BR112020015696A2

BR112020015696A2 - Composição de conjugado polissacarídeo-proteína pneumocócico multivalente

Info

Publication number: BR112020015696A2
Application number: BR112020015696-5A
Authority: BR
Inventors: Kyungjun AN; Dongsoo HAM; Hun Kim; Sunghyun Kim; Jinhwan SHIN; Robert Hopfer; Richard D. KENSINGER; Moe KYAW; Philippe Talaga
Original assignee: Sanofi Pasteur, Inc.; Sk Bioscience Co., Ltd.
Priority date: 2018-02-05
Filing date: 2019-02-04
Publication date: 2020-12-08
Also published as: TW201934140A; IL304977A; WO2019152925A8; KR20230008923A; TWI826420B; JP2022000449A; US11911452B2; WO2019152925A1; US20210077608A1; SG11202006388SA; KR20200120926A; AU2019215216A1; IL276230A; JP2023134727A; JP6950099B2; CN111757753A; US20210401963A1; MX2020008198A; JP2021511367A; JP7030235B2

Abstract

a presente invenção refere-se a composições de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto que compreendem 21 conjugados de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócicos diferentes, em que cada um dos conjugados inclui um polissacarídeo capsular de um serotipo diferente de streptococcus pneumoniae conjugado a toxoide tetânico (tt) ou crm197, em que os serotipos de streptococcus pneumoniae são selecionados dentre 1, 3, 4, 5, 6a, 6b, 7f, 8, 9n, 9v, 10a, 11a, 12f, 14, 15b, 18c, 19a, 19f, 22f, 23f e 33f, em que os polissacarídeos capsulares de dois dos serotipos 1, 3 e 5 e um ou ambos os serotipos 15b e 22f são conjugados a tt e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados a crm197. são também fornecidos métodos para produzir as composições de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto e métodos para usar as mesmas para a profilaxia contra infecção ou doença por streptococcus pneumoniae num sujeito.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO DE CONJUGADO POLISSACARÍDEO-PROTEÍNA PNEUMOCÓCICO MULTIVALENTE".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício e depende da data de depósito do pedido de patente provisório número U.S. 62/626.509, depositado em 5 de fevereiro de 2018, e do pedido de patente coreano número 10-2018-0045246, depositado em 18 de abril de 2018, cujas divulgações completas estão incorporadas ao presente documento a título de referência.

CAMPO DA TÉCNICA

[002] Este pedido se refere, de modo geral, a composições de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, vacinas que compreendem as mesmas e métodos para usar estas composições e vacinas para profilaxia de infecção ou doença por Streptococcus pneumoniae num sujeito.

ANTECEDENTES

[003] O pneumococo (Streptococcus pneumoniae) é uma bactéria anaeróbica facultativa em formato de lanceta, Gram-positiva com mais de 90 serotipos conhecidos. Foi demonstrado que a maioria dos serotipos de S. pneumoniae causa doenças, com os 23 serotipos mais comuns responsáveis por aproximadamente 90% das doenças invasivas em todo o mundo. Os serotipos são classificados com base na resposta serológica dos polissacarídeos capsulares, o fator de virulência mais importante para pneumococo. Os polissacarídeos capsulares são antígenos independentes de célula T que induzem a produção de anticorpos na ausência de células T auxiliares. Os antígenos independentes de célula T geralmente induzem anticorpos com baixa afinidade e respostas imunológicas de curta duração com pouca ou nenhuma memória imunológica.

[004] As vacinas pneumocócicas iniciais incluíram combinações de polissacarídeos capsulares de diferentes serotipos. Estas vacinas podem conferir imunidade contra S. pneumoniae em pacientes com sistema imunológico saudável ou desenvolvido; no entanto, não foram eficazes em bebês que não possuem um sistema imunológico desenvolvido e em indivíduos idosos, que frequentemente têm função imunológica prejudicada. Para melhorar a resposta imunológica às vacinas pneumocócicas, particularmente em bebês e idosos, que têm maior risco de desenvolver infecção por S. pneumoniae, os polissacarídeos capsulares foram conjugados com proteínas veículoas adequadas para criar vacinas pneumocócicas conjugadas. A conjugação com uma proteína veículoa adequada altera O polissacarídeo capsular de um antígeno independente de célula T para um antígeno dependente de célula T. Deste modo, a resposta imunológica contra o polissacarídeo capsular conjugado envolve células T auxiliares, que ajudam a induzir uma resposta imunológica mais potente e rápida mediante a reexposição ao polissacarídeo capsular.

[005] Há pelo menos duas abordagens para o desenvolvimento de vacinas pneumocócicas conjugadas: a abordagem de veículo único e a abordagem de veículo misto. A imunogenicidade de diferentes conjugados de polissacarídeos capsulares pode variar dependendo do serotipo pneumocócico e da proteína veículoa usados. Na abordagem de veículo único, os polissacarídeos capsulares de diferentes serotipos são conjugados com um único veículo de proteína. A série de vacinas PREVNAR da Pfizer é um exemplo de uma abordagem de veículo único, em que os diferentes polissacarídeos capsulares são conjugados ao veículo de proteína CRM:197, uma variante não tóxica do toxoide da difteria que tem uma única substituição de aminoácido do ácido glutâmico por glicina. A vacina PREVNAR 7-valente (PREVNAR) foi aprovada pela primeira vez em 2000 e contém os polissacarídeos capsulares dos sete serotipos mais prevalentes: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. A vacina 13-valente, PREVNAR 13, adicionou os serotipos 1, 5, 7F, 3, GA e 19A ao veículo de proteína CRM197. O veículo de proteína, CRM1697, o único veículo usado nas vacinas PREVNAR nunca foi usado como parte de um sistema de veículo misto numa vacina pneumocócica conjugada.

[006] A segunda abordagem de vacina pneumocócica é a abordagem de veículo misto. Na abordagem de veículo misto, em vez de usar um único veículo de proteína, são usados dois ou mais veículos de proteína, com polissacarídeos capsulares de serotipos específicos conjugados a um primeiro veículo de proteína e polissacarídeos capsulares de diferentes serotipos conjugados a pelo menos um segundo veículo de proteína diferente. Por exemplo, GlaxoSmithKline desenvolveu SYNFLORIX, uma vacina pneumocócica conjugada de veículo misto 10-valente (serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) que usa proteína D de influenza H, toxoide tetânico e toxoide da difteria como os veículos de proteína. Em SYNFLORIX, os serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14 e 23F são conjugados à proteína D; o serotipo 18C é conjugado ao toxoide tetânico; e o serotipo 19F é conjugado ao toxoide da difteria [2]. O serotipo 3 foi removido do precursor 11-valente para SYNFLORIX, em parte, devido ao fato de que o mesmo não mostrou eficácia específica para serotipo num teste de otite média aguda [1]. Outro grupo, Aventis Pasteur, desenvolveu uma vacina pneumocócica conjugada de veículo misto 11-valente (serotipos 1, 3,4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) que usa o toxoide da difteria e o toxoide tetânico como veículos de proteínas [3]. Os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 9V, 14 e 18C podem provocar uma resposta melhor quando conjugados ao toxoide da difteria do que os mesmos provocam quando conjugados ao toxoide tetânico [6]. Assim, os serotipos 3, 6B, 14 e 18C foram conjugados à toxina da difteria, e os serotipos 1, 4, 5, 7F, 9V, 19F e 23F foram conjugados ao toxoide tetânico. O desenvolvimento desta vacina pneumocócica de veículo misto foi encerrado devido, em parte, a razões técnicas e ao potencial de uma resposta reduzida quando administrada com vacinas acelulares contra coqueluche [3]. Recentemente, foi relatado que os serotipos 5 assim como 1 têm um dos títulos de OPA mais baixos observados em todos os serotipos de PREVNAR 13, em que houve uma correlação associada entre o título de IgG e a atividade de OPA [4]. Também foi sugerido que, para o serotipo 3, seria necessária uma concentração de IgG sérica muito maior para proteção [5].

SUMÁRIO

[007] Este pedido fornece composições novas e melhoradas de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto e vacinas que compreendem as mesmas. Num aspecto, a composição de conjugado pneumocócico “multivalente de veículo misto compreende 21 conjugados de polissacarídeo capsular-proteina pneumocócicos diferente, em que cada conjugado de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócico compreende um veículo de proteína conjugado a um polissacarídeo capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae, em que os serotipos de Streptococcus pneumoniae são selecionados dentre 1, 3, 4, 5, GA, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, em que o carreado de proteína é CRM197 ou toxoide tetânico, em que quatro dos polissacarídeos capsulares são conjugados ao toxoide tetânico e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM+197, e em que dois dos quatro polissacarídeos capsulares que são conjugados ao toxoide tetânico são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1,3e5eos dois polissacarídeos capsulares restantes são os serotipos 15B e 22F.

[008] Numa modalidade da composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 5, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197.

[009] Em outra modalidade da composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 3, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 4, 5, 6A, 6B, 7F,, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197.

[010] Em ainda outra modalidade da composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 5, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 23F e 33F são conjugados ao CRM 197.

[011] Em outro aspecto, este pedido fornece uma composição de conjugado —pneumocócico multivalente de veículo misto que compreende 21 conjugados de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócicos diferente, em que cada conjugado de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócico compreende um veículo de proteína conjugado a um polissacarídeo capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae, em que os serotipos de Streptococcus pneumoniae são selecionados dentre 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, ON, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, em que o carreado de proteína é CRM197 ou toxoide tetânico, em que três dos polissacarídeos capsulares são conjugados ao toxoide tetânico e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM 197, e em que os três polissacarídeos capsulares que são conjugados ao toxoide tetânico são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1,3, 5, 15B e 22F. Em certas modalidades, dois dos três polissacarídeos capsulares que são conjugados ao toxoide tetânico são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3 e 5, e o polissacarídeo capsular restante conjugado ao toxoide tetânico é serotipo 15B ou 22F.

[012] Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto compreende ainda um adjuvante, tal como um adjuvante à base de alumínio, incluindo, porém sem limitação, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

[013] Outro aspecto é direcionado ao uso da composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto como uma vacina.

[014] Ainda outro aspecto é direcionado a uma vacina que compreende a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[015] Ainda outro aspecto é direcionado a um método para profilaxia da infecção ou doença por Streptococcus pneumoniae num sujeito, tal como um ser humano, sendo que o método compreende administrar uma quantidade profilaticamente eficaz das composições de conjugado pneumocócico 21-valentes de veículo misto ou uma vacina que compreende as mesmas ao sujeito.

[016] Em certas modalidades, o sujeito é um ser humano que tem pelo menos 50 anos de idade, e a doença é pneumonia ou doença pneumocócica invasiva (IPD).

[017] Em outras modalidades, o sujeito é um ser humano que tem pelo menos 6 semanas de idade, e a doença é pneumonia, doença pneumocócica invasiva (IPD) ou otite média aguda (AOM). Em algumas modalidades, o sujeito humano tem 6 semanas a 5 anos de idade. Em outras modalidades, o sujeito humano tem 2 a 15 meses de idade ou 6

7ITO a 17 anos de idade.

[018] Em certas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto ou vacina é administrada por injeção intramuscular. Em certas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto ou vacina é administrada como parte de uma série de imunizações.

[019] Ainda outro aspecto é direcionado a um conjugado imunogênico de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N que contém: um sacarídeo capsular de serotipo 9N de Streptococcus pneumoniae; e uma proteína veículoa ligada ao sacarídeo capsular, em que a proteína veículoa é CRM197. Em certas modalidades do conjugado imunogênico de serotipo 9N, as composições de conjugado pneumocócico multivalentes de veículo misto e as vacinas (e métodos/usos das mesmas), o sacarídeo de serotipo 9N pode ser ligado a CRM+197 para formar um conjugado num estado em que é ativado para ter um grau de oxidação de 2 a 19 ou 5 a 10 e um peso molecular de 200 a 700 kDa. Em certas modalidades do conjugado imunogênico de serotipo 9N, a composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo mistos e vacinas (e métodos/usos das mesmas), o conjugado imunogênico de serotipo 9N pode ter um peso molecular de 500 a 4000 kDa.

[020] Em certas modalidades do conjugado imunogênico de serotipo 9N, a composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo mistos e vacinas (e métodos/usos das mesmas), a razão entre o Sacarídeo capsular de serotipo 9N e a proteína veículoa no conjugado imunogênico de serotipo 9N é 0,1 a 5 (p/p). Em certas modalidades, a razão é 0,5 a 2,5.

[021] Em certas modalidades do conjugado imunogênico de serotipo 9N, a composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo mistos e vacinas (e métodos/usos das mesmas), 15 a 60% do conjugado imunogênico de serotipo 9N pode ter uma Ka de 0,3 ou menos numa coluna CL-4B.

[022] Em certas modalidades do conjugado imunogênico de serotipo 9N, a composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo mistos e vacinas (e métodos/usos das mesmas), o conjugado imunogênico de serotipo 9N foi preparado com um polissacarídeo de serotipo 9N que foi ativado para alcançar um grau de oxidação de 2 a

19. Em certas modalidades, o conjugado imunogênico de serotipo 9N foi preparado com um polissacarídeo de serotipo 9N que foi ativado para alcançar um grau de oxidação de 5 a 10.

[023] Em certas modalidades do conjugado imunogênico de serotipo 9N, as composições de conjugado pneumocócico multivalentes de veículo misto e vacinas (e métodos/usos das mesmas), quando o sacarídeo de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N é conjugado ao CRM1697 adicionando-se 0,02 a 0,19 ug de periodato por 1 ug de açúcar, o conjugado pode ter um peso molecular de 500 a 4000 kDa, uma distribuição de peso molecular de 15 a 60% (Ka < 0,3) e uma razão entre sacarídeo/proteína de 0,5 a 2,5.

[024] Em ainda outro aspecto, a presente descrição também fornece um método para preparar um conjugado imunogênico de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N, sendo que o método compreende: (a) lisar uma célula bacteriana que produz polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N fermentando o mesmo; (b) purificar o sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N da célula lisada; (c) ativar o polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N reagindo com um agente oxidante para alcançar um grau de oxidação de 2a 190u5a10;e (d) formar um conjugado do sacarídeo capsular de

Streptococcus pneumoniae serotipo 9N ligado ao CRM:197 misturando- se o sacarídeo ativado com CRM 197.

[025] Em certas modalidades, o CRM:197 misturado na etapa (d) pode ser reagido com um agente redutor para formar o conjugado com o polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N ativado. Em certas modalidades, na etapa (c), 0,02 a 0,19 ug de periodato pode ser reagido com 1 ug do polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N a 20 a 25ºC por 15 a 20 horas.

[026] Em certas modalidades, o polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N reagido com o agente oxidante na etapa (c) pode ter um peso molecular de 400 a 900 kDa. Em certas modalidades, o polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N ativado misturado com o CRM:197 na etapa (d) pode ter um peso molecular de 200 a 700 kKDa. Em certas modalidades, o conjugado imunogênico de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N pode ter um peso molecular de 500 a 4000 kDa. Em certas modalidades, uma taxa de entrada inicial entre o CRM:197 e o sacarídeo capsular de serotipo 9N ativado (veículo CRM197: sacarídeo) pode ser 0,5 a 2,5:1. Em certas modalidades, pelo menos 15 a 60% do conjugado imunogênico pode ter uma Ka de 0,3 ou menos conforme medido numa coluna CL-4B.

[027] Em certas modalidades, quando o polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N da presente descrição é conjugado ao CRM'97 adicionando-se 0,02 a 0,19 ug de periodato por 1 ug de açúcar, o conjugado imunogênico tem um peso molecular de 500 a 4000 kDa, uma distribuição de peso molecular de 15 a 60% (Ka < 0,3) conforme medido numa coluna CLAB e uma razão entre CRM'67/polissacarídeo de 0,5 a 2,5.

[028] Os precedentes e outros objetos, recursos e vantagens das composições de conjugado pneumocócico 21-valentes de veículo misto se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada a seguir.

DEFINIÇÕES

[029] A fim de que a presente descrição seja entendida mais facilmente, certos termos são definidos primeiro abaixo. Outras definições para os termos a seguir e outros termos podem ser apresentadas através do relatório descritivo.

[030] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "uma", "um", "o" e "a" incluem referências no plural a menos que o contexto claramente determine de outro modo. Assim, por exemplo, uma referência a "um método" inclui um ou mais métodos e/ou etapas do tipo descrito no presente documento e/ou que se tornará aparente àqueles versados na técnica mediante a leitura desta descrição e assim por diante.

[031] Administra:' Conforme — usado — neste — documento, "administrar" uma composição a um sujeito significa dar, aplicar ou colocar a composição em contato com o sujeito. A administração pode ser realizada por qualquer uma dentre várias vias, tais como, por exemplo, tópica, oral, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intratecal e intradérmica.

[032] Aproximadamente: "Conforme usado no presente documento, o termo "aproximadamente" ou "cerca de", conforme aplicado a um ou mais valores de interesse, se refere a um valor que é similar a um valor de referência determinado. Em certas modalidades, o termo "aproximadamente" ou "cerca de" se refere a uma faixa de valores que está dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos em qualquer direção (maior ou menor) do valor de referência a não ser que determinado de outro modo ou evidente de outro modo a partir do contexto (exceto nos casos em que tal número possa exceder 100% de um valor possível).

[033] Conjugado: Conforme usado no presente documento e entendido a partir do contexto apropriado, os termos "conjugado (ou conjugados)" ou "glicoconjugado (glicoconjugados)" se referem a um polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae conjugado a uma proteína veículoa usando qualquer estratégia de bioconjugação covalente ou não covalente.

[034] Grau de oxidação: Conforme usado no presente documento, o termo "grau de oxidação" (DO) se refere ao número de unidades de repetição de açúcar por grupo aldeído gerado quando um sacarídeo purificado ou dimensionado é ativado com um agente oxidante. O grau de oxidação de um sacarídeo pode ser determinado usando métodos de rotina conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica.

[035] Excipiente: Conforme usado no presente documento, o termo "excipiente" se refere a um agente não terapêutico que pode estar incluído numa composição farmacêutica, por exemplo, para fornecer ou contribuir para uma consistência ou efeito estabilizante desejado.

[036] Veículo misto: Conforme usado no presente documento, uma composição de conjugado pneumocócico de veículo misto se refere a uma composição de conjugado pneumocócico que tem mais do que um tipo de veículo de proteína.

[037] Multivalente: Conforme usado no presente documento, o termo "multivalente" se refere a uma composição de conjugado pneumocócico que tem polissacarídeos capsulares pneumocócicos de mais do que um serotipo de Streptococcus pneumoniae.

[038] Composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto: Conforme usado no presente documento, o termo "composição (ou composições) de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto" se refere a uma composição que compreende ou consiste em 21 conjugados de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócicos diferente, em que cada conjugado de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócico compreende um veículo de proteína conjugado a um polissacarídeo capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae, em que os serotipos de Streptococcus pneumoniae são 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, ON, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, em que o carreado de proteína é CRM197 ou toxoide tetânico, em que 1) em que três dos polissacarídeos capsulares são conjugados ao toxoide tetânico e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM+197, e em que dois dos três polissacarídeos capsulares que são conjugados ao toxoide tetânico são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3e 5,60 polissacarídeo capsular restante é serotipo 15B ou 22F; ou 2) em que quatro dos polissacarídeos capsulares são conjugados ao toxoide tetânico e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM197, e em que dois dos quatro polissacarídeos capsulares que são conjugados ao toxoide tetânico são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3 e 5, e os dois polissacarídeos capsulares restantes são os serotipos 15B e 22F. Em algumas modalidades, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 5, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM:97. Em outra modalidade, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 3, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos restantes são conjugados ao CRM:97. Em ainda outra modalidade, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 5, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM 197.

[039] Peso molecular: A menos que especificado de outra forma, conforme usado no presente documento, o termo "peso molecular" de um sacarídeo capsular ou um conjugado de sacarídeo capsular- proteína veículoa se refere ao peso molecular médio calculado por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) em combinação com dispersão de luz laser em múltiplos ângulos (MALLS).

[040] Excipiente farmaceuticamente aceitável: Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis úteis nesta descrição são convencionais. Remingtons Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15º Edição (1975), descreve composições e formulações adequadas para entrega farmacêutica de uma ou mais composições terapêuticas, incluindo vacinas, e agentes farmacêuticos adicionais. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem, por exemplo, amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno glicol, água, etanol e similares. Em geral, a natureza do excipiente dependerá do modo particular de administração sendo usado. Por exemplo, as formulações parenterais usualmente compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmacêutica e fisiologicamente aceitáveis, tais como água, solução salina fisiológica, soluções de sal equilibradas, tampões, dextrose aquosa, glicerol ou similares como um transportador. Para composições sólidas (por exemplo, formas de pó, pílula, tablete ou cápsula), os excipientes sólidos não tóxicos convencionais incluem, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Adicionalmente a veículos biologicamente neutros, composições farmacêuticas a serem administradas podem conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, um agente ativo de superfície, conservantes e agentes de tamponamento de pH e similares, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.

[041] Quantidade Profilaticamente Eficaz: Conforme definido no presente documento, o termo "uma quantidade profilaticamente eficaz" ou "uma dose profilaticamente eficaz" se refere à quantidade ou dose necessária para induzir uma resposta imunológica suficiente para atrasar o início e/ou reduzir em frequência e/ou gravidade um ou mais sintomas causados por uma infecção por Streptococcus pneumoniae.

[042] Profilaxia: O termo "profilaxia", conforme usado no presente documento, se refere a evitar a manifestação da doença, um atraso no início, e/ou redução na frequência e/ou gravidade de um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou afecção particular (por exemplo, infecção por Streptococcus pneumoniae). Em algumas modalidades, a profilaxia é avaliada numa base populacional de modo que um agente seja considerado para fornecer profilaxia contra uma doença, distúrbio ou afecção particular se uma diminuição estatisticamente significativa no desenvolvimento, frequência e/ou intensidade de um ou mais sintomas da doença, distúrbio ou afecção for observada numa população suscetível à doença, distúrbio ou afecção.

[043] Sujeito: Conforme usado no presente documento, o termo "sujeito" significa qualquer mamífero, incluindo camundongos, coelhos e seres humanos. Em certas modalidades, o sujeito é um adulto, um adolescente ou um bebê. Em algumas modalidades, os termos "indivíduo" ou "paciente" são usados e se destinam a ser intercambiáveis com "sujeito".

DESCRIÇÃO DETALHADA

[044] A descrição a seguir é da modalidade (ou modalidades) descrita e dos Exemplos é apenas exemplificativa na natureza e não se destina de forma alguma a limitar a invenção, sua aplicação ou usos.

[045] Este pedido fornece composições novas e melhoradas de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto e vacinas que compreendem as mesmas. Embora o veículo de proteína, CRM 197, tenha sido usado precedentemente em vacinas pneumocócicas conjugadas de veículo único, este pedido descreve o uso do CRM197 numa vacina pneumocócica conjugada de veículo misto. Em particular, este pedido descreve o uso combinado de CRM+197 e toxoide tetânico como proteínas veículoas para serotipos pneumocócicos específicos em composições e vacinas pneumocócicas conjugadas multivalentes.

[046] Conforme discutido acima, a imunogenicidade de diferentes conjugados de polissacarídeos capsulares pode variar dependendo do serotipo pneumocócico e da proteína veículoa usados. Este pedido descreve a conjugação bem-sucedida do serotipo 3 ao toxoide tetânico como parte de uma vacina de veículo misto, apesar dos ensinamentos precedentes de que o serotipo 3 era mais imunogênico quando conjugado ao toxoide da difteria em vez do toxoide tetânico [6]. Este pedido também descreve a conjugação bem-sucedida dos serotipos 1, 5, 15B e 22F ao toxoide tetânico como parte de uma vacina de veículo misto. O mesmo também divulga a constatação inesperada de que a resposta de anticorpo ao serotipo 3 conjugado ao toxoide tetânico numa composição de conjugado pneumocócico multivalente, por exemplo, 21- valente de veículo misto era cerca de 4,5 vezes maior do que quando o serotipo 3 foi conjugado ao CRM197 numa composição de conjugado pneumocócico 13-valente de veículo único (PREVNAR 13).

[047] Ademais, a constatação inesperada não se limitou ao serotipo 3, mas também foi observada para outros serotipos conjugados ao toxoide tetânico numa composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto. Por exemplo, conforme mostrado nos Exemplos, a conjugação dos serotipos 1 e 5 ou 3 e 5 ao toxoide tetânico numa composição de conjugado pneumocócico de veículo misto com os serotipos restantes conjugados ao CRM; (por exemplo, PCV21(1/5/15B/22F)-TT e PCV21(3/5/15B/22F)-TT) induziu consistentemente — respostas de anticorpo significativamente aprimoradas aos serotipos conjugados ao toxoide tetânico em comparação às respostas de anticorpo (resposta de IgG ou títulos MOPA) contra os mesmos serotipos conjugados ao CRM:197 numa composição de conjugado pneumocócico de veículo único (PREVNAR

13).

[048] O toxoide tetânico é significativamente maior do que o CRM'197. Portanto, conjugar três ou quatro dos serotipos 1, 3, 5, 15B e 22F ao toxoide tetânico como parte de uma vacina de veículo misto resulta numa razão entre polissacarídeo reduzido e veículo ("PS/C") para aqueles serotipos conjugados ao toxoide tetânico em comparação à razão PS/C daqueles mesmos serotipos conjugados a um veículo único que é menor do que o toxoide tetânico, como CRM197. Desta maneira, a abordagem de veículo misto descrita neste pedido pode ser usada para reduzir as razões PS/C para um ou mais dos serotipos 1, 3, 5, 15B ou 22F.

[049] As composições de conjugado pneumocócico 21-valentes de veículo misto descritas neste pedido também incluem serotipos pneumocócicos não atualmente cobertos pelas três vacinas pneumocócicas conjugadas atualmente disponíveis no mercado global: PREVNAR (chamada Prevenar em alguns países), SYNFLORIX e PREVNAR 13. As doenças causadas por serotipos pneumocócicos não atualmente cobertos estão aumentando, devido, em parte, ao desenvolvimento de resistência antibacteriana, ao número aumentado de pacientes imunocomprometidos e à falta de pressão imunológica. Por exemplo, nenhuma das vacinas pneumocócicas conjugadas atualmente disponíveis inclui o serotipo 9N. Adicionalmente, nenhuma das vacinas pneumocócicas conjugadas atualmente disponíveis inclui os serotipos 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F. A presente descrição demonstra a implementação bem-sucedida dos serotipos 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F num veículo misto (toxoide tetânico e CRM:1697), vacina pneumocócica conjugada, assim como respostas de anticorpos induzidas pelo serotipo 9N que foram cerca de 40 a 50 vezes maiores do que PREVNAR13. SEROTIPO 9N DE POLISSACARÍDEO PNEUMOCÓCICO

[050] O polissacarídeo de serotipo 9N pode ser obtido diretamente das bactérias usando um procedimento de isolamento conhecido por aqueles de habilidade comum na técnica (incluindo, porém sem limitação, os métodos descritos na Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2006/0228380). Adicionalmente, o sacarídeo pode ser produzido usando protocolos sintéticos.

[051] A cepa de Streptococcus pneumoniae de serotipo 9N pode ser obtida a partir de coleções de culturas estabelecidas (por exemplo, o Laboratório de Referência Estreptocócica dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (Atlanta, Geórgia)) ou amostras clínicas.

[052] A célula bacteriana é tipicamente cultivada num meio, tal como um meio à base de soja. Após fermentação da célula bacteriana que produz o polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N, a célula bacteriana é lisada para produzir um lisado celular. Então, o polissacarídeo de serotipo 9N pode ser isolado do lisado celular usando técnicas de purificação conhecidas na arte, incluindo centrifugação, filtração profunda, precipitação, ultrafiltração, tratamento com carvão ativado, diafilttação e/ou cromatografia em coluna (incluindo, porém sem limitação, os métodos descritos na Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2006/0228380). O polissacarídeo capsular de serotipo 9N purificado pode ser usado para a preparação de um conjugado imunogênico. O polissacarídeo capsular de serotipo 9N obtido pela purificação do polissacarídeo de serotipo 9N do lisado de Streptococcus pneumoniae e, opcionalmente, pelo dimensionamento do polissacarídeo purificado pode ser caracterizado por diferentes parâmetros, incluindo, por exemplo, o peso molecular (MW) do polissacarídeo capsular de serotipo 9N.

[053] Em certas modalidades, o polissacarídeo purificado que é purificado a partir do serotipo 9N de Streptococcus pneumoniae antes da conjugação tem um peso molecular de 5 a 5000 kDa. Em certas modalidades, o polissacarídeo capsular de serotipo 9N antes da conjugação tem um peso molecular de 50 a 1000 kDa. Em certas modalidades, o polissacarídeo capsular de serotipo 9N antes da conjugação tem um peso molecular de 70 a 900 kDa. Em certas modalidades, o polissacarídeo capsular de serotipo 9N antes da conjugação tem um peso molecular de 100 a 800 kDa. Em certas modalidades, o polissacarídeo capsular de serotipo 9N purificado pode ser ativado antes da conjugação para ter um peso molecular de 50 a 800 kDa, 80 a 780 kDa, 100 a 770 kDa, 120 a 760 kDa, 140 a 750 kDa, 150 a 740 kDa, 160 a 730 kDa, 170 a 735 kDa, 180 a 720 kDa, 190 a 710 kDa, 200 a 700 kDa, 220 a 690 kDa, 240 a 680 kDa, 260 a 670 kDa, 270 a 660 kDa ou faixas de peso molecular similares. Qualquer número inteiro dentro de qualquer uma das faixas acima é contemplado como uma modalidade da presente descrição.

[054] O polissacarídeo de serotipo 9N ativado pode ser caracterizado por um grau de oxidação e peso molecular. Em certas modalidades, o polissacarídeo de serotipo 9N ativado pode ter um grau de oxidação de 0,5 a 25, 0,6 a 23, 0,8 a 21, 1 a 20,8, 1,1 a 20,5, 1,2a 20,3, 1,3 a 20, 1,4 a 19,5, 1,5a 19,3, 1,6 a 19,2, 1,7 a 19,1,2a19,3a 18,4 a 150u5a10.

[055] O polissacarídeo pode se tornar ligeiramente reduzido em tamanho “durante um procedimento de purificação normal. Adicionalmente, conforme descrito na presente descrição, o polissacarídeo pode ser submetido ao dimensionamento antes da conjugação. A faixa de peso molecular mencionada acima se refere à esta do polissacarídeo purificado após a etapa de dimensionamento final (por exemplo, após a purificação, hidrólise e ativação) antes da conjugação.

COMPOSIÇÕES DE CONJUGADO PNEUMOCÓCICO MULTIVALENTES DE VEÍCULO MISTO E MÉTODOS PARA PRODUZIR AS MESMAS

[056] Esta descrição fornece uma composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto que compreende ou consiste em 21 conjugados de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócicos diferente, em que cada conjugado de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócico compreende um veículo de proteína conjugado a um polissacarídeo capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae, em que os serotipos de Streptococcus pneumoniae são 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, ON, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, em que o carreado de proteína é CRM197 ou toxoide tetânico, em que 3 a 4 dos polissacarídeos capsulares são conjugados ao toxoide tetânico e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM:197, e em que os 3 a 4 polissacarídeos capsulares que são conjugados ao toxoide tetânico são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3, 5, 15B e 22F. Em certas modalidades, três dos polissacarídeos capsulares são conjugados ao toxoide tetânico e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM:197. Em certas modalidades, quatro dos polissacarídeos capsulares são conjugados ao toxoide tetânico e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM 197

[057] Num aspecto, a descrição fornece uma composição de conjugado —pneumocócico multivalente de veículo misto que compreende ou consiste em 21 conjugados de polissacarídeo capsular- proteína pneumocócicos diferente, em que cada conjugado de polissacarídeo — capsular-proteína pneumocócico compreende um veículo de proteína conjugado a um polissacarídeo capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae, em que os serotipos de Streptococcus pneumoniae são 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, em que o carreado de proteína é CRM:197 ou toxoide tetânico, em que quatro dos polissacarídeos capsulares são conjugados ao toxoide tetânico e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM 197, e em que dois dos quatro polissacarídeos capsulares que são conjugados ao toxoide tetânico são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3 e 5 e os dois polissacarídeos capsulares restantes são os serotipos 15B e 22F.

[058] Em uma modalidade, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 5, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM+197. Em outra modalidade, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 3, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM:197. Em ainda outra modalidade, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 5, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM 197.

[059] Numa vacina de conjugado de polissacarídeo-proteína, uma proteína veículoa é conjugada a um antígeno de polissacarídeo primariamente para ajudar a melhorar a resposta imunológica (por exemplo, resposta de anticorpo) ao antígeno de polissacarídeo. As proteínas veículoas são, de preferência, proteínas que são não tóxicas. As proteínas veículoas devem ser passíveis de conjugação a um polissacarídeo pneumocócico usando procedimentos de conjugação padrão, conforme discutido em mais detalhes abaixo. As proteínas veículoas usadas nas composições de conjugado pneumocócico 21- valentes de veículo misto são toxoide tetânico (TT) e CRM197, cada uma das quais foi usada no projeto de vacinas pneumocócicas conjugadas, mas nunca na mesma vacina de veículo misto.

[060] CRM97 é uma variante não tóxica (isto é, toxoide) da toxina da difteria que retém as propriedades imunológicas da toxina da difteria do tipo selvagem. CRM197 se difere da toxina da difteria do tipo selvagem numa única base no gene estrutural, que dá origem a uma única substituição de aminoácido do ácido glutâmico por glicina. CRM:197 é tipicamente isolado de culturas de cepa C7 de Corynebacterium diphtheria (B197) cultivada em casaminoácidos e meio à base de extrato de levedura. CRM:97 pode ser purificado através de ultrafiltração, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica. Alternativamente, CRM+197 pode ser preparado de forma recombinante de acordo com a Patente nº U.S. 5.614.382, que é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade. CRM 197 foi usado no projeto de vacinas pneumocócicas conjugadas, mas nunca como parte de uma vacina de veículo misto.

[061] O toxoide tetânico é preparado e usado em todo o mundo para imunização em grande escala contra tétano (ou trismo) causado por Clostridium tetani. O toxoide tetânico também é usado tanto isoladamente quanto em combinação com vacinas contra difteria e/ou coqueluche. A proteína original, a toxina tetânica, é geralmente obtida em culturas de Clostridium tetani. A toxina tetânica é uma proteína de cerca de 150 kDa e consiste em duas subunidades (cerca de 100 kDa e cerca de 50 kDa) ligadas por uma ligação de dissulfeto. A toxina é tipicamente desintoxicada com formaldeído e pode ser purificada a partir de filtrados de cultura usando métodos conhecidos, tais como precipitação com sulfato de amônio (consultar, por exemplo, [7], [8]) ou técnicas de cromatografia, conforme descrito, por exemplo, no documento nº WO 1996/025425. A toxina tetânica também pode ser inativada por meios genéticos recombinantes.

[062] O toxoide tetânico também foi usado como uma proteína veículoa em outras vacinas, incluindo vacinas pneumocócicas conjugadas. Porém, o uso da toxina tetânica numa vacina pneumocócica conjugada de veículo misto em combinação com CRM+197 é novo. A técnica também se afasta da conjugação do serotipo 3 ao toxoide tetânico numa vacina pneumocócica conjugada de veículo misto devido ao fato de que o serotipo 3 mostrou ser mais imunogênico quando conjugado ao toxoide da difteria em comparação com o toxoide tetânico [6].

[063] Os polissacarídeos capsulares pneumocócicos usados nas composições e vacinas descritas no presente documento, incluindo os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, ON, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C , 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, podem ser preparados a partir de Streptococcus pneumoniae usando qualquer técnica disponível, incluindo técnicas padrão conhecidas por uma pessoa de habilidade comum na técnica, incluindo, por exemplo, aquelas descritas nos documentos nº WO 2006/110381, WO 2008/118752, WO 2006/110352 e nas Publicações de Pedido de Patente nº U.S. 2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, 2008/0102498 e 2008/0286838, todos os quais estão incorporados a título de referência em suas totalidades. Por exemplo, cada serotipo de polissacarídeo capsular pneumocócico pode ser cultivado em meio de cultura (por exemplo, um meio à base de soja). As células são lisadas, e polissacarídeos individuais podem ser purificados a partir do lisado através de centrifugação, precipitação, ultrafiltração e/ou cromatografia em coluna. Adicionalmente, o polissacarídeo capsular pneumocócico pode ser produzido usando protocolos sintéticos.

[064] Os polissacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae compreendem unidades de oligossacarídeo de repetição que podem conter até 8 resíduos de açúcar. Um antígeno de sacarídeo capsular pode ser um polissacarídeo de comprimento total ou pode ter tamanho reduzido (por exemplo, uma única unidade de oligossacarídeo ou uma cadeia de sacarídeo de comprimento mais curto do que o nativo de unidades de oligossacarídeos de repetição). O tamanho dos polissacarídeos capsulares pode ser reduzido por vários métodos conhecidos na técnica, tais como tratamento de hidrólise ácida, tratamento com peróxido de hidrogênio, dimensionamento por um homogeneizador de alta pressão, opcionalmente seguido por um tratamento com peróxido de hidrogênio para gerar fragmentos de oligossacarídeos ou microfluidização.

[065] O conjugado pneumocócico de cada um dos serotipos pode ser preparado conjugando-se um polissacarídeo capsular de cada serotipvo a uma proteína veículoa. Os diferentes conjugados pneumocócicos podem ser formulados numa composição, incluindo uma formulação de dosagem única.

[066] Para preparar um conjugado de polissacarídeo-proteína, os polissacarídeos capsulares preparados a partir de cada serotipo pneumocócico podem ser quimicamente ativados de modo que os polissacarídeos capsulares possam reagir com uma proteína veículoa. Uma vez ativado, cada polissacarídeo capsular pode ser conjugado separadamente a uma proteína veículoa para formar um glicoconjugado. A ativação química dos polissacarídeos e a conjugação subsequente à proteína veículoa podem ser alcançadas por métodos convencionais. Por exemplo, os grupos hidroxila vicinais na extremidade dos polissacarídeos capsulares podem ser oxidados a grupos aldeído por agentes oxidantes, tais como periodatos (incluindo periodato de sódio, periodato de potássio ou ácido periódico), conforme descrito, por exemplo, nas Patentes nº U.S. 4.365.170, 4.673.574 e

4.902.506, que estão incorporadas ao presente documento a título de referência em suas totalidades. O periodato oxida aleatoriamente o grupo hidroxila vicinal de um carboidrato para formar um grupo aldeído reativo e causa a clivagem de uma ligação de C-C. O termo "periodato" inclui tanto periodato quanto ácido periódico. Este termo também inclui tanto metaperiodato (1014) quanto ortoperiodato (IOs5-). O termo

"periodato" também inclui vários sais de periodato incluindo periodato de sódio e periodato de potássio. Em certas modalidades, o polissacarídeo pode ser oxidado na presença de metaperiodato de sódio.

[067] Em certas modalidades, o periodato pode ser usado numa quantidade de cerca de 0,03 a 0,17 ug por 1 ug de polissacarídeo. Em certas modalidades, o periodato pode ser usado numa quantidade de cerca de 0,025 a 0,18 ug ou cerca de 0,02 a 0,19 ug por 1 ug de polissacarídeo. O sacarídeo pode ser ativado conforme desejado dentro da faixa acima. Fora da faixa, o efeito pode ser insatisfatório.

[068] Os polissacarídeos também podem ser ativados com tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridínio (CDAP) para formar um éster de cianato. O polissacarídeo ativado é, então, acoplado diretamente ou por meio de um grupo espaçador ou ligante a um grupo amino na proteína veículoa.

[069] Por exemplo, o espaçador poderia ser cistamina ou cisteamina para gerar um polissacarídeo tiolado que poderia ser acoplado ao veículo por meio de uma ligação de tioéter obtida após a reação com uma proteína veículoa ativada por maleimida (por exemplo, usando éster de N-[i-maleimidobutirloxilsuccinimida (GMBS)) ou uma proteína veículoa haloacetilada (por exemplo, usando iodoacetimida, bromoacetato de N-succinimidila (SBA; SIB), N-succinimidil(4- iodoacetil)aminobenzoato (SIAB), sulfossuccinimidil(4- iodoacetil)aminobenzoato (sulfo-SIAB), iodoacetato de N-succinimidila (SIA) ou 3-[bromoacetamido]proprionato de succinimidila (SBAP)). De preferência, o éster cianato (opcionalmente produzido pela química de COAP) é acoplado à hexano diamina ou di-hidrazida do ácido adípico (AOH), e o sacarídeo derivado de amino é conjugado à proteína veículoa usando a química de carbodi-imida (por exemplo, EDAC ou EDC) por meio de um grupo carboxila no veículo de proteína. Tais conjugados são descritos, por exemplo, nos documentos nº WO 93/15760, WO 95/08348 e WO 96/129094, todos os quais estão incorporados ao presente documento a título de referência em suas totalidades.

[070] A conjugação dos polissacarídeos capsulares ativados e das proteínas veículoas pode ser alcançada, por exemplo, por aminação redutora, conforme descrito, por exemplo, nas Publicações de Pedido de Patente nº U.S. 2006/0228380, 2007/0231340, 2007/0184071 e 2007/0184072, WO 2006/110381, WO 2008/0796538 e WO 2008/143709, todos os quais estão incorporados ao presente documento a título de referência em suas totalidades. Por exemplo, os polissacarídeos capsulares ativados e a proteína veículoa podem ser reagidos com um agente redutor para formar um conjugado. Os agentes redutores que são adequados incluem boroidretos, tais como cianoboroidreto de sódio, borano-piridina, triacetoxiboroidreto de sódio, boroidreto de sódio ou resina de troca de boroidreto. No final da reação de redução, pode haver grupos aldeído não reagidos restantes nos conjugados. Os grupos aldeído não reagidos podem ser submetidos a capeamento usando um agente de capeamento adequado, tal como boroidreto de sódio (NaBH.4). Numa modalidade, a reação de redução é executada em solvente aquoso. Em outra modalidade, a reação é executada um solvente aprótico. Numa modalidade, a reação de redução é executada em DMSO (dimetilsulfóxido) ou em solvente de DMF (dimetilformamida). Outros agentes redutores possíveis incluem, porém sem limitação, amina-boranos, tais como piridina-borano, 2- picolina-borano, — 2,6-diborano-metanol, — dimetilamina-borano, — t- BuMeiPrN-BH3, benzilamina-BH3 ou B5-etil-P-metilpiridina-borano (PEMB).

[071] Os polissacarídeos capsulares ativados podem ser conjugados diretamente à proteína veículoa ou indiretamente através do uso de um espaçador ou ligante, tal como um ligante bifuncional. O ligante é opcionalmente heterobifuncional ou homobifuncional, que tem, por exemplo, um grupo amino reativo e um grupo ácido carboxílico reativo, 2 grupos amino reativos ou dois grupos ácido carboxílico reativos.

[072] Outras técnicas adequadas para conjugação usam carbodi- imidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N- hidroxissuccinimida, S--NHS, EDC, TSTU, conforme descrito, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 98/42721, que está incorporada a título de referência em sua totalidade. A conjugação pode envolver um ligante de carbonila que pode ser formado pela reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo com 1,1"- carbonildi-imidazol (CDI) (consultar Bethell et al. (1979) J. Biol. Chem. 254:2572-2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218:509-518) seguido pela reação com uma proteína para formar uma ligação de carbamato. Isto pode envolver a redução da terminação anomérica para um grupo hidroxila primário, proteção/desproteção opcional do grupo hidroxila primário, reação do grupo hidroxila primário com CDI para formar um intermediário de carbamato de CDI e acoplamento do intermediário de carbamato de CDI a um grupo amino numa proteína.

[073] A razão entre polissacarídeo e proteína veículoa para vacinas pneumocócicas conjugadas está tipicamente na faixa de 0,3 a 3,0 (p/p), mas pode variar com o serotipo. A razão pode ser determinada pela medição independente das quantidades de proteína e polissacarídeo presentes ou por métodos que fornecem uma medida direta da razão conhecidos na técnica. Métodos incluindo espectroscopia de RMN de *H ou SEC-HPLC-UV/RI com monitorização dupla (por exemplo, índice de refracção e UV, para material total e teor de proteína, respectivamente) podem perflar a razão entre sacarídeo/proteína através da distribuição de tamanho dos conjugados,

assim como por SEC-HPLC-MALLS ou MALDI-TOF-MS.

[074] Os conjugados de polissacarídeo-proteína assim obtidos podem ser purificados e enriquecidos por uma variedade de métodos. Estes métodos incluem concentração/diafiltração, cromatografia em coluna e filtração profunda. Os conjugados de polissacarídeo-proteína purificados são combinados para formular uma composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto, que pode ser usada como uma vacina.

[075] A formulação de uma composição de vacina pode ser realizada usando métodos reconhecidos na técnica. Uma composição de vacina é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Os conjugados de polissacarídeo capsular- proteína pneumocócicos individuais podem ser formulados em conjunto com um transportador fisiologicamente aceitável para preparar a composição. Os exemplos de tais transportadores incluem, porém sem limitação, água, solução salina tamponada, polióis (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglico! líquido) e soluções de dextrose.

[076] Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto compreende ainda um adjuvante. Conforme usado no presente documento, um "adjuvante" se refere a uma substância ou transportador que melhora não especificamente a resposta imunológica a um antígeno. Os adjuvantes podem incluir uma suspensão de minerais (alume, sais de alumínio, tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, hidróxi fosfato sulfato de alumínio, etc.) nos quais o antígeno é adsorvido; ou emulsão de água em óleo em que a solução de antígeno é emulsificada em óleo mineral (por exemplo, adjuvante incompleto de Freund), às vezes com a inclusão de micobactérias mortas (adjuvante completo de Freund) para melhorar adicionalmente a antigenicidade. Os oligonucleotídeos imunoestimuladores (tais como aqueles que incluem um motivo CpG) também podem ser usados como adjuvantes (por exemplo, consultar as Patentes nº U.S. 6.194.388; 6.207.646;

6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; 6.339.068; 6.406.705; e 6.429.199). Os adjuvantes também incluem moléculas biológicas, tais como lipídios e moléculas coestimuladoras. Os exemplos de adjuvantes biológicos incluem ASO04 [9], IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-a, IFN-y, G-CSF, LFA- 3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L e 41 BBL.

[077] Em algumas modalidades, o adjuvante é um adjuvante à base de alumínio. Tipicamente, uma dose única de vacina de 0,5 ml é formulada para conter cerca de 0,1 mg a 2,5 mg do adjuvante à base de alumínio. Em outras modalidades, uma dose única de vacina de 0,5 ml é formulada para conter entre 0,1 mg a 2 mg, 0,1 mg a 1mg,0,1mga 0,5 mg, 0,1 mg a 0,2 mg, 0,125 mg a 2,5 mg, 0,125 mg a 0,5 mg, 0,125 mg a 0,2 mg ou 0,125 a 0,25 mg do adjuvante à base de alumínio. Em certas modalidades, uma dose única de vacina de 0,5 ml é formulada para conter cerca de 0,125 mg a cerca de 0,250 mg do adjuvante à base de alumínio. Em certas modalidades, uma dose única de vacina de 0,5 ml é formulada para conter cerca de 0,125 mg do adjuvante à base de alumínio. Em certas modalidades, uma dose única de vacina de 0,5 ml! é formulada para conter cerca de 0,250 mg do adjuvante à base de alumínio.

[078] Em modalidades particulares, o adjuvante é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

[079] Em modalidades particulares, o adjuvante é fosfato de alumínio.

[080] Em algumas modalidades, a composição é para uso como uma vacina contra uma infecção por Streptococcus pneumoniae.

CARACTERIZAÇÃO DE CONJUGADOS DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR-VEÍCULO DE PROTEÍNA PNEUMÁTICOS

[081] Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo- veículo de proteína pode ter um peso molecular de 100 a 10000 kDa. Em certas modalidades, o conjugado tem um peso molecular de 200 a 9000 kDa. Em certas modalidades, o conjugado tem um peso molecular de 300 a 8000 kDa. Em certas modalidades, o conjugado tem um peso molecular de 400 a 7000 kDa. Em certas modalidades, o conjugado tem um peso molecular de 500 a 6000 kDa. Em certas modalidades, o conjugado tem um peso molecular de 600 a 5000 kDa. Em certas modalidades, o conjugado tem um peso molecular de 500 a 4000 kDa. Qualquer número inteiro dentro de qualquer uma das faixas acima é contemplado como uma modalidade da presente descrição.

[082] Quando o peso molecular está dentro da faixa acima, o conjugado pode ser formado de forma estável com alto rendimento. Também, a proporção de um polissacarídeo livre pode ser reduzida. Adicionalmente, uma imunogenicidade superior pode ser alcançada dentro da faixa de peso molecular acima.

[083] Após os conjugados individuais de polissacarídeo-proteína serem purificados, os mesmos são compostos para formular a composição imunogênica da presente descrição.

[084] Os conjugados de sacarídeo-proteína dos serotipos da presente descrição podem ser caracterizados por uma razão entre o polissacarídeo e o veículo de proteina (quantidade de polissacarídeo/quantidade de veículo de proteína, p/p).

[085] Em certas modalidades, a razão (p/p) entre o polissacarídeo e o veículo de proteína no conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína para cada serotipo é 0,5 a 2,5, 0,4 a 2,3, 0,3 a 2,1, 0,22 a2, 0,24 a 2, 0,2 a 1,8, 0,18-1,6, 0,16 a 1,4, 0,14 a 1,2, 0,12a 1 ou 0,1 a 1 (por exemplo, cerca de 0,7, cerca de 0,8, cerca de 0,9, cerca de 1,0, cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,6, cerca de 1,6, cerca de 1,6, cerca de 1,8,

cerca de 1,9, cerca de 2,0, cerca de 2,1, cerca de 2,2, cerca de 2,3, cerca de 2,4 ou cerca de 2,5).

[086] Quando a razão entre o polissacarídeo e o veículo de proteína está dentro da faixa acima, o conjugado pode ser formado de forma estável com alto rendimento. Também, a proporção de um polissacarídeo livre pode ser reduzida. Adicionalmente, uma imunogenicidade superior pode ser alcançada, e o conjugado pode ser mantido de forma estável sem interferência de outros serotipos dentro da faixa acima.

[087] Os conjugados e composições imunogênicas da presente descrição podem conter um polissacarídeo livre que não é covalentemente conjugado ao veículo de proteína, mas está, no entanto, presente na composição de conjugado de polissacarídeo- veículo de proteína. O polissacarídeo livre pode estar associado não covalentemente ao conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína (isto é, ligado não covalentemente, adsorvido ou aprisionado no ou pelo conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína).

[088] Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo- veículo de proteína contém menos do que cerca de 60%, cerca de 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ou 15% de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo. Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo- veículo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 60% de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo. Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 50% de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo. Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 40% de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo. Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 30 % de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo. Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 25 % de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo. Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 20 % de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo. Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 15 % de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo. Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 10 % de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo.

[089] O conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo pode também ser caracterizado pela sua distribuição de tamanho molecular (Ka). Um meio de cromatografia de exclusão de tamanho (CL-4B; microesferas de agarose reticuladas, 4%) pode ser usado para determinar a distribuição relativa de tamanho molecular do conjugado. A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) é usada numa coluna alimentada por gravidade para perfilar a distribuição de tamanho molecular do conjugado. As grandes moléculas excluídas dos poros no meio são eluídas mais rapidamente do que as pequenas moléculas. Um coletor de frações é usado para coletar o eluato da coluna. As frações são testadas colorimetricamente por ensaio de sacarídeo. Para a determinação de Ka, a coluna é calibrada para estabelecer a fração em que as moléculas são completamente excluídas (Vo; Ka = 0) e a fração que representa a retenção máxima (V;; Ka = 1). A fração na qual um atributo de amostra especificado é atingido (Ve) está relacionada à Ka pela expressão Ka = (Ve - Vo)/(Vi - Vo).

[090] Em certas modalidades, pelo menos 15% do conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo pode ter uma Ka de 0,3 ou menos numa coluna CL-4B.

[091] Em certas modalidades, pelo menos 20 % do conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo pode ter uma Ka de 0,3 ou menos numa coluna CL-4B. Em certas modalidades, pelo menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90% do conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo pode ter uma Ka de 0,3 ou menos numa coluna CL-4B. Em certas modalidades, pelo menos 60 % do conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo pode ter uma Ka de 0,3 ou menos numa coluna CL-4B. Em certas modalidades, pelo menos 50 a 80 % do conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo pode ter uma Ka de 0,3 ou menos numa coluna CL-4B. Em certas modalidades, pelo menos 65 a 80 % do conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo pode ter uma Ka de 0,3 ou menos numa coluna CL-4B. Em certas modalidades, pelo menos a 60% do conjugado de sacarídeo-proteína de cada serotipo pode ter uma Ka de 0,3 ou menos numa coluna CL-4B.

MÉTODOS E USOS PROFILÁTICOS

[092] Num aspecto, esta descrição fornece uma vacina que compreende uma composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o excipiente farmaceuticamente aceitável compreende pelo menos um tampão, tal como um tampão de succinato, um sal, tal como cloreto de sódio, e/ou um agente ativo de superfície, tal como um éster de polioxietileno sorbitano (por exemplo, polissorbato 80). Em algumas modalidades, trêê ou quatro polissacarídeos capsulares “selecionados dos serotipos específicos, conforme mencionado acima, são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares restantes dentre 1, 3, 4, 5, GA, 6B, 7F, 8, ON, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F são conjugados ao CRM+197 (21-valente).

[093] Numa modalidade, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 5, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197 (21-valente).

[094] Em outra modalidade, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 3, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197 (21-valente).

[095] Em ainda outra modalidade, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 5, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197 (21-valente).

[096] Em algumas modalidades, a vacina produz uma resposta imunológica protetora num sujeito humano contra a doença causada pela infecção por Streptococcus pneumoniae.

[097] De acordo com um aspecto adicional, esta descrição fornece um método para profilaxia da infecção ou doença por Streptococcus pneumoniae, sendo que o método compreende administrar a um sujeito humano uma quantidade profilaticamente eficaz de uma composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto ou uma vacina que compreende a mesma. A composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto ou vacina que compreende a mesma pode ser administrada por qualquer via, incluindo, por exemplo, por uma via sistêmica ou mucosa, conforme descrito abaixo em mais detalhes.

[098] Em certas modalidades, o sujeito humano é um sujeito idoso, e a doença é pneumonia ou doença pneumocócica invasiva (IPD). Em certas modalidades, o sujeito idoso tem pelo menos 50 anos de idade. Em outras modalidades, o sujeito idoso tem pelo menos 55 anos de idade. Em ainda outras modalidades, o sujeito idoso tem pelo menos 60 anos de idade.

[099] Em outras modalidades, o sujeito humano é um bebê, e a doença é pneumonia, doença pneumocócica invasiva (IPD) ou otite média aguda (AOM). Em certas modalidades, o bebê tem de O a 2 anos. Em outras modalidades, o bebê tem de 2 a 15 meses.

[0100] Em ainda outra modalidade, o sujeito humano tem 6 semanas a 17 anos de idade, e a doença é pneumonia, doença pneumocócica invasiva (IPD) ou otite média aguda (AOM). Em certas modalidades, o sujeito humano tem 6 semanas a 5 anos de idade. Em outras modalidades, o sujeito humano tem 5 a 17 anos de idade.

[0101] A quantidade de conjugado em cada dose de vacina ou a quantidade profilaticamente eficaz da composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto pode ser selecionada como uma quantidade que induz a profilaxia sem efeitos adversos significativos. Tal quantidade pode variar dependendo do serotipo pneumocócico. Geralmente, cada dose pode incluir cerca de 0,1 ug a cerca de 100 ug de polissacarídeo, especificamente, cerca de 0,1 a 10 pg e, mais especificamente, cerca de 1 ug a cerca de 5 ug. As quantidades ideais de componentes para uma vacina específica podem ser verificadas por estudos padrão envolvendo a observação de respostas imunológicas apropriadas nos sujeitos. Por exemplo, a quantidade para vacinação de um sujeito humano pode ser determinada extrapolando-se um resultado de teste em animal. Adicionalmente, a dose pode ser determinada empiricamente.

[0102] Em algumas modalidades, a vacina ou a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml! formulada para conter cerca de 1 ug a cerca de 5 ug de cada polissacarídeo capsular; cerca de 1 ug a cerca de 30 ug de TT; cerca de 20 ug a cerca de 85 ug de CRM197; e opcionalmente cerca de 0,1 mg a cerca de 0,5 mg do adjuvante de alumínio elementar. Em algumas modalidades, a vacina ou a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 2 ug a cerca de 2,5 ug de cada polissacarídeo capsular exceto o serotipo 6B e, opcionalmente, o serotipo 3, que está/estão presentes numa quantidade de cerca de 4 ug a cerca de 5 ug; cerca de 2 ug a cerca de 25 ug de TT; cerca de 40 ug a cerca de 75 ug de CRM197; e opcionalmente cerca de 0,1 mg a cerca de 0,25 mg do adjuvante de alumínio elementar.

[0103] Em algumas modalidades, a vacina ou a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 2,2 ug de cada polissacarídeo capsular exceto o serotipo 6B, que está presente numa quantidade de cerca de 4,4 ug.

[0104] Em algumas modalidades, a vacina ou a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 2 ug a cerca de 2,5 ug de cada um dos polissacarídeo capsulares exceto até seis polissacarídeos capsulares selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 9V, 19A e 19F, cada um dos quais está presente numa quantidade de cerca de 4 ug a cerca de 5 ug. Numa modalidade, os até seis polissacarídeos capsulares, presentes numa quantidade de cerca de 4 ug a cerca de 5 ug, são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3, 4, 6B, 9V, 19A e 19F. Em outras modalidades, a vacina ou a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 2,2 ug de cada um dos polissacarídeos capsulares exceto até seis polissacarídeos capsulares selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 9V, 19A e 19F, cada um dos quais está presente numa quantidade de cerca de 4,4 ug. Numa modalidade, os até seis polissacarídeos capsulares, presentes numa quantidade de cerca de 4,4 ug, são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3, 4, 6B, 9V, 19A e 19F.

[0105] Em algumas modalidades, a vacina ou a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 2 ug a cerca de 2,5 ug dos polissacarídeos capsulares dos serotipos 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 22F, 23F e 33F e cerca de 4 ug a cerca de 5 ug dos polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 3, 6B, 19A e 19F.

[0106] Em algumas modalidades, a vacina ou a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 2 ug a cerca de 2,5 ug dos polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 5, 6A, 7F, 8, ON, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 22F, 23F e 33F e cerca de 4 ug a cerca de 5 ug dos polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 4, 6B, 9V, 19A e 19F.

[0107] Em certas modalidades, a vacina ou a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 2 a 2,5 ug dos polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F e cerca de 4 a cerca de 5 ug dos polissacarídeos capsulares dos serotipos 3 e 6B.

[0108] Em algumas modalidades, a vacina ou a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml! formulada para conter cerca de 2 a cerca de 2,5 ug dos polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F e cerca de 4 a cerca de 5 ug dos polissacarídeos capsulares do serotipo 6B e cerca de 8 a cerca de 9 ug dos polissacarídeos capsulares do serotipo 3 e, mais preferencialmente, cerca de 8,8 ug dos polissacarídeos capsulares do serotipo 3.

[0109] Em certas modalidades, a composição do conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto ou vacina que compreende a mesma compreende ainda cloreto de sódio e tampão de succinato de sódio como excipientes.

[0110] Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser formulada numa formulação líquida em que cada um dos polissacarídeos capsulares pneumocócicos dos serotipos 1, 5, 15B e 22F é conjugado ao TT, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197 (21-valente). Cada dose de 0,5 ml pode ser formulada num líquido contendo: cerca de 2,2 ug de cada polissacarídeo capsular, exceto o serotipo 6B a cerca de 4,4 ug; cerca de 2 ug a cerca de 25 ug de proteína veículoa TT (apenas para os serotipos 1, 5, 15B e 22F) e cerca de 40 ug a cerca de 75 ug de proteína veículoa CRM197; cerca de 0,125 a 0,250 mg de adjuvante de alumínio elementar (cerca de 0,5 a 1,2 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão de succinato de sódio como excipientes.

[0111] Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser formulada numa formulação líquida em que cada um dos polissacarídeos capsulares pneumocócicos dos serotipos 3, 5, 15B e 22F é conjugado ao TT, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197 (21-valente).. Numa modalidade, cada dose de 0,5 ml pode ser formulada num líquido contendo: cerca de 2,2 ug de cada polissacarídeo capsular, exceto o serotipo 6B a cerca de 4,4 ug; cerca de 2 ug a cerca de 25 ug de proteína veículoa TT (apenas para os serotipos 3, 5, 15B e 22F) e cerca de 40 ug a cerca de 70 ug de proteína veículoa CRM197; cerca de 0,125 mg a cerca de 0,250 mg de adjuvante de alumínio elementar (cerca de 0,5 a 1,2 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão de succinato de sódio como excipientes. Em outra modalidade, cada dose de 0,5 ml pode ser formulada num líquido contendo: cerca de 2,2 ug de cada polissacarídeo capsular, exceto os até seis polissacarídeos capsulares selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 9V, 19A e 19F a cerca de 4,4 ug; cerca de 2 ug a cerca de 25 ug de proteína veículoa TT (apenas para os serotipos 3, 5, 15B e 22F) e cerca de 40 ug a cerca de 70 ug de proteína veículoa CRM197; cerca de 0,125 mg a cerca de 0,250 mg de adjuvante de alumínio elementar (cerca de 0,5 a 1,2 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão de succinato de sódio como excipientes. Numa modalidade, até seis polissacarídeos capsulares a cerca de 4,4 ug são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3, 4, 6B, 9V, 19A e 19F. Em ainda outra modalidade, cada dose de 0,5 ml pode ser formulada num líquido contendo: cerca de 2,2 ug de cada polissacarídeo capsular, exceto os serotipos 1, 3, 6B, 19A e 19F a cerca de 4,4 ug; cerca de 2 ug a cerca de 25 ug de proteína veículoa TT (apenas para os serotipos 3, 5, 15B e 22F) e cerca de 40 ug a cerca de 70 ug de proteína veículoa CRM:197; cerca de 0,125 mga cerca de 0,250 mg de adjuvante de alumínio elementar (cerca de 0,5 a 1,2 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão de succinato de sódio como excipientes.

[0112] Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser formulada numa formulação líquida em que cada um dos polissacarídeos capsulares pneumocócicos dos serotipos 1, 3, 15B e 22F é conjugado ao TT, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197 (21-valente).. Numa modalidade, cada dose de 0,5 ml pode ser formulada num líquido contendo: cerca de 2,2 ug de cada polissacarídeo capsular, exceto o serotipo 6B a cerca de 4,4 ug; cerca de 2 ug a cerca de 25 ug de proteína veículoa TT (apenas para os serotipos 1, 3, 15B e 22F) e cerca de 40 ug a cerca de 75 ug de proteína veículoa CRM197; cerca de 0,125 mg a cerca de 0,250 mg de adjuvante de alumínio elementar (cerca de 0,5 a 1,2 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão de succinato de sódio como excipientes.

[0113] Em algumas modalidades, a formulação líquida pode ser carregada numa seringa de dose única sem um conservante. Após agitação, a formulação líquida se torna uma vacina que é uma suspensão — branca — homogênea pronta para administração intramuscular.

[0114] A composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser administrada numa única injeção ou como parte de uma série de imunizações. Por exemplo, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser administrada 2, 3, 4 ou mais vezes em intervalos apropriadamente espaçados, tais como um intervalo de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 meses ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto é administrada a um bebê 4 vezes nos primeiros 15 meses de nascimento, incluindo, por exemplo, em cerca de 2, 3, 4 e 12 a 15 meses de idade; em cerca de 3,4, 56 12 a 15 meses de idade; ou em cerca de 2, 4,6 e 12 a 15 meses de idade. Esta primeira dose pode ser administrada tão cedo quanto 6 semanas de idade. Em outra modalidade, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto é administrada a um bebê 3 vezes nos primeiros 15 meses de nascimento, incluindo, por exemplo, em cerca de 2, 4 e 11 a 12 meses.

[0115] A composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto também pode incluir uma ou mais proteínas de Streptococcus — pneumoniae. Os exemplos de proteínas de Streptococcus pneumoniae adequadas para inclusão incluem aquelas identificadas no Pedido de Patente Internacional WO02/083855, assim como aquelas descritas no Pedido de Patente Internacional WO02/053761.

[0116] A composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser administrada a um sujeito por uma ou mais vias de administração conhecidas por uma pessoa de habilidade comum na técnica, tal como uma via parenteral, transdérmica ou transmucosal, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intracutânea, intravenosa ou subcutânea, e pode ser formulada em conformidade. A composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser formulada para ser compatível com sua via de administração pretendida.

[0117] Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser administrada como uma formulação líquida por injeção intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, intravenosa, intra-arterial ou transdérmica ou injeção mucosal respiratória. As composições de conjugado pneumocócico 21- valentes de veículo misto podem ser formuladas em forma líquida ou numa forma liofiizada. Em algumas composições, as composições injetáveis são preparadas em formas convencionais, como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção ou como emulsões. Em algumas modalidades, soluções e suspensões de injeção são preparadas a partir de pós ou grânulos estéreis. Considerações gerais sobre a formulação e fabricação de agentes farmacêuticos para administração por estas vias podem ser encontradas, por exemplo, em Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19º edição, Mack Publishing Co., Easton, PA., 1995; incorporado ao presente documento a título de referência. Atualmente, a aspersão oral ou nasal ou via de aerossol (por exemplo, por inalação) são as mais comumente usadas para entregar agentes terapêuticos diretamente aos pulmões e sistema respiratório. Em algumas modalidades, uma composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto é administrada usando um dispositivo que entrega uma dosagem medida da composição. Os dispositivos adequados para uso na entrega de composições farmacêuticas intradérmicas descritas no presente documento incluem dispositivos de agulha curta, tais como aqueles descritos na Patente nº U.S. 4.886.499, Patente nº U.S. 5.190.521, Patente nº U.S. 5.328.483, Patente nº U.S.

5.527.288, Patente nº U.S. 4.270.537, Patente nº U.S. 5.015.235, Patente nº U.S. 5.141.496, Patente nº U.S. 5.417.662 (todas as quais estão incorporadas ao presente documento a título de referência). As composições intradérmicas podem também ser administradas por dispositivos que limitam a extensão de penetração eficaz de uma agulha na pele, tais como aqueles descritos no documento nº WO1999/34850, incorporado ao presente documento a título de referência, e equivalentes funcionais dos mesmos. São também adequados dispositivos de injeção a jato que entregam vacinas líquidas à derme por meio de um injetor de jato líquido ou por meio de uma agulha que perfura o estrato córneo e produz um jato que atinge a derme. Os dispositivos de injeção a jato são descritos, por exemplo, na Patente nº U.S. 5.480.381, Patente nº U.S. 5.599.302, Patente nº U.S. 5.344.144, Patente nº U.S. 5.993.412, Patente nº U.S. 5.659.912, Patente nº U.S.

5.659.189, Patente nº U.S. 5.704.911, Patente nº U.S. 5.383.851, Patente nº U.S. 5.893.397, Patente nº U.S. 5.466.220, Patente nº U.S.

5.339.163, Patente nº U.S. 5.312.335, Patente nº U.S. 5.503.627, Patente nº U.S. 5.064.413, Patente nº U.S. 5.520.639, Patente nº U.S.

4.596.556, Patente nº U.S. 4.790.824, Patente nº U.S. 4.941.880, Patente nº U.S. 4.940.460, WO1997/37705 e WO1997/13537 (todos os quais estão incorporados ao presente documento a título de referência). São também adequados dispositivos de entrega de pó/partícula balísticos que usam gás comprimido para acelerar a vacina em forma de pó através das camadas externas da pele até a derme. Adicionalmente, seringas convencionais podem ser usadas no método clássico de Mantoux para administração intradérmica.

[0118] As preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Os exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos, tais como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Os exemplos de óleo incluem óleo vegetal ou animal, óleo de amendoim, óleo de soja, azeite de oliva, óleo de girassol, óleo de fígado, óleo sintético, tal como óleo marinho, e lipídios obtidos a partir de leite ou ovos. Os veículos aquosos incluem água, suspensões, emulsões ou soluções alcoólicas/aquosas, incluindo solução salina e meios tamponados. Os transportadores parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, cloreto de sódio e dextrose, Ringer com lactato e óleos fixos. Os transportadores intravenosos incluem repositores de fluido e nutrientes, repositores de eletrólitos (tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer) e similares. Os conservantes e outros aditivos podem estar também presentes, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e similares.

[0119] A composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser formulada na forma de um frasco de dose unitária, frasco de dose múltipla ou seringa pré-carregada. Um veículo farmaceuticamente aceitável para uma formulação líquida inclui solvente, suspensão, emulsão ou óleo aquoso ou não aquoso. À composição pode ser isotônica, hipertônica ou hipotônica. No entanto, é desejável que a composição para infusão ou injeção seja basicamente isotônica. Assim, isotonicidade ou hipertonicidade podem ser vantajosas para o armazenamento da composição. Quando a composição é hipertônica, a composição pode ser diluída para isotonicidade antes da administração. Um agente de tonicidade pode ser um agente de tonicidade iônico, tal como sal, ou um agente de tonicidade não iônico, tal como carboidrato. O agente de tonicidade iônica inclui, porém sem limitação, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de potássio e cloreto de magnésio. O agente de tonicidade não iônica inclui, porém sem limitação, sorbitol e glicerol. De preferência, pelo menos um tampão farmaceuticamente aceitável está incluído. Por exemplo, quando a composição é uma infusão ou injeção, é preferencial que seja formulada num tampão com uma capacidade de tamponamento a pH 4 a pH 10, tal como pH 5a pH 9o0upH6apH8.O tampão pode ser selecionado dentre aqueles adequados para a Farmacopeia dos Estados Unidos (USP). Por exemplo, o tampão pode ser selecionado a partir do grupo que consiste num ácido monobásico, tal como ácido acético, ácido benzoico, ácido glucônico, ácido glicérico e ácido láctico; um ácido dibásico, tal como ácido aconítico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido carbônico, ácido glutâmico, ácido málico, ácido succínico e ácido tartárico; um ácido polibásico, tal como ácido cítrico e ácido fosfórico; e uma base, tal como amônia, dietanolamina, glicina, trietanolamina e TRIS.

[0120] A composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode compreender um agente ativo de superfície. Os exemplos do agente ativo de superfície incluem, porém sem limitação, éster de polioxietileno sorbitano (geralmente denominado Tweens), em particular, polissorbato 20 e polissorbato 80; copolímeros (tais como DOWFAX) de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), óxido de butileno (BO); octoxinóis com diferentes repetições do grupo etoxi(óxi- 1,2-etanodi-ila), em particular, octoxinol-9 (Triton-100); etilfenoxipolietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípido, tal como lecitina; etoxilato de nonilfenol, tal como a série TERGITOL NP; éter graxo de polioxietileno derivado de álcool laurílico, cetílico, estearílico, oleílico (tensoativo Brij), em particular, éter trietilenoglicol monolaurílico (Brij 30); éter de sorbitano conhecido como SPAN, em particular, trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano.

[0121] Misturas de agentes ativos de superfície, tais como Tween 80/Span 85, podem ser usadas. Uma combinação de éster de polioxietileno sorbitano, tal como Tween 80, e octoxinol, tal como Triton X-100, é também adequada. Uma combinação de Laureth 9 e Tween e/ou o octoxinol também é vantajosa. De preferência, a quantidade de éster de polioxietileno sorbitano (tal como Tween 80) incluída pode ser 0,01% a 1% (p/v), 0,01% a 0,1% (p/v), 0,01% a 0,05% (p/v) ou cerca de 0,02%; a quantidade de octilfenóxi polioxietanol ou nonilfenóxi polioxietanol (tal como Triton X-100) incluída pode ser 0,001% a 0,1% (p/v), em particular, 0,005% a 0,02%; e a quantidade de éter de polioxietileno (tal como Laureth 9) incluída pode ser 0,1% a 20% (p/v), possivelmente, 0,1% a 10%, em particular, 0,1% a 1% ou cerca de 0,5%.

[0122] Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser entregue por meio de um sistema de controle de liberação. Por exemplo, infusão intravenosa, emplastro transdérmico, lipossoma ou outras vias podem ser usadas para administração. Num aspecto, macromoléculas, tais como microesfera ou implante, podem ser usadas.

[0123] A descrição acima descreve, de modo geral, a presente invenção. Um entendimento mais completo pode ser obtido em referência aos exemplos específicos a seguir. Estes exemplos são descritos apenas para o propósito de ilustração e não se destinam a limitar o escopo da invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1. PREPARAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS CAPSULARES DE S. PNEUMONIAE

[0124] O cultivro de S. pneumoniae e a purificação de polissacarídeos capsulares foram conduzidos conforme conhecido por um versado na técnica. Os serotipos de S. pneumoniae foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC) (serotipo 1: ATCC nº 6301; serotipo 3: ATCC nº 6303; serotipo 4: ATCC nº 6304; serotipo 5: ATCC nº 6305; serotipo 6A: ATCC nº 6306; serotipo 6B: ATCC nº 6326; serotipo 7F: ATCC nº 10351; serotipo 9N: ATCC nº 6309; serotipo 9V: ATCC nº 10368; serotipo 14: ATCC nº 6314; serotipo 18C: ATCC nº 10356; serotipo 19A: ATCC nº 10357; serotipo 19F: ATCC nº 6319; serotipo 23F: ATCC nº 6323). Cepas internas para os serotipos 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F foram usadas, mas qualquer cepa publicamente disponível pode ser usada. S. pneumoniae foi caracterizada por cápsulas e motilidade, diplococo Gram-positivo, em formato de lanceta e hemólise alfa num meio de ágar-sangue. Os serotipos foram identificados pelo teste de Quelling usando antissoros específicos (Patente nº US 5.847.112).

PREPARAÇÃO DE BANCOS DE CÉLULAS

[0125] Várias gerações de estoques de sementes foram geradas a fim de expandir as cepas e remover componentes de origem animal (gerações F1, F2 e F3). Duas gerações adicionais de estoques de sementes foram produzidas. A primeira geração adicional foi cultivada a partir de um frasco de F3, e a geração subsequente foi cultivada a partir de um frasco da primeira geração adicional. Os frascos de sementes foram armazenados congelados (abaixo de -70ºC) com glicerol sintético como um crioconservante. Para a preparação do banco de células, todas as culturas foram cultivadas em meio à base de soja. Antes do congelamento, as células foram concentradas por centrifugação, o meio gasto foi removido, e os péletes celulares foram ressuspensos num meio fresco contendo um crioconservante (tal como glicerol sintético).

CULTIVO E COLHEITA

[0126] As culturas do banco de células de trabalho foram inoculadas em garrafas de sementes contendo um meio à base de soja e cultivadas. Após a densidade óptica alvo (absorbância) ter sido alcançada, a garrafa de sementes foi usada para inocular um fermentador contendo o meio à base de soja. A cultura foi encerrada quando um valor de densidade óptica começou a ser mantido constante. Após o término da cultura, foi adicionado desoxicolato de sódio à cultura para lisar as células. O conteúdo do fermentador resultante foi resfriado, e a precipitação de proteínas foi induzida. Então, a mistura foi centrifugada para remover as proteínas precipitadas e detritos celulares.

PURIFICAÇÃO

[0127] A solução obtida a partir da centrifugação foi filtrada através de um filtro de profundidade para remover as proteínas e detritos celulares que não precipitaram na centrifugação. O filtrado foi concentrado numa membrana de 100 kDa MW, e o concentrado foi diafiltrado com 10 volumes de um tampão de fosfato de sódio 25 mM (pH 7,2) para obter uma amostra. A amostra foi filtrada para coletar um sobrenadante do qual os polissacarídeos foram precipitados e filtrados. O filtrado foi concentrado numa membrana de 30 kDa, e o concentrado foi diafitrtado usando cerca de 10 volumes de água triplamente destilada. Após realizar a diafiltração, a solução restante foi filtrada através de um filtro de 0,2 um. Um teste de controle em processo foi realizado no filtrado (aparência, proteínas restantes, ácidos nucleicos restantes, endotoxinas, pesos moleculares e a quantidade total de polissacarídeos). O concentrado foi esterilizado por filtração e armazenado a -20ºC. EXEMPLO 2. PREPARAÇÃO DO CONJUGADO DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR S. PNEUMONIAE E PROTEÍNA

VEÍCULOA

[0128] Polissacarídeos de diferentes serotipos foram ativados seguindo diferentes trajetórias e, então, conjugados a uma proteína veículoa, CRM:s7; ou TT. Especificamente, os conjugados foram preparados conjugando-se cada um dos polissacarídeos capsulares de todos os serotipos, exceto 15B e 22F, ao CRM197 e conjugando-se cada um dos polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 3, 5, 15B e 22F ao TT. Dependendo do tamanho do serotipo nativo, o processo de ativação pode incluir a redução do tamanho de cada polissacarídeo capsular para o peso molecular alvo, ativação química e troca de tampão por meio de ultrafiltração. Os conjugados foram purificados usando ultrafiltração e finalmente filtrados através de filtro de 0,2 um. Os parâmetros do processo, tais como pH, temperatura, concentração e tempo, foram conforme segue. (1) PROCESSO DE ATIVAÇÃO ETAPA 1: HIDRÓLISE

[0129] A aminação redutiva é um método conhecido para a conjugação de polímeros em que uma ligação amida é formada entre um grupo amina primária (-NH2) de uma proteína e um aldeído de um sacarídeo. Grupos aldeídos são adicionados ao polissacarídeo capsular pneumocócico para promover a conjugação à proteína veículoa. Uma estrutura de diol vicinal de um monossacarídeo pode ser oxidada por periodato de sódio (NalOs) para formar grupos aldeídos. Os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 3, 4, 6A, 8, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 22F e 33F foram pré-tratados conforme segue.

[0130] No caso do serotipo 1, hidróxido de sódio (a uma concentração final de base de 0,05 M) foi adicionado a uma solução do polissacarídeo capsular, e a solução foi incubada a 50+2ºC. A solução foi, então, resfriada até uma temperatura numa faixa de cerca de 21ºC a cerca de 25ºC, e ácido clorídrico foi adicionado à mesma a um pH final de 6,0+0,1, interrompendo assim a hidrólise.

[0131] No caso do serotipo 3, 8, 11A e 15B, ácido clorídrico (a uma concentração final de ácido de 0,01 M) foi adicionado a uma solução do polissacarídeo capsular, e a solução foi incubada a 60+2ºC. A solução foi, então, resfriada até uma temperatura numa faixa de cerca de 21ºC a cerca de 25ºC, e fosfato de sódio 0,1 M foi adicionado à mesma a um pH final de 6,0+0,1, interrompendo assim a hidrólise.

[0132] No caso do serotipo 4, ácido clorídrico (a uma concentração final de ácido de 0,1 M) foi adicionado a uma solução do polissacarídeo capsular, e a solução foi incubada a 45+2ºC. A solução foi, então, resfriada até uma temperatura numa faixa de cerca de 21ºC a cerca de 25ºC, e fosfato de sódio 1 M foi adicionado à mesma a um pH final de 6,0+0,1, interrompendo assim a hidrólise.

[0133] No caso do serotipo 6A, e ácido acético glacial (a uma concentração final de ácido de 0,1 M) foi adicionado a uma solução do polissacarídeo capsular, e a solução foi incubada a 60+2ºC. A solução foi, então, resfriada até uma temperatura numa faixa de cerca de 21ºC a cerca de 25ºC, e hidróxido de sódio 1 M foi adicionado à mesma a um pH final de 6,0+0,1, interrompendo assim a hidrólise.

[0134] No caso do serotipo 12F, ácido clorídrico (a uma concentração final de ácido de 0,01 M) foi adicionado a uma solução do polissacarídeo capsular, e a solução foi incubada a 70+2ºC. A solução foi, então, resfriada até uma temperatura numa faixa de cerca de 21ºC a cerca de 25ºC, e fosfato de sódio 0,1 M foi adicionado à mesma a um pH final da solução de 6,0+0,1, interrompendo assim a hidrólise.

[0135] No caso dos serotipos 14 e 18C, e ácido acético glacial (a uma concentração final de ácido de 0,2 M) foi adicionado a uma solução do polissacarídeo capsular, e a solução foi incubada a 94+2ºC. À solução foi, então, resfriada até uma temperatura numa faixa de cerca de 21ºC a cerca de 25ºC, e fosfato de sódio 1 M foi adicionado à mesma de modo que um pH final da solução tenha sido 6,0+0,1, interrompendo assim a hidrólise.

[0136] No caso dos serotipos 22F e 33F, ácido clorídrico (a uma concentração final de ácido de 0,01 M) foi adicionado a uma solução do polissacarídeo capsular, e a solução foi incubada a 60+2ºC. A solução foi, então, resfriada até uma temperatura numa faixa de cerca de 21ºC a cerca de 25ºC, e fosfato de sódio 0,1 M foi adicionado à mesma a um pH final de 6,0+0,1, interrompendo assim a hidrólise.

[0137] Cada um dos polissacarídeos capsulares obtidos foi diluído em água para injeção (WFI), acetato de sódio e fosfato de sódio até uma concentração final entre cerca de 1,0 mg/ml e cerca de 2,0 mg/ml. ETAPA 2: REAÇÃO DE PERIODATO

[0138] O equivalente molar de periodato de sódio para cada ativação de sacarídeo pneumocócico foi determinado com base na massa molar de unidade de repetição. Com uma mistura completa, a reação de oxidação foi deixada prosseguir por 16 a 20 horas de 21ºC a 25ºC para todos os serotipos, exceto 1, 7F e 19F, para os quais a temperatura era de 10ºC ou menos. Para ajudar a manter a produção consistente e estável de conjugados, uma faixa de níveis de grau de oxidação (Do) para cada serotipo é alvejada durante o processo de conjugação. Uma faixa alvejada preferencial para os níveis de Do para cada serotipo é mostrada na Tabela 1 e na Tabela 2. TABELA 1. FAIXA DE DO PARA TODOS OS SEROTIPOS A SEREM CONJUGADOS AO CRM:157 TABELA 2. FAIXA DE DO PARA OS SEROTIPOS 1, 3, 5, 15B E 22F

A SEREM CONJUGADOS A TT ssssm| | —— ETAPA 3: ULTRAFILTRAÇÃO

[0139] O sacarídeo oxidado foi concentrado e diafiltrado com WFI num ultrafiltro de 100 kDa MWCO (ultrafiltro de 30 kDa para o serotipo 1 e ultrafiltro de 5 kDa para o serotipo 18C). A diafiltração foi conduzida com o uso de 0,9% de solução de cloreto de sódio para o serotipo 1, tampão de acetato de sódio 0,01 M (pH 4,5) para os serotipos 7F e 23F e tampão de fosfato de sódio 0,01 M (pH 6,0) para o serotipo 19F. O permeado foi descartado, e o retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 um. ETAPA 4: LIOFILIZAÇÃO

[0140] Para os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 4, 5, 8, 9N, 9V, 10A, 14 e 33F que devem ser conjugados a uma proteína veículoa usando um solvente aquoso, uma solução mista de polissacarídeos e proteína veículoa foi preparada sem adição de sacarose adicional, liofilizada e, então, armazenada a -25ºC + 5ºC.

[0141] Para os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1 e 18C que devem ser conjugados a uma proteína veículoa usando um solvente aquoso, polissacarídeos e proteína veículoa foram independentemente preparados sem adição de sacarose adicional, liofiizada e, então, armazenada a -25ºC + 5ºC.

[0142] Para polissacarídeos capsulares dos serotipos 6A, 6B, 7F, 15B-TT, 19A, 19F, 22F-TT e 23F que devem ser conjugados a uma proteína veículoa usando um solvente de DMSO, uma quantidade predeterminada de sacarose para atingir uma concentração final de sacarose de 5% + 3% (p/v) foi adicionada aos sacarídeos ativados, e as amostras foram independentemente preparadas, liofilizadas e, então, armazenadas a -25ºC + 5ºC.

[0143] Para o polissacarídeo capsular do serotipo 11A, uma quantidade predeterminada de sacarose para atingir uma concentração de sacarose final de 20% + 5% (p/v) foi adicionada ao sacarídeo ativado, e os polissacarídeos e a proteína veículoa foram independentemente preparados, liofilizados e, então, armazenados a -25ºC + 5ºC.

[0144] Para o polissacarídeo capsular do serotipo 12F, uma quantidade predeterminada de sacarose para atingir uma concentração de sacarose final de 10 % + 5% (p/v) foi adicionada ao sacarídeo ativado, e os polissacarídeos e a proteína veículoa foram independentemente preparados, liofilizados e, então, armazenados a - 25ºC + 5ºC. (2) PROCESSO DE CONJUGAÇÃO

[0145] A conjugação aquosa foi conduzida para os serotipos 1,3,4, 5, 8, ON, 9V, 10A, 14, 18C e 33F, e a conjugação de DMSO foi conduzida para os serotipos 6A, 6B, 7F, 11A, 12F, 15B-TT, 19A, 19F, 22F-TT e 23F. Cada um dos polissacarídeos capsulares foi conjugado a uma proteína veículoa a uma razão de 0,2 a 2:1. ETAPA 1: DISSOLUÇÃO

CONJUGAÇÃO AQUOSA

[0146] Para os serotipos 1, 3, 4, 5, 8, 9N, 9V, 10A, 14, 18C, e 33F, a amostra liofilizada foi descongelada e equilibrada à temperatura ambiente. A amostra liofilizada foi reconstituída a uma concentração de reação usando uma solução de tampão de fosfato de sódio a 23+2ºC a uma razão definida para cada serotipo. CONJUGAÇÃO DE DIMETIL SULFÓXIDO (DMSO)

[0147] Para os serotipos 6A, 6B, 7F, 11A, 12F, 15B-TT, 19A, 19F, 22F-TT e 23F, a amostra liofilizada foi descongelada, equilibrada à temperatura ambiente e reconstituída em DMSO. ETAPA 2: REAÇÃO DE CONJUGAÇÃO

CONJUGAÇÃO AQUOSA

[0148] Para os serotipos 3-TT, 4, 5-TT, 8, ON, 9V, 10A, 14, 18C e 33F, a reação de conjugação foi iniciada adicionando-se a solução de cianoboroidreto de sódio (100 mg/ml) a 1,0 a 1,4 mol de cianoboroidreto de sódio por mol de sacarídeo. No entanto, para os serotipos 1, 1-TT e 3, a reação foi iniciada adicionando-se solução de cianoboroidreto de sódio a 0,5 mol de cianoboroidreto de sódio por mol de sacarídeo.

[0149] A mistura de reação foi incubada a 23ºC a 37ºC por 4 a 106 horas. A temperatura e o tempo de reação foram ajustados por serotipo. A temperatura foi, então, reduzida para 23+2ºC, e cloreto de sódio 0,9% foi adicionado ao reator. Solução de boroidreto de sódio (100 mg/ml) foi adicionada para alcançar 1,8 a 2,2 equivalentes molares de boroidreto de sódio por mol de sacarídeo. A mistura foi incubada a 23+2ºC por 3 a 6 horas. Este procedimento reduziu quaisquer aldeídos não reagidos presentes nos sacarídeos. Então, a mistura foi diluída com cloreto de sódio 0,9%, e a mistura de conjugação diluída foi filtrada usando um pré-filtro de 0,8 ou 0,45 um.

CONJUGAÇÃO DE DMSO

[0150] Para os polissacarídeos capsulares dos serotipos 6A, 6B, TF, 11A, 12F, 15B-TT, 19A, 19F, 22F-TT e 23F, a reação de conjugação foi iniciada adicionando-se a solução de cianoboroidreto de sódio (100 mg/ml) a uma razão de 0,8 a 1,2 equivalente molar de cianoboroidreto de sódio por um mol de sacarídeo ativado. WFI foi adicionada à mistura de reação até uma concentração alvo de 1% (v/v), e a mistura foi incubada por 12 a 26 horas a 23+2ºC. 100 mg/ml de uma solução de boroidreto de sódio (tipicamente 1,8 a 2,2 equivalentes molares de boroidreto de sódio por mol de sacarídeo ativado) e WFI (alvo 5% em v/v) foram adicionados à reação, e a mistura foi incubada por 3 a 6 horas a 23+2ºC. Este procedimento reduziu quaisquer aldeídos não reagidos presentes nos sacarídeos. Então, a mistura de reação foi diluída com cloreto de sódio 0,9%, e a mistura de conjugação diluída foi filtrada usando um pré-filtro de 0,8 ou 0,45 um. ETAPA 3: ULTRAFILTRAÇÃO

[0151] A mistura de conjugado diluída foi concentrada e diafiltrada num filtro de ultrafittação de 100 kKDa MWCO ou num filtro de ultrafiltração de 300 kKDa MWCO com um mínimo de 15 volumes de cloreto de sódio 0,9% ou tampão. Também, a composição e o pH do tampão usado no processo variaram dependendo de cada um dos serotipos. ETAPA 4: ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO

[0152] O retentado após a ultrafiltração foi esterilizado por filtração (0,2 um), e controles em processo (aparência, proteína livre, sacarídeo livre, distribuição de tamanho molecular, esterilidade, teor de sacarídeo, teor de proteína, pH, endotoxina, cianeto residual, DMSO residual, identidade de sacarídeo, identidade de TT e identidade de CRM+197) foram realizados nos conjugados filtrados. O concentrado final foi refrigerado e armazenado a 2ºC a 8ºC. EXEMPLO 3. FORMULAÇÃO DA VACINA PNEUMOCÓCICA

CONJUGADA MULTIVALENTE

[0153] Os volumes desejados de concentrados a granel finais obtidos a partir do Exemplo 2 foram calculados com base no volume de batelada e nas concentrações a granel de sacarídeos. Após cloreto de sódio 0,85% (solução salina fisiológica), polissorbato 80 e tampão de succinato terem sido adicionados ao vaso de formulação pré- identificado, foram adicionados concentrados a granel. A preparação foi, então, completamente misturada e esterilizada por filtração através de uma membrana de 0,2 um. O volume formulado foi gentilmente misturado durante e após a adição de fosfato de alumínio a granel. O pH foi verificado e ajustado, se necessário. O produto a granel formulado foi armazenado a 2 a 8ºC. As seguintes formulações de vacinas pneumocócicas conjugadas multivalentes não limitantes foram preparadas e nomeadas PCV21(1/5/15B/22F)-TT e PCV21(3/5/15B/22F)-TT:

[0154] PCV21(1/5/15B/22F)-TT incluiu conjugados de polissacarídeos preparados conjugando-se cada polissacarídeo dos serotipos 1, 5, 15B e 22F a TT e cada polissacarídeo dos serotipos 3,4,

6A, 6B, 7F, 8, ON, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 23F e 33F a CRM197; e

[0155] PCV21(3/5/15B/22F)-TT incluiu conjugados de polissacarídeos preparados conjugando-se cada polissacarídeo dos serotipos 3, 5, 15B e 22F a TT e cada polissacarídeo dos serotipos 1,4, 6A, 6B, 7F, 8, ON, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 23F e 33F a CRM197.

[0156] A composição de PCV21(1/5/15B/22F)-TT numa dose total de 0,5 ml incluiu 2,2 ug de cada polissacarídeo, exceto o serotipo 6B em 4,4 ug; 2 ug a 25 ug de TT (para os serotipos 1, 5, 15B e 22F) e 40 ug a 75 ug de CRM197, 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alumínio); 4,25 mg de cloreto de sódio; cerca de 295 ug de uma solução de tampão de succinato; e cerca de 100 ug de polissorbato 80 no total de 0,5 ml de dose.

[0157] A composição de PCV21(3/5/15B/22F)-TT numa dose total de 0,5 ml incluiu 2,2 ug de cada polissacarídeo, exceto pelos serotipos 1,3, 6B, 19A e 19F em 4,4 ug; 2 ug a 25 ug de TT (para os serotipos 3, 5, 15B e 22F), 0,250 mg de alumínio elementar (1,13 mg de fosfato de alumínio), com os outros componentes e conteúdo idêntico àquele de PCV21(1/5/15B/22F)-TT. EXEMPLO 4. IMUNOGENICIDADE DA VACINA PNEUMOCÓCICA

CONJUGADA MULTIVALENTE

[0158] As vacinas pneumocócicas multivalentes de veículo misto, PCV21(1/5/15B/22F)-TT e PCV21(3/5/15B/22F)-TT preparadas no Exemplo 3, foram testadas quanto à capacidade para induzir uma resposta imunogênica em coelhos. A avaliação de imunogenicidade foi realizada por ELISA específico para antígeno para concentrações séricas de IgG e por ensaio opsonofagocítico (OPA) para a funcionalidade do anticorpo. Coelhos brancos da Nova Zelândia foram imunizados por via intramuscular na semana O e na semana 2 com uma dose de 5% maior do que a dose clínica humana planejada de cada polissacarídeo (2,31 ug de cada polissacarídeo, exceto 6B a 4,62 ug) na formulação ou a dose humana (2,2 ug de cada polissacarídeo, exceto 6B a 4,4 ug). Os soros foram amostrados a cada 2 semanas após a imunização. Ambas as concentrações mostraram os mesmos resultados.

[0159] 4-1. POV21(3/5/15B/22F)-TT

MEDIÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE IGG ESPECÍFICA PARA SEROTIPO

[0160] Polissacarídeos capsulares (PnPs) para cada serotipo foram revestidos numa placa de 96 poços a 0,5 ug/poço a 1 ug/poço. Uma quantidade equivalente de soro foi amostrada de cada sujeito e foi agrupada por grupo. O agrupamento de soro foi serialmente diluído 2,5 vezes com um tampão de diluição de anticorpo que compreende Tween e polissacarídeo pneumocócico da parede celular (CWPS) obtido a partir do Statens Serum Institut (5 ug/ml) e, então, reagido à temperatura ambiente por 30 minutos. A placa foi lavada 5 vezes com um tampão de lavagem e, então, soro pré-adsorvido e diluído 50 ul foi adicionado à placa de poço revestido, seguido pela incubação à temperatura ambiente por 2 horas a 18 horas. A placa de poço foi lavada da mesma maneira e, então, conjugados de IgG de anticoelho de cabra-fosfatase alcalina foram adicionados a cada poço, seguido pela incubação à temperatura ambiente por 2 horas. As placas foram lavadas conforme descrito acima, e 1 mg/ml de tampão de p-nitrofenilamina como substrato foi adicionado a cada poço e, então, reagido à temperatura ambiente por 2 horas. A reação foi bruscamente arrefecida adicionando- se 50 ul de NaOH 3 M, e as absorbâncias a 405 nm e 690 nm foram medidas. Como um exemplo comparativo, a vacina 13-valente comercialmente disponível (PREVNAR13) foi submetida ao mesmo procedimento. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

TABELA 3. CONCENTRAÇÃO DE IGG (U/ML) PARA 21 SEROTIPOS EM 2 SEMANAS APÓS A IMUNIZAÇÃO SECUNDÁRIA

[0161] Quando os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3 e 5 foram conjugados ao TT, a concentração de IgG específica para serotipo aumentou significativamente em comparação a esta obtida quando os mesmos foram conjugados ao CRM197. Coelhos imunizados com PCV21(3/5/15B/22F)TT também demonstraram aumentos significativos na concentração de IgG contra os oito serotipos adicionais não presentes em PREVNAR13 (isto é, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F). O serotipo 9N, em particular, teve um aumento maior do que 50 vezes na concentração sérica de IgG específica em relação ao PREVNAR13.

TESTE DE IMUNOGENICIDADE FUNCIONAL (MOPA)

[0162] As funções de anticorpo foram avaliadas testando-se o soro num ensaio MOPA. A cepa de MOPA de S. pneumoniae armazenada a -70ºC ou menos foi diluída à vez de diluição final correspondente, de modo que uma concentração de cada cepa tenha sido cerca de 50000 CFU/ml. Uma quantidade equivalente de soro foi amostrada de cada indivíduo, agrupada por grupo e diluída em série 2 vezes de modo que ul de soro permanecessem numa placa de fundo em U. Após a diluição da amostra, 10 ul da cepa preparada para cada serotipo foram misturados com a amostra diluída, e a mistura foi deixada reagir à temperatura ambiente por 30 minutos de modo que S. pneumoniae e o anticorpo fossem bem misturados. Uma mistura de células HL-60 pré- diferenciadas e complemento foi adicionada e reagida numa incubadora de CO>z (37ºC) por 45 minutos. A temperatura foi reduzida para interromper a fagocitose, e 10 ul da solução da reação foram pintados a uma placa de ágar pré-seca por 30 a 60 minutos e, então, deixados serem absorvidos na placa por 20 minutos até secarem. Uma solução de estoque de TTC de 25 mg/ml foi adicionada a um ágar de sobreposição preparado, e um anticorpo apropriado para a cepa correspondente foi adicionado ao mesmo. A mistura foi completamente misturada e, então, cerca de 25 ml da mistura foram adicionados à placa e endurecidos por cerca de 30 minutos. A placa completamente endurecida foi incubada numa incubadora de CO? (37ºC) por 12 a 18 horas e, então, as colônias foram contadas. O título de MOPA foi expresso como uma taxa de diluição na qual 50% de extermínios foram observados. Como um exemplo comparativo, a vacina 13-valente comercialmente disponível (PREVNAR13) foi submetida ao mesmo procedimento. Os resultados são mostrados na Tabela 4. TABELA 4. TÍTULOS DE MOPA PARA 21 SEROTIPOS EM 2

SEMANAS APÓS A IMUNIZAÇÃO SECUNDÁRIA Serotipo PREVNAR13 a O o 8 Nato | 6 == |

[0163] Quando os serotipos 3 e 5 foram conjugados ao TT, títulos de MOPA funcionais aumentaram significativamente em comparação aos títulos de MOPA obtidos quando os mesmos foram conjugados ao CRM:167. Coelhos imunizados com PCV21(3/5/15B/22F)-TT também demonstraram aumentos significativos em títulos de MOPA funcionais contra cada um dos oito serotipos adicionais que não estão presentes em PREVNAR13 (isto é, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F).

[0164] 4-2. POV21(1/5/15B/22F)- TT

[0165] A concentração de IgG específica para serotipo e o título de imunogenicidade funcional foram medidos da mesma maneira que em 4-1, e os resultados de dois experimentos separados são mostrados a seguir.

MEDIÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE IGG ESPECÍFICA PARA

SEROTIPO TABELA 5. CONCENTRAÇÃO de IgG (U/ml) PARA 21 SEROTIPOS EM 2 SEMANAS APÓS A IMUNIZAÇÃO SECUNDÁRIA PCV21(1/5/15B/22F)- | PREVNA | PCV21(1/5/15B/22F)- R13 TT R13 TT 46202,4 14208,3 28405,2 34321,1 8965,5 7658,8 3042941 3824,7 207073,2

PCV21(1/5/15B/22F)- | PREVNA OO R13 TT R13 TT 43766,3 163,9 49047,9 158798,8 62963,5 95617,7 10104,6 5835,1 4128,6

[0166] Quando os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1 e 5 foram conjugados ao TT, a concentração de IgG específica para serotipo aumentou significativamente em comparação a esta obtida quando os mesmos foram conjugados ao CRM197. Coelhos imunizados com PCV21(1/5/15B/22F)-TT também demonstraram aumentos significativos na concentração de IgG contra os oito serotipos adicionais não presentes em PREVNAR13 (isto é, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F). Novamente, o serotipo 9N mostrou um aumento significativo (maior do que 50 vezes) em relação ao PRENAR13. TESTE DE IMUNOGENICIDADE FUNCIONAL (MOPA) TABELA 6. TÍTULOS DE MOPA PARA 21 SEROTIPOS EM 2

[0167] Quando os serotipos 1 e 5 foram conjugados ao TT, títulos de MOPA funcionais aumentaram significativamente em comparação aos títulos de MOPA obtidos quando os mesmos foram conjugados ao CRM:1697. Coelhos imunizados com PCV21(3/5/15B/22F)-TT também demonstraram aumentos significativos em títulos de MOPA funcionais contra cada um dos oito serotipos adicionais que não estão presentes em PREVNAR13 (isto é, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F). EXEMPLO 5. DETALHES ADICIONAIS SOBRE A PREPARAÇÃO DO CONJUGADO SACARÍDEO-PROTEÍNA DE STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE SEROTIPO 9N

PREPARAÇÃO DE BANCO DE CÉLULAS

[0168] Streptococcus pneumoniae serotipo 9N (ATCC 6309) foi adquirido a partir da American Type Culture Collection (ATCC). Para a proliferação da cepa e remoção de constituintes de origem animal, o estoque de sementes foi cultivado por várias gerações. O frasco de estoque foi mantido num refrigerador (< -70ºC) juntamente com glicerol sintético como um crioprotetor. Para a preparação de um banco de células, a cultura celular foi proliferada num meio à base de soja. Antes do congelamento, as células foram concentradas por centrifugação e, após a remoção do meio usado, os péletes celulares foram ressuspensos num meio fresco contendo um crioprotetor (por exemplo, glicerol sintético).

FERMENTAÇÃO

[0169] A cultura do banco de células foi inoculada numa garrafa de sementes contendo um meio à base de soja. Até que a condição de crescimento tenha sido satisfeita, a cultura foi incubada à temperatura constante sem agitação. A cultura foi inoculada num fermentador de sementes contendo um meio à base de soja, com temperatura, pH e velocidade de agitação controlados, usando uma garrafa de sementes. A fermentação terminou após o crescimento ter sido interrompido ou a capacidade de trabalho do fermentador ter sido atingida. Após o término da fermentação pela adição de um desativador, os detritos celulares foram removidos usando uma combinação de filtração e centrifugação de fluxo contínuo.

PURIFICAÇÃO

[0170] O processo de purificação de polissacarídeo pneumocócico consistiu em filtração multicamada, concentração/diafilttação e filtração/eluição repetidas.

ATIVAÇÃO

[0171] A concentração final de polissacarídeo foi ajustada a cerca de 2,0 g/l adicionando-se sequencialmente WFI de uma quantidade calculada. Se necessário, o pH da reação foi ajustado a aproximadamente 6,0. Após o ajuste de pH, a temperatura de reação foi ajustada a 21 a 25ºC. Aproximadamente 0,024 a 0,189 mg de periodato de sódio foi adicionado por 1 mg de açúcar para iniciar a oxidação. À reação de oxidação foi conduzida por 16 a 20 horas a 21 a 25ºC.

[0172] O polissacarídeo ativado foi concentrado e diafiltrado usando uma membrana de ultrafiltração de 100 kDa MWCO. A diafiltração foi conduzida para WFI de 10 vezes o volume do volume de diafiltração. Então, o polissacarídeo ativado purificado foi armazenado a 2a 8 ºC. O sacarídeo ativado purificado foi caracterizado (i) pela concentração de sacarídeo determinada por ensaio colorimétrico, (ii) pela concentração de aldeído determinada por ensaio colorimétrico, (iii) pelo grau de oxidação e (iv) pelo peso molecular medido por SEC-MALLS.

[0173] SEC-MALLS é usado para determinar o peso molecular de polissacarídeos e conjugados de polissacarídeo-proteína. SEC é usado para separar o polissacarídeo com base no volume hidrodinâmico. Um detector de índice de refração (RI) e um detector de dispersão de luz laser de múltiplos ângulos (MALLS) são usados para determinar o peso molecular. Quando a luz reage com um material, a luz é dispersa. À quantidade de luz dispersa está relacionada à concentração, o quadrado de dn/dc (incremento de índice de refração específico) e a massa molar do material. O peso molecular é calculado com base no sinal da luz dispersa do detector de MALLS e no sinal de concentração do detector de RI.

[0174] O grau de oxidação (DO) do polissacarídeo ativado é determinado como o mol de unidades de repetição de açúcar dividido pelo mol de aldeído. O mol de unidades de repetição de açúcar é determinado por várias técnicas colorimétricas, por exemplo, usando o ensaio de antrona. E o mol de aldeído é determinado pelo ensaio colorimétrico de Park-Johnson.

[0175] Usando estas técnicas descritas acima, foi determinado que o polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N ativado obtido pelo método descrito acima tem um grau de oxidação de 2 a 19, mais tipicamente, 5 a 10 e um peso molecular de cerca de 200 a 700 kDa.

CONJUGAÇÃO

[0176] O polissacarídeo ativado foi mesclado com a proteína veículoa CRM197, a uma razão de 0,5 a 2 g de CRM:197 por 1 g do polissacarídeo ativado. Então, a mistura mesclada foi liofiizada. À mistura liofilizada do polissacarídeo ativado e CRM197 foi armazenada a -20ºC.

[0177] A mistura liofilizada do polissacarídeo ativado e CRM197 foi reconstituída numa solução de fosfato de sódio 0,1 M e, então, misturada o suficiente. A concentração final de polissacarídeo na solução da reação foi de cerca de 10 a 20 g/l. Após o início da conjugação pela adição de 1,0 a 1,2 equivalente molar de cianoboroidreto de sódio (NaBH3;CN) à mistura de reação, a reação foi conduzida a 35 a 39ºC por 44 a 52 horas. A reação de conjugação foi terminada adicionando-se uma solução de cloreto de sódio 0,9% do mesmo volume que a solução de reação de conjugação e, então, adicionando-se 1,8 a 2,2 equivalentes molares de boroidreto de sódio (NaBH) para submeter a capeamento o aldeído não reagido. A reação de capeamento foi conduzida a 21 a 25ºC por 3 a 6 horas.

[0178] A solução de conjugado foi diluída com uma solução de cloreto de sódio 0,9% para concentração e diafiltração usando uma membrana de 100 kDa MWCO. A solução de conjugado diluída foi filtrada através de um filto de 0,8 a 045 um e purificada por concentração e diafiltração. A diafiltração que usa uma membrana de 100 kDa MWCO foi conduzida usando uma solução de cloreto de sódio 0,9% de 15 a 40 vezes o volume de diafiltração. Após a diafiltração ter sido concluída, a solução restante foi filtrada através de um filtro de 0,2 um. A solução de conjugado foi diluída a uma concentração abaixo de aproximadamente 0,55 mg/ml, esterilizada por filtração e, então, armazenada a 2 a 8ºC.

[0179] O conjugado de serotipo 9N purificado foi caracterizado, em particular, (i) pela concentração de proteína determinada pelo ensaio colorimétrico (Lowry), (ii) pela concentração de aldeído determinada pelo ensaio colorimétrico, (iii) pela razão entre sacarídeo e proteína, (iv) pela distribuição de tamanho molecular determinada por cromatografia de exclusão de tamanho (CL-4B) e (v) pelo peso molecular medido por SEC-MALLS.

[0180] A alteração nas características do conjugado de serotipo 9N foi observada ao variar o grau de oxidação (DO). O resultado é resumido na Tabela 7. TABELA 7 panes osso — Ta [2 3 [4] Peso molecular de polissacarídeo o mento = | em solição de reação de 20,0 conjugação, g/I púnens sets — + 2 [5 [15 [5 Razão entre sacarídeo e proteína % de distribuição de peso

[0181] A alteração nas características do conjugado de serotipo 9N foi observada ao variar a razão de mesclagem do polissacarídeo ativado e CRM97 durante a liofilização. O resultado é resumido na Tabela 8. TABELA 8 pano cocomento — [7 [e [sm |) ativado, kDa EESTTETO = 0. | em solição de reação de 20,0 conjugação, g/I prconamenacameã — as [ue [e |)

[0182] A alteração nas características do conjugado de serotipo 9N foi observada ao variar a concentração de polissacarídeo na solução de reação de conjugação. O resultado é resumido na Tabela 9. TABELA 9

COLLCEESEZEIEILIE ativado, kDa DO 6,1 Concentração de polissacarídeos em solução de reação de, 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 store sacas pata 19 | 18 [ 055 | om | om % de distribuição de peso Peso molecular do conjugado, EXEMPLO 6. ANÁLISE DE IMUNOGENICIDADE

[0183] Uma composição de conjugado monovalente contendo o conjugado sacarídeo-proteína de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N conjugado a CRM 197 foi formulada.

[0184] A imunogenicidade das composições imunogênicas monovalentes das Tabelas 11 a 13 foi analisada por ELISA. A concentração sérica da IgG específica para serotipo foi determinada.

[0185] Cinco coelhos brancos fêmeas da Nova Zelândia pesando 2,5 a 3,5 kg foram imunizados com a dose clínica humana proposta (conjugado 2,2 ug; + 0,25 mg/ml de alumínio como AIPOs) em O semana por meio de uma via intramuscular. Os coelhos foram imunizados novamente na semana 2 com a vacina conjugada da mesma dose, e amostras sanguíneas foram coletadas na semana 4. ELISA específico para serotipo foi conduzido para amostras de soro na semana O e na semana 4.

[0186] O resultado de análise é mostrado na Tabela 10. Os coelhos imunizados com a composição de conjugado monovalente (conjugado número 8) mostraram aumento significativo no título total de IgG para o serotipo 9N. Os coelhos imunizados com outros conjugados também mostraram aumento significativo no título total de IgG.

[0187] A Tabela 10 mostra um resultado da medição da concentração de IgG após a imunização dos coelhos com o conjugado número 8 da Tabela 8. TABELA 10 o] semen Ca [em | ses

[0188] Embora uma ou mais modalidades exemplificativas tenham sido descritas no relatório descritivo, será compreendido pelos indivíduos de habilidade comum na técnica que várias alterações na forma e nos detalhes podem ser realizadas às mesmas sem que se afaste do espírito e do escopo do conceito inventivo conforme definido pelas reivindicações a seguir.

REFERÊNCIAS

[0189] As referências a seguir são citadas no pedido e fornecem informações gerais sobre o campo da técnica e fornecem ensaios e outros detalhes discutidos no pedido. As referências a seguir são incorporadas ao presente documento a título de referência em suas totalidades.

[0190] [1] Prymula et al., The Lancet, 367:740-48 (2006).

[0191] [2] Vesikari et al., PIDJ, 28(4):S866-76 (2009).

[0192] [3] Dagan et al., Infection & Immunity, 5383-91 (2004).

[0193] [4] Juergens et al., Clinical and Vaccine Immunology, 21(9):

1277-1281 (2014).

[0194] [5] Andrews et al., The Lancet, 14:839-846 (2014).

[0195] [6] Nurkka et al., Vaccine, 20:194-201 (2001).

[0196] [7] Levin e Stone, J. Immunol., 67:235-242 (1951).

[0197] [8] W.H.O. Manual for the Production and Control of Vaccines: Tetanus Toxoid, 1977 (BLG/UNDP/77.2 Rev.l.)

[0198] [9] Didierlaurent et al., J. Immunol., 183:6186-6197 (2009).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, caracterizada pelo fato de que compreende 21 conjugados de polissacarídeo capsular-proteina pneumocócicos diferentes, em que cada conjugado de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócico compreende um veículo de proteína conjugado a um polissacarídeo capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae, em que os serotipos de Streptococcus pneumoniae são selecionados dentre 1, 3, 4, 5, GA, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, em que o veículo de proteína é CRM+197 ou toxoide tetânico, e em que quatro dos polissacarídeos capsulares são conjugados ao toxoide tetânico e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados a CRM+197, em que os quatro polissacarídeos capsulares que são conjugados ao toxoide tetânico são serotipos 15B, 22F e dois serotipos selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1,3 e5.

2. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 5, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 23F e 33F são conjugados a CRM 197.

3. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 3, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 23F e 33F são conjugados a CRM 197.

4. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 5, 15B e 22F são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 23F e 33F são conjugados a CRM 197.

5. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.

6. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um adjuvante à base de alumínio.

7. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

8. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é fosfato de alumínio.

9. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que: o polissacarídeo capsular do serotipo 9N é conjugado ao CRM197 num estado em que o polissacarídeo capsular do serotipo 9N é ativado para ter um grau de oxidação de 2 a 19 ou 5a 10 e um peso molecular de 200 a 700 kDa; o conjugado formado entre o polissacarídeo capsular do serotipo 9N e CRM197 tem um peso molecular de 500 a 4000 kDa; uma razão entre o polissacarídeo capsular do serotipo 9N e

CRM197 no conjugado formado entre o polissacarídeo capsular do serotipo 9N e CRM197 é 0,5 a 2,5 (p/p); e/ou a 60% do conjugado formado entre o polissacarídeo capsular do serotipo 9N e CRM197 tem uma Ka de 0,3 ou menos numa coluna CL-4B.

10. Uso da composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que se destina à profilaxia contra infecção ou doença por Streptococcus pneumoniae num sujeito.

11. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

12. Método para profilaxia da infecção ou doença por Streptococcus pneumoniae num sujeito, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar uma quantidade profilaticamente eficaz da composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou a vacina, como definida na reivindicação 11, ao sujeito.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano que tem pelo menos 50 anos de idade, e a doença é pneumonia ou doença pneumocócica invasiva (IPD).

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano que tem pelo menos 6 semanas de idade, e a doença é pneumonia, doença pneumocócica invasiva (IPD) ou otite média aguda (AOM).

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem 6 semanas a 5 anos de idade, 2 a 15 meses de idade ou 6 a 17 anos de idade.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 10, ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato de que a composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto ou a vacina é administrada por injeção intramuscular.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo fato de que a composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto ou a vacina é administrada como parte de uma série de imunizações.