JP2022513458A - Ｏ－結合型グリコシル化のための修飾キャリアタンパク質 - Google Patents

Ｏ－結合型グリコシル化のための修飾キャリアタンパク質 Download PDF

Info

Publication number
JP2022513458A
JP2022513458A JP2021533480A JP2021533480A JP2022513458A JP 2022513458 A JP2022513458 A JP 2022513458A JP 2021533480 A JP2021533480 A JP 2021533480A JP 2021533480 A JP2021533480 A JP 2021533480A JP 2022513458 A JP2022513458 A JP 2022513458A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
pgll
seq
neisseria
carrier protein
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021533480A
Other languages
English (en)
Inventor
フォラドール，ライナー
ヨッヘン ケムラー，シュテファン
トーマス コヴァリク，ミカエル
ヨハン ポッシュ，ゲラルト
Original Assignee
グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム filed Critical グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム
Publication of JP2022513458A publication Critical patent/JP2022513458A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0283—Shigella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

1つ以上のピリンGlycoTagを組み込むように修飾されたキャリアタンパク質、及びO-結合型グリコシル化のためのその利用が提供される。特に、少なくとも1つのGlycoTagを含むキャリアタンパク質を含む修飾キャリアタンパク質であって、上記少なくとも1つのGlycoTagが、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL GlycoTag(NgGlycoTag)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)PglL GlycoTag(NlGlycoTag)、若しくは、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)GlycoTag(NsGlycoTag)、又はそれらの組み合わせである上記修飾キャリアタンパク質が、上記修飾キャリアタンパク質をコードする核酸及びベクター、これらの修飾キャリアタンパク質又はそれらをコードする核酸を含む宿主細胞、バイオコンジュゲート、バイオコンジュゲートの作製方法及びバイオコンジュゲートの使用と共に提供される。【選択図】 なし

Description

配列表の参照
本出願は、ASCIIテキストファイルフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
発明の分野
本発明の分野は、一般的に、1つ以上のGlycoTag(糖タグ)を含む修飾キャリアタンパク質、及びかかる修飾キャリアタンパク質の、例えばPgILを用いた、効率的なO-結合型グリコシル化における使用に関する。
タンパク質グリコシル化は、細菌における一般的な翻訳後修飾であり、これによりグリカンが、例えば、表面タンパク質、鞭毛、又は線毛に共有結合する[1]。糖タンパク質は、付着、タンパク質分解に対するタンパク質の安定化、及び宿主免疫応答の回避に関与する[1]。2つのタンパク質グリコシル化機構は、グリカンがタンパク質に転移する様式によって区別される。1つの機構は、ヌクレオチド活性化糖から受容体タンパク質への糖(carbohydrate)の直接転移(例えば、真核細胞のゴルジ体におけるタンパク質O-グリコシル化及び一部の細菌におけるフラジェリンO-グリコシル化において用いられる)を含む。第2の機構は、脂質キャリア上への多糖の事前構築(preassembly)(グリコシルトランスフェラーゼによる)を含み、この多糖がその後、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)によりタンパク質受容体に転移される[1]。この第2の機構は、例えば、真核細胞の小胞体におけるN-グリコシル化(ジェジュニ菌(カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni))の十分に特徴づけられたN-結合型グリコシル化系)、及びより最近特徴づけられた、髄膜炎菌(ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis))、ナイセリア・ゴノコッカス(Neisseria gonococcus)、及び緑膿菌(シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))のO-結合型グリコシル化系において用いられる[1]。O-結合型グリコシル化(O-グリコシル化)に関しては、グリカンは、一般的に、タンパク質受容体上のセリン残基又はスレオニン残基に結合する。N-結合型グリコシル化(N-グリコシル化)に関しては、グリカンは、一般的に、タンパク質受容体上のアスパラギン残基に結合する。一般的には、[2]を参照のこと。
2つの最もよく理解されているグリコシル化系は、C.ジェジュニ(C. jejuni)のN-結合型グリコシル化系及びナイセリア属のO-結合型グリコシル化系である。[1]、[3]。これらの2つの系においては、ウンデカプレニルピロリン酸(UndPP)脂質キャリアに結合している多糖(グリカン供与体)が、フリッパーゼによりペリプラズムに移行される(フリップされる)。[2]、[3]。ペリプラズム中では、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)が、グリカンをタンパク質受容体(ピリン)に転移させる[2]、[3]。C.ジェジュニ(C. jejuni)のOTase(PglB)は、グリカンを、保存されたピリンペンタペプチドモチーフD/E-X1-N-X2-S/T(ここでX1及びX2は、プロリンを除く任意の残基である)中のアスパラギン(N)に転移させる。[4]。N.メニンギティディス(N. meningitidis))のOTase(NmPglL)は、グリカンを、N.メニンギティディス(N. meningitidis)のピリンPilE配列(「シークオン」)(N)-SAVTEYYLNHGEWPGNNTSAGVATSSEIK-(C)(配列番号140、成熟N.メニンギティディス(N. meningitidis)のPilE配列である配列番号137の残基45～73に対応する)中のSer63に転移させる。[1]、[3]、[5]。本開示までは、他のOTase(例えば淋菌(N.ゴノレア(N. gonorrhoeae))、N.ラクタミカ(N. lactamica)又は、N.シャエガニ(N. shayeganii)由来のOTase)がその上にグリカンを転移させるピリン配列は、知られていなかった([6]を参照のこと)。
コンジュゲートワクチン(免疫原性グリカンに共有結合しているキャリアタンパク質を含む)は、様々な細菌性感染症に対するワクチン接種についての成功したアプローチであった。しかし、これらのコンジュゲートワクチンがそれにより日常的に製造される化学的方法は複雑であり、比較的非効率である([4]の図1)。コンジュゲートワクチンの製造効率を高めるため、in vivo法(従って「バイオコンジュゲートワクチン」)が開発されている。これらのin vivo法は、上記のN-グリコシル化系及びO-グリコシル化系、特にOTaseシークオンを利用し、その結果、これらを利用しない場合にはOTaseによりグリコシル化されないタンパク質(キャリアタンパク質)が、in vivoでグリコシル化される。
例えば、キャリアタンパク質AcrA及びEPAは、大腸菌(E. coli)中で、グリカン供与体としての異種多糖及びC.ジェジュニ(C. jejuni)PglBを用いてN-グリコシル化されたが、これは、AcrA及びEPAが最初に、適切なペリプラズムシグナル配列及び少なくとも1コピーのPglBシークオン配列D/E-X1-N-X2-S/T(「GlycoTag」)を組み込むように修飾されたからである。[4]；[7]、[8]、[9]、[10]、[11]も参照されたい(これらは全てその全体が参照により本明細書中に組み込まれる)。PglBベースのバイオコンジュゲーション製造の使用は、PglBが以下の特定の糖基質：還元末端のC-2位にアセトアミド基を含む糖基質、及び最初の2つの糖の間にβ-1,4結合(すなわち、「S-2」糖と「S-1」糖との間の結合、第1の糖(S-1)は還元末端を含み、S-2は、S-1に隣接している)を有さない糖基質しか受容しないため、制限されている。[3]、[12]、[13]。
このPglBベースの系の制限を克服するため、またナイセリア属のPglLが糖基質に関して「無差別(promiscuous)」であるため([3])、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis))由来のPglL OTaseを用いたO-グリコシル化系が最近の研究の焦点となっている([1]、[14]、[15]、[16]；[6]も参照)。
例えば、キャリアタンパク質EPA、TTc、及びCTBは、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)において、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglLにより、グリカン供与体としてシゲラ・フレックスネリ宿主細胞に内在していた多糖(「内在性多糖」)を用いてO-グリコシル化されたが、これは各キャリアタンパク質が、ペリプラズムシグナル配列及び1コピーのN.メニンギティディス(N. meningitidis)PilEシークオン配列：
(N)-SAVTEYYLNHGEWPGNNTSAGVATSSEIK-(C) (配列番号140)
を組み込むように修飾されたからである(EPA及びTTcはそれらのN末端で修飾され、CTBはC末端で修飾された)。[3]。またこれらの修飾されたEPAキャリアタンパク質及びCTBキャリアタンパク質について、大腸菌及びサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)中においても、NmPglL及び内在性多糖を用いてO-グリコシル化が達成された。[3]。より小さなNmGlycoTag(全て配列番号140の配列のフラグメント)も示され、最も小さいものは長さ12アミノ酸であった(それに2つの親水性フラグメントが隣接していた場合、首尾よく使用された)([3]の6)。
しかし、その先行のPglLと同様に、このNmPglLの機能の適用可能性は、少なくとも、NmPilEシークオン配列と組み合わせたNmPglLによるO-グリコシル化しか示されておらず、またこの系がキャリアタンパク質としてのCTBに対して不適切な(unfortunate)バイアスを示したため、限定されている(CTBは、望ましいキャリアタンパク質であるEPAよりも有効であった)。[3]；[5]も参照。
様々なキャリアタンパク質(とりわけEPA)の効率的なO-グリコシル化、及び内部グリコシル化部位におけるO-グリコシル化のために最適に組み合わせることができる、一連のPglL OTase及びピリンシークオンが必要とされている。
一態様において、本発明は、特定のピリン配列及びそれらを含む修飾キャリアタンパク質であって、場合によりここで上記ピリン配列が、NmPglL由来のOTase又はそれらのホモログ(例えば、N.ゴノレア(N. gonorrhoeae)、N.ラクタミカ(N. lactamica)、又はN.シャエガニ(N. shayeganii)由来のOTase)によってO-グリコシル化される、上記ピリン配列及びそれらを含む修飾キャリアタンパク質について最初に記載する。別の態様において、本発明は、様々な糖タグ化された(glycotagged)キャリアタンパク質(とりわけEPA)の、キャリアタンパク質残基のN末端、C末端、及び/又は内部に位置するGlycoTag(内部GlycoTagは、経時安定性などのコンジュゲート特性を改善すると期待されている)による効率的なO-グリコシル化を提供する。
本発明の実施形態としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる。
1. 少なくとも1つのGlycoTagを含むキャリアタンパク質を含む修飾キャリアタンパク質であって、上記少なくとも1つのGlycoTagが、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL GlycoTag(NgGlycoTag)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)PglL GlycoTag(NlGlycoTag)、若しくはナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)GlycoTag(NsGlycoTag)、又はそれらの組み合わせである、上記修飾キャリアタンパク質。
2. 少なくとも1つのGlycoTagが、キャリアタンパク質のN末端、C末端、及び/又は内部に位置している、実施形態1の修飾キャリアタンパク質。
3. 少なくとも1つのNgGlycoTagが、12～30アミノ酸長であり且つその中に配列番号147の配列を含むペプチド配列からなる、実施形態1又は2の修飾キャリアタンパク質。例えば、NgGlycoTagは、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29若しくは30アミノ酸長であるか、又は13～29、14～28、15～27、16～25、17～24、18～13、12～25、12～20又は12～15アミノ酸長である。一実施形態において、1、2、3、4若しくは5個、又は1～5、1～4、1～3若しくは1～2個のアミノ酸置換(1個又は複数個)(ここで上記アミノ酸は、配列番号147のその位置におけるアミノ酸から変更されている)が、NgGlycoTagアミノ酸配列中に存在する。一実施形態において、アミノ酸置換(1個又は複数個)は、保存的置換(1個又は複数個)である。
4. 少なくとも1つのNgGlycoTagが、30アミノ酸長であり且つその中に配列番号147の配列を含むペプチド配列からなる、実施形態1、2、又は3の修飾キャリアタンパク質。
5. 少なくとも1つのNgGlycoTagが、配列番号145であるペプチド配列からなる、実施形態4の修飾キャリアタンパク質。一実施形態において、1、2、3、4若しくは5個、又は1～5、1～4、1～3若しくは1～2個のアミノ酸置換(1個又は複数個)(ここで上記アミノ酸は、配列番号145のその位置におけるアミノ酸から変更されている)が、NgGlycoTagアミノ酸配列中に存在する。一実施形態において、アミノ酸置換(1個又は複数個)は、保存的置換(1個又は複数個)である。
6. 少なくとも1つのNgGlycoTagが、20アミノ酸長であり且つその中に配列番号147の配列を含むペプチド配列からなる、実施形態1、2、又は3の修飾キャリアタンパク質。
7. 少なくとも1つのNgGlycoTagが、配列番号146であるペプチド配列からなる、実施形態6の修飾キャリアタンパク質。
8. 少なくとも1つのNgGlycoTagが、配列番号147であるペプチド配列からなる、実施形態3の修飾キャリアタンパク質。
- 特定の実施形態において、上記修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、及び133のうちの1つのアミノ酸配列を有する。
9. 少なくとも1つのNlGlycoTagが、12～35アミノ酸長であり且つその中に配列番号151の配列を含むペプチド配列からなる、実施形態1又は2の修飾キャリアタンパク質。例えば、NlGlycoTagは、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29若しくは30アミノ酸長であるか、又は13～29、14～28、15～27、16～25、17～24、18～13、12～25、12～20又は12～15アミノ酸長である。一実施形態において、1、2、3、4若しくは5個、又は1～5、1～4、1～3若しくは1～2個のアミノ酸置換(1個又は複数個)(ここで上記アミノ酸は、配列番号151のその位置におけるアミノ酸から変更されている)が、NlGlycoTagアミノ酸配列中に存在する。一実施形態において、アミノ酸置換(1個又は複数個)は、保存的置換(1個又は複数個)である。
10. 少なくとも1つのNlGlycoTagが、35アミノ酸長であり且つその中に配列番号151の配列を含むペプチド配列からなる、実施形態9の修飾キャリアタンパク質。
11. 少なくとも1つのNlGlycoTagが、配列番号150であるペプチド配列からなる、実施形態9又は10の修飾キャリアタンパク質。
12. 少なくとも1つのNlGlycoTagが、配列番号151であるペプチド配列からなる、実施形態9の修飾キャリアタンパク質。
- 特定の実施形態において、上記修飾キャリアタンパク質は、配列番号103のアミノ酸配列を有する。
13. 少なくとも1つのNsGlycoTagが、12～31アミノ酸長であり且つその中に配列番号164の配列を含むペプチド配列からなる、実施形態1又は2の修飾キャリアタンパク質。例えば、NsGlycoTagは、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29若しくは30アミノ酸長であるか、又は13～29、14～28、15～27、16～25、17～24、18～13、12～25、12～20又は12～15アミノ酸長である。一実施形態において、1、2、3、4若しくは5個、又は1～5、1～4、1～3若しくは1～2個のアミノ酸置換(1個又は複数個)(ここで上記アミノ酸は、配列番号164のその位置におけるアミノ酸から変更されている)が、NsGlycoTagアミノ酸配列中に存在する。一実施形態において、アミノ酸置換(1個又は複数個)は、保存的置換(1個又は複数個)である。
14. 少なくとも1つのNsGlycoTagが、31アミノ酸長であり且つその中に配列番号164の配列を含むペプチド配列からなる、実施形態13の修飾キャリアタンパク質。
15. 少なくとも1つのNsGlycoTagが、配列番号163であるペプチド配列からなる、実施形態13又は14の修飾キャリアタンパク質。
16. 少なくとも1つのNsGlycoTagが、配列番号164であるペプチド配列からなる、実施形態13の修飾キャリアタンパク質。
17. 少なくとも1つのナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL GlycoTag(NmGlycoTag)をさらに含む、実施形態1～16の1つの修飾キャリアタンパク質。
- 特定の実施形態において、上記修飾キャリアタンパク質は、配列番号111のアミノ酸配列を有する。
18. 少なくとも1つのGlycoTagを含むキャリアタンパク質を含む修飾キャリアタンパク質であって、上記少なくとも1つのGlycoTagが、12～19アミノ酸長であり且つその中に配列番号142の配列を含むペプチド配列からなるナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL GlycoTag(NmGlycoTag)である、上記修飾キャリアタンパク質。例えば、NmGlycoTagは、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29若しくは30アミノ酸長であるか、又は13～29、14～28、15～27、16～25、17～24、18～13、12～25、12～20又は12～15アミノ酸長である。一実施形態において、1、2、3、4若しくは5個、又は1～5、1～4、1～3若しくは1～2個のアミノ酸置換(1個又は複数個)(ここで上記アミノ酸は、配列番号142のその位置におけるアミノ酸から変更されている)が、NmGlycoTagアミノ酸配列中に存在する。一実施形態において、アミノ酸置換(1個又は複数個)は、保存的置換(1個又は複数個)である。
19. 少なくとも1つのNmGlycoTagが、19アミノ酸長であり且つその中に配列番号142の配列を含むペプチド配列からなる、実施形態18の修飾キャリアタンパク質。
20. 少なくとも1つのNmGlycoTagが、配列番号141であるペプチド配列からなる、実施形態18又は19の修飾キャリアタンパク質。
21. 少なくとも1つのNmGlycoTagが、配列番号142であるペプチド配列からなる、実施形態18の修飾キャリアタンパク質。
- 特定の実施形態は、NmGlycoTagが配列番号140の配列からならないという条件で提供される。
- 特定の実施形態において、上記修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、199、202及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有する。
22. キャリアタンパク質が、コレラ毒素bサブユニット(CTB)、破傷風トキソイド(TT)、破傷風毒素Cフラグメント(TTc)、ジフテリアトキソイド(DT)、CRM197、緑膿菌外毒素A(EPA)、C.ジェジュニ(C. jejuni)のアクリフラビン耐性タンパク質A(CjAcrA)、大腸菌のアクリフラビン耐性タンパク質A(EcAcrA)、及び緑膿菌PcrV(PcrV)からなる群から選択される、実施形態1～21の1つの修飾キャリアタンパク質。
23. キャリアタンパク質がEPAである、実施形態1～22の1つの修飾キャリアタンパク質。
24. 少なくとも1つのGlycoTagが、配列番号1について番号付けされた、残基A14、D36、Q92、G123、E157、A177、Y208、N231、E252、R274、A301、Q307、A365、S408、T418、A464、A519、G525、A533、S585、K240若しくはA375、又はそれらの組み合わせに位置する、実施形態23の修飾キャリアタンパク質。一実施形態において、残基A14、D36、Q92、G123、E157、A177、Y208、N231、E252、R274、A301、Q307、A365、S408、T418、A464、A519、G525、A533、S585、K240若しくはA375、又はそれらの組み合わせは、少なくとも1つのGlycoTagで置換されている。
25. 少なくとも1つのナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL GlycoTag(NmGlycoTag)を含む緑膿菌外毒素A(EPA)キャリアタンパク質を特徴とする修飾キャリアタンパク質であって、上記少なくとも1つのNmGlycoTagが、配列番号1について、残基A14、D36、Q92、G123、E157、A177、Y208、N231、E252、R274、A301、Q307、A365、S408、T418、A464、A519、G525、A533、S585、K240若しくはA375、又はそれらの組み合わせに位置する、上記修飾キャリアタンパク質。一実施形態において、残基A14、D36、Q92、G123、E157、A177、Y208、N231、E252、R274、A301、Q307、A365、S408、T418、A464、A519、G525、A533、S585、K240若しくはA375、又はそれらの組み合わせは、NmGlycoTagで置換されている。
26. 少なくとも1つのNmGlycoTagが、12～29アミノ酸長であり且つその中に配列番号142の配列を含むペプチド配列からなる、実施形態25の修飾キャリアタンパク質。
27. 少なくとも1つのNmGlycoTagが、29アミノ酸長であり且つその中に配列番号142の配列を含むペプチド配列からなる、実施形態25又は26の修飾キャリアタンパク質。
28. 少なくとも1つのNmGlycoTagが、配列番号140であるペプチド配列からなる、実施形態25、26、又は27の修飾キャリアタンパク質。
29. 少なくとも1つのNmGlycoTagが、19アミノ酸長であり且つその中に配列番号142の配列を含むペプチド配列からなる、実施形態25又は26の修飾キャリアタンパク質。
30. 少なくとも1つのNmGlycoTagが、配列番号141であるペプチド配列からなる、実施形態25～29の1つの修飾キャリアタンパク質。
31. 少なくとも1つのNmGlycoTagが、配列番号142であるペプチド配列からなる、実施形態25又は26の修飾キャリアタンパク質。
32. キャリアタンパク質のN末端、C末端、及び/又は内部に位置する少なくとも第2のGlycoTagを含む、実施形態25の修飾キャリアタンパク質。
33. 2つ以上のGlycoTagを含み、少なくとも第2のGlycoTagが、NgGlycoTag、NlGlycoTag、又は、NsGlycoTagである、実施形態32の修飾キャリアタンパク質。
- 特定の実施形態は、NmGlycoTagが配列番号140の配列からならないという条件で提供される。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101, 103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、及び135のうちの1つのアミノ酸配列を有する。
34. 1つ以上のGlycoTag-隣接ペプチド(G-fペプチド)をさらに含む、実施形態1～33の1つの修飾キャリアタンパク質。
35. 1つ以上のG-fペプチドが、GlycoTagのN末端、C末端、又はそれらの組み合わせに位置する、実施形態1～34の1つの修飾キャリアタンパク質。
36. 1つ以上のG-fペプチドがGlycoTagに隣接している、実施形態1～34の1つの修飾キャリアタンパク質。
- 修飾キャリアタンパク質が、1つ以上のGlycoTagでグリカンに結合している(場合により共有結合している)、実施形態1～36のいずれか1つにおける修飾キャリアタンパク質。
- グリカンがPglLグリカン基質である、上記の修飾キャリアタンパク質。
- グリカンが以下の還元末端構造を有する、上記の修飾キャリアタンパク質：
(i) グルコース、ガラクトース、ガラクトフラノース、ラムノース、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、デオキシHexNAc、diNAcBac、又はPseの還元末端構造；
(ii) DATDH、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、ガラクトース、又は、グルコースの還元末端構造；
(iii) GlcNAc、GalNAc、FucNAc、又はグルコースの還元末端構造；又は
(iv) ガラクトース-β1,4-グルコース、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ガラクトース-β1,4-グルコース、ラムノース-β1,4-グルコース、ガラクトフラノース-β1,3-グルコース、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンのS-2からS-1への還元末端構造。
- グリカンが、
シゲラ(Shigella)グリカン(例えば、ソンネイ赤痢菌(シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei))グリカン(例えば、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原)、若しくはシゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)グリカン(例えば、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS)、若しくは志賀赤痢菌(シゲラ・ジセンテリア(Shigella dysenteriae))グリカン)、又は
ストレプトコッカス(Streptococcus)グリカン(例えば、肺炎球菌(ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae))(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)14 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)23A CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)33F CPS、又は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)22A CPS)))
である、上記の修飾キャリアタンパク質。
- (a) グリカンが、
シゲラ(Shigella)グリカン(例えば、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei)グリカン(S.ソンネイ(例えば、S. sonnei)O抗原)、若しくはシゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)グリカン(例えば、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS)、若しくはシゲラ・ジセンテリア(Shigella dysenteriae)グリカン)、又は
ストレプトコッカス(Streptococcus)グリカン(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)14 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)23A CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)33F CPS、若しくは、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)22A CPS))であり；且つ
(b) 上記グリカンが、以下の還元末端構造：
(i) グルコース、ガラクトース、ガラクトフラノース、ラムノース、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、デオキシHexNAc、diNAcBac、又はPseの還元末端構造；
(ii) DATDH、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、ガラクトース、又はグルコースの還元末端構造；
(iii) GlcNAc、GalNAc、FucNAc、又は、グルコースの還元末端構造；又は
(iv) ガラクトース-β1,4-グルコース、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ガラクトース-β1,4-グルコース、ラムノース-β1,4-グルコース、ガラクトフラノース-β1,3-グルコース、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンのS-2からS-1への還元末端構造
を有する、上記の修飾キャリアタンパク質。
- (a) グリカンが、ストレプトコッカス(Streptococcus)グリカン(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)(例えば、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPS、ストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)14 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)22A CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)23A CPS、又は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)33F CPS))であり；且つ(b) 上記グリカンが、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ガラクトース-β1,4-グルコース、ラムノース-β1,4-グルコース、又はガラクトフラノース-β1,3-グルコースのS-2からS-1への還元末端構造を有する、上記の修飾キャリアタンパク質。
37. 上記の実施形態のいずれか1つ、又は実施形態1～36のいずれか1つにおける修飾キャリアタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
38. ヌクレオチド配列が、ナイセリア(Neisseria)細胞、シゲラ(Shigella)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、エシェリキア(Escherichia)細胞、シュードモナス(Pseudomonas)細胞、エルシニア(Yersinia)細胞、カンピロバクター(Campylobacter)細胞、又はヘリコバクター(Heliobacter)細胞中での発現用にコドン最適化されている、実施形態37の核酸分子。
39. 実施形態37又は38の核酸分子を含むベクターであって、修飾キャリアタンパク質ヌクレオチド配列が、ペリプラズムシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されている、上記ベクター。
40. ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)OTase、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)OTase、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)OTase、又は、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)OTaseをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子をさらに含む、実施形態39のベクター。
- 特定の実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。
- 特定の実施形態において、ベクターは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)ATCC 14685 PglL、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)PglL、黄色球菌(ナイセリア・フラべスケンス(Neisseria flavescens))NRL30031/H210 PglL、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996 PglL、ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)014株F0314 PglL、ナイセリア・アークティカ(Neisseria arctica)PglL、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL、ナイセリア種(Neisseria sp.)83E34 PglL、ナイセリア・ワズウォーシ(Neisseria wadsworthii)PglL、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongata subsp. glycolytica)ATCC 29315 PglL、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200 PglL、ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)020株F0370 PglL、ナイセリア種(Neisseria sp.)74A18 PglL、ナイセリア・ウェアベリ(Neisseria weaver)ATCC 51223 PglL、又は、ナイセリア・マカカエ(Neisseria macacae)ATCC 33926 PglL OTaseをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子をさらに含む。
- 特定の実施形態において、ベクターは、配列番号8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、及び48のうちの1つのヌクレオチド配列を含む核酸分子をさらに含む。
- 特定の実施形態において、ベクターは、配列番号9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、又は49のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子をさらに含む。
41. 実施形態39又は40のベクターを含む、グラム陰性細菌宿主細胞。
42. ナイセリア(Neisseria)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、シゲラ(Shigella)細胞、エシェリキア(Escherichia)細胞、シュードモナス(Pseudomonas)細胞、又はエルシニア(Yersinia)細胞である、実施形態41の宿主細胞。
43.
(a) PglLグリカン基質；
(b) PglLグリカン基質を脂質キャリア上に構築することができるグリコシルトランスフェラーゼ；
(c) ペリプラズムを標的とする、実施形態1～36の1つの修飾キャリアタンパク質；及び
(d) PglL OTase
をコードする1つ以上の核酸分子を含む、グラム陰性細菌細胞。
44. 細胞が、核DNA中に1つ以上の核酸分子を含む、実施形態43のグラム陰性細菌細胞。
45. ナイセリア(Neisseria)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、シゲラ(Shigella)細胞、エシェリキア(Escherichia)細胞、シュードモナス(Pseudomonas)細胞、又はエルシニア(Yersinia)細胞である、実施形態43又は44のグラム陰性細菌細胞。
46. PglL OTaseが内在性PglLホモログである、実施形態43、44、又は45のグラム陰性細菌細胞。
47. 実施形態43、44、又は45のグラム陰性細菌細胞であって、PglL OTaseが上記細胞に対して異種であり、細胞の内在性PglLホモログが対照と比較して低下している、上記グラム陰性細菌細胞。
48. ペリプラズムに、以下：
(a) 脂質キャリア結合PglLグリカン基質、
(b) 実施形態1～36のいずれか1つにおける修飾キャリアタンパク質、及び
(c) PglL OTase
を含む、グラム陰性細菌細胞。
49. ナイセリア(Neisseria)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、シゲラ(Shigella)細胞、エシェリキア(Escherichia)細胞、シュードモナス(Pseudomonas)細胞、又はエルシニア(Yersinia)細胞である、実施形態48のグラム陰性細菌細胞。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、ナイセリア(Neisseria)細胞、シゲラ(Shigella)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、ストレプトコッカス(Streptococcus)細胞、エシェリキア(Escherichia)細胞、シュードモナス(Pseudomonas)細胞、エルシニア(Yersinia)細胞、カンピロバクター(Campylobacter)細胞、又はヘリコバクター(Heliobacter)細胞に内在性のものである。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、O抗原である。特定の実施形態において、O抗原は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコース、ガラクトース、ガラクトフラノース、ラムノース、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、デオキシHexNAc、diNAcBac、又はPseの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、脂質結合PglLグリカン基質は、DATDH、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、ガラクトース、又は、グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、脂質結合PglLグリカン基質は、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、又は、グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、ガラクトース-β1,4-グルコース、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ガラクトース-β1,4-グルコース、ラムノース-β1,4-グルコース、ガラクトフラノース-β1,3-グルコース、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei)グリカン抗原(例えば、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)グリカン抗原(例えば、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS)、シゲラ・ジセンテリア(Shigella dysenteriae)グリカン抗原、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカン抗原(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)14 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)15A CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)33F CPS、又はS. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)22A CPS)である。
- 特定の実施形態において、PglL OTaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)ATCC 14685 PglL、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)PglL、ナイセリア・フラべスケンス(Neisseria flavescens) NRL30031/H210 PglL、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996 PglL、ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)014株F0314 PglL、ナイセリア・アークティカ(Neisseria arctica)PglL、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL、ナイセリア種(Neisseria sp.)83E34 PglL、ナイセリア・ワズウォーシ(Neisseria wadsworthii)PglL、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongata subsp. glycolytica)ATCC 29315 PglL、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200 PglL、ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)020株F0370 PglL、ナイセリア種(Neisseria sp.)74A18 PglL、ナイセリア・ウェアベリ(Neisseria weaver)ATCC 51223 PglL、又はナイセリア・マカカエ(Neisseria macacae)ATCC 33926 PglL OTaseである。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、又はナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、及びナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPglL)、又はナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(配列番号33、NsPglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)、又はナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、又はナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、及び55のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン(FucNAc)の還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、又は55のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、又は55のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号134又は135のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、GalNAc、FucNAc、又は、GlcNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号134又は135のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又は、ラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号134又は135のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又は、ラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンの還元末端構造を有するシゲラ(Shigella)(例えば、S.ソンネイ(S. sonnei)若しくは、S.フレックスネリ(S. flexneri))抗原又はストレプトコッカス(Streptococcus)(例えば、S.ニューモニエ(S. pneumonieae))抗原であり、修飾キャリアタンパク質は、配列番号134又は135のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS、又はストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPSである。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、又は、グルコースの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、ガラクトース-β1,4-グルコース、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ラムノース-β1,4-グルコース、ガラクトフラノース-β1,3-グルコース、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又は、ラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei)グリカン抗原(例えば、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)グリカン抗原(例えば、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS)、シゲラ・ジセンテリア(Shigella dysenteriae)グリカン抗原、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカン抗原(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)14 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)15A CPS、又は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)33F CPS)である。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン(FucNAc)の還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、又はナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、又はナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)である。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン(FucNAc)の還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPglL)、又は、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(配列番号33、NsPglL)である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPglL)、又は、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(配列番号33、NsPglL)である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、及び99のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン(FucNAc)の還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、及び99のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、及び99のうちの1つのアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、108、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202、及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、108、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202、及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NmPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン(FucNAc)の還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、103、105、107、109、及び111のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NgPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン(FucNAc)の還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号103のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NlPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン(FucNAc)の還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号111のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NsPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン(FucNAc)の還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、113、115、117、121、123、125、127、129、131、及び133のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、113、115、117、121、123、125、127、129、131、及び133のうちの1つのアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NgPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン(FucNAc)の還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)、又は、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルクロン酸-β1,4-グルコースのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコースの還元末端構造又はグルクロン酸-β1,4-グルコースのS-2からS-1への還元末端構造を有するS.ニューモニエ(S. pneumoniae)CPSである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPSである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、又はナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、ラムノース-β1,4-グルコースのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコースの還元末端構造又はラムノース-β1,4-グルコースのS-2からS-1への還元末端構造を有するS.ニューモニエ(S. pneumoniae)CPSである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)22A CPSである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、199、202、及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有する。
50. 以下：
(a) PglLグリカン基質、
(b) 実施形態1～36のいずれか1つにおける修飾キャリアタンパク質、及び
(c) PglL OTase
を含む組成物。
51. 実施形態1～36のいずれか1つの修飾キャリアタンパク質と1つ以上の他の分子とを含むコンジュゲート。
52. 1つ以上の他の分子がグリカンであり、それぞれがGlycoTagのセリン残基又はスレオニン残基に共有結合している実施形態51のコンジュゲート。
53. 1つ以上のグリカンが、ナイセリア(Neisseria)細胞、シゲラ(Shigella)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、ストレプトコッカス(Streptococcus)細胞、エシェリキア(Escherichia)細胞、シュードモナス(Pseudomonas)細胞、エルシニア(Yersinia)細胞、カンピロバクター(Campylobacter)細胞、又はヘリコバクター(Heliobacter)細胞に内在性のものである、実施形態52のコンジュゲート。
- 修飾キャリアタンパク質が、シゲラ(Shigella)グリカン[例えば、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei)グリカン(例えば、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原)、又は、例えば、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)グリカン(例えば、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS)、若しくはシゲラ・ジセンテリア(Shigella dysenteriae)グリカン]に結合しているか、あるいは、ストレプトコッカス(Streptococcus)グリカン[例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)14 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)23A CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)33F CPS、又は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)22A CPS)]に結合している、実施形態51のコンジュゲート。
54. 1つ以上のグリカンが、それぞれ、グルコース、ガラクトース、ガラクトフラノース、ラムノース、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、デオキシHexNAc、diNAcBac、又はPseの還元末端構造を有する、実施形態52 又は53のコンジュゲート。
55. 実施形態51～54のいずれか1つのコンジュゲートを含む組成物。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)ATCC 14685 PglL、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)PglL、ナイセリア・フラべスケンス(Neisseria flavescens) NRL30031/H210 PglL、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996 PglL、ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)014株F0314 PglL、ナイセリア・アークティカ(Neisseria arctica)PglL、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL、ナイセリア種(Neisseria sp.)83E34 PglL、ナイセリア・ワズウォーシ(Neisseria wadsworthii)PglL、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongata subsp. glycolytica)ATCC 29315 PglL、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200 PglL、ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)020株F0370 PglL、ナイセリア種(Neisseria sp.)74A18 PglL、ナイセリア・ウェアベリ(Neisseria weaver)ATCC 51223 PglL、又は、ナイセリア・マカカエ(Neisseria macacae)ATCC 33926 PglL OTaseである。
- 特定の実施形態において、グリカンは、ナイセリア(Neisseria)細胞、シゲラ(Shigella)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、ストレプトコッカス(Streptococcus)細胞、エシェリキア(Escherichia)細胞、シュードモナス(Pseudomonas)細胞、エルシニア(Yersinia)細胞、カンピロバクター(Campylobacter)細胞、又はヘリコバクター(Heliobacter)細胞に内在性のものである。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質はO抗原である。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、及びナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPglL)、又は、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(配列番号33、NsPglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)、又は、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、又は、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、及び55のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、又は55のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、又は55のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号134又は135のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、GalNAc、FucNAc、又はGlcNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号134又は135のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号134又は135のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有するシゲラ(Shigella)(例えば、S.ソンネイ(S. sonnei)若しくはS.フレックスネリ(S. flexneri))抗原又はストレプトコッカス(Streptococcus)(例えば、S.ニューモニエ(S. pneumoniae))抗原であり、修飾キャリアタンパク質は、配列番号134又は135のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS、又はストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPSである。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、又は、グルコースの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、ガラクトース-β1,4-グルコース、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ガラクトース-β1,4-グルコース、ラムノース-β1,4-グルコース、ガラクトフラノース-β1,3-グルコース、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、ガラクトース-β1,4-グルコース、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ガラクトース-β1,4-グルコース、ラムノース-β1,4-グルコース、ガラクトフラノース-β1,3-グルコース、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有するシゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei)グリカン抗原(例えば、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)グリカン抗原(例えば、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS)、シゲラ・ジセンテリア(Shigella dysenteriae)グリカン抗原、又はストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカン抗原(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)14 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)15A CPS、又は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)33F CPS)であり、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質はFucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、又はナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)である。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、又は、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)である。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPglL)、又は、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(配列番号33、NsPglL)である。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPglL)、又は、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(配列番号33、NsPglL)である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、及び99のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、及び99のうちの1つのアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、100、102、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202、及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、100、102、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202、及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NmPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、103、105、107、109、及び111のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NgPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号103のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NlPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号111のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NsPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、113、115、117、121、123、125、127、129、131、及び133のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、113、115、117、121、123、125、127、129、131、及び133のうちの1つのアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NgPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)、又は、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルクロン酸-β1,4-グルコースのS-2からS-1への還元末端を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルクロン酸-β1,4-グルコースのS-2からS-1への還元末端を有するS.ニューモニエ (S. pneumoniae)抗原である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPSである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、又は、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、ラムノース-β1,4-グルコースのS-2からS-1への還元末端を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、ラムノース-β1,4-グルコースのS-2からS-1への還元末端を有するS.ニューモニエ (S. pneumoniae)抗原である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)22A CPSである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、199、202、及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有する。
56. O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質の製造方法であって、グラム陰性細菌宿主細胞を培養することを含み、ここで上記グラム陰性細菌宿主細胞が：
(a) 脂質キャリア結合PglLグリカンを産生し、
(b) ペリプラズムシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されている実施形態1～36のいずれか1つにおける修飾キャリアタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現し、
(c) PglL OTaseをコードするヌクレオチド配列を発現し、
これによりO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質を製造する、
上記方法。
- O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質の製造方法であって、グラム陰性細菌宿主細胞を培養することを含み、ここで上記グラム陰性細菌宿主細胞が：
(a) PglLグリカンをコードするヌクレオチド配列を発現し；
(b) 脂質キャリア結合PglLグリカンを構築することができるグリコシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上のヌクレオチド配列(1つ又は複数)を発現し；
(c) ペリプラズムシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されている実施形態1～36のいずれか1つにおける修飾キャリアタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現し、
(d) PglL OTaseをコードするヌクレオチド配列を発現し、
これによりO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質を製造する、
上記方法。
57. PglLグリカンが、ナイセリア(Neisseria)細胞、シゲラ(Shigella)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、ストレプトコッカス(Streptococcus)細胞、エシェリキア(Escherichia)細胞、シュードモナス(Pseudomonas)細胞、エルシニア(Yersinia)細胞、カンピロバクター(Campylobacter)細胞、又はヘリコバクター(Heliobacter)細胞に内在性のグリカンと本質的に同一である、実施形態56の方法。
58. PglLグリカンが、還元末端にグルコース、ガラクトース、ガラクトフラノース、ラムノース、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、デオキシHexNAc、diNAcBac、又はPseを有することを特徴とする、実施形態56 又は57の方法。
59. PglLグリカンが宿主細胞に内在性のものである、実施形態56、57、又は58の方法。
60. 細胞からO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質を単離することをさらに含む、実施形態56、57、58、又は59の方法。
61. 実施形態56～60のうちの1つの方法により製造されるO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質を含む組成物。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)ATCC 14685 PglL、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)PglL、ナイセリア・フラべスケンス(Neisseria flavescens) NRL30031/H210 PglL、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996 PglL、ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)014株F0314 PglL、ナイセリア・アークティカ(Neisseria arctica)PglL、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL、ナイセリア種(Neisseria sp.)83E34 PglL、ナイセリア・ワズウォーシ(Neisseria wadsworthii)PglL、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongata subsp. glycolytica)ATCC 29315 PglL、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200 PglL、ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)020株F0370 PglL、ナイセリア種(Neisseria sp.)74A18 PglL、ナイセリア・ウェアベリ(Neisseria weaver)ATCC 51223 PglL、又は、ナイセリア・マカカエ(Neisseria macacae)ATCC 33926 PglL OTaseである。
- 特定の実施形態において、脂質キャリア結合PglLグリカンはO抗原である。特定の実施形態において、O抗原は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、及びナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPglL)、又は、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(配列番号33、NsPglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)、又は、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、又は、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、及び55のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、又は55のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、又は55のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号134又は135のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、GalNAc、FucNAc、又はGlcNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号134又は135のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンの還元末端構造を有する、シゲラ(Shigella)(例えば、S.ソンネイ(S. sonnei)若しくはシゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri))抗原、又はストレプトコッカス(Streptococcus)(例えば、S.ニューモニエ(S. pneumoniae))抗原である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS、又はストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPSである。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、又はグルコースの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、ガラクトース-β1,4-グルコース、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ラムノース-β1,4-グルコース、ガラクトフラノース-β1,3-グルコース、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、ガラクトース-β1,4-グルコース、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ラムノース-β1,4-グルコース、ガラクトフラノース-β1,3-グルコース、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンの還元末端構造を有する、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei)グリカン抗原(例えば、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)グリカン抗原(例えば、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS)、シゲラ・ジセンテリア(Shigella dysenteriae)グリカン抗原、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカン抗原(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)14 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)15A CPS、又はS. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)33F CPS)であり、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、又はナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)である。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、又はナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)である。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPglL)、又はナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(配列番号33、NsPglL)である。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPglL)、又はナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(配列番号33、NsPglL)である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、及び99のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、及び99のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、及び99のうちの1つのアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、100、102、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202、及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、100、102、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202、及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NmPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、103、105、107、109、及び111のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NgPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号103のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NlPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号111のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NsPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、及び133のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、及び133のうちの1つのアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NgPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)、又はナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルクロン酸-β1,4-グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコース(例えば、グルクロン酸-β1,4-グルコース)の還元末端構造を有するストレプトコッカス(Streptococcus)(例えば、S.ニューモニエ(S. pneumoniae))抗原である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPSである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、又はナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、ラムノース-β1,4-グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコース(例えば、ラムノース-β1,4-グルコース)の還元末端構造を有するストレプトコッカス(Streptococcus)(例えば、S.ニューモニエ(S. pneumoniae))抗原である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)22A CPSである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、199、202、及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有する。
62. O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質の製造方法であって、グラム陰性細菌宿主細胞を培養することを含み、ここで上記グラム陰性細菌宿主細胞が：
(a) 脂質キャリア結合PglLグリカン基質を含み、
(b) ペリプラズム中に修飾キャリアタンパク質を含み、
上記修飾キャリアタンパク質は、少なくとも1つのNgGlycoTag、NlGlycoTag、又はNsGlycoTagを含むキャリアタンパク質を特徴とし、
(c) ナイセリア(Neisseria)PglL OTaseを含む、
上記方法。
63. 脂質キャリア結合PglLグリカン基質が、還元末端に、グルコース、ガラクトース、ガラクトフラノース、ラムノース、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、デオキシHexNAc、diNAcBac、又はPseを含む、実施形態62の方法。
64. 脂質キャリア結合PglLグリカン基質が宿主細胞に内在性のものである、実施形態62又は63の方法。
65. 細胞からO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質を単離することをさらに含む、実施形態62～64の1つの方法。
- 特定の実施形態において、上記方法は、細胞のペリプラズムからO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質を単離することを含む。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)ATCC 14685 PglL、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)PglL、ナイセリア・フラべスケンス(Neisseria flavescens) NRL30031/H210 PglL、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996 PglL、ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)014株F0314 PglL、ナイセリア・アークティカ(Neisseria arctica)PglL、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL、ナイセリア種(Neisseria sp.)83E34 PglL、ナイセリア・ワズウォーシ(Neisseria wadsworthii)PglL、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongata subsp. glycolytica)ATCC 29315 PglL、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200 PglL、ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)020株F0370 PglL、ナイセリア種(Neisseria sp.)74A18 PglL、ナイセリア・ウェアベリ(Neisseria weaver)ATCC 51223 PglL、又はナイセリア・マカカエ(Neisseria macacae)ATCC 33926 PglL OTaseである。
- 特定の実施形態において、グリカンはO抗原である。特定の実施形態において、O抗原は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、及びナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPglL)、又はナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(配列番号33、NsPglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)、又は、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、又は、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、及び55のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、又は55のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号134又は135のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、GalNAc、FucNAc、又はGlcNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号134又は135のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンの還元末端構造を有するシゲラ(Shigella)抗原又はストレプトコッカス(Streptococcus)抗原である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS、又はストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPSである。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、又はグルコースの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、ガラクトース-β1,4-グルコース、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ラムノース-β1,4-グルコース、ガラクトフラノース-β1,3-グルコース、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、ガラクトース-β1,4-グルコース、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ラムノース-β1,4-グルコース、ガラクトフラノース-β1,3-グルコース、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有するシゲラ(Shigella)抗原又はストレプトコッカス(Streptococcus)抗原であり、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei)グリカン抗原(例えば、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)グリカン抗原(例えば、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS)、シゲラ・ジセンテリア(Shigella dysenteriae)グリカン抗原、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカン抗原(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)14 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)15A CPS、又はS. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)33F CPS)である。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、又はナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPglL)、又はナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(配列番号33、NsPglL)である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、及び99のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、及び99のうちの1つのアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NmPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、103、105、107、109、及び111のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NgPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号103のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NlPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号111のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NsPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、113、115、117、121、123、125、127、129、131、及び133のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、113、115、117、121、123、125、127、129、131、及び133のうちの1つのアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NgPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)、又はナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルクロン酸-β1,4-グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコース(例えば、グルクロン酸-β1,4-グルコース)の還元末端構造を有するストレプトコッカス(Streptococcus)抗原である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPSである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、又はナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、ラムノース-β1,4-グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコース(例えば、ラムノース-β1,4-グルコース)の還元末端構造を有するストレプトコッカス(Streptococcus)抗原である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)22A CPSである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、199、202、及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有する。
66. コンジュゲートの作製方法であって、実施形態1～36のいずれか1つにおける修飾キャリアタンパク質の存在下でPglL OTaseとPglLグリカン基質とを接触させること、これによりコンジュゲートを作製すること、場合によりその後上記コンジュゲートを単離することを含む、上記方法。
67. コンジュゲートがバイオコンジュゲートであり、接触が、グラム陰性細菌細胞のペリプラズム中で生じる、実施形態66の方法。
68. 実施形態66又は67の方法により製造されるO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質を含む組成物。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、少なくとも1つのGlycoTagを含む、コレラ毒素bサブユニット(CTB)、破傷風トキソイド(TT)、破傷風毒素Cフラグメント(TTc)、ジフテリアトキソイド(DT)、CRM197、緑膿菌外毒素A(EPA)、C.ジェジュニ(C. jejuni)のアクリフラビン耐性タンパク質A(CjAcrA)、大腸菌のアクリフラビン耐性タンパク質A(EcAcrA)、及び緑膿菌PcrV(PcrV)からなる群から選択されるキャリアタンパク質を特徴とする。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、ナイセリア(Neisseria)細胞、シゲラ(Shigella)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、ストレプトコッカス(Streptococcus)細胞、エシェリキア(Escherichia)細胞、シュードモナス(Pseudomonas)細胞、エルシニア(Yersinia)細胞、カンピロバクター(Campylobacter)細胞、又はヘリコバクター(Heliobacter)細胞に内在性のものである。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、O抗原である。特定の実施形態において、O抗原は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコース、ガラクトース、ガラクトフラノース、ラムノース、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、デオキシHexNAc、diNAcBac、又はPseの還元末端構造を有する。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)ATCC 14685 PglL、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)PglL、ナイセリア・フラべスケンス(Neisseria flavescens) NRL30031/H210 PglL、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996 PglL、ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)014株F0314 PglL、ナイセリア・アークティカ(Neisseria arctica)PglL、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL、ナイセリア種(Neisseria sp.)83E34 PglL、ナイセリア・ワズウォーシ(Neisseria wadsworthii)PglL、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongata subsp. glycolytica)ATCC 29315 PglL、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200 PglL、ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)020株F0370 PglL、ナイセリア種(Neisseria sp.)74A18 PglL、ナイセリア・ウェアベリ(Neisseria weaver)ATCC 51223 PglL、又はナイセリア・マカカエ(Neisseria macacae)ATCC 33926 PglL OTaseである。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、及びナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPglL)、又はナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(配列番号33、NsPglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)、又はナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、又はナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、及び55のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、又は55のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号134又は135のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、GalNAc、FucNAc、又は、GlcNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号134又は135のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、シゲラ(Shigella)抗原又はストレプトコッカス(Streptococcus)抗原である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS、又はストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPSである。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、又はグルコースの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、199、202、又は204のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、ガラクトース-β1,4-グルコース、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ラムノース-β1,4-グルコース、ガラクトフラノース-β1,3-グルコース、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei)グリカン抗原(例えば、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)グリカン抗原(例えば、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS)、シゲラ・ジセンテリア(Shigella dysenteriae)グリカン抗原、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカン抗原(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)14 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)15A CPS、又はS. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)33F CPS)である。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、又は、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPglL)、又はナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(配列番号33、NsPglL)である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、及び99のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有し、修飾キャリアタンパク質は、配列番号57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、及び99のうちの1つのアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。さらなる実施形態において、PglL Otaseは、NmPglLである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NmPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、103、105、107、109、及び111のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NgPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号103のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NlPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号111のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NsPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、113、115、117、121、123、125、127、129、131、及び133のうちの1つのアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号101、113、115、117、121、123、125、127、129、131、及び133のうちの1つのアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、NgPglLである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、FucNAcの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)、又はナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルクロン酸-β1,4-グルコースのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコースの還元末端構造(例えば、グルクロン酸-β1,4-グルコースのS-2からS-1への還元末端構造)を有するストレプトコッカス(Streptococcus)抗原である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPSである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51のアミノ酸配列を有し、PglL Otaseは、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)、又はナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)PglL Otaseである。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、ラムノース-β1,4-グルコースのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコースの還元末端構造(例えば、ラムノース-β1,4-グルコースのS-2からS-1への還元末端構造)を有するストレプトコッカス(Streptococcus)抗原である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)22A CPSである。
- 特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、配列番号51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、199、202、及び204のうちの1つのアミノ酸配列を有する。
69. 1つ以上の免疫原性グリカンに共有結合している実施形態1～36のいずれか1つにおける修飾キャリアタンパク質を含む、免疫原性組成物。
- 1つ以上の免疫原性PglLグリカン基質に共有結合している実施形態1～36のいずれか1つにおける修飾キャリアタンパク質を含む、免疫原性組成物。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、ナイセリア(Neisseria)細胞、シゲラ(Shigella)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、ストレプトコッカス(Streptococcus)細胞、エシェリキア(Escherichia)細胞、シュードモナス(Pseudomonas)細胞、エルシニア(Yersinia)細胞、カンピロバクター(Campylobacter)細胞、又はヘリコバクター(Heliobacter)細胞に内在性のものである。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、O抗原である。特定の実施形態において、O抗原は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。
- 特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコース、ガラクトース、ガラクトフラノース、ラムノース、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、デオキシHexNAc、diNAcBac、又はPseの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、脂質結合PglLグリカン基質は、DATDH、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、ガラクトース、又はグルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、脂質結合PglLグリカン基質は、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、又はグルコースの還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、ガラクトース-β1,4-グルコース、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ガラクトース-β1,4-グルコース、ラムノース-β1,4-グルコース、ガラクトフラノース-β1,3-グルコース、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンのS-2からS-1への還元末端構造を有する。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、シゲラ(Shigella)(例えば、S.ソンネイ(S. sonnei)若しくはシゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri))抗原、又はストレプトコッカス(Streptococcus)(例えば、S.ニューモニエ(S. pneumoniae)抗原である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS、ストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)14 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)15A CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)33F CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)22A CPS、又は、S.フレックスネリ種(S. flexneri sp.)2a CPSである。
70. 哺乳動物に免疫学的有効量の実施形態69の免疫原性組成物を投与することを含む、哺乳動物における抗体応答を誘導する方法。
71. 哺乳動物における抗体応答の誘導において使用するための、実施形態69における免疫原性組成物。
- 哺乳動物における免疫応答の誘導において使用するための、実施形態69における免疫原性組成物。
72. 哺乳動物における抗体応答を誘導するための、実施形態69の免疫原性組成物の使用。
- 哺乳動物における免疫応答を誘導するための、実施形態69の免疫原性組成物の使用。
73. 哺乳動物における抗体応答を誘導するための医薬の製造のための、実施形態69の免疫原性組成物の使用。
- 哺乳動物における免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、実施形態69の免疫原性組成物の使用。
74. ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)感染により引き起こされる疾患の治療又は予防において使用するための、実施形態69における免疫原性組成物。
- ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)感染により引き起こされる疾患が、肺炎、侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)の増悪、中耳炎、髄膜炎、菌血症、肺炎、及び/又は結膜炎である、実施形態74の免疫原性組成物。
- 哺乳動物におけるストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカンに対する免疫応答の誘導において使用するための、実施形態69における免疫原性組成物。
75. 哺乳動物においてストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカンに対する抗体応答を誘導するための、実施形態69の免疫原性組成物の使用。
- 哺乳動物におけるストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカンに対する免疫応答を誘導するための、実施形態69の免疫原性組成物の使用。
76. 哺乳動物においてストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカンに対する抗体応答を誘導するための医薬の製造のための、実施形態69の免疫原性組成物の使用。
- 哺乳動物においてストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカンに対する免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、実施形態69の免疫原性組成物の使用。
ナイセリア(Neisseria)のO結合型オリゴサッカリルトランスフェラーゼ媒介性グリコシル化経路の概略。[2]の図3(b)から出典した。 S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原の、rEPA1(カラム#1及び#4)、rEPA2(カラム#2)、及びrEPA3(カラム#3)へのNmPglL転移をアッセイすることから得られたウェスタンブロット結果(図２Ａ)及びクーマシーブルーの結果(図２Ｂ)。His-タグ化EPAに対する抗体を使用した。 rEPA1-S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原バイオコンジュゲートの安定性について、3つの異なる温度で(-80℃、2～8℃、及び室温(RT)20～25℃)、6ヶ月の期間研究した。さらに、精製したrEPA1-S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原について、5回の凍結/融解サイクル(5FT)を行った。図３は、0ヶ月、2週間、1ヶ月、3ヶ月、及び6ヶ月において採取したサンプルのSEC-HPLC読み出し値(readout)を表す。 0日目、7日目、10日目及び18日目に2μgの糖、40μgのタンパク質、及び非フロイントアジュバントを含むrEPA1-S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原バイオコンジュゲート組成物を皮下注射されたニュージーランド白ウサギから0日目、21日目、及び28日目に採取した放血血清をプローブするウェスタンブロット結果(S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原及びEPAに対する抗体を使用した)。 0日目、7日目、10日目及び18日目に10μgの糖、200μgのタンパク質、及び非フロイントアジュバントを含むrEPA1-S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原バイオコンジュゲート組成物を皮下注射されたニュージーランド白ウサギから0日目、21日目、及び28日目に採取した放血血清をプローブするウェスタンブロット結果(S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原及びEPAに対する抗体を使用した)。 S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原、S.フレックスネリ(S. flexneri)2a O抗原、及びストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)12F CPSの、rEPA1又はrEPA43上へのNmPglL転移をアッセイすることから得られたウェスタンブロット結果。His-タグ化EPAに対する抗His抗体を使用した。 S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原の、mAcrA、mPcrV、mCrm197(カラム「3.1」)、又はm2Crm197(カラム「3.2」)上へのNmPglL転移をアッセイすることから得られたウェスタンブロット結果。His-タグ化EPAに対する抗His抗体を使用した。 rEPA4～rEPA23を産生するように修飾された、表面曝露された緑膿菌外毒素A(EPA)残基の表現。残基は配列番号1について番号付けされ、構造はProtein Data Bank (PDB) ID 1IKQから出典した。 rEPA24～rEPA25を産生するように修飾された、表面曝露された緑膿菌外毒素A(EPA)残基の表現。残基は配列番号1について番号付けされ、構造はProtein Data Bank(PDB) ID 1IKQから出典した。 脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原の、rEPA4～rEPA15、rEPA24～rEPA25へのNmPglL転移をin vivoでアッセイすることから得られたウェスタンブロット結果。ヒスチジンtagに対する抗体(上部ゲル)及びS.ソンネイ(S. sonnei)O抗原に対する抗体(下部ゲル)を使用した。 脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原の、rEPA16～rEPA25へのNmPglL転移をin vivoでアッセイすることから得られたウェスタンブロット結果。ヒスチジンtagに対する抗体(上部ゲル)及びS.ソンネイ(S. sonnei)O抗原に対する抗体(下部ゲル)を使用した。 NgPglL、NlPglL、NePglL、NbPglL及びNmuPglが、脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原を、内在性GlycoTagを含むキャリアタンパク質に(すなわち、キャリアタンパク質rEPA26～rEPA31それぞれに)転移させるか否かをアッセイすることから得られたウェスタンブロット結果。ヒスチジンtagに対する抗体(上部ゲル)及びS.ソンネイ(S. sonnei)O抗原に対する抗体(下部ゲル)を使用した。 NsPglLが、脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原を、内在性GlycoTagを含むキャリアタンパク質に(すなわち、キャリアタンパク質rEPA26～rEPA31それぞれに)転移させるか否かをアッセイすることから得られたウェスタンブロット結果。図９Ｂはまた、NmPglLの、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原のrEPA26～rEPA31上への転移をアッセイしたウェスタンブロット結果も示す。ヒスチジンtagに対する抗体(上部ゲル)及びS.ソンネイ(S. sonnei)O抗原に対する抗体(下部ゲル)を使用した。 脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原の、rEPA332～rEPA39へのNgPglL転移をアッセイすることから得られたウェスタンブロット結果。「N末端」は、そのN末端に機能的に連結された配列番号145のNgPilin GlycoTag配列を有するEPAであった。「N/C末端」は、配列番号145のNgPilin GlycoTag配列の2コピーを、1つはそのN末端に有し、2つめはそのC末端に有するEPAであった。EPAに対する抗体を使用した。 脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原の、rEPA332～rEPA39へのNgPglL転移をアッセイすることから得られたウェスタンブロット結果。「N末端」は、そのN末端に機能的に連結された配列番号145のNgPilin GlycoTag配列を有するEPAであった。「N/C末端」は、配列番号145のNgPilin GlycoTag配列の2コピーを、1つはそのN末端に有し、2つめはそのC末端に有するEPAであった。S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原に対する抗体を使用した。 脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原の、rEPA32、rEPA34、rEPA36、rEPA38、rEPA40、rEPA41、及びrEPA42へのNmPglL転移をin vivoでアッセイすることから得られたウェスタンブロット結果及びクーマシーブルー染色結果。EPAに対する抗体を使用した。 ニューモコッカル種(Pneomococcal Sp.)8 CPSグリカンの、rEPA1上へのNmPglL、NgPglL(「N.ゴノレア(N. gonorrhoeae)1」)、NlPglL(「N.ラクタミカ(N. lactamica)1」)、NlATCC23970PglL(「N.ラクタミカ(N. lactamica)2」)及びNgF62PglL(「N.ゴノレア(N. gonorrhoeae)2」)転移をアッセイすることから得られたウェスタンブロット及びクーマシーブルー染色の結果。ニューモコッカル種(Pneomococcal Sp.)8 CPSグリカンに対する抗体を使用した。 ニューモコッカル種(Pneomococcal Sp.)8 CPSグリカンの、rEPA1上へのNmPglL、NgPglL(「N.ゴノレア(N. gonorrhoeae)1」)、NlPglL(「N.ラクタミカ(N. lactamica)1」)、NlATCC23970PglL(「N.ラクタミカ(N. lactamica)2」)及びNgF62PglL(「N.ゴノレア(N. gonorrhoeae)2」)転移をアッセイすることから得られたウェスタンブロット及びクーマシーブルー染色の結果。サンプルのタンパク質キナーゼ(「PK」)処理は、NmPglL、NgPglL(「N.ゴノレア(N. gonorrhoeae)1」)、NlPglL(「N.ラクタミカ(N. lactamica)1」)及びNgF62PglL(「N.ゴノレア(N. gonorrhoeae)2」)のシグナルを消失させ、ニューモコッカル種(Pneomococcal Sp.)8 CPSグリカンが、rEPAタンパク質に結合したことを示していた。ニューモコッカル種(Pneomococcal Sp.)8 CPSグリカンに対する抗体を使用した。 NmPglL、NgPglL(「N.ゴノレア(N. gonorrhoeae)1」)、NlPglL(「N.ラクタミカ(N. lactamica)1」)及びNgF62PglL(「N.ゴノレア(N. gonorrhoeae)2」)の、ニューモコッカル種(Pneomococcal Sp.)22A CPSグリカンのrEPA1上への転移をアッセイすることから得られたウェスタンブロット及びクーマシーブルー染色の結果。サンプルのタンパク質キナーゼ(「+PK」)処理は、NmPglL、NgPglL(「N.ゴノレア(N. gonorrhoeae)1」)、NlPglL(「N.ラクタミカ(N. lactamica)1」)及びNgF62PglL(「N.ゴノレア(N. gonorrhoeae)2」)のシグナルを消失させ、ニューモコッカル種(Pneomococcal Sp.)22A CPSグリカンが、rEPA1タンパク質に結合したことを示していた。ニューモコッカル種(Pneomococcal Sp.)22A CPSグリカンに対する抗体を使用した。
発明の詳細な説明
本発明は、1つ以上のGlycoTagを組み込む修飾キャリアタンパク質、及びin vivoバイオコンジュゲーション又はin vitroバイオコンジュゲーションのためのそれらの使用を提供する。
定義
本発明の理解を容易にするため、多数の用語及び語句が以下に定義される。これらの用語及び語句の代替形(時制)も本明細書中に包含される。別段に記載されない限り、専門用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V、Oxford University Press版、1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al. (編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.版、1994 (ISBN 0-632-02182-9)；及びRobert A. Meyers (編)、Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference、VCR Publishers, Inc.版、1995 (ISBN 1-56081-569-8)中に見出され得る。
本明細書中で使用される「～を含む(comprise)」(「comprising」又は「comprises」)は、オープンエンドであり、「～を含むが、これらに限定されるものではない」を意味する。「～を有する(having)」は、本明細書中で「～を含む(comprising)」の同義語として使用される。「～を含む(comprising)」という言葉を伴う実施形態が本明細書中のどこに記載されていようとも、かかる実施形態は、「～からなる(consisting of)」及び/又は「本質的に～からなる(consisting essentially of)」に関して記載される実施形態を包含することが理解される。「その中に～を含む(comprises therein)」又は「その中に～を含んでいる(comprising therein)」は、言及される分子、アミノ酸配列、又はヌクレオチド配列が、その中にGlycoTag分子、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列をそれぞれ組み込んでいることを意味する。例えば、「その中にGlycoTagを含むキャリアタンパク質」について、そのキャリアタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、5'末端と3'末端の間にGlycoTagをコードするヌクレオチド配列を有し、同様に、キャリアタンパク質のアミノ酸配列は、N末端とC末端との間にGlycoTagアミノ酸配列を有する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明らかに別段に指示しない限り複数の指示対象を包含する。従って、例えば「a GlycoTag」との言及は、1つ以上のGlycoTagを包含する。
「約(about)」又は「約(approximately)」は、大体、「およそ(around)」又は「ほぼ(in the region of)」を意味する。上記の用語「約(about)」又は「約(approximately)」はさらに、当業者により決定される、特定の値について許容される文脈誤差の範囲内であることを意味し、これは、部分的には、上記の値がどのように測定されるか(すなわち、測定系の制限又は特定の目的のために必要とされる精度)によって決まるだろう。用語「約(about)」又は「約(approximately)」が数値範囲と共に用いられる場合、上記の用語は、示される数値の上下の境界を広げることによってその範囲を修正する。例えば、「約(about)5.5～6.5g/l」は、数値範囲の境界が5.5未満及び6.5超に広がり、その結果、当該特定の値が、数値範囲内の値と同じ機能的結果を達成することを意味する。例えば、「約(about)」及び「約(approximately)」は、当技術分野の慣行により、1標準偏差内、又は1標準偏差超を意味し得る。あるいは、「約(about)」及び「約(approximately)」は、所与の値の20％まで、10％まで、5％まで、又は1％までの範囲を意味し得る。
「A及び/又はB」のような語句において使用される用語「及び/又は」は、「A及びB」「A又はB」、「A」並びに「B」を包含することが意図される。同様に、「A、B、及び/又はC」のような語句において使用される用語「及び/又は」は、以下の実施形態：A、B、及びC；A、B、又はC；A又はC；A又はB；B又はC；A及びC；A及びB；B及びC；A(単独)；B(単独)及びC(単独)のそれぞれを包含することが意図される。
特に記載されない限り、2つ以上の成分を混合するステップを含む方法は、任意の特定の混合順序を要求しない。成分は、任意の順序で混合することができる。3つの成分が存在する場合、2つの成分を互いに組み合わせることが可能であり、その後この組み合わせを第3の成分と組み合わせることができる、等である。同様に、方法のステップは番号付けされ得るが(例えば、(1)、(2)、(3)等、又は(i)、(ii)、(iii))、このステップの番号付けは、それ自体は、上記ステップをその順序で行わなければならない(すなわち、ステップ1、その後ステップ2、その後ステップ3、等)ことを意味しない。特定の実施形態において、「その後(then)」という単語は、方法のステップの順序を特定するために用いられる。
本明細書中で、「本質的に同一(essentially the same)」とは、当業者が、その差が取るに足りない、無視できる、及び/又は統計的に有意でないとみなし得るような、少なくとも2つの分子(構造又は機能を含む)又は数値の間の高度の類似性を意味する。例えば、本明細書中で、第1のポリペプチド、コンジュゲート、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、又は分子が、第2のポリペプチド、コンジュゲート、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、又は分子と比較して、構造及び機能において取るに足りない差しか有していない場合、第1のものは、第2のものと「本質的に同一」である。
「有効量」は、言及される効果又は結果を生じさせるために十分な量を意味する。「有効量」は、記載される目的に関連する公知技術を用いて、経験的且つ日常的な方法で決定することができる。特定の実施形態において、組成物は、免疫学的有効量の抗原、アジュバント、又はその両方を含む。特定の実施形態において、「対象に治療薬(例えば、本発明の免疫原性組成物又はワクチン)を投与する」の文脈における「有効量」は、予防的効果及び/又は治療的効果(1つ又は複数)を有する治療薬の量を指す。特定の実施形態において、「有効量」は、1、2、3、4又はそれ以上の、以下の効果を達成するために十分な治療薬の量を指す：(i) 細菌性感染症又はそれに関連する症状の重篤度を低減又は改善する；(ii) 細菌性感染症又はそれに関連する症状の期間を低減する；(iii) 細菌性感染症又はそれに関連する症状の進行を予防する；(iv) 細菌性感染症又はそれに関連する症状の退縮を引き起こす；(v) 細菌性感染症又はそれに関連する症状の発生又は発症を予防する；(vi) 細菌性感染症又はそれに関連する症状の再発を予防する；(vii) 細菌性感染症に関連する臓器不全を低減する；(viii) 細菌性感染症を有する対象の入院を低減する；(ix) 細菌性感染症を有する対象の入院期間を低減する；(x) 細菌性感染症を有する対象の生存率を増加させる；(xi) 対象における細菌性感染症を除去する；(xii) 対象における細菌の複製を阻害又は低減する；及び/又は(xiii) 別の治療薬の予防的効果又は治療的効果(1つ又は複数)を高めるか又は改善する。
「対象」は、動物、特に霊長類(例えばヒト)などの哺乳動物を指す。
「～を本質的に含まない(essentially free from)」又は「～を本質的に含まない(essentially free of)」における「～を本質的に含まない(essentially free)」は、検出可能なレベル未満の言及される物質を含むか、又は不可避なレベルの言及される物質のみ(微量)を含むことを意味する。
「実質的に」という単語は、「完全に」を除外せず、例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まなくてもよい。「実質的に純粋な」は、少なくとも50％純粋(すなわち、夾雑物を含まない)、少なくとも90％純粋、少なくとも95％純粋、少なくとも98％純粋、又は少なくとも99％純粋な物質を指す。
従来どおり、「NH2」又は「N-」という表記は、アミノ酸配列のN末端を指し、「COOH」又は「C-」という表記は、アミノ酸配列のC末端を指す。
タンパク質、残基、又はアミノ酸配列に関して本明細書中で用いられる「内部の(Internal)」、「内部の(Interior)」は、N末端とC末端との間に位置していることを意味する。
「フラグメント」は、「n」個の連続的な核酸又はアミノ酸をそれぞれ含む参照配列のヌクレオチド又はポリペプチドであり、ここで「n」は、参照配列中のアミノ酸の総数未満の任意の整数である。特定の実施形態において、「n」は、1～100の任意の整数である。このようにして、仮想の100残基長の参照配列(SeqX)の「そのフラグメント」は、SeqXの任意の1～99個の連続アミノ酸からなり得る。特定の実施形態において、フラグメントは、完全長配列のうちの10、20、30、40又は50個の連続アミノ酸からなる。フラグメントは、完全長の参照ポリペプチド配列のN末端及びC末端のいずれか又は両方から「n」個の連続アミノ酸を除去することにより容易に得ることができる。フラグメントは、完全長の参照ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列の3'末端及び5'末端のいずれか又は両方から「n」個の連続核酸を除去することにより容易に得ることができる。本明細書中で用いられる「免疫原性フラグメント」は、抗原配列の「n」個の連続アミノ酸からなり、哺乳動物における抗体応答又は免疫応答を誘発することができる。ポリペプチドのフラグメントは、例えば、当技術分野で公知の技術を用いて、例えば組換え的に、タンパク質消化により、又は化学合成によって製造することができる。ポリペプチドの内部フラグメント又は末端フラグメントは、ポリペプチドの完全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の、(末端フラグメントについては)3'末端又は5'末端から1つ以上の核酸を除去することにより、あるいは(内部フラグメントについては)3'末端及び5'末端の両方から1つ以上の核酸を除去することによって生成することができる。
「機能的に連結された(operably linked)」又は「機能的に連結された(operatively linked)」は、「操作可能(operational)」となるように連結されていること、例えば、組換えタンパク質発現のためのポリヌクレオチド配列の配置を意味する。特定の実施形態において、「機能的に連結された(operably linked)」は、意図される機能(例えば、発現)が達成されるような、例えば核酸成分の、当技術分野で認められた配置を指す。当業者であれば、特定の環境下(例えば、切断部位又は精製タグ)では、共に「機能的に連結された」2つ以上の成分が、(連続的に連結されている)核酸配列又はアミノ酸配列中で必ずしも互いに隣接しているわけではないことを認識するであろう。「制御配列」(例えば、プロモーター、エンハンサー、又はIRES)に「機能的に連結された」コーディング配列は、コーディング配列の発現が制御配列の影響下又は制御下にあるような方法で連結されている。当業者であれば、様々な配置が機能的であり、且つ包含されることを認識するであろう。
「組換え」は、人工的又は合成的であることを意味する。特定の実施形態において、「組換え」は、言及されるアミノ酸、ポリペプチド、コンジュゲート、抗体、核酸、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、又は分子が、2つ以上の分子(例えば、異種の核酸配列又はアミノ酸配列)の人工的な組み合わせによって作製されたことを示す。このような人工的組み合わせとしては、限定するものではないが、化学合成及び遺伝子工学技術などが挙げられる。特定の実施形態において、「組換えポリペプチド」は、組換え核酸を用いて作製されたポリペプチド(宿主細胞中に導入される核酸)を指す。特定の実施形態において、組換え核酸は異種ではない(例えば、組換え核酸が宿主細胞中に生来的に存在する核酸の第2のコピーである場合)。本明細書中で、「トランスジーン」は、細胞中に導入されたポリヌクレオチドを意味し、従って、トランスジーンは組換えである。
「変異(mutant)」及び「修飾された(modified)」は、それらの十分に理解された慣用の意味で示され、少なくとも、言及される分子が、対照(例えば、野生型分子又はその天然の対応物)と比較して(構造及び/又は機能が)、同等の条件下で変更されていることを意味するか、又は言及される数値が、対照の数値と比較して、同等の条件下で変更されている(増加又は減少している)ことを意味する。
「保存的」アミノ酸置換又は変異は、類似側鎖を有する残基の互換性を指し、また従って、典型的には、ポリペプチド中のアミノ酸の、同一の又は類似の定義されるアミノ酸のクラス内のアミノ酸との置換を包含する。しかし、本明細書中で、一部の実施形態において使用される「保存的変異」は、上記の保存的変異が、代わりに、脂肪族残基から脂肪族残基へ、非極性残基から非極性残基へ、極性残基から極性残基へ、酸性残基から酸性残基へ、塩基性残基から塩基性残基へ、芳香族残基から芳香族残基へ、又は拘束残基から拘束残基への置換であり得る場合、親水性残基から親水性残基へ、疎水性残基から疎水性残基へ、ヒドロキシル含有残基からヒドロキシル含有残基へ、又は小残基から小残基への置換は含まない。さらに、本明細書中で使用される場合、A、V、L、又はIは、別の脂肪族残基又は別の非極性残基のいずれかへ保存的に変異され得る。以下の表は、例示的な保存的置換を示す。
Figure 2022513458000001
本明細書における「単離された」又は「精製された」は、天然には見出されない形態のポリペプチド、コンジュゲート、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、又は分子を意味する。この用語は、例えば、宿主細胞又は生物から分離された(粗抽出物を含む)か、あるいは、その天然の環境から取り外された、ポリペプチド、コンジュゲート、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、又は分子を包含する。特定の実施形態において、単離又は精製されたタンパク質は、そのタンパク質が生来結合していた(又は生来接触していた)全ての他のポリペプチドを本質的に含まないタンパク質である。例えば、「単離されたPglL」又は「精製されたPglL」は、そのPglLタンパク質が、単離又は精製されていなければ宿主細胞の内部で結合(接触)していたであろう他のペリプラズムポリペプチドを本質的に含まない組換えPglLタンパク質を包含する。例えば、「単離されたO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質」又は「精製されたO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質」は、非-O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質から(例えば、in vitroコンジュゲーションステップに従って)分離されていてもよい。特定の実施形態において、「単離された」又は「精製された」は、タンパク質が抗体又は抗体フラグメントに結合していないことも意味する。特定の実施形態において、単離又は精製されたタンパク質は、タンパク質の成分(副部分(sub-parts))のコレクションを含まない。例えば、タンパク質がタンパク質成分の複合体である場合、「単離された/精製された複合体」は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)又は2-メルカプトエタノール(これらはいずれも、複合体中のタンパク質成分間の結合を破壊する)の適用後に得られた、複合体の成分(互いに結合していない)のコレクションを含まないものであり得る。
「医薬品グレードの」又は「製薬上許容される」ポリペプチド、コンジュゲート、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、又は分子は、単離され、精製され、あるいは不純物を本質的に含まない(例えば、上記ポリペプチド、コンジュゲート、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、又は分子が投与される可能性のある対象に対して容認し難いほど毒性の成分(例えば天然の成分)を本質的に含まない)ように製剤化される。医薬品グレードのポリペプチド、コンジュゲート、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、又は分子は、粗製のポリペプチド、コンジュゲート、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、又は分子ではない。
本明細書中で用いられる「ホモログ(1つ又は複数)」は、異なる属又は種の生物に由来する、及び/又は異なる構造を有するにも関わらず、本質的に同一の機能を有する2つ以上の分子を意味する。本明細書中で類似の機能性を示すため、「PglL」又は「PilE」を使用して、当技術分野において代替的な表記が使用されている場合であっても、それぞれオリゴサッカリルトランスフェラーゼ又はピリンを指し得る(例えば、本明細書中の「PaPglL」は、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)由来の「PglO」と呼ばれるオリゴサッカリルトランスフェラーゼを包含し、これは、N. メニンギティディス(N. meningitidis)PglLの公知のホモログである([16]、[17]；([14]、[18]、[19]も参照のこと))。
本明細書中で用いられる「内在性の(endogenous)」は、言及される2つ以上のポリペプチド、コンジュゲート、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、組成物、若しくは分子が同一種の生物に由来するか、又は、例えば合成若しくは組換えポリペプチドの場合、本質的に同一種の生物に由来する構造及び機能からなることを意味する。例えば、「PglL」に関して、「内在性の」は、主題のPglLの主題のピリン(又はそれに由来するGlycoTag)に対する関係を指し、これらが両方とも同一種の生物に由来するか、又は本質的に同一種の生物に由来する構造及び機能からなることを意味する。一例として、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglLは、N. メニンギティディス(N. meningitidis)PilEに対して「内在性である」(またこのようにして、PglLは言及されるピリンに対して「内在性である」と言うこともできる)。さらなる例として、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglLは、N.メニンギティディス(N. meningitidis)細胞(特に、対照又は野生型のN. メニンギティディス(N. meningitidis))細胞「に内在性のものである」。
本明細書中で用いられる「異種の」は、言及される2つ以上のものが、天然には互いに関連していないことを意味する。特定の実施形態において、タンパク質は、同等の天然の細胞(例えば、同等の条件下の野生型細胞)がそのタンパク質を産生し得ない場合、その細胞に対して「異種」である。特定の実施形態において、ペリプラズムシグナル配列は、タンパク質に対して(又はそのタンパク質のアミノ酸配列)に対して「異種」であるが、これは、同等の天然のタンパク質(例えば、野生型タンパク質)が、そのシグナル配列に機能的に連結され得ないからである。
「核酸」、「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」は、修飾されているか、非修飾であるか、又は合成であるか否かに関わらず、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、ポリリボヌクレオチド分子、又はポリデオキシリボヌクレオチド分子を指すために用いられる。従って、本明細書中で定義されるポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖DNA、一本鎖領域及び二本鎖領域を含むDNA、一本鎖及び二本鎖RNA、並びに一本鎖領域及び二本鎖領域を含むRNA、一本鎖であり得るか、若しくはより典型的には二本鎖であり得るか、又は一本鎖領域及び二本鎖領域を含むDNA及びRNAを含むハイブリッド分子、を包含し得る。従って、安定性のため、又は他の理由のために修飾された骨格を有するDNA又はRNAは、その用語が本明細書中で意図するような「ポリヌクレオチド」である。DNA又はRNAは、合成であってもよい(例えば、限定するものではないが、一緒になってポリヌクレオチドを形成する核酸サブユニットなど)。さらに、イノシンなどの稀塩基、又はトリチル化塩基などの修飾塩基を含むDNA又はRNAは、本明細書中で定義される用語「ポリヌクレオチド」の範囲内に含まれる。一般的に、用語「ポリヌクレオチド」は、全ての化学的、酵素的及び/又は代謝的修飾形態の非修飾ポリヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドは、in vitro 組換えDNA媒介技術などの様々な方法により、また細胞及び生物中のDNAの発現によって作製することができる。ポリヌクレオチドは、ゲノム核酸及びプラスミド核酸を包含する。DNAとしては、限定するものではないが、例えば、イントロンを有するゲノム(核)DNA、並びにcDNA(例えば、イントロンが除去されている)などの組換えDNAなどが挙げられる。RNAとしては、限定するものではないが、mRNA及びtRNAなどが挙げられる。本発明のポリヌクレオチド分子の任意の組換え発現のためにコドン最適化が利用されることが想定される。
「ベクター」は、それにより核酸分子を含有させて1つの環境から別の環境へと移行させるか、又は核酸分子の操作を容易にするビヒクルを指す。ベクターは、例えば、クローニングベクター、発現ベクター、又はプラスミドであり得る。ベクターとしては、例えば、BACベクター又はYACベクターなどが挙げられる。用語「発現ベクター」は、限定するものではないが、細胞による発現に適したコーディング配列を含む任意のベクター(例えば、プラスミド、コスミド又はファージ染色体)を包含する(例えば、ここで上記コーディング配列は、プロモーターなどの転写制御エレメントに機能的に連結されている)。ベクターは、2つ以上の核酸分子を含むことが可能であり、特定の実施形態において、それらの2つ以上の核酸分子のそれぞれは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書中で互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。「ペプチド」は、1～50個のアミノ酸からなるアミノ酸のポリマーを指すために使用し得る。上記ポリマーは直鎖であっても分岐鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含み得、また非アミノ酸で遮断され得る。この用語はまた、天然に、又は介入により：例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化(修飾キャリアタンパク質のO-グリコシル化を除く)、脂質付加、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、非天然アミノ酸による修飾、又は任意の他の操作若しくは修飾(ラベル化成分とのコンジュゲーションなど)により修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。また上記の定義内には、例えば、1つ以上のアミノ酸のアナログ(例えば非天然アミノ酸等を含む)、並びに当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。
「グリカン」は、より小さな糖分子を含む大きな糖(carbohydrate)分子であり、本明細書中特定の実施形態において、「糖タンパク質」(アミノ酸側鎖に共有結合しているグリカン(1つ又は複数)を含むタンパク質)のオリゴ糖鎖を指す。「Oグリカン」又は「O結合グリカン」は、本明細書中で、別の分子のセリン残基又はスレオニン残基に共有結合しているグリカン(すなわち、グリカンがO結合型グリコシル化に関わる)に言及するために使用される。グリカンは免疫原性であり得る。[3]。
オリゴ糖又は多糖の「還元末端」は、グリコシド結合に関与していない遊離アノマー炭素を有し、このため開鎖形態に変換することができる単糖である。本明細書中の第1の糖(「S-1」)は、還元末端を含む糖であり、第2の糖(「S-2」)はS-1に隣接する糖である。S-2糖は、S-1糖へ、例えば、α-(1→3)、β-(1→3)、β-(1→4)、又はα-(1→6)結合(連結)によって結合することができる(連結されうる)([3]を参照のこと)。
本明細書中の「抗原」又は「免疫原」は、対象における免疫応答を誘導することができる物質(典型的にはタンパク質又はグリカン)を指す。特定の実施形態において、抗原は「免疫学的に活性な」タンパク質(例えば、糖タンパク質)であり、「免疫学的に活性な」は、対象に投与されると(直接投与、又は対象にそのタンパク質をコードするヌクレオチド配列又はベクターを投与することのいずれかにより)、そのタンパク質に対する体液性型及び/又は細胞性型の免疫応答を誘発することができることを意味する。「O抗原」は、一般的には2～6個の糖残基を有するオリゴ糖単位(O-単位)の反復からなる[20]。O抗原は、グラム陰性細菌の外膜の成分である[20]。特定の実施形態において、グリカンはO抗原である。
「アジュバント」は、抗原の免疫学的効果の誘導、大きさ、及び/又は寿命を増強する非抗原物質である。
「コンジュゲーション」は、キャリアタンパク質の糖への結合(例えば、共有結合による)を指す。
本明細書中で「コンジュゲート」は、互いに結合している2つ以上の分子(例えば、タンパク質)を意味する。該2つ以上の分子は、場合により組換え分子であり、及び/又は互いに異種である。特定の実施形態において、コンジュゲートは2つ以上の分子を含み、その第1の分子は、キャリアタンパク質(例えば、修飾キャリアタンパク質)であり、残りの1つ以上の分子は、キャリアタンパク質のセリン残基又はスレオニン残基に共有結合しているグリカンである。特定の実施形態において、コンジュゲートは、グリコシル化キャリアタンパク質、例えばO-グリコシル化キャリアタンパク質(O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質を含む)を含む。コンジュゲートは、化学的コンジュゲーション又はin vitroコンジュゲーション(バイオコンジュゲーション)の結果物であり得る。
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位を通して、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、脂質、又は前述のものの組み合わせなどの標的を認識して特異的に結合する、免疫グロブリン分子を意味する。本明細書中で使用される用語「抗体」は、抗体が所望の生物学的活性を示す限り、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、少なくとも2つのインタクトな抗体から生成される多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体を含む融合タンパク質、及び任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、5つの主要なクラスの免疫グロブリン：IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgM、又はそのサブクラス(アイソタイプ)(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)のいずれかであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造及び3次元配置を有する。抗体は、ネイキッドであってもよく、又は毒素、放射性同位体等のような他の分子にコンジュゲートしていてもよい。用語「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部分を指す。「抗原結合フラグメント」は、抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を指す。抗原結合フラグメントは、インタクトな抗体の抗原性決定可変領域を含有し得る。抗体フラグメントの例としては、限定するものではないが、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFvフラグメント、直鎖抗体、及び単鎖抗体などが挙げられる。
「抗体応答」は、抗抗原抗体の産生を意味する。「抗体応答を誘導する」又は「抗体応答を惹起する」は、抗抗原抗体(例えば、抗O抗原抗体又は抗グリカン抗体)の産生をin vivoで刺激することを意味する。
2つ以上の配列の文脈において用いられる「同一の」又はパーセント「同一性」は、整列された配列の全長にわたる同一のヌクレオチド又はアミノ酸の数に対する言及である(明確性のため、この文脈における「保存されたアミノ酸置換」は「同一」ではあり得ないが、例えば、アミノ酸のアナログは「同一」である)。パーセント同一性を計算するための幾つかの公知の方法がある([21]を参照のこと)。別段に記載されない限り、本明細書における、第1のアミノ酸配列の第2のアミノ酸配列に対するパーセント同一性「X」は(100 x (Y/Z))として計算され、ここで「Y」は、「マッチ」(目視検査又は特定の配列アラインメントプログラムにより整列させた第1の配列と第2の配列のアラインメントにおいて、同一のマッチとしてスコア化されたアミノ酸残基)の数であり、「Z」は、整列させた残基の総数である。従って、別段に記載されない限り、第1のアミノ酸配列が第2のアミノ酸配列より短く、且つパーセント同一性が「配列の全長」にわたって計算される場合、「Z」は第1の配列の(アミノ酸の数における)長さに等しい。
パーセント同一性は、配列比較ソフトウェア又はアルゴリズムを用いて、又は目視検査により測定することができる。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用し得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが、当技術分野で公知である。配列アラインメントアルゴリズムの、1つのこのような非限定的な例は、[22]に記載され、[23]において修正され、NBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれた([24])アルゴリズムである。特定の実施形態では、[24]に記載されるとおり、ギャップ化BLASTを使用することができる。BLAST-2、WU-BLAST-2([25]、ALIGN、ALIGN-2(Genentech社、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)、又はMegalign(DNASTAR)は、配列を整列させるために使用することができる、さらなる公的に利用可能なソフトウェアプログラムである。特定の実施形態において、2つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェア中のGAPプログラムを用いて(例えば、NWSgapdna.CMPマトリックス、並びに40、50、60、70、又は90のギャップウェイト及び1、2、3、4、5、又は6のレンスウェイトを用いて)決定される。特定の代替的実施形態において、Needleman及びWunschのアルゴリズム([26])を組み込むGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムを使用して、(例えば、Blossum 62マトリックス又はPAM250マトリックスのいずれか、並びに16、14、12、10、8、6、又は4のギャップウェイト及び1、2、3、4、5のレンスウェイトを用いて)、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定することができる。あるいは、特定の実施形態において、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Myers及びMillerのアルゴリズム([27])を用いて決定される。例えば、パーセント同一性は、ALIGNプログラム(バージョン2.0)を使用して、且つPAM120を残基表、ギャップ長ペナルティ12及びギャップペナルティ4で使用して決定することができる。特定のアラインメントソフトウェアによる最大アラインメントのための適切なパラメータは、当業者により決定され得る。特定の実施形態では、アライン
メントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
非限定的な例として、任意の特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドが、参照配列と特定のパーセント配列同一性を有する(例えば、少なくとも80％同一、少なくとも85％同一、少なくとも90％同一である、また一部の実施形態においては、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一である)か否かは、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package、Unix用バージョン8、Genetics Computer Group、ウィスコンシン州(WI 53711)、マジソン、サイエンスドライブ575、ユニバーシティリサーチパーク)などの公知の方法を用いて決定することができる。Bestfitは、Smith及びWatermanのローカルホモロジーアルゴリズム(Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981))を用いて、2つの配列間の相同性の最良のセグメントを見出す。Bestfit又は任意の他の配列アラインメントプログラムを用いて、特定の配列が、例えば、本発明による参照配列と95％同一であるか否かを決定する場合、パラメータは、同一性のパーセントが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、参照配列中のヌクレオチドの総数の最大5％のホモロジーにおけるギャップが許容されるように設定される。
一部の実施形態では、本発明の2つの核酸又はポリペプチドは実質的に同一であり、これは、上記の2つの核酸又はポリペプチドが、最大一致のために比較及び整列された場合に、配列比較アルゴリズムを用いて又は目視検査により測定して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、また一部の実施形態においては、少なくとも95％、96％、97％、98％、99％のヌクレオチド又はアミノ酸残基同一性を有することを意味している。同一性は、少なくとも約10、約20、約40～60残基長の、又はそれらの間の任意の整数値の配列の領域にわたって存在し得、また60～80残基より長い領域、例えば少なくとも約90～100残基にわたる可能性もあり、一部の実施形態では、配列は、例えばヌクレオチド配列のコーディング領域などの、比較される配列「の全長にわたって」実質的に同一である。
本明細書において、「～について番号付けされた」「～と比較して」、「～に従って番号付けされた」は、アミノ酸配列中の位置(location)について言及するために用いられるが、言及されるアミノ酸配列に限定されるものではない。従って、例えば、「配列番号140について番号付けされた残基I28」は、配列番号145のI29並びに配列番号163のI28を包含し得ることが理解されるであろう(以下に示される)。
Figure 2022513458000002
本明細書中で用いられる「宿主細胞」は、分子(通常は、異種の又は非ネイティブな核酸分子)が導入されるか、導入されたか、又は導入されるであろう細胞を指す。本明細書における宿主細胞は、ヒト生物全体を包含しない(すなわち、「単離された宿主細胞」)。
PglL
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST又はOTase)は、オリゴ糖を脂質キャリアから新生タンパク質へと転移させる膜埋め込み酵素(membrane-embedded enzyme)である(連続的作用によりオリゴ糖を構築する細胞質中のグリコシルトランスフェラーゼとは異なり、OTaseは、一括してグリカンをタンパク質に転移させる[2])。O-結合型グリコシル化は、糖分子(グリカン)の、タンパク質標的(例えば、ピリン)中のアミノ酸残基(例えば、セリン又はスレオニン)の側鎖ヒドロキシ基への共有結合からなる。例えば、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)由来のピリン-グリコシル化遺伝子L(PglL)タンパク質は、O-結合型グリコシル化に関与するOTaseである。グラム陰性細菌のペリプラズムにおいて、PglLは、グリカンをUnd-PP-グリカンからピリンタンパク質へと転移させる([1])。PglB(N-グリコシル化)とは異なり、PglLは、活性のために、還元末端のC-2位における2-アセトアミド基又は最初の2つの糖間のβ 1,4結合を必要とせず、このため実質的にあらゆるグリカンを転移させることができる(大腸菌細胞及びサルモネラ(Salmonella)細胞の両方において、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglLは、例えば、C.ジェジュニ(C. jejuni)七糖、大腸菌O7抗原、大腸菌K30莢膜構造、S.エンテリカ(S. enterica)O抗原、及び大腸菌O16ペプチドグリカンサブユニットを、ピリンに転移させる)([1]、[3]、[14]、[16])。従って、NmPglL及びそのホモログ、例えばナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)由来のPglL(「PglO」と呼ばれる、[6]及び[9])及び緑膿菌(シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))由来のPilO([15])は、基質「無差別性(promiscuous)」である(すなわち、これらは緩い基質特異性を有し、このため、多様なオリゴ糖及び多糖を転移させることができる)。[1]及び[14]([3]及び[16]を通して)。ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)ホモログは、本明細書中に記載されており(実施例を参照のこと)、当技術分野で公知である：([17]、[28]、[18])。
本明細書中の「PglL OTase」は、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL OTase並びにNmPglL OTaseホモログを包含する。従って、本明細書中の用語「PglL OTase」は、例えば、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)OTase、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)OTase、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)OTase、及びナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)OTaseを含む。
本明細書中で用いられる「PglLグリカン基質」、「PglL基質」は、PglL Otaseにより転移され得るグリカン(すなわち、PglLの基質であるグリカン)に対する言及である。[1]、[14]、[29]、[3]、[16]を参照のこと。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、脂質キャリアに結合する(「脂質キャリア結合PglLグリカン基質」)。特定の実施形態において、脂質キャリアは、ウンデカプレノールピロリン酸(UndPP)、ドリコールピロリン酸、又はそれらの合成等価物である。特定の実施形態において、脂質キャリアはUndPPである。特定の実施形態において、グリカンは、「UndPP-結合PglL基質」である。脂質キャリア結合グリカンは、グラム陰性宿主細胞中で膜結合していると考えられている。膜結合している脂質キャリア結合PglLグリカン基質は、「ペリプラズムに」位置しているということができる。特定の実施形態において、NmPglLグリカン基質、NgPglLグリカン基質、NlPglLグリカン基質、又はNsPglLグリカン基質は特定されている。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、グルコース、ガラクトース、ガラクトフラノース、ラムノース、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、デオキシHexNAc、diNAcBac、又はPseの還元末端を有するグリカンを含む。特定の実施形態において、グリカンは免疫原性である(例えば、「免疫原性PglLグリカン基質」)。特定の実施形態において、グリカンは、O抗原である(例えば、「PglL O抗原基質」)。[1]、[14]、[29]、[16]、[30]、[15]を参照のこと。
異種宿主細胞中のナイセリアの(Neisserial)PglLの組換え発現は、本明細書中に記載されており、また当技術分野により公知である([10]、[8]、[9]、[29](例えば、表1)、[11]、[1]、[14]、[5]、[3]、[31]を参照のこと；全て、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる)。
キャリアタンパク質
本明細書中で用いられる「キャリアタンパク質」は、バイオコンジュゲートワクチンの製造におけるキャリアタンパク質としての使用に好適なタンパク質を意味する(例えば、[32])。本明細書中で用いられる「キャリアタンパク質」は、「脂質キャリア」(又は「脂質結合キャリア」)とは異なり、脂質キャリア又は脂質結合型キャリアとしては、限定するものではないが、ウンデカプレニルピロリン酸(UndPP)などが挙げられる。
本明細書中で用いられる「修飾キャリアタンパク質」は、野生型と比較して(1つ以上の方法で)変更されているキャリアタンパク質を意味する(すなわち、「修飾キャリアタンパク質」は、野生型ピリンタンパク質を除外する)。修飾キャリアタンパク質としては、限定するものではないが、1つ以上のGlycoTag、精製タグ、欠失(例えば、膜貫通ドメインの少なくとも一部の)、挿入、及び/又は変異(例えば、AcrA変異(1つ又は複数)([33])を組み込むキャリアタンパク質などが挙げられる。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、対照キャリアタンパク質(例えば、野生型)と比較して、修飾キャリアタンパク質がPglLグリカン基質の「受容体」となり得るように変更されている(すなわち、PglLグリカン基質を、ピリン中間体を介することなくPglLから直接受容する)。特定の実施形態において、1つのこのような修飾キャリアタンパク質は、1つ以上のGlycoTagを含むことによって変更される。特定の実施形態において、1つのこのような修飾キャリアタンパク質は、そのN末端、C末端、及び/又は内部残基に1つ以上のGlycoTagを含む。明確性のため、「1つ以上のGlycoTagをそのN末端及び/又はC末端に有するキャリアタンパク質を含む修飾キャリアタンパク質」は、「そのN末端及び/又はC末端において1つ以上のGlycoTagに機能的に連結されているキャリアタンパク質を含む修飾キャリアタンパク質」を意味する。そのN末端及び/又はC末端において
特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、グリカンに、直接的に(例えば、O結合型グリコシド結合を介して)又は間接的に(例えば、リンカーを介して)共有結合しており、ここで結合は、1つ以上のGlycoTagにおける結合である。さらなる実施形態において、グリカンは、PglLグリカン基質である。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、シゲラ(Shigella)グリカン(例えば、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei)グリカン(例えば、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原)、又は、例えばシゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)グリカン(例えば、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS)、又はシゲラ・ジセンテリア(Shigella dysenteriae)グリカン)に結合している。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、ストレプトコッカス(Streptococcus)グリカン(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)14 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)23A CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)33F CPS、又は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)22A CPS))に結合している。
「O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質」は、修飾キャリアタンパク質がグリコシル化されており、特に、O-結合型グリコシル化に関わっている(例えば、PglLグリカン基質にO結合している修飾キャリアタンパク質)ことを意味する。
O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質は、2つ以上の異なる免疫原性グリカンに直接的に又は間接的に結合することが可能であり、このようにして、2つ以上の免疫原性グリカンに対する免疫応答又は抗体応答を誘導するのに役立ち得る(すなわち、多価である)。
例となるキャリアタンパク質としては、限定するものではないが、例えば緑膿菌の解毒外毒素A(「EPA」；例えば[4]を参照のこと)、CRM197、マルトース結合タンパク質(MBP)、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、破傷風毒素Cフラグメント(TTc)、S.アウレウス(S. aureus)の解毒溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大腸菌FirmH、大腸菌FirmHC、大腸菌易熱性エンテロトキシン、大腸菌易熱性エンテロトキシンの解毒変異体、コレラ毒素bサブユニット(CTB)、コレラ毒素、コレラ毒素の解毒変異体、大腸菌Satタンパク質、大腸菌Satタンパク質のパッセンジャードメイン、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)ニューモリシン及びその解毒変異体、C.ジェジュニ(C. jejuni)のアクリフラビン耐性タンパク質A(CjAcrA)、大腸菌のアクリフラビン耐性タンパク質A(EcAcrA)、緑膿菌PcrVタンパク質(PcrV)、C.ジェジュニ(C. jejuni)の天然糖タンパク質、S.ニューモニエ(S. pneumoniae)NOX、S.ニューモニエ(S. pneumoniae)PspA、S.ニューモニエ(S. pneumoniae)PcpA、S.ニューモニエ(S. pneumoniae)PhtD、S.ニューモニエ(S. pneumoniae)PhtE、S.ニューモニエ(S. pneumoniae)ply(例えば、解毒ply)、S.ニューモニエ(S. pneumoniae)LytB、インフルエンザ菌(ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae))タンパク質D(PD)などが挙げられる。[34]、[35]、[36]。特定の実施形態において、キャリアタンパク質は、CTB、TT、TTc、DT、CRM197、EPA、EcAcrA、CjAcrA、及びPcrVからなる群から選択される。特定の実施形態において、キャリアタンパク質は、EPA、EcAcrA、CjAcrA、及びPcrVからなる群から選択される。特定の実施形態において、キャリアタンパク質はEPAである。特定の実施形態において、キャリアタンパク質はEcAcrAである。
特定の実施形態において、キャリアタンパク質は、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)由来のタンパク質D(PD)、例えば、[37]の図9由来のタンパク質D配列である(図9a及び9bを合わせて364アミノ酸)。このタンパク質を免疫原性組成物中に含めると、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)関連中耳炎に対するあるレベルの保護を提供することができる([38])。タンパク質Dは、完全長タンパク質として使用してもよく、又はフラグメントとして使用してもよい(例えば、タンパク質Dは、[39]に記載されているとおりであり得る)。例えば、タンパク質D配列は、[37]に記載されているような、[37]の図9から19個のN末端アミノ酸が欠失しているタンパク質Dフラグメントを含み(又はこれらからなり)得、場合により前記タンパク質Dフラグメント(348アミノ酸)のN末端に融合したNS1由来のトリペプチドMDPを有し得る。一態様において、タンパク質D又はタンパク質Dのフラグメントは、脂質付加されていない。
一実施形態において、キャリアタンパク質はCRM197である。CRM197は、非毒性形態のジフテリア毒素であるが、ジフテリア毒素(DT)とは免疫学的に区別することができない。ジフテリア毒素の遺伝子的に解毒されたアナログとしては、CRM197、並びにUS 4,709,017、US 5,843,711、US 5,601,827、及びUS 5,917,017に記載されている他の変異体などが挙げられる。CRM197は、毒素産生性カリネファージbのニトロソグアニジン突然変異誘発により作製された非毒素産生段階のβ197tox-に感染したC.ジフテリアエ(C. diphtheriae)によって産生される([40])。CRM197タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子中の一塩基変化によってジフテリア毒素とは異なる。これは、52位におけるアミノ酸のグリシンからグルタミンへの変化をもたらし、この変化は、フラグメントAをNADに結合できないようにして、このため非毒性にする([41]、[42])。
一実施形態において、キャリアタンパク質は、破傷風トキソイド(TT)である。破傷風毒素は、1315個のアミノ酸残基からなる約150kDaの単一ペプチドである。破傷風毒素は、パパインにより切断されて2つのフラグメントを生じ得；そのうちの1つであるフラグメントCは、約50kDaである。TTのフラグメントCは、[43]に記載されている。
一実施形態において、キャリアタンパク質はdPly(解毒ニューモリシン(detoxified pneumolysin))である。ニューモリシン(Ply)は、明確な細胞溶解(溶血)活性及び補体活性化活性を有する多機能毒素である([44])。この毒素は、肺炎球菌により分泌はされないが、自己溶解酵素の影響下における肺炎球菌の溶解で放出される。その作用としては、例えば、ヒト単球による炎症性サイトカインの産生の刺激、ヒト呼吸器上皮上の繊毛の拍動の阻害、殺菌活性及び好中球の遊走の低減、またコレステロールへの結合を伴う赤血球の溶解における作用などが挙げられる。ニューモリシン(Ply)は毒素であるため、in vivoで投与され得る前に解毒される(すなわち、保護に適した用量(dosage)で提供される場合にヒトに対して非毒性にする)ことが必要である。野生型又はネイティブのニューモリシンの発現及びクローニングは、当技術分野で公知である。例えば、[45]、[46]、及び[47]を参照のこと。Plyの解毒は、化学手段により、例えば、ホルマリン処理若しくはグルタルアルデヒド処理、又はその両方の組み合わせに供することによって行うことができる([48]、[49])。このような方法は、様々な毒素について、当技術分野で公知である。あるいは、Plyは、遺伝子的に解毒することができる(Plyは、生物学的には不活性であるが、その免疫原性エピトープを依然として維持するように変更される)。例えば、[50]、[51]、及び[52]。本明細書中で使用されるとおり、用語「Ply」は、医薬用途に適した(すなわち非毒性の)変異ニューモリシン及び解毒ニューモリシン(dPly)を包含することが理解される。
キャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートの製造のため、キャリアタンパク質をコードする核酸を宿主細胞中に導入することができる。グラム陰性細菌内でのin vivoバイオコンジュゲーションにおいて使用するため、キャリアタンパク質は、ペリプラズム内に位置する。キャリアタンパク質は、ペリプラズムシグナル配列の使用により、ペリプラズムを標的とし得る。ペリプラズムシグナル配列の構造及び使用(それらの切断、コドン最適化、及び異種タンパク質への組換え結合を含む)は、当技術分野で公知である。例えば、[53]、[54]、[5]、及び[34]を参照のこと。コドン最適化もまた、一般的には、当技術分野において周知であり、別段(実施例を含む)に記載されない限り、本発明の任意の組換え発現のためにコドン最適化が利用されることが想定される。例えば、[55]、[56]、[57]、[58]、[59]、及び[60]を参照のこと。
シグナル配列(ペリプラズムシグナル配列を含む)は、通常、タンパク質の、例えばペリプラズムへの移行の間に、シグナルペプチダーゼによって除去される(すなわち、成熟タンパク質は、そこから少なくともシグナル配列が除去されているタンパク質である)。「ペリプラズムを標的とする」は、本明細書中で、シグナル配列が通常は除去されていることを認めるために使用される。このように、「ペリプラズムを標的とする」タンパク質は、ペリプラズムシグナル配列に機能的に連結されたタンパク質と、ペリプラズムシグナル配列が既に除去されている成熟タンパク質の両方を含む。
ペリプラズムシグナル配列は、当技術分野で周知である。特定の実施形態において、ペリプラズムシグナルは、エルウィニア・カロトボランス(Erwinia carotovorans)ペクチン酸リアーゼB(pelB)、大腸菌外膜ポリンA(OmpA)、大腸菌ジスルフィドオキシドレダクターゼ(DsbA)、大腸菌Tol-Pal細胞エンベロープ複合体(TolB)、大腸菌マルトース結合タンパク質サブユニット(MalE)、大腸菌フラジェリン(Flgl)、易熱性エンテロトキシン(LtIIb)(例えば、大腸菌LtIIb)、SipA(例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)SipA、クロストリジウム・アシデュリシ(Clostridium acidurici)SipA、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)SipA)、大腸菌ニッケル結合タンパク質NikA(NikA)、バチルス種(Bacillus sp.)エンドキシラナーゼ(XynA)、大腸菌熱安定性エンテロトキシンII(STII)、又は大腸菌アルカリホスファターゼサブユニット(PhoA)のペリプラズムシグナルである。[5]。特定の実施形態において、ペリプラズムシグナル配列は、PelB、OmpA、DsbA、TolB、又はMalEである。特定の実施形態において、ペリプラズムシグナル配列はDsbAである。
特定の実施形態において、キャリアタンパク質は、「タグ(tag)」すなわち、キャリアタンパク質の検出、単離及び/又は同定を可能とするアミノ酸の配列を含む。例えば、キャリアタンパク質にタグを付加することは、そのタンパク質の精製、また従って、タグ化されたキャリアタンパク質を含むバイオコンジュゲートの精製において有用であり得る。本明細書において使用し得る例示的なタグとしては、限定するものではないが、ヒスチジン(HIS)タグ(例えば、ヘキサヒスチジンタグ、又は6XHis-Tag)、FLAG-TAG及びHAタグ、さらにまたstrepタグ、mycタグ、又はそれらの組み合わせなどが挙げられる。特定の実施形態において、本明細書中で使用されるタグは除去可能であり、例えば、タンパク質が精製された後など、これらがもはや必要ではなくなると、化学剤により又は酵素的手段によって除去される。
本明細書中で用いられる「精製タグ」は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び/又はアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製を補助するリガンドを指す。精製タグ及びそれらの使用は当技術分野で周知であり(例えば、[61]、[62]を参照のこと)、例えば、ポリ-ヒスチジン(HIS)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、c-Myc(Myc)、ヘマグルチニン(HA)、FLAG、又はマルトース結合タンパク質(MBP)であり得る。特定の実施形態において、精製タグは、エピトープタグである(エピトープタグとしては、例えば、ヒスチジン、FLAG、HA、Myc、V5、緑色蛍光タンパク質(GFP)、GSK、β-ガラクトシダーゼ(b-GAL)、ルシフェラーゼ、マルトース結合タンパク質(MBP)、又は赤色蛍光タンパク質(RFP)タグが挙げられる)。特定の実施形態において、ポリペプチドは、1つ以上の精製タグ(精製タグの組み合わせを含む)に機能的に連結されている。従って、タンパク質を精製、回収、取得又は単離するステップは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーを含み得る。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質(又はそれを含むコンジュゲート)を精製するステップは、アフィニティークロマトグラフィー及び、例えば、σ28アフィニティーカラム、又は修飾キャリアタンパク質又はそれを含むコンジュゲートに(場合によりグリカンに結合することによって)結合する抗体を含むアフィニティーカラムを利用する。特定の実施形態において、少なくとも精製タグに機能的に連結された修飾キャリアタンパク質を含む融合タンパク質を精製するステップは、アフィニティークロマトグラフィー及び、例えば、精製タグに結合するアフィニティーカラムを利用する。
GlycoTag(糖タグ)
本明細書中で用いられる「GlycoTag」は、組換えのO結合型グリコシル化部位であり、ピリンアミノ酸配列のフラグメントからなる。このように、用語「GlycoTag」は、組換えアミノ酸配列(すなわち、野生型ピリンから分離されたアミノ酸配列)を指すために用いられるのに対して、「シークオン」は、野生型ピリン内に位置する(すなわち、野生型ピリンから分離されていない)同じ配列を指すために使用することができる。
1つのキャリアタンパク質中の複数のGlycoTagの使用が想定され(実施例を参照のこと)、場合により、複数のGlycoTagは互いに隣接している。2つ以上のGlycoTagは、1つ以上のアミノ酸からなる「アミノ酸リンカー」により分離されていてよく、このリンカーは、例えば、1つ以上のグリシン([63])、1つ以上のセリン、及び/又はそれらの組み合わせ([64]を参照)であり得る。本明細書中の「アミノ酸リンカー」は、「リンカー」の1種である。
キャリアタンパク質のN末端又はC末端に位置するGlycoTagのO-グリコシル化効率は、GlycoTagに、1つ以上の「隣接ペプチド」(例えば、DPRNVGGDLD(配列番号1の残基599～608)又はQPGKPPR(配列番号1の残基628～634)などの親水性アミノ酸を含むペプチド)を隣接させる(すなわち、GlycoTagのN末端に向かって及び/又はC末端に向かって配置する)ことによって高めることができる。[3]。このような隣接ペプチドは、GlycoTagに隣接していてもよく(すなわち、GlycoTagと隣接ペプチドとの間にアミノ酸が存在しない)、又は、隣接ペプチドとGlycoTagとの間に1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸を有していてもよい。2つ以上の隣接ペプチドの挿入を使用し得る。隣接ペプチドは、配列番号142、147、151又は164の配列(全て12アミノ酸長)を有するGlycoTagのような、比較的短いGlycoTagのO-グリコシル化効率を高めるために使用することができる。
本明細書における親水性アミノ酸は、アルギニン(R)、リジン(K)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)、ヒスチジン(H)、セリン(S)、スレオニン(T)、チロシン(Y)、システイン(C)及びトリプトファン(W)を含む。
グリカン
グリカンは、キャリアタンパク質に転移(例えば、共有結合)させることができる任意の糖である。グリカンは、単糖、オリゴ糖及び多糖を含む。オリゴ糖は、2～10個の単糖を有するグリカンである。多糖は、10個超の単糖を有するグリカンである。多糖は、O抗原、莢膜、及び菌体外多糖からなる群から選択することができる。
本発明による使用のためのグリカンは、PglL Otase基質である。[1]、[14]、[29]、[16]、[30]、及び[15]。特定の実施形態において、グリカンは、脂質キャリアに機能的に連結されている。特定の実施形態において、グリカンは、限定するものではないが、ヘキソース、ヘキソースのN-アセチル誘導体、オリゴ糖、及び多糖であり得る。特定の実施形態において、グリカンの還元末端における単糖は、ヘキソース又はヘキソースのN-アセチル誘導体である。特定の実施形態において、グリカンは、その還元末端に、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノトール、フコース又はマンノースなどのヘキソース単糖を含む。特定の実施形態において、還元末端におけるヘキソース単糖は、グルコース又はガラクトースである。特定の実施形態において、グリカンの還元末端は、ヘキソースのN-アセチル誘導体である。一般的には、ヘキソースのN-アセチル誘導体(又は「ヘキソース単糖誘導体」)は、2位にアセトアミド基を含む。特定の実施形態において、ヘキソースのN-アセチル誘導体は、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルヘキソサミン(HexNAc)、デオキシHexNAc、及び2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、N-アセチルフコサミン(FucNAc)、及びN-アセチルキノボサミン(QuiNAc)から選択される。特定の実施形態において、ヘキソースのN-アセチル誘導体は、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、N-アセチルフコサミン(FucNAc)、2,4-ジアセトアミド-2,4,6-トリデオキシヘキソース(DATDH)、グリセラミド-アセトアミドトリデオキシヘキソース(GATDH)及びN-アセチルヘキソサミン(HexNAc)から選択される。特定の実施形態において、グリカンは、N,N-ジアセチルバシロサミン(diNAcBac)又はプソイダミン酸(Pse)の還元末端を有する。特定の実施形態において、グリカンは、グルコース、ガラクトース、アラビノトール、フコース、マンノース、ガラクトフラノース、ラムノース、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、デオキシHexNAc、QuiNAc、diNA
cBac、又はPseの還元末端を有するグリカンである。特定の実施形態において、グリカンは、グルコース、ガラクトース、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、デオキシHexNAc、又はdiNAcBacの還元末端を有するグリカンである。特定の実施形態において、グリカンは、グルコース、ガラクトース、ガラクトフラノース、ラムノース、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、又はdiNAcBacの還元末端を有するグリカンである。特定の実施形態において、グリカンは、グルコース、ガラクトース、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、又はdiNAcBacの還元末端を有するグリカンである。特定の実施形態において、グリカンは、DATDH、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、ガラクトース、及びグルコースからなる群から選択される還元末端を有するグリカンである。特定の実施形態において、グリカンは、還元末端GlcNAc、GalNAc、FucNAc、又はグルコースを有するグリカンである。特定の実施形態において、グリカンは、ガラクトース-β1,4-グルコース、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ガラクトース-β1,4-グルコース、ラムノース-β1,4-グルコース、ガラクトフラノース-β1,3-グルコース、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンのS-2からS-1への還元末端を有するグリカンである。
特定の実施形態において、グリカンは、ナイセリア(Neisseria)細胞、シゲラ(Shigella)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、ストレプトコッカス(Streptococcus)細胞、エシェリキア(Escherichia)細胞、シュードモナス(Pseudomonas)細胞、エルシニア(Yersinia)細胞、カンピロバクター(Campylobacter)細胞、又はヘリコバクター(Heliobacter)細胞に内在性のものである。特定の実施形態において、グリカンは、シゲラ(Shigella)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、エシェリキア(Escherichia)細胞、又はシュードモナス(Pseudomonas)細胞に内在性のものである。特定の実施形態において、グリカンは、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)細胞、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)細胞、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)細胞、又は大腸菌細胞に内在性のものである。特定の実施形態において、グリカンは、C.ジェジュニ(C. jejuni)、N. メニンギティディス(N. meningitidis、髄膜炎菌)、P.エルギノーサ(P. aeruginosa、緑膿菌)、S.エンテリカ(S. enterica)LT2、又は大腸菌(E. coli)に由来する。[3]、[29]、[1]、[14]を参照のこと。
特定の実施形態において、グリカンは免疫原性グリカン(抗原)である。特定の実施形態において、グリカンはO抗原である。特定の実施形態において、グリカンは、ナイセリア(Neisseria)細胞、シゲラ(Shigella)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、ストレプトコッカス(Streptococcus)細胞、エシェリキア(Escherichia)細胞、シュードモナス(Pseudomonas)細胞、エルシニア(Yersinia)細胞、カンピロバクター(Campylobacter)細胞、又はヘリコバクター(Heliobacter)細胞に内在性の免疫原性O抗原である。さらなる実施形態において、PglLグリカン基質は、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei)グリカン抗原(例えば、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)グリカン抗原(例えば、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)2a CPS)、シゲラ・ジセンテリア(Shigella dysenteriae)グリカン抗原、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカン抗原(例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ種(Streptococcus pneumoniae sp.)12F CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)8 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)14 CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)23A CPS、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)33F CPS、又は、S. ニューモニエ種(S. pneumoniae sp.)22A CPS)である。特定の実施形態において、グリカンは、グルコース、ガラクトース、アラビノトール、フコース、マンノース、ガラクトフラノース、ラムノース、GlcNAc、GalNAc、FucNAc、DATDH、GATDH、HexNAc、デオキシHexNAc、QuiNAc、diNAcBac、又はPseの還元末端を有するストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカンである。特定の実施形態において、グリカンは、ガラクトース-β1,4-グルコース、グルクロン酸-β1,4-グルコース、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン、ガラクトース-β1,4-グルコース、ラムノース-β1,4-グルコース、ガラクトフラノース-β1,3-グルコース、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミン、又はラムノース-β1,4-N-アセチルガラクトサミンのS-2からS-1への還元末端を有するグリカンである、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカンである。全90個のS. ニューモニエ(S. pneumoniae)血清型のCP遺伝子クラスターは、Sanger Institute (http://WorldWideWeb(www).sanger.ac.uk/Projects/S_pneumoniae/CPS/)により配列決定されている。配列は、Genbank CR931632-CR931722としてNCBIに提供されている。S. ニューモニエ(S. pneumoniae)の莢膜生合成遺伝子はさらに、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)株1196/45(血清型23a)由来の血清型23Aにおいて、NCBI GenBank受託番号CR931683.1として記載されている。ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)株1039/41由来の血清型23Bは、NCBI GenBank受託番号CR931684.1として記載されている。ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)株Dr. Melchior由来の血清型23Fは、NCBI GenBank受託番号CR931685.1として記載されている。
特定の実施形態において、グリカンは、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原である。特定の実施形態において、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原は、wbgTタンパク質、wbgUタンパク質、wzxタンパク質、wzyタンパク質、wbgVタンパク質、wbgWタンパク質、wbgXタンパク質、wbgYタンパク質、及びwbgZタンパク質からなる。特定の実施形態において、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原は、配列番号108と少なくとも90％同一性を有するwbgTタンパク質、配列番号109と少なくとも90％同一性を有するwbgUタンパク質、配列番号110と少なくとも90％同一性を有するwzxタンパク質、配列番号111と少なくとも90％同一性を有するwzyタンパク質、配列番号112と少なくとも90％同一性を有するwbgVタンパク質、配列番号113と少なくとも90％同一性を有するwbgWタンパク質、配列番号114と少なくとも90％同一性を有するwbgXタンパク質、配列番号115と少なくとも90％同一性を有するwbgYタンパク質、及び配列番号116と少なくとも90％同一性を有するwbgZタンパク質からなる。
これらの利用
コンジュゲーション
本明細書に示されるとおり、修飾キャリアタンパク質は、バイオコンジュゲーションのために使用することができる。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、グラム陰性細菌宿主細胞内のin vivoバイオコンジュゲーションのために使用することができる。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、修飾キャリアタンパク質を、ナイセリア属の(Neisserial)PglL及びPglLグリカン基質と共に、場合により好適なバッファー中でインキュベートすることによるコンジュゲート製造のために使用することができる。
In vivoバイオコンジュゲーション
特定の実施形態において、O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質は、in vivoの方法及び系を用いて製造される。特定の実施形態において、O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質(又はバイオコンジュゲート)が作製され、その後宿主細胞のペリプラズムから単離される。本発明のin vivoコンジュゲーション(「バイオコンジュゲーション」)は、グラム陰性細菌細胞中の組換えタンパク質発現及び上記細胞からの単離のための公知の方法論を利用し、この方法論は、配列の選択及び最適化、ベクター設計、プラスミドのクローニング、培養パラメータ、及びペリプラズム精製技術を含む。例えば、[65]、[3]、[5]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[1]、[14]、[4]、[63]、及び[31]を参照のこと。宿主細胞を用いたバイオコンジュゲートの製造方法は、例えば、[66]及び[67]に記載されている。バイオコンジュゲーションは、バイオコンジュゲーションが製造のために必要とする化学薬品が少なく、生成される最終製品についてより一貫性があるという点において、in vitroの化学的コンジュゲーションを上回る利点を提供する。
本発明により使用するためのグラム陰性細菌細胞としては、限定するものではないが、ナイセリア(Neisseria)属、シゲラ(Shigella)属、サルモネラ(Salmonella)属、エシェリキア(Escherichia)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、エルシニア(Yersinia)属、カンピロバクター(Campylobacter)属、ビブリオ(Vibrio)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、又はヘリコバクター(Heliobacter)属に由来する細胞などが挙げられる。特定の実施形態において、宿主細胞は、ナイセリア(Neisseria)細胞、シゲラ(Shigella)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、エシェリキア(Escherichia)細胞、シュードモナス(Pseudomonas)細胞、エルシニア(Yersinia)細胞、カンピロバクター(Campylobacter)細胞、及びヘリコバクター(Heliobacter)細胞からなる群から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、シゲラ(Shigella)細胞、サルモネラ(Salmonella)細胞、及びエシェリキア(Escherichia)細胞からなる群から選択される。一実施形態において、グラム陰性細菌細胞は、ナイセリア属種(Neisseria ssp.)細胞、シゲラ属種(Shigella ssp.)細胞、サルモネラ属種(Salmonella ssp.)細胞、エシェリキア属種(Escherichia ssp.)細胞、シュードモナス属種(Pseudomonas ssp.)細胞、エルシニア属種(Yersinia ssp.)細胞、カンピロバクター属種(Campylobacter ssp.)細胞、ビブリオ属種(Vibrio ssp.)細胞、クレブシエラ属種(Klebsiella ssp.)細胞、又はヘリコバクター属種(Helicobacter ssp.)細胞として分類される。グラム陰性細菌宿主細胞は、ナイセリア・エロンガタ(Neisseria elongata)以外のナイセリア属種(Neisseria ssp.)の細胞として分類され得る。さらなる実施形態において、グラム陰性細菌細胞は、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)細胞、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)細胞、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)細胞、大腸菌細胞、又はシュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)細胞である。一実施形態において、宿主細胞は、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)細胞、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)細胞、及び大腸菌細胞からなる群から選択される。特定の実施形態において、宿主細胞は、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞は、大腸菌細胞である。一実施形態において、グラム陰性細菌細胞は、大腸菌株K12、Top10、W3110、CLM24、BL21、SCM6又はSCM7に由来する。特定の実施形態において、宿主細胞は、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞は、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)細胞である。一実施形態において、グラム陰性細菌細胞は、S.エンテリカ(S. enterica)株SL3261、SL3749、SL326iδwaaL、又はSL3749に由来する。特定の実施形態において、宿主細胞は、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)細胞である。特定の実施形態において、宿主細胞は、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)細胞である。例えば表1における[10]、[8]、[9]、[29]、及び[11]；[3]、[31]、[5]、[1]、[14]を参照のこと。
特定の実施形態において、グラム陰性細菌細胞は、細胞の内在性(ペリプラズム性)O抗原リガーゼ(又は「内在性PglLホモログ」)が、対照(例えば、野生型)と比較して、発現又は機能が低下しているか(欠失若しくは「ノックダウン」)、若しくはノックアウト(KO)されるように改変されている。特定の実施形態において、「内在性PglLホモログの低下」又は「内在性PglLホモログが低下している」は、低下(例えば、ノックダウン)を意味するために用いられ、これらは、内在性PglLホモログの発現又は機能のノックアウトを包含する。このように、本発明のグラム陰性細菌細胞は、その内在性PglLホモログを欠失し得る。例えば、大腸菌のWaaL遺伝子及びサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)のWaaL遺伝子は、N. メニンギティディス(N. meningitidis)PglLの機能的ホモログである。([17]、[28]、及び[68])。従って、例えば、本発明により使用するためのエシェリキア(Escherichia)宿主細胞又はサルモネラ(Salmonella)宿主細胞は、WaaLの発現又は機能が、少なくとも対照(場合により野生型)のエシェリキア(Escherichia)細胞又はサルモネラ(Salmonella)細胞と、本質的に同一の条件下で比較して低下するように改変されていることが想定される。特定の実施形態において、宿主細胞の内在性PglL遺伝子(例えば、waaL遺伝子)は、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列により置換されている。内在性PglLホモログをノックダウン又はノックアウトするための技術は公知であり、例えば、内在性PglLホモログをコードする遺伝子の変異又は欠失などが挙げられる。実施例及び、例えば[3]を参照のこと；また[18]も参照のこと。
本発明の宿主細胞は、細胞質ゾルにおけるオリゴ糖の連続的構築のため、内在性又は異種のグリコシルトランスフェラーゼ(細胞質のグリコシルトランスフェラーゼ)を利用することができる。このようなグリコシルトランスフェラーゼとしては、例えば、図1及び[2]に示されるナイセリア(Neisseria)のPglD、PglC、PglB/PglB2、及びPglAなどが挙げられる(特にナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)については[103]も参照、また特にナイセリア・エロンガタ(Neisseria elongata)については[104]も参照)。用語「グリコシルトランスフェラーゼ」は、本明細書中で、当技術分野により使用されるとおりに用いられ、「ホスホグリコシルトランスフェラーゼ」と呼び得るもの(例えば、ナイセリアの(Neisserial)PglB[103])を包含する。グラム陰性細菌宿主細胞は、異種の(例えば、細菌の又はグラム陰性細菌の)グリコシルトランスフェラーゼを含むように改変することが可能であり、場合により野生型と比較して低下した内在性グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、対応する内在性グリコシルトランスフェラーゼの発現の低下)を含むようにさらに改変され得る。本発明の宿主細胞は、その内在性グリコシルトランスフェラーゼが標的グリカンを産生するという理由で選択されてもよく、又は、本発明の宿主細胞は、標的グリカンを構築する異種グリコシルトランスフェラーゼ(1つ又は複数)を発現するように操作されていてもよい(場合により、宿主細胞が対応する内在性グリコシルトランスフェラーゼ(1つ又は複数)を発現しないようにさらに改変される)。このような異種グリコシルトランスフェラーゼは、そのグリコシルトランスフェラーゼが標的グリカン構造を構築する限り、その由来元により限定されない。活性化糖供与体、及びそれらの輸送体若しくは受容体もまた存在する。標的グリカン構築のためのグリコシルトランスフェラーゼの選択及び宿主細胞操作は、一般的であり、当技術分野で周知である([105]、[106])。実際、「個々の[グリコシルトランスフェラーゼ]酵素の役割を予測し、それらを特定の経路に割り当てるための十分な知識が存在し、特定のグリカンを特定のグリココンジュゲート上に生成するために必要とされる[グリコシルトランスフェラーゼ]酵素レパートリーのin silico 予測を可能とする」[106]。また公的に利用可能なツールも存在し、これにより当業者は、特定の機能を有するグリコシルトランスフェラーゼを検索する(すなわち、標的グリカン合成反応を検索する)ことにより(例えば、Carbohydrate Active EnZYmesデータベースWorldWideWeb.cazy.org/GlycosylTransferases)、及び/又は標的グリカンの構造ベースの検索によって(例えば、Bacterial Carbohydrate Structure DataBase (csdb.glycoscience.ru/bacterial)、ここには検索されるグリカン構造について、以前に公開されていた場合、グリコシルトランスフェラーゼの情報が提供されている)、標的グリカンを構築することができるグリコシルトランスフェラーゼを同定することできる。
「O-グリコシル化機構」は、当技術分野で周知の、O-グリコシル化のための分子(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、フリッパーゼ、ポリメラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(遺伝子クラスター及びオルガネラを含む))、及び工程について総称的に言及するために用いられる。例えば、[69]、[3]、[5]、[31]、[10]、[8]、[9]、[29]、[11]を参照のこと。特定の実施形態において、グラム陰性細菌宿主細胞は、宿主細胞に対して内在性、異種、又はそれらの組み合わせの、O-グリコシル化機構を含む。さらなる実施形態において、グラム陰性細菌宿主細胞は、細胞の内在性PglL又はPglLホモログが対照と比較して低下しているという条件で、O-グリコシル化機構を含む。さらなる実施形態において、グラム陰性細菌宿主細胞は、細胞の内在性PglL又はPglLホモログが対照と比較して低下しているという条件で、内在性O-グリコシル化機構を含む。特定の実施形態において、大腸菌(E. coli)又はS.エンテリカ(S. enterica)グラム陰性宿主細胞は、細胞のPglLホモログWaaLが対照と比較して低下しているという条件で、内在性O-グリコシル化機構を含む。
この場合も先と同様に、コドン最適化は当技術分野で周知であり、別段(実施例を含む)に記載されない限り、コドン最適化が本発明の任意の組換え発現のために利用されることが想定される。
本発明のトランスジーンの発現は、例えばプロモーターを含む転写制御エレメント(TCE)の制御下にあり得る。特定の実施形態において、トランスジーンは、ある特定の外部刺激、例えば、限定するものではないが、テトラサイクリンなどの抗生物質、エクジソンなどのホルモン、又は重金属に曝された場合にのみ転写を開始する構成的プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下にある。プロモーターはまた、特定の細胞型、組織又は器官に特異的でもあり得る。多くの好適なプロモーター及びエンハンサーが当技術分野で公知であり、任意のこのような好適なプロモーター又はエンハンサーは、本発明のトランスジーンの発現のために使用することができる。本発明により使用するためのプロモーターは公知であり、例えば、限定するものではないが、ParaBAD、アラビノース、tac-プロモーター(Ptac)及び構成的プロモーター(ネイティブな構成的プロモーターを含む)などが挙げられる。([4]；[10]、[8]、[9]、[29]、[11]も参照)。特定の実施形態において、プロモーターは、ParaBADプロモーター又はアラビノースプロモーターである。
グラム陰性細菌細胞中への核酸分子の組み込みは、任意の数の当技術分野で公知の技術を用いて実施することが可能であり、例えば、宿主細胞中への核酸分子又はベクターの安定なトランスフェクション又は形質転換のための技術などが挙げられる。上記に引用されている参考文献、及び[70]に列挙及び記載されている技術を参照のこと。組換え核酸は、エレクトロポレーション、ヒートショックによる化学的形質転換、自然形質転換、ファージトランスダクション、及びコンジュゲーションなどの方法を用いて、本発明の宿主細胞中に導入することができる。特定の実施形態において、組換え核酸は、プラスミドを用いて宿主細胞中に導入される(例えば、組換え核酸は、発現ベクターなどのプラスミドにより宿主細胞中で発現される)。別の実施形態において、組換え核酸は、[71]に記載されている挿入方法を用いて宿主細胞中に導入される。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼ、修飾キャリアタンパク質、PglL Otase、又はPglLグリカン基質を組み込むグラム陰性細菌細胞は、当技術分野で公知の様々な方法を用いて増殖させることが可能であり、例えば、ブロス培養液中で増殖させることができる。上記細胞により製造された修飾キャリアタンパク質又はO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質は、当技術分野で公知の様々な方法、例えば、レクチンアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離することができる([1])。
O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質は、(宿主細胞不純物及び非グリコシル化キャリアタンパク質を除去するために)精製することが可能であり、場合により当技術分野で公知の技術により特性決定することができる(例えば、[4]、[72]を参照；また[10]、[8]、[9]、[29]、及び[11]も参照のこと)。バイオコンジュゲートの精製は、細胞溶解(例えば、1つ以上の遠心分離ステップを含む)、その後の1つ以上の単離ステップ(例えば、1つ以上のクロマトグラフィーステップ、あるいは、分画(fractionation)ステップ、溶解度差ステップ、遠心分離ステップ、及び/又はクロマトグラフィーステップの組み合わせを含む)であり得る。前記1つ以上のクロマトグラフィースステップは、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アニオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、及び/又はサイジングカラムクロマトグラフィー、例えば、Ni2+アフィニティークロマトグラフィー及び/又はサイズ排除クロマトグラフィーを含み得る。特定の実施形態において、1つ以上のクロマトグラフィースステップは、イオン交換クロマトグラフィーを含む。その結果、1つ以上の精製ポリペプチドが、タグ(精製タグ)に機能的に連結され得る。例えば、アフィニティーカラムIMAC(固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー)を使用して、ポリ-ヒスチジンタグをキャリアタンパク質に機能的に連結させて結合し、その後アニオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行うことができる。例えば、バイオコンジュゲートの精製は、浸透圧ショック抽出とそれに続くアニオン性クロマトグラフィー及び/又はサイズ排除クロマトグラフィーによるものであってもよく([7])、又は浸透圧ショック抽出とそれに続くNi-NTAアフィニティークロマトグラフィー及びフルオロアパタイトクロマトグラフィー([4])によるものであってもよい。
In vitro コンジュゲーション
O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質をin vitroで製造するため、PglL OTaseを、修飾キャリアタンパク質及びPglLグリカン基質と共に、例えばバッファー中でインキュベートすることができる。特定の実施形態において、上記バッファー(bugger)は、約6～約8のpHを有する。一態様において、バッファーは、リン酸バッファー生理食塩水であり得る。別の態様において、バッファーは、7.5のpHを有するTris-HCl 50mMであり得る。
特定の実施形態において、公知のプロトコルを使用する化学的コンジュゲーションが用いられる(例えば、[73]、[74]、[75])。これにより、グリカンを(直接的に又はリンカーを介して)修飾キャリアタンパク質のアミノ酸残基に共有結合させることができる。本明細書において、「直接結合した(Directly linked)」は、2つの実体が化学結合、例えば共有結合を介して結合していることを意味する。本明細書において、「間接的に結合した(Indirectly linked)」は、2つの実体が連結部分(linking moiety)(「リンカー」)(直接共有結合の対語として)を介して結合していることを意味する。特定の実施形態において、上記の連結部分(linking moiety)は、アジピン酸ジヒドラジドである。特定の実施形態において、PglLグリカン基質は、カルボジイミド化学、還元的アミノ化(reductive animation)、シアニル化化学(例えばCDAP化学)、マレイミド化学、ヒドラジド化学、エステル化学、及びN-ヒドロキシスクシンイミド化学からなる群から選択される化学的コンジュゲーション法を用いて得ることができる化学的結合を通して、修飾キャリアタンパク質に(直接的に又はリンカーを介して)共有結合している。コンジュゲートは、[76]、[77]に記載されている直接還元的アミノ化法により調製することができる。他の方法は、[78]、[79]、[80]に記載されている。あるいは、上記のコンジュゲーション法は、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)によるグリカンの活性化に依存して、シアン酸エステルを形成する。このようなコンジュゲートは、[81]、[82]、[83]に記載されている。[84]も参照のこと。
グリコシル化タンパク質(すなわち、コンジュゲート)は、その後、当技術分野で公知の技術により精製することが可能であり、また場合により特性決定することができる(例えば、[4]、[72]を参照；[8]、[9]、[10]、[11]も参照のこと)。
コンジュゲート
本発明のO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質は、多数の疾患の治療のための治療剤として使用することが可能であり、この場合、有効量のO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質が、かかる治療を必要とする対象に投与される。また本発明のO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質は、有効量のO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質が、かかる治療を必要とする対象に投与される場合、疾患の予防のためのワクチンとして又は免疫原性組成物中で使用することもできる。従って、多数の異なるO-グリコシル化修飾キャリア(crrier)タンパク質を製造するための本明細書中に記載される方法は、ワクチン学において極めて有用であることがわかるであろう。
「均一性(Homogeneity)」とは、グリカンの長さ、及び場合により(possibly)グリコシル化部位の数のばらつき(variability)を意味する。上記に列挙される方法は、この目的のために使用することができる。SE-HPLCは、流体力学半径の測定を可能とする。上記キャリア中のグリコシル化部位の数が多いほど、グリコシル化部位がより少ないキャリアと比較して流体力学半径のばらつきは大きくなる。しかしながら、単一グリカン鎖が分析される場合、それらは、より制御された長さのため、より均一となり得る。グリカン長は、ヒドラジン分解、SDS PAGE、及びCGEにより測定される。さらに、均一性は、特定のグリコシル化部位の使用パターンがより広い範囲/より狭い範囲へと変化することも意味し得る。これらの因子は、糖ペプチドLC-MS/MSによって測定することができる。
「バイオコンジュゲート均一性」は、結合した糖残基の均一性を意味し、これはグリカン長及び流体力学半径を測定する方法を用いて評価することができる。
「収量」は、制御され且つ最適化された条件下のバイオリアクター中で増殖させた1リットルの細菌性生産培養液から生じる糖量(carbohydrate amount)として測定される。バイオコンジュゲートの精製後、アントロンアッセイ又は糖特異的抗血清を用いるELISAのいずれかにより、糖収量を直接測定することができる。間接的測定は、タンパク質量(BCA、Lowry、又はブラッドフォード(bardford)アッセイにより測定される)並びにグリカンの長さ及び構造を用いて、タンパク質1グラム当たりの理論糖量を計算することによって可能である。さらに、収量は、揮発性バッファーから糖タンパク質調製物を乾燥させ、天秤を使用して重量を測定することによって測定することもできる。
分析方法
本発明のグリカン及びコンジュゲートを分析するために様々な方法を使用することが可能であり、例えば、SDS-PAGE又はキャピラリーゲル電気泳動などが挙げられる。O抗原ポリマーの長さは、直線状に構築される反復単位の数によって規定される。これは、典型的な梯子様パターンが、グリカンを構成する様々な反復単位数の結果であることを意味する。従って、SDS PAGE(又はサイズで分離する他の技術)において互いに隣り合う2つのバンドは、単一の反復単位のみで異なる。これらの個別の差は、グリカンのサイズについて糖タンパク質を分析する場合に利用される：異なるポリマー鎖長を有する非グリコシル化キャリアタンパク質とバイオコンジュゲートは、それらの電気泳動移動度に従って分離する。バイオコンジュゲート上に存在する第1の検出可能な反復単位数(n1)及び平均反復単位数(naverage)が測定される。これらのパラメーターを用いて、例えば、バッチ間の一貫性又は多糖安定性を実証することができる。
別の実施形態において、完全バイオコンジュゲートのサイズを測定するために、高質量MS及びサイズ排除HPLCが適用され得る。
別の実施形態において、アントロン-硫酸アッセイを使用して、多糖収量を測定することができる。[85]を参照のこと。別の実施形態において、メチルペントースアッセイを使用して、多糖収量を測定することができる。例えば、[86]を参照のこと。
グリコシル化部位利用
グリコシル化部位利用は、例えば、糖ペプチドLC-MS/MSにより定量することができる：コンジュゲートをプロテアーゼ(1つ又は複数)で消化して、ペプチドを好適なクロマトグラフィー法(C18、親水性相互作用HPLC HILIC、GlycoSepNカラム、SE HPLC、AE HPLC)で分離し、MS/MSを用いて異なるペプチドを同定する。この方法は、その前の化学的方法(スミス分解(smith degradation))又は酵素的方法による糖鎖短縮を伴って使用することもできるし、又は上記の糖鎖短縮を伴わずに使用することもできる。215～280nmのUV検出を用いた糖ペプチドピークの定量は、グリコシル化部位利用の相対的測定を可能とする。別の実施形態において、サイズ排除HPLCにより：より高いグリコシル化部位利用は、SE HPLCカラムからのより早い溶出時間により反映される。
組成物
修飾キャリアタンパク質を含む組成物が提供される。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質は、O-グリコシル化されている。特定の実施形態において、修飾キャリアタンパク質に機能的に連結されたグリカンは免疫原性であり、従って上記組成物は免疫原性組成物である。
「免疫原性組成物」、「ワクチン組成物」又は「医薬組成物」は、活性成分の生物学的活性が有効であることを可能とするように製剤化され、上記組成物が投与されるであろう対象に対して容認し難いほど毒性の付加的成分は含有しない調製物である。免疫原性組成物、ワクチン組成物、又は医薬組成物は、医薬品グレードの活性成分(例えば、医薬品グレードの抗原)を含み、従って、本発明の免疫原性組成物、ワクチン組成物、又は医薬組成物は、任意の、例えば天然の組成物と区別される。[87]を参照のこと。特定の実施形態において、免疫原性組成物、ワクチン組成物、又は医薬組成物は無菌である。特定の実施形態において、組成物は、「免疫原性コンジュゲート」(例えば、免疫原性グリカンに共有結合している修飾キャリアタンパク質)を含む免疫原性組成物である。特定の実施形態において、免疫原性グリカンは、O抗原である。免疫原性組成物は、免疫学的有効量の免疫原性グリカン又は免疫原性コンジュゲートを含む。「免疫学的有効量」は、個体に単回投与として投与してもよく、又は一連の投与の一部として投与されてもよい。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、製薬上許容されるアジュバント、賦形剤、担体、又は希釈剤をさらに含む。アジュバント、賦形剤、担体、及び希釈剤は、それら自体は抗体応答又は免疫応答を誘導せず、むしろこれらは、抗原(例えば、免疫原性グリカン)に対する抗体応答又は免疫応答を誘発するか又は増強する技術的効果を提供する。
一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、一価の製剤である。他の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、多価製剤、例えば、二価、三価、及び四価製剤である。例えば、多価製剤は、2つ以上の免疫原性修飾キャリアタンパク質を含む(例えば、第1の免疫原性グリカンを含む第1の免疫原性O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質及び少なくとも第2の免疫原性グリカンを含む第2の免疫原性O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質、場合によりさらに、第3の免疫原性グリカンを含む第3の免疫原性O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質を含む)。さらなる実施形態において、多価免疫原性組成物は、2つ以上の異なる免疫原性グリカンに直接的に又は間接的に結合しているO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質を含む。
また、本発明の免疫原性コンジュゲート(例えば、免疫原性グリカンを含むO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質)を、製薬上許容されるアジュバント、賦形剤、又は希釈剤と混合するステップを含む、免疫原性組成物を作成する方法も提供される。
哺乳動物に免疫学的有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む、哺乳動物(例えば、ヒト哺乳動物)における抗体応答を誘導する方法が提供される。また、哺乳動物における抗体応答又は免疫応答の誘導において使用するための免疫原性組成物も提供される。哺乳動物における抗体応答又は免疫応答を誘導するための医薬の製造のための免疫原性組成物が提供される。
ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)は、世界的に重要な被包性ヒト病原体である。ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)(S.ニューモニエ(S. pneumoniae)、肺炎球菌(pneumococcus))は、(特に乳幼児及び高齢者における)相当数の病的状態及び死亡の原因となるグラム陽性細菌であり、菌血症及び髄膜炎、肺炎などの侵襲性疾患、並びに急性中耳炎などの他の非非侵襲性疾患を引き起こす。S.ニューモニエ(S. pneumoniae)によって引き起こされる主要な臨床的症候群は広く認識されており、標準的な医学の教科書において考察されている。例えば、侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)は、S.ニューモニエ(S. pneumoniae)が血液又は別の通常は無菌の部位から単離される任意の感染症として定義されている。本明細書において、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)感染により引き起こされる疾患、例えば、肺炎、侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)、慢性閉塞性肺疾患の増悪(eCOPD)、中耳炎、髄膜炎、菌血症、肺炎及び/又は結膜炎の治療又は予防において使用するための免疫原性組成物が提供される。哺乳動物におけるストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカンに対する免疫応答の誘導において使用するための免疫原性組成物が提供される。また、哺乳動物においてストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカンに対する抗体応答又は免疫応答を誘導するための免疫原性組成物も提供される。哺乳動物においてストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)グリカンに対する抗体応答又は免疫応答を誘導するための医薬の製造のための免疫原性組成物が提供される。
ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)感染により引き起こされる疾患は、肺炎、侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)、慢性閉塞性肺疾患の増悪(eCOPD)、中耳炎、髄膜炎、菌血症、肺炎及び/又は結膜炎から選択され得る。ヒト哺乳動物が乳幼児(本発明の文脈において0～2歳と定義される)である場合、疾患は、中耳炎、髄膜炎、菌血症、肺炎及び/又は結膜炎から選択され得る。一態様において、ヒト哺乳動物が乳幼児(本発明の文脈において0～2歳と定義される)である場合、疾患は、中耳炎及び/又は肺炎から選択される。ヒト哺乳動物が高齢者(すなわち、年齢が50歳超、典型的には55歳超、またより一般的には60歳超)である場合、疾患は、肺炎、侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)、及び/又は慢性閉塞性肺疾患の増悪(eCOPD)から選択され得る。一態様において、ヒト哺乳動物が高齢者である場合、疾患は、侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)である。別の態様において、ヒト哺乳動物が高齢者である場合、疾患は、慢性閉塞性肺疾患の増悪(eCOPD)である。
アジュバント
アジュバントは、抗原に対する免疫応答又は抗体応答を増強及び調節するために、免疫原性組成物及びワクチン組成物において使用される非抗原成分である。アジュバントが抗原の免疫学的効果の誘導、大きさ、及び/又は寿命を増強することは、十分に認識されている。アジュバントは、化合物が単独で投与される場合、抗原に対する免疫応答又は抗体応答を生じない化合物である。
本発明の免疫原性組成物及びワクチン組成物は、抗原に加えてアジュバントを含み得る。特定の実施形態において、アジュバントは医薬品グレードである。アジュバントは、免疫原性組成物又はワクチン組成物の投与の前、同時又は後に投与され得る。
アジュバントの具体例としては、限定するものではないが、アルミニウム塩(ミョウバン)(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウム)、3 脱-O-アシル化モノホスホリルリピドA(MPL)、MF59、AS03、AS04、ポリソルベート80(TWEEN 80(登録商標))、イミダゾピリジン化合物([88]を参照)、イミダゾキノキサリン化合物([89]を参照)、CpG([90])又はオリゴヌクレオチドを含有する非メチル化CpG([91])、及びサポニン、例えばQS21([92]を参照)などが挙げられる。一部の実施形態において、アジュバントは、フロイントアジュバント(完全又は不完全)である。他のアジュバントは、場合によりモノホスホリルリピドAなどの免疫刺激剤と組み合わされた、水中油型エマルション(例えば、スクアレン又はピーナッツ油)である([93]を参照)。特定の実施形態において、アジュバントは、水中油型エマルション(例えば、MF59及びAS03)、リポソーム(例えば、3-o-デサシル-4'-モノホスホリルリピドA(MPL))及び/又は、サポニン(例えば、QS21)(例えば、AS01)、TLR2アゴニスト、TLR3アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR5アゴニスト、TLR6アゴニスト、TLR7アゴニスト、TLR8アゴニスト、TLR9アゴニスト、アルミニウム塩、ナノ粒子、微粒子、ISCOMS、フッ化カルシウム、有機化合物複合体、又はそれらの組み合わせである。例えば、[94]、[95]及び[96]を参照のこと。特定の実施形態において、本発明の免疫原性組成物又はワクチン組成物は、抗原及びアジュバントを含み、ここで上記アジュバントは、水中油型エマルション(例えば、MF59及びAS03並びにそれらの各サブタイプ、例えばサブタイプB及びEなど)、アルミニウム塩(例えば、リン酸アルミニウム及び水酸化アルミニウム)、リポソーム、サポニン(例えば、QS21)、Toll様受容体のアゴニスト(TLRa)(例えば、TLR4a及びTLR7a)、又はそれらの組み合わせ(例えば、Alum-TLR7a([97])である。「TLRアゴニスト」は、直接リガンドとして、又は内因性リガンド又は外因性リガンドの生成を通して間接的に、TLRシグナル伝達経路を通じたシグナル応答を引き起こすことができる成分を
意味する([98])。例えば、TLR4アゴニストは、TLR-4シグナル伝達経路を通じたシグナル応答を引き起こすことができる。TLR-4アゴニストの好適な例は、リポ多糖、好適にはリピドAの非毒性誘導体、特にモノホスホリルリピドA、又はさらに特に3-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)である。特定の実施形態において、免疫原性組成物又はワクチン組成物は、1つ以上のアジュバントを含む。
特定の実施形態において、アジュバントは、モノホスホリルリピドA(例えば、3-脱-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL))若しくはその誘導体、あるいはモノホスホリルリピドAと、アルミニウム塩(例えば、リン酸アルミニウム若しくは水酸化アルミニウム)又は水中油型エマルションのいずれかとの組み合わせである。特定の実施形態において、アジュバントは、水中油型エマルション中のQS21、3D-MPL及びトコフェロールの製剤を含む([99])。
賦形剤
製薬上許容される賦形剤は、当業者により選択され得る。例えば、製薬上許容される賦形剤は、トリス(トリメタミン)、リン酸塩(例えば、リン酸ナトリウム、スクロース-リン酸グルミン酸)、酢酸塩、ホウ酸塩(例えば、ホウ酸ナトリウム)、クエン酸塩、グリシン、ヒスチジン及びコハク酸塩(例えば、コハク酸ナトリウム)、好適には塩化ナトリウム、ヒスチジン、リン酸ナトリウム又はコハク酸ナトリウムなどのバッファーであり得る。製薬上許容される賦形剤としては、塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム又は塩化マグネシウムを挙げることができる。場合により、製薬上許容される賦形剤は、溶解度及び/又は安定性を安定させる少なくとも1つの成分を含む。可溶化剤/安定化剤の例としては、洗浄剤(detergent)、例えば、ラウリルサルコシン及び/又はポリソルベート(例えば、TWEEN 80(登録商標)(ポリソルベート80))などが挙げられる。また安定化剤の例として、ポロキサマー(例えば、ポロキサマー124、ポロキサマー188、ポロキサマー237、ポロキサマー338及びポロキサマー407)も挙げられる。製薬上許容される賦形剤としては、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、TWEEN 80(登録商標)(ポリソルベート80)、TWEEN 60(登録商標)(ポリソルベート60)、TWEEN 40(登録商標)(ポリソルベート40)及びTWEEN 20(登録商標)(ポリソルベート20)、又はポリオキシエチレンアルキルエーテル(好適にはポリソルベート80)などが挙げられ得る。代替的な可溶化剤/安定化剤としては、アルギニン、及びガラス形成ポリオール(例えばスクロース、トレハロースなど)が挙げられる。製薬上の賦形剤は、保存剤、例えばフェノール、2-フェノキシエタノール、又はチオメルサールであり得る。他の製薬上許容される賦形剤としては、糖(例えば、ラクトース、スクロース)及びタンパク質(例えば、ゼラチン及びアルブミン)などが挙げられる。本発明により使用するための製薬上許容される賦形剤としては、生理食塩水溶液、デキストロース水溶液及びグリセロール水溶液(当技術分野において、「担体」又は「充填剤」とも呼ばれる)などが挙げられる。多数の製薬上許容される賦形剤は、例えば、[100]に記載されている。
本発明の免疫原性組成物は、生理食塩水及びグリセロールなどの希釈剤も含み得る。さらに、免疫原性組成物は、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、及び/又はポリオールなどの補助剤を含み得る。
本発明の免疫原性組成物は、1種以上の塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、及びアルミニウム塩(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン(硫酸アルミニウムカリウム)、又はこのようなアルミニウム塩の混合物)も含み得る。
本発明の免疫原性組成物は、保存剤、例えば、水銀誘導体チメロサール又は2-フェノキシエタノールも含み得る。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、0.001％～0.01％のチメロサールを含む。一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、0.001％～0.01％の2-フェノキシエタノールを含む。
本発明の免疫原性組成物は、洗浄剤、例えばTWEEN 80(登録商標)(ポリソルベート80)などのポリソルベートも含み得る。洗浄剤は、低いレベル(例えば、<0.01％)で存在してもよいが、抗原製剤を安定化させるためには、より高いレベル(例えば、最大10％)が推奨される。
投与
本発明の免疫原性組成物又はワクチンは、前記免疫原性組成物又はワクチン組成物を、感染しやすい哺乳動物に対して全身経路又は粘膜経路を介して投与することにより、前記哺乳物の免疫応答又は抗体応答を誘導し、及び/又は前記哺乳物を保護又は治療するために使用することができる。これらの投与としては、筋肉内(IM)経路、腹腔内経路、皮内(ID)経路又は皮下経路を介した注射、又は口道/消化管、気道、尿生殖路に対する粘膜投与を介した注入などが挙げられ得る。例えば、鼻腔内(IN)投与を使用することができる。本発明の免疫原性組成物又はワクチンは単回投与として投与することが可能であるが、その成分は、同時に共投与されてもよく、又は異なる時間に共投与されてもよい。共投与のため、上記の異なる投与のいずれか又は全てにおいて、例えば、任意選択のアジュバントが存在し得るが、しかし、本発明の1つの特定の態様において、任意選択のアジュバントは、免疫原性O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質と組み合わせて存在する。単一の投与経路に加えて、2つの異なる投与経路を使用することができる。最初のワクチン接種に続いて、対象は、1回、又は適切に間隔をあけた数回の追加免疫を受容し得る。
本明細書中に記載されている実施例及び実施形態は、例示の目的のためのみであり、それを考慮した様々な改変又は変化が当業者に示唆されるであろうこと、また本出願の精神及び範囲に包含されることが理解される。
実施例１
材料及び方法
多糖生合成クラスター(O抗原又は莢膜多糖)の染色体コピーを含む、O抗原リポ多糖リガーゼ遺伝子waaLが欠損した大腸菌(大腸菌W3110 ΔwaaL、ΔwecA-wzzE、ΔO16::P.シゲロイデス(P. shigelloides)O17(S.ソンネイ(S. sonnei))のwbgT-wbgZクラスター(本明細書中以降「大腸菌(E. coli)W3110ΔwaaL」))、並びに、PglL及び修飾キャリアタンパク質を発現する2つのプラスミドを使用した。単一コロニーを、50ml TBdev培地(酵母抽出物24g/L、大豆ペプトン12g/L、グリセロール100％ 4.6mL/L、K2HPO4 12.5g/L、KH2PO4 2.3g/L、MgCl2x6H2O 2.03g/L)に播種し、30℃でOD 0.8まで増殖させた。この時点で、誘導物質として0.1mM IPTG及び0.1％アラビノースを添加した。この培養液をさらに一晩(o/n)インキュベートし、さらなる分析のために回収した([00119]を参照)。バイオリアクター評価の場合、50mLの(非誘導)一晩(o/n)培養液を使用して、11の培養液を21個のバイオリアクター中に播種した。このバイオリアクターを500～1000rpmで撹拌し、2M KOH又は20％H3PO4のいずれかの自動制御添加によりpHを7.2に維持し、培養温度を30℃に設定した。溶存酸素(pO2)のレベルを10％酸素に維持した。バッチ段階において、細胞を、50g/Lのグリセロールを含有することを除いて上記のとおりのTBdev培地中で増殖させた。供給培養液として、250g/Lグリセロール及び0.1％IPTG(1プラスミド系)又は0.1％IPTG及び2.5％アラビノース(2プラスミド系)を添加したTBdevを使用した。増殖のフェドバッチ段階を開始する前に、0.1 mM IPTGによる誘導(1プラスミド系)、並びに0.1mM IPTG及び0.1％アラビノースによる誘導(2プラスミド系)をOD=35で行った。線形供給速度を24時間維持し、その後16時間の飢餓期間を設けた。バイオリアクター培養液を合計約40時間の培養後に回収し、このとき、この培養液はOD600=±80に達していたはずであった。
上記の製造方法を、以前に記載されたクーマシーブリリアントブルー染色又はウェスタンブロットにより分析した([101])。サンプルをニトロセルロース膜上にブロッティングした後、抗Hisタンパク質、抗グリカンタンパク質又は抗キャリアタンパク質のいずれかで免疫染色した。抗ウサギIgG-HRP(Biorad社)を、二次抗体として使用した。検出は、ECL(商標)ウェスタンブロッティング検出試薬(Amersham Biosciences社、バッキンガムシャー州、リトル・チャルフォント)を用いて実施した。
ペリプラズムタンパク質抽出のため、10,000gで20分間遠心分離することにより細胞を回収し、1体積の0.9％NaCl中に再懸濁した。7,000gで25～30分間の遠心分離により細胞をペレット化した。この細胞を、懸濁バッファー(25％スクロース、100mM EDTA、200mM Tris HCl(pH8.5)、250 OD/ml)中に再懸濁し、この懸濁液を撹拌下に4～8℃で30分間インキュベートした。この懸濁液を、4～8℃において、7,000～10,000gで30分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を同一体積の氷冷20mM Tris HCl(pH8.5)中に再懸濁し、撹拌下に4～8℃で30分間インキュベートした。スフェロプラスト(spheroblast)を、4～8℃において10,000gで25～30分間遠心分離し、上清を回収して、0.2gメンブレンに通過させた。ペリプラズム抽出物を7.5％SDS-PAGEにロードし、同定のためクーマシーで染色した。
バイオコンジュゲート精製のため、100,000 ODの細胞から得られたペリプラズムタンパク質を含む上清を、Source Qアニオン交換カラム(ほぼ180mlに等しいXK 26/40の流動媒体(bed material))上にロードし、バッファーA(20mM Tris HCl(pH 8.0))で平衡化した。5カラム体積(CV)のバッファーAで洗浄した後、タンパク質を、50％バッファーB(20mM Tris HCl+1M NaCl(pH 8.0))までの15CVの線形勾配で溶出し、その後100％バッファーBまでの2CVの線形勾配で溶出した。タンパク質をSDS-PAGEで解析し、クーマシーで染色した。バイオコンジュゲートは、6～17mSの伝導度で溶出し得る。サンプルを10倍濃縮し、バッファーを20mM Tris HCl(pH 8.0)に交換した。
バイオコンジュゲートを、Source Qカラム(ほぼ28mlに等しいXK 16/20の流動媒体)上にロードし、バッファーA：20mM Tris HCl(pH 8.0)で平衡化した。上記で使用した勾配と同一の勾配を使用して、バイオコンジュゲートを溶出した。タンパク質をSDS-PAGEで解析し、クーマシーで染色した。通常、バイオコンジュゲートは、6～17mSの伝導度で溶出する。サンプルを10倍濃縮し、バッファーを20mM Tris HCl(pH 8.0)に交換した。
バイオコンジュゲートをSuperdex 200(Hi Load 26/60、分取グレード)上にロードし、これを20mM Tris HCl(pH 8.0)で平衡化した。Superdex 200カラム由来のタンパク質画分をSDS-PAGEで解析し、クーマシー染色で染色した。
異なる精製ステップに由来するバイオコンジュゲートをSDS-PAGEで解析し、クーマシーで染色した。バイオコンジュゲートは、上記方法を用いて純度98％超まで精製される。バイオコンジュゲートは、この技術を用いて首尾よく製造することができる。
キャリアタンパク質の最適化
緑膿菌外毒素A(EPA)キャリアタンパク質(配列番号1)を、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)ピリンPilE(配列番号137として提供される野生型配列)由来の1つ以上のGlycoTagを組み込むように修飾した(方法については、[29]、[6]、[4]、及び[31]を参照のこと。これらは全て、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる)。組換えEPA(rEPA、配列番号1)を修飾して、3つの他の組換えEPAタンパク質を作製した：
- N末端にNmPilE GlycoTag配列番号140(配列番号137の残基45～73に対応する)(29アミノ酸長)を組み込むように修飾された第1の組換えEPAタンパク質 (rEPA1、配列番号51)。
- 配列番号1についての内部残基A375にNmPilE GlycoTag配列番号140を組み込むように修飾された第2の組換えEPAタンパク質(rEPA2、配列番号53)。
- C末端にNmPilE GlycoTag配列番号140を組み込むように修飾された第3の組換えEPAタンパク質 (rEPA3、配列番号55)。
技術的実現可能性
ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)(配列番号8のポリヌクレオチド配列、配列番号9のアミノ酸配列をコードする)、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei)O抗原遺伝子クラスター(配列番号6のポリヌクレオチド配列、配列番号208～216のアミノ酸配列をコードする)、並びにキャリアタンパク質rEPA1、rEPA2、及びrEPA3(DsbAペリプラズムシグナル配列(配列番号5、配列番号4をコードする)に機能的に連結されている)のうちの1つを、O抗原リポ多糖リガーゼ遺伝子waaLが欠損した大腸菌W3110中に導入した(大腸菌W3110ΔwaaL)。rEPA1～rEPA3のそれぞれについて1つの、3個の細胞ロットを作製した。クーマシーブルー染色及びウェスタンブロットアッセイで、NmPglLが、脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原を、rEPA1、rEPA2、及びrEPA3のそれぞれに効率的に転移させたことを確認した(図2において、それぞれ#1～#4に対応する)。転移は、1プラスミド系(すなわち、PglLとrEPAキャリアが1つのプラスミド中で組み合わされている(図2A及び図2Bの#1～#3))、又は2プラスミド系(すなわち、PglLとEPAが2つの別個のプラスミド上にコードされている、IPTG及びアラビノース誘導性(図2A及び図2Bの#4))のいずれにおいても観察された。質量分析では、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原が、rEPA1に結合される場合に、インタクトであり且つその構造が維持されることを確認した。21～25個の反復単位(以下)がrEPA1に結合していると決定された。
Figure 2022513458000003
 rEPA1-S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原バイオコンジュゲートの安定性について、3つの異なる温度で(-80℃、2～8℃、及び室温(RT)20～25℃)、6ヶ月間研究した。さらに、精製rEPA1-S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原について、5回の凍結/融解サイクル(5FT)を実施した。0ヶ月、2週間、1ヶ月、3カ月、及び6ヶ月において採取したサンプルのSEC-HPLC読み出し値は、rEPA1-S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原バイオコンジュゲートのピーク面積が、長期間一定であったことを明らかにした(図3)。同じことは、5回の凍結/融解サイクルを受けたサンプルについても観察された。分解産物は観察されず、小さな凝集のみが観察された。上記のバイオコンジュゲートは、優れた経時安定性を有していた(図3)。
免疫原性
rEPA1-S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原バイオコンジュゲートの免疫原性を評価するため、4匹の雌のニュージーランド白ウサギ(3～4月齢)を2群に分け(1群当たり2匹のウサギ)、0日目、7日目、10日目及び18日目に、2μgの糖、40μgのタンパク質、及び非フロイントアジュバント(群1)、又は10μgの糖、200μgのタンパク質、及び非フロイントアジュバント(群2)を含むバイオコンジュゲート組成物を皮下注射した。0日目、21日目、及び28日目に放血させた。28日目に採取した血液サンプルのウェスタンブロットは、全ての対象においてS.ソンネイ(S. sonnei)O抗原及びEPAに対する抗体が生成され(図4)、2μg用量(図4A)が、10μg用量(図4B)よりも優れた抗体応答を誘導することを明らかにした。これらの結果は、NmPglL媒介性rEPA1-S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原バイオコンジュゲートが、ウサギにおいて免疫原性であることを示す。
実施例２
キャリアタンパク質汎用性
キャリアタンパク質上で複数のGlycoTagを使用することの技術的実現可能性を評価するため、EPAを、1コピー又は2コピーのいずれかの配列番号9の配列を有するNmPilE GlycoTagを組み込むように修飾した。1コピーのGlycoTagのみを組み込むEPAについては、このGlycoTagはN末端に位置していた(rEPA1)。2コピーのGlycoTag配列番号140を組み込むEPAについては、第1のGlycoTagはN末端に位置し、第2のGlycoTagはC末端に位置していた(rEPA43、配列番号135)。ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)を、3つの異なる脂質キャリア結合多糖：S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原、S.フレックスネリ(S. flexneri)2a CPS、又はストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)12F CPSのうちの1つの存在下で、rEPA1又はrEPA43に適用した。NmPglLは、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原、S.フレックスネリ(S. flexneri)2a CPS、及びストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)12F CPSのそれぞれを、rEPA1及びrEPA43上に転移させた(図5)。
これらの結果は、2つ以上のGlycoTagを組み込むように修飾されたキャリアタンパク質を、in vivoバイオコンジュゲーションに使用し得ることを示す。
キャリアタンパク質に対するNmPglLの汎用性(versatility)を評価するため、公知のキャリアタンパク質AcrA、PcrV、及びCrm197も、上記のとおり、1コピーの配列番号140の配列を有するNmPilE GlycoTagを組み込むように修飾した。修飾AcrA(mAcrA)については、pelBシグナル配列(配列番号198の残基1～22)がAcrA配列のN末端に機能的に連結され、GlycoTag配列番号140がAcrAのC末端に機能的に連結され、6xHis-tagがGlycoTagのC末端に機能的に連結された(mAcrAについては、配列番号199)。修飾PcrV(mPcrV)については、LtIIbシグナル配列(配列番号202の残基1～23)が、PcrV配列のN末端に機能的に連結され、GlycoTag配列番号140がPcrVのC末端に機能的に連結され、6xHis-tagがGlycoTagのC末端に機能的に連結された(mPcrVについては、配列番号202)。第1の修飾Crm197(mCrm197)については、DsbAシグナル配列(配列番号4)が、Crm197配列のN末端に機能的に連結され、GlycoTag配列番号140がCrm197のC末端に機能的に連結され、6xHis-tagがGlycoTagのC末端に機能的に連結された(mCrm197については、配列番号204)。第2の修飾Crm197(m2Crm197、配列番号207)については、DsbAシグナル配列(配列番号4)が、配列番号140のGlycoTag配列のN末端に機能的に連結され、これらが共にCrm197配列のN末端に機能的に連結され；GlycoTag配列番号140はまた、Crm197のC末端にも機能的に連結され、6xHis-tagがGlycoTagのC末端に機能的に連結された(配列番号207のm2Crm197配列を参照)。NmPglL、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原、並びにmAcrA、mPcrV、mCrm197、及びm2Crm197のうちの1つを、大腸菌W3110ΔwaaL中に機能的に導入した。このようにして、NmPglLは、mAcrA、mPcrV、mCrm197、又はm2Crm197の存在下で脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原に接触した。NmPglLは、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原を、mAcrA、mPcrV、mCrm197、及びm2Crm197上に転移させた(図6)。
PglL基質汎用性
NmPglLの基質汎用性を評価するため、血清型Sp8、Sp12F、Sp14、Sp22A、Sp23A、及びSp33Fのそれぞれのうちの1つに由来するニューモコッカル(Pneumococcal)莢膜多糖(CPS)をコードする多糖遺伝子クラスター(すなわち、ヌクレオチド配列)を、大腸菌(E. coli)W3110ΔwaaLに染色体導入した(表1)。またNmPglL、及びrEPA1又はrEPA43ヌクレオチド配列(上記の実施例１)も、大腸菌W3110ΔwaaL細胞のそれぞれに機能的に導入した。12個の組換え宿主細胞を作製し、そのうち6個は6つの異なるニューモコッカル(Pneumococcal)CPSのそれぞれのうちの1つとrEPA1を組み込んでおり、別の6個は6つの異なるニューモコッカル(Pneumococcal)CPSのそれぞれのうちの1つとrEPA43を組み込んでいた。このようにして、NmPglLは、rEPA1又はrEPA43の存在下で各脂質キャリア結合ニューモコッカル(Pneumococcal)CPSペプチドグリカンに接触し、NmPglLは、in vivoで、ニューモコッカル(Pneumococcal)CPSグリカンをrEPA1又はrEPA43上に転移させた：
Figure 2022513458000004
ニューモコッカル(Pneumococcal)Sp15A CPSについての結果は、Sp15A CPSの転移が検出されなかったため決定的ではなかったが、ニューモコッカル(Pneumococcal)Sp14 CPSの転移は検出され、Sp15A CPSとSp14 CPSは両方ともガラクトース-β1,4-グルコース-UndPPの還元末端構造を有していた。NmPglLは、rEPA1及びrEPA43上に、ニューモコッカル(Pneumococcal)血清型8、12F、14、22A、23A、及び33Fのグリカン(それぞれ、グルクロン酸-β1,4-グルコース(Sp8)、N-アセチル-フコサミン-α1,3-N-アセチル-ガラクトサミン(Sp12F)、ガラクトース-β1,4-グルコース(Sp14)、ラムノース-β1,4-グルコース(Sp22A、Sp23A)、及びガラクトフラノース-β1,3-グルコース(Sp33F)の還元末端構造を有する)の全てを転移させた。これらの結果により、NmPglLグリカン基質には、その還元末端にグルコース又はGalNAcを有するNmPglLグリカン基質が包含されることが確認される(Faridmoayerらによっても裏付けられている([3]))。
実施例３
ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglLホモログの同定及び特性決定
それぞれ異なるナイセリア(Neisseria)種に由来する20個のナイセリア(Neisseria)PglLタンパク質を同定した。確立された方法を用いて、最初に、各PglLを、それらがS.ソンネイ(S. sonnei)O抗原(配列番号208～216のタンパク質をコードする、wbgT、wbgU、wzx、wxy、wbgV、wbgW、wbgX、wbgY、及びwbgZ遺伝子からなるオペロンにより作製され、これらが、N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンの還元末端構造を有する糖を作製する)7を、NmPglL(対照)の効率と少なくとも同等の(すなわち、これと等しいか又はこれを上回る)効率で、内在性ピリン上に転移させる能力についてスクリーニングした。これにより6個のナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglLホモログを同定した。その後、この6個のナイセリア(Neisseria)PglLタンパク質を、それぞれ、それらがS.ソンネイ(S. sonnei)O抗原を、NmPglL(対照)と少なくとも同等の効率でrEPA1上に転移させる能力についてスクリーニングした。これにより4個のナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglLホモログを同定した。方法については、[4]、[6]、[29]、及び[31](これらは全て、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる)を参照のこと。結果は、以下の表2にまとめられるとおりであった：
Figure 2022513458000005
Figure 2022513458000006
NmPglL、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae))PglL(NgPglL)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongata subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePglL)、及びナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPglL)は、脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原を、可溶性のNmPilE-ベースのGlycoTag上に転移させることが示された。これは大部分が、非内在性GlycoTag上へのグリカン転移であった。これらの結果は、NgPglL、NlPglL、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPglL)、ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(配列番号33)(NsPglL)、NePglL、及びNbPglLが全て、N-アセチル-フコサミン(FucNAc)の還元末端構造(N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンであるS-2からS-1への構造)を有する脂質結合グリカン基質を、その内在性ピリン又はrEPA1上に、対照(NmPglL)と少なくとも同等の効率で転移させることを示す。以下の実施例８も参照のこと。
実施例４
内部NmPilE GlycoTagを有する設計されたキャリアタンパク質
22個の修飾EPAキャリアタンパク質(各タンパク質は、内部残基に、1コピーの配列番号140の配列(配列番号137のNmPilE配列の残基45～73に対応する29アミノ酸配列)を有するNmPilE GlycoTagを組み込む)を設計し、製造した。以下に列挙されるEPA残基(配列番号1について番号付けされた)が、配列番号140のGlycoTag配列に置換された(すなわち、29アミノ酸の挿入)：
Figure 2022513458000007
図7A(EPA残基1～20を表す)及び図7B(EPA残基21～22を表す)。
キャリアタンパク質中に位置するGlycoTag(すなわち、「内部GlycoTag」)へのグリカン転移を評価するため、NmPglL(配列番号9)、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原(配列番号208～216)、及びrEPA4～rEPA25(DsbAペリプラズムシグナル配列に機能的に連結されている)のそれぞれのうちの1つをコードするヌクレオチド配列を、大腸菌W3110ΔwaaL(完全遺伝子型大腸菌W3110 ΔwaaL::PglLNm、ΔwecAwzzECA、ΔO16::P.シゲロイデス(P. shigelloides)O17のwbgT-wbgZクラスター)中に導入した。rEPA4～rEPA25のそれぞれについて1つの、22個の異なる細胞ロットを作製した。ウェスタンブロットアッセイにより、NmPglLが、in vivoで、脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原を、rEPA4～rEPA17、rEPA19～rEPA25の全てに効率的に転移させたことが確認された。この実験において、rEPA15に関する結果は、rEPA18発現が観察されなかったため、決定的ではなかった(図8)。
実施例５
NmPglLのホモログは、グリカンを内在性ピリンベースのGlycoTagに転移させる
ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)ピリンPilEのホモログを、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)(NgPilin)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPilin)、ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongate subsp. glycolytica)ATCC 29315(NePilin)、及びナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPilin)、ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPilin)、及びナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(NsPilin)から同定した(それぞれ配列番号143、148、153、156、159、及び162のアミノ酸配列)。実施例３及び上記の表2における内在性ピリンも参照のこと。これらのピリンのそれぞれに由来するGlycoTag を設計した。
確立された方法を用いて、EPAキャリアタンパク質(配列番号1)を、NgPilin、NlPilin、NePilin、NbPilin、NmuPilin、及びNsPilinのそれぞれのうちの1つに由来するGlycoTagの1コピーを組み込むように修飾した。6つの組換えEPA(rEPA)タンパク質を作製した：
- N末端に配列番号145のNgPilin GlycoTag(配列番号143の残基52～81に対応；30アミノ酸長)を組み込むように修飾された第1のEPA (rEPA26、配列番号101)。
- N末端に配列番号150のNlPilin GlycoTag(配列番号148の残基52～86に対応；35アミノ酸長)を組み込むように修飾された第2のEPA (rEPA27、配列番号103)。
- N末端に配列番号154のNePilin GlycoTag(配列番号153の残基52～96に対応；45アミノ酸長)を組み込むように修飾された第3のEPA (rEPA28、配列番号105)。
- N末端に配列番号157のNbPilin GlycoTag(配列番号156の残基57～93に対応；37アミノ酸長)を組み込むように修飾された第4のEPA (rEPA29、配列番号107)。
- N末端に配列番号160のNmuPilin GlycoTag(配列番号159の残基52～92に対応；41アミノ酸長)を組み込むように修飾された第5のEPA (rEPA30、配列番号109)。
- N末端に配列番号163のNsPilin GlycoTag(配列番号162の残基53～83に対応；31アミノ酸長)を組み込むように修飾された第6のEPA (rEPA31、配列番号111)。
ウェスタンブロットアッセイを使用して、NgPglL(配列番号11)、NlPglL(配列番号13)、NePglL(配列番号39)、NbPglL(配列番号41)、NmuPglL(配列番号25)(図9A)、並びにNsPglL(配列番号33)(図9B)が、脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原(配列番号208～216)を、内在性GlycoTagを含むキャリアタンパク質に(すなわち、キャリアタンパク質rEPA26～rEPA31それぞれに)転移させるか否かを決定した。これらのアッセイはまた、NmPglL(配列番号9)が、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原を、rEPA26～rEPA31上に転移させることができるか否かについても試験した(図9A及び図9B)。
これらの結果は、PglL(NgPglL、NlPglL、及びNsPglL)が、N-アセチル-フコサミン(FucNAc)の還元末端構造(N-アセチル-アルトルロン酸-α1,3-4-アミノ-N-アセチル-フコサミンであるS-2からS-1への構造)を有する脂質キャリア結合ペプチドグリカンを、N末端に内在性GlycoTagを有する修飾EPAキャリアタンパク質上に転移させることを示す。これらの3つのうち、NgPglLは、NlPglLがS.ソンネイ(S. sonnei)O抗原をrEPA27転移させたのよりも効率的に、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原をrEPA26に転移させた。同様に、NlPglLは、NsPglLがS.ソンネイ(S. sonnei)O抗原をrEPA31に転移させたのよりも効率的に、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原をrEPA27に転移させた。またNmPglLも、S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原を、rEPA26、rEPA27及びrEPA31上に転移させた(図9A及び図9B)。
実施例６
ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonnorrhoeae)のGlycoTag(1つ又は複数)を含む設計されたキャリアタンパク質
修飾EPAキャリアタンパク質(各タンパク質は、1コピー又は2コピーのナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)のPilin GlycoTag配列を組み込む)を設計し、製造した。内部EPA残基R274、S408、及び/又はA519(配列番号1について番号付けされた)が、配列番号145又は配列番号146(それぞれ、配列番号143のNgPilin配列の残基52～81に対応する30アミノ酸配列、及び配列番号143のNgPilin配列の残基 62～81に対応する20アミノ酸配列)の配列を有するNgPilin GlycoTagに置換された(以下の表4)。
確立された方法を用いて、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)(配列番号11)、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei) O抗原(配列番号208～216)、及びrEPA32～rEPA39(それぞれ配列番号113、115、117、119、121、123、125、及び127、DsbAペリプラズムシグナル配列下)のそれぞれのうちの1つをコードするヌクレオチド配列を、2つの大腸菌(E. coli)W3110ΔwaaL宿主細胞株のそれぞれに機能的に導入した。「st12807」株は、waaL遺伝子座に組み込まれたNgPglL配列を有し、以下の遺伝子型を有する：W3110 ΔwaaL、ΔwecAwzzECA、ΔO16::P.シゲロイデス(P. shigelloides)O17のwbgT-wbgZクラスター、ΔwaaL::pglL_Neisseria_gonorrhoeae_CNT56492。「st8774」株は、waaL遺伝子座に組み込まれたNgPglL配列を有しておらず、以下の遺伝子型を有する：W3110 ΔwaaL ΔwecAwzzECA ΔO16::P.シゲロイデス(P. shigelloides)O17のwbgT-wbgZクラスター。st12807株及びst8774株のそれぞれにおいて、rEPA32～rEPA39のそれぞれについて1つの、16個の細胞ロットを作製した。方法については、[4]、[6]、[29]、及び[31](これらは全て、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる)を参照のこと。ウェスタンブロットアッセイは、NgPglLが、in vivoで、脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原を、大部分の修飾EPA(rEPA32、rEPA34、rEPA36～rEPA38)に効率的に転移させたが、2つ(rEPA33及びrEPA39)については転移が非効率的であり、1つ(rEPA35)については全く転移させなかったことを示す。図10A、図10B、及び以下の表4。
Figure 2022513458000008
これらの結果は、配列番号145及び146のGlycoTag配列のいずれかで置換された内部残基R274、又はA519を有する修飾EPAキャリアタンパク質が、in vivoにおけるNgPglLを介した修飾EPAのO-グリコシル化のために効率的であることを示す。同様に、配列番号146のGlycoTag配列で置換された内部残基R274及びA519の両方を有する修飾EPAキャリアタンパク質も、in vivoにおけるNgPglLを介した修飾EPAのO-グリコシル化のために効率的である。
またこれらの結果は、配列番号145のGlycoTag配列で置換された内部残基S408を有する修飾EPAキャリアタンパク質が、in vivoにおけるNgPglLを介した修飾EPAのO-グリコシル化のために機能するが、そのO-グリコシル化が非効率的であることも示す。これは、他の研究においては、残基S408にNmGlycoTagを組み込む修飾EPAキャリアタンパク質が、NmPglLにより効率的にO-グリコシル化されたため(未公開データ)、興味深い。
配列番号146のGlycoTag配列で置換された内部残基S408を有する修飾EPAキャリアタンパク質は、in vivoにおけるNgPglLを介した修飾EPAのO-グリコシル化については機能しなかった。
実施例７
系比較
NmPglL及びNgPglLが、グリカンを、NgPilin GlycoTagを含む修飾EPAキャリアタンパク質に転移させる能力を比較した。実施例６で得られたrEPA32、rEPA34、rEPA36、及びrEPA38、並びに以下のものを使用した：
Figure 2022513458000009
確立された方法を用いて、NmPglL(配列番号9)又はNgPglL(配列番号11)をコードするヌクレオチド配列、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei)O抗原(配列番号208～216)を作製するために必要とされる酵素をコードするヌクレオチド配列、並びにrEPA32、rEPA34、rEPA36、rEPA38、rEPA40、rEPA41、及びrEPA42(DsbAペリプラズムシグナル配列下)のそれぞれのうちの1つをコードするヌクレオチド配列を、大腸菌W3110ΔwaaL中に機能的に導入した。14個の異なる細胞ロットを作製した。クーマシーブルー染色及びウェスタンブロットアッセイは、NmPglLが、in vivoで、脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原を、rEPA32、rEPA34、rEPA36、rEPA38、rEPA40、rEPA41、及びrEPA42の全てに効率的に転移させたことを示す。同様に、NgPglLは、in vivoで、脂質キャリア結合S.ソンネイ(S. sonnei)O抗原を、rEPA32、rEPA34、rEPA36、rEPA38、rEPA40、rEPA41、及びrEPA42の全てに効率的に転移させた。(図11)。
これらの結果は、配列番号145のNgPilin GlycoTag配列及び配列番号146のNgPilin GlycoTag配列が、これらのGlycoTagがキャリアタンパク質(ここではEPA)のN末端又は内部残基に導入される場合に、NmPglL及びNgPglLの両方によって効率的にO-グリコシル化されることを示す。これは、1コピー又は2コピーのいずれかの配列番号145及び配列番号146のNgPilin GlycoTag配列を用いた場合に真実であった。NgPglLは、配列番号146のGlycoTag配列を、NmPglLよりも効率的にグリコシル化した。(図11)。
実施例８
NmPglL及びNmPglLホモログは、ニューモコッカル(Pneumococcal)莢膜多糖(CPS)を、rEPA1に転移させる
NmPglL、及び実施例３に記載されているその20個のホモログを、それらの、in vivoにおいて、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)血清型Sp8又はSp22AのCPSグリカンをrEPA1(DsbAペリプラズムシグナル配列下の)上に転移させる能力について評価した。ニューモコッカル(Pneumococcal)Sp8 CPSは、グルクロン酸-β1,4-グルコースの還元末端構造を有する(表1)。ニューモコッカル(Pneumococcal)Sp22A CPSは、ラムノース-β1,4-グルコースの還元末端構造を有する(表1)。
確立された方法を用いて、ニューモコッカル(Pneumococcal)血清型Sp8又はSp22A由来のCPSをコードするヌクレオチド配列、並びに21個のナイセリア(Neisserial)のPglLタンパク質のうちの1つをコードするヌクレオチド配列、及びrEPA1をコードするヌクレオチド配列を、大腸菌W3110ΔwaaL中に機能的に導入した。42個の宿主細胞を作製した(各CPSは21個のPglLのそれぞれでアッセイされた)。このようにして、ナイセリア(Neisserial)PglLは、rEPA1の存在下で各脂質キャリア結合ニューモコッカル(Pneumococcal)CPSペプチドグリカンに接触し、ナイセリア(Neisserial)PglLは、in vivoで、ニューモコッカル(Pneumococcal)CPSグリカンを、rEPA1上に転移させた(表5及び図12A、図12B、図13A、及び図13B)。
クーマシーブルー染色及びウェスタンブロットアッセイにより、NmPglL、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)(配列番号11)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)(配列番号13)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)(配列番号15)及びナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)(配列番号17)が、脂質キャリア結合ニューモコッカル種(Pneomococcal Sp.)8 CPSグリカンを、rEPA1上に転移させることが確認された。図12A、図12B、及び表5。
クーマシーブルー染色及びウェスタンブロットアッセイにより、NmPglL、NgPglL、NlPglL、及びNgF62PglLが、脂質キャリア結合ニューモコッカル種(Pneomococcal Sp.)22A CPSグリカンを、rEPA1上に転移させることが確認された。図13、及び表5。
Figure 2022513458000010
Figure 2022513458000011
実施例９
ピリン構造の比較
Figure 2022513458000012
Figure 2022513458000013
配列の概要
グループ化された配列間の関係：
全ての例示的な修飾キャリアタンパク質(rEPA配列、並びにmAcrA、mPcrv、及びmCrm197) - 配列番号51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、199、202、及び204。
rEPA修飾キャリアタンパク質配列のみ - 配列番号51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101, 103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、及び135。
NmPglL及びS.ソンネイ(S. sonnei)O抗原でアッセイした修飾キャリアタンパク質(実施例１におけるrEPA；実施例２におけるAcr、Pcr、及びCrm197；並びに実施例４、５、及び７を参照) - 配列番号51、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、100、102、105、107、109、111、113、117、121、125、129、131、133、199、202、及び204。
NgPglL及びS.ソンネイ(S. sonnei)O抗原でアッセイした修飾キャリアタンパク質(実施例５、６、及び７を参照) - 配列番号101、113、115、117、121、123、125、127、129、131、及び133。
** 配列特性は、優先出願(1つ又は複数)の明細書中に(例えば、下線を付すことにより)示されている**
配列番号1
緑膿菌外毒素A(EPA)アミノ酸配列(成熟配列/シグナル配列は除去されている)。NCBI参照配列WP_016851883.1に対応する。
配列番号2
緑膿菌外毒素A(EPA)アミノ酸配列(シグナル配列には下線を付した)。
NCBI参照配列WP_016851883.1に対応する。
Figure 2022513458000014
配列番号3
緑膿菌外毒素A(EPA)ポリヌクレオチド配列。NCBI受託番号JX026663.1に対応する。
配列番号4
DsbAシグナル配列。
配列番号5
DsbAシグナルペプチドポリヌクレオチド配列。
配列番号6
プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)O17(すなわち、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei))O抗原クラスターヌクレオチド配列(wbgT、wbgU、wzx、wxy、wbgV、wbgW、wbgX、wbgY、及びwbgZコーディング領域を含む；10963 bps)。NCBI Genbank受託番号AF285970.1に対応する。[102]。
配列番号7
PelBシグナル配列。
配列番号8
ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)ヌクレオチド配列。
配列番号9
ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)アミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号 AEK98518.1に対応する。
配列番号10
ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonnorrhoeae)PglL(NgPglL)ポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号CNT56492.1に対応する。
配列番号11
ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonnorrhoeae)PglL(NgPglL)アミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号CNT56492.1に対応する。
配列番号12
ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)ポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号CBN87842.1に対応する。
配列番号13
ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 PglL(NlPglL)アミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号CBN87842.1に対応する。
配列番号14
ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)ポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EEZ75009.1に対応する。
配列番号15
ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)アミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号EEZ75009.1に対応する。
配列番号16
ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)ポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EFF40644.1に対応する。
配列番号17
ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)アミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号EFF40644.1に対応する。
配列番号18
ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)ATCC 14685 PglLポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EEZ72274.1に対応する。
配列番号19
ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)ATCC 14685 PglLアミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号EEZ72274.1に対応する。
配列番号20
ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)PglLポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号KGJ31457.1に対応する。
配列番号21
ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)PglLアミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号KGJ31457.1に対応する。
配列番号22
ナイセリア・フラべスケンス(Neisseria flavescens)NRL30031/H210 PglLポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EEG34481.1に対応する。
配列番号23
ナイセリア・フラべスケンス(Neisseria flavescens)NRL30031/H210 PglLアミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号EEG34481.1に対応する。
配列番号24
ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996 PglL(NmuPglL)ポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EFC87884.1に対応する。
配列番号25
ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996 PglL(NmuPglL)アミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号EFC87884.1に対応する。
配列番号26
ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)014株F0314 PglLポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EFI23064.1に対応する。
配列番号27
ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)014株F0314 PglLアミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号EFI23064.1に対応する。
配列番号28
ナイセリア・アークティカ(Neisseria arctica)PglLポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号KLT72636.1に対応する。
配列番号29
ナイセリア・アークティカ(Neisseria arctica)PglLアミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号KLT72636.1に対応する。
配列番号30
ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL(Ns2PglL)ポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EGY51766.1に対応する。
配列番号31
ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL(Ns2PglL)ポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EGY51766.1に対応する。
配列番号32
ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL(NsPglL)ポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EGY51593.1に対応する。
配列番号33
ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 PglL(NsPglL)アミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号EGY51593.1に対応する。
配列番号34
ナイセリア種(Neisseria sp.)83E34 PglLポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号KPN72282.1に対応する。
配列番号35
ナイセリア種(Neisseria sp.)83E34 PglLアミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号KPN72282.1に対応する。
配列番号36
ナイセリア・ワズウォーシ(Neisseria wadsworthii)PglLポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EGZ44098.1に対応する。
配列番号37
ナイセリア・ワズウォーシ(Neisseria wadsworthii)PglLアミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号EGZ44098.1に対応する。
配列番号38
ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongata subsp. glycolytica)ATCC 29315 PglL(NePglL)ポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EFE49313.1に対応する。
配列番号39
ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongata subsp. glycolytica)ATCC 29315 PglL(NePglL)アミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号EFE49313.1に対応する。
配列番号40
ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200 PglL(NbPglL)ポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EGF10835.1に対応する。
配列番号41
ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200 PglL(NbPglL)アミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号EGF10835.1に対応する。
配列番号42
ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)020株F0370 PglLポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EKY03535.1に対応する。
配列番号43
ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)020株F0370 PglLアミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号EKY03535.1に対応する。
配列番号44
ナイセリア種(Neisseria sp.)74A18 PglLポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号KPN74230.1に対応する。
配列番号45
ナイセリア種(Neisseria sp.)74A18 PglLアミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号KPN74230.1に対応する。
配列番号46
ナイセリア・ウェアベリ(Neisseria weaveri) ATCC 51223 PglLポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EGV35010.1に対応する。
配列番号47
ナイセリア・ウェアベリ(Neisseria weaveri) ATCC 51223 PglLアミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号EGV35010.1に対応する。
配列番号48
ナイセリア・マカカエ(Neisseria macacae)ATCC 33926 PglLポリヌクレオチド配列。NCBI Genbank受託番号EGQ77792.1に対応する。
配列番号49
ナイセリア・マカカエ(Neisseria macacae)ATCC 33926 PglLアミノ酸配列。NCBI Genbank受託番号EGQ77792.1に対応する。
配列番号50
rEPA1ポリヌクレオチド配列。
配列番号51
rEPA1アミノ酸配列 - N末端に配列番号140のGlycoTag配列が付加されている(DsbAシグナル配列には下線を付し、GlycoTag及び6xHis Tag(配列番号217)には二重下線を付した)。
Figure 2022513458000015
配列番号52
rEPA2ポリヌクレオチド配列。
配列番号53
rEPA2アミノ酸配列 - 残基A375に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列及びGlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には二重下線を付した)。
Figure 2022513458000016
配列番号54
rEPA3ポリヌクレオチド配列。
配列番号55
rEPA3アミノ酸配列 - C末端に配列番号140のGlycoTag配列が付加されている(DsbAシグナル配列及びGlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には二重下線を付した)。
Figure 2022513458000017
Figure 2022513458000018
配列番号56
rEPA4ポリヌクレオチド配列 - 残基A14に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号57
rEPA4アミノ酸配列 - 残基A14に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000019
配列番号58
rEPA5ポリヌクレオチド配列 - 残基D36に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号59
rEPA5アミノ酸配列 - 残基D36に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000020
配列番号60
rEPA6ポリヌクレオチド配列 - 残基Q92に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号61
rEPA6アミノ酸配列 - 残基Q92に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000021
配列番号62
rEPA7ポリヌクレオチド配列 - 残基G123に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号63
rEPA7アミノ酸配列 - 残基G123に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000022
配列番号64
rEPA8_E157_ヌクレオチド
配列番号65
rEPA8アミノ酸配列 - 残基E157に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000023
配列番号66
rEPA9ポリヌクレオチド配列 - 残基A177に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号67
rEPA9アミノ酸配列 - 残基A177に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000024
配列番号68
rEPA10ポリヌクレオチド配列 - 残基Y208に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号69
rEPA10アミノ酸配列 - 残基Y208に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000025
配列番号70
rEPA11ポリヌクレオチド配列 - 残基N231に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号71
rEPA11アミノ酸配列 - 残基N231に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000026
配列番号72
rEPA12ポリヌクレオチド配列 - 残基E252に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号73
rEPA12アミノ酸配列 - 残基E252に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000027
配列番号74
rEPA13ポリヌクレオチド配列 - 残基R274に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号75
rEPA13アミノ酸配列 - 残基R274に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000028
配列番号76
rEPA14ポリヌクレオチド配列 - 残基A301に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号77
rEPA14アミノ酸配列 - 残基A301に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000029
Figure 2022513458000030
配列番号78
rEPA15ポリヌクレオチド配列 - 残基Q307に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号79
rEPA15アミノ酸配列 - 残基Q307に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000031
配列番号80
rEPA16ポリヌクレオチド配列 - 残基A365に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号81
rEPA16アミノ酸配列 - 残基A365に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000032
配列番号82
rEPA17ポリヌクレオチド配列 - 残基S408に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号83
rEPA17アミノ酸配列 - 残基S408に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000033
Figure 2022513458000034
配列番号84
rEPA18ポリヌクレオチド配列 - 残基T418に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号85
rEPA18アミノ酸配列 - 残基T418に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000035
配列番号86
rEPA19ポリヌクレオチド配列 - 残基A464に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号87
rEPA19アミノ酸配列 - 残基A464に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000036
配列番号88
rEPA20 ポリヌクレオチド配列 - 残基A519に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号89
rEPA20アミノ酸配列 - 残基A519に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000037
配列番号90
rEPA21ポリヌクレオチド配列 - 残基G525に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号91
rEPA21アミノ酸配列 - 残基G525に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000038
配列番号92
rEPA22ポリヌクレオチド配列 - 残基H533に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号93
rEPA22アミノ酸配列 - 残基H533に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000039
配列番号94
rEPA23ポリヌクレオチド配列 - 残基S585に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号95
rEPA23アミノ酸配列 - 残基S585に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000040
配列番号96
rEPA24_ポリヌクレオチド配列 - 残基K240に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号97
rEPA24_アミノ酸配列 - 残基K240に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000041
配列番号98
rEPA25ポリヌクレオチド配列 - 残基A375に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号99
rEPA25アミノ酸配列 - 残基A375に配列番号140のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列、GlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には下線を付した)。
Figure 2022513458000042
Figure 2022513458000043
配列番号100
rEPA26ポリヌクレオチド配列 - N末端に配列番号145のGlycotTag配列が付加されている。
配列番号101
rEPA26アミノ酸配列 - N末端に配列番号145のGlycoTag配列が付加されている(DsbAシグナル配列及び6xHis Tag(配列番号217)には下線を付し、GlycoTagには二重下線を付した)。
Figure 2022513458000044
配列番号102
rEPA27ポリヌクレオチド配列 - N末端に配列番号150のGlycoTag配列が付加されている。
配列番号103
rEPA27アミノ酸配列 - N末端に配列番号150のGlycoTag配列が付加されている(DsbAシグナル配列及び6xHis Tag(配列番号217)には下線を付し、GlycoTagには二重下線を付した)。
Figure 2022513458000045
配列番号104
rEPA28ポリヌクレオチド配列 - N末端に配列番号154のGlycoTag配列が付加されている。
配列番号105
rEPA28アミノ酸配列 - N末端に配列番号154のGlycoTag配列が付加されている(DsbAシグナル配列及び6xHis Tag(配列番号217)には下線を付し、GlycoTagには二重下線を付した)。
Figure 2022513458000046
Figure 2022513458000047
配列番号106
rEPA29ポリヌクレオチド配列 - N末端に配列番号157のGlycoTag配列が付加されている。
配列番号107
rEPA29アミノ酸配列 - N末端に配列番号157のGlycoTag配列が付加されている(DsbAシグナル配列及び6xHis Tag(配列番号217)には下線を付し、GlycoTagには二重下線を付した)。
Figure 2022513458000048
配列番号108
rEPA30ポリヌクレオチド配列 - N末端に配列番号160のGlycoTag配列が付加されている。
配列番号109
rEPA30アミノ酸配列 - N末端に配列番号160のGlycoTag配列が付加されている(DsbAシグナル配列及び6xHis Tag(配列番号217)には下線を付し、GlycoTagには二重下線を付した)。
Figure 2022513458000049
配列番号110
rEPA31 ポリヌクレオチド配列 - N末端に配列番号163のGlycoTag配列が付加されている。
配列番号111
rEPA31_アミノ酸配列 - N末端に配列番号163のGlycoTag配列が付加されている(DsbAシグナル配列及び6xHis Tag(配列番号217)には下線を付し、GlycoTagには二重下線を付した)。
Figure 2022513458000050
配列番号112
rEPA32ポリヌクレオチド配列 - 残基R274に配列番号145のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号113
rEPA32アミノ酸配列 - 残基R274に配列番号145のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列及びGlycoTagには下線を付した)。
Figure 2022513458000051
配列番号114
rEPA33ポリヌクレオチド配列 - 残基S408に配列番号145のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号115
rEPA33アミノ酸配列 - 残基S408に配列番号145のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列及びGlycoTagには下線を付した)。
Figure 2022513458000052
配列番号116
rEPA34ポリヌクレオチド配列 - 残基A519に配列番号145のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号117
rEPA34アミノ酸配列 - 残基A519に配列番号145のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列及びGlycoTagには下線を付した)。
Figure 2022513458000053
配列番号118
rEPA35ポリヌクレオチド配列 - 残基S408に配列番号146のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号119
rEPA35アミノ酸配列 - 残基S408に配列番号146のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列及びGlycoTagには下線を付した)。
Figure 2022513458000054
配列番号120
rEPA36ポリヌクレオチド配列 - 残基A519に配列番号146のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号121
rEPA36アミノ酸配列 - 残基A519に配列番号146のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列及びGlycoTagには下線を付した)。
Figure 2022513458000055
Figure 2022513458000056
配列番号122
rEPA37ポリヌクレオチド配列 - 残基R274及びS408に配列番号146のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号123
rEPA37アミノ酸配列 - 残基R274及びS408に配列番号146のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列及びGlycoTagには下線を付した)。
Figure 2022513458000057
配列番号124
rEPA38ポリヌクレオチド配列 - 残基R274及びA519に配列番号146のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号125
rEPA38アミノ酸配列 - 残基R274及びA519に配列番号146のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列及びGlycoTagには下線を付した)。
Figure 2022513458000058
配列番号126
rEPA39ポリヌクレオチド配列 - 残基S408及びA519に配列番号146のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号127
rEPA39アミノ酸配列 - 残基S408及びA519に配列番号146のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列及びGlycoTagには下線を付した)。
Figure 2022513458000059
Figure 2022513458000060
配列番号128
rEPA40ポリヌクレオチド配列 - N末端に配列番号145のGlycoTag配列が付加されている。
配列番号129
rEPA40アミノ酸配列 - N末端に配列番号145のGlycoTag配列が付加されている(DsbAシグナル配列には下線を付し、GlycoTagには二重下線を付した)。
Figure 2022513458000061
配列番号130
rEPA41ポリヌクレオチド配列 - 残基R274に配列番号146のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号131
rEPA41アミノ酸配列 - 残基R274に配列番号146のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列及びGlycoTagには下線を付した)。
Figure 2022513458000062
配列番号132
rEPA42ポリヌクレオチド配列 - 残基R274及びA519に配列番号145のGlycoTag配列が挿入されている。
配列番号133
rEPA42アミノ酸配列 - 残基R274及びA519に配列番号145のGlycoTag配列が挿入されている(DsbAシグナル配列及びGlycoTagには下線を付した)。
Figure 2022513458000063
配列番号134
rEPA43ポリヌクレオチド配列 - N末端及びC末端に配列番号140のGlycoTag配列が付加されている。
配列番号135
rEPA43アミノ酸配列 - N末端及びC末端に配列番号140のGlycoTag配列が付加されている(DsbAシグナル配列及び6xHis Tag(配列番号217)には下線を付し、GlycoTagには二重下線を付した)。
Figure 2022513458000064
配列番号136
成熟rEPA43 アミノ酸配列(すなわち、シグナル配列が除去されている) - N末端及びC末端に配列番号140のGlycoTag配列が付加されている(6xHis Tag(配列番号217)には下線を付し、GlycoTagには二重下線を付した)。
Figure 2022513458000065
配列番号137
ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)MC58 PilEアミノ酸配列(成熟配列；シグナル配列が除去されている)。NCBI受託番号NP_273084.1に対応する。
配列番号138
ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)MC58 PilEアミノ酸配列(シグナル配列には下線を付した)。NCBI受託番号NP_273084.1に対応する。
Figure 2022513458000066
配列番号139
ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)MC58 PilEポリヌクレオチド配列。NCBI参照配列NC_003112.2の17741～17229に対応する。
Figure 2022513458000067
配列番号140
ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PilE GlycoTagアミノ酸配列(配列番号137の残基45～73に対応；29アミノ酸長)。例えば、
Ser Ala Val Thr Glu Tyr Tyr Leu Asn His Gly Glu Trp Pro Gly Asn Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Thr Ser Ser Glu Ile Lys。
配列番号141
ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PilE GlycoTagアミノ酸配列(配列番号137の残基55～73に対応；19アミノ酸長)。例えば、Gly Glu Trp Pro Gly Asn Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Thr Ser Ser Glu Ile Lys
配列番号142
ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PilE GlycoTagアミノ酸配列(配列番号137の残基55～66に対応；12 アミノ酸長)。例えば、Gly Glu Trp Pro Gly Asn Asn Thr Ser Ala Gly Val。
配列番号143
ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)ピリン(NgPilin)アミノ酸配列。NCBI GenBank CNT62005.1に対応する。
配列番号144
ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)ピリン(NgPilin)ポリヌクレオチド配列。NCBI GenBank CNT62005.1に対応する。
配列番号145
ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)GlycoTagアミノ酸配列(配列番号143の残基52～81に対応；30アミノ酸長)。例えば、Ser Ala Val Thr Gly Tyr Tyr Leu Asn His Gly Thr Trp Pro Lys Asp Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Ser Ser Pro Thr Asp Ile Lys。
配列番号146
ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)GlycoTagアミノ酸配列(配列番号143の残基62～81に対応；20アミノ酸長)。例えば、Gly Thr Trp Pro Lys Asp Asn Thr Ser Ala Gly Val Ala Ser Ser Pro Thr Asp Ile Lys。
配列番号147
ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)GlycoTagアミノ酸配列(配列番号143の残基62～73に対応；12アミノ酸長)。例えば、Gly Thr Trp Pro Lys Asp Asn Thr Ser Ala Gly Val。
配列番号148
ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06ピリン(NlPilin)アミノ酸配列。NCBI GenBank CBN86420.1に対応する。
配列番号149
ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06ピリン(NlPilin)ポリヌクレオチド配列。NCBI GenBank CBN86420.1に対応する。
配列番号150
ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 GlycoTagアミノ酸配列(配列番号148の残基52～86に対応；35アミノ酸長)。例えば、Ala Ala Val Val Glu Tyr Tyr Ser Asp Asn Gly Thr Phe Pro Ala Gln Asn Ala Ser Ala Gly Ile Ala Thr Ala Ser Ala Ile Thr Gly Lys Tyr Val Ala Lys。
配列番号151
ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06 GlycoTagアミノ酸配列(配列番号148の残基62～73に対応；12アミノ酸長)。例えば、Gly Thr Phe Pro Ala Gln Asn Ala Ser Ala Gly Ile。
配列番号152
ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongata subsp. glycolytica)ATCC 29315ピリン(NePilin)ポリヌクレオチド配列。NCBI GenBank EFE49588.1に対応する。
配列番号153
ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongata subsp. glycolytica)ATCC 29315ピリン(NePilin)アミノ酸配列。NCBI GenBank EFE49588.1に対応する。配列番号186と100％同一。
配列番号154
ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongata subsp. glycolytica)ATCC 29315 GlycoTagアミノ酸配列(配列番号153の残基52～97に対応；45アミノ酸長)。
配列番号155
ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPilin)ポリヌクレオチド配列。NCBI GenBank EGF11985.1に対応する。
配列番号156
ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200(NbPilin)アミノ酸配列。NCBI GenBank EGF11985.1に対応する。
配列番号157
ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200 GlycoTagアミノ酸配列(配列番号156の残基57～93に対応；37アミノ酸長)。
配列番号158
ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPilin)ポリヌクレオチド配列。NCBI GenBank EFC89512.1に対応する。
配列番号159
ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996(NmuPilin)アミノ酸配列。NCBI GenBank EFC89512.1に対応する。
配列番号160
ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996 GlycoTagアミノ酸配列(配列番号159の残基52～92に対応；41アミノ酸長)。
配列番号161
ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(NsPilin)ポリヌクレオチド配列。NCBI GenBank EGY51595.1に対応する。
配列番号162
ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871(NsPilin)アミノ酸配列。NCBI GenBank EGY51595.1に対応する。配列番号177及び179と100％同一。
配列番号163
ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 GlycoTagアミノ酸配列(配列番号162の残基53～83に対応；31アミノ酸長)。例えば、Gly Ala Val Thr Glu Tyr Glu Ala Asp Lys Gly Val Phe Pro Thr Ser Asn Ala Ser Ala Gly Val Ala Ala Ala Ala Asp Ile Asn Gly Lys。
配列番号164
ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871 GlycoTagアミノ酸配列(配列番号162の残基63～74に対応；12アミノ酸長)。例えば、Gly Val Phe Pro Thr Ser Asn Ala Ser Ala Gly Val。
配列番号165
ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EEZ75637.1に対応する。
配列番号166
ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EFF40919.1に対応する。
配列番号167
ナイセリア・シネレア(Neisseria cinereal)ATCC 14685ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EEZ70774.1に対応する。
配列番号168
ナイセリア・シネレア(Neisseria cinereal)ATCC 14685ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EEZ70775.1に対応する。
配列番号169
ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank KGJ31398.1に対応する。
配列番号170
ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank KGJ31397.1に対応する。
配列番号171
ナイセリア・フラべスケンス(Neisseria flavescens)NRL30031/H210ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EEG33288.1に対応する。
配列番号172
ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EFC89512.1に対応する。
配列番号173
ナイセリア・ムコサ(Neisseria mucosa)ATCC 25996ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EFC89511.1に対応する。
配列番号174
ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)014株F0314ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EFI23295.1に対応する。
配列番号175
ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)014株F0314ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EFI23294.1に対応する。
配列番号176
ナイセリア・アークティカ(Neisseria arctica)ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank KLT73057.1に対応する。
配列番号177
ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EGY51595.1に対応する。配列番号162及び179と100％同一。
配列番号178
ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank. EGY51594 (=ID 180)に対応する。
配列番号179
ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EGY51595.1に対応する。配列番号162及び177と100％同一。
配列番号180
ナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)871ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EGY51594.1に対応する。
配列番号181
ナイセリア種(Neisseria sp.)83E34ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank KPN71218.1に対応する。
配列番号182
ナイセリア種(Neisseria sp.)83E34ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank KPN71186.1に対応する。
配列番号183
ナイセリア・ワズウォーシ(Neisseria wadsworthii)9715ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EGZ51246.1に対応する。
配列番号184
ナイセリア・ワズウォーシ(Neisseria wadsworthii)9715ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EGZ51247.1に対応する。
配列番号185
ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongata subsp. glycolytica)ATCC 29315ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EFE49587.1に対応する。
配列番号186
ナイセリア・エロンガタ亜種グリコリティカ(Neisseria elongata subsp. glycolytica)ATCC 29315ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EFE49588.1に対応する。配列番号153と100％同一。
配列番号187
ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EGF04823.1に対応する。
配列番号188
ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EGF11985.1に対応する。
配列番号189
ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)ATCC BAA-1200ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EGF12096.1に対応する。
配列番号190
ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)020株F0370ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EKY04118.1に対応する。
配列番号191
ナイセリア種口腔分類群(Neisseria sp. oral taxon)020株F0370ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EKY04120.1に対応する。
配列番号192
ナイセリア種(Neisseria sp.)74A18ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank KPN73545.1に対応する。
配列番号193
ナイセリア種(Neisseria sp.)74A18ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank KPN73546.1に対応する。
配列番号194
ナイセリア・ウェアベリ(Neisseria weaver)ATCC 51223ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EGV37979.1に対応する。
配列番号195
ナイセリア・マカカエ(Neisseria macacae)ATCC 33926ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EGQ74605.1に対応する。
配列番号196
ナイセリア・マカカエ(Neisseria macacae)ATCC 33926ピリンアミノ酸配列。NCBI GenBank EGQ74606.1に対応する。
配列番号197
AcrAポリヌクレオチド配列(pelBシグナル配列を含む)。
配列番号198
AcrAアミノ酸配列(pelBシグナル配列には下線を付した)。
Figure 2022513458000068
配列番号199
mAcrAアミノ酸配列 - C末端に配列番号140のGlycoTag配列が付加されている(pelBシグナル配列及び配列番号140のGlycoTagには下線を付し；6xHis-Tag(配列番号217)には二重下線を付した)。
Figure 2022513458000069
配列番号200
PcrVポリヌクレオチド配列(LtIIbシグナル配列を含む)。
配列番号201
PcrVアミノ酸配列(LtIIb シグナル配列には下線を付した)。
Figure 2022513458000070
配列番号202
mPcrVアミノ酸配列 - C末端に配列番号140のGlycoTag配列が付加されている(LtIIbシグナル配列及びGlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には二重下線を付した)。
Figure 2022513458000071
配列番号203
Crm197ポリヌクレオチド配列(DsbAシグナル配列、及びC末端に配列番号140のGlycoTag配列を含む)。
配列番号204
mCrm197アミノ酸配列 - C末端に配列番号140のGlycoTag配列が付加されている(DsbAシグナル配列及びGlycoTagには下線を付し、6xHis Tag(配列番号217)には二重下線を付した)。
Figure 2022513458000072
配列番号205
Crm197アミノ酸配列(DsbAシグナル配列には下線を付した)。
Figure 2022513458000073
配列番号206
m2Crm197ポリヌクレオチド配列(DsbAシグナル配列、並びにN末端及びC末端に配列番号140のGlycoTag配列を含む)。
配列番号207
M2Crm197アミノ酸配列 - N末端及びC末端に配列番号140のGlycoTag配列が付加されている(DsbAシグナル配列及び6xHis-tag(配列番号217)には下線を付し、GlycoTagには二重下線を付した)。
Figure 2022513458000074
配列番号208
NCBI Genbank受託No. AAG17408.1に対応する、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)O17(すなわち、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei))O抗原WbgTアミノ酸配列。[102]。
配列番号209
NCBI Genbank受託No. AAG17409.1に対応する、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)O17(すなわち、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei))O抗原WbgUアミノ酸配列。[102]。
配列番号210
NCBI Genbank受託No. AAG17410.1に対応する、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)O17(すなわち、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei))O抗原Wzxアミノ酸配列。[102]。
配列番号211
NCBI Genbank受託No. AAG17411.1に対応する、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)O17(すなわち、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei))O抗原Wzyアミノ酸配列。[102]。
配列番号212
NCBI Genbank受託No. AAG17412.1に対応する、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)O17(すなわち、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei))O抗原WbgVアミノ酸配列。[102]。
配列番号213
NCBI Genbank受託No. AAG17413.1に対応する、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)O17(すなわち、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei))O抗原WbgWアミノ酸配列。[102]。
配列番号214
NCBI Genbank受託No. AAG17414.1に対応する、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)O17(すなわち、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei))O抗原WbgXアミノ酸配列。[102]。
配列番号215
NCBI Genbank受託No. AAG17415.1に対応する、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)O17(すなわち、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei))O抗原WbgYアミノ酸配列。[102]。
配列番号216
NCBI Genbank受託No. AAG17416.1に対応する、プレシオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)O17(すなわち、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei))O抗原WbgZアミノ酸配列。[102]。
配列番号217
6xHis-tag
参考文献
参考文献表

[1] Faridmoayer et al., "Functional Characterization of Bacterial Oligosaccharyltransferases Involved in O-Linked Protein Glycosylation," J. Bacteriology, pp. 8088-8098, 2007.
[2] Tan et al., "Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions," Trends in Bioch. Sci., vol. 40, no. 7, pp. 342-350, 2015.
[3] Faridmoayer et al., "Extreme Substrate Promiscuity of the Neisseria Oligosaccharyl Transferase Involved in Protein O-Glycosylation," J. Biol. Chem., vol. 283, no. 50, pp. 34596-34604, 2008.
[4] Pan et al., "Biosynthesis of Conjugate Vaccines Using an O-Linked Glycosylation System," mBio, vol. 7, no. 2, pp. e00443-16, 2016.
[5] Ihssen et al., "Production of glycoprotein vaccines in Escherichia coli," Microbial Cell Factories, vol. 9, p. 61, 13 total pages, 2010.
[6] Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, China WO/2016/082597 (June 2, 2016; English language equivalent EP3225690).
[7] Vik et al., "Broad spectrum O-linked protein glycosylation in the human pathogen Neisseria gonorrhoeae," PNAS, vol. 106, no. 11, pp. 4447-4452, 2009.
[8] Ravenscroft et al., "Purification and characterization of a Shigella Conjugate Vaccine, Produced by Glycoengineering Escherichia coli," Glycobiology, vol. 26, no. 1, pp. 51-62, 2016.
[9] Glycovaxyn AG, US Pat No. 8,846,342 (September 30, 2014).
[10] Glycovaxyn AG, US Pat No. 8,895,014 (November 25, 2014).
[11] ETH Zurich, US Pat No. 8,753,864 (June 17, 2014).
[12] Glycovaxyn AG, US Pat. No. 9,585,950 (March 7, 2017).
[13] Wacker et al., "Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems," PNAS, vol. 103, pp. 7088-7093, 2006.
[14] Bentley, "Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes," PLoS Gen, vol. 2, p. e31, 2006.
[15] Borud et al., "Genetic, Structural, and Antigenic Analysis of Glycan Diversity in the O-Linked Protein Glycosylation Systems of Human Neisseria Species," J. Bacteriology, vol. 192, no. 11, pp. 2816-2829, 2010.
[16] Li et al., "Understanding protein glycosylation pathways in bacteria," Future Microbiol., vol. 12, no. 1, pp. 59-72, 2017.
[17] Schulz et al., "Identification of Bacterial Protein O-Oligosaccharyltransferases and their glycoprotein substrates," PLoS One, vol. 8, no. 5, p. e62768, 2013.
[18] Ruan et al., "The WaaL O-antigen lipopolysaccharide ligase has features in common with metal ion-independent inverting glycosyltransferases," Glycobiology, vol. 22, no. 2, pp. 288-299, 2012.
[19] Aas et al., "Neisseria gonorrhoeae O-linked pilin glycosylation: functional analyses define both the biosynthetic pathway and glycan structure," Molecular Microbiology, vol. 65, no. 3, pp. 607-624, 2007.
[20] Samuel & Reeves, "Biosynthesis of O-antigens: genes and pathways involved in nucleotide sugar precursor synthesis and O-antigen assembly," Carbohydrate Research, vol. 338, pp. 2503-2519, 2003.
[21] May, " Percent Sequence Identity: The Need to Be Explicit," Structure, vol. 12, pp. 737-738, 2004.
[22] Karlin et al., "Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes," PNAS, vol. 87, pp. 2264-2268, 1990.
[23] Karlin & Altschul, "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences," PNAS, vol. 90, pp. 5873-5877, 1993.
[24] Altschul et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," Nucleic Acids Research, vol. 25, no. 17, pp. 3389-3402, 1997.
[25] Altschul & Gish, "Local Alignment Statistics," in Multiple Alignment and Phylogenetic Trees (Volume 266), 1996, pp. 460-480.
[26] Needleman & Wunsch, "A General Method Applicable to the Search for Similarities in the Amino Acid Sequence of Two Proteins," J. Mol. Biol., vol. 48, pp. 443-453, 1970.
[27] Myers & Miller, "Optimal Alignments in Linear Space," Comput Appl Biosci (CABIOS), vol. 4, no. 1, pp. 11-17, 1988.
[28] Abeyrathne et al., "Functional Characterization of WaaL, a Ligase Associated with Linking O-Antigen Polysaccharide to the Core of Pseudomonas aeruginosa Lipopolysaccharide," J. Bacteriol., vol. 187, no. 9, pp. 3002-3012, 2005.
[29] University of Alberta, US Pat. No. 9,238,830 (January 19, 2016).
[30] Musumeci et al., "In Vitro Activity of Neisseria meningitidis PglL O-Oligosaccharyltransferase with Diverse Synthetic Lipid Donors and a UDP-activated Sugar," J. Biological Chemistry, vol. 288, no. 15, pp. 10578-10587, 2013.
[31] Sun et al., "Design and production of conjugate vaccines against S. Paratyphi A using an O-linked glycosylation system in vivo," npj Vaccines, vol. 4, pp. 1-9, 2018.
[32] Pichichero, "Protein carriers of conjugate vaccines," Human Vaccines & Immunotherapeutics, vol. 9, no. 12, pp. 2505-2523, 2013.
[33] Ge et al., "The C-Termainal Domain of AcrA is Essential for the Assembly and Function of the Multidrug Efflux Pump AcrAB-TolC," J. Bacteriology, vol. 191, no. 13, pp. 4365-4371, 2009.
[34] Glaxosmithkline Biologicals SA WO/2017/067964 (April 27, 2017).
[35] Avci et al., "A mechanism for glycoconjugate vaccine activation of the adaptive immune system and its implications for vaccine design," Nature Medicine, vol. 17, no. 12, pp. 1602-1610, 2011.
[36] Dagan et al., "Glycoconjugate vaccines and immune interference: a review," Vaccine, vol. 28, pp. 5513-5523, 2010.
[37] FORSGREN, Arne; European Pat. No. EP0594610 B1 (September 2, 1998; related to WO 91/18926).
[38] Prymula et al., "Pneumococcal capsular polysaccharides conjugated to protein D for prevention of acute otitis media caused by both Streptococcus pneumoniae and non-typable Haemophilus influenzae: a randomised double-blind efficacy study," The Lancet, vol. 367, pp. 740-748, 2006.
[39] Smithkline Beecham Biologicals S.A. WO/2000/056360 (September 28, 2000).
[40] Uchida et al., "Mutation in the Structural Gene for Diphtheria Toxin carried by Temperate Phage β," Nature: New Biology, vol. 233, pp. 8-11, 1971.
[41] Pappenheimer et al., "Diphtheria Toxin," Ann. Rev. Biochem., vol. 46, pp. 69-94, 1977.
[42] Rappuoli, "Isolation and Characterization of Corynebacterium diphtheriae Nontandem Double Lysogens Hyperproducing CRM197," Applied and Environmental Microbiology, vol. 46, no. 3, pp. 560-564, 1983.
[43] Neubauer & Helting, "Structure of Tetanus Toxin: the arrangement of papain digestion products within the heavy chain-light chain framework of extracellular toxin," Biochiica et Biophysica Acta, vol. 668, pp. 141-148, 1981.
[44] Rubins et al., "Distinct roles for pneumolysin's cytotoxic and complement activities in the pathogenesis of pneumococcal pneumonia," American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, vol. 153, no. 4, pp. 1339-1346, 1996.
[45] Walker et al., "Molecular cloning, characterization, and complete nucleotide sequence of the gene for pneumolysin, the sulfhydryl-activated toxin of Streptococcus pneumoniae," Infect. Immun., vol. 55, no. 5, pp. 1184-1189, 1987.
[46] Mitchell et al., "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties," Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1007, no. 1, pp. 67-72, 1989.
[47] Mitchell et al., "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2," Nucleic Acids Research, vol. 18, no. 13, p. 4010, 1990.
[48] Glaxosmithkline Biologicals S.A. WO/2004/081515 (September 23, 2004).
[49] Glaxosmithkline Biologicals S.A. WO/2006/032499 (March 30, 2006).
[50] Paton, et al., WO 1990/006951 (June 28, 1990).
[51] Berry et al., "Comparative virulence of Streptococcus pneumoniae strains with insertion-duplication, point, and deletion mutations in the pneumolysin gene," Infection and Immunity, vol. 67, no. 2, pp. 981-985, 1999.
[52] Patent WO 1999003884.
[53] Low et al., "Optimisation of Signal Peptide for Recombinant Protein Secretion in Bacterial Hosts," Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 97, pp. 3811-3826, 2013.
[54] Yoon et al., "Secretory Production of Recombinant Proteins in Escherichia coli," Recent Patents on Biotechnology, vol. 4, pp. 23-29, 2010.
[55] Tian et al., "Predicting Synonymous Codon Usage and Optimizing the Heterologous Gene for Expression in E.coli," Sci. Reports, vol. 7, no. 9926, pp. 1-9, 2017.
[56] Chin et al., "Codon Optimization OnLine (COOL): a web-based multi-objective optimization platform for synthetic gene design," Bioinformatics Applications Note, vol. 30, no. 15, pp. 2210-2212, 2014.
[57] Hilterbrand et al., "CBDB: The codon bias database," BMC Bioinformatics, vol. 13, no. 62, pp. 1-7, 2012.
[58] Codon Usage Database, available at http://WorldWideWeb(www).kazusa.or.jp/codon/, KAZUSA DNA RES. INST.; last visited July 30, 2018.
[59] Codon Optimization Tool, available at http://WorldWideWeb(www).idtdna.com/CodonOpt, INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES; last visited July 30, 2018.
[60] The Codon Bias Database, available at http://WorldWideWeb(www)cbdb.info (as described in Hilterbrand et al., 2012 BMC Bioinformatics 13:62, 7 total pages).
[61] Thermo Fisher Scientific, Protein Preparation Handbook, 2017.
[62] Thermo Fisher Scientific, Fusion Protein Purification Resins, 2013.
[63] Fisher et al., "Production of Secretory and Extracellular N-Linked Glycoproteins in Escherichia coli," Applied and Environmental Microbiology, vol. 77, no. 3, pp. 871-881, 2011.
[64] Klein et al., "Design and Characterization of structured Protein Linkers with differing Flexibilities," Protein Engineering, Design & Selection, vol. 27, no. 10, pp. 325-330, 2014.
[65] Rosano & Ceccarelli, "Recombinant Protein Expression in Escherichia coli: advances and challenges," Frontiers in Microbiology, vol. 5, no. 172, pp. 1-17, 2014.
[66] ETH ZUERICH WO/2003/074687 (September 12, 2003).
[67] ETH ZUERICH WO/2006/119987 (November 16, 2006).
[68] Feldman et al., "Engineering N-linked protein glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli," PNAS, vol. 102, no. 8, pp. 3016-3021, 2005.
[69] Keys & Aebi, "Engineering Protein Glycosylation in Prokaryotes," Current Opinion in Systems Biology, vol. 5, pp. 23-31, 2017.
[70] Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y.: CSHL Press, 2001.
[71] Jones Day, WO/2014/037585 (March 13, 2014).
[72] Kowarik et al., "N-Linked Glycosylation of Folded Proteins by the Bacterial Oligosaccharyltransferase," Science, vol. 314, no. 5802, pp. 1148-1150, 2006.
[73] Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften, WO/2015/004041 (January 15, 2015).
[74] Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften E.V., WO/2016/091399 (June 16, 2016).
[75] Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften E.V., WO 2016198170 (December 15, 2016).
[76] Wyeth LLC, US Pregrant Pub. No. 2007/0184072 (August 9, 2007).
[77] University of Rochester, US Pat. No. 4,673,574 (June 16, 1987).
[78] Merck & Co. Inc., EP 0161188 B1 (April 3, 1991).
[79] SCLAVO SPA, EP0208375 B1 (December 11, 1991).
[80] American Cyanamid Co. EP0477508 (July 12, 1995).
[81] U.S. Government as represented by the Secretary Of The Army, WO/1993/015760 (August 19, 1993).
[82] Henry M. Jackson Foundation, WO/1995/008348 (March 30, 1995).
[83] Lees, A., WO/1996/029094 (September 26, 1996).
[84] Chu et al., "Further studies on the Immunogenicity of Haemophilus influenzae Type b and Pneumococcal Type 6A Polysaccharide-Protein Conjugates," Infection and Immunity, vol. 40, no. 1, pp. 245-256, 1983.
[85] Leyva et al., "Rapid and sensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate format to quantify carbohydrate in biopharmaceutical products: method development and validation," Biologicals, vol. 36, no. 2, pp. 134-141, 2008.
[86] Dische & Shettles, "A specific color reaction of methylpentoses and a spectrophotometric micromethod for their determination," J. Biol. Chem., vol. 175, no. 2, pp. 595-603, 1948.
[87] Pogue et al., "Production of pharmaceutical-grade recombinant aprotinin and a monoclonal antibody product using plant-based transient expression systems," Plant Biotech. J., vol. 8, pp. 638-654, 2010.
[88] Novartis AG, WO/2007/109812 (September 27, 2007).
[89] Novartis AG, WO 2007/109813 (September 27, 2007).
[90] Shirota & Kilnman, "Recent Progress Concerning CpG DNA and its use as a vaccine adjuvant," Expert Rev. Vaccines, vol. 13, no. 2, pp. 299-312, 2014.
[91] The University of Iowa Research Foundation, WO/1996/002555 (February 1, 1996).
[92] Cambridge Biotech Corp., US Pat. No. 5,057,540 (October 15, 1991).
[93] Stoute et al., "A Preliminary Evaluation of a Recombinant Circumsporozoite Protein Vaccine against Plasmodium falciparum malaria. RTS, S Malaria Vaccine Evaluation Group," N. Engl. J. Med., vol. 336, no. 2, pp. 86-91, 1997.
[94] Afiris AG, US Pre-grant Pub. No. 2015/0093431 (April 2, 2015).
[95] Novartis AG, WO/2011/027222 (March 10, 2011).
[96] Novartis AG, Patent US Pre-grant Pub No. 2012/0237546 (September 9, 2012).
[97] Buonsanti et al., "Novel Adjuvant Alum-TLR7 Significantly Potentiates Immune Response to Glycoconjugate Vaccines," Sci. Rep., vol. 6, p. 29063, 2016.
[98] Sabroe et al., "Toll-Like Receptors in Health and Disease: Complex Questions Remain," J. Immunol., vol. 171, no. 4, pp. 1630-1635, 2003.
[99] Smithkline Beecham Biologicals S.A., Patent WO/1995/017210 (June 29, 1995).
[100] Reilly, William J. Jr., "Chapter 36: Pharmaceutical Excipients," in Remington Essentials of Pharmaceutics, London, Pharmaceutical Press, 2012, pp. 683-704.
[101] Wacker et al., "N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli," Science, vol. 298, no. 5599, pp. 1790-1793, 2002.
[102] Shepherd et al., "Comparison of O-antigen gene clusters of Escherichia coli (Shigella) sonnei and Plesiomonas shigelloides O17: sonnei gained its current plasmid-borne O-antigen genes from P. shigelloides in a recent event," Infect. Immun., vol. 68, no. 10, pp. 6065-6061, 2000.
[103] Hartley et al., "Biochemical Characterization of the O-Linked Glycosylation Pathway in Neisseria gonorrhoeae Reponsible for Biosynthesis of Protein Glycans Containing N,N'-Diacetylbacillosamine," Biochemistry, vol. 50, no. 22, pp. 4936-4948, 2011.
[104] Anonsen et al., "Characterization of a Unique Tetrasaccharide and Distinct Glycoproteome in the O-Linked Protein Glycosylation System of Neisseria elongata subsp. glycolytica," J. Bacteriology, vol. 198, no. 2, pp. 256-267, 2016.
[105] Endo and Koizumi, "Large-Scale Production of Oligosaccharides Using Engineered Bacteria" 2000 Curr. Op. in Structural Bio., vol. 10, pp. 536-541 (also in HANDBOOK OF CARBOHYDRATE ENGINEERING 1ST ED. 2005).
[106] Clausen et al., "Chapter 56: Glycosylation Engineering" in ESSENTIALS OF GLYCOBIOLOGY 3 Ed. 2017 (available at https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK453027/).

Claims (24)

  1. 少なくとも1つのGlycoTagを含むキャリアタンパク質を含む修飾キャリアタンパク質であって、該少なくとも1つのGlycoTagが、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL GlycoTag(NgGlycoTag)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)PglL GlycoTag(NlGlycoTag)、若しくはナイセリア・シャエガニ(Neisseria shayeganii)GlycoTag(NsGlycoTag)、又はそれらの組み合わせである、前記修飾キャリアタンパク質。
  2. 少なくとも1つのNgGlycoTagが、12～30アミノ酸長であり且つその中に配列番号147の配列を含むペプチド配列からなる、請求項１に記載の修飾キャリアタンパク質。
  3. 少なくとも1つのNlGlycoTagが、12～35アミノ酸長であり且つその中に配列番号151の配列を含むペプチド配列からなる、請求項１に記載の修飾キャリアタンパク質。
  4. 少なくとも1つのNsGlycoTagが、12～31アミノ酸長であり且つその中に配列番号164の配列を含むペプチド配列からなる、請求項１に記載の修飾キャリアタンパク質。
  5. 少なくとも1つのGlycoTagを含むキャリアタンパク質を含む修飾キャリアタンパク質であって、該少なくとも1つのGlycoTagが、12～19アミノ酸長であり且つその中に配列142を含むペプチド配列からなるナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL GlycoTag(NmGlycoTag)である、前記修飾キャリアタンパク質。
  6. キャリアタンパク質が、コレラ毒素bサブユニット(CTB)、破傷風トキソイド(TT)、破傷風毒素Cフラグメント(TTc)、ジフテリアトキソイド(DT)、CRM197、緑膿菌外毒素A(EPA)、C.ジェジュニ(C. jejuni)のアクリフラビン耐性タンパク質A(CjAcrA)、大腸菌のアクリフラビン耐性タンパク質A(EcAcrA)、及び緑膿菌PcrV(PcrV)からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか1項に記載の修飾キャリアタンパク質。
  7. 少なくとも1つのナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL GlycoTag(NmGlycoTag)を含む緑膿菌外毒素A(EPA)キャリアタンパク質を特徴とする修飾キャリアタンパク質であって、該少なくとも1つのNmGlycoTagが、配列番号1について、残基A14、D36、Q92、G123、E157、A177、Y208、N231、E252、R274、A301、Q307、A365、S408、T418、A464、A519、G525、A533、S585、K240若しくはA375、又はそれらの組み合わせに位置する、前記修飾キャリアタンパク質。
  8. 少なくとも1つのNmGlycoTagが、12～29アミノ酸長であり且つその中に配列番号142の配列を含むペプチド配列からなる、請求項７に記載の修飾キャリアタンパク質。
  9. 請求項１～８のいずれか1項に記載の修飾キャリアタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
  10. 請求項９に記載の核酸分子を含むベクターであって、前記修飾キャリアタンパク質ヌクレオチド配列が、ペリプラズムシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されている、前記ベクター。
  11. ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)PglL(NmPglL)オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)PglL(NgPglL)OTase、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)020-06(NlPglL)OTase、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)ATCC 23970 PglL(NlATCC23970PglL)OTase、又はナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)F62 PglL(NgF62PglL)OTaseをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子をさらに含む、請求項１０に記載のベクター。
  12. 請求項１０又は１１に記載のベクターを含む、グラム陰性細菌宿主細胞。
  13. 以下：
    (a) PglLグリカン基質；
    (b) PglLグリカン基質を脂質キャリア上に構築することができるグリコシルトランスフェラーゼ；
    (c) ペリプラズムを標的とする請求項１～８のいずれか1項に記載の修飾キャリアタンパク質；及び
    (d) PglL OTase
    をコードする1つ以上の核酸分子を含む、グラム陰性細菌細胞。
  14. ペリプラズムに、以下：
    (a) 脂質キャリア結合PglLグリカン基質、
    (b) 請求項１～８のいずれか1項に記載の修飾キャリアタンパク質、及び
    (c) PglL OTase
    を含む、グラム陰性細菌細胞。
  15. 以下：
    (a) PglLグリカン基質、
    (b) 請求項１～８のいずれか1項に記載の修飾キャリアタンパク質、及び
    (c) PglL OTase
    を含む、組成物。
  16. 請求項１～８のいずれか1項に記載の修飾キャリアタンパク質と1つ以上の他の分子とを含むコンジュゲート。
  17. O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質の製造方法であって、グラム陰性細菌宿主細胞を培養することを含み、ここで該グラム陰性細菌宿主細胞が：
    (a) 脂質キャリア結合PglLグリカンを製造し、
    (b) ペリプラズムシグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結された請求項1～8のいずれか1項に記載の修飾キャリアタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現し、
    (c) PglL OTaseをコードするヌクレオチド配列を発現し、これによりO-グリコシル化修飾キャリアタンパク質を製造する、
    前記方法。
  18. O-グリコシル化修飾キャリアタンパク質の製造方法であって、グラム陰性細菌宿主細胞を培養することを含み、ここで該グラム陰性細菌宿主細胞が：
    (a) 脂質キャリア結合PglLグリカン基質を含み、
    (b) ペリプラズム中に修飾キャリアタンパク質を含み、
    該修飾キャリアタンパク質が、少なくとも1つのNgGlycoTag、NlGlycoTag、又はNsGlycoTagを含むキャリアタンパク質を特徴とし、
    (c) ナイセリア(Neisseria)PglL OTaseを含む、
    前記方法。
  19. コンジュゲートの作製方法であって、請求項１～８のいずれか1項に記載の修飾キャリアタンパク質の存在下でPglL OTaseとPglLグリカン基質とを接触させ、これによりコンジュゲートを作製すること、場合によりその後該コンジュゲートを単離することを含む、前記方法。
  20. 1つ以上の免疫原性グリカンに共有結合している請求項１～８のいずれか1項に記載の修飾キャリアタンパク質を含む免疫原性組成物。
  21. 哺乳動物における抗体応答を誘導する方法であって、該哺乳動物に免疫学的有効量の請求項２０に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、前記方法。
  22. 哺乳動物における抗体応答の誘導において使用するための、請求項２０に記載の免疫原性組成物。
  23. 哺乳動物における抗体応答を誘導するための、請求項２０に記載の免疫原性組成物の使用。
  24. 哺乳動物における抗体応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項２０に記載の免疫原性組成物の使用。
JP2021533480A 2018-12-12 2019-12-11 Ｏ－結合型グリコシル化のための修飾キャリアタンパク質 Pending JP2022513458A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18212100 2018-12-12
EP18212100.4 2018-12-12
PCT/EP2019/084632 WO2020120569A2 (en) 2018-12-12 2019-12-11 Modified carrier proteins for o-linked glycosylation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022513458A true JP2022513458A (ja) 2022-02-08

Family

ID=65009496

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021533480A Pending JP2022513458A (ja) 2018-12-12 2019-12-11 Ｏ－結合型グリコシル化のための修飾キャリアタンパク質

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220054632A1 (ja)
EP (1) EP3894431A2 (ja)
JP (1) JP2022513458A (ja)
CN (1) CN113227125A (ja)
WO (1) WO2020120569A2 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL308201A (en) 2020-09-17 2024-01-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Multivalent vaccine compositions and uses thereof
CN113588856B (zh) * 2021-07-16 2023-07-21 深圳大学 一种高通量大规模筛选组蛋白修饰结合蛋白质的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3231868A1 (en) * 2014-12-08 2017-10-18 Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, China O-antigen carbohydrate chain extended salmonella paratyphi a and use thereof

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4673574A (en) 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
US4695624A (en) 1984-05-10 1987-09-22 Merck & Co., Inc. Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency
US4709017A (en) 1985-06-07 1987-11-24 President And Fellows Of Harvard College Modified toxic vaccines
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
EP0449856B1 (en) 1988-12-16 2001-09-12 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
CA2129899C (en) 1992-02-11 2011-01-04 James J. Mond Dual carrier immunogenic construct
JP3506431B2 (ja) 1992-05-06 2004-03-15 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ジフテリア毒素受容体結合領域
WO1993025210A1 (en) 1992-06-18 1993-12-23 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines
JP3828145B2 (ja) 1993-09-22 2006-10-04 ヘンリー エム．ジャクソン ファウンデイション フォー ザ アドバンスメント オブ ミリタリー メディスン 免疫原性構成物の製造のための新規シアン化試薬を使った可溶性炭水化物の活性化方法
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5917017A (en) 1994-06-08 1999-06-29 President And Fellows Of Harvard College Diphtheria toxin vaccines bearing a mutated R domain
ES2267100T5 (es) 1994-07-15 2011-04-08 The University Of Iowa Research Foundation Oligonucleótidos inmunomoduladores.
ES2200059T3 (es) 1995-03-22 2004-03-01 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Produccion de construcciones inmunogenicas usando carbohidratos solubles activados mediante reactivos cianilados organicos.
CA2297374A1 (en) 1997-07-21 1999-01-28 North American Vaccine, Inc. Modified immunogenic pneumolysin, compositions and their use as vaccines
CA2365296A1 (en) 1999-03-19 2000-09-28 Pierre Michel Desmons Vaccine
DE60303591T2 (de) 2002-03-07 2007-03-01 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich System und methode zur herstellung von rekombinanten, glykosylierten protein in prokaryontischen wirtszellen
ES2295836T3 (es) 2003-03-13 2008-04-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Procedimiento de purificacion de citolisina bacteriana.
GB0421083D0 (en) 2004-09-22 2004-10-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Purification process
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP1888761B1 (en) 2005-05-11 2010-09-29 ETH Zurich Recombinant n-glycosylated proteins from procaryotic cells
ES2376492T3 (es) 2006-03-23 2012-03-14 Novartis Ag Compuestos de imidazoquinoxalina como inmunomoduladores.
CA2646891A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
US9238830B2 (en) 2006-12-13 2016-01-19 The Governors Of The University Of Alberta Methods and systems for O-glycosylating proteins
DK2257307T3 (en) 2008-02-20 2018-08-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa BIOCONJUGATES MANUFACTURED FROM RECOMBINANT N-Glycosylated PROTEINS FROM PROCARYOTIC CELLS
CN102844047B (zh) 2009-09-02 2017-04-05 诺华股份有限公司 含tlr活性调节剂的免疫原性组合物
PL2501406T3 (pl) 2009-11-19 2018-05-30 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Biosyntetyczny układ wytwarzający immunogenne polisacharydy w komórkach prokariotycznych
JP6339366B2 (ja) 2010-05-06 2018-06-06 グリコヴァキシン アーゲー 莢膜グラム陽性菌のバイオコンジュゲートワクチン
EP2659907A1 (en) 2012-05-01 2013-11-06 Affiris AG Compositions
US20150238596A1 (en) 2012-09-10 2015-08-27 Glycovaxyn Ag Bioconjugates comprising modified antigens and uses thereof
AU2014289342B2 (en) 2013-07-07 2018-05-31 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Synthetic vaccines against Streptococcus pneumoniae type 1
CN105695497B (zh) 2014-11-27 2019-09-24 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种细菌多糖修饰的重组融合蛋白的制备方法及其应用
JP6622804B2 (ja) 2014-12-12 2019-12-18 マックス プランク ゲゼルシャフト ツゥアー フェデルゥン デル ヴィッセンシャフテン エー フォー ストレプトコッカス ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４に対するワクチン
DK3303357T3 (da) 2015-06-08 2021-08-02 Max Planck Gesellschaft Vacciner mod streptococcus pneumoniae serotype 5
GB201518668D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic Comosition

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3231868A1 (en) * 2014-12-08 2017-10-18 Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, China O-antigen carbohydrate chain extended salmonella paratyphi a and use thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"class II pilin PilE [Neisseria lactamica 020-06].", DATABASE DDBJ/EMBL/GENBANK [ONLINE], JPN6023050043, 3 November 2016 (2016-11-03), ISSN: 0005211381 *
"fimbrial protein EcpC [Neisseria shayeganii 871].", DATABASE DDBJ/EMBL/GENBANK [ONLINE], JPN6023050044, 29 September 2011 (2011-09-29), ISSN: 0005211382 *
"pilin, partial [Neisseria gonorrhoeae].", DATABASE DDBJ/EMBL/GENBANK [ONLINE], JPN6023050042, 26 July 2016 (2016-07-26), ISSN: 0005211380 *
CHAO PAN , PENG SUN , BO LIU , HAOYU LIANG , ZHEHUI PENG , YAN DONG , DONGSHU WANG , XIANKAI LIU , B: "Biosynthesis of Conjugate Vaccines Using an O-Linked Glycosylation System", AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, vol. Vol.7, No.2, e00443-16, JPN6023050041, 26 April 2016 (2016-04-26), pages 1 - 11, ISSN: 0005211379 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020120569A2 (en) 2020-06-18
EP3894431A2 (en) 2021-10-20
CN113227125A (zh) 2021-08-06
US20220054632A1 (en) 2022-02-24
WO2020120569A3 (en) 2020-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Harding et al. A platform for glycoengineering a polyvalent pneumococcal bioconjugate vaccine using E. coli as a host
JP7370391B2 (ja) 大腸菌ｏ抗原多糖のバイオコンジュゲート、その製造方法およびその使用方法
AU2013343520B2 (en) Production of recombinant vaccine in E. Coli by enzymatic conjugation
EP2142660B1 (en) Methods and systems for o-glycosylating proteins
JP6682451B2 (ja) 改変型宿主細胞およびその使用
KR20150054800A (ko) 변형된 항원을 포함하는 생체접합체 및 이의 용도
US20140336366A1 (en) Bioconjugate vaccines made in prokaryotic cells
WO2013020988A1 (en) Pasteurellaceae vaccines
US20230226175A1 (en) Modified exotoxin a proteins
US20220088211A1 (en) O-linked glycosylation recognition motifs
Duke et al. Development and immunogenicity of a prototype multivalent group B Streptococcus bioconjugate vaccine
JP2022513458A (ja) Ｏ－結合型グリコシル化のための修飾キャリアタンパク質
US20240066109A1 (en) Klebsiella Pneumoniae O-Antigen Glycosylated Proteins and Methods of Making and Uses Thereof
US20230346902A1 (en) Shigella-Tetravalent (Shigella4V) Bioconjugate
KR20220035377A (ko) 람노오스-다당류
WO2024077205A2 (en) Moraxellaceae o-linking oligosaccharyltransferases, glycosylation fragments, and uses thereof
Ajay Castro et al. A platform for the recombinant production of Group A Streptococcus glycoconjugate vaccines
JP2024517754A (ja) Ｏ－結合型グリコシル化に十分な最小シークオン
JP2022541911A (ja) バイオコンジュゲートグリコシル化の定量化
EA046206B1 (ru) Биоконъюгаты полисахаридных о-антигенов e.coli, способы их получения и способы их применения

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210812

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20221201

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20231120

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20231205

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240228