DE602004010376T2

DE602004010376T2 - Verfahren zur reinigung von bakteriellem cytolysin

Info

Publication number: DE602004010376T2
Application number: DE602004010376T
Authority: DE
Inventors: Ralph Biemans; Carine Goraj; Emmanuel Mertens; Anne Vandercammen
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2003-03-13
Filing date: 2004-03-11
Publication date: 2008-10-23
Anticipated expiration: 2024-03-12
Also published as: MXPA05009579A; US8815254B2; EP1601689A2; CA2812817C; NO336672B1; HK1086013A1; IS2587B; RU2005125832A; JP2006520205A; EG24449A; EP1601689B1; ES2295836T3; DK1601689T3; RU2340627C2; NO20054134D0; CA2518669A1; AU2004219910A1; JP2010259448A; AU2010212257B2; JP5683866B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der bakteriellen Cytolysinreinigung und insbesondere ein Verfahren der Reinigung von Pneumolysin. Pneumolysin ist ein Protein aus Streptokokkus pneumoniae mit guten antigenen Eigenschaften, das als ein Impfungsbestandteil gegen S. pneumoniae Infektion oder Otitis media geeignet ist. Das Verfahren der Erfindung beschreibt einen ungewöhnlichen und vorteilhaften Schritt der Reinigung von Pneumolysin in einem einzelnen chromatographischen Schritt durch Bindung von ihm an eine hydrophobe Wechselwirkungssäule in der Gegenwart eines Detergens und Hochsalzes. Das Verfahren verwendet günstig die Eigenschaft der bakteriellen Cytolysine der hohen Affinität für aromatische Verbindungen, die Cholesterin ähneln, insbesondere, wenn sie in einem aggregierten Zustand vorliegen und daher allgemein für die Reinigung von Mitgliedern dieser Familie von Toxinen anwendbar sein werden.
Thiol-aktivierte Cytolysine bilden eine hervortretende Gruppe von bakteriellen Toxinen, von denen Streptolysin O der Prototyp ist (Billington et al. FEMS Microbiol. Lett. (2000), 182; 197–205). Diese Toxine sind für eukaryotische Zellen durch die Bildung von Poren in der Zellmembran lytisch. Oxidierende Wirkstoffe beeinflussen ihre cytolytische Aktivität negativ, während reduzierende Wirkstoffe ihre Aktivität wiederherstellen können. Mitglieder dieser Gruppe zeigen eine 30–60% Ähnlichkeit in der primären Aminosäuresequenz und enthalten eine fast invariante Undecapeptidsequenz nahe dem C-Ende. Cholesterin ist der Hauptzielzellrezeptor für diese Toxine. Die Cytolysine binden an Cholesterin enthaltende Membranen und oligomerisieren, um Transmembranporen bis zu 30 nm im Durchmesser und bestehend aus 40–80-Monomer-Unterheiten zu bilden. Die Bindung von Membrancholesterin induziert eine konformationelle Änderung in dem Toxinmonomer, was die darauf folgenden Ereignisse der Oligomerisation, Membraninsertion und Porenbildung antreibt.
Streptokokkus pneumoniae ist der Krankheitserreger von verschiedenen menschlichen Erkrankungen, einschließlich Pneumonie, Bacteriämie, Meningitis, Otitis media und Sinusitis. Manchmal können diese Erkrankungen trotz der Erhältlichkeit von Antibiotika zum Tode führen. Das Auftreten von Antibiotika-resistenten Stämmen von S. pneumoniae hat die Probleme, die durch dieses Pathogen hervorgerufen werden, verschlimmert. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, dass effektive Impfstoffe gegen S. pneumoniae entwickelt werden.
Polyvalente Pneumokokkenimpfstoffe, die gereinigte kapsuläre Polysaccharide enthalten, sind seit mehreren Jahren erhältlich. Ihre Anwendung wird durch schlechte Immunogenität begrenzt, insbesondere bei Hochrisikogruppen, einschließlich Kindern, älteren Menschen und denjenigen mit Sichelzellenanämie, multiplem Myelom, Zirrhose oder Alkoholismus. Sie stellen auch einen Serotyp-spezifischen Schutz bereit und durch die existierenden Formulierungen werden nur 23 von 90 bekannten Serotypen abgedeckt. Dies ergibt einen Schutz gegen 90% der Serotypen, die in der US-Population gefunden werden, aber nur gegen ungefähr 70% der Serotypen, die in asiatischen Populationen gefunden werden. Kürzlich wurde ein konjugierter sieben-valenter Impfstoff erhältlich, der ähnliche Probleme beim Schutz gegen alle Pneumokokkenstämme aufweist.
Pneumolysin (Ply) ist ein 53 kDa Thiol-aktiviertes Cytolysin, das in allen Stämmen von S. pneumoniae gefunden wird, das bei Autolyse freigesetzt wird und zu der Pathogenese von S. pneumoniae beiträgt. Es ist hoch konserviert, wobei nur wenige Aminosäuresubstitutionen zwischen den Ply-Proteinen von verschiedenen Serotypen auftreten. Der hohe Grad der Konservierung von Pneumolysin und seine Immunogenität machen es zu einem potentiellen Kandidaten als einem Impfstoffbestandteil. Wildtyp-Ply ist jedoch für den Einschluss in Impfstoffe für die Verwendung beim Menschen wegen seiner Toxizität ungeeignet. Ply ruft Schaden an den Zellmembranen durch Wechselwirkung mit Membran-gebundenem Cholesterin und Oligomerisierung, um Poren in der Membran zu bilden, hervor. Ein konserviertes Cystein-enthaltendes Motiv, das nahe dem C-Ende gefunden wird, scheint in die lytische Aktivität verwickelt zu sein. Es wurden Mutationen von Ply vorgeschlagen, um diese Toxizität zu senken ( WO 90/06951 , WO 99/03884 ).
Es wurde ein Zweischrittverfahren für die Reinigung von Pneumolysin durch Lock et al. (Microbial Pathogenesis (1996) 21; 71–83) beschrieben. Rekombinantes Pneumolysin wird aus einer E. coli-Kultur unter Verwendung einer Kombination von Innenaustausch- und Gelfiltrations-Chromatographie gereinigt. Das Verfahren involviert die Schritte der Herstellung eines Extraktes, den man eine DEAE-Sepharose-Säule, gefolgt von einer Sephacryl S200-HR-Säule hinunterfließen lässt. Dieses Verfahren könnte verwendet werden, um rekombinantes oder natives Pneumolysin zu reinigen.
Kuo et al. beschreiben ein Verfahren der Reinigung von rekombinanten GST-Pneumolysin-Fusionsprotein (Infection and Immunity (1995) 63; 2706–2713). Das Fusionsprotein wird in einer E. coli-Kultur exprimiert und ein Zell-Lysat wird auf ein Glutathion-Agarosegel geladen. Das Fusionsprotein wird mit Glutathion eluiert und Thrombin kann verwendet werden, um das Fusionsprotein zu spalten. Die Proteine lässt man wieder über eine Glutathion-Agarosesäule fließen, um GST zu entfernen. Das Affinität-gereinigte Pneumolysin wurde unter Verwendung einer Hydroxylapatitsäule weiter gereinigt.
Mitchell et al. (BBA (1989) 1007; 67–72) beschreiben ein Verfahren der Reinigung von Pneumolysin unter Verwendung von hydrophober Wechselwirkungs-Chromatographie. Unter den Bedingungen, die sie verwenden (250 mM Salz) schaffte es das Pneumolysin nicht, eng an die Säule zu binden, obwohl seine Vorwärtsbewegung verzögert wurde und das Pneumolysin als ein breiter Peak eluierte. Zusätzliche Schritte der Bestimmung, welche Fraktionen reines Pneumolysin enthielten, Konzentrationen der positiven Fraktionen, erneute Ladung auf die Säule und Flution mit einer kleinen Menge Wasser waren nötig, um das Problem des Pneumolysins, das an das Säulenmaterial nicht eng band, zu überwinden.
Es bleibt ein anhaltender Bedarf für verbesserte Impfstoffe gegen S. pneumoniae. Der Einschluss eines Ply-Bestandteiles ist vielversprechend, obwohl die Toxizität des Proteins ein Problem bleibt. Die Entwicklung eines schnellen und effektiven Verfahrens für die Massenreinigung von Pneumolysin ist auch erforderlich. Die Verfahren, die zuvor beschrieben wurden, involvieren die Verwendung von multiplen Reinigungsschritten mit dazwischen liegenden Assay- und Konzentrationsschritten. Die vorliegende Erfindung stellt ein effizienteres Reinigungsverfahren bereit, das günstig einen einzelnen Chromatographieschritt verwendet, der in der Lage ist, zur Reinigung von großen Chargen von Pneumolysin verwendet zu werden.
Beschreibung der Figuren
1 – SDS-PAGE-Gele, die die Reinigung von Pneumolysin zeigen. Die folgenden Proben ließ man auf SDS-PAGE-Gelen laufen: Bahn 1 – Molekulargewicht-Standards, Bahn 2 – Überstand von Zellextrakt, Bahn 3 – Phenyl-Sepharose-Durchfluss, Bahn 4 Phenyl-Sepharose erstes Waschen, Bahn 5 – Phenyl-Sepharose zweites Waschen, Bahn 6 Phenyl-Sepharose Waschen mit 0,5 M NaCl, Bahn 7 Phenyl-Sepharose-Flution mit Niedrigsalzpuffer, Bahn 8 Pneumolysin nach Denaturierung/Rückfaltungsschritten, Bahn 9 – Pneumolysin nach sterilisierender Filtration.
Tafel A zeigt das Gel nach Coomassieblau-Färbung. Tafel B zeigt das Gel nach einem Western-Blotting-Verfahren unter Verwendung von anti-E. coli-Antikörpern, um auf kontaminierende Proteine zu sondieren.
2 – SDS-PAGE-Analyse von GMBS (N-(γ-Maleimidobutyryloxy)succinimidester) modifiziertes Pneumolysin-Coomassieblau gefärbt.
Die folgenden Proben wurden auf einem SDS-PAGE-Gel laufen gelassen: – Bahn 1 – Molekulargewichtstandards, Bahn 2 – nicht modifiziertes Pneumolysin, Bahn 3 – PLY, behandelt mit GMBS in einem molaren Verhältnis von GMBS/Lysin von 4/1, Bahn 4 – PLY, behandelt mit GMBS in einem molaren Verhältnis von GMBS/Lysin von 4/1 und für 7 Tage bei 37°C inkubiert, Bahn 5 – PLY, behandelt mit GMBS in einem molaren Verhältnis von GMBS/Lysin von 8/1, Bahn 6 – PLY, behandelt mit GMBS in einem molaren Verhältnis von GMBS/Lysin von 8/1 nach Inkubation für 7 Tage bei 37°C, Bahn 7 – PLY, behandelt mit Sulfo-NHS-acetat in einem molaren Verhältnis von NHS/Lysin von 10/1, Bahn 8 – PLY, behandelt mit NEM, Bahn 9 – PLY, behandelt mit NEM nach 7 Tagen Inkubation bei 37°C.
3 – Toxizität von GMBS-behandeltem Pneumolysin, das intranasal an Mäuse verabreicht wird. Die mit Rauten markierte Linie zeigt die Überlebensrate für Mäuse an, die mit 2 μg nativem Pneumolysin provoziert wurden. Die mit Quadraten markierte Linie zeigt die Überlebensrate für Mäuse an, die mit 10 μg GMBS-behandeltem Pneumolysin provoziert wurden.
4 – Schutz, der durch GMBS-behandeltes Pneumolysin bei Mäusen induziert wurde, die intranasal mit nativem Pneumolysin provoziert wurden. Die mit Rechtecken markierte Linie zeigt die Überlebensrate bei Mäusen, die mit einem Adjuvans allein geimpft wurden. Die mit Rauten markierte Linie zeigt die Überlebensrate für Mäuse an, die mit nativem Pneumolysin geimpft wurden. Die mit Quadraten markierte Linie zeigt die Überlebensrate für Mäuse an, die mit GMBS behandeltem Pneumolysin geimpft wurden.
5 – Schutz, der durch Impfung mit PhtD und GMBS behandeltem Pneumolysin bei Mäusen induziert wird, die intranasal mit Typ 2 D39 Pneumokokkenstamm provoziert wurden. Die mit Rechtecken markierte Linie stellt die Überlebensrate für Mäuse dar, die mit Adjuvans allein geimpft wurden. Die mit Rauten markierte Linie stellt die Überlebensrate für Mäuse dar, die mit PhtD geimpft wurden. Die mit Rechtecken markierte Linie stellt die Überlebensrate für Mäuse dar, die mit PhtD und GMBS behandeltem Pneumolysin geimpft wurden.
Ausführliche Beschreibung
Verfahren
Das Verfahren der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung eines bakteriellen Cytolysins, wie Pneumolysin. Ein Cytolysin, z. B. Pneumolysin, wird unter Verwendung von nur einem einzigen Säulenchromatographieschritt gereinigt, ohne dass eine Wiederbeladung auf die Säule notwendig ist. Das Protein wird in einer aggregierten Form an eine hydrophobe Wechselwirkungssäule in der Gegenwart eines Detergens und Salzes gebunden. Wenige Proteine binden unter diesen Bedingungen an die Säule, was die Reinigung eines Cytolysins in einem einzelnen Schritt erlaubt.
Für die Zwecke der Erfindung ist ein lösliches Aggregat eines Cytolysins, vorzugsweise Pneumolysin, eine aggregierte Form des Cytolysins, die nach der Zentrifugation bei 30.000 g für 20 Minuten in dem Überstand verbleibt. Das lösliche Aggregat wird auf einem hydrophoben Wechselwirkungs-Chromatographiematerial, vorzugsweise Phenyl-Sepharose, in der Gegenwart eines Hochsalzes, vorzugsweise 1 M, zurückgehalten. Optional ist das lösliche Aggregat kolloidal.
Das Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, wird an die Säule als ein lösliches Aggregat gebunden. Es ist aus verschiedenen Gründen ungewöhnlich, Aggregate auf eine Säule zu laden, einschließlich Verstopfung von Filtern oder Säulen und Verlust an Material. Durch Verwendung eines Detergens, das die Größe der Aggregate reduziert, um ein lösliches Aggregat zu bilden, wird jedoch gefunden, dass diese Aggregate unter Detergensbedingungen fest an die Säule binden, aber in einer Reinheit von mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, vorzugsweise 90%, 95%, mehr vorzuziehen 97%, 98% oder 99%, wie durch SDS-PAGE-Analyse bestimmt wird, ohne nachteilige Beeinflussung der Säulenfilter eluiert werden können. Das Verfahren bringt vorzugsweise einen Ertrag von mindestens 100, 200, 500, 700, mehr vorzuziehen 1.000, 1.500, 1.700 oder 1.900 mg Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, pro Liter Fermentation. Vorzugsweise werden mindestens 1%, 2%, 5%, 7%, 9% oder 10% des Proteins aus der Fermentationskultur als gereinigtes Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, gewonnen.
Das Verfahren nutzt die Fähigkeit des Cytolysins, wie Pneumolysin, aus, an Cholesterin und andere aromatische Verbindungen zu binden. Diese Bindung ist besonders eng, wenn das Cytolysin aggregiert ist, was es dem Cytolysin erlaubt, in der Gegenwart von Detergens zu binden. Das Verfahren kann auf andere Mitglieder der Cytolysinfamilie ausgedehnt werden, da alle Mitglieder die Fähigkeit teilen, an aromatische Verbindung zu binden und Poren zu bilden. Tatsächlich könnte das Verfahren verwendet werden, um andere Familien von Proteinen, die an Cholesterin oder andere aromatische Verbindungen binden, und/oder Poren bilden, vorzugsweise beides, zu reinigen.
Gemäß einer ersten Ausführungsart wird ein Verfahren zur bakteriellen Cytolysinreinigung bereitgestellt, umfassend die Schritte:

a) Züchten einer Kultur von Zellen, die bakterielles Cytolysin exprimieren;
b) Herstellen eines Extraktes aus der Kultur, die bakterielles Cytolysin enthält;
c) Bindung von löslichem aggregierten bakteriellen Cytolysin, das in dem Extrakt enthalten ist, in der Gegenwart eines Detergens (vorzugsweise aliphatischem Detergens) an ein hydrophobes Wechselwirkungs-Chromatographiematerial unter Hochsalzbedingungen von 0,6–2 M Salz;
d) Flution von bakteriellem Cytolysin in der Gegenwart von Detergens (vorzugsweise aliphatischem Detergens) unter Niedrigsalzbedingungen von 0–0,2 M Salz.

Bei einer zweiten Ausführungsart wird ein Verfahren zur bakteriellen Cytolysinreinigung bereitgestellt, umfassend die Schritte:

a) Züchten einer Kultur von Zellen, die bakterielles Cytolysin exprimieren;
b) Herstellung eines Extraktes aus der Kultur, enthaltend bakterielles Cytolysin;
c) Bindung von bakteriellem Cytolysin, das in dem Extrakt enthalten ist, an ein hydrophobes Wechselwirkungs-Chromatographiematerial in der Gegenwart einer Lösung, die 0,5–2 M Salz und 0,1%–5% Detgerens enthält;
d) Flution von baktieriellem Cytolysin unter Verwendung einer Niedrigsalzlösung, die 0–0,2 M Salz und 0,1–5% Detergens enthält. Bei jeder der obigen Ausführungsarten umfasst das Verfahren der Erfindung vorzugsweise die weiteren Schritte:
e) Entfernung von Detergens von dem bakteriellen Cytolysin;
f) Löslichmachen des bakteriellen Cytolysins durch Zugabe eines Denaturierungsmittels;
g) Entfernung des Denaturierungsmittels von dem bakteriellen Cytolysin.

Das Verfahren der Erfindung kann vorteilhaft verwendet werden, um Pneumokokken-Pneumolysin zu reinigen. Andere Cytolysine, die durch das Verfahren der Erfindung gereinigt werden können, beinhalten Pyolysin von A. pyogenes, Cereolysin von B. cereus, Thuringiolysin O von B. thuringiensis, Laterosporolysin von B. latersporus, Bifermentolysin von C. bifermentans, Botukinolysin von C. botulinum, Chauveolysin von C. chauvoel, Histolyticolysin von C. histolyticum, Oedematolysin von C. novyi Typ A, Perfringolysin O von C. perfringens, Septicolysin O von C. septicum, Sordellilysin von C. sordellii, Tetanolysin von C. tetani, Ivanolysin O von L. ivanovi, Listeriolysin O von L. monocytogenes, Seeligerilysin O von L. seeligeri, Alveolysin von P. alvei, Streptolysin O von S. pyogenes, S. canis oder S. equisimilis, Intermedilysin von S. intermedius, Suilysin von S. suis oder Pneumolysin von S. pneumoniae, die Wildtyp- oder genetisch modifizierte Toxine mit niedrigeren Toxizitätsspiegeln sein können, wie PdA und PdB, die oben beschrieben werden.
Mit Pneumolysin oder Ply wird gemeint: natives Pneumolysin von Pneumokokkus oder rekombinantes Pneumolysin, Wildtyp-Pneumolysin oder Mutanten von Pneumolysin (z. B. diejenigen, die in WO 90/06951 und WO 99/03884 beschrieben werden). Wahlweise kann Pneumolysin auch irgendein Fragment von Pneumolysin oder irgendeine Variante von Pneumolysin bedeuten, die mindestens 70, 80, 90 oder 95% Aminosäuresequenz-Identität mit einer Wildtyp-Pneumolysinsequenz teilt, die noch die Fähigkeit behält, durch die Verfahren der Erfindung gereinigt zu werden, wie durch einen Fachmann einfach bestimmt werden kann.
Bei bevorzugten Ausführungsarten der Erfindung liegt das gleiche Detergens in den Schritten b) und c), b) und d), c) und d), mehr vorzuziehen in den Schritten b), c) und d), vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1%–5% (w/v) vor. Für die Zwecke der Erfindung ist ein aliphatisches Detergens als ein im Wesentlichen aliphatisches Detergens mit unzureichendem aromatischen Charakter definiert, um die Bindung von Cytolysin an die Säule in Schritt c) zu verhindern. Vorzugsweise wird das Detergens einen oder weniger aromatische Ringe aufweisen, am Besten besitzt es keine aromatischen Ringe. Während Schritt b) ist es für das Detergens vorteilhaft, größere Aggregate von Cytolysin in kleinere Aggregate aufzubrechen, was für ein lösliches Aggregat sorgt. Während den Schritten c) und d) erhält das Detergens günstigerweise den löslichen aggregierten Zustand des Cytolysins, was es ihm erlaubt, an die Säule bei Hochsalzbedingungen mit hoher Affinität zu binden.
Das Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, wird in einer Kultur von bakteriellen Zellen, vorzugsweise S. pneumoniae, E. coli oder alternativ in Hefezellen, Insektenzellen, Säugerzellen oder irgendeinem anderen Expressionssystem, das für seine Expression geeignet ist, exprimiert. Bei Expressionssystemen, die hohe Erträge an Pneumolysin herstellen, aggregiert das Pneumolysin oft von selbst, und das Verfahren der Erfindung ist für seine Reinigung ideal. Vorzugsweise wird das Pneumolysin in hohen Erträgen exprimiert, so dass es mehr als 2, 3, 4, 5, 7 oder 10% des Gesamtproteins in dem Expressionssystem ausmacht. Vorzugsweise liegt das Pneumolysin in aggregierter Form vor und ist daher größtenteils ohne hämolytische Aktivität. Z. B. ist die Expression in E. coli in einem Fermentor unter einem Phagen λ-Promotor oder anderen Promotoren, die eine hohe Expression erlauben, einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt.
Vorzugsweise wird das Cytolysin aus dem Expressionssystem als ein Aggregat extrahiert. Alternativ kann ein Niederertrags-Expressionssystem lösliches Cytolysin bereitstellen. In diesem Fall wird der Extrakt, der Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, enthält, auf einen pH unter 7,5 eingestellt, was es dem Cytolysin ermöglicht, über einen Zeitraum von mindestens 8 Stunden, vorzugsweise mindestens 24 Stunden, zu aggregieren.
Die Herstellung eines Extraktes in Schritt b) involviert vorzugsweise einen oder mehrere Schritte der mechanischen Aufbrechung der Zellen und/oder Behandlung der Zellen mit Detergens. Wenn mit einem Hochertragsverfahren hergestellt, bleibt das Pneumolysin in der Form von Aggregaten, aber die Aggregate sollten klein genug sein, dass sie in dem Überstand nach Zentrifugation der Probe unter Bedingungen, die für die Pelletierung unlöslicher zellulärer Abfallprodukte notwendig sind, verbleiben. Vorzugsweise ist das Detergens, das bei der Erfindung verwendet wird, ein aliphatisches Detergens, das keine aromatischen Ringe enthält, vorzugsweise ein ionisches Detergens, mehr vorzuziehen ein kationisches oder anionisches Detergens und am Besten ist das Detergens Natriumlauroylsarcosinat. Bevorzugte Detergenzien sind in der Lage, Pneumolysin zu solubilisieren, während sie es in der Form von kleinen Aggregaten belassen, die an die hydrophobe Wechselwirkungssäule binden, ohne eine Blockierung von Filtern, die an der Säule angebracht sind, hervorzurufen. Bevorzugte Detergenzien sind in der Lage, die Größe von Pneumolysinaggregaten zu reduzieren, was es den Pneumolysinaggregaten erlaubt, ausreichend klein zu sein, so dass sie nach der Zentrifugation der Probe bei 30.000 g für 20 Minuten in dem Überstand verbleiben. Solche löslichen Aggregate sind als solche auf der hydrophoben Wechselwir kungssäule reinigungsfähig. Das Detergens liegt in einer Konzentration zwischen 0,1% und 5%, vorzugsweise 0,5% und 3% (w/v), vorzugsweise zwischen 0,75% und 2%, mehr vorzuziehen um 1% herum vor. Vorzugsweise ist das Detergens dialysierbar.
Nach mechanischem und/oder Detergensaufschluss der Kultur in Schritt b), beinhaltet das Verfahren der Erfindung die Zentrifugation des Zellmaterials und das Sammeln des Überstandes als der Extrakt, der auf das Chromatographiematerial während Schritt c) geladen werden soll. Pneumolysin liegt vorzugsweise in dem Überstand als ein lösliches Aggregat vor.
Das Verfahren der Erfindung verwendet hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie, um das Pneumolysin in einem einzelnen Schritt zu reinigen. Das Säulenmaterial, das in Schritt c) verwendet wird, enthält vorzugsweise aromatische Gruppen, vorzugsweise Phenylgruppen und mehr vorzuziehen ist es Phenyl-Sepharose.
Die Lösung, die in Schritt c) und/oder Schritt d) während der Beladung und Flution der Säule verwendet wird, umfasst ein ionisches Detergens, vorzugsweise ein kationisches oder anionisches Detergens, vorzugsweise ein Detergens, das bei Salzkonzentrationen über 0,5 M löslich ist, am Besten ist das Detergens Natriumlauroylsarcosinat. Das verwendete Detergens ist eines, das die Größe von Cytolysin-, vorzugsweise Pneumolysin-, Aggregaten reduzieren wird, was es dem Cytolysin erlaubt, als ein lösliches Aggregat in der Probe vorzuliegen, so dass es an das hydrophobe Wechselwirkungs-Säulenmaterial bindet, ohne irreversibel an der Säule festzuhängen. Das Detergens liegt in einer Konzentration von vorzugsweise zwischen 0,1% und 5%, vorzugsweise 0,5% und 3% (w/v), mehr vorzuziehen zwischen 0,75% und 2%, am Besten um 1% herum vor.
Die Lösung, die in Schritt c) und/oder d) verwendet wird, enthält ein Salz, vorzugsweise ein Salz, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Ammoniumchlorid, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Ammoniumsulfat, Natriumphosphat, Magnesiumphosphat, Ammoniumphosphat besteht, und ist vorzugsweise bei pH 6–8, vorzugsweise um pH 7 herum, gepuffert. Jeder Puffer, der in der Lage ist, den pH zwischen pH 5 und 9 zu erhalten, kann verwendet werden.
Die Lösung, die verwendet wird, um Pneumolysin an die Säule bei dem Verfahren der Erfindung zu binden, enthält eine hohe Salzkonzentration, vorzugsweise 0,6–2 M, mehr vorzuziehen um 1 M herum. Die Salzkonzentration wird so ausgewählt, dass das Pneumolysin in einer löslichen aggregierten Form vorliegt und in der Lage ist, an das hydrophobe chromatographische Material zu binden.
Wahlweise kann Schritt c) einen Extraschritt des Waschens der Säule bei intermediären Salzbedingungen von ungefähr 0,5 M Salz oder eine Salzkonzentration, die in der Lage ist, irgendwelche schlecht bindenden Unreinheiten zu entfernen, enthalten.
Das Verfahren der Erfindung verwendet einen absteigenden Salzgradienten, um Pneumolysin von der Säule zu eluieren. Vorzugsweise enthält die Niedrigsalzlösung, die verwendet wird, um den Salzgradienten in Schritt d) zu erzeugen, zwischen 0–0,1 M Salz, mehr vorzuziehen 0–40 mM Salz. Alternativ kann eine schrittweise Flution mit dem Niedrigsalzpuffer, der in Schritt d) verwendet wird, enthaltend zwischen 0–0,2 M Salz, mehr vorzuziehen 0–40 mM Salz, verwendet werden.
Optionale Schritte können zu dem Verfahren der Erfindung hinzugefügt werden, wenn es vorgezogen wird, das Pneumolysin zu denaturieren und es darauffolgend durch Entfernung des Denaturierungsmittels zurückzufalten. Diese optionalen Schritte stellen sicher, dass reines Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, mit einer nativen Struktur erhalten wird. Der erste optionale Schritt e) involviert die Entfernung des Detergens durch Diafiltration, Dialyse oder Verdünnung. Dieser Schritt involviert vorzugsweise Diafiltration/Dialyse gegen einen Puffer von pH 8–10, vorzugsweise um 9 herum, mehr vorzuziehen ist der Puffer einer, der in der Lage ist, bei alkalischen pH-Werten zu Puffern, am Besten ist der Puffer DEA. Diese Lösung besitzt vorzugsweise eine niedrige Innenstärke, vorzugsweise 10–50 mM, am Besten um 25 mM herum. Die Diafiltration oder die Dialyse wird vorzugsweise bei 4°C durchgeführt, aber wird alternativ bei Raumtemperatur durchgeführt.
Bei einem zweiten optionalen Schritt wird Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, denaturiert und durch Zugabe eines Denaturierungsmittels löslich gemacht. Vorzugsweise ist das Denaturierungsmittel, das in Schritt f) verwendet wird, Guanidinhydrochlorid, mehr vorzuziehen 5–8 M Guanidinhydrochlorid, am Besten ungefähr 6 M Guanidinhydrochlorid. Das Pneumolysin wird mit Guanidinhydrochlorid für mindestens 10 Minuten, vorzugsweise mindestens 1 Stunde, mehr vorzuziehen für ungefähr 1 Stunde, inkubiert.
Das Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, wird dann vorzugsweise mit 5–9 M Harnstoff, vorzugsweise ungefähr 8 M Harnstoff, während Schritt f) in Kontakt gebracht. Dies wird durch Diafiltration oder Dialyse des Cytolysins, vorzugsweise Pneumolysins, gegen Harnstoff erreicht. Vorzugsweise werden derselbe Puffer und pH während des Austausches von Denaturierungs mittel beibehalten. Vorzugsweise wird ein Reduktionsmittel (DTT, 2-Mercaptoethanol oder Glutathion) während des Austausches von Denaturierungsmittel zugegeben.
Vorzugsweise involviert Schritt f) das In-Kontakt-Bringen von Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, mit 5–8 M Guanidinhydrochlorid, gefolgt vom Austausch des Guanidinhydrochlorids mit 5–9 M Harnstoff.
Um zu verhindern, dass sich ungeeignete Disulfitbindungen bilden, während das Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, denaturiert wird, ist es günstig, sicherzustellen, dass ein Reduktionsmittel während zumindest einem Teil der Schritte f) und g) vorliegt. Ein bevorzugtes Reduktionsmittel ist 0,1–10 mM DTT, vorzugsweise ungefähr 1 mM DTT. Alternativ wird Glutathion oder 2-Mercaptoethanol verwendet. Die bevorzugte Konzentration von Glutathion ist 1–50 mM, mehr vorzuziehen 10–30 mM.
Der optionale Schritt g) involviert die Entfernung des Denaturierungsmittels, um Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, vorzugsweise durch Diafiltration oder Dialyse gegen einen Niedrigsalzpuffer von pH 6–11, vorzugsweise ungefähr pH 9, zurückzufalten. Vorzugsweise wird die Cytolysin-, vorzugsweise Pneumolysin-Konzentration bei mindestens 100 μg/ml, vorzugsweise zwischen 100 μg/ml und 1.000 μg/ml, mehr vorzuziehen bei ungefähr 500 μg/ml erhalten. Optional erfolgt die Diafiltration oder Dialyse gegen einen Puffer, der Propylenglycol mit zwischen 10 und 30%, vorzugsweise ungefähr 15%, enthält. Vorzugsweise wird ein Reduktionsmittel, wie oben beschrieben, während Schritt g) beibehalten. Die Diafiltration oder Dialyse wird vorzugsweise bei 4°C durchgeführt, aber wird alternativ bei Raumtemperatur durchgeführ.
Ein weiterer optionaler Schritt h) involviert die Entfernung des Reduktionsmittels, nachdem Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, rückgefaltet ist. Dies wird vorzugsweise durch Diafiltration oder Dialyse gegen einen Niedrigsalzpuffer von pH 6–11, vorzugsweise ungefähr pH 9, erreicht. Wahlweise erfolgt die Diafiltration oder die Dialyse gegen einen Puffer, der Propylenglycol mit zwischen 10 und 30%, vorzugsweise ungefähr 15% enthält. Die Diafiltration oder Dialyse wird vorzugsweise bei 4°C durchgeführt, aber wird alternativ bei Raumtemperatur durchgeführt.
Bei bevorzugten Verfahren der Erfindung wird Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, so rückgefaltet, dass seine hämolytische Aktivität bei über 25 %, 50%, 75%, am Besten über 90%, von derjenigen des richtig gefalteten Proteins wiederhergestellt wird. Für die Zwecke der Erfindung ist ein „gefaltetes" Protein ein Protein, das die tertiäre Struktur des Proteins, hergestellt durch ein nicht denaturierendes Verfahren, aufweist. In dem Falle von Wildtyp-Pneumolysin wäre die erwartete hämolytische Aktivität des rückgefalteten Pneumolysins 500.000–1.000.000 hämolytische Einheiten/mg Pneumolysin. In dem Fall von punktmutiertem Pneumolysin mit einer niedrigeren hämolytischen Aktivität wäre die hämolytische Aktivität des rückgefalteten Pneumolysins entsprechend niedriger.
Entgiftung eines Toxins
Das Cytolysin, das durch das Verfahren der Erfindung gereinigt wurde, vorzugsweise Pneumolysin, kann einem weiteren optionalen Schritt der Entgiftung durch chemische Behandlung unterworfen werden. Dieser zusätzliche Schritt ist besonders günstig, wenn das Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, an ein Tier oder einen Menschen verabreicht werden soll. Wildtyp-Pneumolysin ist hoch toxisch. Es wurden verschiedene mutierte Pneumolysinproteine isoliert, die eine reduzierte Toxizität aufweisen, jedoch behalten diese weiterhin eine Resttoxizität, die problematisch sein kann, wenn das Pneumolysin intern verabreicht wird ( WO 99/03884 ), WO 90/06951 ). Alternativ kann es durch Konjugation mit Polysacchariden entgiftet werden ( WO 96/05859 ).
Das Verfahren der Erfindung kann sowohl Wildtyp- wie auch mutiertes Cytolysin, z. B. Pneumolysin, durch chemische Behandlung entgiften. Bevorzugte Ausführungsarten benutzen ein Vernetzungsmittel, das mehr bevorzugt ein oder mehrere Chemikalien enthält, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Formaldehyd, Glutaraldehyd und einem Vernetzungs-Reagens, das einen N-Hydroxysuccinomidoester und/oder eine Maleimidgruppe enthält (z. B. GMBS), besteht.
Die Entgiftungsverfahren selbst sind ein Aspekt der Erfindung und können verwendet werden, um bakterielle Toxine, vorzugsweise Pneumolysin, das durch andere Verfahren hergestellt wird, zu entgiften.
Bei einer Ausführungsart beschreibt das Entgiftungsverfahren der Erfindung die Entgiftung eines bakteriellen Toxins, umfassend die Behandlung des Toxins mit einer chemischen Verbindung, vorzugsweise einem Vernetzungsmittel, das reaktiv, vorzugsweise selektiv reaktiv, am Besten spezifisch reaktiv mit Amingruppen, mehr vorzuziehen primären Amingruppen ist.
Für die Zwecke dieser Anmeldung ist ein Vernetzungsreagens als eine Verbindung mit mindestens zwei reaktiven Gruppen, von denen mindestens eine in der Lage ist, mit mindestens einer Gruppe auf dem Bakterientoxin zu reagieren, definiert. Eine weitere reaktive Gruppe ist in der Lage, mit entweder einer Gruppe auf dem Bakterientoxin oder einer getrennten Verbindung (z. B. einer Aminosäure, Peptid, Polypeptid, Zucker oder Polysaccharid) zu reagieren.
Vorzugsweise ist die chemische Verbindung oder das Vernetzungsreagens reaktiv, mehr vorzuziehen selektiv reaktiv, am Besten spezifisch reaktiv mit Amin und Sulfhydrylgruppen. Vorzugsweise reagiert die chemische Verbindung mit einer primären Amingruppe von Lysin, mehr vorzuziehen reagiert das Vernetzungsreagens mit einer primären Amingruppe von Lysin und der Sulfhydrylgruppe von Cystein. Dieses Verfahren ist besonders günstig, wenn Pneumolysin entgiftet wird, da die Modifikation von sowohl den Cystein- wie auch Lysinresten zu einer synergistischen Abnahme in dem Hämolysegrad führt, verglichen mit der Resthämolyseaktivität, wenn das Vernetzungsreagens nur mit Lysin oder Cystein reagiert.
So stellt eine alternative Ausführungsart ein Verfahren zur Entgiftung von bakteriellen Toxinen bereit, umfassend die Modifikation eines Cysteinrestes (optional nahe dem C-Ende des Toxins), der in die toxische Aktivität des Toxins involviert ist (vorzugsweise die lytische Aktivität), umfassend die Behandlung des Toxins mit einem Vernetzungsreagens (vorzugsweise einem heterobifunktionellen Vernetzungsreagens), das die Sulfhydrylgruppen mit einer anderen Aminosäure des Toxins, vorzugsweise mehr als 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40 Aminosäuren von dem Cystein in der Primärstruktur entfernt, vernetzt. Vorzugsweise enthält die andere Aminosäure eine primäre Amingruppe und mehr vorzuziehen ist die Aminosäure Lysin.
Bei einigen Ausführungsarten behalten über 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder 95% des Toxins ein Molekulargewicht innerhalb von 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90%, mehr vorzuziehen zwischen 1–50%, am Besten zwischen 5–10% seines ursprünglichen Molekulargewichtes nach der Behandlung, die durch SDS-PAGE beurteilt wird. Vorzugsweise erwirbt das Toxin ein gering höheres Molekulargewicht nach der Entgiftgungsbehandlung aufgrund von verschiedenen Aminosäureresten, die durch kovalente Bindung an die chemische Verbindung modifiziert werden. Das Verfahren der Erfindung involviert jedoch vorzugsweise keine ausgedehnte Konjugation des Toxins, entweder durch kovalente Bindung von ihm an andere Toxinmoleküle, so dass ein Toxin mit einer multimeren quaternären Struktur gebildet wird, oder durch kovalente Bindung des Toxins an andere große Proteine, Polysaccharide oder Lipopolysaccharide. Am Besten werden die Verfahren, Proteine und Produkte, die in WO 96/05859 offenbart werden, nicht von dieser Erfindung abgedeckt.
Das Verfahren der Erfindung kann verwendet werden, um Bakterientoxine zu entgiften. Bevorzugte Toxine beinhalten die Thiol-aktivierten Cytolysine Pyolysin von A. pyogenes, Cereolysin von B. cereus, Thuringiolysin O von B. thuringiensis, Laterosporolysin von B. latersporus, Bifermentolysin von C. bifermentans, Botukinolysin von C. botulinum, Chauveolysin von C. chauvoel, Histoliticolysin von C. histolyticum, Oedematolysin von C. novyi Typ A, Perfringolysin O von C. perfringens, Septicolysin O von C. septicum, Sordellilysin von C. sordellii, Tetanolysin von C. tetani, Ivanolysin O von L. ivanovi, Listeriolysin O von L. monocytogenes, Seelilgerilysin O von L. seeligeri, Alveolysin von P. alvei, Streptolysin O von S. pyogenes, S. canis oder S. equisimilis, Intermedilysin von S. intermedius, Suilysin von S. suis oder Pneumolysin von S. pneumoniae, die entweder Wildtyp oder genetisch modifizierte Toxine mit niedrigeren Toxizitätsgraden sein können, wie PdA und PdB, die oben beschrieben werden ( WO 90/06951 , WO 99/03884 ).
Das Verfahren kann auch verwendet werden, um die Neisseria-Toxine FrpA, FrpC ( WO 92/01460 ), FrpB (Microbiology 142; 3269–3274, (1996); J. Bacteriol. 181; 2895–2901 (1999)) NM-ADPRT (13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani et al. S. 135) zu entgiften. FrpA und FrpC enthalten eine Region, die zwischen diesen zwei Proteinen konserviert ist, und ein bevorzugtes Fragment des Toxins wäre ein Polypeptid, das dieses konservierte Fragment enthält, vorzugsweise die Aminosäuren 227–1004 der Sequenz von FrpA/C umfassend.
Das Verfahren der Erfindung kann auch verwendet werden, um Bordetella-Toxine zu entgiften, einschließlich Adenylatcyclase (CyaA) (Glaser (1998) Mol. Microbiol. 2; 19–30), dermonekrotisches Toxin (Livey (1984) J. Med, Microbiol. 17 91–103) und Pertussis-Toxin (PT) (Munoz et al. (1981) Infect Immun 33; 820–826). Das Verfahren der Erfindung ist auch für Entgiftung von Tetanustoxin (TT) und Diphtherietoxin (DT) und Toxin von S. aureus und S. epidermidis, einschließlich Autolysin und Hämolysin, nützlich ( WO 01/98499 , WO 02/59148 ).
Die Verfahren der Erfindung führen zu einer Reduktion in der Menge der Toxizität und/oder hämolytischen Aktivität des Toxins von mindestens 90%, vorzugsweise 95%, 96%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% oder 99,99%. (Hämolytische Aktivität wird unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 3 gemessen und Toxizität kann durch das Verfahren aus Beispiel 5 gemessen werden.) Natives Pneumolysin weist eine hämolytische Aktivität von 500.000–1.000.000 Einheiten/mg Pneumolysin auf. Einige punktmutierte Varianten von Pneumoly sin weisen eine reduzierte Toxizität und hämolytische Aktivität auf. Die Entgiftung eines varianten Pneumolysins könnte nicht in der Lage sein, eine so große Prozentabnahme in der hämolytischen Aktivität aufgrund der niedrigeren Ausgangspunktform, deren hämolytische Aktivität reduziert ist, zu erreichen, es gibt jedoch die Vorstellung, dass der Großteil der verbleibenden hämolytischen Aktivität durch die Verfahren der Erfindung entfernt wird.
Der Entgiftungsschritt des Verfahrens der Erfindung stellt vorzugsweise eine Vernetzungsreaktion bereit, die im Wesentlichen nicht reversibel ist. Die Reversibilität wird durch Beobachtung des Grades an hämolytischer Aktivität des entgifteten Toxins direkt nach der Entgiftung und nach der Inkubation bei einer Temperatur von über 25°C, vorzugsweise über 30°C, mehr vorzuziehen über 35°C, am Besten über 37°C für mindestens 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Tage bestimmt. Eine im Wesentlichen nicht reversible Reaktion führt zu einer im Wesentlichen nicht reversiblen Entgiftung und ist als eine Reaktion definiert, bei der der Grad an hämolytischer Aktivität um weniger als 100%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% nach der Inkubation bei einer erhöhten Temperatur, wie oben beschrieben, steigt. Viele Verfahren der Entgiftung, z. B. durch Verwendung von Formaldehydbehandlung, führen zu einer Entgiftung, die nicht stabil ist, sondern die Toxizität über die Zeit erhöht.
Bei einem bevorzugten Entgiftungsschritt des Verfahrens der Erfindung behält über 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder 98% des Toxins eine monomere quaternäre Struktur nach der Vernetzungsreaktion. Viele Vernetzungsreagenzien bilden intermolekulare Quervernetzungen (z. B. Formaldehyd und Glutaraldehyd). Diese kann die immunologischen Eigenschaften des Toxins beeinflussen, da einige Epitope innerhalb des Aggregats versteckt sein werden. Verfahren der Erfindung involvieren vorzugsweise die einfache Modifizierung von Aminosäureresten, vorzugsweise Sulfhydryl- oder primäre Aminogruppen von Aminosäuren und/oder die Bildung von hauptsächlich intramolekularen Quervernetzungen. Die resultierende monomere quaternäre Struktur erlaubt es den Epitopen, auf der Oberfläche des Toxins exponiert zu bleiben.
Bei einer bevorzugten Ausführungsart des Entgiftungsschrittes ist das Vernetzungsreagens heterobifunktionell. Bevorzugte Vernetzungsreagenzien enthalten eine N-Hydroxysuccinimidestergruppe, die bevorzugt, mehr vorzuziehen spezifisch, mit primären Amingruppen reagiert. Vorzugsweise enthält das Vernetzungsreagens eine Maleimidgruppe, die bevorzugt, mehr vorzuziehen spezifisch, mit Sulfhydrylgruppen reagiert. Bei einem pH um 7 reagiert eine Maleimidgruppe 1.000-fach schneller mit Sulfhydrylgruppen als sie es mit Aminen tut. Vorzugsweise enthält das Vernetzungsreagens sowohl eine N-Hydroxysuccinimidestergruppe wie auch eine Maleimidgruppe. Das Vernetzungsmittel ist vorzugsweise unter Verwendung eines Reduktionsmittels nicht spaltbar, da dies zu einer weniger effektiven Entgiftung führt.
Die Entfernung zwischen den reaktiven Gruppen des Vernetzungsreagens ist in der Lage, die Wirksamkeit der Entgiftung zu beeinflussen. Vorzugsweise liegt die Entfernung zwischen den Gruppen des Vernetzungsreagenzes, die mit Amin- und Sulfhydrylgruppen reagieren, zwischen 1,5 und 20 Angstrom, mehr vorzuziehen zwischen 5 und 15 Angstrom und am Besten bei ungefähr 10 Angstrom bei den Verfahren der Erfindung. Vorzugsweise werden Aminosäurereste aus dem Bakterientoxin durch Addition einer Gruppe, die über 5, 7, 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 500 Angstrom lang ist, modifiziert. Vorzugsweise ist die Modifizierungsgruppe zwischen 5 und 100 Angstrom, mehr vorzuziehen zwischen 10 und 20 Angstrom groß.
Der Entgiftungsschritt des Verfahrens der Erfindung erlaubt es genügend Resten, modifiziert zu werden, so dass die sterische Interferenz und/oder konformationelle Änderungen die Funktion des Bakterientoxins inhibieren. Vorzugsweise werden mindestens 5, 7, 10, 12, 14, 15, 20 oder 25 Aminosäurereste des Bakterientoxins modifiziert. Wo nicht umgesetzte Maleimidgruppen auf dem Vernetzungsreagens vorliegen, kann eine Ellman-Reaktion verwendet werden, um die Anzahl von Vernetzungsmolekülen, die an jedes Molekül von Toxin gebunden sind, (indirekt) zu schätzen (Ellman 1959 Arch. Biochem. Biophys. 82; 70).
Bevorzugte Vernetzungsreagenzien sind SMPT, Sulfo-LC-SMPT, Sulfo-KMUS, LC-SMCC, KMUA, Sulfo-LC-SPDP, LC-SPDP, SMPB, Sulfo-SMPB, SMPH, Sulfo-SMCC, SMCC, SIAB, Sulfo-SIAB, GMBS (N-(γ-Maleimidobutyryloxy)succiriimidester), Sulfo-GMBS, MBS, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, EMCA, EMCS, BMPS, SPDP, SBAP, BMPA, AMAS, SATP und SIA (Pierce).
Bei einem bevorzugten Verfahren der Erfindung wird das Toxin mit der chemischen Verbindung oder dem Vernetzungsreagens unter pH-Bedingungen zwischen 5,0 und 9,0, vorzugsweise 6,5 bis 8,0, am Besten 7,0 bis 7,8 behandelt. Bei Behandlungen, bei denen die Reaktion einer Maleimidgruppe mit einer Sulfhydrylgruppe gefördert wird, liegt der bevorzugte pH der Reaktion bei 6,0 und 8,0, mehr vorzuziehen 6,5 und 7,5. Die bevorzugte Konzentration von Salzen während der Reaktion liegt zwischen 100 mM und 1 M, mehr vorzuziehen 150 mM und 500 mM, am Besten zwischen 200 mM und 300 mM. Die Erfin der haben jedoch herausgefunden, dass es manchmal vorzuziehen ist, die Reaktion bei einer Niedrigsalzkonzentration durchzuführen, wobei kein Natriumchlorid oder anderes Salz zugefügt wird. Wo die Reaktion bei einem pH von zwischen 7,6 und 7,8 ausgeführt wird, kann die Reaktion wahlweise ohne die Zugabe eines Salzes durchgeführt werden. Ähnlich kann die Verwendung von höheren Verhältnissen von GMBS zu Toxin ohne die Zugabe von Salz bei pH-Werten zwischen 7,0 und 8,0 durchgeführt werden.
Vorzugsweise wird ein 50–500-facher, mehr vorzuziehen 130–350- oder 350–900-facher, am Besten ein ungefähr 250-facher molarer Überschuss der chemischen Verbindung oder des Vernetzungsreagenzes zu jedem Toxin verwendet. Pneumokokken-Pneumolysin enthält 31 Lysinreste. Daher ist ein 248-facher molarer Überschuss der chemischen Verbindung oder des Vernetzungsreagenzes über Pneumolysin äquivalent zu einem 8-fachen molaren Überschuss der chemischen Verbindung oder des Vernetzungsreagenzes zu jedem Lysinrest. Vorzugsweise wird ein 2–20-faches, mehr vorzuziehen ein 4–15- oder 15–30-faches, am Besten ein ungefähr 8-faches molares Verhältnis von chemischer Verbindung oder Vernetzungsreagens zu Lysinresten bei den Verfahren der Erfindung verwendet.
Die Behandlung mit Vernetzungsreagens schreitet für mindestens 15 Minuten, vorzugsweise für mindestens 30 Minuten, am Besten für ungefähr 1 Stunde zwischen 4°C und 40°C, vorzugsweise zwischen 15°C und 25°C, am Besten bei Raumtemperatur fort. Das Verfahren der Erfindung kann weiter einen Löschungsschritt umfassen, der eine Verbindung verwendet, die eine Sulfhydrylgruppe enthält, vorzugsweise weist der Quencher ein Molekulargewicht von über 50, 100 oder 120 auf, mehr vorzuziehen ist der Quencher einer Aminosäure wie Cystein. Alternativ können die Gruppen mit einem Peptid oder Polysaccharidanteil umgesetzt werden, der in der Lage ist, mit Maleimid zu reagieren, z. B. einem Peptid, das einen Cysteinrest enthält. Dies ist besonders geeignet, wenn nicht umgesetzte Maleimidgruppen vor dem Löschungsschritt vorhanden sind.
Der Entgiftungsschritt ist für die Verwendung bei bakteriellen Toxinen geeignet, wie oben beschrieben wurde. Vorzugsweise ist das bakterielle Toxin von Streptokokkus pneumoniae, am Besten ist das Toxin Pneumolysin. Das Pneumolysin ist ein natives oder rekombinantes Protein oder ein Protein, das gentechnisch hergestellt wurde, um seine Toxizität zu reduzieren (wie oben beschrieben wurde). Fusionsproteine von Toxinen, vorzugsweise Pneumolysin, oder Fragmente von Toxinen, vorzugsweise Pneumolysin, können unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung entgiftet werden.
So wird in einer bevorzugten Ausführungsart ein Toxin (wie Pneumolysin) mit einem Vernetzungsreagens entgiftet, das vorzugsweise heterobifunktionell ist und Gruppen aufweist, die mit Lysin- und Cysteinresten reagieren und das eine bestimmte Größe besitzt, wobei am Besten die reaktiven Gruppen 10–20 Angstrom voneinander entfernt liegen, so dass entweder eines oder vorzugsweise beides des Folgenden auftritt:

a) zwischen 5 und 30, vorzugsweise ungefähr 12–14 Aminosäurereste des Toxins werden durch ein Vernetzungsmolekül modifiziert, das kovalent vorzugsweise an ein Lysin oder einen Argininrest bindet (vorzugsweise, wie indirekt durch eine Ellman-Reaktion gemessen wird), wobei das andere Ende (vorzugsweise mit Cystein) gequencht wurde und/oder
b) eine Cystein-Seitenkette, die in die toxische Aktivität des Toxins (vorzugsweise zum C-Ende des Toxins hin) involviert ist, wird mit einer anderen Seitenkette des Toxins (vorzugsweise an einen Lysin- oder Argininrest), der vorzugsweise mehr als 2, 5, 10, 20, 30 oder 40 Aminosäuren von dem Cysteinrest in der Primärsequenz des Toxins entfernt liegt, vernetzt.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsart wird ein Toxin (vorzugsweise Pneumolysin) mit einer monofunktionellen chemischen Verbindung entgiftet, die vorzugsweise mit Aminosäuren, die eine primäre Aminogruppe enthalten, mehr vorzuziehen Lysin, reagieren, und die eine bestimmte Größe aufweist, am Besten 10–100 Angstrom, so dass das Toxin mit zwischen 5 und 30, mehr vorzuziehen ungefähr 14 chemischen Verbindungen, gebunden an Aminosäurereste, bedeckt ist.
Polysaccharidkonjugate
Ein Problem, das mit dem Polysaccharidansatz für Impfungen vergesellschaftet ist, ist die Tatsache, dass Polysaccharide per se schwache Immunogene sind. Um dies zu überwinden, können Polysaccharide mit Proteinträgern konjugiert sein, die Bystander T-Zell-Hilfe bereitstellen. Das Verfahren der Erfindung kann günstig einen weiteren Schritt der Konjugation des Cytolysins, vorzugsweise Pneumolysin, mit einem bakteriellen Polysaccharid, z. B. einem Lipo-Oligosaccharid oder vorzugsweise einem kapsulären Polysaccharid enthalten.
Ein bevorzugtes Konjugat der Erfindung umfasst Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, das durch das Verfahren der Erfindung erhalten wurden, konjugiert an kapsuläre Polysaccharide, die von Streptokokkus pneumoniae stammen. Die kapsulären Pneumokokkenpolysaccharid-Antigene werden vorzugsweise aus den Serotypen 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F und 33F (am Besten aus den Serotypen 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F und 23F) oder Mischungen aus zwei oder mehr der besagten Konjugate (4, 7, 9, 11, 13 oder 23) ausgewählt.
Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, gereinigt durch das Verfahren der Erfindung, wird auch vorzugsweise mit kapsulären Polysacchariden aus anderen Bakterienstämmen konjugiert. Solche Polysaccharide können z. B. aus H. influenzae, H. influenzae Typ B (Hib), N. meningitidis-Gruppen A, C, W, Y, Streptokokken außer S. pneumoniae (z. B. Gruppe B Streptokokkus, S. pyogenes etc.), Staphylokokkus (z. B. S. aureus, S. epidermidis), E. coli, Enterokokkus (z. B. E. faecalis und E. faecium) etc. isoliert werden. Vorzugsweise stammen die Polysaccharide von H. influenzae Typ B (Hib) und/oder den N. meningitidis Gruppen A, C, W135 und/oder Y.
Die Polysaccharide können durch jedes bekannte Verfahren an Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, gebunden werden (z. B. durch Likhite, U.S. Patent 4,372,945 und durch Armor et al., U.S. Patent 4,474,757 ). Vorzugsweise wird CDAP-Konjugation durchgeführt ( WO 95/08348 ). Um die Immunogenität zu steigern, können die Polysaccharide mit einem Adjuvans versehen und/oder lyophilisiert sein. Die Polysaccharide der Erfindung können in Originalgröße vorliegen oder nach der Reinigung in kleinere Polysaccharide oder Oligosaccharide eingeteilt werden.
Das Verfahren der Erfindung umfasst vorzugsweise einen weiteren Schritt der Formulierung von Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, zu einem Impfstoff.
Proteine und immunogene Zusammensetzungen
Eine weitere Ausführungsart der Erfindung ist Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, gereinigt durch das Verfahren der Erfindung. Dies beinhaltet ein Pneumolysin-bakterielles kapsuläres Polysaccharidkonjugat, das durch das Verfahren der Erfindung hergestellt wird.
Eine weitere Ausführungsart der Erfindung ist eine immunogene Zusammensetzung, die Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, oder Pneumolysin-bakterielles kapsuläres Polysaccharid, das durch das Verfahren der Erfindung erhalten wird (wie oben beschrieben wurde), umfasst.
Die immunogene Zusammensetzung der Erfindung umfasst vorzugsweise weiter ein oder mehrere Mitglieder der Pneumokokkencholin-bindenden Proteinfamilie, vorzugsweise Cholin-bindendes Protein A oder ein immunogenes Fragment davon und/oder ein oder mehrere Mitglieder der Polyhistidintriadenfamilie (einschließlich Fusionsproteine davon), vorzugsweise PhtA, PhtB, PhtD oder PhtE oder ein immunogenes Fragment davon.
Die Cholin-bindende Proteinfamilie (CbpX) betreffend, wurden die Mitglieder dieser Familie ursprünglich als Pneumokokkenproteine identifiziert, die durch Cholin-Affinitätschromatographie gereinigt werden konnten. Alle diese Cholin-bindenen Proteine sind nicht-kovalent an Phosphorylcholin-Anteile von Zellwand-Teichonsäure und Membran-assoziierter Lipoteichonsäure gebunden. Strukturell besitzen sie in der gesamten Familie verschiedene Regionen gemeinsam, obwohl die exakte Natur der Proteine (Aminosäuresequenz, Länge etc.) variieren kann. Im Allgemeinen umfassen Cholin-bindende Proteine eine N-terminale Region(N), konservierte Wiederholungsregionen (R1 und/oder R2), eine Prolin-reiche Region (P) und eine konservierte Cholin-Bindungsregion (C), die aus multiplen Wiederholungen besteht, die ungefähr eine Hälfte des Proteins umfasst. Wie in dieser Anmeldung verwendet, wird der Begriff „Cholinbindungsproteinfamilie (CbpX)" aus der Gruppe ausgewählt, die aus Cholinbindungsproteinen besteht, wie in WO 97/41151 identifiziert wird, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD und CbpG. CbpA wird in WO 97/41151 offenbart. CbpD und CbpG werden in WO 00/29434 offenbart. PspC wird in WO 97/09994 offenbart. PbcA wird in WO 98/21337 offenbart. SpsA ist ein Cholinbindungsprotein, das in WO 98/39450 offenbart wird. Vorzugsweise werden die Cholinbindungsproteine aus der Gruppe ausgewählt, die aus CbpA, PbcA, SpsA und PspC besteht.
Eine andere bevorzugte Ausführungsart sind CpbX-Verkürzungen, worin „CbpX" wie oben definiert ist, und sich „Verkürzungen" auf CbpX-Proteine beziehen, denen 50% oder mehr der Cholinbindungsregion (C) fehlen. Vorzugsweise mangelt es solchen Proteinen an der gesamten Cholinbindungsregion. Mehr vorzuziehen fehlt es solchen Proteinverkürzungen an (i) der Cholinbindungsregion und (ii) auch einem Teil der N-terminalen Hälfte des Proteins, doch sie bewahren mindestens eine Wiederholungsregion (R1 oder R2). Noch mehr vorzuziehen besitzt die Verkürzung zwei Wiederholungsregionen (R1 und R2), mehr vorzuziehen bewahrt die Verkürzung die Prolin-reiche Region (P). Beispiele für solche bevorzugten Ausführungsarten sind NR1 × R2 und R1 × R2, wie in WO 99/51266 oder WO 99/51188 veranschaulicht wird, und NR1 × R2P, es werden jedoch auch andere Cholinbindungsproteine, denen es an einer ähnlichen Cholinbindungsregion mangelt, innerhalb des Umfanges dieser Erfindung überlegt.
Die LytX-Familie sind Membran-assoziierte Proteine, die mit Zell-Lyse vergesellschaftet sind. Die N-terminale Domäne umfasst Cholinbindungsdomäne(n), die LytX-Familie besitzt jedoch nicht all die Eigenschaften, die in der CbpA-Familie gefunden werden, wie oben angemerkt wurde, und so wird die LytX-Familie als unterschiedlich von der CpbX-Familie betrachtet. Im Gegensatz zu der CbpX-Familie enthält die C-terminale Domäne die katalytische Domäne der LytX-Proteinfamilie. Die Familie umfasst LytA, B und C. Im Hinblick auf die LytX-Familie wird LytA in Ronda et al., Eur J Biochem, 164: 621–624 (1987) offenbart. LytB wird in WO 98/18930 offenbart und wird auch als Sp46 bezeichnet. LytC wird auch in WO 98/18930 offenbart und wird auch als Sp91 bezeichnet. Ein bevorzugtes Mitglied dieser Familie ist LytC.
Eine andere bevorzugte Ausführungsart sind LytX-Verkürzungen, worin „LytX" wie oben definiert ist, und „Verkürzungen" sich auf LytX-Proteine bezieht, denen es an 50% oder mehr der Cholinbindungsregion mangelt. Vorzugsweise fehlt es solchen Proteinen an der gesamten Cholinbindungsregion. Ein Beispiel für solche Verkürzungen kann in dem Beispielabschnitt dieser Erfindung gefunden werden.
Noch eine andere bevorzugte Ausführungsart dieser Erfindung sind CbpX-verkürzte-LytX-verkürzte chimäre Proteine (oder Fusionen). Vorzugsweise umfasst dies NR1 × R2 (oder R1 × R2, oder NR1 × R2P) von CbpX und den C-terminalen Teil (Cterm, sprich Fehlen der Cholinbindungsdomäne) von LytX (z. B. LytCCterm oder Sp91Cterm). Mehr vorzuziehen wird CbpX aus der Gruppe ausgewählt, die aus CbpA, PbcA, SpsA und PspC besteht. Noch mehr vorzuziehen ist es CbpA. Vorzugsweise ist LytX LytC (auch bezeichnet als Sp91).
Bei einer anderen Ausführungsart der vorliegenden Erfindung wird ein PspA oder PsaA oder. Verkürzungen, denen es an der Cholinbindungsdomäne (C) fehlt, wahlweise als ein Fusionsprotein mit LytX exprimiert. Vorzugsweise ist LytX LytC.
Die Pht(Polyhistidintriaden)-Familie umfasst die Proteine PhtA, PhtB, PhtD und PhtE. Die Familie wird durch eine Lipidationssequenz, zwei Domänen, die durch eine Prolin-reiche Region getrennt werden, und verschiedene Histidintriaden, die möglicherweise in die Metall- oder Nucleosidbindung oder enzymatische Aktivität involviert sind, (3–5) superpiralisierte α-Helixregionen, ein konserviertes N-Ende und ein heterogenes C-Ende charakterisiert. Sie liegt in allen Stämmen der getesteten Pneumokokken vor. Homologe Proteine wurden auch in anderen Streptokokken und Neisserien gefunden. Bevorzugte Mitglieder der Familie umfassen PhtA, PhtB und PhtD. Mehr vorzuziehen umfasst sie PhtA oder PhtD. Es wird jedoch verstanden, dass die Begriffe Pht A, B, D und E sich auf Proteine beziehen, die Sequenzen besitzen, die in den Zitaten unten offenbart werden, wie auch natürlich auftretende (und menschengemachte) Varianten davon, die eine Sequenzhomologie aufweisen, die zumindest 90% identisch zu den Proteinen ist, auf die verwiesen wird. Vorzugsweise ist sie zumindest 95% identisch und am Besten ist sie zu 97% identisch.
Die immunogene Zusammensetzung der Erfindung kann Fusionsproteine von Histidintriadenproteinen mit einschließen. Bevorzugte Fusionsproteine enthalten i) PhtD oder ein Fragment davon, gebunden an PhtE oder ein Fragment davon, oder ii) PhtB oder ein Fragment davon, gebunden an PhtE oder ein Fragment davon.
Im Hinblick auf die PhtX-Proteine wird PhtA in WO 98/18930 offenbart und wird auch als Sp36 bezeichnet. Wie oben angemerkt wurde, ist es ein Protein aus der Polyhistidintriadenfamilie und weist das Typ II Signalmotiv von LXXC auf.
PhtD wird in WO 00/37105 offenbart und wird auch als SP036D bezeichnet. Wie oben angemerkt wurde, ist es auch ein Protein aus der Polyhistidintriadenfamilie und weist das Typ II LXXC Signalmotiv auf. PhtB wird in WO 00/37105 offenbart und wird auch als Sp036B bezeichnet. Ein anderes Mitglied der PhtB-Familie ist das C3-abbauende Polypeptid, wie in WO 00/17370 offenbart wird. Dieses Protein stammt auch aus der Polyhistidintriadenfamilie und weist das Typ II LXXC Signalmotiv auf. Ein bevorzugtes immunologisch funktionelles Äquivalent ist das Protein Sp42, das in WO 98/18930 offenbart wird. Eine PhtB-Verkürzung (ungefähr 79kD) wird in WO 99/15675 offenbart, die auch für ein Mitglied der PhtX-Familie gehalten wird.
PhtE wird in WO 00/30299 offenbart und wird als BVH-3 bezeichnet. Um eine immunogene Zusammensetzung der Erfindung zu erzeugen, die in der Lage ist, eine Immunreaktion gegen mehr als ein Pathogen hervorzurufen, das bei Otitis media involviert ist, ist es für immunogene Zusammensetzung der Erfindung vorteilhaft, weiter ein Antigen von einem oder mehr (2, 3, 4, 5, 6) aus S. pneumoniae, nicht-typisierbarem Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, RSV, Parainfluenzavirus und/oder Influenzavirus zu umfassen.
Die vorliegende Erfindung überlegt auch Kombinationsimpfstoffe, die Schutz gegen eine Reihe von verschiedenen Pathogenen bereitstellen. Viele pädiatrische Impfstoffe werden nun als Kombinationsimpfstoff gegeben, um die Anzahl von Injektionen, die ein Kind erhalten muss, zu reduzieren. So können für pädiatrische Impfstoffe andere Antigene von anderen Pathogenen mit den Impfstoffen der Erfindung formuliert werden. Z. B. können die Impfstoffe der Erfindung mit (oder verabreicht separat, aber zu der gleichen Zeit mit) dem gut bekannten „trivalenten" Kombinationsimpfstoff, der Diphtherietoxoid (DT), Tetanustoxoid (TT) und Pertussisbestandteile [typi scherweise entgiftetes Pertussistoxoid (PT) und filamentöses Hämagglutinin (FHA) mit optional Pertactin (PRN) und/oder Agglutinin 1 + 2] umfasst, z. B. der vermarktete Impfstoff INFANRIX-DTPa^TM (SmithKlineBeecham Biologicals), der DT-, TT-, PT-, FHA- und PRN-Antigene enthält, oder mit einem ganzzelligen Pertussis-Bestandteil, z. B. wie er durch SmithKlineBeecham Biologicals s. a. als Tritanrix^TM vermarktet wird, formuliert werden. Der kombinierte Impfstoff kann auch ein anderes Antigen, wie Hepatitis B Oberflächen-Antigen (HbsAg), Poliovirus-Antigene (z. B. inaktiviertes trivalentes Poliovirus – IPV), Moraxella catarrhalis äußere Membranproteine, nicht typisierbare Haemophilus influenzae-Proteine, N. meningitidis B äußere Membran-Proteine umfassen.
Beispiele für bevorzugte Moraxella catarrhalis-Protein-Antigene, die in einen Kombinationsimpfstoff (insbesondere für die Prävention von Otitis media) eingeschlossen werden können, sind: OMP106 [ WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA und/oder LbpB [ WO 98/55606 (PMC)]; TbpA und/oder TbpB [ WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61: 2003–2010]; UspA1 und/oder UspA2 [ WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD, HasR ( PCT/EP 99/03824 ); PilQ ( PCT/EP 99/03823 ); OMP85 ( PCT/EP 00/01468 ); lipo06 ( GB 9917977.2 ); lipo10 ( GB 9918208.1 ); lipo11 ( GB 9918302.2 ); lipo18 ( GB 9918038.2 ); P6 ( PCT/EP 99/03038 ); D15 ( PCT/EP 99/03822 ); OmplA1 ( PCT/EP 99/06781 ); Hly3 ( PCT/EP 99/03257 ); und OmpE. Beispiele für nicht typisierbare Haemophilus influenzae-Antigene, die in einen Kombinationsimpfstoff (insbesondere für die Prävention von Otitis media) eingeschlossen werden können, beinhalten: Fibrinprotein [( US 5766606 – Ohio State Research Foundation)] und Fusionen umfassende Peptide davon [z. B. LB1(f) Peptidfusionen; US 5843464 (OSU) oder WO 99/64067 ]; OMP26 [ WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [ EP 281673 (State University of New York)]; TbpA und/oder TbpB, Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 ( WO 94/12641 ); Protein D ( EP 594610 ); P2 und P5 ( WO 94/26304 ).
Andere Kombinationen, die überlegt werden, sind das Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, der Erfindung in Kombination mit viralen Antigenen, z. B. von Influenza (attenuiert, gespalten, oder Untereinheit [z. B. Oberflächenglycoproteinneuraminidase (NA) und Hämagglutinin (HA). Siehe z. B. Chaloupka I. et al., Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15:121–127], RSV (z. B. F- und G-Antigene oder F/G-Fusionen, siehe z. B. Schmidt A. C. et al., J Virol, May 2001, S. 4594–4603), Parainfluenza Virus 3 (PIV3) (z. B. RN- und F-Proteine, siehe Schmidt et al., siehe oben), Varicella (z. B. attenuiert, Glycoprotein I-V etc.) und irgendein (oder allen) Bestandteil(en) von MMR (Masern, Mumps, Röteln).
Impfstoffe
Eine weitere Ausführungsart der Erfindung ist ein Impfstoff, umfassend Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, oder ein Pneumolysin-bakterielles kapsuläres Polysaccharidkonjugat, erhalten durch das Verfahren der Erfindung, und einen pharmazeutisch akzeptablen Arzneiträger und wahlweise ein Adjuvans.
Ein Impfstoff der Erfindung kann die immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung, die oben beschrieben werden, und einen pharmazeutisch akzeptablen Arzneiträger umfassen.
Impfstoffe der Erfindung sind in der Lage, eine schützende Immunantwort gegen S. pneumoniae-Infektion und/oder Otitis media zu erzeugen.
Eine weitere Ausführungsart der Erfindung beinhaltet ein Verfahren der Herstellung einer Vakzine durch Nehmen eines Cytolysins, vorzugsweise Pneumolysin, das durch das Verfahren der Erfindung hergestellt wurde, und Formulierung von ihm als ein Impfstoff mit einem pharmazeutisch akzeptablen Arzneiträger und wahlweise mit einem oder mehreren der weiteren Antigene, die oben beschrieben werden.
Eine weitere Ausführungsart der Erfindung beinhaltet Verfahren der Behandlung oder Prävention von bakterieller Infektion, vorzugsweise Streptokokkus pneumoniae-Infektion oder Otitis media, das die Verabreichung des Impfstoffes oder der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung umfasst.
Eine weitere Ausführungsart der Erfindung ist die Verwendung des Cytolysins, vorzugsweise Pneumolysin, und/oder Pneumolysin-bakteriellem kapsulären Polysaccharidkonjugat, von denen jedes durch ein Verfahren der Erfindung erhalten wird, bei der Herstellung eines Impfstoffes für die Behandlung oder Prävention von bakterieller Infektion, vorzugsweise Streptokokkus pneumoniae Infektion oder Otitis media.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise mit einem Adjuvans versehen. Geeignete Adjuvanzien beinhalten ein Aluminiumsalz, wie Aluminiumhydroxidgel (Alaun) oder Aluminiumphosphat, aber sie können auch ein Salz von Calcium, Magnesium, Eisen oder Zink sein oder sie können eine unlösliche Suspension von acyliertem Tyrosin oder acylierten Zuckern, cationisch oder anionisch derivatisierten Polysacchariden oder Polyphosphazenen sein.
Es wird bevorzugt, dass das Adjuvans so ausgewählt wird, dass es ein bevorzugter Induktor eines TH1-Reaktionstyps ist. Solche hohen Spiegel an Th1-Typ-Cytokinen tendieren dazu, die Induktion von Zell-vermittelten Immunreaktionen auf ein gegebenes Antigen zu favorisieren, während hohe Spiegel an Th2-Typ-Cytokinen dazu tendieren, die Induktion von humoralen Immunreaktionen auf das Antigen zu favorisieren.
Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Unterscheidung von Th1- und Th2-Typ-Immunreaktionen nicht absolut ist. In der Realität wird ein Individuum eine Immunreaktion unterstützen, die als prädominant Th1 oder prädominant Th2 beschrieben wird. Es ist jedoch oft bequem, die Cytokinfamilien in Begriffen zu betrachten, wie sie in Maus-CD4 +ve T-Zell-Klonen durch Mosmann und Coffman beschrieben werden (Mosmann, T. R. and Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, S. 145–173). Traditionell werden Th1-Typ-Reaktionen mit der Produktion von INF-γ- und IL-2-Cytokinen durch T-Lymphocyten in Zusammenhang gebracht. Andere Cytokine, die oft direkt mit der Induktion von Th1-Typ-Immunreaktionen assoziiert sind, werden nicht durch T-Zellen produziert, wie IL-12. Im Gegensatz dazu sind Th2-Typ-Reaktionen mit der Sezernierung von IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 assoziiert. Geeignete Adjuvans-Systeme, die eine überwiegende Th1-Reaktion fördern, beinhalten: Monophosphoryl-Lipid A oder ein Derivat davon, insbesondere 3-de-O-acyliertes Monophosphoryl-Lipid A (3D-MPL) (für seine Herstellung siehe GB 2220211 A ); und eine Kombination aus Monophosphoryl-Lipid A, vorzugsweise 3-de-O-acyliertes Monophosphoryl Lipid A, zusammen mit entweder einem Aluminiumsalz (z. B. Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid) oder einer Öl-in-Wasser-Emulsion. Bei solchen Kombinationen sind Antigen und 3D-MPL in den gleichen Teilchenstrukturen enthalten, was eine effizientere Abgabe von antigenen und immunstimulierenden Signalen erlaubt. Studien haben gezeigt, dass 3D-MPL in der Lage ist, die Immunogenität eines Alaun-adsorbierten Antigens weiter zu steigern [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708–14; EP 689454-B1 ].
Ein verstärktes System involviert die Kombination eines Monophosphoryl-Lipid A und eines Saponinderivats, insbesondere die Kombination von QS21 und 3D-MPL, wie in WO 94/00153 offenbart wird, oder eine weniger reaktive Zusammensetzung, bei der das QS21 mit Cholesterin gelöscht wird, wie in WO 96/33739 offenbart wird.
Eine besonders wirksame Adjuvans-Formulierung, die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion involviert, wird in WO 95/17210 beschrieben und ist eine bevorzugte Formulierung.
Vorzugsweise umfasst der Impfstoff zusätzlich ein Saponin, mehr vorzuziehen QS21. Die Formulierung kann auch eine Öl-in-Wasser-Emulsion und Tocopherol umfassen ( WO 95/17210 ).
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer Impfstoff-Formulierung bereit, die das Mischen eines Cytolysins der vorliegenden Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Arzneiträger, wie 3D-MPL, umfasst.
Unmethylierte CpG enthaltende Oligonucleotide ( WO 96/02555 ) sind auch bevorzugte Induktoren einer TH1-Reaktion und sind für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Impfstoff, wie er hier beschrieben wird, für die Verwendung in der Medizin bereitgestellt. Bei einer Ausführungsart gibt es ein Verfahren der Prävention oder Linderung von Pneumonie bei einem älteren Menschen (über 55 Jahre alt), das die Verabreichung einer sicheren und effektiven Menge eines Impfstoffes der Erfindung und wahlweise eines Th1-Adjuvanzes an den älteren Patienten umfasst.
Bei einer weiteren Ausführungsart wird ein Verfahren der Prävention oder Linderung von Otitis media bei Säuglingen (bis zu 24 Monate) oder Kleinkindern (typischerweise 24 Monate bis 5 Jahre) bereitgestellt, das die Verabreichung einer sicheren und effektiven Menge eines Impfstoffes, der ein Cytolysin, vorzugsweise Pneumolysin, der Erfindung, wahlweise mit einem oder mehreren der weiteren Antigene, die oben beschrieben werden, und wahlweise einem Th1-Adjuvans umfasst, an den Säugling oder das Kleinkind umfasst.
Die Impfstoffpräparate der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um einen Säuger (vorzugsweise einen menschlichen Patienten), der für eine Infektion empfänglich ist, mit Hilfe der Verabreichung des Impfstoffes über einen systemischen oder mucosalen Weg zu schützen oder zu behandeln. Diese Verabreichungen können Injektionen über die intramuskulären, intraperitonealen, intradermalen oder subcutanen Wege oder über mucosale Verabreichung an die oralen/alimentären, respiratorischen, urogenitalen Trakte beinhalten. Die intranasale Verabreichung von Impfstoffen für die Behandlung von Pneumonie oder Otitis media wird bevorzugt (da die nasopharyngeale Trägerschaft von Pneumokokken effektiver verhindert werden kann, wodurch die Infektion in ihrem frühesten Stadium abgeschwächt wird). Obwohl der Impfstoff der Erfindung als eine Einzeldosis verabreicht werden kann, können auch Bestandteile davon zusammen zu der gleichen Zeit oder zu ver schiedenen Zeiten gemeinsam verabreicht werden (z. B. wenn Polysaccharide in einem Impfstoff vorliegen, könnten diese getrennt zu der gleichen Zeit oder ein bis zwei Wochen nach der Verabreichung der bakteriellen Proteinkombination für die optimale Koordination der Immunreaktionen unter Rücksichtnahme aufeinander verabreicht werden). Zusätzlich zu einem einzelnen Weg der Verabreichung, können zwei verschiedene Verabreichungswege verwendet werden. Z. B. können virale Antigene ID (intradermal) verabreicht werden, während bakterielle Proteine IM (intramuskulär) oder IN (intranasal) verabreicht werden können. Wenn Polysaccharide vorliegen, können sie IM (oder ID) verabreicht werden und bakterielle Proteine können IN (oder ID) verabreicht werden. Zusätzlich können Impfstoffe der Erfindung IM für die Erstdosen und IN für Booster-Dosen verabreicht werden.
Die Menge von Konjugat-Antigenen in jeder Impfstoffdosis wird als eine Menge ausgewählt, die eine immunprotektive Reaktion ohne signifikante Nebenwirkungen in typischen Impfstoffen induziert. Eine solche Menge wird abhängig von dem spezifischen Immunogen, das verwendet wird, und wie es angeboten wird, variieren. Der Gehalt von Proteinantigenen in den Impfstoff wird typischerweise in dem Bereich von 1–100 μg, vorzugsweise 5–50 μg, am typischsten in dem Bereich von 5–25 μg liegen. Wenn Polysaccharide mit eingeschlossen werden, wird im Allgemeinen erwartet, dass jede Dosis 0,1–100 μg Polysaccharid, vorzugsweise 0,1–50 μg, mehr vorzuziehen 0,1–10 μg, wovon 1 bis 5 μg in dem besten Bereich liegen, umfasst.
Optimale Mengen von Bestandteilen für einen bestimmten Impfstoff können durch Standardstudien, die die Beobachtung von geeigneten Immunreaktionen bei Individuen involvieren, sichergestellt werden. Nach einer initialen Impfung können Individuen eine oder mehrere Booster-Immunisierungen in adäquaten Zeiträumen erhalten. Typischerweise wird ein Impfstoff Antigen (Proteine), ein Adjuvans und Arzneiträger oder einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
Die Impfstoffherstellung wird allgemein in Vaccine-Design („The subunit and adjuvant approach” (Hrsg. Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York) beschrieben. Die Verkapselung mit Liposomen wird durch Fukerton, US Patent 4,235,877 beschrieben.
Obwohl die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung auf irgendeinem Weg verabreicht werden können, bildet die Verabreichung der beschriebenen Impfstoffe in die Haut (ID) eine Ausführungsart der vorliegenden Erfindung. Menschliche Haut umfasst eine äußere „hornige" Haut, die das Stratum corneum genannt wird, die über der Epidermis liegt. Unter dieser Epidermis liegt eine Schicht, die Dermis genannt wird, die wiederum über dem Subcutangewebe liegt. Forscher haben gezeigt, dass die Injektion eines Impfstoffes in die Haut und insbesondere die Dermis, eine Immunreaktion stimuliert, die auch mit einer Anzahl von zusätzlichen Vorteilen assoziiert sein kann. Die intradermale Impfung mit den Impfstoffen, die hier beschrieben werden, bildet eine bevorzugte Eigenschaft der vorliegenden Erfindung.
Die konventionelle Technik der intradermalen Injektion, das „Mantoux-Verfahren", umfasst die Schritte der Hautreinigung und dann die Straffung mit einer Hand, und dann wird die Nadel in einem Winkel von 10–15° eingeführt, wobei der Anschliff der schmalen Gauge-Nadel (26–31 Gauge) nach oben zeigt. Nachdem der Anschliff der Nadel eingeführt ist, wird der Schaft der Nadel gesenkt und weiter vorgeführt, während ein leichter Druck ausgeübt wird, um sie unter die Haut zu befördern. Die Flüssigkeit wird dann sehr langsam injiziert, wodurch ein Bläschen oder eine Ausbeulung auf der Hautoberfläche gebildet wird, gefolgt von dem langsamen Herausziehen der Nadel.
In allerletzter Zeit wurden Vorrichtungen beschrieben, die spezifisch entwickelt wurden, um flüssige Wirkstoffe in oder über die Haut zu verabreichen, z. B. die Vorrichtungen, die in WO 99/34850 und EP 1092444 beschrieben werden, auch die Jet-Injektionsvorrichtungen, die z. B. in WO 01/13977 ; US 5,480,381 , US 5,599,302 , US 5,334,144 , US 5,993,412 , US 5,649,912 ; US 5,569,189 ; US 5,704,911 ; US 5,383,851 ; US 5,893,397 ; US 5,466,220 ; US 5,339,163 ; US 5,312,335 ; US 5,503,627 ; US 5,064,413 ; US 5,520,639 ; US 4,596,556 , US 4,790,824 ; US 4,941,880 ; US 4,940,460 ; WO 97/37705 und WO 97/13537 beschrieben werden. Alternative Verfahren der intradermalen Verabreichung der Impfstoffpräparate können konventionelle Spritzen und Nadeln oder Vorrichtungen, die für die ballistische Abgabe von festen Impfstoffen entwickelt wurden ( WO 99/27961 ), oder transdermale Pflaster ( WO 97/48440 ; WO 98/28037 ), oder verabreicht auf die Oberfläche der Haut (transdermale oder transcutane Abgabe WO 98/20734 ; WO 98/28037 ) mit einschließen.
Wenn die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung an die Haut verabreicht werden sollen, oder konkreter in die Dermis, liegt der Impfstoff in einem niedrigen flüssigen Volumen vor, insbesondere einem Volumen von zwischen ungefähr 0,05 ml und 0,2 ml.
Der Gehalt von Antigenen in den Haut- oder intradermalen Impfstoffen der vorliegenden Erfindung kann ähnlich den konventionellen Dosen sein, die bei intramuskulären Impfstoffen gefunden werden. Dementsprechend können die Protein-Antigene, die in den intradermalen Impfstoffen vorliegen, in dem Bereich von 1–100 μg, vorzugsweise 5–50 μg liegen. Ähnlich wird von der Menge an Polysaccharid-Konjugat-Antigen, wenn es vorliegt, in jeder Impfstoffdosis im Allgemeinen erwartet, dass sie 0,1–100 μg Polysaccharid, vorzugsweise 0,1–50 μg, vorzugsweise 0,1–10 μg umfasst und zwischen 1 und 5 μg liegen kann. Es ist jedoch eine Eigenschaft von Haut- oder intradermalen Impfstoffen, dass die Formulierungen „low dose" sein können. Demgemäß liegen die Protein-Antigene in „low dose"-Impfstoffen vorzugsweise mit so wenig wie 0,1–10 μg, vorzugsweise 0,1–5 μg pro Dosis vor, und die Polysaccharid-Konjugat-Antigene können, wenn sie vorliegen, in dem Bereich von 0,01–1 μg, und vorzugsweise zwischen 0,01 bis 0,5 μg Polysaccharid pro Dosis vorliegen.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „intradermale Abgabe" die Abgabe des Impfstoffes an die Region der Dermis in der Haut. Der Impfstoff wird jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in der Dermis lokalisiert sein. Die Dermis ist die Schicht in der Haut, die zwischen ungefähr 1,0 und ungefähr 2,0 mm von der Oberfläche der menschlichen Haut lokalisiert ist, aber es gibt eine bestimmte Variationsbreite zwischen Individuen und bei verschiedenen Körperteilen. Im Allgemeinen kann erwartet werden, dass man die Dermis erreicht, indem man an 1,5 mm unter die Oberfläche der Haut geht. Die Dermis ist zwischen dem Stratum corneum und der Epidermis an der Oberfläche und der subcutanen Schicht unten lokalisiert. Abhängig von der Art der Abgabe kann der Impfstoff letztendlich ausschließlich oder hauptsächlich innerhalb der Dermis lokalisiert sein oder er kann letztendlich innerhalb der Epidermis und der Dermis verteilt sein.
Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe der Erfindung können in verschiedenen Tiermodellen oder mit menschlichen Seren evaluiert werden. Zur Veranschaulichung können die folgenden Tiermodelle verwendet werden, um Pneumokokkeninfektion zu evaluieren. C3H/HeJ-Mäuse (6 bis 8 Wochen alt) können s. c. mit 15 μg Protein, das mit 50 μl CFA als Adjuvans versehen wurde, immunisiert werden, gefolgt von Boosterung mit 15 μg Protein mit IFA 3–4 Wochen später. Um den passiven und aktiven Schutz vor systemischer Infektion zu zeigen, können den Mäusen intraperitoneal Immunseren oder Proteine vor der Provokation durch intraperitoneale Injektion mit 15–90 LD50 Pneumokokken in der Woche 8–10 verabreicht werden. Zusätzlich können Proteine in einem Maus-Nasopharynx-Kolonisierungsmodell durch (Wu et al. Microbial Pathogenesis 1997; 23:127–137) getestet werden.
Zusätzlich zu Mäusen sind Säuglingsratten gegenüber Kolonisierung und Infektion mit S. pneumoniae anfällig. Bei passiven protektiven Studien kann die Verabreichung von Maus-Immunseren (100 μl i. p. oder 10 μl i. n.) vor der Provokation mit intranasaler Verabreichung von S. pneumonia (10 μl) bei 2–5 Tage alten Säuglingsratten durchgeführt werden. Die Kolonisierung kann durch Platzierung von Nasenspülungen (20–50 μl instilliert, 10 μl entnommen) bestimmt werden.
Günstige Wechselwirkungen zwischen den Proteinen(oder Protein und Polysaccharid)-Bestandteilen des Kombinationsimpfstoffes können durch Verabreichung einer Dosis von jedem Protein (oder Protein und Polysaccharid) in dem Impfstoff, die bei einem monovalenten Impfstoff subprotektiv sein würden, gezeigt werden. Die gesteigerte protektive Wirksamkeit des Kombinationsimpfstoffes im Vergleich zu monovalenten Impfstoffen kann einer günstigen Wechselwirkung zwischen den Bestandteilen zuzuschreiben sein.
Die Erfindung wird in den begleitenden Beispielen veranschaulicht. Die Beispiele werden unter Verwendung von Standardtechniken, die gut bekannt und Routine für Fachleute auf dem Gebiet sind, durchgeführt, außer wo es anders detailliert beschrieben wird. Die Beispiele sollen veranschaulichen, aber die Erfindung nicht begrenzen.
Beispiele
Beispiel 1 – Reinigung von Pneumolysin
Nach 18-ständiger Induktion der E. coli Kultur durch Steigerung der Temperatur auf 39,5°C wurden die E. coli durch Zentrifugation bei 17.000 g für 1 Stunde pelletiert. Die Pellets wurden in 25 mM Diethanolamin, pH 9,0, erneut suspendiert und die E. coli wurden mechanisch unter Verwendung eines Durchganges bei 500 PSI in einem Rannie-Apparat aufgebrochen. Es wurde 1% Natriumlauroylsarcosinat (SLS) zu den aufgebrochenen E. coli zugegeben, und die Mischung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur vor der Zentrifugation bei 30.000 g für 20 Minuten inkubiert, so dass der Zelldebris pelletiert wurde. Der Überstand wurde 2,5-fach verdünnt, um bei 20 mM Phosphat, pH 7,0, enthaltend 1 mM NaCl und 1% SLS, zu enden und wurde dann auf eine Phenyl-Sepharose-HP-Säule geladen, die in demselben Puffer (20 mM Phosphat, pH 7,0, enthaltend 1 M NaCl und 1% SLS = Äquilibrierungspuffer) äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit 4 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer gewaschen, gefolgt von 2 Säulenvolumen 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 0,5 M NaCl und 1% SLS. Pneumolysin wurde durch Anwendung eines Niedrigsalzpuffers, der 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 1% SLS, enthielt, eluiert. Fraktionen, die Pneumolysin enthielten, wurden unter Verwendung von SDS-PAGE-Analyse identifiziert, gepoolt und der Puffer wurde unter Verwendung von Diafiltration mit 25 mM Diethanolamin, pH 9,0, ausgetauscht.
Das Pneumolysin wurde durch Denaturierung durch Zugabe von festem Guanidinhydrochlorid bis zu einer 6 M endgültigen Konzentration und Inkubation für 1 Stunde löslich gemacht. Es wurde dann gegen 8 M Harnstoff in 25 mM Diethanolamin, pH 9,0, enthaltend 1 mM DTT, diafiltriert. Pneumolysin wurde durch Diafiltration gegen 20 mM Boratpuffer, pH 9,0, enthaltend 1 mM DTT, rückgefaltet. Nach der Renaturierung wurde DTT durch Diafiltration gegen 20 mM Boratpuffer, pH 9,0, entfernt.
Die erreichte Reinheit des Pneumolysins wurde durch Durchlaufen einer SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie-Brillantblau analysiert. Ein separates Gel wurde durch Western-Blotting unter Verwendung eines Antikörpers gegen E. coli analysiert, um den Spiegel von E. coli-Proteinen, die in dem gereinigten Pneumolysinpräparat verbleiben, nachzuweisen. Die biologische Aktivität des gereinigten Pneumolysins wurde unter Verwendung eines in vitro Hämolyse-Assays beurteilt.
Ergebnisse
Wie in 1 gezeigt, war das oben beschriebene Verfahren in der Lage, eine hoch effiziente Reinigung von Pneumolysin nach einem einzelnen Chromatographieschritt zu erzeugen. Das Coomassie-Blau gefärbte Gel in Tafel 1 zeigt, dass die Flution der Säule mit einem Niedrigsalzpuffer, der kein zusätzlich Natriumchlorid enthielt, in der Lage war, eine 53 kDA Bande, korrespondierend zu Pneumolysin, von der Säule in einer hoch gereinigten Form zu eluieren. Man glaubt, dass die viel schwächere Bande von ungefähr 45 kDa auch Pneumolysin ist, da diese zweite Bande an Anti-Pneumolysin-Antikörper bindet (Ergebnisse nicht gezeigt) und es ihr auch nicht gelingt, an die Anti-E. coli-Antikörper zu binden, wie in Tafel B gezeigt wird. Der Western-Blot von Tafel B ist ein hochsensibles Verfahren des Nachweises von irgendwelchen kontaminierenden Proteinen, die in dem gereinigten Pneumolysin verbleiben. Dieses Verfahren war dazu in der Lage, sehr wenig Kontaminanten nachzuweisen und diejenigen, die vorlagen, lagen in einem niedrigen Spiegel vor, der sich unter der Nachweisgrenze der Coomassie-Färbung befand. Das Pneumolysin wird daher auf einen Grad von 98–100% Reinheit gereinigt.
Der Ertrag des Reinigungsverfahrens ist auch mit einem typischen Durchlauf, der ungefähr 1.900 mg Pneumolysin pro Liter Fermentation ergibt, gut. Es wurden ungefähr 10% des Proteins aus der Fermentationskultur als gereinigtes Pneumolysin gewonnen.
Die Aktivität des Pneumolysins wurde in einem Hämolyse-Assay bestimmt, nachdem das Pneumolysin mit Guanidinhydrochlorid/Harnstoff behandelt und durch Entfernung des Denaturierungsmittel rückgefaltet worden war. Hämolytische Aktivität wurde in Verdünnungen des gereinigten Pneumolysins bis runter auf Konzentrationen von 1,3 ng/ml nachgewiesen, was zeigt, dass die hämolytische Aktivität wiederhergestellt worden war. Dies korrespondiert zu zwischen 500.000 und 1.000.000 hämolytischer Einheiten pro mg Wildtyp-Pneumolysin
Beispiel 2 – Entgiftung von S. pneumoniae Pneumolysin unter Verwendung von GMBS
Gereinigtes Pneumolysin wurde durch Modifikation von Sulfhydryl- und primären Amingruppen unter Verwendung des NHS Ester-Maleimid-Vernetzungsreagens GMBS (N-(γ-Maieimidobutyryloxy)succinimidester) entgiftet. Pneumolysin wurde in einer Konzentration von 0,5 mg/ml gegen 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, dialysiert. Der GMBS wurde anfänglich in DMSO aufgelöst und wurde zu Pneumolysin in einem 248-fachen molaren Überschuss von GMBS zugegeben. Die Behandlung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur fortgeführt. Überschüssiger GMBS und Nebenprodukte wurden durch Dialyse gegen 100 mM Natriumphosphat, pH 6,8, entfernt. Weitere Maleimidgruppen wurden durch Reaktion mit 0,6 mg/ml Cystein für 2 Stunden bei Raumtemperatur gelöscht. Um überschüssiges Cystein zu entfernen, wurde die Probe gegen 2 mM Natriumphosphat, pH 7,15, dialysiert.
Beispiel 3 – Charakterisierung von entgiftetem Pneumolysin Hämolytische Aktivität
Es wurde ein hämolytischer Assay verwendet, um die verbleibende Toxizität von entgiftetem Pneumolysin zu beurteilen. Serielle zweifache Verdünnungen von Pneumolysin wurden mit roten Blutkörperchen vom Schaf inkubiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand auf Immunplatten übertragen und freigesetztes Hämoglobin wurde unter Verwendung von optischer Dichteablesung bei 405 nm gemessen. Die Ergebnisse wurden als ng/ml Pneumolysin, korrespondierend zu dem Mittelpunkt der OD-Kurve, ausgedrückt. Der Assay wurde nach Inkubation des entgifteten Pneumolysins bei 37°C für 7 Tage wiederholt, um die Umkehrbarkeit der Entgiftung zu beobachten.
Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, war die Behandlung mit GMBS in der Lage, die hämolytische Aktivität von PLY wesentlich zu reduzieren, wobei eine bis zu 3.000-fache Reduktion in der hämolytischen Aktivität erreicht wurde. Höhere molare Verhältnisse von GMBS zu Lysin waren in der Lage, eine bessere Entfernung der hämolytischen Aktivität hervorzurufen, wobei Ver hältnisse von 4/1 und 5/1 in diesem Experiment optimal waren. Es wurde geschätzt, dass diese Behandlung zu einer Modifikation von ungefähr 14 Lysinresten führt. Wo weniger Lysinreste modifiziert wurden, war die Reduktion an hämolytischer Aktivität geringer.
ELISA
Die Antigenität des entgifteten Pneumolysins wurde durch ELISA beurteilt. Die ELISA-Platten wurden mit einem Meerschweinchen-Anti-Pneumolysin-Antikörper beschichtet. Die Proben, die Verdünnungen von Pneumolysin enthielten, wurden auf den Platten für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde das gebundene Pneumolysin unter Verwendung von Kaninchen-polyclonalen Antikörpern gegen Pneumolysin, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase, nachgewiesen. Nach Waschen der Platten wurde eine Substratreaktion verwendet, um die Menge von an jede Vertiefung gebundenem Pneumolysin zu beurteilen.
Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, führte die Behandlung mit GMBS zu einigem Verlust an Antigenität, wie durch ELISA beurteilt wurde. Es könnten jedoch ELISA-Anzeigewerte von ungefähr 66% von denjenigen, die durch unbehandeltetes PLY abgegeben werden, erreicht werden, was zeigt, dass noch viele Antikörper das modifizierte Pneumolysin erkennen konnten.
SDS-PAGE-Analyse

Man ließ die entgifteten Pneumolysinproteine auf einer SDS-PAGE (Novex 4–20% Polyacrylamidgel Invitrogen) laufen und es wurde Coomassie-Brillantblau verwendet, um die Proteine sichtbar zu machen. Wie in 2 gezeigt wird, führte die Behandlung mit GMBS zu einem leichten Anstieg in dem Molekulargewicht von PLY von 53 kDa zu ungefährt 56 kDa. Diese Steigerung ist auf die Modifikation von zahlreichen Aminosäureresten mit GMBS zurückzuführen. Ein kleiner Prozentsatz von PLY wird zu multimeren Formen konvertiert, wie durch das Auftreten von schwachen Banden mit einem Molekulargewicht von ungefähr 110 kdA und 170 kDA gesehen wird, jedoch verbleibt das meiste des PLY in einer im Grunde monomeren Form. Die Inkubation des PLY bei 37°C für 7 Tage führte nicht zu irgendeiner wesentlichen Änderung bei dem Auftreten des PLY auf einer SDS-PAGE, was zeigt, dass das modifizierte PLY keinem Abbau oder darauf folgender kovalent gebundener Multimerbildung unterworfen ist. Tabelle 1: Versuche zur PLY-Entgiftung durch GMBS

Versuch	GMBS-Überschuss (GMBS/Lysin)	Maleimid-Funktionen	Verhältnis ELISA/LOWRY 4°C 7D37°C %			Hämolytischer Titer ng/ml 4°C 7D37°C
1	/	/	95	56	1,7	4,2
	1/1	8	63	87	186	111
	1,5/1	8,5	69	/	48	/
	2/1	9,4	76	/	309	/
	3/1	11,8	56	/	530	/
	4/1	13,5	66	/	6308	/
	5/1	14,2	67	/	4284	/
2	4/1	13,8	26,2	24,8	NH	NH
	8/1	17,6	23,9	38,0	NH	NH
3	4/1	11,3	89	46	1598	6309

Die Versuche wurden für 1 mg PLY (1 mg/ml) realisiert, mit der Ausnahme des letzten Assays, für den 3 mg behandelt wurden (PLY bei 0,68 mg/ml).
Beispiel 4 – Reaktogenitätsevaluierung von entgiftetem Pneumolysin bei Ratten
Gruppen von drei OFA-Ratten wurden einmal durch intramuskuläre (Tibialis) Beimpfung mit Kochsalz, dem Adjuvans QS21 ( US 5,057,540 ), Pneumolysin, mit Adjuvans versehenem Pneumolysin, Formaldehyd-entgiftetem Pneumolysin, mit Adjuvans versehenem Formaldehyd-entgiftetem Pneumolysin, GMBS-entgiftetem Pneumolsysin, mit Adjuvans versehenem GMBS-entgiftetem Pneumolysin, NHS-Acetat-entgiftetem Pneumolysin oder mit Adjuvans versehenem NHS-Acetat-entgiftetem Pneumolysin immunisiert. Drei Tage nach der Immunisierung wurden alle Ratten getötet und die Tibialis wurde für die histologische Untersuchung präpariert. Die Tibialis wurde in Formalin fixiert und in 2 mm Abschnitte geschnitten, die dehydriert und in Paraffin eingebettet wurden. Es wurden 7 μm Abschnitte geschnitten und unter Verwendung des Trichrom-Masson-Verfahrens gefärbt, bevor sie mikroskopisch untersucht wurden.
Die Reaktogenität wurde unter Verwendung von vier Kriterien beurteilt: Degeneration/Nekrose, endomysiale Entzündung, Hämorrhagie und Aponeurose-Entzündung. Jedem dieser histologischen Kriterien wurde eine Punktzahl für jeden Muskel von jeder Gruppe zugewiesen und eine mittlere Läsionspunktzahl wurde dann für jede Gruppe berechnet. Eine Punktzahl von 0 = normal, 1 = minimal, 2 = gering, 3 = mäßig, 4 = deutlich und 5 = schwer.
Ergebnisse

Die Histologie von Schnitten wurde untersucht. Die mittleren Bewertungen für Degeneration/Nekrose, endomysiale Entzündung, Hämorrhagie und Aponeurose-Entzündung werden in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

Beimpfung	Degeneration/Nekrose	Endomysiale Entzündung	Hämorrhagie	Aponeurose-Entzündung

NaCl	0	0,5	0	0
Ply	3,6	3,8	3,0	1,4
GMBS-Ply	0,6	1,3	1,3	0,4
Adjuvans	2,9	3,9	2,8	2,8
Ply + Adjuvans	4,2	3,9	4,6	1,8
GMBS-Ply + Adj	2,9	3,9	3,8	1,6

Ein Vergleich der histologischen Bewertungen für nicht mit Adjuvans versehenes natives und entgiftetes Pneumolysin zeigt, dass GMBS ein besonders effektives Vernetzungsreagens ist, um es für die Entgiftung von Pneumolysin zu verwenden, wobei es eine starke Abnahme bei der Degeneration/Nekrose, endomysialen Entzündung, Hämorrhagie und Aponeurose-Entzündung hervorruft.
Die Zugabe von Adjuvans (50 μg Aluminiumphosphat und 5 μg MPL) zu den Beimpfungen erhöht die Menge der Reaktogenität als eine Nebenwirkung der Stimulation des Immunsystems. Die Entgiftung von Pneumolysin mit GMBS erlaubte es dem Grad der Degeneration/Nekrose auf denjenigen, der durch das Adjuvans alleine hervorgerufen wurde, reduziert zu werden, der niedriger war, als der Grad, der durch die Beimpfung mit nativem Pneumolysin hervorgerufen wurde. GMBS-entgiftetes Pneumolysin rief einen Grad an Hämorrhagie hervor, der niedriger war, als derjenige, der durch natives Pneumolysin hervorgerufen wurde. Die Grade an endomysialer Entzündung wurden durch das Adjuvans erhöht und dieser Grad lag weiterhin in der Gegenwart von mit Adjuvans versehenen nativen oder GMBS-entgifteten Pneumolysin vor. Die Aponeurose-Entzündung wurde jedoch von dem Grad, der durch das Adjuvans allein hervorgerufen wurde, durch natives oder GMBS-entgiftetes Pneumolysin reduziert, wobei der Grad der Aponeurose gering niedriger lag, wenn das Pneumolysin mit GMBS behandelt worden war.
Beispiel 5 – Evaluierung der Toxizität von mit GMBS behandeltem Pneumolysin bei Mäusen
Gruppen von 20 OF1-Mäusen wurden intranasal mit entweder nativem Pneumolysin oder GMBS-behandeltem Pneumolysin provoziert und die Mäuse wurden für die folgenden 9 Tage beobachtet.
Wie in 3 gezeigt wird, führte die Provokation mit 2 μg nativem Pneumolysin sehr schnell zu dem Tod von allen Mäusen in dieser Gruppe. Das Pneumolysin rief Läsionen durch das gesamte respiratorische System hervor, die zu Atmungsschwierigkeiten und dem Tod führten. Im Gegensatz dazu wies das GMBS-behandelte Pneumolysin eine wesentlich reduzierte Toxizität bei allen Mäusen, die mit 2 μg, 5 μg oder 10 μg des mit GMBS behandelten Pneumolysins geimpft wurden, die die Provokation überlebten, auf.
Beispiel 6 – Schutzstudien, die entgiftetes Pneumolysin verwenden
Gruppen von 20 OF1-Mäusen wurden 3 Mal intramuskulär an den Tagen 0, 14 und 28 mit 5 μg Pneumolysin und 50 μg Aluminiumphosphat und 5 μg MPL als Adjuvans immunisiert. Kontrollmäuse wurden mit Adjuvans allein immunisiert. Das Pneumolysin wurde entweder nicht behandelt oder unter Verwendung der GMBS-Behandlung, die oben beschrieben wird, entgiftet.
Am Tag 42 wurde den Mäusen eine intranasale, tödliche Provokation mit 2 μg nativem Pneumolysin verabreicht. Das Überleben der Mäuse über die folgenden 9 Tage wurde beobachtet.
Ergebnisse
Das letale Provokationsmodell führte zu 90% Mortalität bei den Kontrollmäusen (4). Die Immunisierung mit GMBS-entgiftetem Pneumolysin rief einen sehr guten Schutz mit nur 5% an sterbenden Mäusen während der folgenden 9 Tage hervor. Dies war vergleichbar mit dem Schutz, der nach Impfung mit nativem Pneumolysin erreicht wird, wonach 10% der Mäuse starb.
Beispiel 7 – Evaluierung von entgiftetem Pneumolysin in Kombination mit PhtD in einem letalen Maus-Provokationsmodell
Gruppen von 20 OF1-Mäusen wurden intramuskulär mit a) Adjuvans allein und b) 1 μg PhtD und Adjuvans oder c) 1 μg PhtD und 5 μg GMBS-entgiftetem Pneumolysin und Adjuvans immunisiert. Das verwendete Adjuvans bestand aus 50 μg Aluminiumphosphat und 5 μg MPL und die Immunisierungen fanden an dem Tag 0 und am Tag 14 statt. Die Mäuse wurden mit einer intranasalen letalen Dosis von 5·10⁵ KBE von Serotyp 2 S. pneumoniae Stamm D39 provoziert und das Überleben wurde für die nächsten 10 Tage beobachtet.
Ergebnisse
Wie in 5 gezeigt wird, führte die Provokation mit Stamm D39 zu 75% Letalität nach 10 Tagen bei Kontrollmäusen. Die Immunisierung mit PhtD allein stellte keinen signifikanten Schutz bereit, wobei 70% der Mäuse in dieser Gruppe nach 10 Tagen starben (p = 0,29). Die Immunisierung mit PhtD zusammen mit GMBS-entgiftetem Pneumolysin ergab einen signifikant besseren Schutz mit einer Letalität, die auf 50% reduziert war (p = 0,04).
Beispiel 8 – Entgiftung von Pneumolysin unter Verwendung von Formaldehyd
Ein Vorrat von gereinigtem Pneumolysin wurde bei einer Konzentration von ungefähr 0,4 mg/ml in 25 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, mit 50 mM L-Lysin und 0,1% Formaldehyd (w/v) für 21 Tage bei 40°C behandelt.

Claims

Verfahren zur Reinigung eines bakteriellen Cytolysins, umfassend die folgenden Schritte: a) Züchten einer Kultur von Zellen, die bakterielles Cytolysin exprimieren; b) Herstellen eines Extrakts aus der Kultur, enthaltend bakterielles Cytolysin; c) Bindung von löslichem aggregierten bakteriellen Cytolysin, enthalten in dem Extrakt, in Gegenwart eines Detergens an ein hydrophobes Wechselwirkungs-Chromatographiematerial unter Hochsalzbedingungen von 0,6 bis 2 M Salz; d) Elution des bakteriellen Cytolysins in Gegenwart eines Detergens unter Niedrigsalzbedingungen von 0 bis 0,2 M Salz.
Verfahren gemäß Anspruch 1, weiterhin umfassend die folgenden Schritte: e) Entfernung von Detergens von dem bakteriellen Cytolysin, f) Löslichmachen des bakteriellen Cytolysins durch Zugabe eines Denaturierungsmittels; g) Entfernung des Denaturierungsmittels von dem bakteriellen Cytolysin.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das bakterielle Cytolysin Pneumokokken-Pneumolysin ist.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, wobei Schritt b) das mechanische Aufbrechen der Zellen involviert.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, wobei Schritt b) die Behandlung mit einem Detergens involviert.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, wobei dasselbe Detergens in den Schritten c) und d) vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei dasselbe Detergens in den Schritten b), c) und d) vorliegt.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, wobei das Detergens in einer Konzentration zwischen 0,1 und 5% (G/V) vorliegt.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Schritt b) die Zentrifugation von aufgebrochenem Zellmaterial und das Sammeln eines Überstands als Extrakt von Schritt c) involviert.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographiematerial, das in Schritt c) verwendet wird, aromatische Gruppen enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das hydrophobe Chromatographiematerial Phenyl-Sepharose ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das in der in Schritt c) und/oder in Schritt d) verwendeten Lösung vorliegende Detergens ein aliphatisches Detergens ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Detergens Natriumlauroylsarcosinat ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Hochsalzbedingungen gemäß Schritt c) 1 M Salz enthalten.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die in Schritt c) und/oder d) verwendete Lösung ein Salz enthält, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Ammoniumchlorid, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Ammoniumsulfat, Natriumphosphat, Magnesiumphosphat, Ammoniumphosphat.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die in Schritt c) und/oder Schritt d) verwendeten Bedingungen zwischen pH 6 bis 8, vorzugsweise bei pH 7 liegen.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die in Schritt d) verwendeten Bedingungen 0 bis 0,1 M Salz enthalten.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die in Schritt d) verwendeten Bedingungen 0 bis 40 mM Salz enthalten.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Schritt e) die Entfernung von Detergens durch Diafiltration oder Dialyse involviert.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Diafiltration/Dialyse gegen einen Niedrigsalzpuffer, enthaltend 0 bis 0,2 M Salz und mit einem pH von pH 8 bis 10, vorzugsweise pH 9, durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 20, wobei Schritt f) das Denaturieren des bakteriellen Cytolysins durch Zugabe eines Denaturierungsmittels und Schritt g) das neuerliche Falten des bakteriellen Cytolysins durch graduelle Entfernung des Denaturierungsmittels involviert.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 bis 21, wobei das in Schritt f) verwendete Denaturierungsmittel Guanidinhydrochlorid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei 5 bis 8 M Guanidinhydrochlorid verwendet wird.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 21 bis 23, wobei das bakterielle Cytolysin mit 5 bis 9 M Harnstoff während Schritt f) kontaktiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei Schritt f) das Kontaktieren des bakteriellen Cytolysins mit 5 bis 8 M Guanidinhydrochlorid, gefolgt von ei nem Austausch des Guanidinhydrochlorid gegen 5 bis 9 M Harnstoff involviert.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 21 bis 25, wobei ein Reduktionsmittel während mindestens einem Teil der Schritte f) und g) vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei das Reduktionsmittel 0,1 bis 10 mM DTT, vorzugsweise 1 mM DTT, ist.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 bis 27, wobei Schritt g) das Entfernen des Denaturierungsmittels durch Diafiltration oder Dialyse involviert.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die Diafiltration oder Dialyse gegen eine Lösung mit einem pH von 7 bis 9 durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend einen weiteren Schritt des Entgiftens des bakteriellen Cytolysins durch chemische Behandlung, die die Verwendung eines Vernetzungsmittels involviert.
Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei das Vernetzungsreagens ein oder mehr Chemikalien enthält, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Formaldehyd, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinomidoestern und GMBS.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend einen weiteren Schritt der Konjugation des bakteriellen Cytolysins an ein bakterielles Kapselpolysaccharid.
Verfahren gemäß Anspruch 32, wobei das bakterielle Kapselpolysaccharid von Streptokokkus pneumoniae abstammt.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend einen weiteren Schritt der Formulierung des bakteriellen Cytolysins in eine Vaccin-Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienz.
Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei das bakterielle Cytolysin mit Cholinbindungsprotein A oder einem immunogenen Fragment davon formuliert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 34 oder 35, wobei das bakterielle Cytolysin mit einem oder mehr von PhtA, PhtB, PhtD oder PhtE oder einem immunogenen Fragment davon formuliert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 34 bis 36, wobei das bakterielle Cytolysin mit einem Antigen von nicht-typisierbarem Haemophilus influenzae (HtHi) formuliert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 34 bis 37, wobei das bakterielle Cytolysin mit einem Antigen von Moraxella catarrhalis formuliert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 34 bis 38, wobei das bakterielle Cytolysin mit einem Antigen von RSV formuliert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 34 bis 39, wobei das bakterielle Cytolysin mit einem Antigen von Parainfluenzae-Virus formuliert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 34 bis 40, wobei das bakterielle Cytolysin mit einem Antigen von Influenza-Virus formuliert wird.