성이 일부 소실되었음이 ELISA에 의해 평가되었다. 그러나, 미처리된 PLY에 의해 주어진 것의 대략 66%의 ELISA 판독이 달성될 수 있었는데, 이는 많은 항체가 여전히 개질된 뉴몰리신을 인지할 수 있다는 것을 나타낸다.

SDS-PAGE 분석

무독화된 뉴몰리신 단백질을 SDS-PAGE(노벡스 4-20% 폴리아크릴아마이드 겔 인비트로겐)상에서 영동시키고, 쿠마시 브릴리언트 블루를 사용하여 단백질을 가시화하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, GMBS로 처리하여 53kDa 내지 대략 56kDa로 PLY의 분자량이 다소 증가하였다. 이러한 증가는 GMBS를 이용한 여러 아미노산 잔기의 개질로 인한 것이다. PLY의 적은 백분율은 대략 110kDa 내지 170kDa의 분자량의 희미한 밴드의 현시에 의해 관찰될 수 있는 바와 같이 다량체 형태로 전환될 수 있지만, PLY의 대부분은 본질적으로 단량체 형태로 남아 있다. 7일 동안 37℃에서 PLY를 인큐베이션하여 SDS-PAGE 상에 PLY의 현시에 있어 실질적인 변화를 보이지 않았고, 이는 개질된 PLY가 분해 또는 후속하는 공유 결합된 다량체 형성을 거치지 않는다는 것을 제시한다.

GMBS에 의한 PLY 무독화의 시험

시험	GMBS 과량 (GMBS/리신)	말레이미드 작용기	비율 ELISA/LOWRY 4℃ 7D37℃ %	용혈역가 ng/㎖ 4℃ 7D37℃
1	/ 1/1 1.5/1 2/1 3/1 4/1 5/1	/ 8 8.5 9.4 11.8 13.5 14.2	95 56 63 87 69 / 76 / 56 / 66 / 67 /	1.7 4.2 186 111 48 / 309 / 530 / 6308 / 4284 /
2	4/1 8/1	13.8 17.6	26.2 24.8 23.9 38.0	NH NH NH NH
3	4/1	11.3	89 46	1598 6309

시험은 3㎎(0.68㎎/㎖의 PLY)가 처리된 마지막 검정을 제외하고 1㎎의 PLY(1㎎/㎖)로 수행되었다.

실시예 4. 래트에서 무독화된 뉴몰리신의 반응원성 평가

세마리의 OFA 래트 군을 식염수, 애쥬번트 QS21(US5,057,540), 뉴몰리신, 애쥬번트화된 뉴몰리신, 포름알데하이드 무독화된 뉴몰리신, 애쥬번트화된 포름알데하이드 무독화된 뉴몰리신, GMBS 무독화된 뉴몰리신, 애쥬번트화된 GMBS 무독화된 뉴몰리신, NHS-아세테이트 무독화된 뉴몰리신 또는 애쥬번트화된 NHS-아세테이트 무독화된 뉴몰리신으로 근내(전경골근) 접종에 의해 1회 면역화시켰다. 면역화한지 3일 후에, 모든 래트를 희생시키고 전경골근을 조직학적 검사를 위하여 준비하였다. 전경골근을 포르말린에 고정하고 2mm 슬라이드로 잘라 탈수시키고 파라핀 함침하였다. 7㎛ 절편을 잘라서 트리크롬 매종(Trichrome Masson) 방법을 사용하여 염색하고 그 후에 현미경으로 검사하였다.

반응원성을 4가지 카테고리를 사용하여 평가하였다: 변성/괴사, 근섬유 염증, 출혈, 및 건막 염증. 각 조직학적 카테고리에 대해 점수를 각 군의 각 근육에 주고, 평균 병변 점수를 각 그룹에 대해 계산하였다. O의 점수=정상, 1=최소, 2=경미, 3=중간, 4=현저, 및 5=심각.

결과

절편의 조직학 검사를 검사하였다. 변성/괴사, 근섬유 염증, 출혈, 및 건막 염증에 대한 평균 점수를 표 2에 도시하였다.

접종	변성/괴사	근섬유 염증	출혈	건막 염증
NaCl	0	0.5	0	0
Ply	3.6	3.8	3.0	1.4
GMBS-Ply	0.6	1.3	1.3	0.4
애쥬번트	2.9	3.9	2.8	2.8
Ply+애쥬번트	4.2	3.9	4.6	1.8
GMBS-Ply+애쥬번트	2.9	3.9	3.8	1.6

삭제

애쥬번트화되지 않은 천연 및 무독화된 뉴몰리신에 대한 조직학적 점수를 비교해보면, GMBS가 뉴몰리신을 무독화하는데 특히 유효한 가교제로 변성/괴사, 근섬유 염증, 출혈, 및 건막 염증을 크게 감소시켰다는 것을 알 수 있다.

애쥬번트(50㎍ 알루미늄 포스페이트 및 5㎍ MPL)의 접종물로의 첨가는 면역계를 자극하는 부작용으로서 반응원성의 양을 증가시킨다. GMBS로 뉴몰리신을 무독화하는 것은 변성/괴사의 수준이 천연 뉴몰리신의 접종에 의해 생성된 수준 보다 더 낮은 애쥬번트 단독에 의해 생성된 수준으로 감소시켰다. GMBS 무독화된 뉴몰리신은 용혈의 수준을 천연 뉴몰리신에 의해 생성되는 것보다 더 낮게 했다. 근섬유 염증의 수준은 애쥬번트에 의해 상승되었고, 이 수준은 여전히 애쥬번트화된 천연 또는 GMBS 무독화된 뉴몰리신의 존재하에 존재하였다. 그러나 건막 염증은 단지 천연 또는 GMBS 무독화된 뉴몰리신에 의한 애쥬번트 단독에 의해 생성된 수준으로부터 감소하였으며, 건막의 수준은 뉴몰리신이 GMBS로 처리되는 경우에 다소 낮았다.

실시예 5. 마우스에서 GMBS 처리된 뉴몰리신의 독성 평가

20마리의 OF1 마우스의 군을 천연 뉴몰리신 또는 GMBS-처리된 뉴몰리신 중 어느 하나로 공격하고, 마우스를 그 후 9일 동안 모니터링하였다.

도 3에 도시된 바와 같이, 천연 뉴몰리신 2㎍의 공격은 매우 빠르게 그 그룹의 모든 마우스를 희생시켰다. 뉴몰리신은 호흡 곤란 및 죽음을 초래하는 호흡기 전반에 걸친 병변을 발생시켰다. 대조적으로 GMBS 처리된 뉴몰리신은 실질적으로 감소된 독성을 보였으며, 2㎍, 5㎍, 또는 10㎍의 GMBS 처리된 뉴몰리신으로 접종된 마우스 모두가 공격에서 살아 남았다.

실시예 6. 무독화된 뉴몰리신을 사용한 보호 연구

20 마리의 OF1 마우스의 군을 5㎍의 뉴몰리신 및 50㎍의 알루미늄 포스페이트, 및 5㎍ MPL 애쥬번트로 0일, 14일, 및 28일째에 근내로 3회 면역화하였다. 대조군 마우스는 애쥬번트만으로 면역화하였다. 뉴몰리신은 미처리되거나 상기 기술한 바와 같이 GMBS 처리를 사용하여 무독화되었다.

42일째에, 마우스를 2㎍의 천연 뉴몰리신으로 비강내 치사 공격을 제공하였다. 이후, 9일 동안에 걸쳐 마우스의 생존을 모니터링하였다.

결과

치사 공격 모델은 대조군 마우스에서 90% 사망율을 보였다(도 4). GMBS 무독화된 뉴몰리신을 이용한 면역화는 9일 동안 5%의 마우스만이 죽는 매우 우수한 보호를 보였다. 이는 천연 뉴몰리신을 접종 한 후에 10%의 마우스가 죽은 보호와 비교할 만하였다.

실시예 7. 마우스 치사 공격 모델과 조합된 무독화된 뉴몰리신의 평가

20마리의 OF1 마우스 군을 a) 애쥬번트 단독 또는 b) 1㎍ PhtD 및 애쥬번트 또는 c) 1㎍ PhtD 및 5㎍ GMBS 무독화된 뉴몰리신 및 애쥬번트로 근내 면역화하였다. 사용된 애쥬번트는 50㎍ 알루미늄 포스페이트 및 5㎍ MPL로 구성되고, 면역화는 0일 및 14일째에 수행하였다. 마우스를 5.10⁵ CFU의 혈청형 2 S. 뉴모니애 균주 D39의 비강내 치사 용량으로 면역원성을 시험하고, 생존율을 그 후 10일간 모니터링하였다.

결과

도 5에 도시된 바와 같이, 균주 D39를 이용한 공격은 대조군 마우스에서 10일 후에 75% 치사율을 보였다. PhtD 단독으로 면역화한 경우는 10일 후에 이 그룹에서 마우스의 70%가 죽어 그다지 보호 효과를 제공하지 않았다(p=0.29). GMBS 무독화된 뉴몰리신과 함께 PhtD를 면역화한 것은 치사율을 50%도 감소시켜 상당히 더 우수한 보호능을 보였다(p=0.04).

실시예 8. 포름알데하이드를 이용한 뉴몰리신의 무독화

25mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 중의 약 0.4㎎/㎖의 농도의 정제된 뉴몰리신의 스톡(stock)을 40℃에서 21일 동안 50mM L-리신 및 0.1% 포름알데하이드(w/v)로 처리하였다.

Claims (57)

1. a) 박테리아 세포용해소를 발현하는 세포 배양물을 증식시키는 단계;

   b) 박테리아 세포용해소를 함유하는 상기 배양물로부터 추출물을 제조하는 단계;

   c) 세제(detergent)의 존재하에 상기 추출물에 함유된 응집된 용해성 박테리아 세포용해소를 0.6 내지 2M의 고염 조건하에서 소수성 상호작용 크로마토그래피 재료에 결합시키는 단계; 및

   d) 0.2M 미만의 염을 함유하는 저염 조건하에서 세제의 존재하에 박테리아 세포용해소를 용리시키는 단계를 포함하는, 박테리아 세포용해소의 정제 방법.
2. 제 1항에 있어서, e) 상기 박테리아 세포용해소로부터 세제를 제거하는 단계, f) 변성제의 첨가에 의해 상기 박테리아 세포용해소를 용해시키는 단계; 및 g) 상기 박테리아 세포용해소로부터 상기 변성제를 제거하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 정제 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 박테리아 세포용해소가 폐렴구균 뉴몰리신(pneumolysin)임을 특징으로 하는 정제 방법.
4. 제 1항에 있어서, 단계 b)가 세포를 기계적으로 파쇄하는 것을 포함함을 특징으로 하는 정제 방법.
5. 제 1항에 있어서, 단계 b)가 세제로 처리하는 것을 포함함을 특징으로 하는 정제 방법.
6. 제 1항에 있어서, 동일한 세제가 단계 c) 및 d)에 존재함을 특징으로 하는 정제 방법.
7. 제 1항에 있어서, 상기 세제가 0.1 내지 5% (w/v)의 농도로 존재함을 특징으로 하는 정제 방법.
8. 제 1항에 있어서, 단계 c)에서 사용된 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 재료가 방향족 기를 함유함을 특징으로 하는 정제 방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 소수성 크로마토그래피 재료가 페닐 세파로오스임을 특징으로 하는 정제 방법.
10. 제 1항에 있어서, 단계 c) 및/또는 단계 d)에서 사용된 용액에 존재하는 상기 세제가 지방족 세제(aliphatic detergent)임을 특징으로 하는 정제 방법.
11. 제 1항에 있어서, 상기 세제가 소듐 라우로일 사르코시네이트(sodium lauroly sarcosinate)임을 특징으로 하는 정제 방법.
12. 제 1항에 있어서, 단계 c) 및/또는 d)에 사용된 상기 용액이 염화나트륨, 염화마그네슘, 염화암모늄, 황산나트륨, 황산마그네슘, 황산암모늄, 인산나트륨, 인산마그네슘 및 인산암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된 염을 함유함을 특징으로 하는 정제 방법.
13. 제 1항에 있어서, 단계 c) 및/또는 단계 d)에서 사용된 상기 조건이 pH 6 내지 pH 8임을 특징으로 하는 정제 방법.
14. 제 1항에 있어서, 단계 d)에 사용된 상기 조건이 0.1M 미만의 염을 함유함을 특징으로 하는 정제 방법.
15. 제 2항에 있어서, 단계 e)가 정용여과(diafiltration) 또는 투석에 의한 세제의 제거를 포함함을 특징으로 하는 정제 방법.
16. 제 2항에 있어서, 단계 f)가 변성제의 첨가에 의해 박테리아 세포용해소를 변성시키는 것을 포함하고, 단계 g)가 변성제를 서서히 제거하여 박테리아 세포용해소를 재폴딩시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 정제 방법.
17. 제 2항에 있어서, 단계 f)에서 사용된 상기 변성제가 구아니딘 하이드로클로라이드임을 특징으로 하는 정제 방법.
18. 제 16항에 있어서, 상기 박테리아 세포용해소가 단계 f)의 과정 동안에 5 내지 9M의 우레아와 접촉됨을 특징으로 하는 정제 방법.
19. 제 18항에 있어서, 단계 f)가 박테리아 세포용해소를 5 내지 8M의 구아니딘 하이드로클로라이드와 접촉시킨 후, 상기 구아니딘 하이드로클로라이드를 5 내지 9M의 우레아로 교환하는 것을 포함함을 특징으로 하는 정제 방법.
20. 제 2항에 있어서, 단계 g)가 정용여과 또는 투석에 의한 변성제의 제거를 포함함을 특징으로 하는 정제 방법.
21. 제 20항에 있어서, 정용여과 또는 투석이 pH 7 내지 pH 9의 용액에 대해 수행됨을 특징으로 하는 정제 방법.
22. 제 1항에 있어서, 화학적 처리에 의해 박테리아 세포용해소를 무독화시키는 추가의 단계를 포함함을 특징으로 하는 정제 방법.
23. 제 22항에 있어서, 상기 화학적 처리가 가교제의 사용을 포함함을 특징으로 하는 정제 방법.
24. 제 23항에 있어서, 상기 가교제가 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, N-하이드록시숙시노미도 에스테르 및 GMBS(N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학물질을 함유함을 특징으로 하는 정제 방법.
25. 제 1항에 있어서, 상기 박테리아 세포용해소를 박테리아 협막 다당류에 컨쥬게이션시키는 추가의 단계를 포함함을 특징으로 하는 정제 방법.
26. 제 1항에 있어서, 박테리아 세포용해소를 약제학적 허용 부형제와 함께 백신 조성물로 제형화하는 추가의 단계를 포함함을 특징으로 하는 정제 방법.
27. 제 26항에 있어서, 상기 박테리아 세포용해소가 콜린 결합 단백질 A 또는 이의 면역원성 단편과 함께 제형화됨을 특징으로 하는 정제 방법.
28. 제 26항에 있어서, 상기 박테리아 세포용해소가 PhtA, PhtB, PhtD 또는 PhtE, 또는 이들의 면역원성 단편중 하나 이상과 함께 제형화됨을 특징으로 하는 정제 방법.
29. 제 26항에 있어서, 상기 박테리아 세포용해소가 유형 분류할 수 없는(non-typeable) 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)(NtHi)로부터의 항원과 함께 제형화됨을 특징으로 하는 정제 방법.
30. 제 26항에 있어서, 상기 박테리아 세포용해소가 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis)로부터의 항원과 함께 제형화됨을 특징으로 하는 정제 방법.
31. 제 26항에 있어서, 상기 박테리아 세포용해소가 RSV, 파라인플루엔자 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로부터의 항원과 함께 제형화됨을 특징으로 하는 정제 방법.
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