KR100242093B1 - 신경교 유도 신경 영양성 인자 - Google Patents

신경교 유도 신경 영양성 인자 Download PDF

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Abstract

B49 신경교아종 세포의 무혈청 성장조절배지로부터 신경교 유도 신경영양성 인자(GDNF)라고 하는 신규의 신경영양성 인자가 확인되고 유리된다.
GDNF를 클론화하는 쥐 및 인체 유전자가 클론화되어 배열결정된다. 재조합 DNA 방법에 따라 생물학적 활성의 GDNF를 제조하기 위하여, GDNF를 클론화하는 유전자가 벡터로 서브클론화되고 벡터는 숙주세포를 형질전환하는데 이용된다.

Description

[발명의 명칭]
신경교 유도 신경 영양성 인자
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 신경영양성 인자 및 구체적으로는 신경교 유도 신경영양성인자(GDNF , Glial Derived Neurotrophic Factor)에 관한 것이다. 본 발명에는 또한 천연 공급원으로부터의 GDNF의 정제방법 및 GDNF를 코드화하는 쥐 및 인체유전자의 핵산배열은 물론, GDNF를 코드화하는 쥐 및 인체유전자를 클론화하는 방법이 포함된다. GDNF 유전자는 발현 벡터로 서브클론화되고, 벡터는 생물학적 활성 GDNF를 발현하는데 이용된다. 또한 본 발명은 파킨슨씨병과 같은 신경상해 및 신경관련, 질병의 예방 및 치료용으로 GDNF를 사용하는 방법을 포함한다.
GDNF족 신경영양성 인자의 멤버를 식별하는 방법 및 GDNF에 대한 항체가 개시된다. 마지막으로, 환자에게 GDNF를 분비하는 세포를 이식함으로써 신경상해를 예방 또는 치료하는 방법이 기술된다.
[발명의 배경]
신경영양성 인자는 신경계 또는 신경계에 의하여 자극된 비신경 조직에서 발견되는 천연단백질인데, 그 기능은 신경 및 /또는 신경교 세포의 생존을 촉진하고, 표현적 분화(分化)를 유지하는 것이다(바론(Varon) 및 번지(Bunge) 1797. Ann. Rev. Neuroscience 1:327: 퉤넨(Thoenen) 및 에드가(Edgar) 1985. Science 229:238). 이 생리학적 역할 때문에, 신경영양성 인자는 신경세포 퇴화 및 다양한 신경 퇴화성 질병에서 발생하는 분화된 기능의 상실증세를 치료하는데 유용할 수 있다.
특정 신경영양성 인자가 신경장해를 치료하는데 유용할 가능성이 있기 위하여는, 손상된 신경세포류(들)가 그 인자에 대하여 반드시 반응하여야 한다. 상이한 신경영양성 인자는 통상적으로 명백하게 상이한 신경세포류에 영향을 미친다. 따라서, 다양하게 상이한 신경영양성 인자를 가지고 있어서, 상이한 형태의 질병 또는 장해와 함께 발생하는 각각의 손상된 뉴론을 치료하는 것이 바람직하다.
신경영양성 인자는 관련이 없는 다양한 상해에 대한 반응성 뉴론을 보호할 수 있다. 예를들면, 신경영양성 인자, 신경성장인자(NGF)는 축색돌기의 절단에 의하여 발생하는 사망(리치(Rich)등, 1987 J. Neurocytol 16:261: 오토(Otto) 등, 1987 J. Neurosci. 83:156), 배아발육중의 개체 발생적 사망(햄버거(Hamburger) 등, 1984 J. Neurosci 4:767), 및 탁솔(taxol) 또는 시스플라틴(cisplatin)의 투약에 의하여 발생하는 사망(아프펠(Apfel) 등, 1991 Ann Neurol 29:87)으로부터 지각 뉴론의 상당한 부분을 구제한다. 이와 같은 명백한 일반적인 보호기능은, 신경영양성 인자가 실험적 상해에 대한 반응성 뉴론을 보호한다면, 병인이 불명하더라도, 환자의 그들 뉴론의 상해를 포함하는 질병의 치료에 유용할 수 있다는 개념에 도달하게 된다.
알맞는 뉴론 특이성을 지닌다는 점외에도, 소정의 신경영양성 인자는 약제학적 처리용으로 사용되기에 충분한 양을 얻을 수 있어야 한다. 신경영양성 인자는 통상적으로 조직내에 보이지 않을 정도로 소량 존재하기 때문에 (예를 들면, 호퍼(Hofer) 및 바아드(Barde) 1988 Nature 331:261: 린(Lin) 등. 1989 Science 246:1023), 동물조직으로부터 직접 약제학적 양의 신경영양성 인자를 제조하는 것은 불편하다. 하나의 대체방법으로, 신경영양성 인자에 대한 유전자를 선정하고 이 유전자를 재조합 발현 시스템을 구축하기 위한 기초로 이용하여 잠재적으로 무한한 양의 단백질을 제조하는 것이 요망된다.
본 출원의 발명자들은, 파킨슨씨병에서 퇴화하는 흑질(黑質) 도파민 작동성 뉴론의 배아 전구체에 대한 신경영양성 활동에 대한 생물학적 샘플을 스크린하는 방법을 기술한다. 파킨슨씨병 치료에 유용할 수 있는 신경영양성 인자의 식별을 위한 이 생물학적 검정법은, 이전에 기술된 검정법(프리드맨(Friedman) 등, 1987 Neuro. Sci. Lett. 79:65-72, 여기서 참고로 구체적으로 인용한다)을 기초로하여, 본 발명에서 수식되어 역활을 하게 된다. 이 검정법은 도파민 작동성 뉴론에 대한 신경영양성 활용성의 다양한 잠재적 공급원을 스크린하는데 이용되었다. 본 발명은, 이와 같은 공급원의 하나인, 신경교아종 세포주 B49로 부터의 조정배지(슈벨트(Schubert) 등, 1974 Nature 249:224:-27, 여기서 참고로 구체적으로 인용한다)로부터, 정제된 새로운 신경영양성 인자의 특성을 기술한다. 이 세포주로부터의 조정 배지는 도파민 작동성 신경영양성 활성을 지니는 것으로 기존에 보고되어 있다(본(Bohn) 등, 1989 Soc, Neurosci. Abs. 15:277). 이 기존 보고서에서, 신경영양성 활성의 공급원은 정제되거나, 화학적으로 특성부여되거나 또는 조정배지에 존재하는 단일제제의 결과인 것으로 보이지 않았다. 신경상해는, 하나 이상의 신경세포의 생존 및/또는 적절한 기능을 해치는 조건에 의하여 일어난다. 이와 같은 신경손상은 폭넓은 상이한 원인으로부터 발생할 수 있는데, 이들 중 일부를 아래에서 언급한다.
신경상해는 물리적 장해를 통하여 일어날 수 있는데, 물리적 장해는 축색돌기 및/ 또는 상해부위 근처의 신경세포체의 퇴화를 일으킨다. 신경상해는 맥박에서와 같이, 신경계의 부분으로 혈액의 흐름이 일시적 또는 영구적으로 정지하기 때문에도 일어날 수 있다. 신경상해는 또한 각각 암 및 AIDS 화학요법약인 시스플라타늄 및 디데옥시사이티딘(ddC)과 같은 신경독소에 고의로 또는 우연히 노출됨으로써 일어날 수 있다. 또한 신경상해는 당뇨병 또는 신장기능장해와 같은 만성 대사질환 때문에 일어날 수도 있다. 신경장해는 특정 신경집단의 퇴화에 기인하는 파킨슨씨병, 알즈하이머병 및 근위축성 축색 경화증(ALS, Amyotrophic Lateral Sclerosis)과 같은 신경퇴화성 질병 때문에도 일어날 수 있다.
본 출원은 새로운 신경영양성 인자를 기술한다. 신경영양성 인자는 특정신경세포의 정상적인 기능을 촉진 및/또는 다양하게 상이한 형태의 손상에 대하여 상기 신경세포를 보호하는 천연 단백질이다. GDNF가 위에서 구체적으로 지적한 형태를 포함하여, 다양한 형태의 신경상해를 치료하는데 유용할 수 있다는 것을 암시하는 것이 이들 특성이다.
파킨슨씨병은, 경직성, 운동완만증, 지루증, 가속보행, 굽은 자세, 타액분비, 및 ″환약작성양″운동(″pill rolling″ tremor)을 포함하는 독특한 증상군에 의하여 식별된다. 이 병은 전세계에 걸쳐 모든 종족이 직면하고 있으며, 병이 개시되는 나이는 평균 60세이다.
수년간의 모순되는 이론 및 논쟁후에, 파킨슨씨병에 대한 생화학적 기초가 주원인으로 판명되었다.(베르그만(Bergman), 1990 Drug Store News, 12:IP19를 참조할 것). 파킨슨씨병을 이해하는데 특히 중요한 것은 흑질, 대뇌 기저핵, 및 특히 선조체(線條體)로 알려진 뇌의 영역이다. 중뇌에서 색소성 회백질이 양면으로 쌍을 이룬 층인, 흑질은 도파민 전달과 관련이 되는 반면에, 정상적인 대뇌 기저핵 기능은, 흑질과 연관되며 도파민, 아세틸클로린 및 기타 물질에 의하여 부분적으로 매개되는 피드백 시스템 및 일련의 상호작용을 포함한다.
파킨슨씨병에는, 신경퇴화에 의하여 발생되는 흑질의 도파민 작동성 활성에 있어서 기능 저하현상이 있다. 이것은 도파민 결핍증 및 활성의 균형이 콜린 작동성이 우월한 방향으로 이동하는 결과를 초래한다. 따라서, 아세틸콜린의 농도가 전혀 증가하지 않는다하여도, 이 콜린 작동성 매개체에 의한 중추신경계에 대한 흥분효과(즉, 떨림)는 고갈된 도파민의 억제효과를 압도한다.
지금까지 파킨슨씨병에 대한 가장 효율적인 치료방법은 레보도파(Levodopa)를 경구적 투여하는 것이다. 레보도파는 중추신경계를 침투하여 대뇌 기저핵에서 도파민으로 효소적으로 전환된다. 따라서, 레보도파의 유용성은 뇌에 도파민의 농도를 증가시키는데 있는 것으로 믿어진다. 유감스럽게도, 레보도파나 거의 통상적으로 사용되지 않는 어떤 의약품도 도파민 작동성 뉴론의 퇴화에 의하여 발생하는 질병의 진척을 실제적으로 제거하지 못한다.
다른 연구자들이 다양한 생물학적 공급원에 도파민 작동성 활성이 존재하는 것으로 보고하고 있다. 스프링거(Springer) 등의 PCT 출원 W091/01739호에서, 도파민 작동성 신경영양성 활성이 말초신경계의 세포로부터 유도된 추출물에서 확인되었다. 확인된 활성체는 정제되지 않았으나, 10,000달론 이하의 분자량을 지닌 인자가 있는 것으로 생각되었다. 그 인자는 쥐 좌골신경으로부터 유리되었으나, 이것은 역시 상기 좌골신경에서 발견되는 CNFF는 아니었다(린(Lin) 등, 1989 Science 246:1023).
아펠(Appel) 등의 미합중국 특허 제 5,017,735호에서, 도파민 작동성 활성이 꼬리형 내피조직의 추출물에서 확인되었다. 역시 활성을 일으키는 인자는 정제되지 않았으며 분획을 함유하는 활성체의 겉보기 분자량은 비교적 작았다. 니이지마(Niijima) 등, 1990 Brain Res. 528:151-154(성체 쥐의 뇌의 화학적으로 구심로차단된 선조(線條)): 로(Lo) 등, 1990 Soc. Neurosci. Abstr. 16:809 (선조체 유도 신경영양성 인자)도 참조할 것. 또한, 뇌유도 신경영양성 인자(BDNF), 및 산성 및 염기성 선유아세포 성장인자와 같은, 기타의 신경영양성 인자도 도파민 작동성 활성을 지니는 것으로 알려졌다.
본 발명의 GDNF는, 쥐 태아 중뇌로부터 유리된 도파민 작동성 신경세포의 세포배양주에서의 기능적 활성 및 생존을 촉진하는 능력을 근거로하여 유리되었다. 이들 도파민 작동성 신경세포는, 파킨슨씨병에서 퇴화하는 성체 흑질 도파민 작동성 신경세포의 태아 전구체이다. 따라서 GDNF는 파킨슨씨병의 증상을 일으키는 신경퇴화현상을 저하시키는데 유용할 수 있다.
또한 GDNF는 환자의 도파민 작동성 신경세포에 대한 다른 형태의 손상 또는 부적절한 기능을 치료하는데 유용할 수 있다. 이와 같은 손상 또는 기능부전(機能不全) 현상은 정신분열증 및 기타 형태의 정신병에서 일어날 수 있다. 이와 같은 조건에 대한 현행 치료방법은 흔히 도파민 수용체에 약물 활성을 요구하는데, 이것은 이들 수용체 소유 신경집단을 신경자극하는 도파민 작동성뉴론의 부적절한 기능이 질병의 진전과 관련될 수 있다는 것을 암시한다.
다른 신경영양성 인자에 대한 종전의 경험을 기초로하여, GDNF로 치료될 수 있는 새로운 형태의 신경손상이, 이 신경영양성 인자에 대하여 반응하는 다양한 형태의 신경세포로 알려진 것 이상으로 나타났다. 예를 들면, NGF가 알츠하미머병에서 퇴화하는 기저 전뇌 콜린 작동성 뉴론에 대한 신경영양성 인자로 작용한다는 것이 최근 발견되었을 때, 신경성장 인자(NGF)는 단지 알츠하이머병의 치료용으로 잠재적으로 유용한 것으로 판명되었다(윌리암스(Williams) 등, 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9231). 본 발명에는 GDNF로 유용하게 치료될 수 있는 기타 형태의 신경손상을 판단하는 방법이 마련되어 있다.
페트릭 에비셔르(Patrick Aebischer) 및 공동 연구자들은 소정의 환경에서 의약품을 운반하는 수단으로서 유용한 반투과성의, 이식 가능한 막을 사용하는 방법을 기술하고 있다. 예를 들면, 그들은 신경전달물질 인자를 분비하는 세포의 캡슐화 및 그와 같은 기구를 파킨슨씨병을 앓고 있는 환자의 뇌에 이식하는 방법을 제안하고 있다. 에비셔르 등의 미합중국 특허 제 4,892,538호; 에비셔르 등의 미합중국 특허 제 5,011,472호; 에비셔르 등의 미합중국 특허 제 5,106,627호; PCT 출원 WO 91/10425; PCT 출원 WO 91/10470; 빈(Winn) 등. 1991 Exper. Neurol. 113:322-329; 에비셔르 등, 1991 Exper. Neurol. 111:269-275; 및 트레스코(Tresco) 등, 1992 ASAIO 38:17-23을 참조할 것.
[발명의 요약]
본 발명은 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자(GDNF)에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 구체예에서, B49 조절 배지의 비활성보다 24,000배 이상 비활성이 큰 실질적으로 정제된 GDNF가 얻어진다. 실질적으로 정제된 GDNF는 약 12,000TU/㎍이상의 비활성을 갖는다.
본 발명의 실질적으로 정제된 GDNF는 비환원 SDS-PAGE 상에서의 겉보기 분자량이 약 31~ 42 kD 이며 환원 SDS-PAGE 상에서는 약 20 ~ 30 kD이다. 실질적으로 정제된 GDNF는 실질적으로 하기 아미노산 배열(SEQ ID NO:1)을 포함하는 아미노 단말 배열을 갖는다:
(Ser)-pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala-Leu-Pro-Arg-Arg-Glu-(Arg)-Asn-( )-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-(Ser)-Pro-(Asp)-(Asn)
쥐 GDNF의 성숙 및 “프레-프로”(“pre-pro”)형 아미노산 배열은 제13도 및 14도(SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4)에 제시된 것과 같다. 성숙인체 GDNF의 아미노산 배열은 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와 같다. 인체 GDNF의 프레-프로형 아미노산 배열은 제19도(SEQ ID NO:5) 및 22도(SEQ ID NO:8)에 제시된다.
본 발명의 하나의 관점은 다음 단계를 포함하는, 정제된 GDNF를 얻는 방법이다.: 1) B49 신경 교아종 세포의 무혈청 성장 조절배지의 제조; 2) 조절배지의 농축; 3) 농축 조절배지에 대하여 헤파린 세파로우즈 크로마토 그라피를 수행; 4) 상기 헤파린 세파크로우즈 크로마토그라피로부터 얻어진 분획에 대하여 고속 단백질 액상 크로마토그래피를 수행; 및 5) 상기 고속 단백질 액상 크로마토그라피로 얻어진 분획에 대하여 가역상 고속 액체 크로마토그라피를 수행. 하나의 구체예에서, 정제된 GDNF를 얻는 방법은 또한 단계를 다시 포함한다; 6) 가역상 고속 액체 크로마토그라피에 의하여 얻어진 분획을 예비 SDS-PAGE 처리; 및 7) 예비 SDS-PAGE에 의하여 얻어진 분획에 대하여 가역상 고속 액체 크로마토그라피를 수행.
또한, 기술되는 것은, B49 세포주로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터의 쥐 GDNF 유전자를 클론화하는 것이다. 성숙 및 프레-프로형 쥐 GDNF를 코드화하는 핵산배열이 제13도(SEQ ID NO:3)에 제시된다. GDNF에 대한 코드화 인체 유전자를 얻는 방법도 개시된다. 성숙 인체 GDNF를 코드화하는 핵산배열은 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와 같다. 인체 GDNF의 프레-프로 세그먼트의 최초 50 아미노산은 제22도(SEQ ID NO:8)에 제시된 바와 같다.
본 발명은 또한, 약제학적으로 적절한 캐리어내의 유효한 양의 정제된 GDNF를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 또한 해당 환자에게 치료적으로 유효한 양의 GDNF를 투여하는 것을 포함하는 신경상해의 예방 또는 치료방법을 기술한다. 바람직한 구체예에서, 신경상해는 파킨슨씨병 또는 손상된 즉 부적절하게 작용하는 도파민 작동성 신경세포이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, GDNF는 여기에 기술된 바와 같이 GDNF에 대한 코드화 유전자를 이용하여, 재조합 DNA 방법에 의하여 제조된다.
본 발명은, 성숙형 또는 프레-프로형 GDNF에 대한 코드화 핵산배열에 조작적으로 연결된 발현 조절 인자를 포함하는 생물학적 활성 GDNF 제조용 벡터 및 이와 같은 벡터에 의하여 전환된 숙주세포를 포함한다. 또한 하기 단계를 포함하는 GDNF의 제조를 위한 재조합 DNA 방법도 포함된다: DNA 배열을 발현하는데 필요한 조절 인자를 포함하는 발현 벡터로 GDNF에 대한 코드화 DNA 배열을 서브클론화; 상기 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환; 벡터의 증폭 및 GDNF의 발현을 위한 조건하에서 숙주세포를 배양; 및 GDNF의 수확.
다음 단계를 포함하는, GDNF 재조용 재조합 DNA 방법이 기술된다; 벡터의 증폭 및 GDNF의 발현을 위한 조건하에서 본 발명의 숙주세포를 배양; 및 GDNF를 수확.
본 발명은 GDNF를 인식하는 실질적으로 정제된 항체를 내포한다. 또한 포함되는 것은, 신경교 유도 신경영양성 인자를 분비하는 세포를 해당 환자의 체내에 이식하는 것을 포함하는, 신경상해의 예방 또는 치료방법이다.
마지막으로, 본 발명은 반투막 및 상기 반투막내에 캡슐화된 GDNF를 분비하는 세포를 포함하는 기구를 환자에게 이식함으로써 신경상해를 예방 또는 치료하는 기구를 포함하는데, 상기 반투막은 GDNF에 대하여는 투과성이며 세포에 대하여 해로운 인자에 대하여는 환자로부터 불투과성이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 농축된 B49 신경교아종 세포 무혈청 성장 조절배지 용액에 대한 헤파린 세파로우즈 크로마토그라피 결과를 나타낸다. 이 결과는 용출액 O.D290(―), 전도도(-△-), 및 TU로 표시된 GDNF활성(-o-)을 나타낸다.
막대기로 표시된 분획은 다시 정제하기 위하여 수집되었다.
제2도는 수집된 제1도의 분획에 대한 FPLC 수퍼로즈(superose) 크로마토그라피의 결과를 나타낸다. 이 결과는 O.D.280(―) 및 TU로 표시된 GDNF활성(-o-)을 보여주고 있다.
제3도는 제2도의 분획 14에 대한 RP-HPLC의 결과를 나타낸다. 이 결과는 O.D.214및 하부에 TU로 표시된 GDNF활성을 보여주고 있다.
제4도는 상기 제3도로 부터 얻어진 분획 3 ~ 10에 대한 은착색 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다. 레인 S는 분자량 표준체를 함유한다.
제5도는 제4도의 분획 5 및 6에 대한 예비 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. GDNF 활성(TU)에 대하여 겔 슬라이스가 시험되었다. 겔 슬라이스는 또한, 분자량 마커(Amersham사 제조)를 사용하여, 분자량과 관련되었다.
제6도는 제5도의 분획 16~23에 대한 RP-HPLC의 결과를 나타낸다. 크로마토그람 A는 샘플을 함유하며, 크로마토그람 B는 대조물이다(블랭크 레인에 해당 슬라이스로 부터 수집된 겔 추출물).
제7도는 제6(a)도(레인1)의 피크 3 및 분자량 대조물(레인 S)의 은착색 SDS-PAGE에 의한 분석결과를 나타낸다.
제8도는 정제된 GDNF로 얻은 아미노말단 아미노산 배열을 나타낸다. 빈 괄호는 채택된 배열 결정 기술을 사용하여 아미노산이 결정될 수 없는 위치를 가리킨다. 괄호안에 잔기가 주어진 경우, 그 잔기의 확실성에 관하여는 일부 불확실성이 있다. 완전한 올바른 아미노말단 아미노산 배열은 하기 제19도에 도시된다.
제9도는 트립신 다이제스트 정제 GDNF에 대한 RP-HPLC의 결과를 나타낸다. 크로마토그람 A는 샘플을 함유하여, 크로마토그람 B는 대조물(트립신만을 함유)이다.
제10도는 제9도의 피크 37에 대한 RP-HPLC 후에 브롬화시안으로 처리한 결과를 나타낸다.
제11도는 제10도의 피크 1의 환원 생성물에 대한 RP-HPLC 결과를 나타낸다.
제12도는 정제된 GDNF로부터 얻은 내부 아미노산 배열을 나타낸다.
제13도는 B49 세포 라이브러리 cDNA 클론ZapII76.1로 부터 유도된 쥐 GDNF에 대하여 얻어진 핵산배열을 나타낸다. 또한 GDNF에 대한 추정 아미노산 배열이 도시된다. 성숙 GDNF에 대한 코드화 핵산 배열은 밑줄이 그어져 있다. 가장 바람직한 프레-프로 형태의 GDNF의 아미노말단 배열은 ＊로 표시된다.
제14도는 성숙 GDNF의 추정 아미노산 배열을 나타낸다.
제15도는 닭 태아 모양체 신경절로부터의 부교감 뉴론의 생존을 촉진하기 위한, 정제된 B49 세포 GDNF 및 인체 재조합 CNTF의 결과를 나타낸다. Y축상의 증가하는 광학밀도는 증가하는 뉴론의 생존율을 나타낸다. X축은 각 신경영양성 인자의 감소하는 농도를 나타낸다. 대조로 표시된 곡선은, GDNF로 표시된 곡선을 발생시키기 위하여 사용된 GDNF를 함유하는 것에 인접한, 동일 용적의 불활성 HPLC 분획이다.
제16도는 닭 태아 교감사슬 신경절로부터의 교감 뉴론의 생존을 촉진하기 위한, 정제된 B49 세포 GDNF 및 인체 재조합 CNTF의 결과를 나타낸다. Y축상의 증가하는 광학 밀도는 증가하는 뉴론 생존율을 나타낸다. X축은 각 신경영양성 인자의 감소하는 농도를 나타낸다. 대조로 표시된 곡선은, GDNF로 표시된 곡선을 발생시키기 위하여 사용된 GDNF를 함유하는 것에 인접한, 동일 용적의 불활성 HPLC 분획이다.
제17도는 배양주에서 간뇌 도파민 작동성 뉴론에 의하여 도파민 섭취를 증진시키는 능력에 대한 COS 세포조절 매질의 생물학적 분석결과를 나타낸다. Y축은 라디오라벨된 도파민 섭취량을 나타내며, X축은 농축된 COS 세포배지의 양을 나타낸다. B-1으로 표시된 곡선은, GDNF의 발현을 위하여 적절히 배열된 GDNF 유전자로 형질 이입된 COS 세포로부터의 무혈청 조절배지를 나타낸다. C-1으로 표시된 곡선은, GDNF의 발현을 방지하는 반대 배열의 GDNF 유전자로 형질이입된 COS 세포로부터의 무혈청 조절배지를 나타낸다.
제18도는 닭 태아 교감사슬로부터의 교감 뉴론 배양주에서 생존율을 증진시키는 능력에 대한 COS 세포 조절 매질의 생물학적 분석 결과를 나타낸다. Y축은 배양에 의하여 감소된 MTT 염료양을 나타내는데, 이것은 뉴론 생존율과 비례한다. X축은 농축된 COS 세포 배지의 증가하는 희석율을 나타낸다. GDNF로 표시된 곡선은 GDNF의 발현을 위하여 적절히 배열된 GDNF 유전자로 형질이입된 COS 세포로부터의 무혈청조절배지를 나타낸다. 대조로 표시된 곡선은 GDNF의 발현을 방지하는 반대 배열의 GDNF 유전자로 형질이입된 COS 세포로부터의 무혈청 조절배지를 나타낸다.
제19도에는, 성숙 인체 GDNF에 대한 코드화 유전자의 전부분을 포함하여, 하기 실시예 2C에 기술된 바와 같은, 인체 GDNF로 부터 얻어진 핵산 배열의 일부를 나타낸다. 또한, 성숙 인체 GDNF에 대한 추정 아미노산 배열도 도시된다. 성숙 인체 GDNF에 대한 아미노산 배열은 밑줄이 그어져 있다.
제20도는 도파민 섭취 및 도파민 작동성 뉴론에서 면역착색하는 티로신 히드록시다제(TH)를 자극하는 GDNF의 능력을 나타낸다. 배양주는 실시예 1B에 기술된 바와 같이 구축되었다. GDNF는 평판배양일에 가해졌으며 시험관내에서 9일 후에 다시 가해졌다. A.3H - DA 섭취는 시험관에서 15일 후에 측정되었다. B. 배양주는 시험관내에서 16일 후에 4% 파라포름알레히드로 고정되었으며, 광범위하게 세척되고, 0.2% 트리톤 X-100으로 투과되며, TH(Eugine Tech International 사 제조)에 대한 폴리클론성 항체로 착색되었다. 벡타스타인(Vectastain) ABC 키트(Vector Labs(벌링게임, 캘리포니아주)사 제조)를 이용하여 1차 항체 결합이 가시화되었다.
제21도는 도파민 작동성 뉴론에 대한 GDNF의 특이성을 나타낸다. 실시예 1B에서와 같이 배양주가 구축되었다. GDNF는 평판배양일에 첨가되었다. A.3H-DH 섭취는 시험관에서 7일 후에 측정되었다. B.14C-GABA 섭취는 실험관내에서 8일 후에 측정되었다. 섭취 완충액이, 5.6mM 글루코스, 1.3mM EDTA, 10 μM아미노-옥시아세트산(GABA의 분해를 방지하기 위한), 2mM β-알라닌(GABA의 세포교 섭취를 억제하기 위한), 및 0.1 μM14C-GABA(150mC/mmole, New England Nuclean(보스톤, 마사츄세츠주)사 제조)를 함유하는 pH7.4, 크레브-링거(Kreb-Ringer) 인산염 완충액으로 구성되는 것을 제외하고는, 세포는3H-DH 섭취에 대하여서와 같이 배양 및 처리되었다. GABA 뉴론으로의14C-GABA 섭취 억제제인, 1mM 디아미노부티르산(DABA) 존재하에,14C- 섭취는 10%로 감소되었다. DABA 존재하의 대조 값은 실험치로부터 공제되었다.
제22도는 인체 프레-프로 GDNF의 아미노산 1~50의 코딩 배열을 포함하여, 하기 실시예 2D에 기술된 바와 같은, 인체 GDNF에 대하여 얻어진 핵산 배열의 일부를 나타내고 있다. 또한, 인체 프레-프로 GDNF의 최초 50 아미노산에 대한 추정 아미노산 배열이 묘사된다. 제19도에 주어진 코딩 배열 정보와 함께, 이 정보는 인체 프레-프로 GDNF에 대한 완전한 코딩 배열, 및 인체 프레-프로 GDNF 단백질에 대한 추정 아미노산 배열을 제공한다.
제23도는 하기 실시예 2D에서 기술한 바와 같이, pBSSK-λ3AluI의 플라스미드내의 SacII 및 PstI 부위의 지도를 나타낸다.
제24도는 도파민 작동성 뉴론에 대한 GDNF의 특이성을 나타낸다. 배양주는 실시예 1B에 설명된 바와 같이 구축되었다. GDNF는 평판배양일에 첨가되었으며, 섭취는 시험관내에서 6일 후에 측정되었다. A는 도파민 섭취를, B는 세로토닌 섭취를 나타낸다.
제25도는, 환원조건하에서 수행된, 재중첩 전에 S-세파로우즈 칼럼상에 재중첩되지 않은 GDNF를 함유하는 세균 추출물의 크로마토크라피로부터 얻은 분획의, 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 착색 SDS-PAGE를 나타낸다(실시예 6C 참조). 레인 2~8은 칼럼 용출액으로부터의 연속적인 분획을 나타낸다. GDNF에 대하여 부유화된 분획 3~5는 재중첩을 위하여 수집되었다.
레인 1은 분자량 표준체이다(SDS-70L, Sigma사 제조).
제26도는, 재중첩 전(레인6 및 13), 재중첩 후(레인2)와 재중첩 및 150mM 2-메르캅토에탄올로의 계속되는 역환원 후(레인 5)의, GDNF 용액의 쿠마시 블루 착색 SDS-PAGE를 나타낸다. 재중첩 전 및 역환원 후의 물질은 약 16kDa의 단량체로서 이동한다. 성공적인 재중첩 후의 GDNF는 약 30kDa의 2량체로서 이동한다(환원없이)(실시예 6C 참조). 레인 15는 분자량 표준체이다(SDS-70L, Sigma사).
제27도는 배양주에서 닭 태아 교감 뉴론의 생존율을 촉진시키는 능력을 측정하는, 재중첩 GDNF를 이용한 생물학적 분석의 결과를 나타낸다. 생물학적 분석 공정은 실시예 4A에 기술된 바와 같다. Y축상의 광학밀도(생존 뉴론의 수에 비례)가 X축상의 GDNF 농도(쿠마시 블루 착색 SDS-PAGE 겔의 레이저 비중주사(走査)에 의하여 측정)에 대하여 플롯트 된다. 닭 태아 교감 뉴론 생존에 대한 재중첩 GDNF의 계산된 ED50은 약 3ng/ml이다.
제28도는, 쥐 태아 간뇌의 배양주에서 흑질 도파민 작동성 뉴론에 의한 도파민 섭취능력을 증진시키는 능력을 측정하는, 재중첩 GDNF 를 이용한 생물학적 분석결과를 나타낸다. 생물학적 분석 공정은 실시예 1B에 기술된 바와 같다. Y축상의 도파민 섭취가 X축상의 GDNF 농도에 대하여 플롯트 된다. 이들 배양주에서 증가되는 도파민 섭취에 대한 재중첩 GDNF의 계산된 ED50은 약 3pg/ml이다.
[바람직한 구체예의 상세한 설명]
본 발명은 바람직한 구체예에 관하여 상세히 언급하고자 하는데, 이는 하기 실시예와 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역활을 한다.
본 발명의 이전에는, GDNF가 분리된 생물학적 활성물질 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재하는 것으로 확인되지 않았다. 여기에 기술한 바와 같이, GDNF의 물리적, 화학적 및 생물학적 특성; 그 용도; 제조방법; GDNF를 함유하고 있는 유용한 조성물; GDNF에 대한 코드화 핵산배열; 상기 핵산 배열을 함유하는 벡터; 상기 벡터에 의하여 전환된 숙주세포; 그 재조합 기술에 의한 제조방법; 및 본 발명의 기타 관점과 함께, GDNF에 관한 상세한 설명이 제공된다.
GDNF는 신경교 세포에서 확인되거나 그로부터 얻을 수 있는 단백질로서, 신경영양성 활성을 나타낸다. 좀더 구체적으로는, 흑질 도파민 작동성 뉴론의 태아 전구체상에 도파민 섭취를 증진시키는 능력 및 또한 교감 및 부교감 신경세포의 생존율을 촉진시키는 능력으로 부분적으로 특징지워지는 도파민 작동성 신경영양성 단백질이다. 실질적으로 정제된 GDNF는 다시 다음의 몇가지 방법으로 특징화된다.
1. 비활성이 최소한 약 12,000 TU/ μg.
2. 환원 SDS-PAGE 상의 분자량이 약 20~23 kD이다.
3. 비환원 SDS-PAGE 상의 분자량이 약 31~42 kD이다.
4. 비활성이 B49- 조절배지의 비활성보다 적어도 약 24,000배가 크다.
5. 간뇌 배양주에서 티로신 히드록시라제 면역반응성을 상향 조절하는 능력이 있다.
6. 제8도에 도시한 바와 같은 아미노말단 아미노산 배열을 갖는다(SEQ ID NO:1).
7. 제12도에 도시한 바와 같은 내부 아미노산 배열을 갖는다(SEQ ID PAGE:2).
본 발명의 GDNF는 아래에서 상세하게 보다 완전히 기술된다. 본 발명은 이와 같은 관점은, 제8도에 주어진 배열(SEQ ID NO:1)과 동일하거나 또는 실질적으로 상동성인 아미노 말단 아미노산 배열을 갖는 임의의 도파민 작동성 신경영양성 단백질을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 또한 제12도에 주어진 배열(SEQ ID NO:2)과 동일하거나 또는 실질적으로 상동성인 내부 아미노산 배열을 지닌 임의의 도파민 작동성 신경영양성 단백질도 포함한다.
본 발명은 여기서 신경교 유도 신경영양성 인자(GDNF)로 정의된 신규의 도파민 작동성 신경영양성 단백질을 포함한다. GDNF는 B49 신경 교아종 세포의 무혈청 성장 조절배지에서 확인되고, 그로부터 실질적으로 정제된 형태로 유리되어 왔다.
GDNF는 정제되어 특성이 부여되었으며, 정제된 물질의 부분적인 아미노산 배열이 얻어졌다. 얻어진 부분적인 아미노산 배열을 기초로 하여, GDNF의 재조합 제조에 이용될 수도 있는 쥐 cDNA 클론을 얻기 위하여 DNA 프로우브가 고안되었다. 이와 같은 클론의 핵산배열 및 쥐 GDNF의 추정 아미노산 배열이 제13도(SEQ ID NO:3) 및 제14도(SEQ ID NO:4)에 도시된다.
GDNF의 아미노 말단 아미노산 배열이 결정되어 제8도에 도시된다(SEQ ID NO:1). GDNF의 내부 아미노산 배열의 일부분도 결정되어, 제12도에 도시된다(SEQ ID NO:2). 정제된 GDNF는 비환원성 조건하에서, SDS-PAGE 상에서 약 31~42 kD의 겉보기 분자량을 가지며, 환원성 조건하에서는, SDS-PAGE 상에서 20~23 kD이다. 이와 같은 이론에 제한을 받는 것은 아니나, 이 정보는, GDNF가 그 천연 발생 상태에서 글리코실화된, 디술피드-결합 2량체라는 것과 일치한다는 것을 암시한다.
하기 실시예 6C에서 보다 상세히 기술된 바와 같이, 세균 발현 시스템에서 인체 GDNF를 발현시킴으로써, 재조합 인체 GDNF 즉 rhGDNF를 제조하게 된다. 발현 후 유리된 물질은 필수적으로 생물학적 불활성이며, 단량체로서 존재한다. 재중첩에 따라, GDNF는 생물학적 활성의 디술피드-결합 2량체로 존재한다. 따라서 GDNF는 그 천연적인, 생물학적 활성 형태의 디술피드-결합 2량체이다. 그러나 본 발명은 그 단량체 및 2량체와 생물학적 활성 및 비활성 형태의 GDNF 모두를 포함한다.
인체 GDNF에 대한 코드와 게놈 DNA 유전자를 클론화하기 위하여, 쥐 GDNF의 핵산배열을 기초로 하여 프로우브가 마련되었다. 성숙 GDNF 코드화 인체 유전자 및 인체 성숙 GDNF의 아미노산 배열이 제19도에 제시된다(SEQ ID NO:5).
GDNF는 또한, 하기 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 흑질 도파민 작동성 뉴론의 태아 전구체에 대한 도파민 섭취를 증진시키는 능력으로 특성이 부여될 수 있다. GDNF는 다시, 하기 실시예 4에서 기술한 바와 같이, 교감 및 부교감 신경세포의 생존율을 촉진시키는 능력에 의하여 특성이 부여될 수 있다.
GDNF는 추가로, 간뇌 배양에서 티로신 히드록시라제 면역 반응성을 상향조절하는 능력에 의하여 특성이 부여될 수 있다. 이 특성의 일례가 실시예 1E에 기술되며 제20도에 도시된다. 또한, GDNF는 일반적인 뉴론에 비하여 도파민 작동성 뉴론에 대하여 일부 특이성을 보이는 것으로 나타났다.
예를 들면, 이와 같은 현상은 r-아미노부틸산(GABA)를 함유하는 뉴론에서의 GABA 섭취에 대한 제한된 효과에 의하여 증명되었다. 이것도 실시예 1E에 기술되고 제21도에 도시된다. GDNF는 또한, 세로토닌 작동성 뉴론에서의 세로토닌 섭취에 대하여도 제한된 효과를 지니는 것으로 밝혀졌다. 이것은 실시예 1E에 기술되고 제24도에 도시된다.
본 명세서 전반을 통하여, 신경교 유도 신경영양성 인자에 관한 모든 언급은, 여기서 설명되고 특성이 부여된 GDNF와 실질적으로 상동성이며 생물학적으로 균등한 임의의 공급원의 신경영양성 인자를 가리키는 것으로 이해하여야 한다. 쥐 및 인체 단백질 사이의 상동성 정도는 약 93%이며, 모든 포유동물 GDNF는 비슷하게 상동성의 정도가 높다. 이와 같은 GDNF들은 그 생물학적 활성 형태의 2량체로서 존재한다.
본 발명은 여기에 기술된 바와 같이 절단된 형태의 천연발생 및 재조합 GDNF는 물론 글리코실화 및 비글리코실화 형태의 GDNF를 포함한다. 다른 구체예에서, GDNF는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 기타의 반복 폴리마 성분의 부착에 의하여 수식된다. 본 발명은 또한 아미노 말단 메티오닌 잔기를 함유하는 세균 발현 시스템에서 재조합 기술로 제조된 GDNF도 포함된다.
본 명세서 및 특허청구의 범위 전반을 통하여 사용된 “생물학적으로 균등한”이라는 것은 유사한 양상으로 일부 또는 모든 동일한 신경영양성 특성을 나타낼 수 있는 본 발명의 조성물을 의미하는데, B49 조절배지로부터 유리된 GDNF와 반드시 동일한 정도일 필요는 없다. 계속되는 명세서 및 특허청구의 범위 전반을 통하여 사용된 “실질적으로 상동성”이라는 것은, 종래에 보고된 임의의 GDNF에 의하여 나타난 것 이상으로 B49 조절배지로부터 유리된 GDNF와 상동성인 정도를 의미한다. 바람직하게는, 상동성의 정도는 70%이상, 가장 바람직하게는 80%이상, 좀 더 바람직하게는 90%, 95% 또는 99% 이상이다. 여기에 기술된 상동성의 비율은, 2개의 배열 중 작은 쪽에서 발견된 아미노산 잔기의 비율로서 계산되는데, 이 2개의 배열은, 여기서 구체적으로 참고로 인용하는, Atlas of Protein Sequence and Structure 5권, 124페이지(1972), National Biochemical Research Foundation, 워싱톤 디.시에서 데이호프(Dayhoff)가 제시한 바와 같이, 100 아미노산 길이에 4개의 갭이 도입되어 배열을 지원할 때 비교되는 배열내의 동일한 아미노산 잔기끼리 정렬시킨다. 또한 실질적으로 상동성인 것에 포함되는 것은, 여기에 기술된 GDNF에 대한 항체와의 교차반응성에 의하여 유리될 수 있거나, 유전자가 여기에 기술된 GDNF에 대한 유전자 또는 유전자의 세그먼트와의 잡종형성을 통하여 유리될 수 있는 임의의 GDNF이다.
본 발명의 바람직한 GDNF는 B49 조절배지로부터 유리되었으며 실질적으로 정제된 형태로 유리되었다. 또 하나의 바람직한 GDNF는 재조합 DNA 기술에 의하여 제조되어 실질적으로 정제된 형태의 GDNF를 산출한다. 본 출원의 목적에 있어서, “순수한 형태”또는 “실질적으로 정제된 형태”는, 여기에 개시된 GDNF를 언급한는데 사용될 경우, GDNF가 아닌 기타의 단백질이 실질적으로 없는 제조물을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 GDNF는 최소한 50% 순수, 바람직하게는 75% 순수 및 좀 더 바람직하게는 80%, 95% 또는 99% 순수하다. 본 발명의 하나의 구체예에서, GDNF 단백질 제조물은 당 분야의 통상적인 한 사람의 숙련자가 별도의 정제단계를 수행함이 없이 그 아미노산 배열의 최소한도 부분을 결정할 수 있을 정도로 실질적으로 정제된 형태의 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, GDNF는 하기 실시예 1에 기술된 바와 같이, B49 조절배지로부터 정제된다. 물론 여기에 제시된 정보에서, GDNF의 기타 공급원도 확인될 수 있으며 그와 같은 공급원으로부터의 GDNF 정제는 일반적으로 여기에 제시된 정제방법에 의하여 성취될 수 있다는 것은 당 분야의 숙련자에게는 자명한 것이다.
GDNF의 도파민 작동성 활성은 정제방법을 용이하게 하는데 이용된다.
도파민 작동성 신경영양성 활성에 대한 생물학적 분석법이 하기 실시예 1B에 기술된다. 간략하게 말하면, 혈청부유 또는 무혈청 환경조건에서 간뇌세포가 준비된다. 도파민 작동성 활성 시험용 샘플이 탈염되어 연속적으로 세포 배양주에 첨가되고, 접시는 6.5% CO2를 함유하는 가습 분위기 중에서 6일간 37℃로 배양된다. 시험물질의 존재 하에, 배양주는 다음에 3중 수소 도파민(3H-DA)으로 37℃에서 배양된다. 도파민 섭취는 중지되고, 세포는 세척되며, 배양주내에 유지된 3중 수소의 섬광계수에 의하여 도파민 섭취가 분석된다.
GDNF의 정제방법이 하기 실시예 1C에서 상세히 기술된다. 정제공정이 표 1에 상세히 나타난다. 조절배지 출발 물질은, 조절배지가 수집되어 보급될 때, 세포를 무혈청 배지에 2일간 방치함으로써 B49 신경교아종 세포로부터 제조된다. 이 순환공정은 B49 세포의 각 뱃치로부터 조절배지를 3번 수확하게 된다. 조절배지는 원심분리되고, 다음 정제단계 이전에 10배로 농축된다.
여기서 B49 신경교아 세포종의 무혈청 성장조절배지로 규정된 이 조 혼합물제조의 제1단계는, 0.15 N NaCl을 함유하는 pH8.0, 50mM NaPi 완충액으로 평형화된 헤파린 세루로우즈 칼럼상에 조절배지를 도입하는 것이다. 1.5 N NaCl을 함유하는 pH8.0, 50mM NaPi로 제조된 계층별 완충액이, 용출현상이 안정화된 후 칼럼에 도입된다. 이 크로마토그라피로부터의 분획의 GDNF 활성을 측정하고, GDNF 활성을 지닌 분획들을 다음 단계의 정제용으로 수집하였다.
수집된 분획은, 0.5 N NaCl을 함유하는 pH7.4, 50mM NaPi 완충액의 용매 완충액을 지닌, 수퍼로즈(Superose) 칼럼상에서 고속 단백질 액체 크로마토그라피(FPLC) 처리되었다. 다시 한번, 얻어진 분획의 GDNF 활성이 측정된다. 이 공정으로부터의 단일 분획은 다음에 산성화되어 C-8 가역상 고속 액체 크로마토그라피(HPLC) 칼럼상에 적제된다. GDNF 활성을 지니는 것으로 확인된 분획은 다음 단계의 정제 및 단백질 배열 결정을 위하여 수집된다. 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 이 시점에서 얻어진 GDNF는 조절배지보다 약 24,000배의 비활성을 갖는다. 이 시점에서 얻어진 단백질의 아미노산 말단 배열 결정은 제8도에 도시한 바와 같은 아미노 말단 배열을 제공한다(SEQ ID NO:1).
HPLC로부터 얻어진 GDNF의 다음 정제단계는 GDNF 활성을 지닌 분획에 대하여 예비 SDS-PAGE를 수행함으로써 이루어진다. 분획을 함유하는 단백질에 글리세롤 및 SDS를 함유하는 완충액이 첨가되고, 용액은 비환원 15% SDS-PAGE 상을 주행하며 2시간 동안 10℃, 40mA/겔에서 전기 영동이 수행된다. 약 30~42 kD의 분자량에 해당하는 겔부분은 생물학적 검정에 의하여 GDNF 활성을 지니는 것으로 밝혀졌다. SDS-PAGE 로부터 유리된 물질의 제2 HPLC 크로마토그라피 결과는, 제6도에 도시한 바와 같이, 단일 피크의 GDNF를 산출한다.
[표 1]
예비 SDS-PAGE 전후의 HPLC로부터 얻은 물질에 대한 GDNF의 아미노 말단 배열이 측정되었다. 정제된 GDNF의 아미노산 배열을 얻기 위하여 이용된 공정이 실시예 1D에 제시된다. 아미노 말단 배열은 가스상 단백질 시퀀서(Sequencer)로 얻어진다. 내부배열은, 예비 SDS-PAGE에 의하여 더 이상 정제되지 않은 HPLC에 의하여 얻어진 물질로부터 얻어진다. 내부 아미노산 배열은 트립신으로 정제된 GDNF를 배양함으로써 얻어진다. 얻어진 트립신 단편은 HPLC에 의하여 분리된다. 하나의 단편이 처리되지 않은 단백질의 아미노 말단 배열의 첫째 13 아미노산 잔기를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 제2단편은 CNBr로 처리되고, HPLC로 정제되고, 환원되어 다시 HPLC로 정제되었다. 얻어진 아미노산 배열은 제12도에 도시된다.(SEQ ID NO:2). 괄호안에 제시된 배열들은 신빙성이 적은 것으로 단정되었다.
본 발명은 GDNF에 대한 유전자 및 GDNF를 코드화하는 것으로 확인된 유전자의 클론화 방법을 포함한다. GDNF에 대한 쥐 및 인체 유전자의 클론화를 위한 상세한 공정이 하기 실시예 2에 제시된다. 당 분야의 숙련자들은 이와 같은 유전자의 기타 클론화하는 방법이 여기에 게시된 내용에 비추어 보아 자명하다는 것을 이해하게 된다. 특히 GDNF를 코드화하는 다른 류로부터의 유전자를 클론화하는 것은 여기에 기술된 개시내용 및 방법의 관점에서 자명하게 된다.
여기에 기술된 쥐 GDNF 유전자는 B49 세포로부터 유리된 폴리 A+ RNA로 부터 구성된 cDNA 라이브러리로부터 얻어지는데, 정제된 GDNF로부터 얻어진 아미노산 배열을 기준으로 하여 퇴화 올리고 뉴클레오티드 프로우브로 스크린된다. cDNA는 표준공정에 의하여 얻어지며, EcoRI-다이제스트 링커를 함유하도록 처리되고, λZapII 클론화 벡터로 삽입된다. 이용된 잡종형성 프로브는32P-표식이며, 아래의 퇴화 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO:7)로 구성된다.
몇개의 포지티브 클론이 얻어지며, 하나의 클론(λZapII76.1)은 DNA 배열결정에 의하여, 퇴화 프로우브를 설계하는데 이용되지 않은 GDNF의 부분을 코드화하는 것으로서 긍정적으로 확인되었다.
λZapII76.1에 함유된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 배열을 얻는 방법이 하기 실시예 2B에 제시된다. cDNA 클론의 5’단부의 최초 877 염기쌍의 뉴클레오티드 배열이 측정되어 제13도에 도시된다(SEQ ID NO:2). 제13도에서, 도시된 클론은, 정제된 GDNF의 아미노 말단을 내포하는 277 아미노산의 오픈 리딩 프레임(ORF, Open Reading Frame)을 함유하며 정제된 GDNF의 분활에 의하여 얻어진 내부 펩티드에 대한 배열과 일치한다.
제14도에 도시된 추정 아미노산 배열(SEQ ID NO:4)은 “성숙 GDNF”에 대한 아미노산 배열을 나타낸다. “성숙 GDNF”라는 것은 B49 조절배지로부터 얻은 정제된 GDNF의 배열이라는 의미이다. 물론, 정제된 GDNF는 2량체 또는 기타 다량체로서 존재할 수 있으며, 글리코실화되거나 또는 다른 방법으로 화학적으로 수식될 수 있다. 성숙 GDNF는, 특히 카르복실 말단 단부로부터의 lys-arg 잔기 5 및 6 잔기의 단백질 분해 공정에 의하여, 카르복실 말단에서 절단될 수 있다. 제13도(SEQ ID NO:2)에 도시된 바와 같은 λZapII76.1 쥐 클론의 핵산배열의 검사결과는, GDNF는 초기로부터 프레-프로 GDNF 폴리펩티드로 번역되며, 이 분자의 “프로”부분 및 시그널 배열의 단백질 분해 처리결과는, B49 조절배지로부터 얻어진 것과 동일한 성숙배열을 지닌 정제된 GDNF를 가져온다는 것을 암시한다. 프레-프로 GDNF 폴리펩티드는 클론의 5’단부(제13도의 위치 50)에 있는 첫째 ATG -- 메티오닌 코드화 -- 코돈에서 개시된다고 추정된다. 여기서 본 발명은, 당 분야의 숙련자가 기본적인 실험실 방법에 의하여 용이하게 얻을 수 있는 보다 완전한 클론 및 여기에 기술된 클론으로부터 번역된 임의의 모든 프레-프로 GDNF 폴리펩티드는 물론, 제13도에 도시된 유전자로부터 번역될 수 있는 임의의 모든 프레-프로 GDNF 폴리펩티드를 포함한다.
제13도에 제시된 쥐 핵산 배열(SEQ ID NO:2)을 검토하여 보면 위치 518 및 538 사이에 위치한 추정 아미노산 배열은 Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu인데, 이것은 하기 실시예 1의 내부배열 부분에서 기술된 방법에 의하여 정제된 성숙GDNF로부터 유도된 펩티드에 대하여 결정된 아미노산 배열과 일치한다. 위치 706에 있는 TGA 정지 코돈은 ORF를 종결시킨다. 정제된 GDNF의 예상길이는 134 아미노산 잔기이며, 이 폴리펩티드의 예상 분자량은 14.931이다. 2개의 잠재적인 N-결합 글리코실화 부위가 위치 425 및 533에서 일어난다. 이들 부위의 일방 또는 양방에서의 글리코실화는 분자의 분자량을 증가시키게 된다.
정제된 성숙 GDNF 배열의 개시점과 일치하는, 위치 281에 존재하는 세린잔기는 배열 Lys-Arg에 의하여 선도되는데, 이 배열은, GDNF의 추정 전구 체형을 처리하여 B49 세포로부터 정제된 형태의 분자를 제조하기 위한 잠재적인 단백질 분해 분활부위를 제공한다. 잠재적인 번역 개시 코돈(ATG)는 배열의 위치 50에서 발생하며 잠재적인 분비 시그널 배열이 근접하여 뒤따른다. 이 ATG에 인접하는 배열은 코작 콘센서스 배열(Kozak 1987 Nucleic Acid Res. 15: 125-48)과 매우 유사하여, 이 ATG가 번역개시 부위로서 이용될 수 있다는 것을 가리킨다. 또한 이 ATG는 cDNA 클론의 배열내에서 최선 두 5’ATG이다. 이 사실은 ATG가 전구체형 GDNF의 번역을 위한 잠재적인 개시부위라는 것을 암시한다.
쥐 cDNA 클론의 뉴클레오티드 배열에 대하여 위에서 지적된 이들 특징은, GDNF가 처음에 프레-프로-GDNF 폴리펩티드로서 번역되며, 이 분자의 “프로”부분 및 시그널 배열의 단백질 분해 처리는, B49 조절배지로부터 정제된 형태의 GDNF를 제조하게된다는 가능성을 제시한다. 그러나, 다른 형태의 GDNF의 발생도 배열 데이터와 일치한다. 예를 들면, 2개의 다른 잠재적 ATG 번역개시가 681 bp ORF 내에서 발생하는데, 하나는 위치 206에서 다른 하나는 242에서이다. 이들 ATG는 정제된 GDNF의 아미노 말단 배열 출발점의 상류에 위치한다. 진핵세포에서 번역개시가 일반적으로 mRNA의 5’-선두 ATG에서 일어나기는 하나 (상기 Kozak 문헌 참조), 번역개시의 일부가 ATG 하류에서 일어나는 예가 있다. 즉 다른 형태의 전구체형 GDNF는 이들 ATG 코돈에서의 번역개시에 의하여 일어난다고 생각할 수 있다. 이들 폴리펩티드를 단백질 분해처리하면, B49 세포조절배지에서 관측된 바와 동일한 형태의 정제된 GDNF를 제조하게 된다. 또한, 오픈 리딩 프레임이 cDNA 클론의 배열의 5’단부를 통하여 연장된다. 따라서 번역의 개시가 cDNA 클론에는 존재하지 않는 상류에서 일어나는 것이 가능하다. 이 결과, GDNF는 여기에 기술된 아미노산 배열 및 추가의 상류 배열을 포함하는 보다 큰 전구체로서 번역된다. 이와 같은 가정적 전구체 형태를 처리하여도 여기에 보고된 정제된 형태의 GDNF를 제조하게 된다. 역전사 효소에 의한 프라이머 연장을 경유하여 GDNF 유전자를 함유하는 mRNA의 5’단부를 배열결정함으로써, 잠재적인 상류 ATG 개시점을 검출하는 것이 가능하다(매니아티스 등의 상기 문헌 참조). 또한, 다른 cDNA 클론이 B49 라이브러리로부터 얻어질 수 있으며, 이들 클론의 5’단부는 배열결정될 수 있다. 최초 ATG의 상류에 위치한 5’mRNA의 크기는 “S1 지도화”(“S1 mapping”)기술 (매니아티스 등의 상기 문헌 첨조) 및/또는 역전사 효소 반응의 프라이머 연장 생성물에 의하여 보다 대략적으로 측정될 수 있다. 정제된 GDNF를 코드화하는 배열을 지닌 다양한 추정형태의 1차 번역 생성물을 생각할 수 있는 반면에, 재조합 파아지 λZapII76.1에 운반된 cDNA 클론에 대하여 여기서 제시된 부분적인 DNA 배열은, B49 세포 조절배지로부터 유리된 정제된 GDNF 폴리펩티드를 구성하는 코드화 배열을 명백하게 규정한다.
하기 실시예 2C에서, GDNF를 코드화하는 인체 유전자의 클론화 방법이 기술된다. 인체 게놈 라이브러리가, 실시예 2B에 기술된 쥐 cDNA 클론으로부터 유도된 프로우브로 스크린된다. 인체 GDNF의 게놈 DNA 클론이 확인되었으며, 성숙 인체 GDNF에 대한 코드화 유전자의 배열이 제19도에 제시된다(SEQ ID NO:5).
인체 GDNF의 유전자에 대한 제19도의 배열은 GDNF의 프레-프로 부분에 대한 전체의 코드화 배열을 제시하지 못한다. 인체 프레-프로 GDNF의 최초 50 아미노산에 대한 코드화 배열을 얻기 위한 공정이 하기 실시예 2D에 기술된다. 얻어진 배열이 제22도에 제시된다(SEQ ID NO:8). 배열을 얻기 위하여 이용된 플라스미드 pB55K-λ3Alul의 지도가 제23도에 도시된다.
본 발명은 GDNF 코드화 핵산 배열을 포함한다. 쥐(제13도)(SEQ ID NO:3) 및 인체(제19도)(SEQ ID NO:5) GDNF를 코드화하는 비교적 높은 상동성의 배열이 여기에 제시된다. 본 발명의 범위에 또한 포함되는 것은 동일한 또는 높은 상동성의 아미노산 배열을 코드화하는 실질적으로 유사한 핵산배열이다. 예를 들면, 대장균과 같은 세균 발현 시스템에서 성숙 GDNF의 발현을 위한 구조를 마련할 때, 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 핵산배열내의 소정 코돈이 잘 알려진 표준 공정에 의하여 대장균에서 보다 용이하게 발현된 코돈으로 치환될 수 있다. 이와 같이 수식된 핵산배열은 본 발명의 범위에 속하게 된다.
특정 핵산배열은 당분야의 숙련자에 의하여 수식될 수 있다. 따라서, 본 발명은 제14도(SEQ ID NO:4) 및 19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 성숙 쥐 및 성숙 인체 GDNF 및 제13도(SEQ ID NO:3)에 제시된 프레-프로 쥐 GDNF 및 제19도(SEQ ID NO:5) 및 22도(SEQ ID NO:8)에 제시된 프레-프로 인체 GDNF에 대한 아미노산 배열을 코드화하는 모든 핵산배열을 포함한다. 본 발명은 또한 이와 같은 핵산배열 잡종을 형성하며 도파민 작동성 활성을 지닌 폴리펩티드를 코드화하는 핵산배열도 포함한다. 본 발명은 또한 도파민 작동성 활성을 지니며, GDNF와 결합하는 항체에 의하여 인식되는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산배열도 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 범위에 속하는 임의의 핵산배열에 조작적으로 연결된 발현 조절 인자를 포함하는 벡터를 내포한다. 본 발명은 또한 본 발명의 범위에 속하는 임의의 핵산배열에 조작적으로 연결된 발현 조절 인자를 포함하는 벡터로 형질전환된 임의의 변종의 숙주세포도 포함한다.
하기 실시예 5에 COS 세포에서의 GDNF 발현이 기술된다. 제13도에 도시된 GDNF 코드화 유전자는, COS 세포와 같은 클론화 유전자 세포의 일시적 발현용으로 고안된 벡터인, 플라스미드 벡터 pSG5로 서브콜론화 된다. 적절한 및 부적절한 배향의 GDNF 유전자를 함유하는 플라스미드가 선택되고 DNA가 COS-7 세포로 형질이입 되었다. 배양 후, 형질 전환 세포를 수집하였다. COS-7 조절배지를, 도파민 작동성 분석 및 교감 신경절 뉴론 분석 양면에서 생물학적 활성을 시험하였다. 적절한 배양으로 GDNF에 대한 유전자를 함유하는 세포로부터의 조절배지는 상기 양면에서의 분석에서 생물학적 활성을 갖는 것으로 밝혀졌는데, 이는 생물학적 활성의 GDNF가 재조합 DNA 기술에 의하여 성공적으로 제조되었음을 가리킨다.
본 발명의 하나의 바람직한 구체예에서, 인체 숙성 GDNF가 세균 발현 시스템에서 재조합 DNA 기술에 의하여 제조된다.
하기 실시예 6에 대장균에서의 인체 GDNF의 발현이 기술된다. 제19도에 도시된 바와 같은 성숙 인체 GDNF를 코드화하는 인체 GDNF 유전자의 부분이 인체 GDNF 구조를 제조하는데 이용되었다. 이와 같은 구조는 하나의 플라스미드 벡터속으로 연결되는데, 이 벡터는 대장균 균주 JM107로 형질전환된다. 형질전환된 숙주세포의 배양 후, 생성된 GDNF를 수확하였다. 기대된 분자량(약 15,000 달론)의 성숙 인체 GDNF가 얻어지고 아미노 말단 배열결정에 의하여, 얻어진 단백질이 성숙 인체 GDNF라는 것이 확인되었다.
대장균에서 발현된 인체 GDNF의 재중첩 및 천연화가 하기 실시예 6C에 기술된다. 기술된 본 발명의 구체예에서, 발현된 단백질 함유 추출물이 재중첩 전에 S-세파로우즈 고속 유동 수치상의 이온교환 크로마토그라피에 의하여 부분적으로 정제된다. 재중첩은 GDNF 함유 추출물에 우선 디티오트레이톨을, 다음에 글루타티온 디솔디움염, 다음에 재중첩 완충액을 첨가함으로써 완수된다. 재중첩된 rhDNF는 실질적으로 완전히 생물학적 활성을 가지며, 그 생물학적 활성형에서 디술피드 결합 2량체로서 존재한다. 재중첩전 및 재중첩된 물질의 환원 후의 GDNF는 단량체 상태로 존재하며 실질적으로 생물학적 불활성을 나타낸다.
GDNF는 다른 발현 시스템에서의 발현에 의하여도 제조될 수 있다. 예를 들면, 제19도에 도시된 바와 같은 성숙 인체 GDNF에 대한 코드화 핵산배열로, 당분야의 숙련자는 다른 발현 시스템에서 GDNF를 제조할 수 있다. 발현 조절 인재에 조작적으로 연결된 GDNF에 대한 코드화 핵산배열을 함유하는 벡터가, 바시러스, 슈도모나스 및 효모를 포함하는 기타 미생물 숙주 세포로 형질전환될 수 있다. 바큘로비루스 발현 시스템도 채택될 수 있다.
위에서 지적한 바와 같이, 본 발명은 환자의 신경장해를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 신경상해 환자에게 치료적으로 유효한 양의 인체 단백질 신경교 유도 신경영양성 인자(GDNF)를 투여하는 방법을 포함한다.
신경세포 및/또는 그 축색돌기의 생존 또는 기능이 손상되면 그 질병 즉 의료적 증상은 신경장해로 간주된다. 바람직한 구체예에서, 다음과 같은 조건의 결과로 이와 같은 신경장해가 발생된다. 1) 상해부위 근처의 축색돌기 및/또는 신경세포체를 변질시키는 물리적 상해; 2) 박동에서의 국소빈혈; 3) 각각 암 및 AIDS 화학요법인 시스플라티늄 및 디데옥시사이티딘(ddc)과 같은 신경독소에 노출; 4) 당뇨병 또는 신장기능 장해와 같은 만성 대사질환; 및 5) 특정 뉴론집단의 변질을 일으키는, 파킨슨씨병, 알즈하이머병 및 근위축성 축색경화증(ALS)과 같은 신경 퇴화성 질병. 신경상해와 관련되는 배타적이 아닌 조건에는 파킨슨씨병, 알즈하이머병 및 근위축성 축색경화증, 당뇨병성 다발성 신경장해, 암 화학요법약 탁솔 또는 시스플라틴 또는 빈크리스틴에 의하여 발생하는 독성 신경장해, AIDS 화학요법약인 ddL 또는 ddC에 의하여 발생하는 독성 신경장해 및 뇌 및 척추의 물리적 장해 및 팔 및 손에 대한 부상 및 절단상해에 의하여 발생되는 신경계에 대한 물리적 장해가 포함된다.
GDNF 제조방법도 여기에 개시된다. 하나의 개시된 방법은 신경교 세포 주 조절배지와 같은 다양한 공급원으로부터 GDNF를 유리하는 방법으로 구성된다. 제2방법은 GDNF 코드화 유전자를 유리하고, 적절한 벡터 및 세포 형태에서 유전자를 클론화, 및 GDNF를 제조하기 위하여 유전자를 발현하는 방법을 포함한다. 일반적으로 재조합 DNA 방법의 본보기인, 후자의 방법은 본 발명의 하나의 바람직한 방법이다. 재조합 DNA 방법은 고순도로 비교적 다량의 단백질을 얻을 수 있기 때문에 바람직한 것이다. 재조합 인체 GDNF는 치료용 조성물의 제조 및 신경상해 치료용으로 가장 바람직한 단백질이다.
본 발명은 GDNF와 아미노산 상동성을 공유하는 단백질을 코드화하는 유전자의 확인 및 클론화하는 수단 및 그와 같이 확인된 모든 단백질을 포함한다.
3개의 신경영양성 인자를 포함하는 포유동물 유전자족이 기술되어 있다. (레이브록(Leibrock)등, 1989 Nature 341:149-152, 마이손피어르(Maisonpierre)등, 1990 Science 247:1446-1451). 이 족을 포함하는 3개의 단백질의 성숙형 [신경성장인자(NGF), 뇌유도 신경영양성 인자(BDNF) 및 뉴로트로핀-3(NT-3)]은 서로 ~50%의 아미노산 동일성을 공유한다. 이들 각각의 단백질에 위치하는 6개의 시스테인 잔기의 위치는 정확하게 보존된다. 구조적으로 유사하기는 하여도, 이들 3개의 단백질은 상이한 조직분포(언포오스(Ernfors)등, 1990 Neuron 5:511~526, 마이손피어르 등, 1990 Neuron 5:501~509, 및 필립스(phillips)등, 1990 Science 250:290--294)및 상이한 시험관내 활성(로젠탈(Rosenthal)등, 1990 Neuron 4:767-773, 위트모어(Whittemore)등, 1987 Brain Res Rev 12:439)을 나타낸다.
GDNF는 기존에 개시된 어떤 단백질과도 현저한 상동성을 나타내지 않으나, GDNF와 실질적인 아미노산 배열 상동성을 가지며, 생체내에서, 상이한 특이적 조직 분포 양상 및/또는 상이한 스펙트럼의 활성을 지닌 신경영양성 인자로서 작용할 수 있는 단백질을 코드화하는 미확인 유전자가 존재할 수 있다. 이와 같은 단백질은 GDNF족 신경영양성 인자의 멤버를 구성한다. 각각 제13도(SEQ ID NO:3) 및 19도(SEQ ID NO:5) 및 전도(SEQ ID NO:8)에 제시된 쥐 및 인체 GDNF 유전자의 DNA 배열은, 이와 같은 가정적인 “GDNF 유전자족”의 신규멤버를 확인하는데 이용될 수 있다.
위에서 지적한 “NFG 유전자족” 또는 “GDNF 유전자족”과 같은 유전자족 멤버의 단백질 생성물 중에서 아미노산 배열을 보존한 결과, DNA 수준에서 상당한 배열의 보존이 있었다. 따라서, 적절한 잡종형성 조건하에서, 핵산 “교차 접종형성”(“cross-hybridization”)이 족내의 유전자 사이에서 일어날 수 있는데, 즉, 한 멤버의 배열로 부터 유도된 핵산 프로우브는, 그 프로우브와 관련이 있으나 동일하지는 않은 배열을 지닌 상이한 족의 멤버로부터 핵산 분자와 안정한 잡종 2원분자를 형성한다(벨츠(Beltz)등, 1983 Methods in Enzymology 100:266-285). 따라서, 쥐, 인체 또는 기타류로부터의 GDNF의 배열을 기초로 한 특이한 또는 변성 DNA (또는 RNA) 프로우브를 제조 및 불완전하게 쌍을 이룬 핵산 2중체를 안정하게 형성하는 조건하에서 다양한 표적 DNA (또는 RNA)들과 잡종형성 실험을 수행함으로써 GDNF에 대한 배열 상동성과 관련되는 유전자를 스크린할 수 있다.
흔히 “감소된 엄증성”(“reduced stringency”)이라고 하는 이와 같은 잡종형성 조건은 문헌 (벨츠 등의 상기문헌, 셈브룩(Sambrook)등, 1989 Molecular Cloning, 2판, Cold Spring Harbor Press사 출판)에 잘 기술되어 있으며, 가장 흔하게는, 수용액에서 수행될 때의 잡종 형성반응의 온도에 있어서의 감소 및/또는 50% 포룸알데히드를 함유하는 용액을 통상적으로 사용하는 잡종형성 시스템에서의 포룸알데히드 농도의 감소를 포함한다. 잡종형성 엄증성을 감소시키는 기타 수단도 기술되어 있으며 채용될 수 있다(셈브룩의 상기문헌). 이들 잡종형성 실험에서의 핵산 표적은 다음을 포함할 수 있다.
1) 인체, 쥐, 또는 임의의 포유동물류를 함유하는 게놈 DNA 라이브러리, 또는 박테리오파아지, 플라스미드, 코스미드, 효모인조염색체를 포함하는 임의의 편리한 벡터, 또는 기타 형태의 벡터로 클론화된 기타류의 DNA;
2) 상술한 임의의 조직으로 부터 얻어진, 또는 상술한 임의의 조직으로부터 얻어진 임의의 형태의 1차 세포의 배양물로 부터, 또는 현존하는 또는 임의의 1차 세포로 부터 제조된 임의의 형태의 안정한 세포주의 배양물로 부터 얻어진 임의의 조직형태로 부터의 RNA로 부터 생성된 cDNA 라이브러리;
3) 제한 효소로 다이제스트되며 겔 전기영동처리 및 고형담체상으로의 전이에 의한 사우턴 블롯트 분석용으로 제조되는 상기 1항에서 설명한 게놈 DNA;
4) 사우턴 블롯트 분석을 위하여 전기영동처리 및 고형 담체로 전이되는, 상기 2항에서 설명한 RNA들, 이와 같은 RNA는 총 세포 RNA 또는 분류된 폴리 A+ RNA를 포함할 수 있다.
5) GDNF에서 발생하는 배열을 기초로한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 채택하며 주형으로서 상기 1~4항의 임의의 핵산 공급원을 채택하는 중합효소연쇄반응(PCR)의 생성물.
일부 경험적으로 결정된 일련의 잡종형성 조건하에서 GDNF 기준 프로우브로 잡종형성하는 것으로 증명되는 임의의 핵산배열이, 당 분야의 숙련자에게 잘 알려진 임의의 다양한 기술에 의하여 클론화되어 배열결정될 수 있으며, 배열 상동성의 정도는 직접적으로 측정되어 GDNF 유전자족의 멤버를 확인할 수 있다. 이와 같은 잡종형성 시도는 NGF 배열을 기초로 한 프로우브 스크린함으로써 NT-3 클론화하는데 이용된다.(카이쇼(Kaisho)등, 1990 FEBS Letters 266:187-191).
GDNF족 멤버를 확인하는 별도의 방법에는 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 GDNF족 멤버로 부터의 배열을 증폭한 후 증폭된 배열을 클론화 및 분석하는 방법이 포함된다. PCR을 위한 변성 (또는 비변성) 올리고뉴클레오티드 프라이머가 GDNF의 배열을 기초로 하여 합성될 수 있다. 시스테인 위치의 보존 및 NGF족에 대하여 관측된 시스테인 잔기의 인접부근에 아미노산 배열을 보존하면, 성숙 GDNF의 시스테인 주의영역이 프라이머 합성의 명백한 후보지로 나타나나, 다양한 기타 프라이머도 단백질의 숙성 및 프레-프로 위치 양방으로부터 선택될 수 있다. PCR 반응은 저하된 아닐링온도의 조건하에서 수행될 수 있는데, 이 아닐링 온도는 GDNF 배열 뿐만 아니라 임의의 GDNF족 멤버의 배열도 증폭시키게 된다(인니스(Innis)등, 1990 PCR Protocals: A Guide to Methods and Applications, Academic Press사 출판 참조). 이와 같은 PCR 반응 생성물은 겔 전기영동에 의하여 크기가 선별되고 적절한 벡터로 클론화되고 클론화된 DNA는 배열결정되어 GDNF족 멤버를 확인할 수 있다. 선택적으로, 우선 클론을 식별하기 위한 엄밀성이 높은 조건하에서 프로우브 특이 GDNF로의 잡종형성에 의하여 클론은 스크린될 수 있다. 고도의 엄중성하에서 GDNF로의 잡종형성에 실패한 클론은 다음에 배열결정되거나 또는 이들 클론은 엄중성이 낮은 조건하에서 GDNF 프로우브로 잡종형성될 수 있으며 이들 조건하에서 GDNF 프로우브로 잡종형성된 모든 클론은 다음에 배열결정된다.
GDNF족 멤버를 클론화하기 위하여 PCR을 이용하는 제2시도는 상술한 PCR 반응의 생성물을 표식하는 것이며 이들 생성물을, 엄중성이 높고 및/또는 낮은 조건하에서, 위에서 열거한 핵산 표적을 스크린하기 위한 프로우브로 이용하는 것이다. 잡종형성하는 클론 또는 핵산 세그먼트는 GDNF 클론 및 그 멤버를 확인하기 위하여 위에서 상술한 바와 같이 분석될 수 있다. 이와 같은 시도는 NGF 및 BDNF의 배열을 기초로 한 NT-3를 클론화하는데 이용되어 왔다(마이손피에르 등, 1990, Science 247:1446~1451).
본 발명의 바람직한 구체예에서, GDNF를 포함하는 치료제 조성물이 신경상해로 고통을 받고 있는 환자에게, 유효량 투여된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, GDNF는 파키슨씨 병으로 고통을 받고 있는 환자를 치료하는데 치료적으로 사용된다. 당 분야의 숙련자는 GDNF로의 치료에 어떤 뉴론이 반응하는가를 진단할 수 있는 다양한 분석방법에 친숙하며, GDNF에 반응하는 기타의 반응 뉴론의 결정을 별도의 실험을 수행하지 않고도 완수할 수 있다. 당 분야의 숙련자는 GDNF에 대한 정보가 몸체를 통하여 발현되는 장소 및 그들 각각의 영역에 존재하는 GDNF 단백질의 양을 용이하게 측정할 수 있다. 당 분야의 숙련자는 또한 신경계 전반에 걸쳐서 GDNF에 대한 결합부위의 위치를 결정할 수 있다. 이 정보는 당 분야의 숙련자로 하여금 GDNF와 반응할 가능성이 있는 뉴론 형태를 결정할 수 있는데, 이것은 다음에 이 단백질에 대한 적절한 임상적 증상을 암시하게 된다. 다음에 적절한 세포배양 및 동물실험이 수행되어 GDNF가 그와 같은 증상을 치료하는데 유용할 것인지의 여부를 결정하게 된다.
B49 조절배지로부터 유리된 정제된 GDNF도 배양물에서 교감 및 부교감 신경세포의 생존을 촉진하는 것으로 나타났다. 이들 결과는 실시예 4에 상세히 기술된다.
GDNF의 신경영양성 기능은 하나 이상의 분리된 및 분리 가능한 부분에 의하여 나누어 제공될 수 있기 때문에, 본 발명의 방법이 GDNF 신경영양성 기능(또는 기능들)을 조절하는 GDNF의 해당 부분(또는 부분들)로 구성되는 활성성분의 치료적 조성물을 투여함으로써 실행될 수 있다는 것도 상상할 수 있다.
본 발명의 치료제 조성물은, 주사에 의하여 비경구적으로 또는 이식된 펌프로부터의 계속적인 주입에 의하여 뇌척추액(CSF)으로 직접 바람직하게 투여될 수 있다. 비경구적으로 서서히 방출되는 제제, 흡입성 미스트, 구강성 활성 제제 또는 좌약과 같은 기타의 유효한 투여형태도 예상할 수 있다. 또한, 혈액뇌관문을 횡단하는 GDNF의 침투를 촉진할 수 있는 하나 이상의 제제와 관련된 투여방법도 예상할 수 있다. 하나의 바람직한 캐리어는 생리학적 식염수이나, 인조 CSF와 같은 기타 약제학적으로 수용가능한 캐리어도 사용될 수 있다고 생각한다. 하나의 바람직한 구체예에서, 캐리어 및 GDNF는 생리학적으로 양립할 수 있는, 서서히 방출하는 형태의 제제를 구성하는 것을 예상할 수 있다. 그와 같은 캐리어에서의 제1용매는 당연히 수성 또는 비수성일 수 있다. 또한 캐리어는 약제의 pH, 몰침투압, 점도, 투명도, 색상, 무균성, 안정성 용해도 또는 냄새를 변화시키거나 유지하기 위하여 기타의 약리학적으로 수용가능한 첨가제를 함유할 수 있다. 마찬가지로 캐리어는 GDNF의 안정성, 용해도, 방출 또는 혈액뇌관문을 횡단하는 흡수 또는 침투를 변경 또는 유지하기 위하여 또 다른 약리학적으로 수용가능한 첨가제를 함유할 수 있다. 이와 같은 첨가제는 단일 용량이나 다중 용량의 형태로 경구적으로 복용하거나 또는 이식 펌프로부터의 계속적 또는 주기적인 주입에 의하여 CSF로 직접 투여하기 위한 약제를 조제하는데 통상적 및 관습적으로 채용되는 물질들이다.
일단 치료용 조성물이 조제되면, 용액, 현탁액, 겔, 에멀존, 고체, 또는 탈수화 또는 동결건조 분말로서 무균처리병에 저장된다. 이와 같은 제제는 사용하기 용이한 형태로 또는 적용 직전 재구성이 요구되는 형태로 저장된다. 상기 제제의 바람직한 저장형태는 4℃ 이하 및 바람직하게는 -70도이다.
바람직하게는, GDNF를 함유하는 제제의 비경구적 복용방법은 피하, 근육내, 추강내 또는 뇌내의 루트를 경유하는 것이다. 소정의 GDNF 투여량을 달성 및 유지하기 위하여는, 반복되는 피하 또는 근육내 주사가 적용되거나, 또는 GDNF가 이식 펌프로부터 연속적으로 또는 주기적으로 주입될 수 있다. 투여의 빈도는 제제에 있어서의 GDNF의 약물동태학적 매개변수 및 사용된 투여방법에 좌우된다.
세포몸체가 뇌 및 척추내에 존재하는 도파민 작동성 및 기타 손상 신경세포에 소정량의 GDNF를 투여하기 위하여, GDNF는 뇌 또는 척추 거미막하강내로 또는 뇌실내에 투여될 수 있다. 투약은 연속적으로 또는 주기적으로 될 수 있으며 영구 또는 이식 가능한 펌프에 의하여 또는 주기적 주사에 의하여 이루어질 수 있다. 투여는 또한 GDNF가 혈액뇌관문을 투과하도록 하는 제제와 함께 일어날 수도 있다.
GDNF를 함유하는 특정 제제가 경구적으로 적용되는 것도 고려할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 양식으로 적용되는 GDNF는 캡슐에 넣어진다. 캡슐에 넣어진 GDNF는 고체 투약형태의 조제에 관습적으로 사용되는 캐리어가 있거나 또는 없이도 조제될 수 있다. 바람직하게는, 생물학적 이용도가 극대화되고 프레-시스템 열화현성(pre-systemic degradation)이 극소화될 때 위-장관에 있는 지점에서 제제의 활성부가 방출되도록 캡슐이 설계된다. 부가적인 첨가제가 포함되어 GDNF의 흡수를 용이하게 할 수 있다. 희석제, 방향제, 저융점 왁스, 식물유, 윤활제, 현탁화제, 타블릿 분해제, 및 결합제도 사용될 수 있다.
적용방법에 관계없이, 환자의 대략의 체중 또는 표면적에 따라 소정의 투여량이 계산된다. 상술한 방법을 포함하는, 치료용에 적절한 투여량을 결정하는데 필요한 보다 상세한 계산은, 당 분야의 통상의 기술자에 의하여 일상적으로 할 수 있으며, 특히 여기서 기술한 투여량 정보 및 검정방법에 비추어 볼 때, 과도한 실험을 수행하지 않고도 그들에 의하여 일상적으로 수행되는 업무의 범위에 속한다. 이들 투여량은 적절한 용량(用量)-반응 데이타와 관련하여 이용되는 투여량 결정용 검정방법의 사용을 통하여 확인될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, GDNF는 생물학적 활성형의 GDNF를 합성 및 분비할 수 있는 환자의 세포속에 이식함으로써 치료적으로 투여될 수 있다. 이와 같은 GDNF 생성세포는 GDNF의 천연 제조자인 세포(B49 세포와 유사)일 수 있으며 또한 GDNF의 제조능력이, 발현 및 분비를 촉진하는데 적절한 형태로 GDNF 유전자로의 형질전환에 의하여 증대되는 세포들일 수 있다.
외래 GDNF류의 투여에 의한 환자에서의 가능한 면역반응을 최소화하기 위하여는, 천연 GDNF 제조 세포가 인체를 근원으로 한 것이며, 인체 GDNF를 제조하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 하기 실시예 5 및 6에서 사용된 것과 유사한 방법에 의하여 인체 GDNF에 대한 코드화 발현구조를 이용하여, 세포를 형질전환시킴으로써 인체 GDNF를 발현시킬 수 있다.
인체 GDNF를 천연적으로 분비할 수 있는 세포는 다음 기구를 이용하여 확인될 수 있다: (1) 잡종형성, 중합효소 연쇄반응, 또는 기타의 관련방법에서 노턴블로트 분석, RNase 보호에 의하여 인체 GDNF 정보를 생성하는 세포주를 발견하기 위하여, 인체 GDNF에 대한 전령 RNA의 일부를 나타내는 올리고뉴클레오티드 또는 인체 GDNF에 대한 전령 RNA의 일부에 대한 상보적인 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다; 또는 (2) 웨스턴 블롯트 분석법, ELISA 검정법, 방사성 면역 측정법 또는 기타 관련 방법에 의하여, 그 추출물 또는 조절배지가 GDNF 단백질을 함유하는 세포주를 발견하기 위하여, 인체 GDNF를 인식하는 폴리클론성 또는 모노클론성 항체가 이용될 수 있다. 바람직한 방법은, 상기 (2)의 방법에 의하여 인체 GDNF에 대한 항체로 일련의 인체 근원 세포로 부터 조절배지를 스크린하여, 배지로 GDNF를 분비하는 세포를 발견하는 것이다. 이와 같이 제조된 GDNF는, B49 세포에 의하여 제조되고 그 배지로 분비된 GDNF로 수행된 바와 같이, 정제 및 아미노산 배열 분석에 의하여 확인된다. 하기 실시예 7은 인체 재조합 GDNF에 대한 항체의 제조 및 유리방법을 기술하고 있다.
자연 분비 세포 또는 인체 GDNF를 분비하도록 형질전환된 세포가 환자 치료용으로 이용될 수 있다. 인체 또는 비인체 동물세포가 반투막성 폴리마에 담겨져 환자에 이식되어 GDNF를 방출하게 되나, 환자의 면역 시스템에 의한 세포의 파괴를 방지한다. 선택적으로, 생체 밖에서 GDNF를 생성하도록 형질전환된 환자 자신의 세포는, 위에서와 같은 캡슐화 없이도 환자에게 직접 이식될 수 있다.
생세포의 막 캡슐화에 관한 방법은 당 분야의 숙련자에게는 친숙한 것으로, 캡슐화된 세포의 제조 및 이를 환자에게 이식하는 작업은 별도의 과도한 실험을 하지 않고도 수행할 수 있다. 여기서 구체적으로 참고로 인용하는 미합중국 특허 제4,892,538; 5,011,472; 및 5,106,627호를 참조할 것. 생세포를 캡슐화하는 시스템이 에비셔르(Aebischer)등의 PCT 출원 WO 91/10425호에 기술되어 있는데, 여기서 참고로 구체적으로 인용한다. 또한, 에비셔르 등의 PCT 출원 WO 91/10470호; 빈(Winn)등, 1991 Exper. Neurol. 113: 322-329; 에비셔르 등, 1991 Exper. Neurol. 111:269-275; 트레스코(Tresco) 등, 1992 ASAIO 38:17-23의 각각을 여기서참고로 구체적으로 인용하는데, 참조하기 바란다.
특히, GDNF를 분비하는 세포는 파킨슨씨병 환자의 선조(線條)에 이식되어 흑질 도파민 작동성 뉴론의 말단 영역에 GDNF를 제공하며 흑질에 이식되어 도파민 작동성 세포체에 GDNF를 제공할 수 있다. 이와 같이 국부적으로 적용된 GDNF는 도파민 작동성 말단부에 의하여 선조의 발아 및 신경 재지배를 촉진하게 되며, 도파민 작동성 신경세포가 더 이상 퇴화하는 것을 방지 또는 진행속도를 늦추게 한다.
따라서 본 발명은, GDNF를 생성시키는 그 천연적인 능력이 있는 세포나, 또는 GDNF를 분비하도록 조작된 세포를 해당 환자의 체내에 이식함으로써 신경손상을 방지 또는 치료하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 환자가 사람일 경우, 분비된 GDNF는 인체 성숙 GDNF이다.
여기서 기술된 GDNF제제는 인체에는 물론 가축에게도 이용될 수 있으며, “환자”라는 용어가 제한적인 양상으로 해석되어서는 안된다. 가축에 적용하는 경우에 있어서, 투여량의 범위는 상술한 바와 동일하다.
특정 문제 또는 환경에 대한 본 발명의 응용은 본 명세서에 내포된 내용면에서 보아 당 분야의 통상의 기술을 가진자의 능력의 범위에 속한다.
본 발명의 대표적인 이용의 예를 하기 실시예에서 볼 수 있다.
[실시예]
[실시예 1]
[GDNF의 정제 및 배열결정]
본 실시예는 GDNF의 생물학적 분석 및 정제방법을 기술한다. 정제 단계의 출발물질인 B49 세포주 조절배지의 제조방법도 기술된다. 정제된 GDNF의 아미노산 배열 및 정제된 단백질로 부터 얻은 아미노산 배열을 얻는 방법도 기술된다.
A. 재료
임신기간이 조절된 쥐를 지비 밀러 라브, 알리손 파크, 피에이.(Zivie Miller lab, Allison Park, PA.)로 부터 구했다. 별도의 언급이 없는 한 모든 시약은 시그마 케미칼 코(Sigma Chemical Co., 센트루이스, 미조리주) 제품이다.
B. 도파민 작동성 신경영양성 활성에 대한 생물학적 검정
배양조건 : 근소한 수식은 하였으나 기존 방법(프리드만(Friedman) 및 마이틸리뉴(Mytilineou) 1987 Neurosci. Lett. 79:65-72)대로 해리된 간뇌세포 배양주를 준비하였다. 요약하면, 임신 16일째 날에 스프라규 다올리(Sprague-Dawley) 쥐 태아의 뇌로부터의 간뇌 피개(被蓋)가 살균된 조건의 현미경하에서 절개되고, Ca2+및 Mg2+가 없는 둘베코(Dulbecco)의 인산염 완충 식염수에 수집되어, 온화한 분쇄에 의하여 기계적으로 해리되었다. 세포는 400μℓ의 배지를 함유하는 직경 16㎜ 조직배양 웰(Falcon, hincoln, Park, NJ 제품, 24-웰 플레이트) 상에 웰당 100μ로 판상배양되어 밀도가 웰당 2.5~3.5×105세포가 되었다. 배양 웰은 미리 pH8.4의 10mM 붕산나트륨내의 0.1㎎/㎖의 폴리 L-오르니틴 용액에 37℃에서 3시간 노출시키고, 밀리 -Q H2O로 3회, 어얼(Earle)의 평형 염용액(Gibco사 제조)으로 한번 세척하였다. 공급배지는, 글루코오즈(39mM)로 보충된 최소 필수배지(MEM, Minimal Essential Medium, Gibco사), 중탄산나트륨(24.5mM), 글루타민(2mM), HEPES(15mM), 페니실린 G(5U/㎖), 스트렙토마이신(15㎍/㎖), 10% 열불활성화 암송아지 혈청(Gibco사) 및 10% 열불활성화 말혈청(Gibco사)으로 구성된다. 배양주는 6.5% CO2를 함유하는 수분 포화 대기에서 37℃로 유지되었다. 3시간 후, 대부분의 세포가 웰의 바닥에 접착되었을 때, 배지를 500㎕의 새로운 배지로 대체하였다. 이때, GDNF 활성 검정용 샘플의 계열 희석액이 각각의 웰에 쌍으로 첨가되고, 플레이트는 37℃ 배양기에서 배양되었다. 1주일 후, 배양주를 플루오로데옥시유리딘(13㎍/㎖) 및 유리딘(33㎍/㎖)으로 24시간 처리하여 과도한 신경교세포의 증식을 방지한 후 암송아지 혈청이 없는 상기 배지를 공급하였다. 공급배지는 주단위로 교환되었다.
선택적으로, 혈청이 단백질, 호르몬 및 염의 혼합물로 대체된 화학적으로 합성된 무혈청 배지가 사용되었다. 합성배지(DM, Defined Medium)는, MEM 및 F12 영양소 혼합물(모두 Gibco사 제품, 1:1 v/v)과 글루코스(33mM)와의 혼합물, 글루타민(2mM), NaHCO3(24.5mM), HEPES(15mM)으로 구성되는데, 다시 트란스페린(100㎍/㎖), 인슐린(25㎍/㎖), 푸트레신(60μM), 프로게스테론(20nM), 아셀렌산 나트륨(30nM), 페니실린 G(U/㎖) 및 스트렙토마이신(5㎍/㎖)으로 보충된다. DM의 몰침투압 농도는 밀리-Q H2O를 첨가하여 325로 조절되었다(110~125㎖ H2O/ℓ). DM을 사용하여, 형태학 또는 성상교세포 특이 세포골결 단백질인 신경교선유 산성 단백질(GFAP, Glial Fibrillary Acidic Protein)에 대한 착색에 의하여, 몇개의 비신경성 세포가 확인되었다. GDNF는 혈청 함유배지 및 합성배지 양방에서 도파민 흡수를 자극하는 활성이 있다. 하기 실시예에서 시행된 모든 검정은 혈청함유 배지에서 수행되었다.
도파민 작동성 뉴론에서의 특정 “스캐벤저”(“scavenger”) 운반체를 통한 도파민 흡수의 측정 및 면역조직 화학을 이용하여 도파민 합성 효소 티로신 히드록시라제에 대한 양성 뉴론의 수를 계산함으로써, 도파민 작동성 뉴론의 기능적 상태가 이들 배양주에서 검정될 수 있다. 역시 도파민을 운반할 수 있으며 또한 티록신 히드록시라제를 함유하는 노르아드렌 작동성 뉴론으로 배양주가 현저하게 오염될 가능성은, 주의깊은 절개 및 도파민 운반체가 노르아드렌 작동성 뉴론보다는 오히려 도파민 작동성 뉴론의 약리학적 특징을 나타냄으로써 배재되었다. 이들 배양주에서의 도파민 섭취는, 도파민 작동성 뉴론상의 모노아민 운반체의 억제제인 GBR 2909에 의하여 20nM의 ED50으로 억제된다. 대조적으로, 그들 배양주에서 도파민 섭취를 억제하기 위하여는, 모노아민 운반체 또는 노르아르덴 작동성 뉴론의 억제제인, 300배 이상의 데시프라민이 요구된다. 이들 수치는 도파민 작동성 뉴론에서 모노아민 운반체에 대하여 보고된 것들이다.
샘플제조: 간뇌 세포 배양주에서의 도파민 작동성 신경영양성 활성에 대한 검정을 하기 전에, 단계 1~3의 정제단계(하기 C항 참조)로부터 생성된 모든 샘플을 하기와 같이 탈염하였다. 100㎕의 배지 10/10 (캐리어로서)를 센트리콘-10(Centricon-10, Amicon사 제조)에 첨가하고 10분간 방치하였다. 검정될 샘플의 일정부분을 센트리콘에 가한 후, 중탄산염은 없으나 pH7.2의 10mM HEPES를 함유하는 1㎖의 돌베코의 고 글루코스 모디파이드 이글 배지(Dulbecco's high glucose Modified Eagle medium)(용액 A)에 가하고, 5,000×g에서 70분간 원심분리하였다. 농축수(약 0.1㎖)를 새로운 용액 A로 1.1㎖가 되게 하여 2회 재원심 분리하였다. 배양 웰에 첨가하기 전에 0.11㎛ 울트라프리-MC 무균 듀라포어 유니트(Ultrafree-MC sterile Durapore unit, Millipore, Bed ford MA 제조)를 통하여 샘플을 여과하였다.
3H-도파민 섭취: 3중 수소 도파민(3H-DA)의 섭취가 배양 중 6일째 또는 7일째에 약간의 수정은 하였으나 종전방법(프리드만 및 마이틸리뉴(1987) Neurosci. Lett. 79:65-72)대로 수행되었으며, 모든 용액은 37℃로 유지되었다. 요약하면 배지를 제거하여, 5.6mM 글루코오스, 1.3mM EDTA, 0.1mM 아스코르브산 및 모노아민 옥시다제의 억제제인, 0.5mM 파르길린을 함유하는 pH7.4의 크레브스-링거(Krebs-Ringer) 인산염 완충액으로 2회 세척하였다.
배양주를 37℃에서 15분간 0.25㎖의 50nM3H-DA(New England Nuclear사(보스톤, 마사츄세츠주) 제조, 비활성 36~37 Ci/mmol)로 배양하였다. 배양 혼합물을 제거함으로써3H-DA 섭취를 정지한 후 세포를 0.5㎖의 섭취 완충액으로 2회 세척하였다. 세포로부터3H-DA를 방출하기 위하여, 배양주를 37℃에서 30분간 0.5㎖의 85% 에탄올로 배양한 후 10㎖의 EcoLite(ICN사(이르빈, 캘리포니아주) 제조)를 가하고 신틸레이션 계수기(scintillation counter)로 계산하였다. 도파민 뉴론의 고친화성 섭취 펌프의 특정 억제제인, 0.5mM GBR-12909 (RBI)에 첨가함으로써 공시험치를 얻었는데 (헤이킬라(Heikkila)등, 1984 Euro J. Pharmacol. 103:241-48). 불처리 대조 배양주에서3H-DA 섭취가 통상 5% 미만이었다. GDNF 활성의 영양단위(TU)의 수는, 배양주의3H-DA 섭취의 최대 자극의 50%를 나타내는 휘석의 역수로서 정의된다. 비활성은 TU의 수를 샘플에 존재하는 단백질의 양으로 나눔으로써 계산된다.
C. GDNF의 정제
출발물질: 디. 슈벨트(D.Schubert), (Salk Institute, La Jolla, CA)로부터 얻은 B49 신경교아종 세포(슈벨트 등, 1974 Nature 249:224-27 참조)가 10% 암송아지 혈청, 4mM 글루타민, 50U/㎖ 페니실린-G 및 50㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는, 배양 플라스크(225㎠, 코스타(Costar)사 (캠브리지, 마사츄세츠주 제조)내의 DMEM 배지에서 성장되어 군집을 이루었다. 배양주를 10㎖의 무혈청 배지로 1회 세척한 후 세포를 2일간 플라스크당 50㎖의 무혈청 배지에 방치함으로써 무혈청 성장 배지(CM)를 제조하였다. CM이 수집되고, 그로부터 6일까지 매 2일마다 세포에 새로운 무혈청 배지를 재보충하였다. 각 배치의 세포들로부터의 3 회수물의 결합된 CM을 5,000×g로 20분간 4℃에서 원심분리하여 세포 및 파편을 제거하였다. 아미콘(Amicon) 농축기(YM 10막)를 통하여 상청액을 약 10배로 농축하고, 4℃에서 20분간 40,000×g로 원심분리하였다. 마이크로 컬튜어 캡슐(Micro Culture Capsule, Gelman Sciences사 제조)을 통하여 상청액을 여과하고 4℃에서 1개월까지 저장할 수 있었다.
단계 1. 헤파린 세파로즈 크로마토그라피: 상기 제조물(200㎎의 단백질) 0.15N NaCl을 함유하는 pH8.0의 50mM NaPi 완충액(완충액 A)으로 평형화된 헤파린 세파로우즈 CL-6B (파아마시아(Pharmacia)사 (피스카타웨이, 뉴저지주 제조)의 칼럼(1×25㎝) 상에 적재하였다. 다음에 칼럼을, 용출액의 280nm(O.D280)에서의 광학밀도가 기준선으로 되돌아올 때까지 동일 완충액으로 세척하고 완충액 A로부터 1.5N NaCl을 함유하는 pH8.0의 50mM NaPi(완충액 B)로 주행하는 100㎖ 선상 계층별로 용출되었다. 2㎖의 분획이 수집되었다. 전기 전도도 및 GDNF 활성에 관하여 분획을 분석하였다. 제1도는 이와 같은 크로마토그라피를 나타낸다. 용출된 단백질의 프로필은 O.D280으로서 도시된다. 첨부되어 도시된 것은 각 분획에서 측정된 전기전도 및 GDNF 활성의 플롯트이다. 다음의 분석을 위하여, 막대기로 표시된 GDNF 활성이 피크인 분획(0.6~0.8N NaCl 부근)을 수집하였다.
단계 2. FPLC 수퍼로즈 크로마토그라피: 아미콘 농축기(Amicon)사 (베벌리, 마사츄세츠주) 제조, YM10막)를 통하여 상기 수집물을 0.4㎖로 농축하고, 0.5N NaCl을 함유하는 pH7.4, 50mM NaPi 완충액의 고속 단백질 액체 크로마토그라피(FPLC) 수퍼로즈 12칼럼(파아마시아사 제조)상에서 0.5㎖/분의 유속으로 크로마토그라피를 시행하였다. 용출 14분 후, 0.5㎖의 분획을, 5㎕의 0.4% 트윈(Tween) 20을 함유하고 있는 실리콘화 마이크로퓨즈 튜브(siliconized microfuge tube)에 수집하였다. 각 분획의 일정부분에 대하여 GDNF의 활성을 분석하였다. 제2도는 O.D280에서 추적된 단백질 프로필 및 첨부된 GDNF 활성 패턴의 크로마토그라피를 도시하고 있다. 칼럼상에 적제된 GDNF 활성의 85%는 #12~15에 있다.
단계 3. RP-HPLC1: 상기의 분획 #14를 10㎕의 25% 트리플루오로아세트산(TFA)으로 산성화하였다. 산성화된 물질의 반을, 좁은 구경의 아쿠아포어(Aquapore) RP-300 C-8 가역 HPLC 칼럼, (브라운리(Brounlee) 칼럼, 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems)사 (산 조스, 캘리포니아주) 제조), 2.1×220㎜상에 적재하여, H2O/0.1% TFA: 80% 아세토니트릴/0.085% TFA 계층별로 용출하였다. 214nm에서의 UV 흡수를 기준으로하여 단백질 함유 분획을 실리콘화 마이크로 퓨즈 튜브에 수작업으로 수집하였다. 각 분획의 일정부분에 대하여 GDNF의 활성을 분석하였다. 제3도는 O.D214에서 추적된 단백질 프로필 및 낮은 판넬에서의 활성 패턴의 크로마토그라피를 도시하고 있다. 분획 5 및 6은 RP-HPLC에서 회수된 약 90%의 활성을 함유하고 있는 반면에, 분획 7은 나머지 10%의 활성을 지니고 있다. 제4도는, 제3도에 도시된 GDNF 활성의 피크 부근의 분획의 은착색 SDS-PAGE 겔 주행을 도시하고 있다.
단계 4. 예비 SDS-PAGE: 정점의 GDNF 활성을 함유하는 분획 5 및 6을 수집하여 10㎕의 0.4% 트윈 20 존재하에 20㎕로 농축하였다. 샘플에 1㎕의 1M 트리스 염기 및 40% 글리세롤과 5% SDS를 함유하는 5㎕의 pH6.8, 0.2M 트리스-HCl을 첨가하여, 비환원 15% SDS-PAGE(라엠리(Laemmli) 1970 Nature 277:680-684) (0.075×14×11.5㎝의 슬라브, 20 웰-콤(well-comb), 0.075×0.4×2.8㎝/샘플 웰)상에서 주행되었다. 10℃의 40㎃/겔에서 2시간 동안 전기영동 처리되었다. 겔 스트립을 1.14㎜ 슬라이스로 나누었다. 각 슬라이스를 2개의 작은 조각으로 절단하고, 4℃에서 계속 흔들면서 20시간에 걸쳐, 0.01% 트윈 20을 함유하는 pH6.7, 25㎕의 5mM NaPi로 3회 연속 교환하면서 용출하였다. 용출된 물질의 3개의 일정부분을 종합하여 GDNF 활성을 분석하고(제5도), 높은 활성을 지닌 용출액(제5의 30~42kD에 해당하는 겔 슬라이스 #16~23으로부터 나온)을 수집하였다. 공시험 겔 스트립(전기영동 처리전에 그 정점에는 단지 SDS-PAGE 완충액만이 적재되었다)도 대조용으로서 유사하게 처리되었다.
단계 5. RP-HPLC: 수립된 겔 용축액을 약 150㎕ 농축하고 20㎕로 농축하고 25% TFA로 산성화하여, 단계 3에서 기술한 바와 같이 RP-HPLC 상에서 주행되었다. O.D214를 기준으로하여, 단백질 함유 분획이 실리콘화 마이크로퓨즈 튜브에 수작업으로 수집되어 GDNF 활성이 분석되었다. 제6도는 그와 같은 크로마토그라피의 결과를 나타낸다. 대조용으로서, 유사하게 절단된 공시험 겔 스트립으로부터의 용출액도 RP-HPCL 상에서 주행되었다. 대조 프로필상의 상기 샘플에서 오직 현저한 O.D214피크(제6도, 판넬 A 대 B)는 피크 3인데, 이것은 HPLC 칼럼상에 적재된 GDNF 활성의 70%를 함유한다. 제7도는 은착색 SDS-PAGE 겔 상에서 주행된 피크 3을 나타낸다. 오직 가시적인 착색은 30~40kD 사이의 매우 넓은 밴드인데, 이는 예비 SDS-PAGE(제5도)에서 관측된 GDNF 활성 프로필과 일치한다. 전형적인 정제현황이 표 I에 요약되어 있다.
D. 정제된 GDNF 아미노산 배열
아미노 말단 배열: 제6도의 피크 3을 가스상 단백질 시퀀서(Applied Biosystems사 제품)로 배열결정하였다. 얻어진 배열이 제8도에 제공된다. 단계 3의 정제 후 최고의 GDNF 활성을 지닌 분획(제3도의 분획 5 및 6)의 배열도 정제된 샘플로 얻어진, 제8도의 것과 동일한 단일 배열을 나타내었다. 이들 상이한 분획들이 공통으로 갖고 있는 유일한 물질은 30~42kD 사이에서 얼룩점으로 주행되고 있는 물질이다. 따라서, 제4도에서 분획 5 및 6의 은착색 겔에서 보이는 30~42kD 영역밖의 오염밴드는 a) 현행 기술로 배열 결정되기에는 양이 너무 적을 수 있으며; b) 배열에 있어서, 30~42kD 얼룩 밴드와 관련이 있을 수 있으며; 또는 c) 절단된 아미노 말단을 가질 수 있다.
내부 배열: 상술한 단계 3의 정제 후의 GDNF 제조물은 내부 배열을 얻기 위한 출발물질로 사용되었다. 제3도의 분획 5 및 6이 9㎕의 0.4% 트윈을 함유하는 실리콘화 마이크로퓨즈 튜브에 수집되어 40㎕로 농축되었다. 2.5M 구아니딘 염화수소 및 1㎍의 트립신을 함유하는 160㎕의 1% NH4HCO3를 샘플에 첨가하여 37℃에서 철야로 배양하였다. 혼합물은 20㎕의 25% TFA로 산성화하여, 약 150㎕로 농축하고, 좁은 구경의 아쿠아포어 RP-300 C8 역상 HPLC 칼럼(브라운리 칼럼), 2.1×220㎜ 상에서 펩티드가 분리되고, H20/0.1% TFA: 80% 아세토니트릴/0.085% TFA 계층별로 용출되었다. 펩티드 함유 분획이, 214㎜의 흡수를 기준으로 하여, 실리콘화 마이크로퓨즈 튜브에 수동으로 수집되었다. 제9도는 이와 같은 크로마토그라피의 결과를 나타낸다. 제9도의 피크 10의 배열은 제8도(SEQ ID NO:1)에 도시된 미처리 단백질의 아미노 말단 배열의 최초 13 아미노산 잔기와 동일한 것으로 측정되었다. 제9도의 피크 37은 다시 CNBr로 처리되었다. 샘플은 20㎕로 농축되었다. 샘플에 70㎕의 90% 포름산 및 5㎎의 CNBr이 첨가되어, 실온에서 철야로 암중에서 배양되었다. 이 혼합물은 20㎕로 농축되어 100㎕의 0.1% TFA로 휘석되고 상술한 바와 같이 역상 HPLC에서 분리되었다. 제10도는 이와 같은 크로마토그라피의 결과를 나타낸다. 제10도의 피크 1이 5㎕의 0.4% 트윈 20 존재하에 20㎕로 농축되었다. 100㎕의 1% NH4CO3및 5㎕의 50mM 디티오트레이톨을 샘플에 첨가하고, 샘플을 실온에서 한시간 배양하였다. 혼합물을 10㎕의 25% TFA로 산성화하고, 100㎕로 농축하여 위에서와 같이 역상 HPLC 상에서 분리하였다. 제11도는 이와 같은 크로마토그라피의 결과를 나타낸다. 제11도의 피크 33 및 34는 모두 동일한 배열을 제공하였다(제12도)(SEQ ID NO:2).
E. GDNF의 특성
SDS-PAGE 상에서의 이동성: 샘플에 어떤 열처리도 하지 않고, 비환원 조건하에서, GDNF는 SDS-PAGE 상에서 31~42kD 사이의 얼룩 밴드로서 주행된다. 환원제(4% β-메르캅토에탄올)의 존재하에 샘플을 3분간 100℃로 가열하면, GDNF는 20~30kD 사이에서 분리된 다수의 밴드로 주행된다. 겔에 적재된 생물학적 활성의 약 50%가 후자(환원 조건)가 아니라 전자(비환원 조건)에서 회수될 수 있기 때문에, GDNF는 디술피드-결합 2량체이며 2량체로서만이 오직 활성일 수 있다. 단일 아미노 말단은, GDNF 제조물이 코아 1차 구조라는 점에서 동질성이라는 것을 암시하는 반면에, 얼룩 또는 다수 밴드 형태는 이질적 글리코실화 단백질이라는 것을 암시한다.
비활성: 정제된 GDNF는 약 17 영양단위/ng의 예상 비활성을 갖는데, 이는 도파민 섭취의 반-최대(half-maximal) 자극이 약 60pg/ml의 비교적 낮은 농도에서 일어난다는 것을 가리킨다. 정제된 GDNF에 대하여 측정된 비활성은, RP-HPLC에서 사용된 산성화 유기 용매 및 SDS-PAGE에서 변성 조건에의 노출로 인해 정제단계 중 GDNF의 부분적 불활성 때문에 얼마간 과소 평가될 수 있다.
GDNF의 특이성: GDNF는 도파민 뉴론에서 도파민의 섭취를 강화시키는 그 능력에 의하여 정제된다(제20(a)도). GDNF도 도파민 뉴론의 생존 및/또는 성숙의 다른 지수를 상향조절 시켰는지의 여부를 측정하기 위하여, 간뇌 배양주에서의 티로신 히드록시라제(TH) 면역 반응성도 측정되었다. 이것은 배양주에서 도파민 뉴론에 특이한 하나의 표식이다. GDNF에 의한 면역 반응성의 상향조절은 도파민 뉴론의 증대된 생존율 및/또는 도파민 뉴론당 TH생성의 증가율 때문일 수 있다. 판상배양일에 첨가된 정제된 GDNF 및 8일 후에 검사된 배양주는 GDNF가 없는 대조용보다 TH+뉴론의 수가 10배가 높았다. 만일 9일째에 두번째로 GDNF가 투여되고 7일후(시험관내 16일)에 배양주가 검사되면, 대조용에 대하여 유사한 투여량 비례 증가현상이 관측될 수 있다(제20(b)도). 따라서, GDNF는 간뇌 도파민 뉴론에서 도파민 뉴론의 생존을 유지 및/또는 TH의 발현을 증진시킬 수 있다.
GDNF가 도파민 뉴론의 성숙 및/또는 생존에 특정 자극효과를 나타내는 것으로, 모든 뉴론에 대하여 일반적인 작용을 나타내는 것이 아니라는 것을 증명하기 위하여, 역시 간뇌 배양주에 존재하는, г-아미노부티르산(GABA)을 함유하는 뉴론의 GDNF에 대한 반응성을 분석하였다. 각각 15일 및 16일간 다양한 농도의 GDNF와 함께 성장된 간뇌 세포의 자매 배양주에서 H3-도파민(3H-DA) 및14C-GABA 섭취를 측정하였다. 상술한 바와 같이 GDNF는 간뇌 도파민 뉴론의3H-DA 섭취능력을 GDNF가 없는 대조용보다 ~150% 이상 강화시켰다(제21(a)도). 그러나, GDNF 존재하의14C-GABA를 섭취는 조절용보다 겨우 ~20% 높기 때문에, GDNF는 GABA 뉴론이14C-GABA를 섭취하는 능력에는 전혀 현저한 영향을 주지 않았다(제21(b)도). 이것은 또한 계산된3H-DA/14C-GABA 비율의 증가로도 설명된다.(제21(c)도). 이들 데이타는 도파민 및 GABA 간뇌 뉴론이 GDNF의 존재에 대하여 상이하게 반응하며, 간뇌 배양주에서의3H-DA 섭취에 대한 GDNF의 자극 효과는, GABA 뉴론과는 대조적으로, 도파민에 대하여 특이적이라는 것을 가리킨다.
이들 관측된 결과는 GDNF가 파킨슨씨병이나 도파민 작동성 뉴론과 관련되는 질병을 치료하는 데 이용될 수 없는 이유를 명백히 설명하게 된다. 이들 결과는 GDNF가 도파민 작동성 뉴론의 최소한 2가지 중요한 특성; 도파민 섭취 및 TH 효소량을 상향 조절한다는 것을 증명한다. 상기 결과는 또한, GABA 뉴론이 유사하게 영향을 받지 않기 때문에, GDNF의 효과가 도파민 작동성 뉴론에 대하여 적어도 부분적으로 특이적이라는 것을 나타낸다.
도파민 작동성 및 GABA 작동성 뉴론외에, 쥐 태아 간뇌 배양주에는 다른 신경집단, 세로톤 작동성 뉴론이 있다. 간뇌 배양주에서 도파민 작동성 뉴론에 의하여 도파민 섭취를 증대시키는 상피성장인자(EGF, Epidermal Growth Factor)와 같은 일부 인자도 세로톤 작동성 뉴론에 의한 세로토닌 섭취 및 GABA 작동성 뉴론에 의한 GABA 섭취를 증진시킨다. 캐스퍼(Casper) 등, 1991 J. Neurosci. 30:372를 참조할 것. 이것은 이들 인자가 도파민 작동성 뉴론에 대하여 특이적이 아니라는 것을 가리킨다.
반대로, GDNF는 세로톤 작동성 뉴론에 의한 세조토닌의 흡수를 증가시키지 못한다. 섭취 완충액이3H-DA 대신에 50mM3H-세로토닌(11Ci/몰, 아머샴(Amersham)사 (알링톤 하이츠, 일리노이스주 제조)을 함유하는 것을 제외하고는, 실시예 1B에 기술된 바와 같은,3H-DA 섭취에 대한 방법대로3H-세로토닌 섭취를 측정하였다. 세로토닌 뉴론에서 세로토닌 섭취의 공지의 유력한 억제제인, 10㎛의 시탈프람(Citalpram, Mount Sinai School of Medicine의 닥터 마이틸리뉴(C. Mytilineou)로 부터 얻음)의 존재하에,3H-세로토닌 섭취는 15%로 저하되었다. 시탈프람 존재하의 대조용 값은, 제24도에 도시한 바와 같은 실험치로부터 감해졌다.
EGF와 같은 비특이적 인자와는 대조적으로, GDNF는 도파민 섭취가 현저하게 증가되는 조건하에서 GABA 섭취(제21도) 및 세로토닌 섭취(제24도)를 증진시키지 못한다. 이들 및 상술한 결과는, 간뇌 배양주에 존재하는 GABA 작동성 및 세로톤 작동성 뉴론과 비교할 때, GDNF가 동일 배양주에 존재하는 도파민 작동성 뉴론에 대하여 특이적이라는 것을 가리킨다. 이와 같은 특이성은 GDNF의 파킨슨씨병 치료에 대한 유용성을 강화시키는데, 파킨슨씨병은 간뇌(흑질) 도파민 작동성 뉴론에 대하여 특이적인 질병이라고 생각된다.
[실시예 2]
[GDNF에 대한 유전자의 클론화]
A. GDNF를 코드화하는 쥐 유전자의 cDNA 카피의 클론화
GDNF 코드화 유전자를 클론화하기 위하여, B49 세포로부터 유리된 폴리 A+RNA로부터 cDNA 라이브러리가 구성되고, 이 라이브러리는, 정제된 GDNF로부터 얻은 아미노산 배열을 기초로 한 변성 올리고뉴클레오티드 프로우브로 스크린되었다. 이 프로우브로 잡종형성하는 cDNA 클론이, DNA 배열 결정법에 의하여, 스크린하는 올리고 프로우브가 기초로하는 아미노산 배열에 대한 카르복실 말단에 위치하며 GDNF에 존재하는 아미노산 배열을 코드화하는, 변성 올리고튜클레오티드 프로우브에서 사용된 배열의 3’에 위치하는 DNA 배열을 함유하는 것으로 측정되었다.
B49 세포주에 대한 배양조건은 상기 실시예 1에 상세히 기술되어 있다.
RNA 제조를 위하여, 세포는 혈청 함유 배지 집단부근에서 성장되어, 무혈청 배지(DMEM)에서 1회 세척되고, DMEM에서 4일간 성장되며, 2일후 한번 배지를 교환하였다. 다음에 세포가 수확되고, 콤친스키(Chomczynski) 및 사키(Sacchi) 1987 Analytical Biochemistry 162:156-159의 방법에 의하여 전체 RNA가 추출되었다. 마니아키스(Maniatis) 등, 1989 Molecular Cloning 2판, CSH Press사에 기술된 바와 같이, 올리고 dT 셀루로오즈 친화성 칼럼 위를 통과함으로써, 이 전체 RNA로부터 폴리 아데닐화 RNA가 제조되었다.
M-MLV RNaseH- 역전사 효소(Bethesda Research Lab사 제조, 게티스버그, 메리랜드주)를 이용하여, 그 제조자가 기술한 프로토콜을 따라, cDNA를 합성하였다. 제 1 사슬 반응은 올리고 dT15프라이머(파아마시아사 제조)로 준비되었으며 또한 5㎍의 폴리 A+RNA당 8 유니트의 RNasin(Promega사 제조, 메디슨, 위스콘신주)이 포함되었다. 제 2 사슬 합성은, 제조자의 프로토콜에 따라, E. coli DNA 폴리머라제I, E. coli 및 RNaseH, 및 E. coli DNA 리가아제(모두 BRL 제품)로 진행되었다. 클론화를 용이하게 하기 위하여, cDNA를 T4 DNA 폴리머라제(BRL)로 처리하여 무딘 단부를 제조하고 EcoRI 메틸라제(BRL)로 메틸화 되었다. 이들 단계는 효소 판매자에 의하여 제공된 프로토콜에 따라 수행되었다. 다음에 cDNA는 한 용적의 페놀 및 클로로포룸의 1:1 혼합물로 2회 추출되고, 수성 분획은 1/2 용적의 7.5M NH4Ac 및 3용적의 에탄올로 실온에서 침전되었다. 침전물은 실온에서 15분간 16,000×g로 원심분리하여 회수되어, 70% 에탄올로 세척되고, 진공건조 및 50㎕, 50mM 트리스-HCl(7.6), 10mM MgCl2, 1mM ATP, 1mM DTT, 500 피코몰의 포스포릴화 링커(CCCGAATTCGGG, 파아마시아사 제조)(SEQ ID NO:9)를 함유하는 5% PEG 8000 및 3 유니트의 T4 DNA 리가아제(BRL)에서 재부유되었다. 링커 결합은 16℃에서 철야(~16시간)로 수행되었다. 반응 혼합물은 페놀/클로로포룸으로 추출되고 위에서와 같이 침전되었다. 세척된 펠렛트는 건조되고, 400 유니트의 EcoRI (New England Biolabs사, 베벌리, 마사츄세츠주)가 첨가된, 50㎕의 EcoRI 소화 완충액(100mM 트리스-HCl(7.5), 5mM MgCl2, 50mM NaCl 및 0.025% 트리톤 X-100)에서 재부유되었다. 반응은 37℃에서 2시간 배양되었다. 침전 후(상기와 같이), 펠렛트는 EcoRI 소화 완충액에서 재부유되고, 상술한 바와 같이 제 2 라운드의 EcoRI 소화가 수행되었다. 이 반응물은 침전되어 40㎕의 10mM 트리스-HCl(8.0), 1mM EDTA, 100mM NaCl 중에서 재부유되었다. 이제 EcoRI 소화 링커를 함유한 이 cDNA는 세파크릴(cephacryl) S-300 (파아마시아사 제조) 스핀 칼럼을 통한 약 1,100g에서의 5분간의 원심분리에 의하여 크기별로 분류되었다. 이 칼럼을 통한 유체를 수립하여 상기와 같이 에탄올 침전하고 10mM 트리스-HCL(8.0) 1mM EDTA 중에서 약 1㎍/㎕ 농도로 재부유되었다.
λZapII(Stratagene, 라 졸라, 캘리포니아주 제조) 클론화 벡터에 cDNA 라이브러리가 구성되었다. 통상적으로 1㎍의 EcoRI-소화 및 포스파타제화 벡터 아암(스트라타진사로부터 구입)이, 50mM 트리스-HCl(7.6), 7mM MgCl2, 1mM DTT, 5% PEG 8000 및 1mM ATP 내의 약 3 와이스(Weiss) 유니트 T4 DNA 리가제(NEB)를 사용하여 5㎕의 연결에, 0.1㎕의 EcoRI 연결 cDNA에 연결되었다. 결합반응은 16℃에서 철야로 수행되었다. 연결체는 판매자가 제공한 프로토콜에 따라 기가팩II 골드 팩키징 익스트랙(GigapackII Gold packaging extracts, 스트라타진사로부터 구입)에 팩키지화되었다. 라이브러리는 적정되고 스트라타진사 제품인 XL1-블루 호스트(Blue host)상에서 스크린되었다.
이와 같은 하나의 연결반응 및 팩키지화로, 약 270,000 플라크 형성 유니트가, 총 12,150㎜ 직경 페트리 플레이트상에 배치되었다. 마니아티스등이 기술한 공정의 처리 후에 이들 플레이트로부터 2중의 니트로셀루로오스 필터 리프트가 제조되었다. 필터는 하기32P 표식 변성 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO:7)(I=인노신)으로 잡종형성되었다:
이 배열은, 상기 실시예 1에 기술한 바와 같이 정제된 GDNF의 아미노 말단 주위에서 얻어진 아미노산 배열(제8도)(SEQ ID NO:1)을 기초로 한다:
올리고뉴클레오티드는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(파아마시아사 또는 United States Biochemicals사 제조, 클리브랜드, 오하이오주)를 이용하여32P-ATP(Amersham사 제조, 알링톤 하이츠, 일리노이즈주)로부터 유도된32P로 표식되었다. 잡종형성 반응은 6X SSPE, 0.1% SDS, 0.1㎎/㎕ tRNA(SIGMA사, 센트루이스, 미조리주) 및 2X 덴하르트(Denhart)(각각 0.4mg/ml: 피콜, 폴리비닐피롤리딘, BSA 프랙션 V) 시약중에서 50℃에서 철야(약 16시간)로 수행되었다. 잡종형성 용액은 용액 ㎖당 2~3 ×106cpm의 표식된 올리고를 함유하였다. 잡종형성 반응 후, 필터는 실온에서 2X SSPE, 0.1% SDS로 1회, 50℃로 예열된 동일 용액에서 2회 세척하였다. 필터는 공기 건조되고 증감판을 이용하여 -70℃에서 7일간 필름에 노출되었다.
현상된 필름을 검사하여 스크린 올리고뉴클레오티드로 잡종형성한 플라크를 확인하였다. 이 1차 스크린에서, 24개의 양성결과가 확인되었다. 양성반응에 해당하는 라이브러리 플레이트 영역을 절단, 재부유 및 재판상화하여 상술한 잡종형성 공정을 통하여 제 2 라운드의 스크린 작업을 하였다.
제 2 스크린에서, 원래 24개 중 8개가 양성으로 재시험된 반면에 16은 부정적인 결과가 나왔다. 이들 8개의 양성반응체는 추가로 1 또는 2라운드의 잡종형성 반응을 통하여 플라크 정제되고, 이들 중 6은, GDNF를 코드화할 수 있는 DNA 배열을 함유하고 있는지의 여부를 확인하기 위하여 DNA 배열 결정법에 의하여 분석되었다.
클론화 삽입체를 함유하는 λZapII 파아지의 파이지미드부를 pBluescript SK-라 한다. pBluescript SK- 파이지미드를, 올리고뉴클레오티드 프로우브 잡종형성한 각각의 λZapII 재조합체로부터 절단하였다.
λZapII 벡터로부터 재조합 pBluescript SK- 플라스미드의 생체내 절단에 관한 공정은 판매자의 프로토클에 상세히 나와 있다. 간략히 요약하면, λZapII 및 M13 “헬퍼”(“helper”) 파아지의 공감염(coinfection)은 재조합 pBluescript의 단일 사슬 DNA 카피를 감염성 M13 비리온(virion)내에 팩키지화한다. 이와 같은 비리온이 감수성균을 감염시킬 때, 단일사슬 DNA는 2중 사슬 DNA로 전환되며, 플라스미드로서 수직으로 전파된다. 이와 같은 일은 pBluescript SK- 상에서 코드화된 앰피실린 저항성 유전자에 의하여 선택될 수 있다. 따라서, 각각의 8개의 양성 λZapII 클론으로부터 “구출된”(“rescued”) 재조합 pBluescript SK- 플라스미드를 함유하는 대장균 XL1-블루 유도체는, 스트라타진사의 프로토콜에 의하여, 및 λZapII 벡터와 함께 제공된 “헬퍼” 파아지를 채택함으로써 용이하게 얻어진다.
DNA 배열결정을 위하여, 번보임(Birnboim) 및 도일리(Doily) 1979 NAR 7:1513-1523을 근거로한 “미니-프리프(“mini-prep”)공정에 의하여, 6개의 이들 재조합 플라스미드로부터 2중 사슬 플라스미드 DNA가 제조되었다. 프라이머로서의 스크린 올리고 및 이들 주형을 이용하여, 디데옥시-사슬 종결방법을 사용하는 DNA 배열결정 반응이 수행되었다. 배열결정 반응용 시약은 키트(시퀘나제 버젼 2.0)로서 유나이티이드 스테이츠 바이오케미칼(United States Biochemical사)로부터 얻었으며, 배열결정 공정은 판매자가 제공한 프로토콜에 의하여 수행되었다. 클론 λZapII76.1로부터 유도된 하나의 클론, pBluescript SK- 76.1은 하기 배열을 제공하였다.(SEQ ID NO:11):
이 배열은 번역되어 하기 아미노산 배열을 제공할 수 있다(SEQ ID NO:12):
이 배열은 5 아미노산 잔기 카르복시 말단으로부터 시작하여 스크린 올리고/배열결정 프라이머를 생성하기 위하여 사용된 아미노산 배열의 단부까지의 GDNF의 아미노 말단 영역에 대하여 측정된 아미노산 배열에 해당한다. 이 결과는, λZapII76.1에 함유된 cDNA 클론은, B49 세포조절배지로부터 정제된 GDNF 단백질의 일부 또는 전부를 코드화하여야 한다는 것을 나타낸다.
B. GDNF의 코드화 배열을 포함하는 cDNA 클론 λZapII76.1 영역의 뉴클레오티드 배열.
cDNA 클론의 5’단부의 최초 877 염기쌍의 뉴클레오티드 배열이 측정되었다. 이 영역은, 정제된 GDNF의 아미노-말단에 대하여 얻어진 아미노산 배열을 포함하는 227 아미노산의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 함유하며, 정제된 GDNF의 분활에 의하여 유도된 내부 펩티드와 일치하는 배열인 것으로 밝혀졌다. 이 ORF에 대하여 예상된 카르복시말단 134 아미노산은 정제된 성숙 GDNF 단백질의 예상 아미노산 배열을 포함한다. 선도 93 아미노산은 추정 분비신호 배열이 뒤따르는 잠재적인 개시 ATG 코돈을 포함하며, 실시예 1에서 상술한 GDNF의 성숙, 정제형을 생성하는 단백질의 전구체 또는 “프레-프로”형의 분활을 위한 잠재적 단백질 분해 공정처리 부위를 함유한다.
배열결정 반응용 주형 DNA는 플라스미드 pBluescript SK- 76.1 DNA의 단일 사슬 및 2중 사슬 형태를 포함한다. 2중 사슬 DNA는 “보일링 프리프”(“boiling prep”) 공정(Anal, Biochem. 114: 193: 97)에 의하여 XL1-블루(pBluescript SK- 76.1)의 배양주로부터 제조되었으며, CsCl 밀도 계층별로 밴드화되었다. 파아지와 함께 공급된 관련 프로토콜을 이용하여 판매자(스트라타진사)에 의하여 공급된 “헬퍼”M13 파아지로 XL1-블루(pBluescript SK- 76.1)을 감염하여, 단일 사슬 주형이 생성되었다. 길이가 15~23 뉴클레오티드인 단일 사슬 뉴클레오티드 프라이머가 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems, 포스터시, 캘리포니아주) DNA 신테사이저(Synthesizer), 모델 380A 합성기로 합성되어, 일반적으로 정제 과정없이 사용되었다. 배열결정은 디데옥시-사슬 종결법을 이용하여 수행되었다. 사용된 시약은 시퀀나제 버젼 2.0 키드(United States Biochemical사)에 포함되며 판매자가 공급한 프로토콜에 따라 사용되었다.
정제된 성숙 GDNF 단백질에 코드화 배열을 함유하는, cDNA 클론 λZapII76.1의 5’ 단부의 최초 877 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 배열이, 이 배열내에서 발견되는 681 염기쌍 오픈 리딩 프레임(OFR)의 추정 아미노산 배열과 함께 제13도(SEQ ID NO:3)에 도시된다. 정제된 GDNF에 해당하는 배열은 세린 잔기가 있는 281 위치에서 출발하는데, 제14도(SEQ ID NO:4)에 도시한다. 이 영역에서 얻어진 DNA 배열은, 정제된 GDNF의 아미노 말단에서 관측된 아미노산 배열의 최초 23 잔기와 완전히 일치하는 아미노산 배열로 예상된다(실시예 1 참조).
제13도에 도시한 바와 같은 유전자의 분석을 근거로 할 때, GDNF는 처음에는 프레-프로 GDNF 폴리펩티드로서 번역되며, 신호배열 및 이 분자의 “프로”(“pro”) 부분을 단백질 분해 처리하면, B49 세포 조절배지로부터 정제된 GDNF를 생성하는 것으로 보인다. 이와 같은 프레-프로형의 대한 가장 유력한 번역개시부위는 제13도(SEQ ID NO:3)의 배열의 위치 50에서 발생하는 ATG 코돈이다.
C. GDNF를 코드화하는 인체 유전자의 클론화
수많은 신경영양성 인자의 아미노산 배열이 다양한 포유동물에 걸쳐서 보존되었다(홀북(Hallbook)등, 1991 Neuron 6: 845-858: 맥도날드(McDonald) 등, 1991 BBA). 아미노산 배열의 보존 결과, 이들 단백질을 코드화하는 유전자의 뉴클레오티드 배열이 상당히 보존되었다. 따라서, 포유동물의 신경영양성 인자를 코드화하는 유전자는, 적절한 아닐링 조건하에서 다른 포유동물의 신경영양성 인자를 코드화하는 유전자와 함께 교차 잡종형성(즉, 안정한 2중 사슬 DNA 잡종을 형성한다) 할 수 있다는 것은 사실이다. 이 특성은 GDNF에 대한 유전자를 포함하는 클론화 인체 DNA 단편을 확인하는데 이용된다.
벡터 λFIXII에 구성된 인체 게놈 라이브러리를 스트라타진사로부터 구입하여(카탈로그 #946203) 상기 실시예 2B에서 기술된 GDNF의 쥐 cDNA 클론(pBluescript SK- 76.1)으로부터 유도된32P-표식 프로우브를 이용하여 스크린하였다. 프로우브는 중합효소 사슬반응을 이용하여 특정 증폭에 의하여 성숙 GDNF로부터의 250bp의 코드화 배열로 구성되었으며(사이키(Saiki)등, 1985 Science 230:1350) 다음과 같이 제조되었다: 주형으로서 ＜1ng λZapII76.1 DNA를 이용하여 50㎕ 또는 100㎕ PCR 반응이 수행되고 10~20 pmol의 각각의 두 올리고 뉴클레오티드 프라이머가 쥐 GDNF로부터의 배열을 기초로 하였다. 하나의 올리고는 상기 실시예 2A에 기술된 “스크린닝올리고”(“screening oligo”)(또한 DHD-21 이라고도 한다)인 반면에 제 2 올리고(DHD-26)(SEQ ID NO:13)는 아래의 배열을 갖는데:
이것은 GDNF 분활의 내부 펩티드 생성물로부터 얻어진 아미노산 배열(Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu)(SEQ ID NO:14)를 기초로 한다(실시예 1 참조). 반응은 2.5-5μ의 폴리머라제(USB)를 사용하여, 10mM 트리스-HCl(25℃ 에서 pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 10㎍/㎖ BSA(Promega R3961), 각각 0.2mM dNPT(파아마시아사)에서 수행되었다. 반응의 30 사이클의: 95℃에서 1분, 44℃에서 1½분 및 72℃에서 1½분으로 구성되었다. 이 반응의 생성물은 아가로우스 겔 전기영동법에 의하여 약 250bp인 것으로 관측되었는데, 이것은 제13도에 도시된 cDNA 배열의 2개의 프라이머의 위치와 일치한다. 이 표식되지 않은 단편은, 판매자의 프로토콜에 따라, 울트라프리-MC 필터 유니트(Ultrafree-MC Filter Unit, Millipore사, 베드포드, 마사츄세츠주)에 의한 원심분리에 의하여 겔로부터 용출되어, 동일한 2개의 올리고 프라이머를 채택하는 후속 PCR 표식반응에서 주형으로서 이용된다. 이들 반응은 냉 dCTP의 농도가 12.5μM로 감소되고, 2.5μM 3000~5000 Ci/mmol α-32P dCTP (AMERSHAM사)가 반응에 첨가된 것을 제외하고는 동일 조건하에서 수행되었다. 표식화 반응의 생성물은 바이오스핀(BioSpin) 6 스핀 칼럼(BioRad사, 리치몬드, 캘리포니아주) 위를 통과하였다. 이 칼럼을 관통하는 유동은 인체 게놈 라이브러리를 스크린하는데 프로우브로서 이용되었다.
스트라타진사에 의하여 제공된 대장균주 PLK17을 사용하여 라이브러리를 평판화하였다. 각각 약 50,000 플라크를 함유하는 24개의 150㎜ 페트리 플레이트가 준비되었다. 상기 마니아티스 등에 의하여 기술된 방법에 따라 각 플레이트로부터 중복 니트로셀루로오즈 필터 리프트가 제조되었다. 이들 48 필터는 상술한 250×106cpm의 PCR 프로우브(0.5N NaOH 처리에 의하여 변성된)로, 250㎖ 6x SSPE, 0.1% SDS, 2x 덴하르트 시약, 0.1㎎/㎖ tRNA 및 30% 프름알데히드(USB) 중에서 42℃에서 철야(~16시간)로 탐침되었다.
다음에 필터는 실온에서 250㎖ 2x SSPE, 0.1% SDS로 2회 및 50℃로 예열된 1.6 1 0.1x SSPE, 0.1% SDS로 2회 세척되었다. 필터는 실온에서 건조되도록 방치되고 증감판과 함께 70℃로 6일간 필름 밑에 놓았다. 필름은 현상되어 기록되었다. 상술한 잡종 형성 공정을 경유하여 제 2 라운드의 스크린 작업을 위하여, 6개의 강력한 중복 양성반응이 관측되었다. 양성반응에 해당하는 라이브러리 플레이트의 영역을 절단, 재부유 및 재판상화되었다.
6개 모두가 양성으로서 재시험되었으며 하나의 부가적인 평판화 및 잡종형성 라운드를 경유하여 플라크 정제되었다. 프로우브로 잡성형성하는 영영 부근의 DNA 세그먼트를 서브클론화 및 배열결정하여, GDNF에 대하여 코드화하는 인체 유전자의 배열의 전부 또는 일부를 측정하는 것은 당 분야의 숙련자에 있어서는 일상적인 작업인 것이다. 전체의 인체 GDNF 유전자가 이들 클론에 나타나지 않으면, 게놈을 따라 “걷고”(“walk”) 이 영역부근의 DNA의 중복 세그먼트를 클론화하여 유전자의 남아있는 부분을 얻어 배열결정하는 것도 또한 일상적인 일이다.
당 분야의 숙련자에게는 자명할 상기 방법 및 기타 방법은 기타의 인체 유전자 라이브러리를 스크린하는데 적용될 수 있다. 예를 들면, 상술한 프로우브 및 잡종형성 프로토콜을 이용하여, 인체 내피로부터 추출된 A+RNA로 구성된 인체 cDNA 라이브러리가 스크린되었다. 클론닝 벡터 λgt10에 함유된 이 라이브러리는 클론텍크(Clontech)사 (팔로 알토, 캘리포니아주)로부터 구입하였다(카탈로그 #HL 1092a, 롯트 #1561). 이 라이브러리는 플레이트 당 약 20,000 플라크의 밀도로 대장균 LE392 (상기 마니아티스 등의 문헌 참조)상에 평판화 되었고 (Σ 약 250,000 플라크), 상술한 조건하에서 잡종형성에 의하여 스크린되었다. 잡종형성 후, 필터는 실온에서 0.2x SSPE, 0.1% SDS로 2회 및 50℃로 예열된 0.1x SSPE, 0.1% SDS로 2회 세척되었다. 필터는 실온에서 공기 건조되어 필림 밑에 놓여졌다. 증감판과 함께 70℃에서 3일간 노출 후, 필름은 현상되고, 8 중복양성반응이 확인되었다.
쥐 GDNF 프로우브와의 잡종형성에 의하여 인체 게놈 라이브러리로부터의 6λFIX II 클론이 확인되고, 플라크 정제되어 동질성이 확인되었다(상기 참조). 각 파아지의 용해물질이 샘브룩(Sambrook) 등의 방법에 의하여 제조되었다(Moleculer Cloning: A Laboratory Manual: 1989). 아래의 공정에 따라 이들 클론으로부터 DNA가 제조되었다: 5㎖의 각 배양주에 DNAase I(파아마시아사) 및 RNAase A(시그마사)를 첨가하여 최종농도가 1㎍/㎖이 되도록 하였다. 용액을 37℃에서 한시간 배양하였다. 다음에 5㎖의 20% 폴리에틸렌글리콜(시그마사), 2M NaCl을 가하고, 용액을 0℃에서 1시간 배양하였다. 12,000×g로 10분간 원심분리하여 λ파아지를 펠렛트화 하였다. 파아지 펠렛트는 250㎕ TE(10mM TRIS, pH7.4, 1mM EDTA) 중에서 재부유되고, 동일 용적의: a) 클로로포룸; b) 페놀; c) 클로로포룸 및 페놀의 1:1 혼합물; 및 d) 클로로포룸 순으로 연속적으로 추출하였다. 최종 농도가 0.25M이 되도록 초산 암모늄을 가하고, DNA는 2 용적의 에탄올 첨가 및 10,000×g의 원심분리에 의하여 침전되었다. DNA 펠렛트는 TE 중에서 재부유되었다.
6개 각각의 λ 분리주로부터의 DNA는 다양한 제한 핵산효소로 다이제스트되고 단편은 아가로우스 겔을 통한 전기 영동법으로 분리되었다(샘브룩 등). DNA 단편은 2개의 동일한 나이론 막으로 전이되고 (슐레이처(Schleicher) 및 슈엘(Schuell)) 쥐 GDNF로부터의 라디오라벨된 프로우브와 잡종형성되었다. 쥐 GDNF에 있어서, 뉴클레오티드 356 및 357(제13도의 순서에 따라) 사이에는 Eco R1 부위가 있다. 이것은 성숙 GDNF의 코드화 배열내에서 분활한다. 인체 게놈 GDNF 클론이 동등한 위치에 부위를 갖고 있는지를 결정하기 위하여, Eco R1을 인체 클론을 다이제스트하기 위한 하나의 제한 핵산효소로서 이용하였다. 쥐 GDNF의 Eco R1 부위의 상류(프로우브 1) 또는 하류(프로우브 2)의 유전자 영영에 대하여 특징 라디오레벨된 프로우브를 만들었다. 프로우브 1은 길이가 268bp이며, 쥐 GDNF의 5’비번역 배열의 14bp 및 코드화 배열(아미노산 1~85)의 254bp로 구성되었다.
그것은 중합효소 연쇄반응 및 올리고뉴클레오티드 프라이머 PD1 (GACGGGACTCTAAGATG)(SEQ ID NO:15)와 DHD23 (GCIGCIGC(C/T)TG(T/C)TT(A/G)TCIGG)(SEQ ID NO:16)을 이용하는 λZapII76.1 DNA의 증폭에 의하여 제조되었다. 프로우브를 제조하기 위한 반응조건은, 반응이 30사이클의: 95℃에서 1분간, 50℃에서 1½분간 및 72℃에서 1½분간으로 구성된다는 것을 제외하고는 상술한 바와 같다. 프로우브 2는 길이가 195bp이며 쥐 GDNF의 3' 비번역 배열의 17 뉴클레오티드 및 코드화 배열(아미노산 153∼211)의 178bp로 구성되었다. 그것은 중합효소 연쇄반응 및 올리고뉴클레오티드 프라이머 LF2 (CGAGACAATGTACGACA)(SEQ ID NO:17)와 PD2 (CTCTGGAGCCAGGGTCA)(SEQ ID NO:18) 및 DNA 주형으로서의 λZapII76.1을 이용하여 제조되었다. 반응조건은 프로우브 1에 대한 것과 동일하다.
6개의 λ클론 중 5개가 동일한 잡종형성 패턴을 나타내었다. 프로우브 1은 대략 700bp Eco R1 단편으로 잡종형성되고 프로우브 2는 대략 2.8Kb Eco R1 단편으로 잡종형성되었다. 2개의 프로우브가 2개의 상이한 Eco R1 DNA 단편으로 잡종형성 되었다는 사실은 인체 GDNF 유전자가 상동성의 Eco R1 부위를 함유한다는 것을 강력하게 제시한다. 700bp 및 1.8Kb Eco R1 단편은 별도로 블루스크립트 SK-(스트라타진사)로 서브클론화되었다. 이들 두 단편의 뉴클레오티드 배열은 실시예 2B에 기술된 바와같이 측정되었다. 이들 DNA 단편의 배열이 제19도(SEQ ID NO:5)에 도시된다. 이 배열로부터, 프레-프로 GDNF의 아미노산 52를 선도하는 개재배열이 존재한다는 것을 명백히 알 수 있다. 성숙 인체 GDNF에 대하여 코드화하는 유전자 부분에는 개재배열이 존재하지 않는다. 성숙 인체 GDNF의 예상 아미노산 배열은 성숙 쥐 GDNF에 대하여 상동성이 93%이다. 이것은 다른 신경영양성 인자에 대한 쥐 및 인체 단백질 중에서 발견된 아미노산 배열의 상동성과 대략 동일한 정도이다(쥐 및 인체 GDNF간의 아미노산 배열 상동성은 83%이다; 맥도날드 등, BBA(1991). 쥐 및 인체 NGF간의 아미노산 상동성은 95%이며 BDNF는 100%, 및 NT-3는 100%이다; 홀북등, 1991 Neuron 6:845-855).
완전한 인체 프레-프로 GDNF 배열을 얻기 위하여, 이미 얻어진 인체 GDNF 배열을 기초로하여, 라디오라벨된 잡종형성 프로우브가 제조될 수 있으며, 이를 이용하여 인체 cDNA 라이브러리를 스크린한다. cDNA는 가공 처리된 mRNA의 카피이기 때문에, 개재배열은 존재하지 않으며, 완전한 코딩 배열이 얻어질 수 있다. 선택적으로, 코딩 배열에 관한 개재배열의 위치가 알려지면, 개재배열의 상류 배열에 대하여 특이적인 잡종형성 프로우브는 쥐 cDNA 클론으로부터 제조될 수 있으며, 이 프로우브는 5' 엑손(들)을 함유하는 클론에 대한 게놈 라이브러리를 스크린하는데 이용될 수 있다.
D. 인체 프레-프로 GDNF의 최초 50 아미노산을 코드화하는 뉴클레오티드 배열
실시예 2C에서 상세히 설명한 바와같이, 인체 프레-프로 GDNF의 아미노산 51에 대응하는 뉴클레오티드 배열을 분리시키는 개재배열이 있다. 분자의 이 부분의 배열을 얻기 위하여, 쥐 프레-프로 GDNF의 아미노 말단 코딩 배열로부터 유도된 프로우브로 인체 게놈 라이브러리가 스크린되고, 하나의 잡종형성 클론이 배열결정되어, 제22도(SEQ ID NO:8)에 도시된 바와같이 인체 프레-프로 GDNF의 아미노산 1∼50의 코딩 배열을 함유하는 것으로 나타났다.
이 라이브러리 스크린을 위하여, 실시예 2C에 기술된 바와같이 하나의 PCR 프로우브가 합성되었다. 채택된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같다.
PCR(“콜드” (“cold”) 및32P-라벨화 모두) 반응의 조건은, 반응이 25 또는 30 사이클의: 95℃에서 1분간, 50℃에서 1½분간, 및 72℃에서 1분간으로 구성된다는 것을 제외하고는, 실시예 2B에 기술된 바와 같다. 이 반응 생성물은 쥐 프레-프로 GDNF의 최초 122bp 및 추정 개시제 ATG에 대한 14 염기쌍 5'를 함유한다(제13도 및 SEQ ID NO:3 참조). 이 프로우브로 인체 게놈 라이브러리를 스크린하는 조건은 실시예 2C에 기록된 바와 같다. 성숙 인체 GDNF에 대한 배열을 지닌 클론을 식별하기 위하여 사용된 동일 필터 리프트가, 비등점까지 가열된 탈이온 증류수 중에서 15분간 2회 세척되고, 철야로 탐침 및 실시예 2C에 기술된 프로토콜에 따라 세척되었다. 필터는 증감판과 함께 -70℃에서 3일간 필름에 노출되었다. 필름이 현상되었을 때, 다양한 강도의 수많은 중복 양성반응이 관측되었다. 12개의 비교적 강한 양성 반응체를 골라 이들 중 10개를 스크린 조건하에서 연속 라운드의 잡종형성에 의하여 플라크 정제하였다.
이들 재조합 파아지의 클론화 DNA를 사우턴 블롯트 잡종형성법으로 분석하였다. 대략 1,000bp AluI 단편이 프로우브로 잡종형성되는 것으로 밝혀졌으며, Smal-다이제스트된 pBluescript SK- 로 서브클로화되어 pBSSK-λ3AluI를 생성하였다. 이 클론화 Alul 단편은 다시 클론화되어 관련 DNA 세그먼트의 배열결정을 용이하게 한다. 정제된 pBSSK-λ3AluI DNA는 단지 한 번만 벡터를 분활시키는 (폴리링커 영역내에서) 일련의 제한효소로 다이제스트되고 다이제스트 생성물은 아가로우스 겔 전기영동법에 의하여 분석되었다. 2개의 제한효소(PstI 및 SacII)가 이와같이 클론화된 DNA내에서 1회 분활시킨 것으로 확인되었다. 제22도는 SacII 및 PstI 부위의 지도를 나타낸다. 사우턴 블롯트 처리결과는, 스크린 프로우브로 잡종형성 된 클론화 세그먼트의 영역이 클론화 AluI 세그먼트의 SacII 및 PstI 부위 사이에 위치하는 것을 밝혀내었다. 따라서, 배열결정을 위하여, pBSSK-λ3AluI의 2가지의 제거된 유도체를 구성하였다. 하나의 경우에는 다음과 같이 약 300bp의 작은 PstI 단편이 제거되었다: 플라스미드가 PstI로 다이제스트되고 다이제스트는 연결 및 대장균으로 전환되었다. 작은 PstI 단편이 결핍된 부분을 스크린하기 위하여 형질전환제를 처리하였다. 한편으로는, pBSSK-λ3AluI로부터 300bp SacII 단편이 유사하게 제거되어 제2의 제거 유도체가 제조되었다. 이들 두 제거 플라스미드는 반응물의 배열결정을 하는데 주형으로서 사용되었다. 배열결정 방법은 실시예 2B에 기술된 바와같이 이행되었다.
제22도(SEQ ID NO:8)는 이와같이 얻어진 배열의 233염기쌍을 나타낸다. 이 배열은 쥐 프레-프로 GDNF에 대한 코드화 배열의 최초 151bp과 고도의 상동성을 나타내는데; 아미노산 수준에서 88% 동일성; 및 DNA수준에서 95%의 동일성을 나타낸다. 따라서, 이 영역은 인체 프레-프로 GDNF의 아미노 말단 50잔기 및 잔기 51에 대한 코돈의 최초 뉴클레오티드의 코딩 배열을 운반하는 구조배열 부분이라는 결론이 나온다. 이 151bp 배열에 대한 인접 3' 배열은 포유동물 개재배열의 5' 단부에 대한 콘센서스 배열과 상동성이다 [샤피로 (Shapiro) 및 세나파티(Senapathy) 1987 Nucl, Acids Res. 15:7155-7144). 추정 개시제 ATG에 대한 인접 5' 배열은 28bp에 대한 쥐 배열과 강력한 상동성을 지니며; 28 잔기중 27이 동일하다. 이 지점에서 상류 배열은 예리하게 분기한다. 분기점 주위의 배열은 포유동물 개재배열의 3' 단부에 대한 콘센서스 배열과 상당한 상동성을 나타낸다(상기 샤피로 및 세나파티 문헌 참조). 따라서, 직접적인 증거는 없으나, 이것은 스플라이스 부위인 것 같다. 인체 프레-프로 GDNF를 함유하는 오픈 리딩 프레임은 개시제 ATG의 최소 27염기쌍 상류까지 연장된다. 상기 바람직한 구체예의 상세한 설명에서 논의된 바와같이, 별도의 상류 아미노산을 함유하는 다른 형태의 프레-프로 GDNF가 제조될 수 있다는 것이 가능하다. 이들 형태는 또한, 정제되고 배열결정된 성숙 GDNF 분자를 생성하도록 처리될 수 있는 것이다(실시예 1 참조).
이곳 및 실시예 2C에 제시된 뉴클레오티드 배열은, 포유동물 세포중에서 성공적으로 발현(실시예 5 참조)되어 활성 쥐 GDNF를 생성하는 쥐 프레-프로 GDNF와 상당한 상동성을 나타내는 인체 프레-프로 GDNF에 대한 전 코딩 배열을 함유한다.
[실시예 3]
[실험적 파킨슨씨병 증상을 예방하기 위한 GDNF의 이용]
본 실시예는 동물에 신경독소 MPTP(1-메틸-4-페닐-1,2,3,6 테트라히드로-피리딘)를 적절히 투여함으로써 원숭이에게 실험적 파킨슨씨병 증상을 일으키는 방법을 기술한다. 또한, 이와같은 동물의 파킨슨씨병 증상의 진전을 완화하기 위하여, MPTP에 노출된 동물에게 GDNF를 투여하는 방법을 기술한다.
A. MPTP로 처리되어 실험적 파킨슨씨병 증상이 발생된 원숭이에 GDNF의 투여
스테인레스 스틸 캐뉼러가 우측 뇌실에 이식되어 피하에 이식된 침투압 미니 펌프(Alzet 2002)에 연결될 수 있다. 미니 펌프는 다양한 농도의 GDNF 및 음성 대조용으로서 그 희석액을 내포한다. 펌프는 0.5μl/시간으로 14일간 운반한다. 캐뉼러-펌프 이식 2일 후, 원숭이 (세버스 아펠라(Cebus apella))는 우측 경동맥에 0.6mg/kg의 MPTP가 주입된다. 최초 이식 6주 후, 동물에 식염수를 살포하고 신속히 뇌를 제거하였다. 뇌는 얼음 위에서 해부되어 조직의 펀취가 미상핵 및 내피로부터 제거되었다. 흑질은 고정액에 놓여졌다. 미상 내피조직은 HPLC-EC에 의하여 도파민이 분석되었으며, 흑질은 티로신 히드록시라제(TH) 면역반응성을 위하여 처리되었다.
B. GDNF의 효율성
미상핵/내피에 대한 흑질 도파민 작동성 신경세포 및 그 축색돌기의 변성은 이 원숭이 모형에 파킨슨씨병 증상을 일으킨다. GDNF가 이 신경적 변성의 정도를 예방 또는 감소시킬 수 있다는 몇가지의 실험적 증상이 있다. 예를들면, GDNF는 흑질에서 TH 양성 신경세포체의 상실을 방지할 수 있다. 이것은 GDNF에 의하여 MPTP의 의 독성작용으로부터 흑질 도파민 작동성 신경세포가 구출됨을 가리킨다. GDNF는 또한 미상핵/내피의 TH 양성 섬유의 상실을 방지할 수 있다. 이것은 GDNF에 의하여 MPTP의 독성작용으로부터 흑질 도파민 작동성 뉴론의 축색돌기가 구출됨을 의미한다. GDNF는 또한 미상핵/내피의 도파민 함량의 상실을 방지할 수 있다. 이것은 GDNF에 의하여 MPTP의 독성작용으로부터, 흑질 도파민 작동성 뉴론으로부터 미상핵/내피까지 뻗어있는 축색 및 그 도파민 함량이 절약됨을 의미한다.
[실시예 4]
[GDNF에 대한 생물학적 활성 및 가능한 임상적 효능]
실시예 1에서 나타난 바와같이, 정제된 GDNF는, 영양강화배지 및 합성배지 모두에서, 태아 간뇌 신경세포의 배양주에 존재하는 도파민 작동성 뉴론에 의한 도파민 섭취를 증가시킨다. 이것은 GDNF가 이들 도파민 작동성 신경세포에 대한 신경영양성 인자라는 것을 가리킨다. 이와같이, GDNF는 파킨슨씨병에서 일어나는 이들 뉴론의 변성을 치료하는데 유용하다는 것을 증명할 수 있다. 또한 GDNF는 기타의 뇌 도파민 작동성 뉴론의 부적절한 기능을 치료하는데 유용하다는 것을 입증할 수 있다. 이와같은 부적절한 기능은 신경 분열증 및 기타 신경안정제에 의한 치료가 요구되는 질병에서 발생한다.
A. 정제된 GDNF는 배양주에서 교감 및 부교감 신경세포의 생존을 촉진시킨다.
1. 신경 생존율에 대한 검정법:
[재료]
시그마 케미칼 코(Sigma Chemical Co, 센트루이스, 미조우리주)로부터 3-[4,5-디메틸티아졸-2일)-2.5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드(MTT)를 얻었다. 암송아지 혈청은 하이클론 레보러토리스(Hyclone Labolatories, 로간, 유타주)로부터 구입하였다. 배지 및 염용액은 이르빈 사이언티픽(Irvine Scientific, 산타아나, 캘리포니아주)로부터 얻었다. 배양접시는 코스타사(Costar, 캠브리지, 마샤츄세츠주)로부터 얻었다. 실용급의 임성(妊性)의 무병원체인 닭 태아 겨란은 스파파스사(Spafas, 로아노크, 일리노이스주)로부터 얻었다.
[검정법]
닭 태아 모양체 신경절 및 교감사슬 신경절의 배양주를 기존 방법(콜린스 1978 Develop, Biol. 65:50: 맨토프 등, 1986 Develop. Brain Res. 25:191)에 따라 제조하였다. 간략히 요약하면, 모양체 교감 신경절을, 38℃의 가습 대기중에서 각각 8 및 10일간 배양된 임성의, 무병원체인 닭 겨란으로부터 제거하였다. 신경절을 우선, pH7.2, 10mM HEPES 완충액을 함유하며, 2가의 양이온이 없는 항크스 균형염 용액중의 0.12% 박토트립신 1:250(디프코(Difco)사, 데트로이트, 미시간주) 용액에 37℃에서 12분간 노출함으로써, 화학적으로 처리되었다. 최종농도가 10%가 되도록 암송아지 혈청을 첨가함으로써 트립신화를 종결하였다.
이 처리후에, 신경절은, 10% 암송아지 혈청 및 pH7.2, 10mM HEPES를 함유하는, 중탄산염이 없는 둘베코의 고 글루코오스 모디파이드 이글 배지로 구성되는 용액으로 전이되어, 개구가 불로 연마되고 피펫드를 채우는데 2초가 걸리도독 직경이 만들어진 유리 파스토로(Pasteur) 피펫드를 통하여 약 10회 연마됨으로써 기계적으로 처리되었다.
다음에 처리된 신경절은 3시간 동안 100mm 직경의 조직 배양 접시에서 배지(10% 암송아지 혈청, 4mM 글루타민, 60mg/l 페니실린-G, 25mM HEPES, pH7.2로 보충된 둘베코의 모디파이드 이글 배지)에 판상화되었다(접시당 40 해리된 신경절). 이 예비 판상화는 접시에 부착되지 않는 신경세포로부터, 접시에 부착되는 비신경세포를 분리하기 위하여 수행된다. 3시간 후, 원심분리에 의하여 비접착 신경세포를 수집하여, 배지에서 재부유하고, 96웰 마이크로타이터(microtiter) 조직 배양판 상에서 웰당 1500 신경세포의 밀도로 웰당 50μl로 판상화 하였다. 마이크로타이터 웰은 미리 pH8.4, 10mM 붕산 나트륨중의 1mg/ml 폴리-L-오르니틴 용액에 4℃에서 철야로 노출되고, 증류수로 세척 및 공기건조되었다.
각 웰에, 신경영양성 인자 활성 검정대상 샘플의 10μl의 연속 희석액을 첨가하고, 7.5% CO2를 함유하는 가습 대기중에서 20시간동안 37℃로 접시를 배양하였다. 모양체 신경절에 대하여는 18시간, 교감 신경절에 대하여는 40시간 후에, 웰당 15μl의, pH7.2, 10mM HEPES를 함유하는 중탄산염이 없는 둘베코의 고 글루코오스 모디파이트 이글 배지의 테트라졸륨 염료 MTT 1.5mg/ml 용액을 가하고, 배양주를 4시간 동안 37℃의 인큐베이터에 두었다. 다음이 이소프로판을 리터당 6.7ml의 12M HCl 용액 75μl를 첨가하고, 각 웰의 내용물을 30회 연마하여 세포를 파개하고 염료를 부유하였다. 자동 마이크로타이터 플레이트 리더(다이나텍크(Dynatech)사, 칸틸리, 버지니아주)를 이용하여 각 웰의 표준 690nm에 대하여 570nm의 흡수도가 측정되었다. 어떤 신경영양성 인자 제제도 받지 않은 웰(음성 대조)의 흡수도는 샘플 함유 웰의 흡수도에서 감해졌다. 얻어진 흡수도는, 염료를 감소시킬 수 있는 신경세포에서 규정된 바와같이, 각 웰의 생세포수에 비례한다. 신경영양성 인자 활성의 영양단위 수치는 신경세포의 최대 생존율의 50%를 나타내는 희석의 역수로 정의된다. 비활성은 영양단위의 수치를 샘플에 존재하는 단백질의 양으로 나눔으로써 측정된다.
[결과]
제15도에 예시한 바와같이, 정제된 GDNF는 배양주에서 닭 태아 모양체 신경절로부터의 부교감 신경세포의 생존을 촉진시킨다. 제16도에서 설명한 바와같이, 정제된 GDNF는 또한 배양주에서 닭 태아 교감 사슬 신경절로부터의 교감신경세포의 생존을 촉진시킨다.
이들 결과는 GDNF가 교감 및 부교감 뉴론에 대한 생존인자로서 작용함을 가리킨다. 이와같이, 자율(즉, 교감 및 부교감) 신경계에 대한 다양한 형태의 신경상해를 치료하는데 유용할 수 있다. 이와같은 손상은 당뇨병 또는 신장 기능장해와 같은 신진대사 조건으로부터 발생할 수 있다. 이와 같은 손상은 또한, 암 화학요법 치료제 시스플라틴 및 빈크리스틴, 또는 AIDS 화학요법 치료제 ddI 및 ddC와 같은 다양한 화학요법 치료제로 환자를 치료함으로써 발행할 수도 있다. 이와같은 손상은 또한, 자율신경 장해와 같은 유전적 조건에서도 발생할 수 있다. 이와같은 손상은 또는 외상성 상해로부터도 발생할 수 있다.
[실시예 5]
[동물세포에서의 재조합 GDNF의 발현]
A. COS 세포 발현을 위한 재조합 플라스미드의 구성
전체의 GDNF 코드화 배열을 함유하는 pBluescript SK-76.1의 약 1.5kb SmaI 단편이, COS 세포와 같은 SV 40 T 항원을 발현하는 세포에서의 클론화 유전자의 일시적 발현을 위하여 고안된, 플라스미드 벡터 pSG5 (그린 (Green)등, 1988 Nucl. acids. Res.16:369)로 서브클론화되었다.
GDNF cDNA의 DNA 배열(제13도)(SEQ ID NO:3) 및 제한 핵산효소의 유전 지도 제작결과, 벡터의 폴리링커(cDNA 클론의 18bp 5'에서 5'단부)에 위치한 하나의 SmaI 부위 및 성숙 GDNF 대한 코드화 배열에 대략 800bp 3'의 cDNA 클론내에 위치한 하나의 SmaI 부위(∼1500bp 거리)에 의하여 묘사된 SmaI 단편을 확인하였다: 정제된 pSG5 플라스미드 DNA(스트라타진사)는, 판매자의 프로토콜에 따라, EcoRI으로 다이제스트되어 송아지 장관 알카리성 포스파타제(CIAP, Calf Intestinal Alkaline Phosphatage)(Promega사)로 처리되었다. 계속하여 벡터는 전기영동 처리되고 아가로우스 겔로부터 용출되었다. 정제된 pBluescript SK-76.1 플라스미드 DNA는 EcoRI 메틸라제로 메틸화되고, SmaI로 다이제스트 및 실시예 2A에 기술된 EcoRI 링커 분자로 연결되었다. EcoRI 다이제스트 및 아가로우스 겔 전기 영동처리 후, 대상물(현재의 EcoRI 메틸화 및 결합된)의 약 1.5kb SmaI 단편이 용출되어 EcoRI 다이제스트 및 포스파타제 처리된 pSG5 벡터에 연결되었다. 결합 생성물은 CaCl2공정(상기 마니아티스 등의 문헌 참조)을 이용하여 적절한 대장균 XL1-블루를 형질전환하는데 이용되었다. 암피실린-저항성 형질전환제가 선별되어 제한 핵산효소 및 아가로우스 겔 전기영동법에 의하여 재조합 플라스미드에 대하여 분석되었다. EcoRI에 의한 다이제스트의 결과는 대부분의 형질전환제가 소정의 삽입체를 지닌 플라스미드를 함유한다는 것을 가리킨다. BamHI에 의한 다이제스트는 벡터에 존재하는 SV40 촉진인자와 관련된 클론화 GDNF 유전자의 배향을 확인하였다(제13도의 배열의 위치 15에 있는 BamHI 부위를 유의할 것). 두 배향이 얻어졌다.
다음 분석을 위하여 2개의 형질전환체가 선택되었다; 하나는, SV40 촉진인자에서 개시된 RNA 전사체에서 발현되기에 적절한 배향으로 GDNF 유전자를 운반하는, pSG5::rGDNF-4라는 플라스미드를 함유한다. 이들 양 플라스미드의 정제된 제품은 COS 세포 발현 시험용으로 CsCl 밀도 계층별 원심분리에 의하여 제조되었다.
B. COS-7 세포에서의 GDNF의 발현
알카리성 분해에 이어 CsCl 밀도 원심분리 방법에 의하여 이들 구조로부터 플라스미드 DNA를 제조하였다(마니아티스 등의 상기 문헌 참조). 이 DNA는 솜페이락(Sompayrac) 및 단나(Danna)의 방법에 의하여, COS-7 세포로 형질이입되었다(1981, Proc, Natl, Acad, Sci, USA 78:7575-7578). 대조용으로서, 동등한 COS 세포 배양주가, GDNF의 발현을 허용하지 않는 반대 배향으로 GDNF 삽입체를 함유하는 플라스미드 벡터 DNA로 형질이입되었다. 100mm 배양접시당, 30μg의 리포펙틴(lipofectin) 및 0.3∼1μg의 플라스미드 DNA가 사용되었다.
24시간 형질이입 후, 배지에서 가스가 흡입되고, OptiMEM I ± 3% FCS로 대체되었다. 배양주는 48시간 배양되어 다음과 같이 수확되었다:
a) 배지(조절배지 즉 CM)는 빼내어 -80℃에서 저장;
b) 5ml의 PBS + 2.5mM EDTA를 세포 잔디에 첨가하고 25℃에서 3분간 고정한 후, 접시로부터 세포를 빨아들여 1000×g에서 5분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 세포 펠렛트를 -80℃에서 저장하였다.
CM은 센트리콘(Centricon)-10 농축기로 30배로 농축되어 생물학적 활성이 검정되었다. 세포 펠렛트는 pH7.0, 500μl, 10mM EDTA, 1mM 벤자미딘, 100μM PMSF, 1mM E-아미노-N-카로산 중에서 음파처리 되었다. 세포 용해 물질은 14.000×g로 5분간 원심분리되어, 상청액을 생물학적 활성에 대하여 분석하였다.
C. 발현된 GDNF의 생물학적 검정법
GDNF-발현체로 형질이입된 COS 세포로부터의 배지 및 세포 용해물질과 대조 플라스미드(부적절한 배향으로 GDNF 코드화 배열을 지닌)를, 간뇌 뉴론 배양주에서의 도파민 섭취능력(실시예 1 참조) 및 교감 신경절 뉴론의 생존율을 증가시키는 능력(실시예 4 참조)에 관하여 분석하였다. COS 세포 배지(제17도) 및 세포 용해물질(데이터가 도시되지 않는)은, GDNF에서 예상된 바와같이, 도파민 섭취를 증가시켰다. 제18도에 도시한 바와같이, COS세포 배지 및 세포 용해물질은, GDNF에서 예상된 바와같이, 교감사슬 뉴론의 생존율을 증가시켰다.
이들 결과는, 동물세포중의 GDNF의 발현으로, 정제된 GDNF에서 나타나는 생물학적 활성을 지닌 단백질을 생성된다는 것을 가리킨다.
[실시예 6]
[대장균에서의 인체 GDNF의 발현]
A. 인체 GDNF를 코드화하는 플라스미드의 구성
인체 GDNF 유전자의 배열정보를 이용하여(실시예 2C), 인체 GDNF 유전자의 증폭 및 대장균에서 플라스미드 발현 벡터로부터의 발현용 프라이머로서, 합성 올리고뉴클레오티드 PD3 및 PD4가 제조되었다. 올리고뉴클레오티드 PD3(SEQ ID NO:21) 및 PD4(SEQ ID NO:22)의 배열은 다음과 같다:
올리고뉴클레오티드 PD3은 길이가 46 뉴클레오티드이다. 3' 단부에 있는 17 뉴클레오티드는 성숙 단백질의 N-말단을 코드화하는 영역에 있는 인체 GDNF와 완전한 짝을 이룬다. 이들 17 뉴클레오티드는 번역개시 코돈, ATG에 의하여 선도되어, 성숙 인체 GDNF의 합성이 대장균의 올바른 아미노산에서 출발하게 된다. 기타의 뉴클레오티드가 고안되어, GDNF 발현 플라스미드의 구성에 필요한 BamHI 핵산효소 제한부위는 물론, 대장균에서의 양호한 발현에 필요할 것으로 보이는 기타의 시그널을 제공하게 된다.
올리고뉴클레오티드 PD4는 26 뉴클레오티드 길이이다. 3' 단부에 있는 17 뉴클레오티드는 종지 코돈의 인체 GDNF 유전자 3' 의 17 뉴클레오티드와 완전한 짝을 이룬다. 이 올리고뉴클레오티드도 GDNF 발현 플라스미드 구성용 KpnI 제한 핵산효소 부위를 재구성하는데 필요한 배열을 제공한다.
인체 GDNF의 증폭을 위한 반응조건은 다음과 같다: 총 반응용적은 100μl 이며, 인체 GDNF 유전자, 각 20pmol의 PD3 및 PD4, 20mM 트리스-HCL lH 8.8, 10mM KCl, 6mM (NH4)2SO4, 1.5mM MgCl2, 및 0.1% 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 1ng의 λDNA 클론을 함유한다. 반응 혼합물은 95℃로 5분간 가열, 44℃로 냉각되고, 2 유니트의 Pfu DNA 폴리머라제(스트라타진사)가 첨가된다. 반응은 30회의: 72℃에서 1½분간, 95℃에서 1분간 및 44℃에서 1½분간으로 구성된다. 반응종결 시점에서, MgCl2가 첨가되어 최종 농도를 10mM으로 한다. 5유니트의 DNS 폴리머라제 I 대형(클리나우(Klenow)사) 단편(프로메가사)이 첨가되고 반응은 37℃에서 10분간 배양된다. 다음에 10μl의 3M NaAc 및 220μl의 EtOH를 가하고, 용액이 12,000×g로 15분간 원심분리되어 DNA가 침전된다. 침전된 DNA 100μl의 50mM 트리스-HCL(pH8), 50mM NaCl, 10mM MgCl2, 20 유니트의 BamHI 및 20 유니트의 KpnI 중에서 재부유되고 37℃에서 1시간 배양되었다. 아가로우스 겔을 통한 전기 영동처리 및 울트라프리-MC 필터 유니트(밀리포어사)를 이용한 정제 후에, 바른 크기의 DNA 단편이 확인되었다. 이 단편은 대장균 발현 벡터, pT3XI-2(아래에 기술됨)로 연결되었다. 연결 조건은 다음과 같다: 총 반응 용적은 5μl이며 KpnI 및 BamHI로 선형화된 10ng의 pT3XI-2 DNA, 상술한 바와 같은 5ng의 인체 GDNF DNA 단편, 50mM 트리스-HCL(pH7.6), 10mM MgCl21mM ATP, 1mM DTT, 5% 폴리에틸렌글리콜-8000 및 1 유니트의 T4 DNA 리가아제(Bethesda Research Laboratories)를 함유한다. 반응은 14℃에서 2시간 배양되었다.
다음과 같은 방법으로 벡터 pT3XI-2가 구성되었다. 이 구성을 위한 출발 플라스미드는 파아마시아사로부터 구입한 플라스미드 pKK223-3(브로시우스(Brosius) 및 홀리(Holy) 1984)이었다. 플라스미드 pKK223-3은 테트라사이클린 저항성의 일부 유전자를 지닌다. 이 비기능성 유전자는 플라스미드 pBR322상에 지니고 있는 완전한 테트라사이클린 저항성 유전자로 대치되었다. 플라스미드 pKK233-3은 SphI로 완전히 및 BamHI로 부분적으로 다이제스트되었다. 4.4 킬로 염기쌍 단편이 겔 정제되어 합성 어뎁터(SEQ ID NO:23):
및 pBR322의 테트라사이클린 저항성 유전자(PL Biochemicals, 27-4891-01)의 ClaI, SphI 다이제스트로부터 나온 DNA의 539 염기쌍 단편과 결합되었다. 얻어진 플라스미드는 pCJ1이라 한다.
다음에, 뉴잉글런드 바이오라브사로 구입한 XhoI 링커를 플라스미드 pCJ1의 PvuII 부위에 삽입하여 플라스미드 pCJX-1을 형성하였다. 이 삽입 작용은 플라스미드 카피수를 조절하는 rop 유전자를 분쇄한다. 다음에, lacI 유전자를 함유하는 EcoRI 어댑터에 대한 XhoI를 지닌 XhoI 부위로 삽입되었다. 플라스미드 pKK223-3의 폴리링커 영역은 다음에 EcoRI 및 PstI으로의 절단에 의하여 추가의 부위를 함유하는 폴리링커로 대체되었다(SEQ ID NO:24):
이와같이 얻어진 벡터를 pCJXI-1이라 한다.
마지막으로, 테트라사이클린 저항성 유전자가 아황산수소염 돌연변이에 의하여 파괴된 제한효소 SalI, BamHI 및 HindIII에 대한 인식부위를 갖고 있는 유사한 인자로 대체된다. 하기 공정은 pBR322의 테트라사이클린 저항성 유전자를 돌연변이하는데 이용되었다. 플라스미드 pBR322를 HindIII으로 절단한 후, 아황산수소나트륨으로 돌연변이 시켰다(쇼틀(Shortle) 및 보트스테인(Botstein), 1983). 돌연변이 된 DNA는 결합되어 환상 DNA를 형성한 후, HindIII로 절단되어 돌연변이를 회피한 임의의 플라스미드를 선형화한다. E. coli JM109(야니쉬-페론(Yanisch-Perron)등, 1985). 테트라사이클린 저항성 플라스미드는 유리되어 테트라사이클린 저항성 유전자 내의 HindIII 부위의 상실여부가 검사된다. 성공적으로 돌연변이된 플라스미드를 pT1이라 한다. 계속하여 유사한 공정으로 pT1내의 BamHI 부위를 돌연변이시켜서 플라스미드 pT2를 생성한다. 플라스미드는 pT2는 다음에 돌연변이되어 SalI 부위가 제거되고, 플라스미드는 pT3를 형성한다. 돌연변이된 테트라사이클린 저항성 유전자를 지니는 pT3의 ClaI-StyI 단편은 유리되어 pT3XI-2를 형성하기 위한 PCJXL-1의 상동성 단편을 대치하는데 이용되었다. 돌연변이된 테트라사이클린 저항성 유전자는 여전히 기능 단백질을 코드화한다. 다른 부위중에서, 대장균에서의 발현용 유전자의 클론화에 유용한 BamHI 및 KpnI 제한부위를 함유하는 폴리링커가, tacIII 촉진인자 영영의 하류에 도입되었다. 벡터와 인체 성숙 GDNF 구조물과의 결합 2시간 후, 2μl의 반응혼합물을 이용하여 제조자의 지시에 따라 Epicurian Coli SURE초능력 대장균 세포(스트라타진사)를 형질전환하였다. 재조합 플라스미드중 하나의 DNA 배열이 실시예 2B의 방법으로 측정되었다. 배열은 이 플라스미드가 성숙 인체 GDNF에 대한 코드화 인체 GDNF 유전자의 완전한 코딩 배열을 함유한다는 것을 확인하였다.
B. 대장균에서의 인체 GDNF의 발현
인체 GDNF를 코드화하는 DNA 배열을 함유하는 재조합 플라스미드가, 샘브룩 등(1989)에 서술된 CaCl2방법을 이용하여 대장균주 JM107ØrMCB0005, JM107의 T1 저항성 변이체(야니쉬-페론 등(1985))로 형질전환되었다. 재조합체 중의 하나는 100μg.ml 앰피실린(시그마사)을 지닌 50ml의 LB 배지(샘브룩 등) 중에서 37℃에서 철야로 흔들면서 성장되었다. 다음날, 배양주를 100μg/ml 앰피실린을 지닌 LB 배지중에서 1:70으로 희석하였다. 8,000×g로 10분간 원심분리하여 20ml의 세포를 수확하였다. 펠렛트는 4ml의 pH7.4, 100nM EDTA에서 재부유 되었다. 18,000 psig로 프랜치 프레스 프레슈어 셀(French Press Pressure Cell, SLM Instruments사 제조)을 사용하여 세포를 분쇄하였다. 용해물질은 12,000×g로 40℃에서 15분간 원심분리하였다. 펠렛트는 10mM EDTA 중에서 재부유되었다. 발효가 37℃보다는 42℃에서 일어나도록 허용될 경우 보다 많은 GDNF가 수집된다는 것을 알았다.
실시예 6A에 기술된 재조합 플라스미드(여기서 인체 성숙 GDNF에 대한 코드화 배열은 발현 벡터 pT3XI-2에서 클론화된다)를 이용하여 대장균에서 다량의 GDNF 발현체를 얻는 바람직한 방법은 다음과 같다. 10ml의 발효를 위하여, 500ml 접종물이 15μg/ml의 테트라 사이클린을 함유하는 LB 배지(pH7)에서 37℃로 2리터의 바플장치된 진동 플라스크에서 성장되어 2∼3의 광학밀도(A660)가 되었다. 이 배양주는, 12g/l의 트립톤, 24g/l의 효모 추출물, 25g/l의 글리세롤, 1.3g/l의 K2HPO4, 0.4g/l의 KH2PO4, 0.1ml/l의 마콜(Macol) 19:GE60 4:1 혼합물 및 15mg/l의 테트라 사이클린 HCl을 함유하는 10ml의 성장배지를 접종하는데 사용되었다. 이 배양주는 42℃에서 12∼18시간 성장되어 광학밀도(A660)가 약 12∼20이 되었다. 발효물의 pH는 7.0으로 유지되었으며 용존산소는 30% 포화상태로 유지되었다. 발효후, 배양주는 4℃로 냉각되고 원심분리에 의하여 수확되었다.
상술한 이 플라스미드로부터의 인체 GDNF 제조방법은 대장균의 이 균주에는 특이적이 아니나 임의의 적절한 균주에서 생성될 수 있다. 플라스미드는 2개의 다른 균주인 E. coli JM108 (야니쉬 페론 등, 1985) 및 SURE(스트라타진 사)으로 형질전환되었다. 이들 양 균주에서 정분자량의 새로운 단백질 밴드가, 폴리아크릴아미드 겔을 통한 전기영동처리 후 쿠마시 블루 착색에 의하여 가시화되었다.
재부유 물질의 일정부분이 폴리아크릴아미드 겔을 통하여 전기 영동 처리되었다. 겔은 쿠마시 블루로 착색되었다. GDNF에 대한 예상 분자량 (15,000달톤)은 오직 재조합 인체 GDNF를 함유하는 배양주에만 존재할 뿐, 벡터 pT3XI-2만을 함유한 배양주에는 존재하지 않았다. 회수된 단백질은 표준 아미노 말단 배열결정 방법으로 처리되고, 이 단백질의 최초 22 아미노산이 제19도에 도시한 바와같이 인체 GDNF의 아미노산 배열과 동일함으로써 인체 GDNF가 대장균에서 바르게 발현되었음을 확인하였다.
C. 박테리아에서 제조된 재조합 인체 GDNF의 재중첩 및 생물학적 활성
재중첩용 재료의 재조 : 대장균 형질전환제 JM107 (pT3X12::huGDNF)이, 효모 추출물(#0127-01 Difco Laboratories, 데트로이트, 미시간주) 및 트립톤(#0123-05, 디프코 레보러토리스, 데트로이트, 미시간주) 기재 복합배지(24g/l 효모추출물, 12g/l 트립톤, 5g/l 글리세롤, 1.3g/l K2HPO4, 0.4g/l KH2PO4, p.1ml/l 마콜 19/GE60 (4:1), 15mg/l 테트라사이클린)에서 IPTG 도입없이 37℃에서 고정상으로 성장되었다. 세포를 JA10 로터중에서 16,000×g로 4℃에서 20분간 원심분리하고 세포 페이스트는 20℃에서 저장하였다.
세포는 다음과 같이 처리하였다: 5그람의 세포 페이스트를 OCI 인스트루먼츠(Instruments) 균질기를 사용하여 얼음 위에서 pH7.0, 40ml의 10mM EDTA로 균질화하였다. 슬러리를 20,000 psi로 3회 프랜치-프레스 처리한 후 JA 20 로터에서 30,000×g로 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 상청액을 부어내고 펠렛트를 상기와 같이 균질화 및 원심분리 하였다. 하나의 구체예에서, 재추출로부터 얻은 펠렛트는 pH7.4, 40ml의 25mM 트리스로 균질화되고, 상기와 같이 원심분리되며 상청액을 따라낸다. 펠렛트는 8M 뇨소를 함유하거나 또는 30mM 2-메르캅토에탄올을 첨가하지 않은 pH8.0, 40ml의 10mM 아황산나트륨 및 10mM 테트라티온나트륨을 함유하는 pH7.4, 25ml의 인산염으로 균질화 되었다. 술포닐화는 4℃에서 철야로 저으면서 진행되도록 방치된 후, 16,000×g로 4℃에서 10분간 원심분리하여 용액을 투명하게 하였다.
재중첩전의 TU 추출물의 부분 정제: TU 추출물은 S-세파로우즈 파스트플로우(S-Sepharose Fast Flow) 수지(파아마시아사 제조)상의 이온교환 크로마토그라피에 의하여 부분적으로 정제되었다. 칼럼은 평형화되고 8M 뇨소 및 30mM 2-메르캅토에탄올을 함유하는 pH7.4, 25mM 트리스(완충액 A)중에서 실온에서 주행되었다. 샘플을 적재한 후, 기준 광학밀도까지 완충액 A로 세척하고, 각각 완충액 A 및, 8M 뇨소, 500mM MaCl 및 30mM 2-메르캅토에탄올을 함유하는 pH9.0, 100mM 트리스(완충액 B)의 5 칼럼 용적으로 분당 10% 칼럼 용적으로 칼럼이 용출되었다. 칼럼 분획은 280nM에서 조사되고 SDS-PAGE에 의하여 분석되었다. GDNF는 60∼70%의 계층에서 주단백질 피크로서 용출되었다. GDNF 부유 분획은 재중첩용으로 수집되었다(제25도).
재중첩전의 술포닐화 추출물의 부분 정제: Q-세파로우즈 파스트 플로우 수지(파아마시아사)상의 이온교환 크로마토그라피에 의하여 술포닐화 추출물이 부분적으로 정제되었다. 칼럼은 평형화되고 4M 뇨소를 함유하는 pH 8.0, 10mM 트리스(완충액 A)로 4℃에서 주행되었다. 샘플을 적재한 후에, 기준 광학밀도까지 완충액 A로 세척하고, 각각 완충액 A 및, 4M 뇨소 및 500mM NaCl을 함유하는 pH8.0, 10mM 트리스(완충액 B)의 5칼럼 용적으로 분당 5% 칼럼용적으로서 칼럼이 용출되었다. 칼럼 분획은 280nM에서 조사되고 SDS-PAGE에 의하여 분석되었다. GDNF는 50%의 계층에서 주단백질 피크로서 용출되었다. GDNF 부유 분획은 재중첩용으로 수집되었다.
부분적으로 정제된 TU 추출물의 재중첩: 상기와 같이 부분적으로 정제된 GDNF는 다음과 같이 재중첩 되었다: 약 1mg/ml로 GDNF를 함유하는 4ml의 수집된 칼럼 용출액에 5mM로 디티오트레이톨을 첨가하였다. 공기가 방출될 정도로 튜브에 뚜껑을 덮고 25℃에서 15분간 고정하였다. 다음에 산화된 글루타티온 디소디움 염을 15mM으로 첨가하고, 다시 공기가 배기될 수 있도록 뚜껑을 덮어, 25℃에서 15분간 고정하였다. 다음에 이 용액은 14용적의 재중첩 완충액(100mM NA2HPO4, 4M 뇨소; 5% 폴리에틸렌글리콜 300; 및 2mM 시스테인을 함유하는 pH8.3, 10mM 에탄올아민)으로 희석되고 아르곤하에서 5℃로 3일간 고정되었다.
부분적으로 정제된 술포닐화 추출물의 재중첩: 상기와 같이 부분적으로 정제된 GDNF는 다음과 같이 정제되었다: 약 3mg/ml로 GDNF를 함유하는 수집된 칼럼 용축액을 19용적의 재중첩 완충액(100mM Na2HPO4, 4M 뇨소; 5% 폴리에틸렌글리콜 300; 및 3mM 시스테인을 함유하는 pH8.3 트리스)으로 희석되고, 아르곤하에서 5℃로 3일간 고정되었다.
SDS-PAGE에 의한 재중첩 GDNF의 분석: 환원제에 미리 노출됨이 없이 박테리아로부터 추출된 GDNF가 분자량 표준 단백질의 이동에 비할 때 약 16kDa의 겉보기 분자량으로 SDS-PAGE 상의 단량체로서 이동하였다. 2량체의 위치에서는 검출할 수 있는 GDNF가 없었다. 추출기간 중이나 또는 SDS-PAGE 직전, 재중첩 전에 환원제(30∼150mM 2-메르캅토에탄올)에 노출된 GDNF는, 겉보기 분자량이 약 16kDa로, 비환원 박테리아 단백질과 구별할 수 없는 위치에서 이동하였다(제26도 레인 6 및 13). 이것은 박테리아 세포로부터 제조된 GDNF는 재중첩 전에 2량체화 되지 않는다는 것을 가리킨다.
상기와 같이 재중첩된 후, 대부분의 박테리아적으로 제조된 재조합 GDNF는 겉보기 분자량이 약 30kDa로서 비환원 SDS-PAGE 상에서 이동한다(제26도 레인 2). SDS-PAGE 이전에 150mM 2-메르캅토에탄올로 재중첩된 GDNF를 환원하면 다시 약 16kDa의 단량체의 위치에서 이동시키게 된다(제26도 레인 5). 이들 결과는 GDNF를 재중첩하면 단백질이 디술피드 결합 2량체가 되게 한다는 것을 가리킨다. 재중첩된 GDNF의 SDS-PAGE는 환원없이 주행되며 겔이 길이 방향으로 쪼개져서, 슬라이스는 교감 신경절 뉴론 생존율 검정에 있어서의 생물학적 활성이 분석되었다(하기 참조). 오직 검출 가능한 생물학적 활성이 2량체의 위치에 존재한다는 것은 2량체가 생물학적으로 활성이라는 것을 의미한다.
가역상 HPLC(RP-HPLC) 상에서의 재중첩 GDNF의 분석: 재중첩 전에, S-세파로우즈 또는 Q-세파로우즈 크로마토그라피에 의하여 부분적으로 정제된 GDNF는, 아래에 기술된 바와같이 수행된 RP-HPLC 상에서 약 21분간 유지되면서 이동하였다. 재중첩 후의 GDNF는 동일한 조건하에서 약 15분간 유지되면서 이동하였다. 유지시간의 교체로 성공적인 GDNF의 재중첩이 예상된다. PH-HPLC 상에서의 유지시간의 교체는 단백질의 재중첩 후에 관측된다는 것을 흔히 알 수 있다.
이들 샘플의 RP-HPLC는 다음과 같이 수행되었다: 유속 1ml/분: 0.46X 25cm C-4 칼럼(VyDac #214TP54)은 다음과 같이 진전되었다: 용매 A = 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 수용액: 용매 B = 0,1% TFA 아세토니트릴 용액; 0.5∼1.5분간, B는 5%에서 25%로 증가; 1.5∼31.5분간, B는 25%에서 55%로 증가.
생물학적 검정법에 의한 재중첩 GDNF의 분석: 재중첩 GDNF는, 닭 태아(E10) 교감신경절 뉴론 생존율 생물학적 검정(실시예 4A) 및 쥐 태아(E16) 간뇌 배양주 도파민 섭취 생물학적 검정(실시예 1B)의 양면에서 생물학적으로 검정되었다. 재중첩 전에 상기와 같이 30mM 2-메르갑토에탄올에 노출되고 S-세파로우즈 또는 Q-세파로우즈 크로마토그라피에 의하여 정제된 GDNF는 간뇌 배양주 도파민 섭취 검정에 있어서 검출될 만한 생물학적 활성을 크게 저하시켰다. S-세파로우즈 크로마토그라피 처리된 물질의 교감 뉴론 생존율 검정에서의 겉보기 ED50은 약 1μg/ml인데, 이것은 재중첩된 rhGDNF보다 약 333배 낮은 것이다(하기 참조). Q-세파로우즈 크로마토그라피 처리된 물질의 경우에는, 교감 뉴론 생존율 생물학적 검정에서의 겉보기 ED50이 약 3μg/ml이었는데, 이것은 재중첩된 rhGDNF보다 약 100배 낮은 것이다(하기 참조). 재중첩 후, 2-메르캅토에탄올에 대한 미리 노출하거나 노출하지 않는 GDNF는 양방의 생물학적 검정에서 명백히 완전한 활성이었다(제27∼28도). 이 결과는 GDNF가 재중첩 결과 현저한 생물학적 활성을 얻었으며, 재중첩 전의 감소된 또는 결여된 생물학적 활성은 2-메르캅토에탄올에 대한 노출 때문이 아니라는 것을 가리킨다.
이들 생물학적 검정에서의 재중첩 재조합 인체 GDNF(rhGDNF)의 ED50은, B49 세포 조절 배지로부터 정제된 쥐 GDNF에 대하여 이전에 관측된 것과 유사하였다. 교감 뉴론 생존율 생물학적 검정에 있어서, rhGDNFdml ED50은 약 3ng/ml(제27도)이며 쥐 GDNF의 ED50은 약 5ng/ml이었다. 간뇌 배양주 도파민 섭취 검정에 있어서, rhGDNF에 대한 ED50은 약 30pg/ml(제28도)이며 쥐 GDNF의 경우는 약 50pg/ml이었다. 이들 결과는 rhGDNF의 실질적인 부분이 성공적으로 재중첩되었으며 완전히 생물학적으로 활성이라는 것을 가리킨다.
[실시예 7]
[GDNF에 대한 항체의 제조 및 유리]
다음과 같은 방법에 의하여 rhGDNF에 대한 항체가 생성되었다. 이 공정은 다음의 보조제, 면역화 프로토콜 및 동물류를 내포하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, GDNF에 대한 항체는, 재중첩된 천연 단백질 또는 아래에 제시된 공정에서와 같이 변성된, 불활성 단백질을 이용하거나 또는 인체나 기타 동물류로부터의 GDNF 배열의 근접 펩티드로 발생될 수 있다.
단일 클론성 항체는 수많은 표준 방법중의 하나에 의하여 생성될 수 있다(Antibodies, a laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory 1988 ISBN 087969-314-2 편집자 할로우 (ED Harlow) 및 데이비드 레인 (David Lane) 참조). 요약하면, 단일 클론성 항체를 생성하기 위한 이와같은 방법은 절대적은 아니나, 통상적으로 적절한 동물을 면역화하고, 면역화 프로토콜에 대한 이들 동물의 항체반응을 조사하며, 하나 이상의 반응 동물의 임파기관으로부터 항체 생성세포를 유리하고, 골수세포와 같은 적절한 세포주로 이들 세포를 응용하여 항체 분비 영구세포인 융합 세포를 제조하며, 및 소정의 단일 클론성 항체를 생성하는 단일 세포 클론이 얻어질 때까지 단계적으로 유리하기 위하여 스크린하는 단계를 포함한다.
토끼의 폴리클론성 항체는 다음과 같이 발생한다: 0.005∼0.25mg의 rhGDNF를 함유하는 2ml의 무균 식염수를 RIBI 보조제 MPL-TDM-CWS 에멀죤(RIBI ImmunoChem Research, Inc.)의 바이얼 병에 주입하고 제조자의 지시에 의하여 휘둘러서 에멀죤을 형성하였다. RIBI가 제시한 면역화 프로토콜에 따라서 마취된 암 뉴질랜드 흰 토끼에 주사하였다. 다음과 같이 1ml의 보조제 항원 에멀죤이 투여되었다:
0.30ml 피내(皮內) (6개의 각 부위에 0.05ml)
0.40ml 근육내 (각 뒷다리에 0.20ml)
0.10ml 피하 (목부근)
0.20ml 복막내
동물들에게 다시 동일한 프로토콜에 의하여 매 4-6주마다 주사하였다. 첫 주사전 및 매 부우스트(boost)후 10∼14일에 동물로부터 혈액을 채취하여 중화 검정법 또는 표준 ELISA로 항체 생성을 시험하였다.
중화 검정법은 쥐 E16 간뇌 배양주 검정법을 이용하여 다음과 같이 수행되었다. 토끼 시험 혈청이, 5mg/ml의 소혈청 알부민(BSA라 한다)을 함유하는 pH7.4, 25mM HEPES로 평형화된 둘베코의 최소 필수 배지로 희석되었다. 다음에 이것을 검정 웰에 가하고 (500μl의 조직 배양 용액에 25μl의 희석된 시험 혈청을 가함) 37℃에서 30분간 배양하였다. 다음에 검정에 있어서의 최종 rhGDNF 농도인 0.316ng/ml을 위하여 6.32ngm/ml의 rhGDNF를 가하였다. 종전에 기술된 방법에 의하여 배양 8일 후에 도파민 섭취를 측정하였다. 중화 검정에 대한 제 2 부우스트로부터의 항혈청 결과를 아래에 제시한다(하기 표 2 참조).
[표 2]
항혈청은 또한 다음 방법에 의하여 표준 ELISA에서 GDNF 항체에 대하여 적정되었다: 마이크로타이터(96웰, Nunc maxisorp)가 웰당 100μl의, 50mM, pH9.6 중탄산나트륨 코팅 완충액중의 1.0μgm/ml의 rhGDNF로 4℃에서 철야로 피복되었다. 플레이트가 플레이트 세척 완충액(PWB: p.5% 트윈 20을 함유하는 pH7.2, 인산염 완충화 생리학적 식염수)으로 4회 세척된 후, 웰당 200μl의, pH7.2, 인산염 완충화 생리학적 식염수 중의 소혈청 알부민으로 봉쇄되었다. 플레이트는 다시 PWB로 세척되고 적정될 혈청 샘플(20% 표준 염소 혈청 및 PWB에 희석된 100μl)을 웰에 첨가하였다. 플레이트가 35℃에서 1.5시간 배양된 후 다시 PWB로 세척되었다. PWB에서 1:25000 희석된 알카리성 포스파타제 결합 염소 항-토끼 IgG(Jackson Immunochemicals사 제조)를 각 웰(100μl)에 가하고 35℃에서 1.5시간 배양하였다. 앞에서와 같이 플레이트를 PWB로 세척하였다. 다음에 p-NPP 기재(디소디움 p-니트로페닐 포스페이트; Sigma Cat. No. MP389)가 각 웰에 첨가되고 (pH9.8, 10% 디에탄올아민 중의 1.0mg/ml p-NPP 100μl) 플레이트는 25℃에서 배양되었다. 발색현상을 플레이트 리더(Molecular Devices Enax사 제조)에서 405-490nm의 플레이트를 판독함으로써 추구되었다.
항혈청은 또한 다음과 같이 웨스턴 블롯트 상에서 GDNF를 검출 및 정량하는데 이용되었다: 12½% 아크릴아미드 분해 겔 및 4½% 아크릴 아미드 적중(Stacking) 겔을 이용하여 영국 라앰리(Laemmli)에 의하여 최초로 설명된 기본 방법(Nature 227:680-685(1970))에 의하여, 소디움 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(SDS PAGE)이 수행되었다. 겔(16X14X 0.15cm)은 40m amp 정전류로 3시간 전기영동 처리되었다. 환원/변성을 위하여 샘플은, 1% SDS 및 150mN 2-메르캅토에탄올을 함유하는 샘플 완충액중에서 100℃로 10분간 가열되었다.
다음에 겔은 웨스턴 블롯트 처리를 위하여 25mM 트리스베이스, 192mM 글리신, 0.1% SDS 및 20% 메탄올 중에서 16시간 동안 80m amp 정전류로 임모빌론-P막(Millipore Cat. No. IPVH 151 50) 위에 트랜스블롯트 처리되어 다음과 같이 처리되었다:
1) 막을 온화하게 흔들면서 봉쇄 완충액(150mM NaCl; 0.05% 트윈 20; 4% 탈지유 및 0.02% 아지드화나트륨을 함유하는 pH7.4, 10mM 트리스) 중에서 25℃로 1시간 봉쇄하였다.
2) 다음에 GDNF에 대한 희석된 1차 항혈청을 함유하는 봉쇄 완충액 중에서 막을 온화하게 흔들면서 2시간 동안 25℃에서 배양하였다.
3) 막을 봉쇄 완충액 중에서 세척(45분 세척) 하였다.
4) 다음에 희석된 2차 항체(알카리성 포스파타제 결합 친화성 정제 염소 항-토끼 IgG; Cappel Cat. No. 59299)를 함유하는 봉쇄 완충액 중에서 막을 온화하게 흔들면서 2시간 동안 25℃에서 배양하였다.
5) 막을 탈지면이 배제된 봉쇄 완충액으로 세척(45분 세척) 하였다.
6) 막은 소정의 착색이 달성될 때까지 온화하게 흔들면서 25℃에서 165μl의 NBT 및 83μl의 BCIP(Promega 키트 Cat No. P3771)를 지닌 50ml의 현상 완충액(100mM NaCl 및 5mM MgCl2를 함유하는 pH9.5 100mM 트리스) 중에서 현상되었다.
[실시예 8]
[GDNF를 분비하는 막 캡슐화 세포의 제조 및 환자에의 이식]
신경상해로 고통을 받고 있는 환자에게 이식하기 위하여 GDNF를 분비하는 세포가 반투막성 막으로 캡슐화될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 환자는 파킨슨씨병을 앓고 있으며, GDNF를 분비하는 캡슐화 세포는 환자의 선조에 이식되어 도파민 작동성 세포체에 GDNF를 공급한다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 실시예 5 및 6에서 제조되고 설명된 바와같이 GDNF가 분비되도록 고안된 세포가 생물학적으로 양립성이며, 이식 가능하고, 및 복구 가능한 폴리마성 삽입체에 첨합되었다. 삽입체는 이식된 세포를 포위하고 있는 조직속으로 분비된 GDNF가 들어가는 것을 허용하는 반면에, 포위하고 있는 조직으로부터 세포에 해로운 요소가 세포에 접근하는 것을 방지하도록 고안될 수 있다.
GDNF를 분비하도록 고안된 세포는, 발명의 명칭이 세포 캡슐 구축 시스템(Cell Capsule Extrusion System)인, 공개된 PCT 출원 WO 91/10425호에 기술된 방법에 따라서, 이와같은 반투막으로 캡슐화될 수 있다. 막으로 캡슐화된 세포는 표준적인 외과수술 방법에 따라 선조에 이식될 수 있다.

Claims (44)

  1. SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열 또는 배열을 돕기 위해서 100 아미노산길이 안에 4개의 갭 들을 넣을 때 적어도 그것의 70％의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 신경영양성 단백질, 여기서 상기의 단백질은 도파민 작용성 뉴런 내로 도파민 흡수를 촉진하는 능력을 갖는 것을 특징으로 하는 신경영양성 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 배열을 돕기 위해서 100 아미노산길이 안에 4개의 갭 들을 넣을 때 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열과 적어도 그것의 80%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 신경영양성 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기의 단백질은 글리코실레이트된 것을 특징으로 하는 단백질.
  4. 제1항 또는 2항에 있어서, 상기의 단백질은 넌글리코실레이트된 것을 특징으로 하는 단백질.
  5. 제1항 또는 2항에 있어서, 상기의 단백질은 아미노 말단에 메티오닌 잔기를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  6. 제1항 또는 2항에 있어서, 상기의 단백질은 재조합 기술이나 화학적 합성에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기의 단백질은 하나 이상의 폴리머 부분이 붙어있는 것을 특징으로 하는 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기의 폴리머 부분이 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 단백질.
  9. 제1항 내지 8항의 단백질 중 하나와 약제학적으로 적당한 캐리어를 포함하는 조성물, 여기서 상기의 조성물은 신경세포의 생존과 작용을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기의 조성물은 도파민 작용성 신경세포의 생존과 작용을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기의 조성물은 파킨슨병에 의해 영향을 받은 신경세포의 생존과 작용을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기의 조성물은 알쯔하이머병에 의해 영향을 받은 신경세포의 생존과 작용을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 상기의 조성물은 근위축성 측삭경화증에 의해 영향을 받은 신경세포의 생존과 작용을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
  14. 제1항 내지 5항 중 임의의 한 항의 신경영양성 단백질을 코딩하는 핵산 서열.
  15. 신경교 쎌 라인에서 유도된 신경영양성 인자 단백질을 코딩하는 정제되고 분리된 핵산 서열, 여기서 상기의 핵산서열은 (a) 또는 (d)와 같다: (a) SEQ ID NO:3의 304에서 705 뉴클레오타이드 또는 SEQ ID NO:5의 105에서 506 뉴클레오타이드를 포함하거나; (b) SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산; 또는 (c) SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열과 70%이상의 호모로지를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 생물학적으로 동등한 단백질을 코딩하는 핵산; 또는 (d) SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 코딩하는 올리고 뉴클레오타이드 프로브와 상보적인 핵산 서열과 하이브리드하는 핵산; 그리고 여기서 상기의 단백질은 도파민 작용성 뉴런의 도파민 흡수를 촉진하는 능력을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
  16. 제14항 또는 15의 핵산서열을 포함하는 벡터.
  17. 제16항의 벡터를 갖는 숙주세포.
  18. 제17항에 있어서, 상기의 숙주세포는 포유류 세포와 박테리아 세포로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  19. 제17항에 있어서, 상기의 숙주세포는 COS 세포와 대장균 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  20. 제17항에 있어서, 상기의 숙주세포는 인체 이식에 적합하고, 신경교 쎌라인에서 유도된 신경영양성 인자를 발현하고 분비하는것을 특징으로 하는 숙주세포.
  21. 제17항에 있어서, 상기의 숙주세포는 트랜스포옴되거나 트랜스펙트되는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  22. 제17항에 있어서, 상기의 숙주세포는 인체 이식에 적합한 막으로 둘러쌓인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  23. 하기와 같은 단계를 포함하는 신경교 쎌 라인에서 유도된 신경영양성 인자를 생산하는 방법: (a) 상기의 숙주세포에 의해 신경교 쎌 라인에서 유도된 신경영양성 인자의 발현에 적합한 조건하에서 제1항 내지 5항 중 임의의 한 항의 신경영양성 단백질을 코딩하는 핵산서열을 갖는 숙주세포를 배양하는 단계; 그리고 (b) 상기의 숙주세포에서 발현된 신경교 쎌 라인에서 유도된 신경영양성 인자를 선택적으로 분리하는 단계.
  24. 하기와 같은 단계를 포함하는 신경교 쎌 라인에서 유도된 신경영양성 인자를 생산하는 방법: (a) 상기의 숙주세포에 의해 신경교 쎌 라인에서 유도된 신경영양성 인자의 발현에 적합한 조건하에서 제15항의 핵산서열을 갖는 숙주세포를 배양하는 단계; 그리고 (b) 상기의 숙주세포에서 발현된 신경교 쎌 라인에서 유도된 신경영양성 인자를 선택적으로 분리하는 단계.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 분리된 신경교 쎌 라인에서 유도된 신경영양성인자를 리폴딩하는 단계를 더욱 포함하는 방법.
  26. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기의 숙주 세포가 미생물인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기의 숙주 세포가 동물세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제23 내지 27항 중 임의의 한 방법에 의해서 만들어진 정제된 신경교 쎌 라인에서 유도된 신경영양성 인자.
  29. 제28항의 단백질과 약제학적으로 적당한 캐리어를 포함하는 약제 조성물.
  30. SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6에서 설명된 아미노산 서열을 포함하는 신경영양성 단백질에 붙는 항체.
  31. 제30항에 있어서, 상기의 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  32. 제30항에 있어서, 상기의 항체는 폴리클로날 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  33. 하기와 같은 요소로 구성된 장치: (a) 이식에 적합한 막; 그리고 (b) 상기의 막 안에 캡슐로 쌓여있는 세포들, 여기서 상기의 세포는 제1항 내지 5항 중 임의의 한 항의 신경영양성 단백질을 분비한다; 상기의 막은 신경영양성 단백질을 투과하고 상기의 세포들에 해로운 물질은 투과하지 않는다.
  34. 제33항에 있어서, 상기의 세포들은 상기의 신경영양성 단백질을 분비하는 자연적으로 나타난 세포들인 것을 특징으로 하는 장치.
  35. 제33항에 있어서, 상기의 세포들은 트랜스포옴되거나 트랜스펙트되어서 상기의 신경영양성 단백질을 발현하고 분비하는 것을 특징으로 하는 장치.
  36. 제1항 내지 제8항 중 임의의 한 항에 있어서, 다이썰파이드 결합된 다이머인 것을 특징으로 하는 단백질.
  37. SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 신경영양성 단백질.
  38. 제37항에 있어서, 아미노말단에 메티오닌 잔기를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 신경영양성 단백질.
  39. SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6에서 설명된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  40. 제39항에 있어서, 벡터를 포함하는 숙주세포.
  41. 하기의 단계를 포함하는 신경교 쎌 라인에서 유도된 신경영양성 인자의 생산방법: (a) 상기의 숙주세포에 의해 신경교 쎌 라인에서 유도된 신경영양성 인자의 발현에 적합한 조건하에서 제40항의 숙주세포를 배양; 그리고 (b) 상기의 숙주세포에 의해 발현된 신경교 쎌라인에서 유도된 신경영양성 인자를 선택적으로 분리.
  42. SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6의 인접한 아미노산을 코딩하는 적어도 20개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 하이브리다이제이션 프로브.
  43. SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:6의 약 80개의 인접한 아미노산을 코딩하는 제42항의 하이브리다이제이션 프로브.
  44. SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:의 1에서 80의 아미노산을 코딩하는 제42항의 하이브리다이제이션 프로브.
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