NO336672B1 - Prosess for rensing av et bakterielt cytolysin - Google Patents
Prosess for rensing av et bakterielt cytolysinInfo
- Publication number
- NO336672B1 NO336672B1 NO20054134A NO20054134A NO336672B1 NO 336672 B1 NO336672 B1 NO 336672B1 NO 20054134 A NO20054134 A NO 20054134A NO 20054134 A NO20054134 A NO 20054134A NO 336672 B1 NO336672 B1 NO 336672B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- process according
- pneumolysin
- cytolysin
- bacterial
- bacterial cytolysin
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 116
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 title claims description 80
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 title claims description 80
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 64
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 41
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 16
- 101710183389 Pneumolysin Proteins 0.000 claims description 197
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 57
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 55
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 46
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 43
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 35
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 35
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 33
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 30
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 30
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 26
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 17
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 17
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 15
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 13
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 claims description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 11
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 9
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 8
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 7
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 claims description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 7
- 101710164918 Choline-binding protein Proteins 0.000 claims description 6
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical group C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 claims description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 claims description 3
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 claims description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- 229940071089 sarcosinate Drugs 0.000 claims description 3
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 claims description 2
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 claims description 2
- GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H magnesium phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O GVALZJMUIHGIMD-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 2
- 239000004137 magnesium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 229960002261 magnesium phosphate Drugs 0.000 claims description 2
- 229910000157 magnesium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000010994 magnesium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 2
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 51
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 51
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 43
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 43
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 43
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 28
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 24
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 23
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 23
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 16
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 16
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 16
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 16
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 15
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 14
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 12
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 12
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 11
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 10
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 8
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 8
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 8
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 150000003141 primary amines Chemical group 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 8
- -1 Sulfo-LC-SMPT Chemical compound 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 6
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 5
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 108091016312 choline binding proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 5
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 4
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 4
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 4
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 4
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 4
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 3
- 238000011795 OF1 mouse Methods 0.000 description 3
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 3
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 108010021711 pertactin Proteins 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 101100420868 Anuroctonus phaiodactylus phtx gene Proteins 0.000 description 2
- 108010093201 Arcanobacterium pyogenes Pyolysin Proteins 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 2
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 2
- 241000186581 Clostridium novyi Species 0.000 description 2
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 2
- 241000193466 Clostridium septicum Species 0.000 description 2
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 2
- 241000193159 Hathewaya histolytica Species 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710158696 Ivanolysin Proteins 0.000 description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 2
- 108700027766 Listeria monocytogenes hlyA Proteins 0.000 description 2
- 241000760056 Lithoglyptes ivanovi Species 0.000 description 2
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000178961 Paenibacillus alvei Species 0.000 description 2
- 241000193465 Paeniclostridium sordellii Species 0.000 description 2
- 241000193157 Paraclostridium bifermentans Species 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 2
- 241000191980 Staphylococcus intermedius Species 0.000 description 2
- 241000264435 Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis Species 0.000 description 2
- 108700004513 Streptococcus intermedius intermedilysin Proteins 0.000 description 2
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 description 2
- 108010011834 Streptolysins Proteins 0.000 description 2
- 108010031133 Transferrin-Binding Protein A Proteins 0.000 description 2
- 241000186064 Trueperella pyogenes Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010012597 alveolysin Proteins 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 108010060552 cereolysin Proteins 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 2
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical group OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- ZUFONQSOSYEWCN-UHFFFAOYSA-M sodium;2-(methylamino)acetate Chemical compound [Na+].CNCC([O-])=O ZUFONQSOSYEWCN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 108010028874 suilysin Proteins 0.000 description 2
- 108010052441 tetanolysin Proteins 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 2
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 2
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 2
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 2
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 2
- TYKASZBHFXBROF-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)acetate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CN1C(=O)C=CC1=O TYKASZBHFXBROF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKHVDAUOODACDU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCN1C(=O)C=CC1=O JKHVDAUOODACDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoate Chemical compound C1=CC(NC(=O)CI)=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[1-(pyridin-2-yldisulfanyl)ethyl]benzoate Chemical compound C=1C=C(C(=O)ON2C(CCC2=O)=O)C=CC=1C(C)SSC1=CC=CC=N1 GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(C=C1)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLARLSIGSPVYHX-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O VLARLSIGSPVYHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCMOHMXWOOBVMZ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)propanoylamino]hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCN1C(=O)C=CC1=O WCMOHMXWOOBVMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QYEAAMBIUQLHFQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoylamino]hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 QYEAAMBIUQLHFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHVODYOQUSEYJJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]amino]hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)C(CC1)CCC1CN1C(=O)C=CC1=O IHVODYOQUSEYJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIYPCWKHSODVAP-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 DIYPCWKHSODVAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CULQNACJHGHAER-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1=CC=C(NC(=O)CI)C=C1 CULQNACJHGHAER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MDUQWFYJHRLNRN-UHFFFAOYSA-N 1-acetyloxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound CC(=O)ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O MDUQWFYJHRLNRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASNTZYQMIUCEBV-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-[6-[3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoylamino]hexanoyloxy]pyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 ASNTZYQMIUCEBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJNWCIAPVGRBHO-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethyl-dimethyl-[(oxo-$l^{5}-phosphanylidyne)methyl]azanium Chemical group OCC[N+](C)(C)C#P=O NJNWCIAPVGRBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DKIDEFUBRARXTE-UHFFFAOYSA-N 3-mercaptopropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCS DKIDEFUBRARXTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710105077 Agglutinin-1 Proteins 0.000 description 1
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 101100453077 Botryococcus braunii HDR gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033620 Calponin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 101150036540 Copb1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101710110818 Dermonecrotic toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 101000874355 Escherichia coli (strain K12) Outer membrane protein assembly factor BamA Proteins 0.000 description 1
- 241000495778 Escherichia faecalis Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 101100406392 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) omp26 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000873843 Homo sapiens Sorting and assembly machinery component 50 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- 241000186807 Listeria seeligeri Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241000588621 Moraxella Species 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241001212279 Neisseriales Species 0.000 description 1
- 238000011672 OFA rat Methods 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 101710099976 Photosystem I P700 chlorophyll a apoprotein A1 Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102100035181 Plastin-1 Human genes 0.000 description 1
- 208000035109 Pneumococcal Infections Diseases 0.000 description 1
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 description 1
- 108700031620 S-acetylthiorphan Proteins 0.000 description 1
- 101000832034 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Inactive diphosphatase DCS2 Proteins 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 241000702208 Shigella phage SfX Species 0.000 description 1
- 102100035853 Sorting and assembly machinery component 50 homolog Human genes 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- 241000194007 Streptococcus canis Species 0.000 description 1
- 241000130810 Streptococcus pneumoniae D39 Species 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108010031127 Transferrin-Binding Protein B Proteins 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N [2-[3-[6-[3-[(5R,6aS,6bR,12aR)-10-[6-[2-[2-[4,5-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]ethoxy]ethyl]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carbonyl]peroxypropyl]-5-[[5-[8-[3,5-dihydroxy-4-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]octoxy]-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]propoxymethyl]-5-hydroxy-3-[(6S)-6-hydroxy-2,6-dimethylocta-2,7-dienoyl]oxy-6-methyloxan-4-yl] (2E,6S)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methylocta-2,7-dienoate Chemical compound C=C[C@@](C)(O)CCC=C(C)C(=O)OC1C(OC(=O)C(\CO)=C\CC[C@](C)(O)C=C)C(O)C(C)OC1COCCCC1C(O)C(O)C(OCC2C(C(O)C(OCCCCCCCCC3C(C(OC4C(C(O)C(O)CO4)O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)C(CCCOOC(=O)C23C(CC(C)(C)CC2)C=2[C@@]([C@]4(C)CCC5C(C)(C)C(OC6C(C(O)C(O)C(CCOCCC7C(C(O)C(O)CO7)OC7C(C(O)C(O)CO7)O)O6)O)CC[C@]5(C)C4CC=2)(C)C[C@H]3O)O1 FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 201000007930 alcohol dependence Diseases 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005422 blasting Methods 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700039582 histidine triad Proteins 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 108010049148 plastin Proteins 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229960001973 pneumococcal vaccines Drugs 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 description 1
- MKNJJMHQBYVHRS-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[11-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)undecanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCCCCCCN1C(=O)C=CC1=O MKNJJMHQBYVHRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ULARYIUTHAWJMU-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O ULARYIUTHAWJMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- MIDXXTLMKGZDPV-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[6-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCN1C(=O)C=CC1=O MIDXXTLMKGZDPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 108010075210 streptolysin O Proteins 0.000 description 1
- 229910052567 struvite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 125000002653 sulfanylmethyl group Chemical group [H]SC([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical class [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
- C07K14/3156—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci from Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Teknisk område.
Foreliggende oppfinnelse vedrører området bakterielt cytolysin-rensing og særlig en fremgangsmåte for rensing av et bakterielt cytolysin. Pneumolysin er et protein fra Streptococcus pneumoniae med gode antigen-egenskaper som er en egnet vaksinebestanddel mot S. pneumoniae-\ rfieks\ on eller otitis media. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen beskriver et uvanlig og fordelaktig trinn med rensing av cytolysin i ett enkelt kromatografi-trinn, ved å binde det til en hydrofob interaksjonskolonne i nærvær av et vaskemiddel og høyt saltinnhold. Prosessen gjør fordelaktig bruk av den egenskapen at bakterielle cytolysiner har høy affinitet til aromatiske forbindelser som ligner kolesterol, særlig når de er i en aggregert tilstand, og vil dermed generelt være anvendelig for rensing av medlemmer av denne familien av toksiner.
Tiol-aktiverte cytolysiner danner en fremtredende gruppe av bakterielle toksiner, av hvilke steptolysin 0 er prototypen (Billington et al FEMS Microbiol. Lett. (2000), 182; 197-205). Disse toksinene er lytiske overfor eukaryote celler ved dannelsen av porer i cellemembranen. Oksyderende midler påvirker på ugunstig måte deres cytolyse-aktivitet, mens reduksjonsmidler kan gjenopprette aktivitet. Medlemmer av denne gruppen viser 30-60% likhet når det gjelder primær aminosyresekvens, og inneholder en nesten uforanderlig undecapeptid-sekvens nær C-terminus. Kolesterol er den viktigste målcellereseptoren for disse toksinene. Cytolysiner binder seg til kolesterolholdige membraner og oligomeriseres og danner transmembrane porer opptil 30 nm i diameter og sammensatt av 40-80 monomer-delenheter. Bindingen av membran-kolesterol bevirker en konformasjonell endring av toksin-monomerer som driver de påfølgende hendelsene med oligomerisering, membran-innsettelse og poredannelse.
Streptococcus pneumoniae er det agens som forårsaker flere menneskelige sykdommer, innbefattende pneumoni, bakteriemi, meningitt, otitis media og sinusitt. Noen ganger kan disse sykdommene føre til dødsfall, til tross for at antibiotika er tilgjengelig. Fremveksten av antibiotika-resistente stammer av S. pneumoniae har forverret problemene forårsaket av dette patogenet. I denne sammenhengen er det viktig at effektive vaksiner mot S. pneumoniae blir utviklet.
Flerverdige pneumokokk-vaksiner som inneholder rensede kapsel-polysakkarider har vært tilgjengelig i flere år. Deres anvendelse er begrenset av dårlig immunogenisitet særlig hos høyrisikogrupper, innbefattende spedbarn, eldre og de med sigdcelleanemi, multiple myelomer, cirrhose eller alkoholisme. De gir også serotype-spesifikk beskyttelse og kun 23 av 90 kjente serotyper er dekket av eksisterende formuleringer. Dette vil gi beskyttelse mot 90% av serotypene funnet hos USAs befolkning, men kun mot tilnærmet 70% av serotypene funnet hos asiatisk befolkning. Nylig er en konjugert, sjuverdig vaksine blitt tilgjengelig, som likeledes har problemer med å beskytte mot alle pneumokokk-stammene.
Pneumolysin (Ply) er et 53 kDa thiol-aktivert cytolysin funnet hos alle stammer av S. pneumoniae, som frigjøres ved autolyse og bidrar til patogenesen ved S. pneumoniae. Den er meget konservert, med kun noen få aminosyre-substitusjoner som forekommer mellom Ply-proteinene hos forskjellige serotyper. Pneumolysins høye grad av konservering og dets immunogenisitet gjør det til en potensiell kandidat som vaksinebestanddel. Imidlertid er villtype-Ply uegnet for innlemmelse i vaksiner for anvendelse til mennesker, på grunn av dets toksisitet. Ply forårsaker skade på cellemembraner ved å interagere med membranbundet kolesterol og oligomeriseres og danner porer i membranen. Et konservert cystein-inneholdende motiv funnet nær C-terminus har vært implisert i lyse-aktiviteten. Mutasjoner av Ply er blitt foreslått for å redusere denne toksisiteten (WO 90/06951, WO 99/03884).
En to-trinns fremgangsmåte for rensing av pneumolysin er blitt beskrevet av Lock et al (Microbial Pathogenesis (1996) 21; 71-83). Rekombinant pneumolysin blir renset fra en E. co//-kultur ved anvendelse av en kombinasjon av ionebytte- og gelfiltrerings-kromatografi. Fremgangsmåten innebærer trinnene å fremstille en ekstrakt og føre den ned en DEAE-Sepharose-kolonne, fulgt av en Sephacryl S200-HR-kolonne. Denne fremgangsmåten kan anvendes til å rense rekombinant eller nativt pneumolysin.
Kuo et al beskriver en fremgangsmåte for rensing av rekombinant GST-pneumolysin-fusjonsprotein (Infection and Immunity (1995) 63; 2706-2713). Fusjonsproteinet blir uttrykt i en E. co//'-kultur og et cellelysat blir satt på en glutation-agarosegel. Fusjonsproteinet blir eluert med glutation og thrombin kan anvendes til å spalte fusjonsproteinet. Proteinene ble ført over en glutation-agarosekolonne igjen for å fjerne GST. Det affinitetsrensede pneumolysin ble videre renset ved anvendelse av en hydroksylapatitt-kolonne.
Mitchell et al (BBA (1989) 1007; 67-72) beskriver en fremgangsmåte for rensing av pneumolysin ved anvendelse av hydrofob interaksjons-kromatografi. Under betingelsene som de anvender (250 mM salt) sviktet pneumolysinet med hensyn til å binde seg tett til kolonnen, selv om dets progresjon var retardert og pneumolysinet ble eluert som en bred topp. Ytterligere trinn for å bestemme hvilke fraksjoner som inneholdt rent pneumolysin, konsentrering av de positive fraksjonene, ny påsetting på kolonnen og eluering med et lite volum av vann, var nødvendig for å overvinne problemet med at pneumolysin ikke binder seg tett til kolonnematerialet.
Det gjenstår et fortsatt behov for forbedrede vaksiner mot S. pneumoniae. Innlemmelsen av en Ply-bestanddel gir løfter, selv om toksisiteten til proteinet gjenstår som et problem. Utviklingen av en rask og effektiv prosedyre for masse-rensing av pneumolysin er også nødvendig. Fremgangsmåter beskrevet tidligere innebærer anvendelse av mange rensetrinn, med analyse- og konsentreringstrinn innimellom. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en mer effektiv rensemetode som fordelaktig anvender ett enkelt kromatografitrinn, som kan anvendes til å rense store satser av pneumolysin.
Beskrivelse av figurene.
Figur 1: SDS-PAGE-geler viser rensingen av pneumolysin. Følgende prøver ble kjørt på SDS-PAGE-geler: bane 1: molekylvekt-standarder, bane 2: supernatant av celle-ekstrakt, bane 3: fenyl-sepharose-gjennomstrømning, bane 4: fenyl-sepharose første vask, bane 5: fenyl-sepharose andre vask, bane 6: fenyl-sepharose-vask med 0,5M NaCI, bane 7: fenyl-sepharose-eluering med lav saltbuffer, bane 8: pneumolysin etter denaturering/tilbakefoldingstrinn, bane 9: pneumolysin etter steriliseringsfiltrering.
Panel A viser gelen etter coomassie blå-farging. Panel B viser gelen etter en Western blotting-prosedyre ved anvendelse av anti-E. co//-antistoffer for å probe for forurensende proteiner.
Figur 2: SDS-PAGE-analyse av GMBS- (N-[y-maleimidobutyryloksy)suksin-imidester) modifisert pneumolysin - coomassie blå-farget.
Følgende prøver ble kjørt på en SDS-PAGE-gel: bane 1: molekylvekt-standarder, bane 2: umodifisert pneumolysin, bane 3: PLY behandlet med GMBS i et molforhold mellom GMBS og lysin på 4:1, bane 4: PLY behandlet med GMBS i et molforhold mellom GMBS og lysin på 4:1 og inkubert i 7 dager ved 37°C, bane 5: PLY behandlet med GMBS i et molforhold mellom GMBS og lysin på 8:1, bane 6: PLY behandlet med GMBS i et molforhold mellom GMBS og lysin på 8:1 etter inkubering i 7 dager ved 37°C, bane 7: PLY behandlet med Sulfo-NHS-acetat i et molforhold mellom NHS og lysin på 10:1, bane 8: PLY behandlet med NEM, bane 9: PLY behandlet med NEM etter 7 dagers inkubering ved 37°C. Figur 3: Toksisitet av GMBS-behandlet pneumolysin gitt intranasalt til mus. Linjen markert med romber indikerer overlevelsesrate for mus utfordret med 2 ug nativt pneumolysin. Linjen markert med firkanter indikerer overlevelsesraten for mus utfordret med 10 ug GMBS-behandlet pneumolysin. Figur 4: Beskyttelse bevirket av GMBS-behandlet pneumolysin hos mus utfordret intranasalt med nativt pneumolysin. Linjen markert med rektangler viser overlevelsesrate for mus inokulert med adjuvans alene. Linjen markert med romber indikerer overlevelsesraten for mus inokulert med nativt pneumolysin. Linjen markert med firkanter indikerer overlevelsesrate for mus inokulert med GMBS-behandlet pneumolysin. Figur 5: Beskyttelse bevirket av inokulering med PhtD- og GMBS-behandlet pneumolysin hos mus utfordret intranasalt med type 2 D39-pneumokokk-stamme. Linjen markert med rektangler representerer overlevelsesrate for mus inokulert med adjuvans alene. Linjen markert med romber representerer overlevelsesraten for mus inokulert med PhtD. Linjen markert med firkanter representerer overlevelsesraten for mus inokulert med PhtD og GMBS-behandlet pneumolysin.
Detaljert beskrivelse.
Prosesser.
Prosessen ifølge oppfinnelsen er en fremgangsmåte for rensing av et bakterielt cytolysin, så som pneumolysin. Et cytolysin, for eksempel pneumolysin, blir renset ved anvendelse av kun ett enkelt kolonne-kromatografitrinn, uten behov for ny påsetting på kolonnen. Proteinet er bundet i en aggregert form til en hydrofob interaksjonkolonne i nærvær av vaskemiddel og salt. Få proteiner binder seg til kolonnen under disse betingelsene, og tillater rensing av et cytolysin i ett enkelt trinn.
For formålene ifølge oppfinnelsen er et løselig aggregat av et cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, en aggregert form av cytolysinet som forblir i supernatanten etter sentrifugering ved 30.000 g i 20 minutter. Det løselige aggregatet blir holdt på hydrofobt interaksjons-kromatografimateriale, fortrinnsvis fenyl-Sepharose, i nærvær av et høyt saltinnhold, fortrinnsvis 1M. Eventuelt er det løselige aggregatet kolloidalt.
Cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, er bundet til kolonnen som et løselig aggregat. Det er av forskjellige årsaker uvanlig å påsette aggregater på en kolonne, innbefattende tilstopping av filtre eller kolonner og tap av materiale. Imidlertid er det, ved anvendelse av et vaskemiddel som reduserer størrelsen på aggregatene som skal danne et løselig aggregat, funnet at disse aggregatene binder seg tett til kolonnen under betingelser med vaskemiddel, men kan elueres til en renhet på minst 50%, 60%, 70%, 80%, fortrinnsvis 90%, 95%, mer foretrukket 97%, 98% eller 99%, som fastslått ved SDS-PAGE-analyse, uten på ugunstig måte å påvirke kolonnefiltrene. Fremgangsmåten gir fortrinnsvis et utbytte på minst 100, 200, 500, 700, mer foretrukket 1000, 1500, 1700 eller 1900 mg cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, pr. liter fermentering. Fortrinnsvis blir minst 1%, 2%, 5%, 7%, 9% eller 10% av proteinet fra fermenteringskulturen gjenvunnet som renset cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin.
Prosessen utnytter evnen som cytolysiner, så som pneumolysin, har til å binde seg til kolesterol og andre aromatiske forbindelser. Denne bindingen er spesielt tett når cytolysinet er aggregert, noe som tillater cytolysinet å binde seg i nærvær av et vaskemiddel. Prosessen kan utvides til andre medlemmer av cytolysin-familien, siden alle medlemmene har evnen til å binde seg til aromatiske forbindelser og danne porer. Faktisk kan metoden anvendes til å rense andre familier av proteiner som binder seg til kolesterol eller andre aromatiske forbindelser og/eller danner porer, fortrinnsvis begge deler.
Følgelig blir det, i en første utførelsesform, tilveiebragt en prosess for rensing av et bakterielt cytolysin, idet den omfatter trinnene: a) å dyrke en cellekultur som uttrykker bakterielt cytolysin; b) å fremstille et ekstrakt fra kulturen som inneholder bakterielt cytolysin; c) å binde løselig aggregert bakterielt cytolysin som finnes i ekstraktet i nærvær av et vaskemiddel til et hydrofobt interaksjons-kromatografimateriale under betingelser med høyt saltinnhold på 0,6-2 M salt; d) å eluere bakterielt cytolysin i nærvær av et vaskemiddel under betingelser med lavt saltinnhold på 0-0,2 M salt.
I en andre utførelsesform blir det tilveiebragt en prosess som videre omfatter trinnene: e) å fjerne vaskemiddel fra det bakterielle cytolysinet; f) å solubilisere det bakterielle cytolysinet ved å tilsette et denatureringsmiddel; g) å fjerne denatureringsmidlet fra det bakterielle cytolysinet.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan fordelaktig anvendes til å rense
pneumokokk-pneumolysin. Andre cytolysiner som kan renses ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen innbefatter pyolysin fra A. pyogenes, cereolysin fra B. cereus, thuringiolysin 0 fra B. thuringiensis, laterosporolysin fra
B. latersporus, bifermentolysin fra C. bifermentans, botukinolysin fra C. botulinum, chauveolysin fra C. chauvoel, histolyticolysin fra C. histolyticum, oedematolysin fra C. novyi type A, perfringolysin 0 fra C. perfringens, septicolysin O fra C. septicum, sordellilysin fra C. sordellii, tetanolysin fra C. tetani, ivanolysin 0 fra L. ivanovi, listeriolysin 0 fra L. monocytogenes, seeligerilysin O fra L. seeligeri, alveolysin fra P. alvei, streptolysin 0 fra S. pyogenes, S. canis eller S. equisimilis, intermedilysin fra S. intermedius, suilysin fra S. suis eller pneumolysin fra S. pneumoniae som kan være av villtypen eller være genetisk modifiserte toksiner med lavere nivåer av toksisitet, så som PdA og PdB beskrevet ovenfor.
Med pneumolysin eller Ply menes det: nativt pneumolysin fra pneumokokk eller rekombinant pneumolysin, villtype-pneumolysin eller mutanter av pneumolysin (for eksempel dem beskrevet i WO 90/06951 og WO 99/03884). Eventuelt kan pneumolysin også bety et hvilket som helst fragment av pneumolysin eller en hvilken som helst variant av pneumolysin som deler minst 70, 80, 90 eller 95% aminosyresekvens-identitet med en villtype-pneumolysin-sekvens, som fremdeles har evnen til å bli renset ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, slik det lett kan fastslås av en fagperson.
I foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen er det samme vaskemidlet til stede i trinn b) og c), b) og d), c) og d), mer foretrukket i trinn b), c) og d), fortrinnsvis i en konsentrasjon på 0,1%-5% (vekt/volum). For formålene ifølge oppfinnelsen er et alifatisk vaskemiddel definert som et i det vesentlige alifatisk vaskemiddel med utilstrekkelig aromatisk karakter til å forhindre binding av cytolysin til kolonnen i trinn c). Fortrinnsvis vil vaskemidlet ha én eller flere aromatiske ringer, mest foretrukket har det ingen aromatiske ringer. I løpet av trinn b) er det fordelaktig at vaskemidlet bryter opp større aggregater av cytolysin til mindre aggregater som danner et løselig aggregat. I løpet av trinnene c) og d) beholder vaskemidlet fordelaktig den løselige, aggregerte tilstanden av cytolysinet, noe som tillater det å binde seg til kolonnen, under betingelser med høyt saltinnhold, med høy affinitet.
Cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, blir uttrykt i en kultur av bakterieceller, fortrinnsvis S. pneumoniae, E. coli, eller alternativt i gjærceller, insektceller, pattedyrceller, eller et hvilket som helst annet ekspresjonssystem som er egnet for dets ekspresjon. I ekspresjonssystemer som gir høye utbytter av pneumolysin, blir pneumolysinet ofte aggregert av seg selv, og prosessen ifølge oppfinnelsen er ideéll for rensing av det. Fortrinnsvis blir pneumolysin uttrykt i høye utbytter, slik at det utgjør mer enn 2, 3, 4, 5, 7 eller 10% av totalt protein i ekspresjonssystemet. Fortrinnsvis er pneumolysinet i aggregert form, og dermed for det meste fritt for hemolytisk aktivitet. For eksempel er ekspresjon av E. coli i en fermentor under en fag X-promoter, eller andre promotere som tillater høy ekspresjon , velkjent for en person med kunnskap på fagområdet.
Fortrinnsvis blir cytolysinet ekstrahert fra ekspresjonssystemet som et aggregat. Alternativt kan et ekspresjonssystem med lavere utbytte gi løselig cytolysin. I dette tilfelle blir ekstrakten som inneholder cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, justert til en pH under 7,5, noe som tillater cytolysinet å aggregeres i løpet av en periode på minst 8 timer, fortrinnsvis minst 24 timer.
Fremstillingen av en ekstrakt i trinn b) innebærer fortrinnsvis ett eller flere trinn med mekanisk ødeleggelse av cellene og/eller behandling av cellene med vaskemiddel. Hvis utført med en fremgangsmåte med høyt utbytte, forblir pneumolysinet i form av aggregater, men aggregatene bør være små nok, slik at de forblir i supernatanten etter sentrifugering av prøven under betingelser som er nødvendig for å pelletere uløselige cellerester. Fortrinnsvis er vaskemidlet anvendt i oppfinnelsen et alifatisk vaskemiddel som ikke inneholder aromatiske ringer, fortrinnsvis et ionisk vaskemiddel, mer foretrukket et kationisk eller anionisk vaskemiddel, og mest foretrukket er vaskemidlet natriumlaurolysarcosinat. Foretrukne vaskemidler er i stand til å solubilisere pneumolysin, samtidig som de etterlater det i form av små aggregater som binder seg til den hydrofobe interaksjonskolonnen uten å forårsake blokkering av filtre festet til kolonnen. Foretrukne vaskemidler er i stand til å redusere størrelsen på pneumolysin-aggregater, noe som tillater pneumolysin-aggregatene å bli tilstrekkelig små slik at de forblir i supernatanten etter sentrifugering av prøven ved 30.000 g i 20 minutter. Slike løselige aggregater kan renses som sådanne på den hydrofobe interaksjonskolonnen. Vaskemidlet er til stede i en konsentrasjon på mellom 0,1% og 5%, fortrinnsvis 0,5% og 3% (vekt/volum), fortrinnsvis mellom 0,75% og 2%, mer foretrukket rundt 1 %. Fortrinnsvis er vaskemidlet dialyserbart.
Etter mekanisk og/eller vaskemiddel-sprengning av kulturen i trinn b), innbefatter prosessen ifølge oppfinnelsen sentrifugering av cellematerialet og oppsamling av supernatanten som ekstrakten som skal påsettes kromatografimaterialet i trinn c). Pneumolysin er fortrinnsvis til stede i supernatanten som et løselig aggregat.
Prosessen ifølge oppfinnelsen anvender hydrofob interaksjons-kromatografi for å rense pneumolysin i ett enkelt trinn. Kolonnematerialet anvendt i trinn c) inneholder fortrinnsvis aromatiske grupper, fortrinnsvis fenylgrupper, og er mer foretrukket fenyl-sepharose.
Løsningen anvendt i trinn c) og/eller trinn d) under påsetting og eluering av kolonnen, omfatter et ionisk vaskemiddel, fortrinnsvis et kationisk eller anionisk vaskemiddel, fortrinnsvis et vaskemiddel som er løselig ved saltkonsentrasjoner over 0,5M, mest foretrukket er vaskemidlet natriumlaurolysarcosinat. Vaskemidlet anvendt er et som vil redusere størrelsen på cytolysin-, fortrinnsvis pneumolysin-, aggregater, noe som tillater at cytolysinet kan være til stede i prøven som et løselig aggregat, slik at det vil binde seg til det hydrofobe interaksjons-kolonnematerialet uten å bli irreversibelt fanget på kolonnen. Vaskemidlet er til stede i en konsentrasjon på fortrinnsvis mellom 0,1% og 5%, fortrinnsvis 0,5% og 3% (vekt/- volum), mer foretrukket mellom 0,75% og 2%, mest foretrukket rundt 1%.
Løsningen anvendt i trinn c) og/eller d) inneholder et salt, fortrinnsvis et salt valgt fra gruppen som består av natriumklorid, magnesiumklorid, ammoniumklorid, natriumsulfat, magnesiumsulfat, ammoniumsulfat, natriumfosfat, magnesiumfosfat, ammoniumfosfat, og er fortrinnsvis bufret til pH 6-8, fortrinnsvis rundt pH 7. Enhver buffer som er i stand til å holde pH mellom pH 5 og 9 kan anvendes.
Løsningen anvendt til å binde pneumolysin til kolonnen i prosessen ifølge oppfinnelsen inneholder en høy saltkonsentrasjon, fortrinnsvis 0,6-2M, mer foretrukket rundt 1M. Saltkonsentrasjonen er valgt slik at pneumolysin er i en løselig, aggregert form og er i stand til å binde seg til det hydrofobe kromatografimaterialet.
Eventuelt kan trinn c) inneholde et ekstra trinn med å vaske kolonnen i mellomliggende saltbetingelser på rundt 0,5M salt, eller en saltkonsentrasjon som er i stand til å fjerne eventuelle urenheter som binder seg dårlig.
Prosessen ifølge oppfinnelsen anvender en synkende saltgradient til å eluere pneumolysin fra kolonnen. Fortrinnsvis inneholder den lave saltløsningen som anvendes til å danne saltgradienten i trinn d) mellom 0 og 0,1 M salt, mer foretrukket 0-40 mM salt. Alternativt kan trinnvis eluering anvendes med den lave saltbufferen anvendt i trinn d), som inneholder mellom 0 og 0,2M salt, mer foretrukket 0-40 mM salt.
Valgfrie trinn kan legges til prosessen ifølge oppfinnelsen hvis det er foretrukket å denaturere pneumolysinet og deretter tilbakefolde det ved fjerning av denatureringsmidlet. Disse valgfrie trinnene sikrer at rent cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, med en nativ struktur, blir oppnådd. Det første valgfrie trinnet e) innebærer fjerning av vaskemiddel ved hjelp av diafiltrering, dialyse eller fortynning. Dette trinnet innebærer fortrinnsvis diafiltrering/dialyse mot en buffer med pH 8-10, fortrinnsvis rundt 9, idet det er mer foretrukket at bufferen er én som er i stand til å bufre til alkaliske pH-verdier, idet det er mest foretrukket at bufferen er DEA. Løsningen har fortrinnsvis lav ionestyrke, fortrinnsvis 10-50 mM, mest foretrukket rundt 25 mM. Diafiltrering eller dialyse blir fortrinnsvis utført ved 4°C, men blir alternativt utført ved romtemperatur.
I et andre trinn blir cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, denaturert og solubilisert ved tilsetning av et denatureringsmiddel. Fortrinnsvis er denatureringsmidlet anvendt i trinn f) guanidinhydroklorid, mer foretrukket 5-8M guanidinhydroklorid, mest foretrukket rundt 6M guanidinhydroklorid. Pneumolysinet blir inkubert med guanidinhydroklorid i minst 10 minutter, fortrinnsvis minst 1 time, mer foretrukket i omtrent én time.
Cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, blir deretter fortrinnsvis bragt i kontakt med 5-9M urinstoff, fortrinnsvis rundt 8M urinstoff, i trinn f). Dette oppnås ved diafiltrering eller dialyse av cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, mot urinstoff. Fortrinnsvis blir den samme bufferen og pH opprettholdt under utvekslingen av denatureringsmiddel. Fortrinnsvis blir et reduksjonsmiddel (DTT, 2-merkaptoetanol eller glutation tilsatt under utvekslingen av denatureringsmiddel.
Fortrinnsvis innebærer trinn f) å bringe cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, i kontakt med 5-8M guanidinhydroklorid, fulgt av utveksling av guanidinhydrokloridet med 5-9M urinstoff.
For å forhindre at det dannes upassende disulfidbindinger mens cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, blir denaturert, er det fordelaktig å sikre at et reduksjonsmiddel er til stede under minst noe av trinn f) og g). Et foretrukket reduksjonsmiddel er 0,1-10 mM DTT, fortrinnsvis rundt 1 mM DTT. Alternativt anvendes glutation eller 2-merkaptoetanol. Foretrukket konsentrasjon av glutation er 1-50 mM, mer foretrukket 10-30 mM.
Valgfritt trinn g) innebærer fjerning av denatureringsmidlet for å tilbakefolde cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, fortrinnsvis ved diafiltrering eller dialyse mot en lav saltbuffer på pH 6-11, fortrinnsvis rundt pH 9. Fortrinnsvis blir cytolysin-, fortrinsvis pneumolysin-, konsentrasjonen opprettholdt på minst 100 ug/ml, fortrinnsvis mellom 100 ug/ml og 1000 ug/ml, mer foretrukket på rundt 500 ug/ml. Eventuelt er diafiltrering eller dialyse mot en buffer inneholdende propylenglykol på mellom 10 og 30%, fortrinnsvis på rundt 15%. Fortrinnsvis blir et reduksjonsmiddel som beskrevet ovenfor opprettholdt i trinn g). Diafiltrering eller dialyse blir fortrinnsvis utført ved 4°C, men blir alternativt utført ved romtemperatur.
Et ytterligere, valgfritt trinn h) innebærer fjerning av reduksjonsmidlet etter at cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, er blitt tilbakefoldet. Dette oppnås fortrinnsvis ved diafiltrering eller dialyse mot en lav saltbuffer på pH 6-11, fortrinnsvis rundt pH 9. Eventuelt er diafiltrering eller dialyse mot en buffer inneholdende propylenglykol på mellom 10 og 30%, fortrinnsvis på rundt 15%. Diafiltrering eller dialyse blir fortrinnsvis utført ved 4°C, men blir alternativt utført ved romtemperatur.
I foretrukne fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen blir cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, tilbakefoldet, slik at dets hemolytiske aktivitet blir gjenopprettet til over 25%, 50%, 75%, mest foretrukket til over 90% av den til det riktig foldede proteinet. For formålene ifølge oppfinnelsen, er et "foldet" protein et protein som har den tertiære strukturen til proteinet dannet ved en ikke-denatureringsprosess.
I tilfelle av vill-type-pneumolysin vil den forventede hemolytiske aktivitet til tilbakefoldet pneumolysin være 500.000-1.000.000 hemolyse-enheter/mg pneumolysin. I tilfelle av punktmutert pneumolysin med en lavere hemolyseaktivitet, vil hemolyseaktiviteten til det tilbakefoldede pneumolysin være tilsvarende lavere.
Detoksifisering av et toksin.
Cytolysinet renset ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis pneumolysin, kan bli utsatt for et ytterligere, valgfritt trinn med detoksifisering ved
kjemisk behandling. Dette ytterligere trinnet er spesielt fordelaktiv hvis cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, skal administreres til et dyr eller et menneske. Vill-type-pneumolysin er meget toksisk. Flere muterte pneumolysin-proteiner er blitt isolert som har redusert toksisitet, men allikevel har disse fremdeles rest-toksisitet som kan være problematisk når penumolysin blir administrert internt (WO 99/03884, WO 90/06951). Alternativt kan det bli detoksifisert ved konjugering til polysakkarider (WO 96/05859).
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan detoksifisere enten villtype- eller mutert cytolysin, for eksempel pneumolysin, ved kjemisk behandling. Foretrukne utførelsesformer anvender et kryssbindingsmiddel, mer foretrukket inneholdende ett eller flere kjemikalier valgt fra gruppen som består av formaldehyd, glutaraldehyd og et kryssbindings-reagens inneholdende en N-hydroksysuksino-midoester og/eller en maleimidgruppe (for eksempel GMBS).
Detoksifiseringsprosessene er i seg selv et aspekt av oppfinnelsen og kan anvendes til å detoksifisere bakterietoksiner, fortrinnsvis pneumolysin fremstilt med andre fremgangsmåter.
I én utførelsesform beskriver detoksifiseringsprosessen ifølge oppfinnelsen detoksifiseringen av et bakterietoksin, som omfatter å behandlet toksinet med en kjemisk forbindelse, fortrinnsvis et kryssbindingsmiddel som er reaktivt, fortrinnsvis preferanse-reaktivt, mest foretrukket spesifikt reaktivt med amingrupper, mer foretrukket primære amingrupper.
For formålene for denne oppfinnelsen er et kryssbindingsmiddel definert som en forbindelse med minst to reaktive grupper, hvorav minst én er i stand til å reagere med minst én gruppe i bakterietoksinet. En ytterligere, reaktiv gruppe er i stand til å reagere med enten en gruppe på bakterietoksinet, eller en separat forbindelse (for eksempel en aminosyre, peptid, polypeptid, sukker eller polysakkarid).
Fortrinnsvis er den kjemiske forbindelsen eller kryssbindingsmidlet reaktivt, mer foretrukket preferanse-reaktivt, mest foretrukket spesifikt reaktivt med amin-og sulhydrylgrupper. Fortrinnsvis reagerer den kjemiske forbindelsen med en primær amingruppe i lysin, mer foretrukket reagerer kryssbindingsmidlet med en primær amingruppe i lysin og sulhydrylgruppen i cystein. Denne fremgangsmåten er spesielt fordelaktig når pneumolysin blir detoksifisert, siden modifisering av både cystein- og lysinrester fører til en synergistisk reduksjon av hemolysenivået, sammenlignet med rest-hemolyseaktiviteten der kryssbindingsreagenset reagerer med bare lysin eller cystein.
Således tilveiebringer en alternativ utførelsesform en fremgangsmåte for detoksifisering av bakterietoksiner, som omfatter å modifisere en cysteinrest (eventuelt nær C-terminus til toksinet) som er involvert i den toksiske aktiviteten til toksinet (fortrinnsvis lyse-aktiviteten), som omfatter å behandle toksinet med et kryssbindingsreagens (fortrinnsvis et heterobifunksjonelt kryssbindingsreagens) som kryssbinder sulfhydrylgruppene med en annen aminosyre av toksinet, fortrinnsvis mer enn 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40 aminosyrer bort fra cysteinet i den primære strukturen. Fortrinnsvis inneholder den andre aminosyren en primær amingruppe, og mer foretrukket er aminosyren lysin.
I noen utførelsesformer beholder over 50%, 60%, 70%, 80%, 90% eller 95% av toksinet en molekylvekt innen 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,70%, 80% eller 90%, mer foretrukket mellom 1 og 50%, mest foretrukket mellom 5 og 10%, av sin opprinnelige molekylvekt etter behandlingen, som anslått ved hjelp av SDS-PAGE. Fortrinnsvis får toksinet en noe høyere molekylvekt etter detoksifiseringsbehandlingen, på grunn av at flere aminosyrerester blir modifisert ved kovalent binding til den kjemiske forbindelsen. Imidlertid involverer fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis ikke omfattende konjugering av toksinet, verken ved kovalent binding av det til andre toksinmolekyler slik at et toksin med en multimer kvaternær struktur blir dannet, eller ved kovalent binding av toksinet til andre store proteiner, polysakkarider eller lipopolysakkarider. Mest foretrukket er fremgangsmåtene, proteinene eller produktene beskrevet i WO 96/05859 ikke dekket av denne oppfinnelsen.
Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen kan anvendes til å detoksifisere bakterietoksiner. Foretrukne toksiner innbefatter de tiol-aktiverte cytolysinene pyolysin fra A. pyogenes, cereolysin fra B. cereus, thuringiolysin O fra B. thuhngiensis, laterosporolysin fra B. latersporus, bifermentolysin fra C. bifermentans, botukinolysin fra C. botulinum, chauveolysin fra C. chauvoel, histolyticolysin fra C. histolyticum, oedematolysin fra C. novyi type A, perfringolysin 0 fra C. perfringens, septicolysin 0 fra C. septicum, sordellilysin fra C. sordellii, tetanolysin fra C. tetani, ivanolysin 0 fra L. ivanovi, listeriolysin 0 fra L. monocytogenes, seeligerilysin 0 fra L. seeligeh, alveolysin fra P. alvei, streptolysin 0 fra S. pyogenes, S. ca nis eller S. equisimilis, intermedilysin fra S. intermedius, suilysin fra S. suis eller pneumolysin fra S. pneumoniae som kan være av villtype eller kan være genetisk modifiserte toksiner med lave toksisitetsnivåer, så som PdA og PdB beskrevet ovenfor (WO 90/06951, WO 99/03884).
Fremgangsmåten kan også anvendes til å detoksifisere Neisserial-toksinene FrpA, FrpC (WO 92/01460), FrpB (Microbiology 142; 3269-3274, (1996); J. Bacteriol. 181; 2895-2901 (1999)) NM-ADPRT (13th International Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani et al s. 135). FrpA og FrpC inneholder en region som blir konservert mellom disse to proteinene, og et foretrukket fragment av toksinene ville være et polypeptid som inneholder dette konserverte fragmentet, fortrinnsvis omfattende aminosyrer 227-1004 i sekvensen FrpA/C.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan også anvendes til å detoksifisere Bordetella-toksiner, innbefattende adenylat-cyklase (CyaA) (Glaser (1988) Mol. Microbiol. 2; 19-30), dermonekrotisk toksin (Livey (1984) J. Med, Microbiol. 17; 91-103) og pertussis-toksin (PT) (Munoz et al (1981) Infect Immun 33; 820-826). Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er også nyttig for detoksifisering av tetanus-toksin (TT) og difteri-toksin (DT) og toksin fra S. aureus og S. epidermidis, innbefattende autolysin og hemolysin (WO 01/98499, WO 02/59148).
Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen fører til en reduksjon av mengden av toksisitet og/eller hemolytisk aktivitet av toksinet på minst 90%, fortrinnsvis 95%, 96%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% eller 99,99%. (Hemolytisk aktivitet blir målt ved anvendelse av fremgangsmåten i eksempel 3, og toksisitet kan måles ved fremgangsmåten i eksempel 5). Nativt pneumolysin har en hemolytisk aktivitet på 500.000-1.000.000 enheter pr. mg pneumolysin. Noen punkt-muterte varianter av pneumolysin har redusert toksisitet og hemolytisk aktivitet. Detoksifisering av en variant av pneumolysin er kanskje ikke i stand til å oppnå så stor prosentvis reduksjon av hemolytisk aktivitet, på grunn av det lavere startpunktet som hemolytisk aktivitet blir redusert fra, men man forestiller seg at hoveddelen av den gjenværende hemolytiske aktivitet blir fjernet ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen.
Detoksifiseringstrinnet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringer fortrinnsvis en kryssbindingsreaksjon som er i det vesentlige ikke-reversibel. Reverserbarhet blir anslått ved overvåkning av nivået av hemolytisk aktivitet av det detoksifiserte toksinet rett etter detoksifisering og etter inkubering ved en temperatur over 25°C, fortrinnsvis over 30°C, mer foretrukket over 35°C, mest foretrukket over 37°C, i minst 5, 6, 7, 8, 9 eller 10 dager. En i det vesentlige ikke-reverserbar reaksjon resulterer i vesentlig ikke-reversibel detoksifisering, og er definert som en reaksjon hvor nivået av hemolytisk aktivitet stiger med mindre enn 100%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% etter inkubering ved en forhøyet temperatur som beskrevet ovenfor. Mange fremgangsmåter for detoksifisering, for eksempel ved anvendelse avformaldehydbehandling, resulterer i detoksifisering som ikke er stabil, men øker i toksisitet over tid.
I et foretrukket detoksifiseringstrinn i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, beholder over 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% eller 98% av toksinene en monomer kvaternær struktur etter kryssbindingsreaksjonen. Mange kryssbindingsreagenser danner intermolekylære kryssbindinger (for eksempel formaldehyd og glutaraldehyd). Dette kan påvirke de immunologiske egenskapene til toksinet, siden noen epitoper vil være skjult inne i aggregatet. Fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen innebærer fortrinnsvis ganske enkelt å modifisere aminosyrerester, fortrinnsvis sulfhydryl- og/eller primære amingrupper av aminosyrer og/eller dannelse av hovedsakelig intramolekylære kryssbindinger. Den resulterende, monomere, kvaternære struktur tillater at epitoper forblir eksponert på overflaten av toksinet.
I en foretrukket utførelsesform av detoksifiseringstrinnet, er kryssbindingsmidlet heterobifunksjonelt. Foretrukne kryssbindingsreagenser inneholder en N-hydroksysuksinimid-estergruppe som reagerer preferensielt, mer foretrukket spesifikt, med primære amingrupper. Fortrinnsvis inneholder kryssbindingsreagenset en maleimidgruppe som reagerer preferensielt, mer foretrukket spesifikt, med sulfhydrylgrupper. Ved en pH rundt 7 reagerer en maleimidgruppe 1000 ganger raskere med sulfhydrylgrupper enn den gjør med aminer. Fortrinnsvis inneholder kryssbindingsreagenset både en N-hydroksysuksinimid-estergruppe og en maleimidgruppe. Kryssbindingsmidlet er fortrinnsvis ikke spaltbart ved anvendelse av et reduksjonsmiddel, siden dette fører til mindre effektiv detoksifisering.
Avstanden mellom de reaktive gruppene i kryssbindingsreagenset er i stand til å påvirke effektiviteten av detoksifiseringen. Fortrinnsvis er avstanden mellom gruppene i kryssbindingsreagenset som er reaktivt med amin- og sulfhydrylgrupper mellom 1,5 og 20 Ångstrøm, mer foretrukket mellom 5 og 15 Ångstrøm, og mest foretrukket rundt 10 Ångstrøm, i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis blir aminosyrerestene på det bakterielle toksinet modifisert ved tilsetning aven gruppe som er over 5, 7, 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 500 Ångstrøm lang. Fortrinnsvis er modifiseringsgruppen mellom 5 og 100 Ångstrøm, mer foretrukket mellom 10 og 20 Ångstrøm av størrelse.
Detoksifiseringstrinnet i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater at tilstrekkelige rester blir modifisert, slik at sterisk interferens og/eller konformasjonelle endringer hemmer funksjonen til bakterietoksinet. Fortrinnsvis blir minst 5, 7, 10, 12, 14, 15, 20 eller 25 aminosyrerester av bakterietoksinet modifisert. Når uomsatte maleimidgrupper er til stede på kryssbindingsreagenset, kan en Ellman-reaksjon anvendes til å anslå (indirekte) antall kryssbindingsmolekyler som er bundet til hvert toksinmolekyl (Ellman 1959 Arch. Biochem. Biophys. 82; 70).
Foretrukne kryssbindingsreagenser er SMPT, Sulfo-LC-SMPT, Sulfo-KMUS, LC-SMCC, KMUA, Sulfo-LC-SPDP, LC-SPDP, SMPB, Sulfo-SMPB, SMPH, Sulfo-SMCC, SMCC, SIAB, Sulfo-SIAB, GMBS (N-(y-maleimidobutyryl-oksy)suksinimidester), Sulfo-GMBS, MBS, Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, EMCA, EMCS, BMPS, SPDP, SBAP, BMPA, AMAS, SATP og SIA (Pierce).
I en foretrukket fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen blir toksinet behandlet med den kjemiske forbindelsen eller kryssbindingsreagenset under pH-betingelser på mellom 5,0 og 9,0, fortrinnsvis 6,5 til 8,0, mest foretrukket 7,0 til 7,8. I behandlinger hvor omsetningen av en maleimidgruppe til en sulfhydrylgruppe blir befordret, er den foretrukne pH ved omsetningen 6,0 og 8,0, mer foretrukket 6,5 og 7,5. Den foretrukne konsentrasjonen av salter under omsetningen er mellom 100 mM og 1M, mer foretrukket 150 mM og 500 mM, mest foretrukket mellom 200 mM og 300 mM. Imidlertid har oppfinnerne funnet at det noen ganger er foretrukket å utføre omsetningen ved en lav saltkonsentrasjon hvor ikke noe natriumklorid eller annet salt er tilsatt. Når omsetningen blir utført ved en pH på mellom 7,6 og 7,8, kan omsetningen eventuelt bli utført uten tilsetning av salt. Likeledes kan anvendelsen av høyere forhold mellom GMBS og toksin utføres uten tilsetning av salt ved pH-verdier mellom 7,0 og 8,0.
Fortrinnsvis blir et 50-500, mer foretrukket 130-350 eller 350-900, mest foretrukket rundt 250 ganger molart overskudd av den kjemiske forbindelsen eller kryssbindingsreagenset i forhold til hvert toksin anvendt. Pneumokokk-pneumolysin inneholder 31 lysinrester. Derfor er et 248 ganger molart overskudd av kjemisk forbindelse eller kryssbindingsreagens i forhold til pneumolysin ekvivalent med et 8 ganger molart overskudd av kjemisk forbindelse eller kryssbindingsreagens i forhold til hver lysinrest. Fortrinnsvis anvendes et 2-20, mer foretrukket et 4-15 eller 15-30, mest foretrukket rundt 8 ganger molart forhold mellom kjemisk forbindelse eller kryssbindingsmiddel og lysinrester i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen.
Behandlingen med kryssbindingsreagens foregår i minst 15 minutter, fortrinnsvis i minst 30 minutter, mest foretrukket rundt én time, ved mellom 4°C og 40°C, fortrinnsvis mellom 15°C og 25°C, mest foretrukket ved romtemperatur. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte et behandlings-("quenching") trinn ved anvendelse av en forbindelse som inneholder en sulfhydrylgruppe, fortrinnsvis har behandlingsforbindelsen en molekylvekt på over 50, 100 eller 120, og mer foretrukket er behandlingsreagenset en aminosyre, så som cystein. Alternativt kan gruppen bli omsatt med en peptid- eller polysakkarid-enhet som er i stand til å reagere med maleimid, for eksempel et peptid inneholdende en cysteinrest. Dette er spesielt passende der en uomsatt maleimidgruppe er til stede før behandlingstrinnet.
Detoksifiseringstrinnet er egnet for anvendelse på bakterietoksiner som beskrevet ovenfor. Fortrinnsvis er bakterietoksinet fra Streptococcus pneumoniae, mest foretrukket er toksinet pneumolysin. Pneumolysinet er et nativt eller rekombinant protein, eller et protein som er blitt genetisk konstruert for å redusere dets toksisitet (som beskrevet ovenfor). Fusjonsproteiner av toksiner, fortrinnsvis pneumolysin eller fragmenter av toksiner, fortrinnsvis pneumolysin, kan detoksifiseres ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.
Således, i en foretrukket utførelsesform, blir et toksin (så som pneumolysin) detoksifisert med et kryssbindingsreagens som fortrinnsvis er heterobifunksjonelt og som har grupper som er reaktive med lysin- og cysteinrester og som har en viss størrelse, og har mest foretrukket de reaktive gruppene i en avstand på 10-20 Ångstrøm fra hverandre, slik at ett eller begge av følgende skjer: a) mellom 5 og 30, fortrinnsvis rundt 12-14 aminosyrerester av toksinet blir modifisert ved hjelp av et kryssbindingsmolekyl som kovalent binder seg
fortrinnsvis til en lysin- eller argininrest (fortrinnsvis, som målt indirekte ved en Ellman-reaksjon), idet den andre enden er blitt behandlet (fortrinnsvis
med cystein) og/eller;
b) en cystein-sidekjede involvert i den toksiske aktiviteten til toksinet (fortrinnsvis mot C-terminus av toksinet) blir kryssbundet til en annen
sidekjede av toksinet (fortrinnsvis til en lysin- eller argininrest) som fortrinnsvis er skilt med mer enn 2, 5,10, 20, 30 eller 40 aminosyrer fra cysteinresten i den primære sekvensen av toksinet.
I en ytterligere, foretrukket utførelsesform blir et toksin (fortrinnsvis pneumolysin) detoksifisert med en monofunksjonell, kjemisk forbindelse som fortrinnsvis reagerer med aminosyrer som inneholder en primær amingruppe, mer foretrukket lysin, og som har en viss størrelse, mest foretrukket 10-100 Ångstrøm, slik at toksinet blir dekket med mellom 5 og 30, mer foretrukket rundt 14 kjemiske forbindelser bundet til aminosyrerester.
Polysakkaridkonjugater.
Et problem forbundet med polysakkarid-tilnærming til vaksinering, er det faktum at polysakkarider per se er dårlige immunogener. For å overvinne dette, kan polysakkarider bli konjugert til proteinbærere, som gir tilskuer-T-cellehjelp. Prosessen ifølge oppfinnelsen kan fordelaktig inneholde et ytterligere trinn med konjugering av cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin, til et bakterie-polysakkarid, for eksempel et lipo-oligosakkarid, eller fortrinnsvis et kapsel-polysakkarid.
En foretrukket konjugat ifølge oppfinnelsen omfatter cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin oppnådd ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, konjugert til kapsel-polysakkarider avledet fra Streptococcus pneumoniae. Pnemokokk-kapsel-polysakkarid-antigenene er fortrinnsvis valgt fra serotyper 1,2,3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F og 33F (mest foretrukket fra serotyper 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F og 23F), eller blandinger av to eller flere av de nevnte konjugatene (4, 7, 9, 11, 13 eller 23).
Cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, renset ved prosessen ifølge oppfinnelsen, blir også fortrinnsvis konjugert til kapsel-polysakkarider fra andre stammer av bakterier. Slike polysakkarider kan være isolert fra for eksempel H. influenzae, H. influenzae type B (Hib), N. meningitidis- grupper A, C, W, Y, streptokokker forskjellig fra S. pneumoniae (for eksempel gruppe B-streptokokker, S. pyogenes, etc), stafylokokker (for eksempel S. aureus, S. epidermidis), E. coli, enterokokker (for eksempel E. faecalis og E. facecium), etc. Fortrinnsvis er polysakkaridene fra H. influenzae type B (Hib), og/eller N. meningitidis- grupper A, C, W135 og/eller Y.
Polysakkaridet kan bli bundet til cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, ved en hvilken som helst kjent metode (for eksempel av Likhite, US-patent nr. 4.372.945 og av Armor et al., US-patent nr. 4.474.757). Fortrinnsvis blir CDAP-konjugering utført (WO 95/08348). For å øke immunogenisiteten kan polysakkaridene bli tilsatt adjuvans ("adjuvanted") og/eller lyofilisert. Polysakkaridene ifølge oppfinnelsen kan være i full størrelse, eller få en størrelse etter rensingen som mindre polysakkarider eller oligosakkarider.
Prosessen ifølge oppfinnelsen omfatter fortrinnsvis et ytterligere trinn med å formulere cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin, til en vaksine.
Proteiner og immunogene preparater.
Et pneumolysin-bakteriekapsel-polysakkaridkonjugat kan bli dannet ved prosessen ifølge oppfinnelsen.
Et immunogent preparat som omfatter cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin eller pneumolysin-bakteriekapsel-polysakkarid kan bli oppnådd ved prosessen ifølge oppfinnelsen (som beskrevet ovenfor).
Det immunogene preparatet kan videre omfatte fortrinnsvis ett eller flere medlemmer av pneumokokk-cholinbindingsprotein-familien, fortrinnsvis cholinbindingsprotein A eller et immunogent fragment derav, og/eller ett eller flere medlemmer av polyhistidin-triad-familien (innbefattende fusjonsproteiner derav), fortrinnsvis PhtA, PhtB, PhtD eller PhtE, eller et immunogent fragment derav.
Vedrørende Choline Binding Protein-familien (CbpX), ble medlemmer av denne familien opprinnelig identifisert som pneumokokk-proteiner som kunne renses ved cholin-affinitetskromatografi. Alle cholinbindingsproteinene er ikke-kovalent bundet til fosforylcholin-enheter av cellevegg-"teichoic"-syre og membranbundet lipo-"teichoic"-syre. Strukturelt har de flere regioner felles i hele familien, selv om den nøyaktige naturen til proteinene (aminosyresekvens, lengde, etc.) kan variere. Generelt omfatter cholinbindingsproteiner en N-terminal region (N), konserverte repetisjonsregioner (R1 og/eller R2), en prolin-rik region (P) og en konservert cholinbindingsregion (C), som utgjøres av multiple repetisjoner, som omfatter tilnærmet den ene halvparten av proteinet. Som anvendt i denne søknaden, er betegnelsen "Choline Binding Protein-familie (CbpX)" valgt fra gruppen som består av Choline Binding Protein'er som identifisert i WO 97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD og CbpG. CbpA er beskrevet i WO 97/41151. CbpD og CbpG er beskrevet i WO 00/29434. PspC er beskrevet i WO 97/09994. PbcA er beskrevet i WO 98/21337. SpsA er et Choline-bindingsprotein beskrevet i WO 98/39450. Fortrinnsvis er Choline Binding Protein'er valgt fra gruppen som består av CbpA, PbcA, SpsA og PspC.
En annen, foretrukket utførelsesform er CbpX-trunkater hvor "CbpX" er definert ovenfor og "trunkater" refererer til CbpX-proteiner som mangler 50% eller mer av Choline-bindingsregionen (C). Fortrinnsvis mangler slike proteiner hele cholinbindingsregionen. Mer foretrukket mangler slike protein-trunkater (i) cholinbindingsregionen og (ii) en del av den N-terminale halvparten av proteinet også, men bibeholder likevel minst én repetisjonsregion (R1 eller R2). Enda mer foretrukket har trunkatet 2 repetisjonsregioner (R1 og R2), mer foretrukket bibeholder trunkatet den prolinrike regionen (P). Eksempler på slike foretrukne utførelsesformer er NR1xR2 og R1xR2, som illustrert i WO 99/51266 eller WO 99/51188 og NR1XR2P, men andre cholinbindingsproteiner som mangler en lik cholinbindingsregion er også beskrevet.
LytX-familien er membranbunde proteiner forbundet med cellelyse. Det N-terminale domenet omfatter cholinbindingsdomene(r), men LytX-familien har ikke alle trekkene som er å finne hos CbpA-familien angitt ovenfor, og således anses LytX-familien som forskjellig fra CbpX-familien. I motsetning til CbpX-familien, inneholder det C-terminale domenet det katalytiske domenet til LytX-protein-familien. Familien omfatter LytA, B og C. Med hensyn til LytX-familien, er LytA beskrevet i Ronda et al., Eur J Biochem, 164:621-624 (1987). LytB er beskrevet i WO 98/18930, og er også referert til som Sp46. LytC er også beskrevet i WO 98/18930, og er også referert til som Sp91. Et foretrukket medlem av denne familien er LytC.
En annen, foretrukket utførelsesform er LytX-trunkater hvor "LytX" er definert ovenfor og "trunkater" refererer til LytX-proteiner som mangler 50% eller mer av Choline-bindingsregionen. Fortrinnsvis mangler slike proteiner hele cholinbindingsregionen. Et eksempel på slike trunkater er å finne i eksempeldelen i denne oppfinnelsen.
Videre er CbpX-trunkat-LytX-trunkat-kimære proteiner (eller fusjoner) beskrevet. Fortrinnsvis omfatter dette NR1xR2 (eller R1xR2, eller NR1XR2P) av CbpX og den C-terminale delen (Cterm, dvs. mangler cholinbindingsdomenene) i LytX (for eksempel LytCCterm eller Sp91 Cterm). Mer foretrukket er CbpX valgt fra gruppen som består av CbpA, PbcA, SpsA og PspC. Enda mer foretrukket er det CbpA. Fortrinnsvis er LytX LytC (også referert til som Sp91).
Videre er et PspA eller PsaA, eller trunkater som mangler cholinbindingsdomenet (C), eventuelt uttrykt som et fusjonsprotein med LytX beskrevet. Fortrinnsvis er LytX LytC.
Pht- (Poly Histidine Triad) familien omfatter proteiner PhtA, PhtB, PhtD og PhtE. Familien er kjennetegnet ved en lipidasjonssekvens, to domener adskilt av en prolinrik region og flere histidin-triader, muligens involvert i metall- eller nukleosidbinding eller enzymatisk aktivitet, (3-5)-kveilede kveile-regioner, en konservert N-terminus og en heterogen C-terminus. Den er til stede i alle stammer av pneumokokker som er testet. Homologe proteiner er også blitt funnet i andre Streptococci og Neisseria. Foretrukne medlemmer av familien omfatter PhtA, PhtB og PhtD. Mer foretrukket omfatter den PhtA eller PhtD. Det skal imidlertid forstås at betegnelsene Pht A, B, D og E refererer til proteiner som har sekvenser beskrevet i publikasjonene nedenfor, så vel som naturlig forekommende (og menneskelagde) varianter derav som har en sekvenshomologi som er minst 90% identisk med de refererte proteinene. Fortrinnsvis er den minst 95% identisk, og mest foretrukket er den minst 97% identisk.
De immunogene preparatene beskrevet kan innlemme fusjonsproteiner av histidin-triad-proteiner. Foretrukne fusjonsproteiner inneholder i) PhtD eller et fragment derav bundet til PhtE eller et fragment derav, eller ii) PhtB eller et fragment derav bundet til PhtE eller et fragment derav.
Med hensyn til PhtX-proteiner, er PhtA beskrevet i WO 98/18930, og er også referert til Sp36. Som angitt ovenfor, er det et protein fra polyhistidin-triad-familien, og har type ll-signalmotivet til LXXC.
PhtD er beskrevet i WO 00/37105, og er også referert til Sp036D. Som angitt ovenfor, er det også et protein fra polyhistidin-triad-familien, og har type II LXXC-signalmotivet. PhtB er beskrevet i WO 00/37105, og er også referert til Sp036B. Et annen medlem av PhtB-familien er C3-Degrading Polypeptidet, som beskrevet i WO 00/17370. Dette proteinet er også fra polyhistidin-triad-familien, og har type II LXXC-signalmotivet. En foretrukket, immunologisk, funksjonell ekvivalent er proteinet SP42 beskrevet i WO 98/18930. Et PhtB-trunkat (tilnærmet 79 kD) er beskrevet i WO 99/15675, som også betraktes som et medlem av PhtX-familien.
PhtE er beskrevet i WO 00/30299, og er referert til som BVH-3.
For å frembringe et immunogent preparat som er i stand til å utløse en immunrespons mot mer enn ett patogen involvert i otitis media, er det fordelaktig for immunogene preparater å ytterligere omfatte et antigen fra én eller flere (2, 3, 4, 5, 6) av S. pneumoniae, ikke-typbar ("non-typable") Haemophilus influenzae " Moraxella catarrhalis, RSV, parainfluensa-virus og/eller influensavirus. Kombinasjonsvaksiner som gir beskyttelse mot en rekke forskjellige patogener kan dannes. Mange pediatriske vaksiner gis nå som en kombinasjonsvaksine, for å redusere antall injeksjoner som et barn må få. Således kan, for pediatriske vaksiner, andre antigener fra andre patogener bli formulert med vaksinene. For eksempel kan vaksinene bli formulert med (eller administrert separat, men samtidig) den velkjente "treverdige" kombinasjonsvaksinen som omfatter Diphtheria toxoid (DT), tetanus-toxoid (TT), og pertussis-bestanddeler [typisk detoksifisert Pertussis-toxoid (PT) og filamentært hemagglutinin (FHA) med valgfritt pertactin (PRN) og/eller agglutinin 1+2], for eksempel den markedsførte vaksinen INFANRIX-DTPa™ (SmithKlineBeecham Biologicals) som inneholder DT-, TT-, PT-, FHA- og PRN-antigener, eller med en helcelle-pertussis-bestanddel, for eksempel som markedsført av SmithKlineBeecham Biologicals s.a., som Tritanrix™. Den kombinerte vaksinen kan også inneholde et annet antigen, så som Hepatitt B-overflate-antigen (HBsAg), Poliovirus-antigener (for eksempel inaktivert, treverdig poliovirus- I PV), ytre Moraxella catarrhalis-membranproteiner, ikke-typbar Haemophilus influenzae-<p>roiemer, ytre N. meningitidis B-membranproteiner.
Eksempler på foretrukne Moraxella cafarr/)a//s-protein-antigener som kan innbefattes i en kombinasjonsvaksine (spesielt for å forhindre otitis media) er: OMP106 [WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA &/eller LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA &/ellerTbpB [WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspA1 og/eller UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); Iip06 (GB 9917977.2); Iipo10 (GB 9918208.1); lipo11 (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmplAI (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257); og OmpE. Eksempler på ikke-typ-bare Haemophilus influenzae- antigener som kan innbefattes i en kombinasjonsvaksine (spesielt for å forebygge otitis media) innbefatter: Fimbrin-protein [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] og fusjoner som omfatter peptider derfra [for eksempel LB1(f)-peptidfusjoner; US 5843464 (OSU) eller WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; TbpA og/eller TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); protein D (EP 594610); P2; og P5 (WO 94/26304).
Andre kombinasjoner som er omfattet er cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin ifølge oppfinnelsen i kombinasjon med virus-antigener, for eksempel fra influensa (svekket, splittet, eller delenhet [for eksempel overflate-glykoproteiner-neuraminidase (NA) og hemagglutinin (HA). Se for eksempel Chaloupka I. et al, Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15:121-127]; RSV (for eksempel F- og G-antigener eller F/G-fusjoner, se for eksempel Schmidt A. C. et al, J Virol, mai 2001, s. 4594-4603), parainfluensa-virus 3 (PIV3) (for eksempel HN- og F-proteiner, se Schmidt et al. ovenfor), Varicella (for eksempel svekket, glykoproteiner I-V, etc.) og en hvilken som helst (eller alle) bestanddel(er) av MMR (meslinger, kusma, røde hunder).
Vaksiner.
En vaksine kan dannes som omfatter cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin eller et pneumolysin-bakteriekapsel-polysakkaridkonjugat, oppnådd ved prosessen ifølge oppfinnelsen, og en farmasøytisk akseptabel eksipient og eventuelt et adjuvans.
Vaksinen kan omfatte de immunogene preparatene beskrevet ovenfor, og en farmasøytisk akseptabel eksipient.
Vaksinene er i stand til å frembringe en beskyttende immunrespons mot S. pneumoniae-\ nfeks\ on og/eller otitis media.
Det er mulig å behandle eller forhindre en bakterieinfeksjon, fortrinnsvis en Streptococcus pneumoniae-\ n1eks\ on eller otitis media, som omfatter å administrere vaksinen eller det immunogene preparatet heri.
Cytolysinet, fortrinnsvis pneumolysin og/eller pneumolysin-bakteriekapsel-polysakkarid-konjugat, kan anvendes ved fremstillingen av en vaksine for å behandle eller forhindre en bakterieinfeksjon, fortrinnsvis en Strepcococcus pneumoniae-infeksjon eller otitis media.
Vaksinene blir fortrinnsvis tilsatt adjuvans. Egnede adjuvanser innbefatter et aluminiumsalt, så som aluminiumhydroksydgel (alum) eller aluminiumfosfat, men kan også være et salt av kalsium, magnesium, jern eller sink, eller kan være en uløselig suspensjon av acylert tyrosin, eller acylerte sukkertyper, kationisk eller anionisk derivatiserte polysakkarider, eller polyfosfazener.
Det er foretrukket at adjuvanset er valgt slik at det blir en prefensiell befordrer av en TH1-type-respons. Slike høye nivåer av Th1-type-cytokiner har en tendens til å favorisere befordringen av celle-medierte immunresponser på et gitt antigen, mens høye nivåer av Th2-type-cytokiner har en tendens til å favorisere befordringen av humorale immunresponser på antigenet.
Det er viktig å huske at skillet mellom Th1- og Th2-type-immunrespons ikke er absolutt. I realiteten vil et individ støtte en immunrespons som er beskrevet å være overveiende Th1- eller overveiende Th2. Imidlertid er det ofte bekvemt å betrakte familiene av cytokiner uttrykt slik som beskrevet i musedyr-CD4 + ve T-cellekloner av Mosmann og Coffman (Mosmann, T.R. og Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, s. 145-173). Tradisjonelt blir Th1-type-responser forbundet med produksjonen av INF-y- og IL-2-cytokiner av T-lymfocytter. Andre cytokiner som ofte blir direkte forbundet med befordringen av Th1-type-immunresponser er ikke produsert av T-celler, så som IL-12. I motsetning til dette blir Th2-type-responser forbundet med sekresjon av II-4, IL-5, IL-6, IL-10. Egnede adjuvanssystemer som fremmer en overveiende Th1-response innbefatter: Monofosforyl-lipid A, eller et derivat derav, spesielt 3-de-O-acylert monofosforyl-lipid A (3D-MPL) (for fremstilling av det, se GB 2220211 A); og en kombinasjon av monofosforyl-lipid A, fortrinnsvis 3-de-O-acylert monofosforyl-lipid A, sammen med enten et aluminiumsalt (for eksempel aluminiumfosfat eller aluminiumhydroksyd), eller en olje-i-vann-emulsjon. I slike kombinasjoner finnes antigen og 3D-MPL i de samme partikkelformige strukturene, noe som tillater mer effektiv levering av antigene og immunstimulerende signaler. Studier har vist at 3D-MPL er i stand til ytterligere å øke immunogenisiteten til et alum-adsorbert antigen [Thoelen et al. Vaccine
(1998) 16:708-14; EP 689454-B1].
Et forbedret system innebærer kombinasjonen av et monofosforyl-lipid A og et saponin-derivat, spesielt kombinasjonen av QS21 og 3D-MPL, som beskrevet i WO 94/00153, eller et mindre reaktogent preparat hvor QS21 blir behandlet med kolesterol, som beskrevet i WO 96/33739.
En spesielt kraftig adjuvansformulering som involverer QS21, 3D-MPL og tokoferol i en olje-i-vann-emulsjon, er beskrevet i WO 95/17210, og er en foretrukket formulering.
Fortrinnsvis omfatter vaksinen i tillegg et saponin, mer foretrukket QS21. Formuleringen kan også omfatte en olje-i-vann-emulsjon og tokoferol (WO 95/17210).
Det er også mulig å produsere en vaksineformulering som omfatter å blande et cytolysin med en farmasøytisk akseptabel eksipient, så som 3D-MPL.
Umetylert CpG-holdige oligonukleotider (WO 96/02555) er også preferensielle befordrere av en TH 1-respons, og er egnet for anvendelse i foreliggende oppfinnelse.
Det er mulig å forhindre eller lindre pneumoni hos et eldre menneske (over 55 år gammel), ved å administrere en trygg og effektiv mengde av vaksinen, og eventuelt et Th 1-adjuvans, til nevnte eldre pasient.
Det er videre mulig å forhindre eller lindre otitis media hos spedbarn (opptil 24 måneder) eller småbarn (typisk 24 måneder til 5 år), som omfatter å administrere en trygg og effektiv mengde av en vaksine som omfatter et cytolysin, fortrinnsvis pneumolysin heri, eventuelt med ett eller flere av de ytterligere antigenene beskrevet ovenfor, og eventuelt et Th1-adjuvans, til nevnte spedbarn eller småbarn.
Vaksinepreparatene kan anvendes til å beskytte eller behandle et pattedyr (fortrinnsvis en menneske-pasient) som er mottagelig for infeksjon, ved hjelp av å administrere nevnte vaksine på systemisk måte eller via mukosa. Disse administreringene kan innbefatte injeksjon på intramuskulær, intraperitoneal, intradermal eller subkutan måte; eller via mukosa-administrering til munn/fordøyelses-, respirasjons-, genitourin-kanalene. Intranasal administrering av vaksiner for behandling av pneumoni eller otitis media er foretrukket (siden pneumokokker i nasofaryngeal-rommet kan bli mer effektivt forhindret, og således svekke infeksjonen i sin tidligste fase). Selv om vaksinen kan administreres som én enkelt dose, kan bestanddeler derav også administreres samtidig på samme tid, eller til forskjellig tid (for eksempel hvis polysakkarider er til stede i en vaksine, kan disse administreres separat på samme tid eller 1-2 uker etter administrering av bakterieprotein-kombinasjonen for optimal koordinering av immunresponsene med hensyn til hverandre). I tillegg til en administrering på én enkelt måte, kan 2 forskjellige måter for administrering anvendes. For eksempel kan virus-antigener administreres ID (intradermalt), mens bakterieproteiner kan administreres IM (intramuskulært) eller IN (intranasalt). Hvis polysakkarider er til stede, kan de administreres IM (eller ID), og bakterieproteiner kan administreres IN (eller ID). I tillegg kan vaksinene ifølge oppfinnelsen administreres IM for igangssettingsdoser og IN for forsterkningsdoser.
Mengden av konjugat-antigen i hver vaksinedose blir valgt som en mengde som bevirker et immunbeskyttende respons uten betydelige, ugunstige bivirkninger i typiske vaksiner. En slik mengde vil variere, avhengig av hvilket spesifikt immunogen som anvendes og hvordan det presenteres. Inneholdet av protein-antigener i vaksinen vil typisk være i området 1-100ug, fortrinnsvis 5-50ug, mest typisk i området 5-25ug. Hvis polysakkarider er innbefattet, vil det generelt forventes at hver dose vil omfatte 0,1-100ug polysakkarid, fortrinnsvis 0,1-50 jig, mer foretrukket 0,1-10ug, av hvilke 1 til 5ug er det mest foretrukne området.
Optimale mengder av bestanddeler for en spesiell vaksine kan konstateres ved standard studier som innebærer observasjon av passende immunresponser hos individer. Etter en innledende vaksinasjon kan individer få én eller flere forsterknings-immuniseringer med passende mellomrom. Typisk vil en vaksine omfatte antigen (proteiner), et adjuvans, og eksipienter eller en farmasøytisk akseptabel bærer.
Vaksinefremstilling er generelt beskrevet i Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (redaktører Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Innkapsling i liposomer er beskrevet av Fullerton, US-patent nr. 4.235.877.
Selv om vaksinene kan administreres på en hvilken som helst måte, utgjør administrering av de beskrevne vaksinene i huden (ID) en viktig form. Menneskehud omfatter et ytre, "hornaktig" hornlag, kalt stratum corneum, som ligger over epidermis. Under dette epidermis er et lag kalt dermis, som i sin tur ligger over det subkutane vevet. Forskere har vist at injeksjon av en vaksine i huden, og særlig dermis, stimulerer en immunrespons som også kan forbindes med mange ytterligere fordeler. Intradermal vaksinering med vaksinene beskrevet her er beskrevet.
Den konvensjonelle teknikken for intradermal injeksjon, "mantoux-prose-dyren", omfatter trinn med å rengjøre huden og deretter strekke den ut med én hånd, og med skråkanten på en smal-dimensjonert nål (26-31 gauge) rettet oppover blir nålen satt inn i en vinkel på mellom 10 og 15°. Så snart skråkanten på nålen er satt inn, blir beholderen på nålen senket og ytterligere skjøvet fremover, mens det utøves et lett trykk for å heve den under huden. Væsken blir deretter injisert meget sakte, og danner dermed en blære eller hevelse på hudoverflaten, fulgt av sakte uttrekking av nålen.
Mer nylig er det blitt beskrevet anordninger som er spesifikt utformet til å administrere flytende midler inn i eller gjennom huden, for eksempel anordningene beskrevet i WO 99/34850 og EP 1092444, også blekkinjeksjons-anordningene beskrevet for eksempel i WO 01/13977; US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US 5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520.639, US 4.596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US 4.940.460, WO 97/37705 og WO 97/13537. Alternative fremgangsmåter for intradermal administrering av vaksinepreparater kan innbefatte konvensjonelle sprøyter og nåler, eller anordninger utformet for ballistisk levering av faste vaksiner (WO 99/27961), eller transdermale plastere (WO 97/48440; WO 98/28037); eller påført på overflaten av huden (transdermal eller transkutan levering WO 98/20734; WO 98/28037).
Når vaksinene skal administreres til huden, eller mer spesifikt inn i dermis, er vaksinen i et lite væskevolum, spesielt et volum på mellom omtrent 0,05 ml og 0,2 ml.
Innholdet av antigener i huden eller intradermale vaksiner kan være lik konvensjonelle doser, slik de er å finne i intramuskulære vaksiner. Følgelige kan protein-antigenene som er til stede i de intradermale vaksinene være i området 1-100 jig, fortrinnsvis 5-50ug. Likeledes, hvis til stede, er mengden av polysakkarid-konjugat-antigen i hver vaksinedose generelt forventet å omfatte 0,1-100ug polysakkarid, fortrinnsvis 0,1-50ug, fortrinnsvis 0,1-10ug, og kan være mellom 1 og 5ug. Imidlertid er det et trekk ved hud- eller intradermale vaksiner at formuleringene kan være "lav-dose". Følgelige er protein-antigenene i "lav-dose"-vaksinene fortrinnsvis til stede i så lite som 0,1 til 10ug, fortrinnsvis 0,1 til 5ug pr. dose; og, hvis til stede, kan polysakkaridkonjugat-antigenene være til stede i området 0,01-1ug, og fortrinnsvis mellom 0,01 og 0,5ug polysakkarid pr. dose.
Slik det benyttes her, betyr uttrykket "intradermal levering" levering av vaksinen til området av dermis i huden. Imidlertid vil vaksinen ikke nødvendigvis være lokalisert utelukkende i dermis. Dermis er det laget i huden som er lokalisert mellom omtrent 1,0 og omtrent 2,0 mm fra overflaten av menneskehud, men det er en viss mengde variasjon mellom individer, og i forskjellige deler av kroppen. Generelt kan det forventes å nå dermis ved å gå 1,5 mm under hudoverflaten. Dermis er lokalisert mellom stratum corneum og epidermis på overflaten og subkutanlaget under. Avhengig av leveringsmåten, kan vaksinen til slutt være lokalisert kun eller primært inne i dermis, eller den kan til slutt være fordelt innen epidermis og dermis.
De immunogene preparatene og vaksinene heri kan vurderes i forskjellige dyremodeller eller med humant serum. Som en illustrasjon kan følgende dyremodeller anvendes til å vurdere en pneumokokk-infeksjon. C3H/HeJ-mus (6 til 8 uker gamle) kan bli immunisert s.c. med 15ug protein med tilsatt adjuvans 50 ul CFA, 3-4 uker senere fulgt av forsterkning med 15ug protein med IFA. For å demonstrere passiv og aktiv beskyttelse mot systemisk infeksjon, kan mus få administrert intraperitonealt immunsera eller proteiner før utfordring med intraperitoneal injeksjon med 15 til 90 LD50-pneumokokker i uke 8-10. I tillegg kan proteiner testes i en muse-nasofaryngs-koloniseringsmodell av (Wu et al Microbial Pathogenesis 1997; 23:127-137).
I tillegg til mus er rotteunger mottagelig for kolonisering og infeksjon med S. pneumoniae. I passive beskyttelsesstudier kan administrering av muse-immunsera (100 ul i.p. eller 10 ul i.n.) gjøres før utfordring med intranasal administrering av S. pneumonia (10 ul) i 2-5 dager gamle rotteunger. Kolonisering kan bestemmes ved å plate neseutvaskinger (20-40 ul dryppet inn, 10 ul tatt ut).
Fordelaktige interaksjoner mellom protein- (eller protein og polysakkarid) bestanddelene i kombinasjonsvaksinen kan vises ved å administrere en dose av hvert protein (eller protein og polysakkarid) i vaksinen som ville være sub-beskyttende i en énverdig vaksine. Økt beskyttelseseffekt av kombinasjonsvaksinen, sammenlignet med énverdige vaksiner, kan tilskrives en fordelaktig interaksjon mellom bestanddelene.
Oppfinnelsen er illustrert i de medfølgende eksempler. Eksemplene er utført ved anvendelse av standard teknikker, som er velkjente og rutinemessige for dem med kunnskap på fagområdet, unntatt der hvor noe annet er beskrevet i detalj. Eksemplene er ment å illustrere oppfinnelsen.
Eksempler.
Eksempel 1. Rensing av pneumolysin.
Etetr 18 timers induksjon av £. co//-kulturen ved å øke temperaturen til 39,5°C, ble E. coli pelletert ved sentrifugering ved 17.000 g i 1 time. Pelleten ble gjenoppslemmet i 25 mM dietanolamin, pH 9,0, og £. coli ble mekanisk brutt opp ved anvendelse av en passering ved 500 PSI i et Rannie-apparat. 1% natriumlaurolysarcosinat (SLS) ble tilsatt til det oppbrutte £ coli og blandingen ble inkubert i 1 time ved romtemperatur før sentrifugering ved 30.000 g i 20 minutter, slik at cellulært avfall ble pelletert. Supernatanten ble fortynnet 2,5 ganger for å ende opp i 20 mM fosfat, pH 7,0, inneholdende 1M NaCI og 1% SLS, og ble deretter påsatt en fenyl-sepharose HP-kolonne likevektsinnstilt i samme buffer (20 mM fosfat, pH 7,0, inneholdende 1M NaCI og 1% SLS =
likevektsinnstillingsbuffer). Kolonnen ble vasket med 4 kolonnevolumer av
likevektsinnstillingsbuffer, fulgt av 2 kolonnevolumer av 20 mM fosfatbuffer, pH 7,0, inneholdende 0,5M NaCI og 1% SLS. Pneumolysin ble eluertfra kolonnen ved å påføre en lav saltbuffer inneholdende 20 mM fosfatbuffer, pH 7,0, inneholdende 1% SLS. Fraksjoner inneholdende pneumolysin ble identifisert ved anvendelse av SDS-PAGE-analyse, ble slått sammen, og bufferen ble byttet ut med 25 mM dietanolamin, pH 9,0, ved anvendelse av diafiltrering.
Pneumolysinet ble solubilisert ved denaturering ved å tilsette fast guanidinhydroklorid opp til 6M endelig konsentrasjon og inkubering i én time. Det ble deretter diafiltrert mot 8M urinstoff i 25 mM dietanolamin, pH 9,0, inneholdende 1 mM DTT. Pneumolysin ble tilbakefoldet ved diafiltrering mot 20 mM boratbuffer, pH 9,0, inneholdende 1mM DTT. Etter renaturering ble DTT fjernet ved diafiltrering mot 20 mM boratbuffer, pH 9,0.
Renheten av pneumolysin oppnådd ble analysert ved kjøring på et SDS-PAGE og farging med Coomassie-brilliantblå. En separat gel ble analysert ved hjelp av Western blotting ved anvendelse av et antistoff mot E. coli for å påvise nivået av £. co//'-proteiner som er igjen i det rensede pneumolysin-preparatet. Den biologiske aktiviteten til det rensede pneumolysinet ble anslått ved anvendelse av en in vitro-hemolyse-analyse.
Resultater.
Som vist på figur 1, var fremgangsmåten ovenfor i stand til å gi en meget effektiv rensing av pneumolysin etter ett enkelt kromatografitrinn. Coomassie-blå-farget gel i panel A viser at eluering av kolonnen med en lav saltbuffer som ikke inneholder noe tilsatt natriumklorid var i stand til å eluere et 53 kDa-bånd tilsvarende pneumolysin fra kolonnen i en meget renset form. Det mye svakere båndet på tilnærmet 45 kDa antas også å være pneumolysin, siden dette andre båndet binder seg til anti-pneumolysin-antistoffer (resultater ikke vist), og binder seg heller ikke til anti-E. co//'-antistoffene, som vist i panel B. Western blot av panel B er en meget følsom metode for å påvise eventuelle forurensende proteiner som er igjen i det rensede pneumolysinet. Denne fremgangsmåten var i stand til å påvise meget få forurensende stoffer, og de som var til stede var på et lavt nivå som var under påvisningsnivået for Coomassie-farging. Pneumolysinet er derfor renset til et nivå på 98-100% renhet.
Utbyttet fra rensemetoden er også godt med en typisk kjøring som gir rundt 1900 mg pneumolysin pr. liter fermentering. Tilnærmet 10% av proteinet fra fermenteringskulturen ble gjenvunnet som renset pneumolysin.
Aktiviteten til pneumolysinet i en hemolyse-analyse ble anslått etter at pneumolysinet var blitt behandlet med guanidiniumhydroklorid /urinstoff og var blitt tilbakefoldet ved fjerning av denatureringsmidlet. Hemolytisk aktivitet ble påvist i fortynninger av det rensede pneumolysinet ned til konsentrasjoner på 1,3 ng/ml, noe som viser at hemolytisk aktivitet var blitt gjenetablert. Dette tilsvarer mellom 500.000 og 1.000.000 hemolytiske enheter pr. mg villtype-pneumolysin.
Eksempel 2 - Detoksifisering av S. pnetymon/ ae- pneumolysin ved anvendelse av GMBS.
Renset pneumolysin ble detoksifisert ved modifisering av sulfhydryl- og primære amingrupper ved anvendelse av NHS-ester-maleimid-kryssbindingsreagenset GMBS (N-(y-maleimidobutyryloksy)suksinimidester). Pneumolysin i en konsentrasjon på 0,5 mg/ml ble dialysert mot 50 mM fosfatbuffer, pH 7,0. GMBS ble innledningsvis oppløst i DMSO og ble tilsatt til pneumolysin i et 248 ganger molart overskudd av GMBS. Behandlingen fortsatte i én time ved romtemperatur. Overskudd av GMBS og biprodukter ble fjernet ved dialyse mot 100 mM natriumfosfat, pH 6,8. Ytterligere maleimidgrupper ble behandlet ved omsetning med 0,6 mg/ml cystein i to timer ved romtemperatur. For å fjerne overskudd av cystein, ble prøven dialysert mot 2 mM natriumfosfat, pH 7,15.
Eksempel 3 - Karakterisering av detoksifisert pneumolysin.
Hemolytisk aktivitet.
Et hemolyse-assay ble anvendt til å anslå den gjenværende toksisiteten til detoksifisert pneumolysin. Serielle 2-gangers fortynninger av pneumolysin ble inkubert med røde blodceller fra sau. Etter sentrifugering ble supernatanten overført til immunoplater og frigjort hemoglobin ble målt ved anvendelse av optisk densitets-avlesning ved 405 nm. Resultatene ble uttrykt som ng/ml pneumolysin tilsvarende midtpunktet på OD-grafen. Assayet ble gjentatt etter inkubering av det detoksifiserte pneumolysinet ved 37°C i 7 dager, for å overvåke reverserbarheten av detoksifiseringen.
Som vist i tabell 1, var behandling med GMBS i stand til i det vesentlige å redusere den hemolytiske aktiviteten til PLY, idet en opptil 3.000 gangers reduksjon av hemolytisk aktivitet ble oppnådd. Høyere molforhold mellom GMBS og lysin var i stand til å gi bedre fjerning av hemolytisk aktivitet, idet forhold på 4:1 og 5:1 var optimale i dette forsøket. Denne behandlingen ble anslått å resultere i modifisering på 14 lysinrester. Der færre lysinrester ble modifisert, var reduksjonen av hemolytisk aktivitet mindre.
ELISA.
Antigenisiteten til det detoksifiserte pneumolysinet ble anslått med ELISA. ELISA-platene ble belagt med et marsvin-anti-pneumolysin-antistoff. Prøver inneholdende fortynninger av pneumolysin ble inkubert i platene i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking ble det bundne pneumolysinet påvist ved anvendelse av polyklonale kanin-antistoffer mot pneumolysin, konjugert til pepperrot-peroksydase. Etter vasking av platene ble en substratreaksjon anvendt til å anslå mengden av pneumolysin bundet til hver brønn.
Som vist i tabell 1, førte behandling med GMBS til noe tap av antigenisitet, som anslått med ELISA. Imidlertid kunne det oppnås ELISA-avlesninger på tilnærmet 66% av den gitt ved ubehandlet PLY, noe som viser at mange antistoffer fremdeles kunne gjenkjenne det modifiserte pneumolysinet.
SDS- PAGE- analvse.
De detoksifiserte pneumolysin-proteinene ble kjørt på et SDS-PAGE (Novex 4-20% polyakrylamidgel-lnvitrogen) og Coomassie-brilliantblå ble anvendt til å visualisere proteinene. Som vist på figur 2, førte behandling med GMBS til en lett økning av molekylvekten til PLY fra 53 kDA til tilnærmet 56 kDa. Denne økningen skyldes modifiseringen av multiple aminosyre-rester med GMBS. En liten prosentandel av PLY blir omdannet til multimere former, slik det kan sees ved tilsynekomsten av svake bånd med molekylvekt på tilnærmet 110 kDa og 170 kDa, men mesteparten av PLY forblir i en i det vesentlige monomer form. Inkubering av PLY ved 37°C i 7 dager resulterte ikke i noen vesentlig endring i tilsynekomsten av PLY på et SDS-PAGE, noe som viser at det modifiserte PLY ikke utsettes for
nedbrytning eller påfølgende kovalent-bundet multimer-dannelse.
Forsøk ble realisert på 1 mg PLY (1 mg/ml) med unntak av det siste assayet, hvor 3 mg ble behandlet (PLY i 0,68 mg/ml).
Eksempel 4: Reaktogenisitets- vurdering av detoksifisert pneumolysin i rotter.
Grupper på tre OFA-rotter ble immunisert én gang ved intramuskulær (tibia) inokulering med saltoppløsning, tilsatt adjuvans QS21 (US 5.057.540), pneumolysing, adjuvans-tilsatt pneumolysin, formaldehyd-detoksifisert pneumolysin, adjuvans-tilsatt formaldehyd-detoksifisert pneumolysin, GMBS-detoksifisert pneumolysin, adjuvans-tilsatt GMBS-detoksifisert pneumolysin, NHS-acetat-detoksifisert pneumolysin eller adjuvans-tilsatt NHS-acetat-detoksifisert pneumolysin. Tre dager etter immunisering ble alle rottene drept og tibia ble preparert for histologisk undersøkelse. Tibia ble fiksert i formalin og skåret opp i 2 mm skiver som ble dehydratisert og paraffin-innleiret. 7 um-deler ble skåret til og farget ved anvendelse av Trichrome Masson-metoden, før de ble undersøkt mikroskopisk.
Reaktogenisitet ble vurdert ved anvendelse av fire kriterier; nedbrytning/- nekrose, endomysial inflammasjon, blødning og aponeurose-inflammasjon. For hvert histologiske kriterium ble et poeng tildelt hver muskel i hver gruppe, og et gjennomsnittlig lesjonspoeng ble deretter beregnet for hver gruppe. Et poeng på 0 = normal, 1 = minimal, 2 = lett, 3 = moderat, 4 = markert og 5 = kraftig.
Resultater.
Histologien til delene ble undersøkt. De gjennomsnittlige poengene for degenerasjon/nekrose, endomysial inflammasjon, blødning og aponeurose-inflammasjon er vist i tabell 2.
En sammenligning av histologiske poeng for ikke adjuvans-tilsatt nativt og detoksifisert pneumolysin viser at GMBS er et særlig effektivt kryssbindingsreagens å anvende for detoksifisering av pneumolysin, noe som gir en stor reduksjon av nedbrytning/nekrose, endomysial inflammasjon, blødning og aponeurose-inflammasjon.
Tilsetningen av adjuvans (50 ug aluminiumfosfat og 5 ug MPL) til inokulasjonene øker mengden reaktogenisitet som en bivirkning ved stimulering av immunsystemet. Detoksifisering av pneumolysin med GMBS tillot nivået av nedbrytning/nekrose å bli redusert til det produsert av adjuvanset alene, som var lavere enn nivået produsert ved inokulering med nativt pneumolysin. GMBS-detoksifisert pneumolysin ga et lavere blødningsnivå enn det produsert av nativt pneumolysin. Nivåer av endomysial inflammasjon ble forhøyet av adjuvanset, og dette nivået var fremdeles til stede i nærvær av adjuvans-tilsatt nativt eller GMBS-detoksifisert pneumolysin. Aponeurose-inflammasjon ble imidlertid redusert fra nivået produsert av adjuvans alene, med nativt eller GMBS-detoksifisert pneumolysin, idet nivået av aponeurose er noe lavere der hvor pneumolysinet var blitt behandlet med GMBS.
Eksempel 5 - Evaluering av toksisitet av GMBS- behandlet pneumolysin i mus.
Grupper på 20 OF1-mus ble utfordret intranasalt med enten nativt pneumolysin eller GMBS-behandlet pneumolysin, og musene ble overvåket i de følgende 9 dagene.
Som vist på figur 3 førte utfordring med 2 ug nativt pneumolysin meget raskt til død av alle musene i den gruppen. Pneumolysinet ga lesjoner i hele respirasjonssystemet, noe som førte til respirasjonsproblemer og død. I motsetning til dette hadde det GMBS-behandlede pneumolysinet vesentlig redusert toksisitet, der alle musene inokulert med 2 ug, 5 ug eller 10 ug av det GMBS-behandlede pneumolysinet overlevde utfordringen.
Eksempel 6 - beskyttelsesstudier ved anvendelse av detoksifisert pneumolysin.
Grupper på 20 OF1-mus ble immunisert 3 ganger intramuskulært, på dag 0, 14 og 24 med 5 ug pneumolysin og 50 ug aluminiumfosfat og 5 ug MPL som adjuvans. Kontrollmus ble immunisert med adjuvans alene. Pneumolysinet var enten ubehandlet eller detoksifisert ved anvendelse av GMBS-behandlingen beskrevet ovenfor.
På dag 42 ble musene gitt en intranasal, dødelig utfordring med 2 ug nativt pneumolysin. Overlevelsen av musene i løpet av de følgende 9 dagene ble overvåket.
Resultater.
Den dødelige utfordringsmodellen førte til 90% dødelighet hos kontrollmus (figur 4). Immunisering med GMBS-detoksifisert pneumolysin ga meget god beskyttelse, der kun 5% av musene dør i løpet av de følgende 9 dagene. Dette var sammenlignbart med beskyttelse gitt etter inokulering med nativt pneumolysin, hvoretter 10% av musene døde.
Eksempel 7 - Vurdering av detoksifisert pneumolysin i kombinasjon med PhtD i en dødelig utfordringsmodell for mus.
Grupper på 20 OF1-mus ble immunisert intramuskulært med a) adjuvans alene, eller b) 1 ug PhtD og adjuvans, eller c) 1 ug PhtD og 5 ug GMBS-detoksifisert pneumolysin og adjuvans. Adjuvanset anvendt var sammensatt av 50 ug aluminiumfosfat og 5 ug MPL og immuniseringene fant sted på dag 0 og dag 14. Musene ble utfordret med en intranasal, dødelig dose på 5,10<5>CFU av serotype 2 S. pneumoniae stamme D39, og overlevelse ble overvåket i løpet av de neste 10 dagene.
Resultater.
Som vist på figur 5 førte utfordring med stamme D39 til 75% dødelighet etter 10 dager hos kontrollmus. Immunisering med PhtD alene ga ikke signifikant beskyttelse, idet 70% av musene i denne gruppen dør etter 10 dager (p = 0,29). Immunisering med PhtD sammen med GMBS-detoksifisert pneumolysin ga signifikant bedre beskyttelse, der dødeligheten ble redusert til 50% (p = 0,04).
Eksempel 8 - Detoksifisering av pneimolysin ved anvendelse av formaldehyd.
Et forråd av renset pneumolysin i en konsentrasjon på tilnærmet 0,4 mg/ml ble i 25 mM kaliumfosfat-buffer, pH 7,0 wa, behandlet med 50 mM L-lysin og 0,1% formaldehyd (vekt/volum) i 21 dager ved 40°C.
Claims (41)
1. Prosess for rensing av et bakterielt cytolysin,karakterisert vedat den omfatter trinnene: a) å dyrke en cellekultur som uttrykker bakterielt cytolysin; b) å fremstille et ekstrakt fra kulturen som inneholder bakterielt cytolysin; c) å binde løselig aggregert bakterielt cytolysin som finnes i ekstraktet i nærvær av et vaskemiddel til et hydrofobt interaksjons-kromatografimateriale under betingelser med høyt saltinnhold på 0,6-2 M salt; d) å eluere bakterielt cytolysin i nærvær av et vaskemiddel under betingelser med lavt saltinnhold på 0-0,2 M salt.
2. Prosess ifølge krav 1, som videre omfatter trinnene: e) å fjerne vaskemiddel fra det bakterielle cytolysinet; f) å solubilisere det bakterielle cytolysinet ved å tilsette et denatureringsmiddel; g) å fjerne denatureringsmidlet fra det bakterielle cytolysinet.
3. Prosess ifølge krav 1 eller 2, hvor det bakterielle cytolysinet er pneumokokk-pneumolysin.
4. Prosess ifølge krav 1-3, hvor trinn b) innebærer å bryte opp cellene mekanisk.
5. Prosess ifølge krav 1-4, hvor trinn b) innebærer å behandle med et vaskemiddel.
6. Prosess ifølge krav 1-5, hvor det samme vaskemidlet er til stede i trinn c) og d).
7. Prosess ifølge krav 5, hvor det samme vaskemidlet er til stede i trinn b), c) og d).
8. Prosess ifølge krav 1-7, hvor vaskemidlet er til stede i en konsentrasjon på mellom 0,1 og 5% (vekt/volum).
9. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor trinn b) innebærer å sentrifugere oppbrutt cellemateriale og oppsamle en supernatant som ekstrakten fra trinn c).
10. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor det hydrofobe interaksjons-kromatografimaterialet anvendt i trinn c) inneholder aromatiske grupper.
11. Prosess ifølge krav 10, hvor det hydrofobe kromatografimaterialet er fenyl-sepharose.
12. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor vaskemidlet som er til stede i løsningen anvendt i trinn c) og/eller trinn d) er et alifatisk vaskemiddel.
13. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor vaskemidlet er natriumlaurolysarcosinat.
14. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor betingelsene med høyt saltinnhold i trinn c) inneholder 1M salt.
15. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor løsningen anvendt i trinn c) og/eller d) inneholder et salt valgt fra gruppen som består av natriumklorid, magnesiumklorid, ammoniumklorid, natriumsulfat, magnesiumsulfat, ammoniumsulfat, natriumfosfat, magnesiumfosfat, ammoniumfosfat.
16. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor betingelsene anvendt i trinn c) og/eller trinn d) er mellom pH 6 og 8, fortrinnsvis rundt pH 7.
17. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor betingelsene anvendt i trinn d) inneholder 0-0,1M salt.
18. Prosess ifølge krav 17, hvor betingelsene anvendt i trinn d) inneholder 0-40 mM salt.
19. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor trinn e) innebærer å fjerne vaskemidlet ved diafiltrering eller dialyse.
20. Prosess ifølge krav 19, hvor diafiltreringen/dialysen er mot en lav saltbuffer inneholdende 0-0,2M salt og med en pH på pH 8-10, fortrinnsvis pH 9.
21. Prosess ifølge krav 2-20, hvor trinn f) innebærer å denaturere det bakterielle cytolysinet ved å tilsette et denatureringsmiddel og trinn g) innebærer å tilbakefolde det bakterielle cytolysinet ved gradvis å fjerne denatureringsmidlet.
22. Prosess ifølge krav 2-21, hvor denatureringsmidlet anvendt i trinn f) er guanidinhydroklorid.
23. Prosess ifølge krav 22, hvor 5-8M guanidinhydroklorid anvendes.
24. Prosess ifølge krav 22-23, hvor det bakterielle cytolysinet blir bragt i kontakt med 5-9M urinstoff i trinn f).
25. Prosess ifølge krav 24, hvor trinn f) innebærer å bringe bakterielt cytolysin i kontakt med 5-8M guanidinhydroklorid, fulgt av å utveksle guanidinhydrokloridet med 5-9M urinstoff.
26. Prosess ifølge krav 21 -25, hvor et reduksjonsmiddel er til stede under minst en del av trinnene f) og g).
27. Prosess ifølge krav 26, hvor reduksjonsmidlet er 0,1-10 mM DTT, fortrinnsvis 1 mM DTT.
28. Prosess ifølge krav 2-27, hvor trinn g) innebærer å fjerne denatureringsmidlet ved diafiltrering eller dialyse.
29. Prosess ifølge krav 28, hvor diafiltrering eller dialyse er mot en løsning med pH 7-9.
30. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, som omfatter et ytterligere trinn med å detoksifisere det bakterielle cytolysinet ved hjelp av kjemisk behandling med et kryssbindingsmiddel.
31. Prosess ifølge krav 30, hvor kryssbindingsmidlet inneholder ett eller flere kjemikalier valgt fra gruppen som består av: formaldehyd, glutaraldehyd, N-hydroksysuksin-omidoestere og GMBS.
32. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, som omfatter et ytterligere trinn med å konjugere det bakterielle cytolysinet til et bakteriekapsel-polysakkarid.
33. Prosess ifølge krav 32, hvor bakteriekapsel polysakkaridet er avledet fra Streptococcus pneumoniae.
34. Prosess ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, som omfatter et ytterligere trinn med å formulere bakterielt cytolysin til et vaksinepreparat med en farmasøytisk akseptabel eksipient.
35. Prosess ifølge krav 34, hvor det bakterielle cytolysin er formulert med cholinbindende protein A eller et immunogent fragment derav.
36. Prosess ifølge krav 34 eller 35, hvor det bakterielle cytolysin er formulert med ett eller flere av PhtA, PhtB, PhtD eller PhtE eller et immunogent fragment derav.
37. Prosess ifølge et hvilket som helst av kravene 34-36, hvor det bakterielle cytolysin er formulert med et antigen fra ikke-typbar Haemophilus influenzae (NtHi).
38. Prosess ifølge et hvilket som helst av kravene 34-37, hvor det bakterielle cytolysin er formulert med et antigen fra Moraxella catarrhalis.
39. Prosess ifølge et hvilket som helst av kravene 34-38, hvor det bakterielle cytolysin er formulert med et antigen fra RSV.
40. Prosess ifølge et hvilket som helst av kravene 34-39, hvor det bakterielle cytolysin er formulert med et antigen fra parainfluensavirus.
41. Prosess ifølge et hvilket som helst av kravene 34-40, hvor det bakterielle cytolysin er formulert med et antigen fra influensavirus.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB0305791A GB0305791D0 (en) | 2003-03-13 | 2003-03-13 | Detoxification process |
GB0305792A GB0305792D0 (en) | 2003-03-13 | 2003-03-13 | Purification Process |
PCT/EP2004/002641 WO2004081515A2 (en) | 2003-03-13 | 2004-03-11 | Purification process for bacterial cytolysin |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20054134D0 NO20054134D0 (no) | 2005-09-06 |
NO20054134L NO20054134L (no) | 2005-10-04 |
NO336672B1 true NO336672B1 (no) | 2015-10-19 |
Family
ID=32992596
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20054134A NO336672B1 (no) | 2003-03-13 | 2005-09-06 | Prosess for rensing av et bakterielt cytolysin |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US8084235B2 (no) |
EP (1) | EP1601689B1 (no) |
JP (2) | JP4597123B2 (no) |
KR (1) | KR101052996B1 (no) |
CN (1) | CN101818185B (no) |
AU (2) | AU2004219910B2 (no) |
BR (1) | BRPI0408094A (no) |
CA (2) | CA2812817C (no) |
CY (1) | CY1107134T1 (no) |
DE (1) | DE602004010376T2 (no) |
DK (1) | DK1601689T3 (no) |
EG (1) | EG24449A (no) |
ES (1) | ES2295836T3 (no) |
HK (1) | HK1086013A1 (no) |
IL (1) | IL210984A0 (no) |
IS (1) | IS2587B (no) |
MA (1) | MA27666A1 (no) |
MX (1) | MXPA05009579A (no) |
NO (1) | NO336672B1 (no) |
NZ (1) | NZ541969A (no) |
PT (1) | PT1601689E (no) |
RU (1) | RU2340627C2 (no) |
WO (1) | WO2004081515A2 (no) |
Families Citing this family (77)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2340627C2 (ru) | 2003-03-13 | 2008-12-10 | ГлаксоСмитКлайн Байолоджикалз с.а. | Способ очистки бактериального цитолизина |
GB0421083D0 (en) * | 2004-09-22 | 2004-10-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Purification process |
BRPI0609711B8 (pt) | 2005-03-23 | 2021-05-25 | Oculus Innovative Sciences Inc | uso de uma solução aquosa com potencial redutivo oxidativo (orp) |
PT2351578T (pt) | 2005-06-27 | 2017-04-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Processo para o fabrico de vacinas |
GB0607088D0 (en) | 2006-04-07 | 2006-05-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
DK3017827T3 (en) | 2005-12-22 | 2019-02-18 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Pneumococcal polysaccharide conjugate VACCINE |
US8147444B2 (en) | 2006-01-20 | 2012-04-03 | Oculus Innovative Sciences, Inc. | Methods of treating or preventing peritonitis with oxidative reductive potential water solution |
ES2387582T3 (es) | 2006-09-07 | 2012-09-26 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vacuna de combinación con cantidades reducidas del antígeno del virus de la polio |
EP2144924B1 (en) * | 2007-04-16 | 2016-05-11 | MinervaX Aps | Fusion protein vaccine |
EP2142211A1 (en) | 2007-05-02 | 2010-01-13 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Vaccine |
PL2167121T3 (pl) | 2007-06-26 | 2016-01-29 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Szczepionka zawierająca koniugaty polisacharydu otoczkowego streptococcus pneumoniae |
ES2678694T3 (es) | 2008-04-16 | 2018-08-16 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vacuna |
EA201100268A1 (ru) * | 2008-08-28 | 2011-10-31 | Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. | Вакцина |
DK2424562T3 (en) | 2009-04-30 | 2015-12-07 | Coley Pharm Group Inc | Pneumococcal vaccine and uses thereof |
US8668911B2 (en) | 2009-05-14 | 2014-03-11 | The Regents Of The University Of Michigan | Streptococcus vaccine compositions and methods of using the same |
CN102480972B (zh) | 2009-06-15 | 2014-12-10 | 奥古露丝创新科学公司 | 含有次氯酸的溶液及其使用方法 |
MX2012002639A (es) | 2009-09-03 | 2012-03-14 | Pfizer Vaccines Llc | Vacuna de pcsk9. |
LT2493498T (lt) | 2009-10-30 | 2017-05-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Staphylococcus aureus 5 tipo ir 8 tipo kapsulinių sacharidų gryninimas |
GB201003924D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
US20140004142A1 (en) | 2011-03-02 | 2014-01-02 | Pfizer Inc. | Pcsk9 vaccine |
PT3549949T (pt) * | 2011-04-22 | 2024-02-02 | Wyeth Llc | Composições relacionadas com uma toxina de clostridium difficile mutante e métodos da mesma |
MX339058B (es) | 2011-05-17 | 2016-05-09 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vacuna contra streptococcus pneumoniae. |
JP5854537B2 (ja) * | 2012-09-19 | 2016-02-09 | 国立大学法人大阪大学 | 肺炎球菌表面タンパク質aを含む肺炎球菌ワクチン |
RU2615446C2 (ru) * | 2012-11-30 | 2017-04-04 | Байонир Корпорейшн | Прибор для автоматизированного бесклеточного получения белков и способ получения белков с применением данного прибора |
WO2015095868A1 (en) | 2013-12-20 | 2015-06-25 | Wake Forest University Health Sciences | Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines |
BR122023022294A2 (pt) | 2014-01-21 | 2023-12-12 | Pfizer Inc. | Uso de uma composição imunogênica que compreende um conjugado imunogênico compreendendo um polissacarídeo capsular isolado de streptococcus pneumoniae do sorotipo 15b |
MX2016009470A (es) | 2014-01-21 | 2017-01-18 | Pfizer | Composiciones inmunogenicas que comprenden antigenos sacaridos capsulares conjugados y usos de los mismos. |
US10105431B2 (en) | 2014-01-21 | 2018-10-23 | Pfizer Inc. | Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof |
US11160855B2 (en) | 2014-01-21 | 2021-11-02 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
JP2017505792A (ja) | 2014-02-14 | 2017-02-23 | ファイザー・インク | 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート |
US10653764B2 (en) | 2015-01-15 | 2020-05-19 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines |
US9218427B1 (en) * | 2015-01-21 | 2015-12-22 | Maana, Inc. | Dynamic semantic models having multiple indices |
EP3283102A4 (en) * | 2015-04-16 | 2018-10-03 | Inventprise, LLC. | Bordetella pertussis immunogenic vaccine compositions |
KR102225282B1 (ko) | 2015-07-21 | 2021-03-10 | 화이자 인코포레이티드 | 접합된 캡슐형 사카라이드 항원을 포함하는 면역원성 조성물, 그를 포함하는 키트 및 그의 용도 |
GB201518684D0 (en) | 2015-10-21 | 2015-12-02 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
CA3005524C (en) | 2015-11-20 | 2023-10-10 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines |
GB201603029D0 (en) * | 2016-02-22 | 2016-04-06 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
US11224652B2 (en) | 2016-08-05 | 2022-01-18 | Sanofi Pasteur Inc. | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
CN109862908B (zh) | 2016-08-05 | 2023-05-02 | 圣诺菲·帕斯图尔公司 | 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物 |
WO2018102818A1 (en) * | 2016-12-02 | 2018-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Processive template independent dna polymerase variants |
EP3562503A2 (en) | 2016-12-30 | 2019-11-06 | Sutrovax, Inc. | Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids |
US11951165B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
EP3570879B1 (en) | 2017-01-20 | 2022-03-30 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines |
EP3576759A4 (en) | 2017-01-31 | 2020-11-11 | Merck Sharp & Dohme Corp. | PROCESS FOR THE PREPARATION OF CAPSULE POLYSACCHARIDE PROTEIN CONJUGATES FROM STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE SEROTYPE 19F |
US10729763B2 (en) | 2017-06-10 | 2020-08-04 | Inventprise, Llc | Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds |
US10688170B2 (en) | 2017-06-10 | 2020-06-23 | Inventprise, Llc | Multivalent conjugate vaccines with bivalent or multivalent conjugate polysaccharides that provide improved immunogenicity and avidity |
JP7438102B2 (ja) | 2017-09-07 | 2024-02-26 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー | 肺炎球菌多糖体および免疫原性多糖体-キャリアタンパク質コンジュゲートでのその使用 |
CN111683678B (zh) | 2017-12-06 | 2024-01-26 | 默沙东有限责任公司 | 包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的组合物及其使用方法 |
BR112020015696A2 (pt) | 2018-02-05 | 2020-12-08 | Sanofi Pasteur, Inc. | Composição de conjugado polissacarídeo-proteína pneumocócico multivalente |
KR20200121822A (ko) | 2018-02-05 | 2020-10-26 | 사노피 파스퇴르 인코포레이티드 | 다가 폐렴구균성 다당류-단백질 접합체 조성물 |
JP2021522213A (ja) | 2018-04-18 | 2021-08-30 | エスケー バイオサイエンス カンパニー リミテッド | ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類及びその免疫原性接合体 |
US11260119B2 (en) | 2018-08-24 | 2022-03-01 | Pfizer Inc. | Escherichia coli compositions and methods thereof |
CA3120922A1 (en) | 2018-12-12 | 2020-06-18 | Pfizer Inc. | Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof |
JP2022513458A (ja) | 2018-12-12 | 2022-02-08 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | O-結合型グリコシル化のための修飾キャリアタンパク質 |
CA3123414A1 (en) | 2018-12-19 | 2020-06-25 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
JP7239509B6 (ja) | 2019-02-22 | 2023-03-28 | ファイザー・インク | 細菌多糖類を精製するための方法 |
US20220184199A1 (en) | 2019-04-10 | 2022-06-16 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof |
JP2022542316A (ja) | 2019-07-31 | 2022-09-30 | サノフィ パスツール インコーポレイテッド | 多価肺炎球菌多糖体-タンパク質コンジュゲート組成物およびその使用方法 |
EP4051696A1 (en) | 2019-11-01 | 2022-09-07 | Pfizer Inc. | Escherichia coli compositions and methods thereof |
BR112022015796A2 (pt) | 2020-02-21 | 2022-10-11 | Pfizer | Purificação de sacarídeos |
CA3173729A1 (en) | 2020-02-23 | 2021-08-26 | Pfizer Inc. | Escherichia coli compositions and methods thereof |
WO2022084852A1 (en) | 2020-10-22 | 2022-04-28 | Pfizer Inc. | Methods for purifying bacterial polysaccharides |
MX2023004912A (es) | 2020-10-27 | 2023-05-16 | Pfizer | Composiciones de escherichia coli y metodos de las mismas. |
EP4240410A1 (en) | 2020-11-04 | 2023-09-13 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines |
US20220202923A1 (en) | 2020-12-23 | 2022-06-30 | Pfizer Inc. | E. coli fimh mutants and uses thereof |
TW202245835A (zh) | 2021-02-04 | 2022-12-01 | 美商默沙東有限責任公司 | 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物 |
JP2024517780A (ja) | 2021-05-03 | 2024-04-23 | ファイザー・インク | 細菌およびベータコロナウイルス感染症に対するワクチン接種 |
WO2022234416A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Pfizer Inc. | Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections |
TW202306969A (zh) | 2021-05-28 | 2023-02-16 | 美商輝瑞大藥廠 | 包含結合之莢膜醣抗原的免疫原組合物及其用途 |
US20220387613A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-12-08 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
WO2023135515A1 (en) | 2022-01-13 | 2023-07-20 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
WO2023161817A1 (en) | 2022-02-25 | 2023-08-31 | Pfizer Inc. | Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides |
WO2023218322A1 (en) | 2022-05-11 | 2023-11-16 | Pfizer Inc. | Process for producing of vaccine formulations with preservatives |
WO2024084397A1 (en) | 2022-10-19 | 2024-04-25 | Pfizer Inc. | Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections |
WO2024110827A1 (en) | 2022-11-21 | 2024-05-30 | Pfizer Inc. | Methods for preparing conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
WO2024110839A2 (en) | 2022-11-22 | 2024-05-30 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
WO2024116096A1 (en) | 2022-12-01 | 2024-06-06 | Pfizer Inc. | Pneumococcal conjugate vaccine formulations |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8807860D0 (en) * | 1988-04-05 | 1988-05-05 | Connaught Lab | Pertussis vaccine |
ATE205534T1 (de) * | 1988-12-16 | 2001-09-15 | Nederlanden Staat | Pneumolysin-mutanten und pneumokokken-impfstoffe daraus |
DE4133707A1 (de) * | 1991-10-11 | 1993-04-15 | Behringwerke Ag | Verfahren zur reinigung von streptolysin o, intaktes streptolysin o erhaeltlich nach diesem verfahren und seine verwendung |
GB9216351D0 (en) * | 1992-07-31 | 1992-09-16 | Wellcome Found | Vaccine production |
US5565204A (en) * | 1994-08-24 | 1996-10-15 | American Cyanamid Company | Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections |
WO1996023061A2 (en) * | 1995-01-27 | 1996-08-01 | Genencor International, Inc. | Surfactant-based enzyme extraction process |
US5877298A (en) * | 1995-05-04 | 1999-03-02 | Connaught Lab | Acellular pertussis vaccines and methods of preparing thereof |
US5667786A (en) * | 1995-06-07 | 1997-09-16 | Novavax, Inc. | Method for treating tumors with a toxin |
CA2297374A1 (en) * | 1997-07-21 | 1999-01-28 | North American Vaccine, Inc. | Modified immunogenic pneumolysin, compositions and their use as vaccines |
WO2000056360A2 (en) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccine against antigens from bacteriae |
JP4132694B2 (ja) * | 2000-03-10 | 2008-08-13 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 受容体認識部位が保存された生理活性物質の誘導体及びその使用方法 |
GB0022742D0 (en) | 2000-09-15 | 2000-11-01 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
RU2340627C2 (ru) * | 2003-03-13 | 2008-12-10 | ГлаксоСмитКлайн Байолоджикалз с.а. | Способ очистки бактериального цитолизина |
GB0421083D0 (en) | 2004-09-22 | 2004-10-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Purification process |
-
2004
- 2004-03-11 RU RU2005125832/13A patent/RU2340627C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-03-11 AU AU2004219910A patent/AU2004219910B2/en not_active Ceased
- 2004-03-11 PT PT04719447T patent/PT1601689E/pt unknown
- 2004-03-11 MX MXPA05009579A patent/MXPA05009579A/es active IP Right Grant
- 2004-03-11 DE DE602004010376T patent/DE602004010376T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-11 BR BRPI0408094-7A patent/BRPI0408094A/pt not_active Application Discontinuation
- 2004-03-11 CN CN201010157455.6A patent/CN101818185B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-11 NZ NZ541969A patent/NZ541969A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-03-11 WO PCT/EP2004/002641 patent/WO2004081515A2/en active Application Filing
- 2004-03-11 JP JP2006504684A patent/JP4597123B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-11 CA CA2812817A patent/CA2812817C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-11 EP EP04719447A patent/EP1601689B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-11 KR KR1020057017163A patent/KR101052996B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2004-03-11 ES ES04719447T patent/ES2295836T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-03-11 US US10/549,064 patent/US8084235B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-11 CA CA2518669A patent/CA2518669C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-11 DK DK04719447T patent/DK1601689T3/da active
-
2005
- 2005-08-18 IS IS7993A patent/IS2587B/is unknown
- 2005-08-22 EG EGNA2005000491 patent/EG24449A/xx active
- 2005-09-06 NO NO20054134A patent/NO336672B1/no not_active IP Right Cessation
- 2005-09-09 MA MA28487A patent/MA27666A1/fr unknown
-
2006
- 2006-05-24 HK HK06105983.2A patent/HK1086013A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-01-10 CY CY20081100036T patent/CY1107134T1/el unknown
-
2010
- 2010-08-10 AU AU2010212257A patent/AU2010212257B2/en not_active Ceased
- 2010-08-11 JP JP2010180165A patent/JP5683866B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-02-01 IL IL210984A patent/IL210984A0/en unknown
- 2011-08-31 US US13/222,066 patent/US8309327B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-09-27 US US13/628,632 patent/US8815254B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8084235B2 (en) | Purification process for bacterial cytolysin | |
CA2580113C (en) | Purification process for bacterial cytolysin | |
KR101268790B1 (ko) | 백신 | |
ZA200506553B (en) | Purification process for bacterial cytolysin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |