CN1759121B - 纯化细菌溶细胞素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于纯化例如肺炎球菌溶血素的细菌溶细胞素的方法。在去污剂和高盐存在时通过将可溶性凝集的溶细胞素结合到疏水作用层析材料的单个层析步骤产生了优良的溶细胞素的纯化。

Description

纯化细菌溶细胞素的方法

技术领域

本发明涉及细菌溶细胞素纯化的领域，尤其涉及肺炎球菌溶血素的纯化方法。肺炎球菌溶血素是来自肺炎链球菌的具有良好抗原性特点的蛋白质，其适合作为抗肺炎链球菌传染或中耳炎的疫苗组分。本发明的方法描述了以在去污剂和高盐存在时通过将肺炎球菌溶血素结合至疏水作用柱的单个层析步骤纯化肺炎球菌溶血素的不常见的和便利的步骤。该方法方便地利用了细菌溶细胞素尤其在凝集状况下对类似胆固醇的芳香族化合物具有高亲合力而因此通常应用于该毒素家族成员纯化的特性。

硫醇活化的溶细胞素形成明显的细菌毒素组，其中链球菌溶血素O为其原型(Billington等.，FEMS Microbiol.Lett.(2000)，182；197-205)。这些毒素通过在细胞膜上形成小孔而溶解真核细胞。氧化剂不利地影响其细胞溶解活性而还原剂可以还原活性。这些组成员的一级氨基酸序列呈现30-60％相似性且在C-末端附近包含几乎不变的十肽以下序列。胆固醇是这些毒素主要的靶细胞受体。溶细胞素结合包含膜和寡聚体的胆固醇以形成上至30nm直径且由40-80个单体亚单位组成的跨膜孔。膜胆固醇的结合引起毒素单体的构象变化而促进寡聚化、膜嵌入和小孔形成的继发事件。

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是一些人类疾病包括肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎和鼻窦炎的病原体。尽管抗生素是有效的有时这些疾病仍可导致死亡。肺炎链球菌抗生素抗性菌株的出现加剧了由该病原体引起的问题。基于此，开发有效的抗肺炎链球菌的疫苗是很重要的。

包含纯化的荚膜多糖的多价肺炎球菌疫苗已使用多年。其应用受尤其在包括孕妇、老年人的高风险群体中低的免疫原性以及带来镰形细胞贫血症、多发性骨髓瘤、肝硬化或酒精中毒的限制。其也提供了血清型特定的保护而90个已知的血清型中仅23个由已有制剂覆盖。这将保护在美国人口中所发现血清型的90％而仅保护在亚洲人口中发现血清型的约70％。近来可使用一种缀合的七-价疫苗，其同样具有抗所有肺炎球菌株的问题。

肺炎球菌溶血素(Ply)是在所有肺炎链球菌株中发现的53kD硫醇-活化的溶细胞素，其被释放而产生自溶作用且为肺炎链球菌的致病原因。不同血清型的Ply蛋白质间除了有少数氨基酸取代，是非常保守的。肺炎球菌溶血素有高度的保守性和其免疫原性使其成为疫苗组分的可能候选物。然而，野生-型Ply由于其毒性而不适合组合入用于人的疫苗中。Ply通过与膜-结合胆固醇和寡聚体的相互作用而在膜上形成小孔，引起对细胞膜的破坏。在C-末端发现的保守的半胱氨酸-包含基元参与溶解活性。已提示突变Ply而降低其毒性(WO90/06951，WO99/03884)。

Lock等描述了肺炎球菌溶血素纯化的二步法(MicrobialPathogenesis(1996)21；71-83)。使用离子交换和凝胶过滤层析的组合从大肠杆菌培养物中纯化重组的肺炎球菌溶血素。该方法包括制备提取物的和流经DEAE Sepharose柱，随后流经Sephacryl S200-HR柱的步骤。该方法可用于纯化重组的或天然的肺炎球菌溶血素。

kuo等描述了纯化重组的GST-肺炎球菌溶血素融合蛋白的方法(Infection and Immunity(1995)63；2706-2713)。该融合蛋白在大肠杆菌培养物中表达且细胞裂解物上样于谷胱甘肽琼脂糖凝胶。融合蛋白用谷胱甘肽洗脱而凝血酶可用于裂解该融合蛋白。该蛋白质再一次流经谷胱甘肽-琼脂糖柱以除去GST。亲和纯化的肺炎球菌溶血素进一步用羟基磷灰石柱纯化。

Mitchell等(BBA(1989)1007；67-72)描述了利用疏水作用层析纯化肺炎球菌溶血素的方法。在其使用的条件下(250mM盐)，尽管放慢其过程且肺炎球菌溶血素以宽峰被洗脱，肺炎球菌溶血素并没能紧密结合到柱上。需要确定哪个组分包含纯的肺炎球菌溶血素、浓缩阳性组分、重新上柱以及用小体积水洗脱的另外步骤以克服肺炎球菌溶血素没有紧密结合至柱填充材料的问题。

仍然保持对改善抗肺炎链球菌疫苗的一贯需求。尽管该蛋白质的毒性仍然是一个问题，Ply组分的结合已经满足该需求。还需要开发用于大批量肺炎球菌溶血素纯化的快速和有效的方法。以前描述的方法包括利用连同介入试验的多个纯化步骤以及浓缩步骤。本发明提供了方便地利用了单个层析步骤的更高效的纯化方法，其能用于纯化大批量的肺炎球菌溶血素。

附图描述

图1-显示肺炎球菌溶血素纯化的SDS-PAGE凝胶。下列样品上样于SDS-PAGE凝胶：-泳道1-分子量标准，泳道2-细胞提取物的上清液，泳道3-流经苯基-琼脂糖凝胶，泳道4苯基琼脂糖凝胶首次洗涤，泳道5-苯基-琼脂糖凝胶二次洗涤，泳道6苯基-琼脂糖凝胶用0.5MNaCl洗涤，泳道7苯基-琼脂糖凝胶用低盐缓冲液洗脱，泳道8经变性/重新折叠步骤后的肺炎球菌溶血素，泳道9-经灭菌过滤后的肺炎球菌溶血素。

平板A显示考马斯蓝染色后的凝胶。平板B显示经利用抗-大肠杆菌抗体的蛋白质印迹法探测污染蛋白质后的凝胶。

图2-GMBS(N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)修饰的肺炎球菌溶血素-考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析。

下列样品上样于SDS-PAGE凝胶：-泳道1-分子量标准，泳道2-未经修饰的肺炎球菌溶血素，泳道3-用GMBS以GMBS/赖氨酸4/1摩尔比处理的PLY，泳道4-用GMBS以GMBS/赖氨酸4/1摩尔比处理且在37℃孵育7天的PLY，泳道5-用GMBS以GMBS/赖氨酸8/1摩尔比处理的PLY，泳道6-在37℃孵育7天后用GMBS以GMBS/赖氨酸8/1摩尔比处理的PLY，泳道7-用磺基-NHS醋酸盐以NHS/赖氨酸10/1摩尔比处理的PLY，泳道8-用NEM处理的PLY，泳道9-在37℃孵育7天后用NEM处理的PLY。

图3-经鼻给予小鼠的GMBS处理的肺炎球菌溶血素毒性。用菱形标记的曲线表示用2μg天然肺炎球菌溶血素攻击的小鼠存活率。用方形标记的曲线表示用10μg GMBS处理的肺炎球菌溶血素攻击的小鼠存活率。

图4-用天然肺炎球菌溶血素经鼻攻击的小鼠中通过GMBS处理的肺炎球菌溶血素引发的保护作用。用长方形标记的曲线显示单独用佐剂接种的小鼠存活率。用菱形标记的曲线表示用天然肺炎球菌溶血素接种的小鼠存活率。用方形标记的曲线表示用GMBS处理的肺炎求菌溶血素接种的小鼠存活率。

图5-用2型D39肺炎链球菌株经鼻攻击的小鼠中通过PhtD和GMBS处理的肺炎球菌溶血素接种引发的保护作用。用长方形标记的曲线代表单独用佐剂接种的小鼠存活率。用菱形标记的曲线代表用PhtD接种的小鼠存活率。用方形标记的曲线代表用PhtD和GMBS处理的肺炎球菌溶血素接种的小鼠存活率。

详细说明

方法

本发明的方法是用于纯化例如肺炎球菌溶血素的细菌溶细胞素的方法。溶细胞素，例如肺炎球菌溶血素，使用仅单个柱层析步骤无需重新装柱而纯化。蛋白质在去污剂和盐存在时以凝集形式结合疏水作用柱。几乎没有蛋白质在该条件下结合柱而使得溶细胞素以单个步骤纯化。

对本发明的溶细胞素可溶性凝集体而言，优选肺炎球菌溶血素为30,000g离心20分钟后保留在上清液中的溶细胞素的凝集形式。该可溶性凝集体在高盐，优选1M存在时保留在疏水作用层析材料上，优选苯基-琼脂糖凝胶。选择性地，该可溶性凝集体为胶状的。

溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素以可溶性凝集体结合柱。由于各种理由包括过滤器或柱阻塞以及物料损失，将凝集体装载到柱上是不常见的。然而，通过使用缩小凝集体大小以形成可溶性凝集体的去污剂，发现这些凝集体在去污剂条件下紧密结合柱，但可以以通过SDS-PAGE分析的至少50％、60％、70％、80％，优选90％、95％，更优选97％、98％或99％的纯度而无对柱过滤器的不利影响而洗脱。该方法优选得到每升发酵液至少100、200、500、700，更优选1000、1500、1700或1900mg的溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素。优选至少1％、2％、5％、7％、9％或10％来自发酵培养物的蛋白质作为纯化的溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素而回收。

该方法利用了溶细胞素例如肺炎球菌溶血素结合胆固醇及其他芳香族化合物的能力。该结合在溶细胞素凝集，允许溶细胞素在去污剂存在时结合的时候尤其紧密。由于所有成员均有结合芳香族化合物而形成小孔的能力，该方法可延伸至溶细胞素家族的其他成员。事实上该方法可用于纯化那些结合胆固醇或其他芳香族化合物和/或形成小孔，优选两者的其他蛋白质家族。

因此，在第一个实施方案中，提供用于细菌溶细胞素纯化的方法，所述方法包括以下步骤：

a)培养表达细菌溶细胞素的细胞的培养物；

b)从包含细菌溶细胞素的培养物中制备提取物；

c)在去污剂(优选脂肪族去污剂)存在时将包含于提取物中的可溶性凝集的细菌溶细胞素在高盐(优选0.5-2M盐)条件下结合至疏水作用层析材料；

d)在去污剂(优选脂肪族去污剂)存在时低盐(优选0-0.2M盐)条件下洗脱细菌溶细胞素。

在第二个实施方案中，提供用于细菌溶细胞素纯化的方法，所述方法包括以下步骤：

a)培养表达细菌溶细胞素的细胞的培养物；

b)从包含细菌溶细胞素的培养物中制备提取物；

c)在包含0.5-2M盐和0.1％-5％去污剂的溶液存在时将包含于提取物中的细菌溶细胞素结合至疏水作用层析材料；

d)利用包含0.1-5％去污剂的低盐(优选0-0.2M盐)溶液洗脱细菌溶细胞素。

在上述两个实施方案中，本发明的方法优选还包括以下步骤：

e)从细菌溶细胞素中除去去污剂

f)通过添加变性剂溶解细菌溶细胞素；

g)从细菌溶细胞素除去变性剂。

本发明的方法可方便地用于纯化肺炎球菌溶血素。可用本发明的方法纯化的其他溶细胞素包括来自化脓放线菌(A.pyogenes)的化脓放线菌溶血素、来自蜡样芽胞杆菌(B.cereus)的蜡样芽胞杆菌溶血素、来自苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)的苏云金芽孢杆菌溶血素O、来自侧芽孢杆菌(B.latersporus)的侧芽孢杆菌溶血素、来自双酶芽胞梭菌(C.bifermentans)的双酶芽胞梭菌溶血素、来自肉毒芽胞梭菌(C.botulinum)的肉毒芽胞梭菌溶血素、来自肖氏梭菌(C.chauvoel)的肖氏梭菌溶血素、来自溶组织梭状芽孢杆菌(C.histolyticum)的溶组织梭状芽孢杆菌溶血素、来自诺氏梭菌(C.novyi)的A型诺氏梭菌溶血素、来自产气夹膜杆菌(C.perfringens)的产气夹膜杆菌溶血素O、来自败毒梭菌(C.septicum)的败毒梭菌溶血素O、来自索氏芽胞梭菌(C.sordellii)的索氏芽胞梭菌溶血素、来自破伤风梭菌(C.tetani)的破伤风溶血溶血素、来自伊凡奴夫李斯特菌(L.ivanovi)的伊凡奴夫李斯特菌溶血素、来自产单核细胞李斯特菌(L.monocytogenes)的产单核细胞李斯特菌溶血素O、来自西利坚李斯特菌(L.seeligeri)的西利坚李斯特菌溶血素O、来自蜂房类芽孢杆菌(P.alvei)的蜂房类芽孢杆菌溶血素、来自化脓链球菌(S.pyogenes)、狗链球菌(S.canis)或似马链球菌(S.equisimilis)的链球菌溶血素O、来自中间链球菌(S.intermedius)的中间链球菌溶血素、来自猪链球菌(S.suis)的猪链球菌溶血素或来自肺炎链球菌(S.Pneumoniae)的肺炎链球菌溶血素，其为野生型的或如上述PdA或PdB的低水平毒性的遗传修饰毒素。

肺炎球菌溶血素或Ply表示：来自肺炎链球菌的天然肺炎球菌溶血素或重组的肺炎球菌溶血素、野生-型肺炎球菌溶血素或肺炎球菌溶血素的突变体(例如WO90/06951和WO99/03884中所述的)。任选地，肺炎球菌溶血素也可表示肺炎球菌溶血素的任意片段或肺炎球菌溶血素的任意变体，其与野生-型肺炎球菌溶血素序列具有至少70、80、90或95％的氨基酸序列同一性，且如熟练技术人员很容易确定的那样，其仍然保留可通过本发明方法纯化的能力。

在本发明的一个优选的实施方案中，相同的去污剂优选以0.1％-5％(w/v)的浓度存在于步骤b)和c)、b)和d)中，更优选在步骤b)、c)和d)中。对于本发明而言，脂肪族的去污剂确定为不具有充分的芳香族特征以阻止步骤c)中溶细胞素结合柱的实质上的脂肪族去污剂。优选该脂肪族去污剂具有一个或更少的芳香族环，最优选不具有芳香族环。在步骤d)中，去污剂将较大的溶细胞素凝集体打碎至较小的凝集体而得到可溶性凝集体是很有用的。在步骤c)和d)中，去污剂有效地维持了溶细胞素的可溶性凝集体状态，使得其在高盐条件下以高亲合力结合柱。

溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素在细菌细胞，优选肺炎链球菌、大肠杆菌或者在酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞的培养物或任何适合其表达的表达***中表达。在达到肺炎球菌溶血素高产率的表达***中，肺炎球菌溶血素常是自动凝集的而本发明的方法对于其纯化是理想的。优选肺炎球菌溶血素以高产率表达以达到在表达***中其占据超过总蛋白的2、3、4、5、7或10％。优选肺炎球菌溶血素为凝集体形式而因此最大程度地缺乏溶血活性。例如，在大肠杆菌发酵罐中λ噬菌体启动子或其他产生高表达的启动子控制下的表达是本领域技术人员所熟知的。

优选溶细胞素以凝集体从表达***中提取。或者，较低产率的表达***可提供可溶性溶细胞素。在这种情况下，包含溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素的提取物调节至pH低于7.5，其使得溶细胞素在至少8小时时期，优选至少24小时内凝集。

步骤b)中提取物的制备优选包括一个或多个用机械方法破碎细胞和/或用去污剂处理细胞的步骤。如果通过高产率方法制得，肺炎球菌溶血素维持凝集体的形式但凝集体应当足够小以致在沉淀不溶性细胞碎片所需的条件下样品离心后其保留在上清液中。用于本发明的优选去污剂为脂肪族去污剂，其不包括芳香环、优选离子型去污剂、更优选阳离子或阴离子去污剂且最优选地，去污剂为月桂酰基肌氨酸钠。优选的去污剂能溶解肺炎球菌溶血素，只要让其处于结合疏水作用柱而不引起附着于该柱的过滤器阻塞的小凝集体形式。优选的去污剂能缩小肺炎球菌溶血素的大小，使得肺炎球菌溶血素凝集体足够小以致在30,000g 20分钟样品离心后保留在上清液中。该可溶性凝集体是在疏水作用柱上同样可纯化的。去污剂以0.1％至5％，优选0.5％至3％(w/v)，优选0.75％至2％，更优选约1％的浓度存在。优选地，去污剂是可透析的。

随着在步骤b)中培养物的机械方法的和/或去污剂的裂解，本发明的方法包括细胞物质的离心和收集上清液作为提取物以上样于步骤c)中的层析材料中。溶细胞素优选以可溶性凝集体存在于上清液中。

本发明的方法运用疏水作用层析以单个步骤纯化肺炎球菌溶血素。步骤c)中使用的柱填充材料优选包含芳族基团，优选苯基且更优选为苯基-琼脂糖凝胶。

步骤c)和/或步骤d)中上样和柱的洗脱期间使用的溶液包括离子型去污剂，优选阳离子或阴离子去污剂，优选在0.5M以上盐浓度中可溶的去污剂，最优选去污剂为月桂酰基肌氨酸钠。所用的去污剂可缩小溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素凝集体的大小，允许溶细胞素以可溶性凝集体存在于样品中以致其可结合疏水作用柱填充材料而不是不可逆地停留在柱上。去污剂以0.1％至5％，优选0.5％至3％(w/v)，更优选0.75％至2％，最优选约1％的浓度存在。

步骤c)和/或d)中所用的溶液包含盐，优选选自氯化钠、氯化镁、氯化铵、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵、磷酸钠、磷酸镁、磷酸铵的盐且优选缓冲pH6-8，优选约pH7。可使用任何能维持pH在pH5和9之间的缓冲液。

本发明方法中所用结合肺炎球菌溶血素至柱的溶液包含高的盐浓度，优选0.6-2M，更优选约1M。选择盐浓度以使肺炎球菌溶血素处于可溶性凝集的形式且能结合疏水层析材料。

任选地，步骤c)可包含以约0.5M盐的中等盐条件或能除去任何不充分结合的杂质的盐浓度洗涤柱的附加步骤。

本发明的方法利用递减的盐梯度从柱上洗脱肺炎球菌溶血素。优选步骤d)中用于制得盐梯度的低盐溶液包含0-0.1M盐，更优选0-40mM盐。或者，可利用步骤d)中所用的包含0-0.2M盐，更优选0-40mM盐的低盐缓冲液进行梯度洗脱。

任选的步骤可以加入到本发明的方法中，如果其使肺炎球菌溶血素变性且随后通过变性剂的去除而重新折叠之。这些可选步骤确保获得具有天然结构的纯的溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素。第一个可选步骤e)包括通过渗滤、透析或稀释去除去污剂。该步骤优选包括经pH8-10，优选约9的缓冲液的渗滤/透析，更优选该缓冲液能缓冲碱性pH值，最优选该缓冲液为DEA。溶液优选低离子强度的，优选10-50mM，最优选约25mM。渗滤或透析优选在4℃进行但也可在室温下进行。

在第二个任选步骤中，溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素是变性的且通过变性剂的添加而溶解。用于步骤f)中的变性剂优选为盐酸胍，更优选5-8M的盐酸胍，最优选约6M的盐酸胍。肺炎球菌溶血素用盐酸胍孵育至少10分钟，优选至少1小时，更优选约一小时。

步骤f)中，溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素优选随后与5-9M的尿素，优选约8M的尿素接触。此通过溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素抗尿素的渗滤或透析而完成。优选地，在变性剂交换期间维持相同的缓冲液和pH。优选在变性剂的交换期间加入还原剂(DTT，2-巯基乙醇或谷胱甘肽)。

优选步骤f)包括溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素与5-8M盐酸胍接触，随后盐酸胍与5-9M尿素的交换。

在溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素变性时为避免不适当的二硫键形成，确保在步骤f)和g)的至少一部分中还原剂的存在是有帮助的。优选的还原剂为0.1-10mM的DTT，优选约1mM的DTT。或者使用谷胱甘肽或2-巯基乙醇。谷胱甘肽的优选浓度为1-50mM，更优选10-30mM。

任选的步骤g)包括变性剂的去除以便重新折叠溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素。优选经pH6-11，优选约pH9的低盐缓冲液的渗滤或透析而实现。优选地，溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素的浓度维持至少100μg/ml，优选在100μg/ml和1000μg/ml之间，更优选在约500μg/ml。选择性地，渗滤或透析经包含10％至30％，优选约15％丙二醇的缓冲液。优选地，在步骤g)中保留上述还原剂。渗滤或透析优选在4℃进行但也可在室温下进行。

进一步的任选步骤h)包括溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素重新折叠后还原剂的去除。此优选经pH6-11，优选约pH9的低盐缓冲液的渗滤或透析实现。选择性地，渗滤或透析经包含10％至30％，优选约15％丙二醇的缓冲液。渗滤或透析优选在4℃进行但也可在室温下进行。

在本发明优选的方法中，重新折叠溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素以使其溶血活性恢复至超过正常折叠蛋白质的25％、50％、75％最优选至超过90％。对于本发明而言，‘折叠的’蛋白质为具有通过非-变性方法获得的蛋白质的三级结构的蛋白质。就野生型肺炎球菌溶血素而言，重新折叠的肺炎球菌溶血素预期的溶血活性将为500,000-1,000,000溶血单位/mg肺炎球菌溶血素。对于具有较低溶血活性的点突变肺炎球菌溶血素，重新折叠的肺炎球菌溶血素溶血活性将相对较低。

毒素的解毒

用本发明的方法纯化的溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素可以经过进一步的通过化学处理的可选解毒步骤。该附加的步骤在溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素将被施予动物或人时是尤其有益的。野生型肺炎球菌溶血素是高毒性的。已分离一些具有降低的毒性的突变肺炎球菌溶血素蛋白质，然而这些仍然保持残留毒性，其在肺炎球菌溶血素内部给药时(WO99/03884，WO90/06951)可能是有问题的。做为选择其可通过结合至多糖(WO96/05859)而解毒。

本发明的方法可通过化学处理解毒野生型或者突变的溶细胞素，例如肺炎球菌溶血素。优选的实施方案使用交联剂，更优选包含一种或多种选自甲醛、戊二醛的化学试剂和包含N-羟基琥珀酰亚胺酯和/或马来酰亚胺(如GMBS)的交联试剂。

解毒方法本身为本发明的一方面且可用于解毒细菌毒素，优选通过其他方法制备的肺炎球菌溶血素。

在一个实施方案中，本发明的解毒方法描述了包括用化合物，优选对胺基，更优选伯胺基起反应的，优选择优反应的，最优选特异性反应的交联试剂处理毒素的细菌毒素的解毒。

就本申请而言，交联剂定义为至少具有两个活性基团的化合物，其中至少一个能与细菌毒素上的至少一个基团反应。另一个活性基团能与细菌毒素上的或者分离的化合物(例如氨基酸、肽、多肽、糖或多糖)的基团反应。

优选化合物或交联剂对胺和巯基是反应性的，更优选择优反应的，最优选特异性反应的。优选化合物与赖氨酸的伯胺基反应，更优选交联剂与赖氨酸的伯胺基和半胱氨酸的巯基反应。在相对于交联剂仅与赖氨酸或半胱氨酸反应的残留溶血活性，肺炎球菌溶血素由于半胱氨酸和赖氨酸残基的修饰而导致溶血水平的协同降低而解毒的方面，该方法尤其有利。

因此一个可选的实施方案提供了包括修饰参与毒素毒性(优选溶解活性)的半胱氨酸残基(任选毒素的C-末端附近)细菌毒素解毒的方法，包括用将毒素的巯基与另一个氨基酸，优选在一级结构中远离半胱氨酸超过2、5、10、15、20、30、40个氨基酸的氨基酸交联的交联剂(优选异双功能交联剂)处理毒素。优选另一个氨基酸包含伯胺基团且更优选该氨基酸为赖氨酸。

在一些实施方案中，在通过SDS-PAGE评估处理后，超过50％60％、70％、80％、90％或95％的毒素保持分子量在其原始分子量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，更优选在1-50％，最优选在5-10％之内。由于一些氨基酸残基通过与化合物共价结合而修饰，在解毒处理后优选毒素达到稍微更高的分子量。然而本发明的方法优选不包括毒素的广泛缀合，无论是通过共价结合至其他毒素分子以致形成具有多聚体四级结构的毒素，还是通过共价结合毒素至其他的巨大蛋白质，多糖或脂多糖。最优选WO96/05859中公开的方法、蛋白质或产品并不包含在本发明中。

本发明的方法可用于细菌毒素解毒。优选的毒素包括硫醇-活化的来自化脓放线菌(A.pyogenes)的化脓放线菌溶血素、来自蜡样芽胞杆菌(B.cereus)的蜡样芽胞杆菌溶血素、来自苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)的苏云金芽孢杆菌溶血素O、来自侧芽孢杆菌(B.latersporus)的侧芽孢杆菌溶血素、来自双酶芽胞梭菌(C.bifermentans)的双酶芽胞梭菌溶血素、来自肉毒芽胞梭菌(C.botulinum)的肉毒芽胞梭菌溶血素、来自肖氏梭菌(C.chauvoel)的肖氏梭菌溶血素、来自溶组织梭状芽孢杆菌(C.histolyticum)的溶组织梭状芽孢杆菌溶血素、来自诺氏梭菌(C.novyi)的A型诺氏梭菌溶血素、来自产气夹膜杆菌(C.perfringens)的产气夹膜杆菌溶血素O、来自败毒梭菌(C.septicum)的败毒梭菌溶血素O、来自索氏芽胞梭菌(C.sordellii)的索氏芽胞梭菌溶血素、来自破伤风梭菌(C.tetani)的破伤风溶血溶血素、来自伊凡奴夫李斯特菌(L.ivanovi)的伊凡奴夫李斯特菌溶血素、来自产单核细胞李斯特菌(L.monocytogenes)的产单核细胞李斯特菌溶血素O、来自西利坚李斯特菌(L.seeligeri)的西利坚李斯特菌溶血素O、来自蜂房类芽孢杆菌(P.alvei)的蜂房类芽孢杆菌溶血素、来自化脓链球菌(S.pyogenes)、狗链球菌(S.canis)或似马链球菌(S.equisimilis)的链球菌溶血素O、来自中间链球菌(S.intermedius)的中间链球菌溶血素、来自猪链球菌(S.suis)的猪链球菌溶血素或来自肺炎链球菌(S.Pneumoniae)的肺炎链球菌溶血素的溶细胞素，其为野生型的或具有较低毒性水平的的遗传修饰毒素，如上述的PdA或PdB(WO90/06951，WO99/03884)。

该方法也可用于解毒Neisserial毒素FrpA、FrpC(WO92/01460)、FrpB(Microbiology 142；3269-3274，(1996)；J.Bacteriol.181；2895-2901(1999))、NM-ADPRT(13^th International PathogenicNeisseria Conferenee 2002 Masignani et al p135)。FrpA和FrpC两个蛋白质间包含保守区且该毒素的优选片段是包含该保守片段的多肽，优选包括FrpA/C序列的氨基酸227-1004。

本发明的方法也可用于解毒包括腺苷酸环化酶(CyaA)(Glaser(1988)Mol.Microbiol.2；19-30)的博德特氏菌(Bordetella)毒素、皮肤坏死毒素(Livey(1984J.Med，Microbiol.17；91-103)和百日咳毒素(PT)(Munoz等(1981)Infect Immun 33；820-826)。本发明的方法还可用于解毒破伤风毒素(TT)和白喉毒素(DT)以及来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的包括自溶菌素和葡萄球菌溶血素(WO0/99499，WO02/59148)的毒素。

本发明的方法导致毒素毒性和/或溶血活性量至少90％，优选95％、96％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％的恢复。(溶血活性使用实施例3方法测定而毒性可通过实施例5的方法测定。)天然的肺炎球菌溶血素具有500,000-1,000,000单位/毫克肺炎球菌溶血素的溶血活性。肺炎球菌溶血素的一些点-突变变体具有降低的毒性和溶血活性。变体肺炎球菌溶血素的解毒由于溶血活性降低的较低起点而可能不能达到溶血活性很大百分数的减少，然而可以预见的是残留溶血活性的大部分通过本发明的方法被除去。

本发明方法的解毒步骤优选提供一种基本上不可逆的交联反应。可逆性通过在解毒后和在超过25℃，优选超过30℃，更优选超过35℃，最优选超过37℃温度孵育至少5、6、7、8、9或10天后直接监测已解毒毒素的溶血活性水平而评定。基本上不可逆的反应产生基本上不可逆的解毒且定义为其中溶血活性水平在上述升温时孵育后提高少于100％、50％、40％、30％、20％、10％的反应。许多解毒的方法，例如通过使用甲醛处理，导致不稳定的且将来毒性增强的解毒。

在本发明方法的优选解毒步骤中，超过50％、60％、70％、80％、90％、95％，或98％的毒素在交联反应后维持单体的四级结构。许多交联剂形成分子间交联(例如甲醛和戊二醛)。由于一些抗原决定簇将隐藏在凝集体内部，这会影响毒素的免疫学特性。本发明的方法优选包括简单修饰氨基酸残基，优选氨基酸的巯基和/或伯胺基和/或形成主要的分子内交联。反应产物的单体四级结构允许抗原决定簇维持暴露于毒素表面。

在解毒步骤的一个优选实施方案中，交联剂是异双功能的。优选的交联剂包含与伯胺基团择优反应，更优选特异性反应的N-羟基琥珀酰亚胺酯基。优选的交联剂包含与巯基择优反应，更优选特异性反应的马来酰亚胺基。在pH约7时，马来酰亚胺基与巯基反应比其与胺反应快1000倍。优选交联剂包含N-羟基琥珀酰亚胺酯基和马来酰亚胺基。由于此引起较差的有效解毒，优选使用还原剂不可裂解的交联剂。

交联剂活性基团间的距离能影响解毒的效力。优选在本发明方法中，与胺和巯基反应的交联剂基团间的距离在1.5和20埃之间，更优选在5和15埃之间和最优选约10埃。优选细菌毒素上的氨基酸残基通过超过5、7、10、12、15、18、20、50、100、500埃长的基团的添加而修饰。优选修饰基团在5和100埃之间，更优选在10和20埃之间。

本发明方法的解毒步骤使得足够的残基被修饰以使位阻影响和/或构象变化抑制细菌毒素的功能。优选细菌毒素的至少5、7、10、12、14、15、20或25个氨基酸残基被修饰。因为未反应的马来酰亚胺基团呈现在交联剂上，可使用Ellman反应评估(间接地)附着于每个毒素分子的交联剂分子数目(Ellman 1959 Arch.Biochem.Biophys.82；70)。

优选的交联剂为SMPT、磺基-LC-SMPT、磺基-KMUS、LC-SMCC、KMUA、磺基-LC-SPDP、LC-SPDP、SMPB、磺基-SMPB、SMPH、磺基-SMCC、SMCC、SIAB、磺基-SIAB、GMBS(N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)、磺基-GMBS、MBS、磺基-MBS、磺基-EMCS、EMCA、EMCS、BMPS、SPDP、SBAP、BMPA、AMAS、SATP和SIA(Pierce)。

在本发明的一个优选方法中毒素用化合物或交联剂在5.0和9.0之间，优选6.5至8.0，最优选7.0至7.8的pH条件下处理。在促进马来酰亚胺基与巯基反应的处理中，反应优选的pH为6.0和8.0，更优选6.5和7.5。反应期间优选的盐浓度在100mM和1M之间，更优选150mM和500mM，最优选200mM和300mM之间。然而，发明人发现有时在没有氯化钠或其他盐添加的低盐浓度下进行反应更好。因为反应在pH7.6和7.8之间进行，该反应可任选在无盐添加下进行。同样地，GMBS对毒素更高比率的使用可在pH值7.0和8.0之间无盐添加下进行。

优选使用化合物或交联剂对每个毒素50-500，更优选130-350或350-900，最优选约250倍的摩尔过量。肺炎球菌溶血素包含31个赖氨酸残基。因此超过肺炎球菌溶血素248倍摩尔过量的化合物或交联剂相当于化合物或交联剂对每个赖氨酸残基的8倍摩尔过量。本发明方法中优选使用化合物或交联剂对赖氨酸残基的2-20，更优选4-15或15-30，最优选约8倍的摩尔比。

用交联剂的处理在4℃和40℃之间，优选在15℃和25℃之间，最优选在室温下进行至少15分钟，优选至少30分钟，最优选约一个小时。本发明的方法可更进一步包括使用包含巯基的化合物的淬灭步骤，优选该淬灭剂具有超过50、100或120的分子量，更优选该淬灭剂为氨基酸例如半胱氨酸。或者该基团可以与能和马来酰亚胺反应的肽或多糖，例如包含半胱氨酸残基的肽反应。这是尤其合适的，因为未反应的马来酰亚胺基团在淬灭步骤前呈现。

解毒步骤适合用于上述细菌毒素。优选细菌毒素来自肺炎链球菌，最优选毒素为肺炎球菌溶血素。肺炎球菌溶血素为天然的或重组蛋白质或已经过遗传工程减少其毒性(如上所述)的蛋白质。毒素，优选肺炎球菌溶血素的融合蛋白或毒素，优选肺炎球菌溶血素的片段可使用本发明的方法解毒。

因此在一个优选实施方案中，毒素(例如肺炎球菌溶血素)用交联剂解毒，其优选是具有与赖氨酸和半胱氨酸残基反应的基团的异双功能且大小确定的，最优选具有间隔10-20埃距离的活性基团以致下列每个或两者都发生：

a)5和30之间，优选约12-14个毒素的氨基酸残基通过交联分子优选共价结合至赖氨酸或精氨酸残基(优选地，如通过Ellman反应间接测定的)，另一端已经被淬灭(优选与半胱氨酸)而修饰和/或；

b)毒素涉及毒性的半胱氨酸侧链(优选接近毒素的C-末端)交联至毒素的另一个侧链(优选至赖氨酸或精氨酸残基)，其优选与毒素初级序列的半胱氨酸残基隔开超过2、5、10、20、30或40个氨基酸。

在进一步的优选实施方案中，毒素(优选肺炎球菌溶血素)用单功能化合物解毒，其优选与包含伯胺基团的氨基酸，更优选赖氨酸反应，且大小确定，最优选10-100埃以致毒素由5和30之间，更优选约14个结合氨基酸残基的化合物覆盖。

多糖缀合物

一个与多糖方法接种有关的问题为多糖本身缺乏免疫原。为克服该问题，多糖可以缀合至蛋白质载体，其提供旁观T-细胞辅助(bystander T-cellhelp)。本发明的方法可有利地包含将溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素缀合至细菌多糖，例如脂-低多糖或优选荚膜多糖的进一步的步骤。

本发明优选的缀合物包括缀合至来源于肺炎链球菌的荚膜多糖的溶细胞素，优选通过本发明方法获得的肺炎球菌溶血素。肺炎球菌的荚膜多糖抗原优选选自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、11A、11A、12F、1415B、17F18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最优选血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)，或两个或更多上述缀合物的混合物(4、7、9、11、13或23)。

通过本发明的方法纯化的溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素还可优选缀合至来自其他细菌菌株的荚膜多糖。所述多糖可分离自，例如，流感杆菌(H.influenzae)、流感杆菌B型(Hib)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)A、C、W、Y、除了肺炎链球菌外的链球菌(如B链球菌B Streptococcus、化脓链球菌S.pyogenes，等等.)、葡萄球菌(如金黄色葡萄球菌S.aureus、表皮葡萄球菌S.epidermidis)、大肠杆菌肠球菌(如粪肠球菌E.faecalis和屎肠球菌E.faecium)，等等。优选多糖来自流感杆菌B型(Hib)和/或脑膜炎奈瑟氏球菌A、C、W135和/或Y。

多糖可以通过任何已知的方法(例如，通过Likhite，美国专利4，372,945和通过Armor等.美国专利4,474,757)连接到溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素。优选地，进行CDAP缀合(WO95/08348)。为提高免疫原性，多糖可添加佐剂和/或冻干。本发明的多糖可以是完全大小的或纯化后调整大小至较小的多糖或低聚糖。

本发明的方法优选包括配制溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素成疫苗的进一步步骤。

蛋白质和免疫原性组合物

本发明更进一步的实施方案为通过本发明的方法纯化的溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素。此包括通过本发明的方法制备的肺炎球菌溶血素-细菌荚膜多糖缀合物。

本发明更进一步的实施方案为包括通过本发明的方法(如上所述)获得的溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素或肺炎球菌溶血素-细菌荚膜多糖地免疫原性组合物。

本发明的免疫原性组合物优选更进一步包括肺炎球菌胆碱结合蛋白家族的一个或多个成员，优选胆碱结合蛋白A或其免疫原性片段和/或聚组氨酸三联家族(包括其融合蛋白)的一个或多个成员，优选PhtA、PhtB、PhtD或PhtE或其免疫原性片段。

对于胆碱结合蛋白家族(CbpX)，该家族成员最初鉴定为可通过胆碱-亲和层析法纯化的肺炎球菌蛋白质。所有胆碱-结合蛋白质与细胞壁磷壁质的磷酸胆碱配体和膜-相关的脂胞壁酸非-共价结合。在结构上，全部家族具有一些共同的区域，虽然其蛋白质的确切性质(氨基酸序列、长度，等等)可以变化。通常，胆碱结合蛋白质包括N末端区域(N)、保守重复区域(R1和/或R2)、脯氨酸富集区域(P)和保守的胆碱结合区域(C)，由多倍重复构成，其包括了大约蛋白质的一半。如本申请中所用的，术语“胆碱结合蛋白家族(CbpX)”选自WO97/41151鉴定的胆碱结合蛋白质，PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA在WO97/41151中公开。CbpD和CbpG在WO00/29434中公开。PspC在WO97/09994中公开。PbcA在WO98/21337中公开。SpsA为在WO98/39450中公开的胆碱结合蛋白。优选胆碱结合蛋白质选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。

另一个优选的实施方案为CbpX截短物，其中“CbpX”如上定义而“截短物”指缺少50％或更多胆碱结合区域(C)的CbpX蛋白质。优选该蛋白质缺少全部的胆碱结合区域。更优选地，该蛋白质截短物缺少(i)胆碱结合区域和(ii)以及蛋白质N-末端一半的部分，但仍保留至少一个重复区域(R1或R2)。仍然更优选地，截短物具有2个重复区域(R1和R2)，更优选该截短物保留脯氨酸富集区域(P)。所述实施方案的实例为WO99/51266或WO99/51188中例举的NR1×R2和R1×R2以及NR1×R2P，然而，缺少类似胆碱结合区域的其他胆碱结合蛋白质也包括在发明的范围内。

LytX家族为与细胞溶解作用有关的膜相关蛋白质。N-末端结构域包括胆碱结合结构域，然而LytX家族不具有上述CbpA家族中发现的全部特性而因此LytX家族被认为与CbpX家族不同。与CbpX家族相比，C-末端结构域包含LytX蛋白质家族的催化结构域。该家族包括LytA、B和C。对于LytX家族，LytA在Ronda等.Eur J Biochem，164：621-624(1987)中公开。LytB在WO98/18930中公开，且也称为Sp46。LytC也在WO98/18930中公开，且也称为Sp91。该家族优选的成员为LytC。

另一个优选的实施方案为LytX截短物，其中“LytX”如上定义而“截短物”指缺少50％或更多胆碱结合区域的LytX蛋白质。优选该蛋白质缺少全部的胆碱结合区域。该截短物的一个实例存在于本发明的实施例部分。

发明的又一个优选实施方案为CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合)。优选此包括CbpX的NR1×R2(或R1×R2，或NR1×R2P)和LytX的C-末端部分(C-末端，即缺少胆碱结合结构域)(如LytC的C-末端或Sp91的C-末端)。更优选CbpX选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。仍然是更优选地，其为CbpA。优选LytX为LytC(也称为Sp91)。

本发明的另一个实施方案为任意表示为与LytX的融合蛋白的PspA或PsaA，或缺少胆碱结合结构域(C)的截短物。优选LytX为LytC。

Pht(聚组氨酸三联体)家族包括蛋白质PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。该家族具有以下特征：脂质化序列(lipidation sequence)，由脯氨酸-富集区域和几个组氨酸三联体分隔开的两个区(可能与金属或核苷的结合或酶的活性有关)，(3-5)卷曲螺旋区，保守的N-末端和异源的C-末端。它存在于已检验的所有肺炎球菌菌株中。其同源蛋白可见于其它链球菌和奈瑟氏球菌属。该家族优选的成员包括PhtA、PhtB和PhtD。更优选，其包括PhtA或PhtD。可以理解，术语PhtA、B、D和E是指具有在以下引用文献中公开的序列的蛋白，以及其天然(和人工制备的)变体，所述变体与参考蛋白有至少90％的序列同源性。优选至少95％相同，最优选至少97％相同。

本发明的免疫原性组合物可包括组氨酸三联体蛋白质的融合蛋白。优选的融合蛋白包含i)与PhtE或其片段连接的PhtD或其片段或ii)与PhtE或其片段连接的PhtB或其片段。

对于PhtX蛋白而言，PhtA在WO98/18930中公开，也称作Sp36。如上所述，其是一种多组氨酸三联体家族的蛋白，且具有II型信号基序LXXC。

PhtD在WO00/37105中公开，且也称为Sp036D。如上所述，它也是多组氨酸三联体家族的一种蛋白，也具有II型信号基序LXXC。PhtB在WO00/37105中公开，且也称为Sp036B。PhtB家族的另一成员是C3-降解的多肽，在WO00/17370中公开。该蛋白也是多组氨酸三联体家族成员，具有II型信号基序LXXC。优选的免疫功能等效物是蛋白Sp42，在WO98/18930中公开。PhtB截短物(约79kD)在WO99/15675中公开，它也被认为是PhtX家族成员。

PhtE在WO00/30299中公开，称作BVH-3。

为了产生本发明的免疫原性组合物，其能引发对包含中耳炎的超过一种病原体的免疫应答，本发明的免疫原性组合物进一步包括来自肺炎链球菌、未确定型别的(non-typable)流感杆菌、粘膜炎莫拉氏菌、RSV、副流感病毒和/或流感病毒的一种或多种(2、3、4、5、6)是有益的。

本发明也涉及组合型疫苗，所述疫苗可提供抗御不同病原体的保护作用。目前，许多儿科疫苗以组合疫苗的形式提供以降低儿童注射的次数。因此，来源于其他病原体的其他抗原也可以与本发明的疫苗配制成儿科疫苗。例如，本发明的疫苗可与以下物质一起配制(或同一时间分别给药)：公知的“三价”组合疫苗，包含白喉类毒素(DT)，破伤风类毒素(TT)，和百日咳成分[通常是脱毒的百日咳类毒素(PT)，丝状血凝素(FHA)和备选的百日咳杆菌粘附素(PRN)和/或凝集素1+2]，例如，包含DT，TT，PT，PHA和PRN抗原的市售疫苗INFANRIX-DTPa^TM(SmithKlineBeecham Biologicals)，或百日咳完整细胞成分，如SmithklineBeecham Biologicals出售的Tritanrix^TM。所述组合疫苗也可以包含其它抗原，如乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，脊髓灰质炎病毒抗原(例如灭活的三价脊髓灰质炎病毒-IPV)，粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)外膜蛋白，未确定型别的(non-typeable)流感嗜血菌的蛋白，脑膜炎奈瑟氏球菌B的外膜蛋白。

可以包含在组合疫苗中的优选粘膜炎莫拉氏菌蛋白抗原的实例(尤其对于预防中耳炎)是：OMP106[WO97/417319(Antex)和WO96/34960(PMC)]；OMP21；LbpA和/或LbpB[WO98/55606(pmc)]；TbpA和/或TbpB[WO97/13785和WO97/32980(PMC)]；CopB[HelminenME，等.(1993)Infect.Immun.61：2003-2010]；UspA1和/或UspA2[WO93/03761(UniversityofTexas)]；OmpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ(PCT/EP99/03823)；OMP85(PCT/EP00/01468)；lipo06(GB 9917977.2)；lipo10(GB 9918208.1)；lipo11(GB 9918302.2)；lipo18(GB 9918038.2)；P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；OmplA1(PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)和OmpE。可以包含在组合疫苗中的不能确定型别的流感嗜血菌的抗原实例(尤其用来预防中耳炎)包括：丝束蛋白[(US5766608-Ohio State ResearchFoundation)]和包含来该蛋白的肽的融合体[例如LB1(f)肽融合体；US5843464(OSU)或WO99/64067]；OMP26[WO97/01638(Cortecs)]；P6[EP281673(State University of NeWYork)]；TbpA和/或TbpB；Hia；Hsf；Hin47；Hif；Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(WO94/12641)；蛋白D(EP594610)；P2；和P5(WO94/26304)。

其它组合是肺炎球菌PS和本发明蛋白与病毒抗原的组合，所述病毒抗原例如来自流感病毒(减毒型，解体型(split)或其亚单位)[例如，表面糖蛋白神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)。参见，例如ChaloupkaI.等.，Eur.Jounal.lin.Microbiol.Infect.Dis.1996，15：121-127]，RSV(例如F和G抗原或F/G融合体，参见例如，SchmidtA.C.等，J.Virol，May 2001，p4594-4603)，PIV3(例如，HN和F蛋白，参见Schmidt等.同上)，水痘病毒(Varicella)(例如减毒型，糖蛋白I-V，等)，和MMR(麻疹病毒，腮腺炎病毒，风疹病毒)的任何(或全部)成分。

疫苗

本发明的一个进一步的实施方案为包括通过本发明方法获得的溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素或肺炎球菌溶血素-细菌荚膜多糖缀合物以及药物可接受赋形剂和任选的佐剂。

本发明的疫苗可包括本发明上述的免疫原性组合物以及药物可接受赋形剂。

本发明的疫苗能够产生对肺炎链球菌感染和/或中耳炎的保护性免疫应答。

本发明进一步的实施方案包括通过取由本发明方法制得的溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素与药物可接受赋形剂以及更进一步的任意上述一个或多个抗原配制成疫苗而制备疫苗的方法。

本发明更进一步的实施方案包括细菌感染，优选肺炎链球菌感染或中耳炎的治疗或预防方法，包括本发明的疫苗或免疫原性组合物的给药。

本发明更进一步的实施方案为通过本发明的方法获得的溶细胞素，优选肺炎球菌溶血素和/或肺炎球菌溶血素-细菌荚膜多糖缀合物在制备用于治疗或预防细菌感染，优选肺炎链球菌感染或中耳炎的疫苗的用途。

本发明的疫苗优选是含有佐剂的。适当的佐剂包括铝盐如氢氧化铝胶(明矾)或磷酸铝，但也可以是钙盐、镁盐、铁盐或锌盐，或可以是不溶性的酰化酪氨酸悬浮物，或酰化的糖、多糖的阳离子或阴离子衍生物或聚磷腈。

优选所述佐剂是TH1型应答的优先诱导剂。该高水平的Th1型细胞因子针对给定抗原更倾向于诱导细胞介导的免疫应答，而高水平的Th2型细胞因子倾向于诱导针对该抗原的体液免疫应答。

重要的是记住Th1型和Th2型免疫应答之间的不同并不是绝对的。实际上，个体的免疫应答可以以Th1为主，或以Th2为主。但通常为方便起见以Mosmann和Coffman针对鼠CD4+T细胞克隆的描述来判断细胞因子家族(Mosmann，T.R.and Coffman，R.L(1989)Th1 and TH2cells：different patterns of iymphocine secretion lead todifferent functional properties.Annual Review of Immunology，7，p145-173)。通常，Th1型应答与T淋巴细胞产生INF-γ和IL-2细胞因子有关。一般情况下直接同Th1型免疫应答的诱导有关的其它细胞因子不是由T细胞产生的，如IL-12。相反，Th2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有关。促进显著的Th1应答的适当佐剂***包括：单磷脂酰脂质A或其衍生物，特别是3-脱氧酰化单磷脂酰脂质A(3D-MPL)(其制备参见GB 2220211A)；以及单磷脂酰脂质A，优选3-脱氧酰化单磷脂酰脂质A，与铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)的组合，或者与水包油乳剂组合。在所述组合中，抗原和3D-MPL共同包含在同一微粒结构中，使抗原信号和免疫刺激性信号的传输更为有效。研究显示，3D-MPL能进一步提高吸附了明矾的抗原的免疫原性[Thoelen等.Vaccine(1998)16：708-14；EP689454-B1]。

一个提高***涉及单磷脂酰脂质A与皂苷衍生物的组合，尤其是QS21和3D-MPL的组合，其公开于WO94/00153，或者涉及一种低反应性的组合物，其中QS21用胆固醇淬灭，见WO96/33739。

一种特别强效的佐剂制品涉及在水包油乳剂中含有QS21，3D-MPL和生育酚，描述于WO95/17210，该种制剂是优选的制剂。

优选疫苗还包含皂苷，更优选QS21。所述制剂还可包含水包油乳剂和生育酚(WO95/17210)。

本发明还提供一种制备疫苗制剂的方法，该方法包含将本发明的溶细胞素与可药用赋形剂，如3D-MPL混合。

包含非甲基化CpG的寡核苷酸(WO96/02555)也是TH1应答的优先诱导剂，适合用于本发明。

本发明另一方面提供了如本文所述的用于医学的免疫原或疫苗。在一个实施方案中，本发明提供了一种预防或缓解老年人(+55岁)肺炎的方法，该方法包含对所述老年患者给药安全和有效量的本发明疫苗，以及任选的Th1佐剂。

在另一实施方案中，本发明提供了一种预防或缓解婴儿(最大至24个月)或幼儿(通常是24个月到5岁)的中耳炎的方法，其包含对所述婴儿或幼儿给药安全和有效量的疫苗，所述疫苗包含溶细胞素，优选本发明的肺炎球菌溶血素，以及更进一步的上述任意一种或多种抗原和任选的Th1佐剂。

本发明的疫苗制品可通过全身或粘膜途径给药来保护或治疗易受感染的哺乳动物(优选人受试者)。这些给药方式包括肌肉内注射、腹膜内注射、皮内或皮下途径；或通过粘膜给药到口腔/消化道，呼吸道，生殖道。用于治疗肺炎或中耳炎的疫苗的鼻内给药是优选的(因为可以更有效预防鼻咽部携带肺炎球菌，因此在最早期便可减轻感染)。尽管本发明的疫苗可以单剂给药，但其成分也可同时联合给药，或在不同时间联合给药(例如，为了使免疫应答之间能更好地协调，肺炎球菌多糖抗原可以在疫苗的细菌蛋白成分给药的同时或1-2周后分别给药)。除了单一给药途径以外，还可以应用2条不同的给药途径。例如，任何病毒抗原都可以通过皮内给药(ID)，而细菌蛋白可通过肌肉内给药(IM)或鼻内给药(IN)。多糖可以肌肉内给药(或皮内给药)，细菌蛋白可以鼻内给药(或皮内给药)。另外，本发明的疫苗可以肌肉内给药进行初次免疫，鼻内给药进行加强免疫。

每剂典型疫苗中缀合的抗原的量应能诱导出免疫保护性应答，而没有明显的副作用。该量将根据所使用的特异性免疫原和给药途径的不同而变化。疫苗中蛋白抗原的含量通常在1-100μg的范围内，优选5-50μg，通常最优选5-25μg。如果包括多糖，通常，每剂应包含多糖0.1-100μg，优选0.1-50g，优选0.1-10μg，最优选1-5μg。

对具体的疫苗来说，各成分的最佳量可通过标准研究确定，所述研究涉及观察受试者的相应免疫应答。第一次接种后，以充足的时间间隔对受试者进行一次或多次的加强免疫。通常，疫苗包括抗原(蛋白质)、佐剂和赋形剂或药学可接受载体。

疫苗制品通常描述于Vaccine Design(“The subunit and adjuvantapproach”(eds PowellM.F.&Newman M.J.)(1995)Pleun Press NewYork)。Fullerton，美国专利4235877描述了用脂质体进行胶囊化。

尽管本发明的疫苗可通过任何途径给药，但所描述的疫苗进行皮内(ID)给药构成了本发明的一个实施方案。人皮肤包含外部“角质”表皮层，称为角质层，它覆盖了表皮。此表皮下是真皮层，真皮层覆盖了皮下组织。研究者发现皮内注射疫苗，特别是真皮内注射疫苗可刺激免疫应答，还伴随其他多种优点。此处所述的皮内接种疫苗构成了本发明的一个优选特征。

皮内注射的常规技术“芒图试验(mantouxprocedure)”包括以下步骤：清洁皮肤，展开一只手，然后使小号针头(26-31号)的斜面朝上，以10-15度的角度将针***。一旦针的斜面***后，针筒下降，进一步推进的同时略施压力使其在皮下抬起。然后将液体非常缓慢地注入，在皮肤表面形成包或***，然后缓慢将针退出。

近来，皮内或穿皮给与液体制剂的特定装置已被公开，例如：该装置公开于WO99/34850和EP1092444，喷射注射装置公开于WO01/13977、US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5,993,412、US5,649,912、US5,569,189、US5,704,911、US5,383,851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520,639、US4,596,556、US4,790,824、US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705和WO97/13537。该疫苗制剂的真皮内给药替代方法包括常规注射器和针，或固体疫苗的弹道式给药装置(WO99/27961)，或经皮贴剂(WO97/48440；WO98/28037)；或皮肤表面给药(经皮给药WO98/20734；WO98/28037)。

当本发明的疫苗是给至皮肤时，更具体地说是真皮时，给与小量液体疫苗，具体约为0.05ml和0.2ml之间。

本发明皮肤或皮内疫苗中抗原含量可以类似于肌肉内疫苗常规的剂量。因此，皮内疫苗中蛋白质抗原在1-100μg，优选5-50μg范围内。同样地，每剂疫苗中多糖缀合物抗原的量通常预期包含多糖0.1-100μg，优选0.1-50μg，优选0.1-10μg，且可能在1和5μg之间。但所述皮肤或皮内疫苗为“小剂量”制剂。因此在此“小剂量”疫苗中每剂含有的蛋白抗原量优选为0.1-10μg，优选每剂含有蛋白抗原0.1-5μg；且每剂含有的多糖缀合物抗原的量为0.01-1μg，优选0.01-0.5μg。

此处所用的术语“皮内给药”是指将疫苗给至皮肤的真皮区域。但疫苗不一定仅存在于真皮内。真皮层是距离人体皮肤表面约1.0mm和约2.0mm之间的皮肤层，但个体之间和同一个体的不同部位之间存在差异。一般地，预计距离皮肤表面1.5mm的深度达到真皮层。真皮上面为角质层和表皮，下面为皮下层。根据给药模式的不同，可以使该疫苗最终仅存在于或主要存在于真皮内，或最终分布于表皮和真皮。

本发明的免疫原性组合物和疫苗可在各种动物模型中或用人血清评估。举例说明，下列动物模型可用于评估肺炎球菌感染。C3H/HeJ鼠(6至8星期大小)可用添加50μl CFA佐剂的15μg s.c.蛋白免疫，2-4星期后注射IFA为佐剂的15μg蛋白。为了验证对全身感染的被动和主动保护，8-10星期时，小鼠在通过用15至90LD50肺炎球菌腹膜内注射攻击前可用免疫血清或蛋白质经腹膜给药。另外，蛋白质可在小鼠鼻咽集群化模型(Wu等Microbial Pathogenesis 1997；23：127-137)中检验。

除了小鼠，幼鼠是易感的而集群化且通过肺炎链球菌感染。在被动保护物的研究中，2-5天大小的幼鼠崽中小鼠免疫血清的给药(100μl i.p.或10μl i.n.)可在肺炎链球菌(10μl)鼻内给药攻击前完成。集群化可通过接种鼻腔的洗涤(20-40μl滴注，10μl撤消)而测定。

该联合疫苗的蛋白质组分间(或蛋白质和多糖)有益的相互作用可通过给药以单价疫苗中为次-保护性的该疫苗中每种蛋白(或蛋白质和多糖)的剂量而证实。该联合疫苗相对于单价疫苗增强的保护效力归因于组分间有益的相互作用。

本发明在下列实施例中举例说明。实施例使用标准技术进行，除非另外详细描述，其为本领域技术人员所熟知且是常规的。实施例意在例举说明，并非限制本发明。

实施例

实施例1

肺炎球菌溶血素的纯化大肠杆菌培养物通过提高温度至39.5℃的18小时诱导后，大肠杆菌在17,000g离心1小时而沉淀。沉淀物重悬于25mM pH9.0的二乙醇胺中且在Rannie装置中以500PSI一次完成以机械方法破碎大肠杆菌。1％月桂酰基肌氨酸钠(SLS)加入破碎的大肠杆菌中且混合物在室温下孵育1小时，随后30,000g离心20分钟以使细胞碎片沉淀。上清液稀释2.5倍至包含1M NaCl和1％SLS的pH7.0的20mM磷酸盐中，随后上样于以同样的缓冲液(包含1MNaCl和1％SLS的pH7.0的20mM磷酸盐＝平衡缓冲液)平衡的苯基-琼脂糖凝胶HP柱。柱用4倍柱体积的平衡缓冲液洗涤，随后用2倍柱体积的包含0.5MNaCl和1％SLS的pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液洗涤。肺炎球菌溶血素通过应用低盐缓冲液而从柱上洗脱，缓冲液包含含有1％SLSpH7.0的20mM磷酸盐缓冲液。包含肺炎球菌溶血素的组分利用SDS-PAGE分析鉴定而收集，且缓冲液利用渗滤交换为pH9.0的25mM二乙醇胺。

肺炎球菌溶血素通过添加固体盐酸胍至6M终浓度变性而溶解且孵育一小时。其随后经包含1mM DTTpH9.0含有8M尿素的25mM二乙醇胺透滤。肺炎球菌溶血素通过包含1mM DTT的pH9.0地20mM硼酸盐透滤而重新折叠。复性后，DTT通过pH9.0的20mM硼酸盐缓冲液透滤除去。

所达到的肺炎球菌溶血素纯度通过上样SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析。分离胶通过利用抗大肠杆菌的抗体蛋白质印迹法分析以检测在纯化的肺炎球菌溶血素制备物中残留的大肠杆菌蛋白质水平。利用活体外溶血试验评定纯化的肺炎球菌溶血素的生物活性。

结果

如图1所示，上述方法能在单个层析步骤后达到肺炎球菌溶血素的高效纯化。平皿A中考马斯蓝染色的凝胶表明用不添加氯化钠的低盐缓冲液洗脱柱能从柱上以非常纯的形式洗脱对应于肺炎球菌溶血素的53kD条带。约45kD的非常弱的条带也认为是肺炎球菌溶血素，因为此第二个条带结合抗-肺炎球菌溶血素的抗体(结果没有显示)且也不能结合抗大肠杆菌的抗体(如平皿B所示)。平皿B的蛋白质印迹为检测残留在纯化的肺炎球菌溶血素中的任何污染蛋白质的高灵敏度方法。该方法能检测以低于考马斯染色探测水平存在的极少的污染物。肺炎球菌溶血素因此纯化至98-100％的纯度。

经典型试验测定的该纯化方法的产量约每升发酵液1900mg肺炎球菌溶血素，也是良好的。来自发酵培养物约10％的蛋白质作为纯化的肺炎球菌溶血素回收。

溶血试验中肺炎球菌溶血素的活性在肺炎球菌溶血素用盐酸胍/尿素处理以及通过变性剂的去除重新折叠后评定。在纯化的肺炎球菌溶血素降至表明溶血活性已经重建的浓度1.3ng/ml的稀释液中检测到溶血活性。此相当于野生-型肺炎球菌溶血素的每毫克500,000和1,000,000溶血单位之间。

实施例2-肺炎球菌溶血素利用GMBS的解毒

纯化的肺炎球菌溶血素通过利用NHS酯-马来酰亚胺交联剂GMBS(N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)对巯基和伯胺基的修饰而解毒。0.5mg/ml浓度的肺炎球菌溶血素经50mM pH7.0的磷酸盐缓冲液透析。GMBS最初溶于DMSO中且以GMBS248-倍的摩尔过量加入肺炎球菌溶血素。处理在室温下延续一小时。过量的GMBS和副产品通过pH6.8的100mM磷酸钠透析除去。更进一步地，马来酰亚胺基团通过与0.6mg/ml半胱氨酸在室温下反应两个小时而淬灭。为了除去过量的半胱氨酸，样品经pH7.15的2mM磷酸钠透析。

实施例3-解毒肺炎球菌溶血素的鉴定

溶血活性

溶血试验用于评定解毒的肺炎球菌溶血素的残留毒性。连续2-倍稀释的肺炎球菌溶血素与绵羊红细胞孵育。离心后，上清液转移到免疫平板且利用405nm处的光密度读数测定释放的血红蛋白。结果表示为ng/ml肺炎球菌溶血素，相当于OD曲线的中点。在37℃孵育解毒的肺炎球菌溶血素7天后重复试验以监测解毒的可逆性。

如表1所示，用GMBS的处理能基本上降低PLY的溶血活性至实现溶血活性3,000倍的降低。在该实验中，GMBS/赖氨酸的更高摩尔比能以4/1和5/1的最佳比率实现溶血活性更好的去除。该处理估计导致了约14个赖氨酸残基的修饰。较少的赖氨酸残基被修饰，则溶血活性的降低就较差。

ELISA

通过ELISA评定解毒的肺炎球菌溶血素的抗原性。ELISA平板用豚鼠抗-肺炎球菌溶血素的抗体包被。包含肺炎球菌溶血素稀释物的样品在平板中于室温下孵育1小时。洗涤后，利用缀合至辣根过氧化酶的抗肺炎球菌溶血素的兔多克隆抗体检测结合的肺炎球菌溶血素。洗涤平板后，利用酶底物反应来评定结合至每个孔的肺炎球菌溶血素量。

如表1所示，就如通过ELISA评定的，用GMBS处理导致一些抗原性的损失。然而可达到给定的未经处理PLY的约66％的ELISA读数表明许多抗体仍然可以识别修饰过的肺炎球菌溶血素。

SDS-PAGE-分析

解毒的肺炎球菌溶血素蛋白质上样于SDS-PAGE(Novex4-20％聚丙烯酰胺凝胶Invitrogen)且用考马斯亮蓝显示该蛋白质。如图2所示，用GMBS的处理导致PLY分子量从53kD到约56kDa的轻微提高。该提高归因于多个氨基酸残基用GMBS的修饰。从约110kD和170kD分子量的微弱条带的出现看来，小比例的PLY变为多聚体形式，然而，大多数PLY维持基本上单体的形式。在37℃孵育PLY7天并没有引起SDS-PAGE上PLY出现的任何实质性改变表明修饰的PLY不受降解作用或随后的共价-连接的多聚体形成的影响。

表1：通过GMBS的PLY解毒试验

除了最后一个试验以3mg处理(PLY为0.68mg/ml)，试验以1mg PLY(1mg/ml)完成。

实施例4解毒的肺类球菌溶血素在大鼠中的反应原性评估

三个OFA大鼠组通过用盐、佐剂QS21(US5,057,540)、肺炎球菌溶血素、添加佐剂的肺炎球菌溶血素、甲醛解毒的肺炎球菌溶血素、添加佐剂的甲醛解毒的肺炎球菌溶血素、GMBS解毒的肺炎球菌溶血素、添加佐剂的GMBS解毒的肺炎球菌溶血素、NHS-醋酸盐解毒的肺炎球菌溶血素或添加佐剂的NHS-醋酸盐解毒的肺炎球菌溶血素肌肉注射(胫骨肌)接种而免疫一次。免疫后三天，处死所有大鼠且制备胫骨肌用于组织学检查。胫骨肌在***中固定且切成2mm的薄切片，其经脱水和石蜡包埋。在显微镜下检查前切成7μm的切片且用Trichrome Masson方法染色。

用四个标准评估反应原性；退化/坏死，肌内膜炎症，出血和腱膜炎症。基于每个组织学标准，每个组的每个肌肉划分等级，随后计算每个组的平均病变等级。等级0＝正常的，1＝极微的，2＝轻微的，3＝中度的，4＝显著的和5＝严重的。

结果

检查切片的组织结构。表2显示退化/坏死，肌内膜炎症，出血和腱膜炎症的平均等级。

表2

接种	退化/坏死	肌内膜炎症	出血	腱膜炎症
NaCl	0	0.5	0	0
					Ply	3.6	3.8	3.0	1.4
GMBS-Ply	0.6	1.3	1.3	0.4
					佐剂	2.9	3.9	2.8	2.8
Ply+佐剂	4.2	3.9	4.6	1.8
					GMBS-Ply+佐剂	2.9	3.9	3.8	1.6

未加佐剂的天然的和解毒的肺炎球菌溶血素的组织学等级比较表明GMBS是用于肺炎球菌溶血素解毒的特别有效的交联剂，其使得退化/坏死、肌内膜炎症、出血和腱膜炎症大量减少。

佐剂至接种物的添加(50μg磷酸铝和5μg MPL)作为刺激免疫***的旁效应而提高了反应原性值。肺炎球菌溶血素用GMBS的解毒使得退化/坏死降低至单独通过佐剂达到的水平，其比通过用天然的肺炎球菌溶血素接种达到水平要低。GMBS解毒的肺炎球菌溶血素达到的出血水平比通过天然的肺炎球菌溶血素达到的要低。肌内膜炎症的水平通过佐剂提高且该水平在添加佐剂的天然的或GMBS解毒的肺炎球菌溶血素存在时仍然存在。随着腱膜炎症水平在肺炎球菌溶血素用GMBS处理后的轻微降低，腱膜炎症通过天然的或GMBS解毒的肺炎球菌溶血素从单独由佐剂产生的水平开始降低。

实施例5-小鼠中GMBS处理的肺炎球菌溶血素的毒性评估

20个OF1小鼠组用天然的肺炎球菌溶血素或GMBS-处理的肺炎球菌溶血素经鼻攻击且小鼠监测随后的9天。

如图3所示，在那组中所有的小鼠用2μg天然的肺炎球菌溶血素攻击导致迅速死亡。肺炎球菌溶血素引起的病变遍及呼吸***，其导致呼吸困难和死亡。相反，GMBS处理的肺炎球菌溶血素对用2μg、5μg或10μg GMBS处理的肺炎球菌溶血素灌输攻击而存活的所有小鼠具有实质上降低的毒性。

实施例6-利用解毒的肺类球菌溶血素的保护研究

20个OF1小鼠组在0天、14天和28天用5μg肺炎球菌溶血素和50μg磷酸铝以及5μgMPL作为佐剂肌内注射免疫3次。对照小鼠用佐剂单独免疫。肺炎球菌溶血素为未经处理的或利用上述GMBS处理解毒的。

在第42天，小鼠给予2μg天然肺炎球菌溶血素经鼻的、致死的攻击。随后的9天监测存活的小鼠。

结果

该致死的攻击模式在对照小鼠中导致90％死亡(图4)。用GMBS解毒的肺炎球菌溶血素免疫产生很好的保护作用，在随后的9天中只有5％小鼠死亡。这与用天然的肺炎球菌溶血素接种后10％小鼠死亡的保护作用相当。

实施例7解毒的肺炎球菌溶血素联合PhtD在小鼠致死攻击模型中的

评估

20个OF1小鼠组用a)单独的佐剂或b)1μg PhtD和佐剂或c)1μg PhtD和5μg GMBS解毒的肺炎球菌溶血素和佐剂肌内注射而免疫。所用的佐剂由50μg磷酸铝和5μgMPL组成，且在第0天和第14天进行免疫。小鼠用经鼻的血清型2肺炎链球菌株D39的5.105CFU致死剂量攻击且在随后的10天监测存活率。

结果

如图5所示，用菌种D39的攻击在对照小鼠中10天后导致75％致死。单独用PhtD的免疫没能提供显著的保护作用，在该组中10天后70％小鼠死亡(p＝0.29)。用PhtD和GMBS解毒的肺炎球菌溶血素一起免疫产生明显更好的保护作用，致死率降至50％(p＝0.04)。

实施例8肺炎球菌溶血素用甲醛的解毒

pH7.025mM磷酸钾缓冲液中浓度约0.4mg/ml的纯化的肺炎球菌溶血素母液用50m ML-赖氨酸和0.1％甲醛(w/v)在40℃处理21天。

Claims (27)

1.一种用于细菌溶细胞素纯化的方法，所述方法包括以下步骤：

a)培养表达细菌溶细胞素的细胞的培养物；

b)从包含细菌溶细胞素的培养物中制备提取物；

c)在0.6-2M高盐条件下在pH6-8下存在0.1-5％(w/v)脂肪族去污剂时将包含于提取物中的可溶性凝集的细菌溶细胞素结合至苯基-琼脂糖凝胶疏水作用层析材料；

d)在0-0.2M低盐条件下在pH6-8下存在0.1-5％(w/v)脂肪族去污剂时洗脱细菌溶细胞素；

e)从细菌溶细胞素中除去去污剂；

f)通过添加含有盐酸胍的变性剂溶解细菌溶细胞素；

g)从细菌溶细胞素中除去变性剂。

2.权利要求1的方法，其中细菌溶细胞素为肺炎球菌溶血素。

3.权利要求1或2的方法，其中步骤b)包括用机械方法破碎细胞。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中步骤b)包括用去污剂处理。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中同样的去污剂存在于步骤c)和d)中。

6.权利要求4的方法，其中同样的去污剂存在于步骤b)、c)和d)中。

7.前述权利要求任一项的方法，其中步骤b)包括将破裂的细胞物质离心和收集上清液作为步骤c)的提取物。

8.前述权利要求任一项的方法，其中去污剂为月桂酰基肌氨酸钠。

9.前述权利要求任一项的方法，其中用于步骤c)和/或d)的溶液包括选自氯化钠、氯化镁、氯化铵、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵、磷酸钠、磷酸镁、磷酸铵的盐。

10.前述权利要求任一项的方法，其中用于步骤c)和/或步骤d)的条件为约pH7。

11.前述权利要求任一项的方法，其中步骤d)所用条件包括0-0.1M的盐。

12.权利要求11的方法，其中步骤d)所用条件包括0-40mM的盐。

13.前述权利要求任一项的方法，其中步骤e)包括通过渗滤或透析去除去污剂。

14.权利要求13的方法，其中渗滤/透析用pH8-10，优选约pH9的低盐缓冲液进行。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中步骤f)包括通过变性剂的添加来将细菌溶细胞素变性以及步骤g)包括通过逐步除去该变性剂而重新折叠细菌溶细胞素。

16.权利要求1的方法，其中使用5-8M的盐酸胍作为步骤f)中的变性剂。

17.权利要求16的方法，其中在步骤f)中细菌溶细胞素与5-9M尿素接触。

18.权利要求17的方法，其中步骤f)包括细菌溶细胞素与5-8M盐酸胍的接触，随后将盐酸胍替换为5-9M的尿素。

19.权利要求16-18中任一项的方法，其中在步骤f)和g)的至少部分期间存在还原剂。

20.权利要求19的方法，其中还原剂为0.1-10mM的DTT，优选约1mM的DTT。

21.权利要求1-20中任一项的方法，其中步骤g)包括通过渗滤或透析去除变性剂。

22.权利要求21的方法，其中渗滤或透析用pH7-9的溶液进行。

23.前述权利要求任一项的方法，所述方法还包括通过用交联剂进行化学处理来解毒细菌溶细胞素的步骤。

24.权利要求23的方法，其中化学处理包括使用能够与胺和巯基基团反应的交联剂。

25.权利要求23的方法，其中交联剂包括一种或多种选自甲醛、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯和GMBS的化学试剂。

26.前述权利要求任一项的方法，所述方法还包括将细菌溶细胞素缀合至细菌荚膜多糖的步骤。

27.前述权利要求任一项的方法，所述方法还包括将细菌溶细胞素与药学可接受赋形剂配成疫苗组合物的步骤。