PT100879B - Factor neurotrofico derivado da glia, substancialmente purificado, seu processo de obtencao, sequencia de acido nucleico que o dodificam, composicoes farmaceuticas, celulas hospedeiras transformadas e dispositivos que as contem e uso - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA PATENTE DE INVENÇÃO

N° 100 879

REQUERENTE:

AMGEN INC., norte-americana (Estado de Delaware), com sede em Amgen Center, 1840 Dehavilland Drive, Thousand Oaks, Califórnia 91320, Estados Unidos da América

EPÍGRAFE:

Factor neurotrófico derivado da glia, substancialmente purificado, seu processo de obtenção, sequência de ácido nucleico que o codificam, composições farmacêuticas, células hospedeiras transformadas e dispositivos que as contêm e uso

INVENTORES:

Leu-Fen H. Lin, Franklin D. Collins, Daniel H. Doherty, Jack Lile e Susan Bektesk

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4^o da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883. Estados Unidos da América em 20 de Setembro de 1991 sob o n° 07/764685, em 8 de Outubro de 1991 sob o n° 07/774109, em 6 de Novembro de 1991 sob o n° 07/788423 e em 19 de Março de 1992 sob o n° 07/855413.

INPI. MOD. 113 RF 16732

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PATENTE Ν° 100 879

Factor neurotrófico derivado da glia, substancialmente purificado, seu processo de obtenção, sequência de ácido nucleico que o codificam, composições farmacêuticas, células hospedeiras tansformadas e dispositivos que as contêm e uso

RESUMO

O presente invento refere-se a um novo factor neurotrófico referido como factor neurotrófico derivado da glia (GDNF) que foi identificado e isolado a partir de células de glioblastoma B49 cultivadas em meio condicionado isento de soro. Os genes de ratazana e humanos que codificam GDNF foram clonados e sequenciados. Um gene que codifica GDNF foi subclonado num vector e o vector foi utilizado para transformar uma célula hospedeira de modo a produzir GDNF biologicamente activo por um processo de ADN recombinante.

O invento também se refere a composições farmacêuticas contendo o referido factor bem como ao seu uso.

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MEMÓRIA DESCRITIVA

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido é uma continuação em parte do pedido de Patente Americana N de Série 07/855 413, apresentado em 19 de Março de 1992, pedido de Patente Americana N° de Série 07/788 423, apresentado em 6 de Novembro de 1991, pedido de Patente Americana N° de Série 07/774 109, apresentado em 8 de outubro de 1991 e pedido de Patente Americana N^a de Série 07/764 685, apresentado em 20 de Setembro de 1991, cada um dos quais intitulado ” Glial Derived Neurotrophic Factor.

CAMPO DO INVENTO

O presente invento refere-se a factores neurotróficos e em particular ao factor neurotrófico derivado da glia (GDNF). Estão também incluídos neste invento processos para a purificação de GDNF a partir de fontes naturais e processos para a clonagem de genes de ratazan e de humano codificando GDNF, assim como as sequências de ácido nucleico dos genes que codificam GDNF de ratazana e de humano. O gene de GDNF foi subclonado num vector de expressão, e o vector foi utilizado para expressar GDNF biologicamente activo. Adicionalmente, este invento inclui a utilização de GDNF para prevenção e tratamento de nervos lesionados e de doenças do nervo relacionadas, tal como a doença dc Parkinson.

São revelados anticorpos contra GDNF, assim como processos para identificar membros da família GDNF dos factores neurotróficos. Finalmente, são descritos processos para prevenção ou tratamento de nervos lesionados por implantação, em pacientes, de células que segregam GDNF. _ ..

ANTECEDENTES DO INVENTO

Factores neurotróficos são proteínas naturais, encontradas no sistema nervoso ou em tecidos não nervosos inervados pelo sistema nervoso, cuja função é promover a sobrevivência e manutenção da diferenciação fenotípica do nervo e/ou das células da glia (Varon e Bunge 1979 Ann. Rev. Neuroscience 1:327 ;

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Thoenen e Edgar 1985 Science 229:238). Devido a este papel fisiológico, os factores neurotróficos podem ser úteis no tratamento da degeneração das células nervosas e perda de função diferenciada que ocorre numa variedade de doenças neurodegenerativas.

Para que um factor neurotrófico particular possa vir a ser potencialmente útil no tratamento de nervos lesionados, a classe ou classes de células nervosas danificadas devem ser sensíveis ao factor. Diferentes tipos de factores neurotróficos afectam distintamente diferentes classes de células nervosas. Desta forma, é aconselhável ter acesso a uma variedade de diferentes factores neurotróficos para tratar cada uma das classes de neurónios danificados que podem ocorrer com diferentes formas de doença ou lesão.

Os factores neurotróficos podem proteger os neurónios responsivos contra uma variedade de lesões. Por exemplo, o factor neurotrófico, factor de crescimento do nervo (NGF), salvará da morte por corte das suas protuberâncias axonais uma porção significativa de neurónios sensoriais (Rich et al. 1987

J. Neurocytol. 16: 261; Otto et al. 1987 J. Neurosci. 83:156), da morte ontogénica durante o desenvolvimento embrionário (Hamburger et al. 1984 J. Neurosci. 4:767), e de danos causados pela administração de taxol ou cisplatina (Apfel et al. 1991 Ann. Neurol. 29:87). Esta aparente protecção generalizada levou ao conceito de que se um factor neurotrófico protege neurónios responsivos contra danos experimentais, pode ser útil no tratamento de doenças que envolvem danos para estes neurónios em pacientes, mesmo que a etiologia seja desconhecida.

Um determinado factor neurotrófico, além de possuir a especificidade neuronal correcta, deve estar disponível em quantidade suficiente para ser usado como um tratamento farmacêutico. Uma vez que os factores neurotróficos estão tipicamente presentes em tecidos em pequenas quantidades irrecuperáveis (por exemplo, Hofer e Barde 1988 Nature 331:261; Lin et al. 1989 Science 246:1023), não será conveniente preparar

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quantidades farmacêuticas de factores neurotróficos directamente de tecidos animais. Como alternativa, será desejável localizar o gene para um factor neurotrófico e utilizar esse gene como base para estabelecer um sistema de expressão recombinante para potencialmente produzir quantidades ilimitadas da proteína.

Os inventores deste pedido descrevem um processo para pesquisa em amostras biológicas de actividade neurotrófica nos precursores embrionários dos neurónios dopaminérgicos da substância negra que degenera na doença de Parkinson. Este bioensaio para a identificação de factores neurotróficos gue podem ser úteis no tratamento da doença de Parkinson é baseado num ensaio já descrito (Friedman et al. - 1987 Neuro. Sei. Lett. 79:65-72, especificamente incorporado agui por esta referência) e implementado com modificações no presente invento.

Este ensaio foi usado para pesquisar várias fontes potenciais quanto à actividade neurotrófica dirigida para neurónios dopaminérgicos. 0 presente invento descreve a caracterização de um novo factor neurotrófico que foi purificado de uma dessas fontes, o meio condicionado de cultura de uma linha de células de glioblastoma, B49 (Schubert et al. 1974 Nature 249:224-27, aqui incorporado especificamente para referência). Foi previamente relatado que o meio condicionado desta linha celular continha actividade neurotrófica dopaminérgica (Bohn et al. 1989 Soc. Neurosci. Abs. 15:277). Neste relatório prévio, a fonte de actividade neurotrófica não foi purificada, quimicamente caracterizada, ou evidenciou ser a consequência de um único agente no meio condicionado.

A lesão do nervo é causada por condições que comprometem a sobrevivência e/ou o funcionamento adequado de um ou mais tipos de células nervosas. Tal lesão do nervo pode ocorrer derivada de uma vasta variedade de diferentes causas, algumas das quais são abaixo indicadas.

A lesão do nervo pode ocorrer através de lesão física, que causa a degeneração das protuberâncias axonais e/ou dos corpos das células nervosas próximos do local da lesão. A lesão do nervo pode também ocorrer devido à cessação temporária ou permanente do fluxo sanguíneo a partes do sistema nervoso, como numa trombose. A lesão nervosa pode também ocorrer devido a

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SYN225/PO exposição intencional ou acidental a neurotoxinas,

tal como os agentes quimioterapêuticos do cancro e SIDA, cisplatina e dideocicitidina (ddC), respectivamente. A lesão no nervo pode também ocorrer devido a doenças metabólicas crónicas como a diabetes ou disfunção renal. Lesão no nervo pode também ocorrer devido a doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson, doença de Alzheimer, e Esclerose Amiotrófica Lateral (ALS), que resultam da degeneração de populações neuronais específicas.

Este pedido descreve um novo factor neurotrófico. Os factores neurotróficos são proteínas naturais que promovem as funções normais de células nervosas específicas e/ou protegem as mesmas células contra uma variedade de diferentes formas de lesão. São estas propriedades que sugerem que o GDNF pode ser útil no tratamento de várias formas de lesão de nervos, incluindo as formas especificamente indicadas acima.

A doença de Parkinson é identificada por um único conjunto de sintomas que incluem rigidez, bradicinesia, seborreia, passo de festinação, postura flectida, salivação e um tremor ritmíco. A doença é encontrada em todas as raças do mundo, e a média de idade para o seu início é de 60 anos.

Após anos de teorias em conflito e controvérsia, emergiu uma base bioquímica como causa principal para a doença de Parkinson. (Ver, por exemplo, Bergman, 1990 Drug Store News 12:IP19). 0 conhecimento das áreas do cérebro conhecidas como substância negra, gânglios basais, e particularmente, o corpo estriado, é de significativa importância para a compreensão da doença de Parkinson. A substância negra, uma camada bilateral par de matéria cinzenta pigmentada no mesencéfalo, está envolvida na transmissão de dopamina, enquanto a função normal dos gânglios basais envolve uma série de interacções e sistemas de retroacção que estão associados com a substância negra e mediados em parte pela dopamina, acetilcolina e outras substâncias.

Na doença de Parkinson, existe uma disfunção na actividade dopaminérgica da substância negra, que é causada por degeneração neuronal. Isto resulta num estado de deficiência de dopamina e num desvio no balanço de actividade para uma predominância colinérgica. Desta forma, embora não se verifique um aumento na concentração de acetilcolina,

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excitatórios no sistema nervoso central (isto é, os tremores), através deste mediador colinérgico, sobrepoêm-se aos efeitos inibidores da dopamina em débito.

O tratamento mais eficaz para a doença de Parkinson até à data é a administração oral de Levodopa. O Levodopa penetra no sistema nervoso central e é enzimáticamente convertido em dopamina nos gânglios basais. Pensa-se que os efeitos benéficos de Levodopa consistem, deste modo, no aumento da concentração de dopamina no cérebro. Infelizmente, nem Levodopa nem quaisquer dos medicamentos comummente menos utilizados actualmente, travam a progressão da doença que é causada pela degeneração dos neurónios dopaminérgicos.

Outros investigadores relataram a existência de actividade dopaminérgica em várias fontes biológicas. Na publicação PCT W091/01739 de Springer et al.. foi identificada uma actividade neurotrófica dopaminérgica em um extracto derivado de células do sistema nervoso periférico. A actividade identificada não foi purificada, mas atribuída a um factor possuindo uma massa molecular inferior a 10 000 daltons. O factor foi isolado de nervo ciático de ratazana mas, aparentemente, não é CNTF que é também encontrado no nervo (Lin et al. 1989 Science 246:1023).

Na Patente Americana N^a 5 017 735 de Appel et al., a actividade dopaminérgica foi identificada em um extracto de tecido caudado-putâmen. De novo, não foram purificados factores que originassem actividade e as massas moleculares aparentes das fraeções que continham actividade eram relativamente pequenas. Ver também, Niijima et al. 1990 Brain, Res. 528:151-154 (estriado de cérebro de ratazana adulta em que foram eliminadas quimicamente os impulsos nervosos aferentes); Lo et al. 1990 Soc. Neurosci Abstr. 16:809 (factor neurotrófico derivado do estriado). Adicionalmente, outros factores neurotróficos conhecidos mostraram também possuir actividade dopaminérgica, por exemplo, factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), e os factores do crescimento de fibroblasto ácidos e básicos.

r .

-70 GDNF do presente capacidade de promover a em cultura de células, isoladas

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SYN225/PO nervosas nervosas do mesencéfalo de dopaminérgicas são dopaminérgicas na na doença de Parkinson. Assim, o degenera redução da degeneração neuronal que causa de Parkinson.

invento foi isolado com base nà sua actividade funcional e sobrevivência, de células nervosas dopaminérgicas embrião de ratazana. Estas células o precursor embrionário das células substância negra dos adultos que GDNF pode ser útil na os sintomas da doença o GDNF pode ser útil no funcionamento impróprio de doentes humanos. Estas ocorrer em esquizofrenia e ou em tratamento de outras células nervosas lesões ou mau outras formas de

Além disso, formas de lesões dopaminérgicas funcionamento, podem psicose. Os tratamentos correntes para tais condições necessitam frequentemente de drogas activas em receptores de dopamina, sugerindo que a função imprópria dos neurónios dopaminérgicos que inervam estas populações neuronais que possuem receptores pode estar envolvida no processo da doença.

com outros factores nervo que podem ser for aprendendo mais de Alzheimer quando foi recentemente verificado que como um factor neurotrófico para os neurónios basais do proencéfalo que degeneram na doença de 1986 Proc. Natl. Acad. Sei. USA

Com base em experiências anteriores neurotróficos, novas formas de lesão do tratadas com GDNF vão emergir conforme se acerca dos vários tipos de células nervosas que são responsivas a este factor neurotrófico. Por exemplo, o factor de crescimento do nervo (NGF) apenas emergiu como potencial tratamento útil para a donça o NGF actua colinérgicos

Alzheimer. (Williams et al.

83:9231). No-presente invento são proporcionados processos para a determinação de outras formas de lesão de nervo que possam ser útilmente tratadas com GDNF.

descreveram a utilização semipermiáveis, implantáveis, distribuição de drogas ou circunstâncias. Por exemplo, propuseram a capsulação de células que segregam factores neurotransmissores, e a implantação destes

Patrick Aebischer e colaboradores de dispositivos membranares que são muito úteis como meio de medicamentos em determinadas

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—8-

Patente U.S. N 5 011 472 de Aebischer et al.; Patente U.S. N^a 5 106 627 de Aebischer et al.; Pedido PCT WO 91/10425; Pedido PCT WO 91/10470; Winn et al. 1991 Exper. Neurol. 113:322-329; Aebischer et al. 1991 Exper. Neurol. 111:269-275; e Tresco et al. 1992 ASAIO 38:17-23.

SUMÁRIO DO INVENTO

Este invento refere-se e reivindica o factor neurotrófico derivado da glia (GDNF) substancialmente purificado. Em uma concretização deste invento, é obtido GDNF substancialmente purificado possuindo uma actividade específica pelo menos 24 000 vezes superior à actividade específica do meio condicionado de B49. O GDNF substancialmente purificado possui uma actividade especifica de pelo menos cerca de 12 000 TU/Mg.

O GDNF substancialmente purificado do presente invento possui uma massa molecular aparente de cerca de 31-42 kD em SDS-PAGE não redutora, e cerca de 20-23 kD em SDS-PAGE redutora. O GDNF substancialmente purificado possui uma sequência no terminal amino substancialmente constituída pela sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:1):

(Ser)-Pro-Asp-Lis-Gln-Ala-Ala-Ala-Leu-Pro-Arg-Arg-Glu(Arg)-Asn-( )-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-(Ser)-Pro-(Asp)-(Asn).

A sequência de aminoácidos das formas matura e pre-pro de GDNF de ratazana é como apresentada nas Figs. 13 e 14 (SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4). A sequência de aminoácidos de GDNF maturo humano é como apresentada na Fig. 19 (SEQ ID NO:5). A sequência de aminoácidos da forma pre-pro de GDNF humano é como apresentada nas Figuras 19 (SEQ ID NO:5) e 22 (SEQ ID NO:8).

Um dos aspectos do invento é um processo para obtenção de GDNF purificado compreendendo:

1) preparação de um meio de cultura condicionado para as células de glioblastoma B49, isento de soro;

2) concentração do meio condicionado;

3) realização de uma cromatografia em Sepharose-heparina do

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meio condicionado concentrado;

4) realização de cromatografia líquida rápida de proteína de fracções obtidas da referida cromatografia em Sepharose-heparina; e,

5) realização de cromatografia líquida de fase inversa de el evada resolução, das fracções obtidas da referida cromatografia líquida rápida de proteína. Numa concretização, o processo de obtenção de GDNF purificado é ainda constituído pelos passos:

6) sujeição das fracções obtidas por cromatografia líquida de fase inversa de elevada resolução a uma SDS-PAGE preparativa; e,

7) realização de cromatografia líquida de fase inversa de elevada resolução em fracções obtidas por SDS-PAGE preparativa.

É também descrita a clonagem do gene de GDNF de ratazana a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir da linha de células B49. A sequência de ácido nucleico que codifica o GDNF maduro e pre-pro de ratazana é como apresentada na Fiq. 13 (SEQ ID N0:3). O processo para obtenção de um gene humano que codifica o GDNF é também revelado. A sequência de ácido nucleico que codifica o GDNF maduro humano é como apresentada na Fig.19 (SEQ ID NO:5). A sequência de ácido nucleico que codifica os primeiros 50 aminoácidos do segmento pre-pro do GDNF humano é como a seguir apresentado na Fig. 22 (SEQ ID N0:8).

Este invento inclui também composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz de GDNF purificado num portador farmaceuticamente adequado. É também descrito um processo para prevenção e tratamento de lesão de nervos que compreende a administração a um paciente com essa necessidade, de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de GDNF. Em concretizações preferidas, a lesão do nervo é a doença de Parkinson ou lesão ou funcionamento impróprio de células nervosas dopaminérgicas.

Na concretização preferida deste invento, o GDNF é produzido por processos de ADN recombinante, utilizando os genes que codificam o GDNF como aqui descrito. O presente invento

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inclui um vector para utilização na produção de GDNF biologicamente activo constituído por elementos reguladores de expressão, operativamente ligados a uma sequência de ácido nucleíco que codifica o GDNF maduro ou pre-pro, e uma célula hospedeira transformada por tal vector. É também incluído um processo de ADN recombinante para a produção de GDNF compreendendo: subclonagem de uma sequência de ADN que codifica o GDNF num vector de expressão que compreende os elementos reguladores necessários para expressar a sequência de ADN; transformação de uma célula hospedeira com o referido vector de expressão; cultura das células hospedeiras sob condições para a amplificação do vector e expressão de GDNF; e recolha do GDNF.

É descrito um processo de ADN recombinante para a produção de GDNF compreendendo: cultura das células hospedeiras deste invento sob condições para a amplificação do vector e expressão de GDNF; e recolha do GDNF.

Este invento inclui anticorpos substancialmente purificados que reconhecem o GDNF. É também incluído um processo para prevenção e tratamento de lesão de nervos, que inclui a implantação de células que segregam o factor neurotrófico derivado da glia no corpo dos pacientes com essa necessidade. Finalmente, o presente invento inclui um dispositivo para prevenção e tratamento de lesão de nervos por implantação num paciente compreendendo uma membrana semipermeável, e uma célula encapsulada na referida membrana que segrega GDNF, sendo a referida membrana permeável ao GDNF e impermeável aos factores do paciente prejudiciais às células.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS .

Figura 1. apresenta os resultados da cromatografia em Sepharose-heparina, da solução de meio condicionado de crescimento concentrado isento de soro, das células de glioblastoma B49. Os resultados mostram a D.O._2g0 do eluido (—), a conductância (-Δ-), e a actividade do GDNF em TU (-o-). As fracções marcadas por uma barra foram combinadas para posterior purificação.

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Figura 3. apresenta os resultados de RP-HPLC na fracção 14 da Fig.2. Os resultados estão apresentados em D.O.214/ ^{COIn a} actividade de GDNF em TU apresentada em baixo.

Figura 4. apresenta os resultados da análise da SDS-PAGE corada com prata, das fracções 3-10 obtidas na Fig. 3 acima. A faixa S convém os padrões de massa molecular.

Figura 5. apresenta os resultados da SDS-PAGE preparativa das fracções 5 e 6 da Fig.4. Os pedaços do gel foram testados para a actividade de GDNF em TU. Os pedaços do gel foram também correlacionados com massas moleculares por utilização de padrões de massas moleculares (Amersham).

Figura 6. apresenta os resultados de RP-HPLC das fracções 16-23 da Fig. 5. O cromatograma A contém a amostra, e o cromatograma B é um controlo (extracto de gel combinado dos pedaços correspondentes a uma faixa branca).

Figura 7. apresenta os resultados da análise da SDS-PAGE corada por prata do pico 3 da Figura 6A (faixa 1) e um controle de massa molecular (faixa S).

Figura 8. apresenta a sequência de aminoácidos do terminal amino obtida a partir do GDNF purificado. Os parêntesis vazio indicam a posição em que o aminoácido não pode ser determinado utilizando a técnica de sequenciação empregue. Os resíduos dados em parêntesis, reflectem uma certa incerteza na sua identificação. A sequência completa e correcta de aminoácidos da extremidade amino é apresentada na Figura 19 abaixo.

Figura 9. apresenta os resultados de RP-HPLC de GDNF purificado digerido com tripsina. O cromatograma A contém a amostra, e o cromatograma B é um controlo (contendo apenas

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tripsina).

Figura 10. apresenta os resultados de RP-HPLC do pico 37 da Fig. 9. após tratamento com brometo de cianogéneo.

Figura 11. apresenta os resultados de RP-HPLC do produto de redução do pico 1 da Fig. 10.

Figura 12. descreve uma sequência de aminoâcidos interna obtida de GDNF purificado.

Figura 13. apresenta a sequência de ácido nucleico obtida para o GDNF de ratazana, derivado do clone A ZapII76.1. de uma biblioteca de ADNc de células B49. É também apresentada a sequência de aminoâcidos inferida para o GDNF. A sequência de ácido nucleico que codifica o GDNF maduro encontra-se sublinhada. A sequência do terminal amino da forma pre-pro mais preferida de GDNF está marcada com um *.

Figura 14. apresenta a sequência de aminoâcidos inferida para o GDNF maduro.

Figura 15. apresenta os resultados do GDNF purificado de células B49 e CNTF humano recombinante, na promoção da -sobrevivência de neurónios parassimpáticos de gânglios ciliares de embrião de pinto. O aumento da densidade óptica no eixo dos YY representa um aumento da sobrevivência neuronal. O eixo dos XX representa concentrações decrescentes de cada factor neurotrófico. A curva do controlo marcado possui volumes iguais de fracções inactivas de HPLC adjacentes às que continham o GDNF utilizado para originar a curva - de GDNF marcado.

Figura 16. apresenta os resultados de GDNF purificado de células B49 e CNTF recombinante humano, na promoção da sobrevivência de neurónios simpáticos da cadeia de gânglios simpáticos do embrião de pinto. 0 aumento da densidade óptica no eixo dos YY representa um aumento da sobrevivência neuronal. O eixo dos XX representa concentrações decrescentes de cada factor

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SYN225/PO neurotrófico.

curva

marcado

das fracções inactivas de HPLC adjacentes às que continham o GDNF utilizado para originar a curva do GDNF marcado.

Figura 17. apresenta os resultados do bioensaio do meio condicionado das células COS quanto à capacidade de aumentar a incorporação de dopamina por neurónios dopaminérgicos mesencefálicos em cultura. 0 eixo dos YY apresenta a quantidade de dopamina radioactivamente marcada incorporada em função de quantidades crescentes de meio de cultura das células COS concentrado, no eixo dos XX. A curva marcada com B-l representa o meio condicionado isento de soro das células COS transfectadas com o gene de GDNF na orientação adequada para a expressão de GDNF. A curva marcada com C-l representa o meio condicionado isento de soro das células COS transfectadas com o gene de GDNF na orientação oposta, o que evita a expressão de GDNF.

Figura 18 apresenta os resultados do bioensaio de meios condicionados das células COS quanto à capacidade de aumentar a sobrevivência em cultura, de neurónios simpáticos da cadeia simpática de embriões de pinto. O eixo dos YY apresenta a quantidade de corante MTT reduzido pelas culturas e é proporcional à sobrevivência neuronal. O eixo dos XX representa diluições crescentes de meio de cultura concentrado de células COS. A curva marcada com GDNF representa o meio condicionado isento de soro de células COS transfectadas com o gene de GDNF na orientação própria para a expressão de GDNF. A curva marcada com CONTROLO representa o meio condicionado isento de soro de células COS transfectadas com o gene de GDNF na orientação oposta, o que evita a expressão de GDNF.

Figura 19. apresenta a porção de sequência de ácido nucleico obtida para o GDNF humano, como descrito no Exemplo 2C abaixo, incluindo a porção completa do gene que codifica o GDNF maduro humano. É também apresentada a sequência de aminoâcidos inferida para o GDNF maduro humano. A sequência de aminoâcidos para o GDNF maduro humano está sublinhada.

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Figura 20. apresenta a capacidade do GDNF estimular a incorporação de dopamina e a imunodetecção da tirosina-hidroxilase (TH) em neurónios dopaminérgicos. As culturas foram estabelecidas como descrito no Exemplo IB. O GDNF foi adicionado no dia do plaqueamento e reabastecido após nove dias in vitro.

A. A incorporação de ³H-DA foi medida após 15 dias in vitro. B. As culturas foram fixadas após 16 dias in vitro com 4% de paraformaldeído, lavadas extensivamente, permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 e coradas com anticorpos policlonais contra TH (Eugine Tech International, Allendale, NJ). Foi visualizada a ligação primária de anticorpo utilizando um conjunto Vectastain ABC (Vector Labs, Burlingame, CA).

Figura 21. apresenta a especificidade do GDNF para os neurónios dopaminérgicos. As culturas foram estabelecidas como descrito no Exemplo IB. O GDNF foi adicionado no dia do plaqueamento. A. Incorporação de ³H-DA foi medida após sete dias in vitro. B. Incorporação de ³⁴C-GABA foi medida após oito dias in vitro. As células foram incubadas e tratadas como para a incorporação de ³H-DA, com a excepção do tampão de incorporação que consistia no tampão fosfato de Kreb-Ringer, pH 7,4, contendo glicose 5,6 mM, EDTA 1,3 mM, ácido amino-oxiacético 10 μΜ (para evitar a degradação de GABA), β-alanina 2 mM ( para inibir a incorporação de GABA pela glia) e ¹⁴C-GABA 0,1 μΜ (150 mCi/mmol, • New E.nglar.d Nuclear, Boston, MA). Na preser.ça de ácido diaminobutirico (DABA), um potente inibidor da incorporação de ¹⁴C-GABA nos neurónios GABA, a incorporação de ¹⁴C foi reduzida a 10%. Os valores controlo na presença de DABA foram extraídos dos valores experimentais.

Figura 22. apresenta uma porção da sequência de ácido nucleico obtida para o GDNF humano, como descrito no Exemplo 2D abaixo, incluindo a sequência que codifica os aminoácidos 1-50 do GDNF pre-pro humano. É também apresentada a sequência de aminoácidos inferida para os primeiros 50 aminoácidos do GDNF pre-pro humano. Esta informação, em conjunto com a informação da sequência codificante dada na Figura 19, proporciona a sequência de código completa para o GDNF pre-pro humano, e a sequência de

-15aminoácidos inferida para a proteína GDNF pre-pro humana.

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Figura 23. apresenta um mapa dos sítios SacII e PstI no plasmídeo pBSSK-/\ 3AluI, como descrito no Exemplo 2D abaixo.

Figura 24. apresenta a especificidade do GDNF para neurónios dopaminérgicos. As culturas foram preparadas como descrito no Exemplo 1B. 0 GDNF foi adicionado no dia do plaqueamento e a incorporação foi medida após seis dias in vitro. A representa a incorporação de dopamina e B representa a incorporação de serotonina.

Figura 25. apresenta a SDS-PAGE corada com azul de Coomassie, conduzida em condições redutoras, de fracções provenientes de cromatografia numa coluna S-Sepharose, de um extracto bacteriano contendo GDNF não redobrado, antes da redobragem. (ver Exemplo 6C). As faixas 2-8 representam fracções consecutivas do eluído da coluna. As fracções 3-5, enriquecidas em GDNF, foram combinadas para redobragem. A faixa 1 contém padrões de massa molecular (SDS-70L, Sigma).

Figura 26. apresenta a SDS-PAGE corada com azul de Coomassie, da solução de GDNF; antes da redobragem (faixas 6 e 13), após redobragem (faixa 2), e após redobragem e subsequente redução com 2-mercaptoetancl 150 mM (faixa 5). Previamente à redobragem e após nova redução, o material migra como um monómero de cerca de 16 kDa. O GDNF após redobragem com sucesso migra (sem redução) como um dímero a cerca de 30 kDa (ver Exemplo 6C)). A faixa 15 contém padrões de massa molecular (SDS-70L, Sigma).

Figura 27. apresenta os resultados de um bioensaio utilizando GDNF redobrado; medindo a capacidade de promoção de sobrevivência de neurónios simpáticos de embrião de pinto em cultura. O procedimento do bioensaio está descrito no Exemplo 4A. A densidade óptica (proporcional ao número de neurónios sobreviventes) no eixo dos YY é apresentada contra a concentração de GDNF no eixo dos XX (determinada por densitome-1674 374

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tria por varrimento laser dos geles SDS-PAGE corados com azul de

Coomassie). A ED50 calculada do GDNF redobrado, para a sobrevi vência de neurónios simpáticos de embrião de pinto é de cerca de ng/ml.

Figura 28. apresenta os resultados de um bioensaio utilizando GDNF redobrado; medindo a capacidade de aumentar a incorporação de dopamina pelos neurónios dopaminérgicos da substância negra em culturas de mesencéfalo embrionário de ratazana. 0 procedimento do bioensaio está descrito no Exemplo 1B. A incorporação de dopamina do eixo dos YY está apresentada contra as concentrações de GDNF no eixo dos XX. A ED50 calculada do GDNF redobrado, para o aumento da incorporação de dopamina nestas culturas é cerca de 3 pg/ml.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Far-se-á agora referência detalhada às concretizações do invento presentemente preferidas, as quais, em conjunto com os exemplos que se seguem, servem para explicar os princípios do invento.

Antes deste invento, o GDNF não tinha sido identificado como uma substância discreta biologicamente activa ou existia *. numa fcrma substancialmente pura. Como aqui descrito, / proporciona-se uma descrição detalhada do GDNF, acompanhada da descrição das suas características: físicas, químicas e biológicas; da sua utilidade; como produzi-lo; composições úteis que o contêm; sequências de ácido nucleico que o codificam; vectores que contêm essas sequências de ácido nucleico; células hospedeiras transformadas por tais vectores; técnicas recombinantes para a sua produção; e outros aspectos do invento.

O GDNF é uma proteína que pode ser identificada ou ser obtida nas células da glia, e exibe actividade neurotrófica. Mais especificamente, o GDNF é uma proteína neurotrófica dopaminérgica que é em parte caracterizada pela sua capacidade de aumentar a incorporação de dopamina em precursores

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embrionários dos neurónios dopaminérgicos da substância negra, e ainda pela sua capacidade de promover a sobrevivência de células nervosas simpáticas e parasimpáticas.

GDNF substancialmente purificado é ainda caracterizado de várias formas:

1. Possui uma actividade específica de pelo menos cerca de

000 TU//xg.

2. Possui uma massa molecular de	cerca	de	20-23	kD	em
SDS—PAGE redutora.
3. Possui uma massa molecular de	cerca	de	31-42	kD	em
SDS-PAGE não redutora.
4. Possui uma actividade específica	cerca	de	24 000	vezes

superior à actividade específica do meio condicionado B49.

5. Possui a capacidade de sobrerregular a imunoreactividade da tirosina-hidroxilase em cultura mesencefálica.

6. Possui a sequência de aminoácidos do terminal amino como a apresentada na Figura 8 (SEQ ID NO:1).

7. Possui a sequência de aminoácidos interna como a apresentada na Figura 12 (SEQ ID NO:2).

O GDNF do presente invento está completamente descrito abaixo com mais detalhe. Deve ser compreendido que este aspecto do invento cobre qualquer proteína neurotrófica dopaminérgica ·' possuindo a mesma sequência de aminoácidos de terminai amino ou uma substancialmente homóloga à apresentada na figura 8 (SEQ ID NO:1). Este invento inclui também qualquer proteína neurotrófica dopaminérgica que possua a mesma sequência de aminoácidos interna ou uma substancialmente homóloga à apresentada na Figura 12 (SEQ ID NO:2).

Este invento inclui uma nova proteína neurotrófica dopaminérgica que é aqui definida como factor neurotrófico derivado da glia (GDNF). O GDNF foi identificado e isolado a partir de um meio condicionado isento de soro de células de glioblastoma B49, numa forma substancialmente purificada.

O GDNF foi purificado e caracterizado, e foram obtidas as

Γ. ..

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sequências de aminoácidos do material purificado. Com base na sequência parcial de aminoácidos obtida, foram concebidas sondas de ADN para obtenção de um clone de ADNc de ratazana, que pode ser utilizado na produção recombinante de GDNF. A sequência de ácido nucleico de tal clone e a sequência de aminoácidos inferida para o GDNF de ratazana é dada nas Figuras 13 (SEQ ID NO:3) e 14 (SEQ ID N0:4).

A sequência de aminoácidos do terminal amino do GDNF foi determinada e é apresentada na Figura 8 (SEQ ID NO:1). Uma porção da sequência de aminoácidos interna de GDNF foi também determinada e é apresentada na Figura 12 (SEQ ID N0:2). 0 GDNF purificado possui uma massa molecular aparente de cerca de 31-42 kD em SDS-PAGE sob condições não redutoras, e cerca de 20-23 kD em SDS-PAGE sob condições redutoras. Embora não esteja limitado por esta teoria, é postulado que esta informação é consistente com um GDNF dímero ligado por ponte de dissulfureto e glicosado no seu estado normal de ocorrência.

Como descrito com mais detalhe no Exemplo 6C abaixo, a expressão do gene de GDNF humano num sistema de expressão bacteriano leva à produção GDNF humano recombinante ou rhGDNF. O material isolado após a expressão é essencialmente biologicamente inactivo, e existe como um monómero. Após -redobrager.,-c GDNF existe como um dímero ligado por ponte de dissulfureto biologicamente activo. Assim, o GDNF é um dímero ligado por ponte dissulfureto na sua forma natural biologicamente activa. Este invento, contudo, inclui o GDNF em ambas as suas formas monomérica e dimérica, biologicamente activa e inactiva.

As sondas foram preparadas com base na sequência de ácido nucleico de GDNF de ratazana de modo a clonar o gene de ADN genómico que codifica o GDNF humano. 0 gene humano que codifica o GDNF maduro humano, e a sequência de aminoácidos do GDNF maduro humano são apresentadas na Figura 19 (SEQ ID N0:5).

GDNF pode também ser caracterizado pela sua capacidade de

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aumentar a incorporação de dopamina nos precursores embrionários dos neurónios dopaminérgicos da substância negra, como descrito no Exemplo 1 abaixo. 0 GDNF pode ainda ser caracterizado pela sua capacidade de promover a sobrevivência de células nervosas simpáticas e parassimpáticas, como descrito no Exemplo 4 abaixo.

GDNF pode ser adicionalmente caracterizado pela sua capacidade de sobrerregular a imunoreactividade da tirosina-hidroxilase em culturas mesencefálicas. Um exemplo desta característica está descrito no exemplo 1E e apresentado na Figura 20. Adicionalmente, o GDNF tem apresentado alguma especificidade para neurónios dopaminérgicos em relação aos neurónios em geral. Por exemplo, isto foi demonstrado pelo efeito limitado na incorporação de ácido Y-aminobutírico (GABA) em neurónios contendo GABA. Isto está também descrito no Exemplo 1E e apresentado na Figura 21. Mostrou-se, também, que o GDNF tem um efeito limitado na incorporação de serototonina, se existente, em neurónios serotonérgicos. Isto está descrito no Exemplo 1E e apresentado na Figura 24.

Ao longo de toda esta especificação, gualquer referência ao factor neurotrófico derivado da glia deve ser entendida como referência a factores neurotróficos de qualquer origem que sejam substancialmente homólogos e biologicamente eguivalentes ao GDNF caracterizado e aqui descrito.· O grau de homologia entre a proteína de ratazana e humana é de cerca de 93%, e todos os GDNF de mamíferos terão um elevado grau de homologia semelhante. Tais GDNF podem existir como dímeros na sua forma biologicamente activa.

O presente invento abarca formas glicosadas e não glicosadas de GDNF, bem como as formas truncadas do GDNF de ocorrência natural e recombinante agui descritas. Numa concretização adicional, o GDNF é modificado por fixação a um ou mais polietilenoglicol (PEG) ou outras partes de polímeros de repetição. O presente invento abarca também o GDNF produzido recombinantemente em sistemas bacterianos de expressão contendo um resíduo de metionina no terminal amino.

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Por biologicamente equivalente, como utilizado ao longo da especificação e reivindicações, entendem-se composições do presente invento que são capazes de demonstrar todas ou algumas das mesmas propriedades neurotróficas de uma forma semelhante, mas não necessáriamente no mesmo grau que o GDNF isolado do meio condicionado de B49. Por substancialmente homólogos, como utilizado ao longo da especificação e reivindicações seguintes, entende-se um grau de homologia com o GDNF isolado do meio condicionado de B49, em excesso em relação ao apresentado por qualquer GDNF previamente relatado. Preferencialmente, o grau de homologia é superior a 70%, mais preferencialmente superior a 80%, e ainda mais preferencialmente superior a 90%, 95 ou 99%. A percentagem de homologia como aqui descrito é calculada como a percentagem de aminoâcidos encontrados na mais pequena das duas sequências que alinham com resíduos de aminoácido idênticos na sequência, sendo comparadas quando podem ser introduzidos quatro intervalos num comprimento de 100 aminoâcidos para permitir o alinhamento como apresentado por Dayhoff, in Atlas of Protein Sequence and Structure Vol.5. p.124 (1972), National Biochemical Foundation, Washington, D.C., aqui especificamente incorporado para referência. Também se inclui como substancialmente homólogo qualquer GDNF que possa ser isolado devido a reactividade cruzada com anticorpos contra o GDNF aqui descritos, ou cujos genes possam ser isolados através de hibridação com o gene ou segmentos do gene parao GDNF aqui descrito.

Um GDNF preferido do presente invento foi isolado de meio condicionado de B49 e foi isolado numa forma substancialmente purificada. Um GDNF preferido adicional é o preparado por tecnologia do ADN recombinante para produzir GDNF numa forma substancialmente purificada. Para os objectivos do presente pedido, forma pura ou forma substancialmente purificada, quando utilizada para referir o GDNF aqui revelado, significará uma preparação que se encontra substancialmente isenta de outras proteínas que não o GDNF. Preferencialmente, o GDNF do presente invento está pelo menos, 50% puro, preferencialmente 75% puro e mais preferencialmente 80%, 95% ou 99% puro. Numa concretização do presente invento, a preparação da proteína GDNF é constituída

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SYN225/PO por essa forma substancialmente purificada de forma que um perito na arte possa determinar pelo menos porções da sua sequência de aminoácidos sem efectuar primeiro outros passos de purificação.

Numa concretização preferida deste invento, o GDNF é purificado de meio condicionado de B49 como descrito no Exemplo 1 abaixo. Claro que, dada a informação que aqui é apresentada, será evidente para os peritos na arte que outras fontes de GDNF podem ser identificadas, e que a purificação de GDNF de tais fontes pode ser geralmente conseguida de acordo com o processo de purificação aqui apresentado.

A actividade dopaminérgica do GDNF é utilizada para facilitar o processo de purificação. O bioensaio para actividades neurotróficas dopaminérgicas está descrito no Exemplo 1B abaixo. Sumáriamente, são preparadas culturas de células mesencefálicas dissociadas, tanto em ambiemte rico em soro como em ambiente isento de soro. As amostras a testar quanto à actividade dopaminérgica, são dessalinizadas e adicionadas em série às culturas de células e as placas incubadas durante 6 dias a 37°C, numa atmosfera humidificada contendo 6,5% de CC>2 . As culturas, na presença do material de teste, são então incubadas a 37°C com dopamina tritiada (³H-DA).

' A^- iiTCorpoiáção de dopamina é interrompida, as células lavadas, e a incorporação de dopamina analisada por contagem de cintilações do trítio retido nas culturas.

A purificação de GDNF está descrita com detalhe no Exemplo 1C abaixo. O processo de purificação está detalhado na Tabela I. 0 meio condicionado de partida é preparado das células de glioblastoma B49 por colocação das células em meio isento de soro durante 2 dias, quando o meio condicionado é recolhido e reabastecido. Este ciclo é repetido para produzir 3 colheitas de meio condicionado de cada cultura de células B49. O meio condicionado é centrifugado e concentrado cerca de 10 vezes antes de posterior purificação.

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O primeiro passo de preparação desta mistura bruta aqui definido como meio condicionado de crescimento de células de glioblastoma B49 isento de soro, é introduzir o meio condicionado numa coluna de Sepharose-Heparina, equilibrada com tampões NaPi 50 mM, pH 8,0, contendo NaCl 0,15 N. Uma solução tampão de gradiente constituída por NaPi 50 mM, pH 8,0 contendo NaCl 1,5 N é introduzida na coluna após estabilização da eluição. Fracções desta cromatografia são medidas quanto à actividade de GDNF, e as fracções contendo a actividade de GDNF são combinadas para posterior purificação.

As fracções combinadas são submetidas a cromatografia líquida rápida de proteína (FPLC) numa coluna de Superose, com um solvente tampão constituído por tampão NaPi 50 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,5 N. De novo, é determinada a actividade de GDNF das fracções obtidas. Uma única fracção deste procedimento é então acidificada e aplicada numa coluna C-8 de cromatografia líquida de fase inversa de elevada resolução (HPLC). As fracções identificadas como possuindo actividade de GDNF são combinadas para posterior purificação e para sequenciação de proteína. Comó apresentado na Tabela 1 abaixo, o GDNF obtido neste ponto possui uma actividade específica cerca de 24 000 vezes superior à do meio condicionado. A sequenciação do terminal amino da proteína obtida neste ponto fornece a sequência do terminal amino como apresentado na Figura 8 (SEQ ID N0;l). . . ....

A purificação posterior do GDNF obtido da HPLC pode ser efectuada por realização de uma SDS-PAGE preparativa das fracções contendo actividade de GDNF. Às fracções contendo proteína é adicionado tampão contendo glicerol e SDS, e a solução é conduzida numa SDS-PAGE a 15% não redutora, com electroforese conduzida a 10°C e 40 mA/gel durante 2 horas. Verificou-se por bioensaio, que a porção do gel correspondente à massa molecular de cerca de 30-42 kD continha actividade de GDNF. Uma segunda cromatografia de HPLC do material isolado de SDS-PAGE produz um único pico de GDNF, como apresentado na Figura 6.

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TABELA 1.

PURIFICAÇÃO DE GDNF DE MEIO CONDICIONADO DE CÉLULAS B49

PASSO_______PROTEÍNAS BIOACTI- ACTIVIDADE VEZES RENDIMENTO

VIDADE ESPECÍFICA

	(MG)	(TUxlO-3)	(TU/gg)	(%)
CM	200	94	0,5	d)	(100)
1.Sepharose- -Heparina	3,1	37	12	24	39
2. FPLC Superose	0,3a	31	103	206	33
3. RP-HPLC	0,001b	12	12 000	24 000	13
4. SDS-PAGE Preparativa	n.d.	7	n.d.	n.d.	7
5. RP-HPLC	0,0003b	5	17 000	34 000	5

^a com base na D.0.230

-í · - ^b*com base na recuperação da sequenciação de prcteína (cm í picomole) e uma massa molecular pressuposta (da SDS-PAGE não redutora) de 36 kD para o GDNF.

n.d.=não determinado

As sequências do terminal amino de GDNF foram determinadas para o material vindo de HPLC antes e depois da SDS-PAGE preparativa. Os procedimentos utilizados para obtenção das sequências de aminoâcidos do GDNF purificado estão dados no Exemplo ID. A sequência do terminal amino foi obtida com um sequenciador de proteína de fase gasosa. As sequências internas foram obtidas do material obtido por HPLC que não tinha sido posteriormente purificado por SDS-PAGE preparativa. A sequência de aminoâcidos interna foi obtida por incubação com tripsina do

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GDNF purificado. Os fragmentos da tripsina obtidos «Êoraif separados por HPLC. Verificou-se que um fragmento continha os primeiros 13 resíduos de aminoácido da sequência do terminal amino da proteína não tratada. Um segundo fragmento foi tratado com CNBr, purificado por HPLC, reduzido, e de novo purificado por HPLC. A sequência de aminoâcidos obtida é apresentada na Fig. 12 (SEQ ID NO:2). As sequências dadas em parêntesis foram determinadas com um pequeno grau de confiança.

Este invento inclui o processo para clonagem do gene para o GDNF, e o gene que foi identificado que codifica o GDNF. Um procedimento detalhado para a clonagem de genes de ratazana e humanos para GDNF é apresentado abaixo no Exemplo 2. De novo, os peritos na arte poderão verificar que existem outros processos óbvios para a clonagem deste gene à luz do que aqui é revelado. Em particular, a clonagem de genes de outras espécies codificando o GDNF será óbvia vistas as revelações e procedimentos aqui descritos.

O gene para o GDNF de ratazana aqui descrito foi obtido de uma biblioteca de ADNc construída a partir de ARN poli A+ isolado de células B49, que foi pesquisada com uma sonda de oligonucleotidica degenerada com base na sequência de aminoâcidos obtida do GDNF purificado. O ADNc foi obtido de acordo com procedimentos padrão, . tratado para conter ligadores digeridos com EcoRI. e inserido no vector de clonagem ÀZapII. A sonda de hibridação utilizada foi marcada com ³²P, e consistia no seguinte oligonucleótido degenerado (SEQ ID N0:7):

5' >CCIGATAAACAAGCIGCIGC>3 '

Foram obtidos vários clones positivos, e um clone ( AZapII76.1) foi positivamente identificado por sequenciação de ADN, como codificando uma porção do GDNF que não era utilizada na concepção da sonda degenerada.

O procedimento para a obtenção sequência nucleotídica do clone de ADNc contido em XZapII76.1 é apresentado no Exemplo

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2Β abaixo. A sequência nucleotídica dos primeiros 877 pares de bases da extremidade 5' do clone de ADNc foi determinada, e é apresentada na Figura 13 (SEQ ID N0:3). Na Figura 13, o clone apresentado contém uma estrutura de leitura aberta (ORF) de 227 aminoácidos, que inclui a extremidade amino do GDNF purificado e é consistente com a sequência para um péptido interno obtido por clivagem do GDNF purificado.

A sequência de aminoácidos inferida apresentada na Figura 14 (SEQ ID NO:4) mostra a sequência de aminoácidos para o GDNF maduro. Por GDNF maduro, entende-se a sequência do GDNF purificado obtido do meio condicionado de B49. Claro que, o GDNF purificado pode existir como um dímero ou outro multímero, e pode ser glicosado ou quimicamente modificado de outras formas. O GDNF maduro pode ser truncado na extremidade carboxilo, em particular por processamento proteolitico dos resíduos lis-arg 6 e 5, resíduos da extremidade carboxilo. O exame da sequência de ácido nucleico do clone de ratazana A ZapII76.1, como apresentado na Figura 13 (SEQ ID NO:5) sugere que o GDNF é inicialmente traduzido como um polipéptido pre-pro-GDNF e que o processamento proteolitico da sequência sinal e a porção pro desta molécula, resulta no GDNF purificado possuindo a mesma sequência madura do que a obtida do meio condicionado de B49. É postulado·que -o polipéptido pre-pro-GDNF começa nc primeiro codão ATG - que codifica a metionina - na extremidade 5' do clone (posição 50 na Figura 13). O presente invento inclui assim quaisquer e todos os polipéptidos pre-pro-GDNF que podem ser traduzidos do gene apresentado na figura 13, assim como quaisquer e todos os polipéptidos pre-pro-GDNF traduzidos por um clone mais completo, que pode ser fácilmente obtido por um perito na arte utilizando procedimentos laboratoriais padrão e o clone aqui descrito.

Uma revisão da sequência de ácido nucleico de ratazana apresentada na Figura 13 (SEQ ID NO:3) mostra que a sequência de aminoácidos prevista localizada entre as posições 518 e 538 é

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Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu que é consistente com a sequência de aminoácidos determinada para um pêptido derivado do GDNF maduro purificado pelo processo descrito na secção sobre a sequência interna no Exemplo 1 abaixo. Um codão de paragem TGA na posição 706 termina a ORF. 0 comprimento previsto do GDNF purificado é assim de 134 resíduos de aminoácido e a massa molecular prevista deste polipéptido é de 14 931. Ocorrem dois potenciais sítios de glicosação ligados a N nas posições 425 e 533. A glicosação em qualquer um, ou em ambos estes sítios, pode aumentar a massa molecular da molécula.

O resíduo de serina na posição 281, que corresponde ao início da sequência do GDNF maduro purificado, é precedido pela sequência Lys-Arg que proporciona um potencial sítio de clivagem proteolítica para processamento de uma forma precursora putativa do GDNF para produzir a forma da molécula que é purificada das células B49. Um potencial codão de iniciação tradução (ATG) ocorre na posição 50 da sequência e é proximamente seguido por uma potencial sequência sinal de secreção. As sequências de flanco deste ATG mostram uma semelhança suficiente com a sequência de consenso de Kozak (Kozak 1987 Nucl. Acid. Res. 15:125-48) para indicar que este ATG pode ser utilizado como um sítio de iniciação da tradução. Além disso, este ATG é o ATG mais próximo de 5' na sequência do clone de ADNc. Estes factos sugerem-no como um potencial,sítio de início de tradução de uma forma precursora de GDNF.

Estas características acima mencionadas da sequência nucleotídica do clone de ADNc de ratazana, sugerem a possibilidade do GDNF ser inicialmente traduzido como um polipéptido pre-pro-GDNF e que o processamento proteolítico da sequência sinal e da porção pro desta molécula resulta na produção da forma do GDNF que é purificada do meio condicionado das células B49. No entanto, a ocorrência de outras formas de GDNF é também consistente com os dados da sequência. Por exemplo, ocorrem nas 681 bp da ORF dois outros potenciais ATG de iniciação de tradução: um na posição 206 e outro na 242. Estes ATG estão localizados a montante do início da sequência do

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terminal amino do GDNF purificado. Embora, nos eucariotas, a iniciação da tradução ocorra geralmente no ATG mais próximo de 5' do ARNm (Kozak, supra), existem casos em que a proporção das iniciações de tradução ocorrem no ATG a jusante. Assim, formas precursoras alternativas de GDNF podem conceptualmente surgir por iniciação da tradução nestes codões ATG. 0 processamento proteolitico destes polipéptidos pode resultar na produção da mesma forma de GDNF purificado observado no meio condicionado de células B49. Além do mais, a estrutura de leitura aberta prolonga-se até a extremidade 5' da sequência do clone de ADNc. É assim possivel que a iniciação da tradução ocorra num ATG a montante ausente no clone de ADNc. Nesta eventualidade, o GDNF será traduzido como um precursor ainda maior contendo a sequência de aminoácidos aqui descrita e a sequência adicional a montante. O processamento desta forma precursora hipotética pode também levar à produção da forma de GDNF purificado aqui relatada. Será possível detectar potenciais inícios ATG a montante por sequenciação da extremidade 5' do ARNm contendo o gene para o GDNF, através da sua extensão por iniciadores com transcriptase inversa (Maniatis et al., supra). Adicionalmente, outros clones de ADNc podem ser obtidos a partir de bibliotecas B49 e as extremidades 5' destes clones podem ser sequenciados. O tamanho da extremidade 5' do ARNm localizado a montante do primeiro ATG pode ser determinada de forma mais grosseira, pelas «..técnicas de «n?ineamp.ntr> cnir, £1*' (Maniatis et al. , supra) . e/ou a simples medição dos produtos de reacção da extensão com iniciadores da transcriptase inversa. Enquanto uma variedade de formas putativas do produto primário da tradução que contém as sequências que codificam o GDNF purificado podem ser postuladas, a sequência parcial de ADN aqui apresentada para o clone de ADNc contido no fago recombinante A ZapII76.1, define claramente a sequência de codificação que constitui o polipéptido GDNF purificado isolado do meio condicionado de células B49.

No Exemplo 2C abaixo, está descrita a clonagem do gene humano que codifica para o GDNF. Uma biblioteca genómica humana foi pesquisada com uma sonda derivada do clone de ADNc de ratazana descrito no Exemplo 2B. Um clone de ADN genómico do

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GDNF humano foi identificado e a sequência do gene que codifica o GDNF maduro humano está apresentada na Fig. 19 (SEQ ID N0:5).

A sequência apresentada na Figura 19 para o gene do GDNF humano não fornece a sequência de codificação completa para a porção pre-pro do GDNF. O processo de obtenção da sequência de codificação para os primeiros 50 aminoácidos do pre-pro-GDNF humano está descrito abaixo no Exemplo 2D. A sequência obtida está apresentada na Figura 22 (SEQ ID N0:8). 0 mapa do plasmídeo pB55K— A 3Alul utilizado para obter a sequência está apresentado na Figura 23.

Este invento inclui sequências de ácido nucleico codificando o GDNF. São aqui fornecidas sequências com homologias relativamente altas codificando o GDNF de ratazana (Fig. 13) (SEQ ID N0:3) e humano (Fig. 19) (SEQ ID NO:5). Estão também incluídas no âmbito deste invento sequências de ácido nucleico substancialmente semelhantes que codificam as mesmas sequências ou sequências de aminoácidos altamente homólogas. Por exemplo, quando se prepara uma construção para a expressão de GDNF maduro num sistema de expressão bacteriano como a E. coli, certos codões na sequência de ácido nucleico apresentados na Fig. 19 (SEQ ID NO:5) podem ser substituídos por codões mais fácilmente expressos em E. coli de acordo com procedimentos -padrões bem conhecidos. Tais sequências de ácido nucleico serão incluídas no âmbito deste invento.

Sequências de ácido nucleico específicas podem ser modificadas pelos peritos na arte. Desta forma, este invento inclui também todas as sequências de ácido nucleico que codificam as sequências de aminoácidos para o GDNF maduro de ratazana e humano como apresentado nas Figuras 14 (SEQ ID NO:4) e 19 (SEQ ID NO:5), e pre-pro-GDNF de ratazana como apresentado na Figura 13 (SEQ ID NO:3) e para o pre-pro-GDNF humano como apresentado nas Figuras 19 (SEQ ID N0:5) e 22 (SEQ ID NO:8). 0 presente invento incorpora também sequências de ácido nucleico que vão hibridar com todas essas sequências de ácido nucleico

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—ou com os complementos das sequências de ácido nucleico nos casos em que isso seja apropriado— e codifica um polipéptido possuindo actividade dopaminérgica. O presente invento inclui também sequências de ácido nucleico que codificam polipéptidos que possuem actividade dopaminérgica e que são reconhecidos por anticorpos que ligam GDNF.

O presente invento também inclui vectores que compreendem elementos reguladores de expressão operativamente ligados a qualquer das sequências de ácido nucleico incluídas no âmbito deste invento. Este invento incorpora também células hospedeiras —de qualquer variedade— que foram transformadas com vectores compreendendo elementos reguladores de expressão operativamente ligados a qualquer das sequências de ácido nucleico incluídas no âmbito deste invento.

A expressão de GDNF em células COS está descrita abaixo no Exemplo 5. 0 gene que codifica GDNF, apresentado na Figura 13 foi subclonado no vector plasmídico pSG5, um vector concebido para a expressão transitória de genes clonados em células como as células COS. Foram seleccionados plasmídeos contendo o gene de GDNF na orientação própria e imprópria, e o ADN foi transfectado em células COS-7. Após cultura, as células transformadas foram colhidas. 0 meio condicionado das células COS-7 foi testado para bioactividade em ambos os ensaios dopaminérgicos e o ensaio dos neurónios dos gânglios simpáticos . Verificou-se que o meio condicionado das células contendo o gene do GDNF na orientação própria, possuía actividade biológica em ambos os ensaios, indicando que GDNF biologicamente activo tinha sido produzido com êxito através de processos de ADN recombinante.

Numa concretização preferida do presente invento, GDNF maduro humano é preparado pela tecnologia do ADN recombinante num sistema de expressão bacteriano.

A expressão de GDNF humano em E. coli está descrita abaixo no Exemplo 6. A porção do gene de GDNF humano que codifica o

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GDNF maduro humano como apresentado na Figura 19, foi utilizado para preparar uma construção de GDNF humano. Tal construção foi ligada a um vector plasmídico, que foi transformado na estirpe JM10 7 de E. coli. Após cultura das células hospedeiras transformadas, o GDNF produzido foi colhido. Foi obtida uma proteína com a massa molecular esperada para o GDNF maduro humano (cerca de 15 000 daltons), e a sequenciação do terminal amino confirmou que a proteína obtida era o GDNF maduro humano.

A redobragem e naturação do GDNF humano expresso em E. coli está descrita abaixo no Exemplo 6C. Na concretização do invento descrito, o extracto obtido contendo a proteína expressa foi parcialmente purificado antes da redobragem por cromatografia de permuta iónica na resina S-Sepharose Fast Flow. A redobragem foi efectuada por adição de: primeiro, ditiotritol, depois sal de di-sódio de glutationa, depois um tampão de redobragem ao extracto contendo o GDNF. 0 rhGDNF redobrado era substancialmente completamente biologicamente activo, e existia como um dímero ligado por pontes de dissulfureto na sua forma biologicamente activa. 0 GDNF antes da redobragem -- e após redução do material redobrado — existia num estado monomérico e era substancialmente biologicamente inactivo.

O GDNF pode também ser produzido por expressão em outros sistemas do expressão. Por exemplo, com a sequência de ácido nucleico que codifica o GDNF maduro humano como apresentado na Figura 19, um perito na arte pode produzir GDNF em outros sistemas de expressão. Os vectores contendo a sequência de ácido nucleico para GDNF operativamente ligada a elementos reguladores de expressão podem ser transformados em outras células hospedeiras de microrganismos incluindo, Bacillus, Pseudomonas e leveduras. Os sistemas de expressão em Baculovírus podem também ser empregues.

Como notado acima, o presente invento refere-se a processos para o tratamento de lesões de nervos em pacientes com esse sofrimento. Estes processos compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína humana, o

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factor neurotrófico derivado da glia (GDNF) a um paciente que sofre de lesão de nervos.

Uma doença ou indicação médica deve ser considerada como uma lesão de nervos, se a sobrevivência ou função das células nervosas e/ou das suas protuberâncias axonais está comprometida. Numa concretização preferida, tais lesões nos nervos ocorrem como resultado de uma das seguintes condições: 1) lesão física, que causa a degeneração das protuberâncias axonais e/ou dos corpos das células nervosas próximas do local da lesão; 2) Isquemia, como numa trombose; 3) Exposição a neurotoxinas, como os agentes terapêuticos do cancro e da SIDA cisplatina e didesoxicitidina (ddC), respectivamente; 4) Doenças metabólicas crónicas, tal como a diabetes ou disfunção renal; e, 5) Doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson, doença de Alzheimer, e Esclerose Amiotrópica Lateral (ALS), que causam a degeneração de populações neuronais específicas. Uma lista não exclusiva de condições que envolvem lesões de nervos inclui a doença de Parkinson, doença de Azheimer, Esclerose Amiotrópica Lateral, Trombose, Polineuropatia diabética, Neuropatia tóxica causada pelos agentes quimioterapêuticos contra o cancro, taxol ou cisplatina ou vincristina, Neuropatia tóxica causada pelos agentes quimioterapêuticos contra a SIDA ddl ou ddC, e lesões físicas no sistema nervoso como as causadas por lesão física do cérebro ou da espinal medula ou lesões de esmagamento ou de corte no braço e mão.

Processos para a produção de GDNF são também aqui revelados. Um processo revelado consiste no isolamento de GDNF de várias fontes, como o meio condicionado da linha de células da glia. Um segundo processo envolve o isolamento de genes responsáveis pela codificação de GDNF, a clonagem do gene em vectores e tipos de células adequados, e a expressão do gene de modo a produzir o GDNF. 0 último processo, que é exemplo dos processos de ADN recombinante em geral, é uma processo preferido deste invento. Os processos de ADN recombinante são em parte preferidos devido à sua capacidade de obtenção de quantidades comparativamente maiores de proteína com pureza mais elevada. 0

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GDNF humano recombinante, é a proteína mais preferida para a preparação de composições terapêuticas e para o tratamento de lesões de nervos.

Este invento inclui meios para identificação e clonagem de genes que codificam proteínas que partilham homologia de sequências de aminoácidos com GDNF, assim como todas estas proteínas identificadas.

Foi descrita uma família de genes de mamífero constituída por três factores neurotróficos (Leibrock et al. 1989 Nature 341:149-152, Maisonpierre et al- 1990 Science 247:1446-1451). As formas maduras das três proteínas que compreendem esta família [factor do crescimento do nervo (NGF), factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), e neurotrofina-3 (NT-3)] partilham uns com os outros aproximadamente 50% da identidade de aminoácidos. As posições dos seis resíduos de cisteína presentes em cada uma destas proteínas são precisamente conservados. Embora estruturalmente semelhantes, estas três proteínas apresentam distribuições tissulares diferentes (Ernfors et al. 1990 Neuron 5:511-526, Maisonpierre et al . 1990 Neuron 5:501-509, e Phillips et al. 1990 Science 250:290-294) e diferentes actividades in vitro (Rosenthal et al. 1990 Neuron 4:767-773, Whitemore et al. 1987 Brain Res. Rev. 12: 439).

O GDNF não apresenta homologia significativa com qualquer proteína previamente descrita, mas podem existir genes não identificados que codificam proteínas que possuam uma homologia substancial na sequência de aminoácidos com o GDNF e que possam actuar in vivo como factores neurotróficos, com diferentes padrões específicos de distribuição tissular, e/ou diferentes espectros de actividade. Tais proteínas constituirão membros da família GDNF dos factores neurotróficos. As sequências de ADN para os genes GDNF de ratazana e humano, aqui apresentados na Figura 13 (SEQ ID NO:3) e 19 (SEQ ID NO:5) e 22 (SEQ ID NO:8) respectivamente, podem ser utilizadas para identificar novos membros desta putativa família de genes GDNF.

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Como uma consequência da conservação da sequência de aminoâcidos entre os produtos proteicos dos membros de uma família de genes, como a família de genes NGF acima referida ou a família de genes GDNF, existe uma conservação considerável a nível de sequência de ADN. Desta forma, sob condições de hibridação apropriadas, pode ocorrer hibridação cruzada de ácido nucleico entre genes da mesma família, isto é, uma sonda de ácido nucleico derivada de uma sequência de uma família de membros formará uma molécula duplex híbrida estável com moléculas de ácido nucleico que possuam sequências relacionadas, mas não idênticas às da sonda (Beltz et al. 1983 Methods in Enzimoloqy 100:266-285). Desta forma, pode-se pesquisar genes relacionados por homologia de sequência com o GDNF, preparando sondas de ADN (ou ARN), únicas ou degeneradas, com base na sequência de GDNF de ratazana, humano ou de qualquer outra espécie, e realizando experiências de hibridação com uma variedade de ADN alvo (ou ARN), sob condições que irão permitir a formação estável de duplexes imperfeitamente emparelhados de ácido nucleico.

Tais condições de hibridação, denominadas geralmente de severidade reduzida são bem descritas na literatura (Beltz et al., supra; Sambrook et al. 1989 Molecular Cloning, 2* edição, Cold Spring Harbor Press) e envolvem mais frequentemente redução na temperatura da reacção de hibridação,. quando efectuada em solução aquosa, e/ou redução na concentração de formamida em sistemas de hibridação que empregam normalmente soluções de formamida a 50%. Outros meios de redução da severidade da hibridação foram também descritos e podem ser utilizados (Sambrook et al., supra). Os alvos de ácido nucleico nestas experiências de hibridação podem incluir:

1) bibliotecas genómicas de ADN contendo ADN de ratazana, humano, ou de outras espécies de mamíferos, ou ADN de quaisquer outras espécies clonado em vectores convenientes, incluindo bacteriófagos, plasmídeos, cosmídeos, cromossomas artificiais de leveduras, ou qualquer outro tipo de vector;

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2) Bibliotecas de ADNc construídas a partir de ARN de qualquer tipo de tecido obtido a partir de qualquer dos organismos acima mencionados, ou obtidos da cultura de qualquer tipo de célula primária obtida de qualquer dos organismos acima mencionados, ou de qualquer outro tipo de linha celular estável que exista normalmente ou produzida a partir de qualquer cultura de célula primária;

3) ADN genómicos como descrito no item 1 acima, que são digeridos com enzimas de restrição e preparados para análise por transferência de Southern através de electroforese em gel e transferência para um suporte sólido;

4) ARN como descritos no item 2 acima, que são sujeitos a electroforese e transferência para um suporte sólido para análise por transferência de Northern. Tais ARN podem incluir ARN celular total ou ARN poli A+ fraccionado.

5) Produtos da reacção em cadeia de polimerase (PCR) que emprega oligonucleótidos iniciadores com base em sequências que ocorrem no GDNF e utilizam como moldes qualquer das fontes de ácido nucleico descritas nos itens 1 a 4.

Qualquer sequência de ácido nucleico que apresenta hibridação -ccm uma sonda com base no GDNF sob um conjunto de algumas condições de hibridação empiricamente determinadas, pode ser clonada e sequenciada por qualquer das variadas técnicas de sequenciação bem conhecidas para o perito na arte, e o grau da homologia de sequência pode ser directamente determinado para identificar membros de uma família de genes GDNF. Tal abordagem de hibridação foi utilizada para clonar NT-3 por pesquisa com uma sonda com base na sequência de NGF (Kaisho et al. 1990 FEBS Letters 266:187-191).

Um processo alternativo para identificação de membros da família GDNF envolve a utilização da reacção em cadeia de polimerase (PCR), para amplificar sequências de membros da família GDNF, seguida de clonagem e análise das sequências

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amplificadas. Podem ser sintetizados para a PCR oligonucleótidos iniciadores degenerados (ou não degenerados), com base na sequência de GDNF. Uma vez conhecida a localização da cisteína conservada e as sequências conservadas de aminoácidos na vizinhança imediata dos resíduos de cisteína, que se observa para a família NGF, as regiões que rodeiam as cisteínas no GDNF maduro representam candidatos óbvios para síntese de iniciadores, mas uma variedade de outros iniciadores pode também ser escolhida das porções maduras e pre-pro da proteína. As reacções de PCR podem ser efectuadas sob condições de temperatura de hibridação reduzida, que permitirá a amplificação de não só a sequência de GDNF, mas também as sequências de quaisquer membros da família GDNF. Ver, Innis et al. 1990 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press.

Os produtos de tais reacções de PCR, podem ser seleccionados pelo tamanho por electroforese em gel, clonado num vector apropriado e o ADN clonado, sequenciado para identicar membros da família GDNF. Alternativamente, os clones podem ser primeiro pesquisados por hibridação com uma sonda específica para o GDNF, em condições de severidade elevada para identificar clones de GDNF. Quaisquer clones que não hibridem com GDNF em condições de severidade elevada podem então ser sequenciados ou tais clones podem ser hibridados com uma sonda de GDNF em condições de severidade reduzida e quaisquer clones que hibridaram com a sonda de GDNF nestas condições pode então ser sequenciado.

Uma segunda abordagem utilizando PCR para clonagem de membros da família GDNF será a marcação dos produtos da reacção de PCR acima descritos, e utilizar estes produtos como sonda para pesquisar alvos de ácido nucleico acima enumerados, sob condições de elevada e/ou baixa severidade. Os clones ou segmentos nucleicos a hibridar, podem ser analisados como detalhado acima para identificação de clones GDNF e membros da família. Tal abordagem foi utilizada para clonar NT-3 com base em sequências de NGF e BDNF (Maisonpierre et al. 1990 Science 247:1446-1451).

Numa concretização preferida do presente invento, uma

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composição terapêutica ou farmacêutica comprendendo GDNF é administrada numa quantidade eficaz a pacientes sofrendo de lesões de nervos. Numa concretização preferida do presente invento, o GDNF é utilizado terapeuticamente para tratar pacientes sofrendo de doença de Parkinson. Os peritos na arte estão familiarizados com a variedade de ensaios disponíveis para indicar quais os neurónios responsivos ao tratamento com GDNF, e a determinação de outros neurónios receptivos ao GDNF, pode ser efectuada sem experiência prévia. Um perito na arte pode fácilmente determinar onde é que a mensagem para o GDNF é expressa em todo o corpo, e quais os níveis de proteína GDNF em cada uma das regiões. Um perito na arte pode também determinar a localização dos sítios de ligação para o GDNF em todo o sistema nervoso. Esta informação permitirá a um perito na arte determinar os tipos neuronais que parecem ser responsivos a GDNF, o que por sua vez sugerirá as indicações clínicas apropriadas para esta proteína. A cultura de células apropriadas e experiências em animais podem ser efectuadas para determinar até que ponto o GDNF será útil no tratamento de tais indicações.

Foi também verificado que o GDNF purificado isolado de meio condicionado de células B49 promove a sobrevivência de células nervosas simpáticas e parassimpáticas em cultura. Estes resultados estão apresentados em detalhe no Exemplo 4.

Devido à possibilidade da função neurotrófica do GDNF ser conferida por uma ou mais porções separáveis e discretas, está também previsto que o processo do presente invento possa ser praticado por administração de uma composição terapêutica cujo ingrediente activo consiste na porção (ou nas porções) de GDNF que controla (ou controlam) a função neurotrófica do GDNF.

A composição terapêutica ou farmacêutica do presente invento é preferencialmente administrada parentalmente por injecção ou directamente no fluido cerebro-espinal (CSF) por infusão contínua através de uma bomba implantada. Outras formas eficazes de administração, como as formulações parenterais de libertação lenta, misturas inalantes, formulações oralmente r · * »

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activas ou supositórios são também consideradas. A administração em ligação com um ou mais agentes capazes de promoverem a penetração de GDNF através da barreira sangue-cérebro está também considerada. Um veículo preferido é a solução fisiológica salina, mas está contemplado que outros portadores farmaceuticamente aceitáveis como o CSF artificial, podem também ser utilizados. Numa concretização preferida está previsto que o portador e o GDNF constituam uma formulação fisiologicamente compatível de libertação lenta. O solvente primário desse portador pode ser de natureza aquosa ou não aquosa. Adicionalmente,o portador pode conter outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis para modificar ou manter o pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, côr, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou odor da formulação. Da mesma forma, o portador pode conter ainda outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis para modificar ou manter a estabilidade, taxa de dissolução, libertação ou absorção, ou penetração do GDNF através da barreira sangue-cérebro. Tais excipientes são aquelas substâncias usualmente e habitualmente empregues para formular dosagens para administração parentérica, seja na forma de dose única ou multi-dose, ou para infusão directa no CSF por infusão contínua ou periódica através de uma bomba implantada.

Uma vez formulada a composição terapêutica, pode ser armazenada em recipientes estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas numa forma pronta a utilizar, ou numa forma que necessita de reconstituição imediatamente antes da administração. O armazenamento preferido destas formulações é a temperaturas pelo menos tão baixas como 4 °C e preferencialmente a -70 ’C.

Preferencialmente, a forma de administração parentérica das formulações contendo GDNF é através de via subcutânea, intramuscular, intratecal ou intracerebral. Para conseguir a dose desejada de GDNF, doses diárias ou menos frequentes de injecções subcutâneas ou intramusculares podem ser

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administradas, ou o GDNF pode ser administrado por infusão contínua ou periódica através de bomba implantada. A frequência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos do GDNF na formulação e via de administração utilizada.

Para conseguir a dose desejada de GDNF para lesões de células nervosas dopaminérgicas e outras células nervosas cujos corpos celulares se situam no cérebro e espinal-medula, está contemplado que o GDNF será administrado no espaço subaracnoide da espinal-medula ou ao cérebro, ou intracerebroventricularmente. A administração pode ser contínua ou periódica e pode ser efectuada através de uma bomba implantada de fluxo constante ou programável, ou por injecções periódicas. A administração pode também ocorrer em conjunção com agentes que permitem a penetração do GDNF na barreira sangue-cérebro.

Está também contemplado que determinadas formulações contendo GDNF serão administradas oralmente. Preferencialmente, o GDNF que é administrado desta forma é capsulado. 0 GDNF capsulado pode ser formulado com ou sem os portadores habitualmente utilizados na composição de formas de dosagem sólidas. Preferencialmente, a cápsula é concebida de modo que a porção activa da formulação seja libertada no ponto do tracto gastrintestinal em que a biodisponibilidade é maximizada e a degradação·, pré-sistAm-iça é minimizada. Excipientes adicionais podem ser incluídos para facilitar a absorpção de GDNF. Podem também ser empregues diluentes, aromas, gorduras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração em comprimidos e aglutinantes.

Indiferente à maneira de administração, a dose específica é calculada de acordo com o peso aproximado ou a àrea da superfície do corpo do paciente. O refinamento posterior dos cálculos necessários para determinar a dose apropriada para o tratamento envolvendo cada uma das formulações acima mencionadas, é rotineiramente feita pelos peritos na arte e encontra-se no âmbito das tarefas rotineiramente por eles executadas sem prévia experiência, especialmente à luz da

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-39SYN225/PO informação de dosagem e ensaios aqui revelados. Estas dosagens podem ser determinadas através da utilização de ensaios estabelecidos para determinar dosagens utilizadas em conjunção com dados de dose-resposta apropriados.

Numa concretização deste invento, o GDNF pode ser terapeuticamente administrado por implantação nos pacientes, de células capazes de sintetizar e segregar uma forma biologicamente activa de GDNF. Tais células produtoras de GDNF podem ser células que são produtoras naturais de GDNF (análogas às células B49), ou podem ser células cuja capacidade para produzir GDNF foi aumentada por transformação com o gene do GDNF numa forma adequada para promover a sua expressão e secreção. De modo a minimizar uma potencial reacção imunológica em pacientes, da administração de GDNF de espécies estranhas, é preferível que as células naturais produtoras de GDNF sejam de origem humana e produzam GDNF humano. Da mesma forma, transformar-se-ão células para expressarem GDNF humano utilizando uma construção que codifica o GDNF humano, por processos análogos aos utilizados nos Exemplos 5 e 6 abaixo.

As células capazes de segregarem naturalmente GDNF humano podem ser identificadas utilizando os seguintes utensílios: 1) Podem ser utilizados oligonucleótidos representando uma porção -do- API-^T mensageiro para o GDNF humano ou complementares para uma porção de ARN mensageiro para GDNF humano, para revelar linhas celulares que produzem a mensagem para o GDNF humano por análise de transferência de Northern, protecção de ARNase, hibridação in situ, reacção em cadeia de polimerase, ou outros processos relacionados; ou 2) Podem ser utilizados anticorpos policlonais ou monoclonais que reconhecem o GDNF humano, para revelar linhas celulares cujos extractos ou meio condicionado de cultura contenham a proteína GDNF por análise de transferência de Western, ensaio de ELISA, ensaio radio-imunológico, ou outros processos relacionados. Uma estratégia preferida é a pesquisa do meio condicionado de cultura de uma série de células de origem humana, com anticorpos contra GDNF humano pelos processos de (2) acima, para revelar linhas de células que segregam GDNF

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-40para o seu meio de cultura. A

confirmação do GDNF assim produzido virá com a purificação e análise da sequência de aminoácidos, como efectuado para o GDNF segregado para o meio de cultura pelas células B49. 0 Exemplo 7 abaixo descreve a produção e isolamento de anticorpos contra o GDNF humano recombinante.

As células que segregam naturalmente ou as células transformadas para segregarem GDNF humano podem ser utilizadas para tratar pacientes. Células animais humanas ou não humanas podem ser implantadas em pacientes em envólucros poliméricos semi-permeáveis para permitirem a libertação de GDNF, mas evitando a destruição das células pelo sistema imunitário do paciente. Alternativamente, as células do próprio paciente, transformadas para produzirem GDNF ex vivo, podem ser implantadas directamente no paciente sem encapsulação.

A metodologia para a encapsulação de células vivas numa membrana é familiar aos peritos na arte, e a preparação das células capsuladas e a sua implantação em pacientes pode ser efectuada sem experiência prévia. Ver Patentes U.S. N° 4 892 538; 5 011 472; e 5 106 627, cada uma das quais aqui especif icamente incorporada para referência. Um sistema para a encapsulação de células vivas está descrita no Pedido PCT WO 91/10425 de Aebischeret al., aqui especificamente incorporada para referência. Ver também Pedido PCT WO 91/10470 de Aebischer et al. ; Winn et al.. 1991 Exper. Neurol. 113:322-329; Aebischer et al. 1991 Exper. Neurol. 111:269-275; Tresco et al. 1992 ASAI O 38:17-23, cada um dos quais aqui especificamente incorporado para referência.

Em particular, as células que segregam GDNF podem ser implantadas em pacientes com a doença de Parkinson no corpo estriado para proporcionar GDNF aos campos terminais dos neurónios dopaminérgicos da substânia negra e na substância negra, para proporcionar GDNF aos corpos celulares dopaminérgicos. Este GDNF aplicado localmente promoverá a proliferação e a reinervação do corpo estriado pelos terminais

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dopaminérgicos e prevenirá ou abrandará a posterior degeneração das células nervosas dopaminérgicas.

O presente invento inclui, desta forma, um processo para a prevenção e tratamento de lesões de nervos por implantação de células no corpo do paciente com essa necessidade; tais células, podem ser seleccionadas pela sua capacidade natural de produzir GDNF ou manipuladas para segregarem GDNF. Sendo preferencialmente o GDNF segregado, um GDNF maduro humano, quando o paciente é humano.

Deve ser notado que as formulações de GDNF aqui descritas podem ser utilizadas tanto para aplicações veterinárias como humanas, e que o termo paciente” não deve ser construído de forma limitante. No caso de aplicações veterinárias, os intervalos de dosagem devem ser os mesmos acima especificados.

É compreensível que a aplicação dos ensinamentos do presente invento para um problema ou ambiente específico estará nas capacidades de um perito na arte à luz dos ensinamentos aqui contidos. Exemplos de utilizações representativas do presente invento encontram-se nos seguintes exemplos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Purificação e sequenciacão do GDNF.

Este exemplo descreve os processos para o bioensaio e purificação do GDNF. Descreve também processos para a preparação de meio condicionado da linha celular B49, que é o material de partida para a purificação. São também descritos processos para a obtenção da sequência de aminoácidos do GDNF purificado e sequências de aminoácidos parciais obtidas da proteína purificada.

A. Materiais. Ratazanas grávidas com determinado tempo foram obtidas de Zivie Miller Lab, Allison Park, PA. A menos que seja especificado, todos os reagentes foram da Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO.

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Β. Bioensaio para actividades neurotróficas dopaminérqicas.

Condições de cultura: Culturas de células de mesencéfalo dissociadas foram preparadas como previamente descrito (Friedman e Mytilineou 1987 Neurosci. Lett. 79:65-72), com modificações mínimas. Sumáriamente, tegmento mesencefálico rostral de cérebros de embriões de ratazanas Sprague-Dawley, no 16® dia de gestação, foram dissecados sob o microscópio em condições estéreis, recolhidos em solução salina de Dulbecco tamponada com fosfato e isento de Ca²⁺ e Mg²⁺ (Gibco, Gaithersburg, MD) e mecanicamente dissociados por trituração suave. As células foram plaqueadas, 100 μΐ por poço, em poços de cultura de tecidos com 16 mm de diâmetro (Falcon, Lincolm Park, NJ, placa de 24 poços) contendo 400 μΐ de meio, para uma densidade de 2,5-3,5 X10⁵ células por poço. Os poços de cultura tinham sido previamente expostos a uma solução de poli-L-ornitina 0,1 mg/ml em borato de sódio 10 mM, pH 8,4, durante 3 horas a 37 °C, lavados 3 vezes em água milli-Q e uma vez em solução de Earle equilibrada em sal (Gibco). O meio de alimentação (10/10) consistiu no meio mínimo essencial (MEM,Gibco) suplementado com glucose (33 mM), bicarbonato de sódio (24,5 mM), glutamina (2 mM), HEPES (15 mM), penicilina G (5U/ml), estreptomicina (5 Mg/ml), 10% de soro de vitelo fetal inactivado pelo calor (Gibco), e 10% de soro de cavalo inactivado pelo calor (Gibco). As culturas foram incubadas a 37C numa atmosfera saturada com água contendo 6,5% de CO₂·-Após .3 horas, quando a maioria das células aderiu ao fundo do poço, o meio foi substituído com 500 μΐ de meio fresco. Nesta altura, uma diluição em série da amostra a ensaiar quanto à actividade de GDNF é adicionada a cada poço, em duplicado, e as placas foram incubadas numa incubadora a 37°C. Após uma semana, as culturas foram tratadas durante 24 horas com fluorodesoxiuridina (13 gg/ml) e uridina (33 Mg/ml), para evitar proliferação excessiva da glia, e subsequentemente alimentadas com o meio anterior sem soro de vitelo fetal. O meio de alimentação foi mudado semanalmente.

Alternativamente, foi utilizado meio quimicamente definido isento de soro, em que o soro foi substituído por uma mistura de proteínas, hormonas e sais. 0 meio definido (DM) consistiu numa

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mistura de MEM e mistura nutriente F12 (ambos Gibco, 1:1; vol/vol) com glucose (33 mM) , glutamina (2 mM), NaHCO₃ (24,5 mM), HEPES (15 mM), suplementado com transferrina (100 Mg/ml), insulina (25 μg/ml), putrescina (60 μΜ) , progesterona (20 nM), selenito de sódio (30 nM), penicilina G (5 U/ml) e estreptomicina (5 gg/ml). A osmolaridade do DM foi ajustada a 325 pela adição de água milli-Q. (110-125 ml H₂O/1). Utilizando DM, foram evidentes poucas células não neuronais, pela morfologia ou por coloração da proteína ácida fibrilar da glia (GFAP), que é uma proteína do citoesqueleto específica de astrócitos. O GDNF é activo na estimulação da incorporação da dopamina tanto no meio contendo soro como no meio definido. Todos os ensaios realizados nos exemplos seguintes foram efectuados em meio contendo soro.

O estado funcional dos neurónios dopaminérgicos pode ser ensaiado nestas culturas por medida da incorporação de dopamina através de transportadores depuradores específicos nos neurónios dopaminérgicos e por contagem do número de neurónios positivos para a enzima sintética tirosina-hidroxilase de dopamina utilizando imuno-histoquímica. A possibilidade de contaminação significativa das culturas com neurónios noradrenérgicos, que podem também transportar dopamina e contêm também hidrolase da tirosina, foi eliminada por dissecação cuidadosa e nela demonstração de. que os transportadores de dopamina possuem perfis farmacológicos característicos de neurónios dopaminérgicos, em vez de noradrenérgicos. A incorporação de dopamina nestas culturas é inibida por GBR12909, um inibidor do transportador monoamina nos neurónios dopaminérgicos, com uma EDg₀ de 20 nM. Em contraste, é necessário pelo menos-300 vezes mais de desipramina, um inibidor do transportador monoamina ou neurónios noradrenérgicos, para inibir a incorporação de dopamina nestas culturas. Estes valores são os que foram relatados para o transportador monoamina em neurónios dopaminérgicos.

Preparação da amostra: Todas as amostras derivadas da purificação, do Passo 1 ao Passo 3 (ver secção C, abaixo), foram

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desalinizadas como se segue, antes de ser ensaiada a actividade neurotrófica dopaminérgica nas culturas de células mesencefálicas. Adicionaram-se 100 gl do meio 10/10 (como portador) a um Centricon-10 (Amicon) e deixou-se repousar durante 10 minutos. Foram adicionadas alíquotas da amostra a ser ensaiada ao Centricon, seguidas por 1 ml de Meio de Eagle Modificado rico em glucose de Dulbecco, sem bicarbonato, mas contendo HEPES 10 mM, pH 7,2 (solução A), e centrifugado a 5 OOOx g durante 70 minutos. O retido (cerca de 1 ml) foi levado a 1,1 ml com solução A fresca e reconcentrado duas vezes. A amostra foi filtrada através de um filtro Ultrafree-MC de 0,11 gm numa unidade de filtração estéril Durapore (Millipore, Bedford, MA) antes de ser adicionada ao poço de cultura.

Incorporação de ³H-dopamina: A incorporação de dopamina tritiada (³H-DA) foi efectuada em culturas no dia 6 ou 7, como préviamente descrito (Friedman e Mytilineou (1987 ) Neurosci. Lett. 79:65-72) com modificações mínimas, e todas as soluções foram mantidas a 37°C. Sumáriamente, o meio de cultura foi removido, lavado duas vezes com 0,25 ml do tampão de incorporação que consiste no tampão fosfato de Krebs-Ringer, pH

7,4, contendo glucose 5,6 mM, EDTA 1,3 mM, ácido ascórbico 0,1 mM e pargilina 0,5mM, um inibidor da monoamina-oxidase. As culturas foram incubadas com 0,25 ml de ³H-DA 50 nM (New England Nuclear, Boston, MA, ant. esp. 36-37 Ci/mmol) durante 15 minutos a 37°C. A incorporação de ³H-DA foi interrompida por remoção da mistura de incubação, e as células foram então lavadas duas vezes com 0,5 ml do tampão de incorporação. De modo a libertar ³H-DA das células, as culturas foram incubadas com 0,5 ml de etanol 95% durante 30 minutos a 37 °C, e depois adicionadas a 10 ml de EcoLite (ICN,Irvine, CA) e contadas com um contador de cintilações. Os valores do branco foram obtidos por adição do tampão de incorporação GBR-12909 (RBI) 0,5 mM, um inibidor específico da bomba de incorporação dos neurónios com elevada afinidade para a dopamina (Heikkila et al. 1984 Euro. J. Pharmacol. 103:241:248), e apresentavam geralmente uma incorporação de ³H-DA inferior em 5% em relação às culturas não tratadas. O número de unidades tróficas (TU) de actividade de

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-45GDNF foi definido como o recíproco da diluição que dá 50% de estimulação máxima de incorporação de ²H-DA pela cultura. A actividade específica foi determinada dividindo o número de TU pela quantidade de proteína presente na amostra.

C. Purificação do GDNF

Material de partida: Células de glioblastoma B49, obtidas do Dr. Schubert, Salk Institute, La Jolla, CA. (ver Schubert et al. 1974 Nature 249:224-27), foram cultivadas até à confluência em meio DMEM contendo 10 % de soro de vitelo fetal, glutamina 4 mM, penicilina 50 U/ml e estreptomicina 50 gg/ml em balões de cultura (225 cm², Costar, Cambridge, MA). 0 meio de cultura condicionado isento de soro (CM), foi preparado por lavagem da cultura uma vez com 10 ml de meio isento de soro e depois, colocação das células em 50 ml de meio isento de soro por balão durante 2 dias. O CM foi recolhido, e as células foram reabastecidas com meio fresco isento de soro, todos os 2 dias até ao dia 6. O CM de 3 recolhas de cada cultura de células foi combinado e centrifugado a 5 OOOx g durante 20 minutos a 4°C para remoção das células e resíduos celulares. O sobrenadante foi concentrado aproximadamente 10 vezes através de um concentrador Amicon (membrana YM10) e centrifugado a 40 OOOx g durante 20 minutos a 4’C. 0 sobrenadante foi filtrado através de uma cápsula de microcultura de 0,2 μ (Gelman Sciences) e pôde -s^.r. armazenada a 4°C por mais de um mês.

Passo 1. Cromatografia em Sepharose-heparina: A preparação anterior (200 mg de proteína) foi aplicada a uma coluna (1x25 cm) de Sepharose CL-6B-heparina (Pharmacia, Piscataway, NJ) eguilibrada com tampão NaPi 50 mM, pH 8,0, contendo NaCl 0,15 N (tampão A). A coluna foi então lavada com o mesmo tampão até a densidade óptica a 280 nm (D.0.₂8o) úo efluente voltar à linha de base, e eluída com 100 ml de um gradiente linear de tampão A em NaPi 50 mM, pH 8,0, contendo NaCl 1,5 N (tampão B). Foram recolhidas fracções de dois ml. As fracções foram analisadas quanto à condutuvidade e actividade do GDNF. A Figura 1 apresenta a cromatografia. O perfil das proteínas eluídas é apresentado como D.O.₂3q· θ perfil de condutividade encontra-se

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sobreposto com o perfil da actividade medida para cada fracção. As fracções indicadas pelas barras, com pico de actividade de GDNF (cerca de NaCl 0,6-0,8 N) foram combinadas para análise posterior.

Passo 2. Cromatografia de FPLC em Sepharose: O combinado anterior foi concentrado em 0,4 ml num concentrador Amicon (Amicon, Beverly, MA, membrana YM10), e cromatografado numa Superose 12 (Pharmacia), em cromatografia líquida rápida de proteína (FPLC), em tampão NaPi 50 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,5 N com um caudal de 0,5 ml/min. Após 14 minutos de eluição, fracções de 0,5 ml foram recolhidas em tubos de micrccentrífuga siliconizados contendo 5 μΐ de Tween 20 a 0,4%. Alíquotas de cada fracção foram analisadas quanto à actividade de GDNF. A Figura 2 apresenta esta cromatografia com o perfil de proteína traçado a D.O₂₈₀ e com a actividade de GDNF padrão sobreposta. Recuperou-se 85% da actividade de GDNF aplicada na coluna nas fracções #12-15.

Passo 3. RP-HPLC: A fracção #14 anterior foi acidificada com 10 μΐ de ácido trifluoroacético (TFA) a 25%. Metade do material acidificado foi carregado numa coluna Aquapore RP-300 C-8 de HPLC de fase inversa de pequeno diâmetro (coluna Brownlee, Applied Biosystems , San Jose, CA), 2,1 x 220 mm, e eluído com .um gradiente d?. h₂°/-TFA η . ί : 80% .acetonitrilo/TFA 0,085%. As fracções contendo proteína foram recolhidas manualmente em tubos de microcentrífuga siliconizados, com base na absorção UV a 214 nm. Alíquotas de cada fracção foram analisadas quanto à actividade de GDNF. A figura 3 apresenta esta cromatografia com o perfil de proteína traçado à D.O.₂j₄ e com padrão de actividade no painel inferior. As fracções 5 e 6 continham cerca de 90% de actividade recuperada em RP-HPLC, enquanto que a fracção 7 representava os restantes 10% de actividade. A Figura 4 apresenta um ensaio em gel SDS-PAGE corada com prata, das fracções à volta do pico de actividade de GDNF da Figura 3.

Passo 4. SDS-PAGE Preparativa: As fracções 5 e 6 contendo o

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pico de actividade de GDNF foram combinadas e concentradas em 20 μΐ, na presença de 10 μΐ de Tween 20 a 4% numa centrífuga de vácuo. Foi adicionado à amostra 1 μΐ de Tris base 1 M e 5 μΐ de

Tris-HCl 0,2M, pH 6,8, contendo 40% de glicerol e 5% de SDS, e esta foi aplicada numa SDS-PAGE a 15% não redutora (Laemmli 1970 Nature 227:680-684)(placa de 0,0075 x 14 x 11,5 cm, pente de 20 poços, 0,0075 x 0,4 x 2,8 cm/poço de amostra). A electroforese foi conduzida a 10°C a 40 mA/gel durante 2 horas. A tira do gel foi cortada em pedaços de 1,14 mm. Cada pedaço foi cortado em 2 pequenos pedaços e eluídos com 3 mudanças sequenciais de 25 μΐ de tampão NaPi 5 mM, pH 6,7 contendo Tween 20 a 0,01%, por um período de 20 horas com agitação contínua a 4’C . As 3 alíquotas do material eluído foram combinadas, ensaiadas para a actividade de GDNF (Figura 5), e o eluído com maior actividade (do pedaço do gel #16-23 correspondente a 30-42 kD na Figura 5) foi combinado. Uma tira de gel em branco (no topo do qual foi apenas aplicado tampão de amostra de SDS-PAGE antes da electroforese) foi processada de modo semelhante para controlo.

Passo 5. RP-HPLC: O eluente combinado do gel foi concentrado para cerca de 150 μΐ num concentrador de vácuo, acidificado com 20 μΐ de TFA a 25%, e ensaiada em RP-HPLC como descrito no passo 3. As fracções contendo proteína foram recolhidas manualmente em tubos de microcentrífuga •si 1iconizados, com base na ^D-°214 ^e ensaiadas quanto à actividade de GDNF. A Figura 6 mostra os resultados de tal cromatografia. Como controlo, o eluente de pedaços de gel em branco de dimensão semelhante, foi também ensaiado em HPLC. O único pico significativo à D.O₂i4 na amostra contra o perfil do controlo (Figura 6, painel A versus B), é o pico 3, que contém 70% da actividade de GDNF aplicada na coluna de HPLC.

A Figura 7 apresenta o pico 3 ensaiado numa SDS-PAGE corada com prata. A única mancha visível é uma banda muito larga entre os 30-42 kD, coincidente com o perfil de actividade de GDNF observado na SDS-PAGE preparativa (Figura 5). O sumário de uma purificação típica é apresentada na Tabela 1.

-48D. Sequência de aminoácidos do GDNF purificado.

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Sequência do terminal amino: O pico 3 da Figura 6 foi sequenciado com um sequenciador de proteína de fase gasosa (Applied Biosystems). A sequência obtida é apresentada na Figura

8. A sequenciação de fracções com o pico de actividade de GDNF após o passo 3 da purificação (fracções 5 e 6 da Fig. 3), revelaram também uma única sequência, idêntica àquela da Figura 8, obtida com a amostra purificada. 0 único material que estas amostras diferentes têm em comum é o material que migra como uma mancha entre 30-42 kDa. Desta forma, as bandas contaminantes fora da região 30-42 kD visível no gel corado ccm prata, das fracções 5 e 6 da figura 4 podem a) ser em muito pequena quantidade (<1 picomole) para serem sequenciadas pela tecnologia corrente; b) estarem relacionadas com a banda de 30-42 kD em sequência; ou c) terem uma extremidade amino bloqueada.

Sequência interna: A preparação de GDNF após o passo 3 da purificação anteriormente descrita foi utilizada como material de partida para obtenção da sequência interna. As fracções 5 e 6 da Figura 3 foram combinadas num tubo de microcentrífuga siliconizado, contendo 9 μΐ de Tween a 0,4%, e concentradas num concentrador de vácuo até 40 μΐ. Foram adicionados à amostra 160 μΐ de NH₄HCO₃ a 1% contendo hidrocloreto de guanidina 2,5 M e 1 .de. tripsina, e estas foram, incubadas durante a noite a 37’C. A mistura foi acidificada com 20 μΐ de TFA a 25%, concentrada a cerca de 150 μΐ num concentrador de vácuo, e os péptidos foram separados numa coluna de HPLC de fase inversa, Aquapore RP-300 C8 de pequeno diâmetro (coluna Brownlee), 2,1 x 220 mm, e eluída com gradiente de H₂O/0,l% TFA:80% acetonitrilo/0,085% TFA. As fracções contendo os péptidos foram recolhidas manualmente em tubos de microcentrífuga siliconizados, com base na absorção a 214 nm. A Figura 9 apresenta os resultados desta cromatografia. Verificou-se que a sequência do pico 10 da Figura 9 era idêntica aos primeiros 13 resíduos de aminoácidos da sequência da extremidade amino da proteína não tratada, apresentada na Figura 8 (SEQ ID N0:l). O pico 37 da Figura 9 foi posteriormente tratado com CNBr. A amostra foi concentrada até 20 μΐ numa

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SYN225/PO centrífuga de vácuo. Foram adicionados à amostra 70 μΐ de ácido fórmico a 90% e 5 mg de CNBr, e a amostra foi incubada no escuro, à temperatura ambiente durante a noite. Esta mistura foi concentrada a 20 μΐ numa centrífuga de vácuo, diluída com 100 μΐ de 0,1% de TFA e separada por HPLC de fase inversa como descrito acima. A Figura 10 apresenta os resultados dessa cromatografia. O pico 1 da Figura 10 foi concentrado a 20 μΐ na presença de 5μ1 de Tween 20 0,4% numa centrífuga de vácuo. Adicionou-se à amostra 100 μΐ de NH₄HCO₃ a 1% e 5 μΐ de ditiotrietol 50 mM e a amostra foi incubada à temperatura ambiente durante uma hora. A mistura foi acidificada com 10 . μΐ de 25% de TFA, concentrado em 100 μΐ numa centrífuga de vácuo e separado em HPLC de fase inversa como anteriormente. A Figura 11 apresenta os resultados desta cromatografia. Ambos os picos 33 e 34 da Figura 11 apresentam uma sequência idêntica (Figura 12) (SEQ ID NO:2).

E. Características do GDNF.

Mobilidade em SDS-PAGE: Sem qualguer tratamento térmico da amostra e sob condições não redutoras, o GDNF migra como uma banda em mancha, entre 31-42 kD em SDS-PAGE. Quando a amostra é aquecida a 100°C durante 3 minutos na presença de um agente redutor (/3-mercaptoetanol a 4%), o GDNF migra em bandas múltiplas discretas, entre 20-23 kD. Uma vez que cerca de 50% da bioactividade aplicada no gel pode ser recuperada sob as condições precedentes (não redutoras) e não com as últimas (redutoras), o GDNF pode ser um dímero ligado por pontes dissulfureto e apenas activo como dímero. Embora um único terminal amino sugira que a preparação de GDNF é homogénea no que diz respeito à estrutura primária do núcleo, a mancha ou o padrão de bandas múltiplas é sugestivo de uma proteína heterogeneamente glicosada.

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Actividade específica:

O GDNF purificado possuía uma actividade especifica estimada de cerca de 17 unidades tróficas/ng, o que indica que a metade da estimulação máxima da incorporação de dopamina ocorre a concentrações relativamente baixas de aproximadamente 60 pg/ml. A actividade específica medida para o GDNF purificado pode ser subestimada de alguma forma devido à inactivação parcial do GDNF durante a purificação, por exposição aos solventes orgânicos acidificados utilizados na RP-HPLC e às condições desnaturantes em SDS-PAGE.

Especificidade do GDNF: o GDNF foi purificado pela sua capacidade de aumentar a incorporação de dopamina nos neurónios de dopamina (Figura 20A). Para determinar se o GDNF também sobre-regulava outros índices de sobrevivência e/ou maturação dos neurónios dopaminérgicos, a imunorreactividade da tirosina-hidroxilase (TH) foi também medida nas culturas mesencefálicas. A TH é um marcador específico dos neurónios dopaminérgicos nas culturas. A sobreregulação da imunorreactividade pelo GDNF pode ser devida ao aumento na produção de TH pelos neurónios de dopaminérgicos e/ou um aumento na produção de TH pelos neurónios dopaminérgicos. O GDNF purificado foi adicionado no dia de plaqueamento e as culturas examinadas oito dias mais tarde resultaram num número dez vezes maior de neurónios TH⁺ sobre os controlos sem GDNF. Se uma segunda-dose de GDNF fosse adicionada no dia 9 e as culturas examinadas sete dias depois (16 dias in vitro). verificar-se-ia ainda um aumento semelhante dependente da dose sobre o controlo (Fig. 20B). Assim, o GDNF pode sustentar a sobrevivência dos neurónios dopaminérgicos e/ou aumentar a expressão do gene TH em neurónios dopaminérgicos mesencefálicos.

Para demonstrar que o GDNF exerce um efeito de estimulação específico na maturação e/ou sobrevivência dos neurónios dopaminérgicos e não uma acção geral em todos os neurónios, foi analisada a resposta ao GDNF de neurónios que contêm ácido / -aminobutírico (GABA), que está também presente nas culturas mesencefálicas. A incorporação de ³H-dopamina (³H-DA) e ¹⁴CGABA foi medida em culturas irmãs de células mesencefálicas que >ΐ·*^;

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foram cultivadas com várias concentrações de GDNF durante 15 e 16 dias, respectivamente. Como acima descrito, o GDNF aumentou a capacidade de incorporação de ³H-DA dos neurónios dopaminérgicos mesencefálicos aproximadamente 150% acima do controlo sem GDNF (Fig. 21A). No entanto, o GDNF não teve efeito significativo na capacidade de incorporação de ¹⁴C-GABA dos neurónios de GABA, uma vez que a incorporação de 3-⁴C-GABA na presença de GDNF era apenas aproximadamente 20% superior à do controlo (Fig. 21B). Isto é também ilustrado pelo aumento da razão de incorporação ³H-DA/¹⁴C-GABA calculado (Fig. 21C). Estes dados indicam que os neurónios mesencefálicos dopaminérgicos e de GABA respondem diferentemente à presença de GDNF e o efeito de estimulação de GDNF na incorporação de ³H-DA nas culturas mesencefálicas é específico para os neurónios dopaminérgicos, como contrastado com os neurónios de GABA.

Estas observações esclarecem porque razão o GDNF pode ser utilizado para tratar a doença de Parkinson ou outras desordens envolvendo os neurónios dopaminérgicos. Estes resultados demonstram que o GDNF sobre-regula pelo menos duas propriedades importantes dos neurónios dopaminérgicos: a incorporação de dopamina e os níveis da enzima TH. Estes resultados demonstram também que os efeitos do GDNF são, pelo menos em parte, específicos para os neurónios dopaminérgicos, uma vez que os neurónios de GABA não afectados da mesma maneira.

Em adição aos neurónios dopaminérgicos e GABAérgicos, existe uma outra população neuronal, os neurónios serotonérgicos, nas culturas de mesencéfalo de embrião de ratazana. Alguns factores, como o factor de crescimento epidérmico (EFG) que aumenta a incorporação de dopamina pelos neurónios dopaminérgicos em culturas mesencefálicas, aumentam também a incorporação de serotoniana pelos neurónios serotonérgicos, e a incorporação de GABA pelos neurónios GABAérgicos. Ver Casper et al. 1991 J. Neurosci. 30:372. Isto insdica que estes factores não são específicos para os neurónios dopaminérgicos.

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Em contraste, ο GDNF não consegue aumentar a incorporação de serotonina pelos neurónios serotonérgicos. A incorporação de ³H-serotonina foi medida da mesma forma que a incorporação de ³H-DA, como decrito no Exemplo 1B, com a excepção de que o tampão de incorporação continha ³H-serotonina 50 nM (11 Ci/mole, Amersham, Arlington Heights, IL) em vez de ³H-DA. Na presença de citalpram 10 μΜ (obtido do Dr. C. Mytilineou, Mount Sinai School of Medicine), um conhecido potente inibidor da incorporação de serotonina nos neurónios de serotonérgicos, a incorporação de ³H-serotonina foi reduzida em 15%. Os valores do controlo na presença de citalpram foram subtraídos dos valores experimentais apresentados na Figura 24.

Em contraste com factores não específicos como o EGF, o GDNF não consegue aumentar a incorporação de GABA (Figura 21) e a incorpotração de serotonina (Figura 24) em condições em que a incorporação de dopamina é significativamente aumentada. Estes e os resultados acima descritos indicam que o GDNF é específico para os neurónios dopaminérgicos em culturas mesencefálicas, quando comparado com os neurónios GABAérgicos e serotonérgicos presentes nas mesmas culturas. Esta especificidade aumenta a utilidade de GDNF para o tratamento da doença de Parkinson, que é considerada uma doença especifica dos neurónios dopaminérgicos mesencefálicos (da substância negra).

Exemplo 2. Clonagem do gene para o GDNF.

A. Clonagem de uma cópia de ADNc do gene de ratazana que codifica o GDNF.

De modo a clonar o gene que codifica o GDNF, foi construída uma biblioteca de ADNc a partir de ARN poli A+ isolado de células B49, e esta biblioteca foi pesquisada com uma sonda oligonucleotídica degenerada, com base na sequência de aminoácidos obtida do GDNF purificado. Determinou-se por sequenciação de clone de ADN, um clone de ADNc que hibridou com esta sonda, que continha sequências de ADN localizadas em 3' em relação às sequências utilizadas na sonda oligonucleotídica degenerada, que codifica uma sequência de aminoácidos presente no GDNF e localizada na extremidade carboxilo da sequência de aminoácidos na qual se baseou a sonda de oligonucleótidos com

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-53que a pesquisa foi efectuada.

As condições de cultura para a linha celular B49 estão descritas em detalhe no Exemplo 1 acima. Para a preparação de ARN, as células foram cultivadas até próximo da confluência em meio contendo soro, lavadas uma vez em meio isento de soro (DMEM) e cultivadas durante 4 dias em DMEM, com uma muda de meio a cada dois dias. As células foram então colhidas e o ARN total extraído pelo método de Chomczynski e Sacchi 1987 Analvtical Biochemistrv 162:156-159. O ARN poliadenilado foi preparado a partir deste ARN total por passagem através de uma coluna de afinidade de oligo dT-celulose, como descrito em Maniatis et al. 1989 Molecular cloninq. 2^a Ed., CSH Press.

A síntese de ADNc foi efectuada utilizando a transcriptase inversa M-MLV RNaseH (Bethesda Research Lab, Gaithersburg, MD) de acordo com os protocolos descritos pelo vendedor. A reacção da primeira cadeia foi iniciada com um oligonucleótido iniciador dTjg (Pharmacia), incluindo também 8 unidades de RNasin (Promega, Madison, WI) por 5 μ<^ de ARN poli A+. A síntese da segunda cadeia foi dirigida pela ADN polimerase I de E. coli, RNaseH de E. coli e ADN ligase de E. coli (todas da BRL), de acordo com o protocolo do vendedor. Para facilitar a clonagem, o ADNc foi tratado com ADN polimerase de T4 (BRL) para produzir ’ ; .. . ,-xtre.m.i dade.s preenchidas e metiladas com a metilase de EcoRI (BRL). Estes passos foram efectuados de acordo com os protocolos fornecidos pelo vendedor da enzima. O ADNc foi então extractado duas vezes com um volume de uma mistura de 1:1 de fenol e clorofórmio e a fracção aquosa foi precipitada com 1/2 do volume de NH₄Ac 7,5 M e 3 volumes de etanol à temperatura ambiente. O precipitado foi recuperado por centrifugação durante 15 minutos à temperatura ambiente, a 16 OOOx g, lavado com etanol a 70%, seco em vácuo e ressuspenso em 50 μΐ de Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MgCl₂ 10 mM, ATP 1 mM, DTT lmM, 5% de PEG 8000, contendo 500 picomole de ligador fosforilado (CCCGAATTCGGG, Pharmacia) (SEQ ID N0:9) e 3 unidades de ADN ligase de T4 (BRL). A ligação do ligador foi efectuada a 16 °C durante a noite (« 16 horas). A mistura de reacção foi extractada com

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fenol/clorofórmio e precipitada como acima. O precipitado lavado foi seco e ressuspenso em 50 μΐ de tampão de digestão EcoRI (Tris-HCl 100 mM (pH 7,5), MgCl₂ 5 mM, NaCl 50 mM e Triton X-100 a 0,025%), a que foram adicionadoas 400 unidades de EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA). A reacção foi incubada a 37C durante 2 horas. Após precipitação (como em cima), o precipitado foi ressuspenso em tampão de digestão EcoRI e foi efectuada uma segunda digestão com EcoRI. como acima descrito. Esta reacção foi precipitada e ressuspensa em 40 μΐ de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 100 mM. Este ADNc que agora continha ligadores digeridos com EcoRI. foi fraccionado por tamanhos por centrifugação através de uma coluna de centrifugação de Sephacryl S-300 (Pharmacia) cerca de 1100 g durante 5 minutos. O eluido desta coluna foi recolhido, precipitado com etanol como acima, e ressuspenso em Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM a uma concentração de cerca de 0,1 Mg/μΐ.

Foi construída uma biblioteca de ADNc no vector de clonagem XZapII (Stratagene, La Jolla, CA). Tipicamente, 1 pg de braços do vector tratados com fosfatase e digeridos com EcoRI (obtidos da Stratagene), foram ligados a 0,1 μg de ADNc com ligadores EcoRI. em 5 μΐ de ligação utilizando cerca de 3 unidades Weiss de ADN ligase de T4 (NEB) em Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MgCl₂ 7 mM, DTT 1 mM, 5% de PEG 8000 e ATP 1 mM. As ligações foram efectuadas a 16’C durante a noite. As ligações foram embaladas em extractos de embalagem Gigaoackll Gold (obtidos da Stratagene) de acordo com o protocolo fornecido pelo vendedor. As bibliotecas foram plaqueadas para titulação e seleccionadas no hospedeiro XLl-Blue fornecido pela Stratagene.

A partir de uma única ligação e embalagem, cerca de 270 000 unidades de placas fágicas formadas foram plaqueadas em 12 placas de Petri de 150 mm de diâmetro. Foram preparados a partir destas placas, duplicados em filtros de nitrocelulose, segundo os procedimentos descritos por Maniatis et al. Os filtros foram hibridados com a seguinte sonda oligonucleotídica degenerada, marcada com ³²P, (SEQ ID NO:7) (I=inosina):

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-555' > CCIGATAAACAAGCIGCIGC > 3'

CGG

Esta sequência baseia-se na sequência de aminoácidos (Figura 8) (SEQ ID NO:1) obtida do terminal amino de GDNF purificado (SEQ ID NO:10) como descrito no Exemplo 1 acima: Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala oligonucleótido foi marcado com ³²P derivado de ³²P-ATP (Amersham, Arlington Heights, IL) utilizando a polinucleótido-quinase de T4 (Pharmacia ou United States Biochemical, Cleveland, OH). As reacções de hibridação foram efectuadas em 6X SSPE, SDS a 0,1%, ARNt 0,1 mg/ml (SIGMA; St. Louis, MO), e 2X reagente de Denhart's (0,4 mg/ml de cada: ficol, polivinilpirrolidina, fracção V da BSA), a 50°C durante a noite (cerca de 16 horas). A solução de hibridação continha 2-3 x 10⁶ cpm de oligonucleótido marcado por ml de solução. Após a hibridação, os filtros foram lavados duas vezes à temperatura ambiente em 2X SSPE, SDS a 0,1% e duas vezes na mesma solução pré-aquecida a 50°C. Os filtros foram secos ao ar e expostos a um filme durante 7 dias a -70°C utilizando écrans de intensificação.

Os filmes revelados foram examinados para identificar as

- placas-qu~ ..hibri daram com o oligonucleótido de pesquisa. Nesta primeira pesquisa, foram identificados 24 positivos putativos em duplicado. As áreas das placas da biblioteca correspondentes aos sinais positivos foram excisadas, ressuspensas e replaqueadas para uma segunda pesquisa através do procedimento de hibridação acima descrito. Nesta segunda pesquisa, 8 dos 24 originais apresentaram sinal positivo, enquanto 16 apresentaram sinal negativo. Estes oito positivos foram purificados das placas através de 1 ou 2 hibridações adicionais, e seis destes foram subsequentemente analisados por sequenciação de ADN para determinar se continham sequências de ADN que pudessem codificar para o GDNF.

A porção fagemidica do fago ÃZapII, que contém as

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SYN225/PO inserções clonadas, é referida como pBluescript SK-. 0 fagemídeo pBluescript SK- foi excisado de cada um dos recombinantes AZapII que hibridaram com a sonda oligonucleotídica. O procedimento para a excisão in vivo do plasmideo pBluescript SKdo vector X ZapII é apresentado em detalhe nos protocolos do vendedor. Resumidamente, a co-infecção de ÀZapII e um fago auxiliar M13, resulta na embalagem de uma cópia de ADN de cadeia simples do recombinante pBluescript dentro de um virião infeccioso M13. Quando tal virião infecta uma célula sensível, o ADN de cadeia simples é convertido num ADN de cadeia dupla, e é propagado verticalmente como um plasmideo. A selecção deste acontecimento é proporcionada pelo gene de resistência à ampicilina codificado pelo pBluescript SK-. Assim, os derivados da E . coli XLl-Blue contendo o plasmideo recombinante pBluescript SK- salvo de cada um dos oito clones /ZapII positivos, foram fácilmente obtidos seguindo os protocolos descritos pela Stratagene e utilizando o fago auxiliar fornecido com o vector AZapII.

Para a sequenciação de ADN, foi preparado ADN plasmídico de cadeia dupla destes seis plasmídeos recombinantes por um procedimento de mini-preparação baseado em Birnboim e Doily 1979 NAR 7:1513-1523. As reacções de sequenciação do ADN, utilizando o processo de terminação de cadeia dideoxi, foram efectuadas utilizando estes, moldes e o oliqonucleótido de pesquisa como iniciador. Os reagentes para a sequenciação foram obtidos da United States Biochemicals como um conjunto (Sequenase versão 2,0) e os procedimentos de sequenciação foram efectuados de acordo com os protocolos fornecidos pelo vendedor. Um clone, o pBluescript SK-76.1, derivado do clone XZapII76.1 apresentou a seguinte sequência (SEQ ID NO:11):

5' > GAG AGG AAC CGG CAA GCT GCA GCT GCC AGC CCA > 3'

T AA TA TA T

Esta sequência pode ser traduzida para apresentar a seguinte sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:12):

Glu-Arg-Asn-Arg-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-Ser-Pro

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que coincide com a sequência de aminoácidos determinada para uma região da extremidade amino do GDNF, começando a 5 resíduos de aminoácido do terminal carboxílico até ao final da sequência de aminoácidos utilizada para produzir o oligonucleótido sonda e iniciador da sequenciação. Este resultado demonstrou que o clone de ADNc contido no AZapII76.1 deve codificar uma porção, ou toda a proteína GDNF purificada do meio condicionado das células B49 .

B. Sequência Nucleotídica da Região do Clone de ADNc AZapII que Inclui a Sequência que Codifica o GDNF.

A sequência nucleotídica dos primeiros 877 pares de bases da extremidade 5' do clone de ADNc foi determinada. Verificou-se que esta região contém uma estrutura de leitura aberta (ORF) de 227 aminoácidos que inclui a sequência de aminoácidos para a extremidade amino do GDNF purificado, e uma sequência que é consistente com o péptido interno derivado por clivagem do GDNF purificado. Os 134 aminoácidos do terminal carboxilo previstos para esta ORF compreendem a sequência de aminoácidos prevista para a proteína GDNF madura purificada. Os 93 aminoácidos precedentes, incluem um potencial codão de iniciação ATG, seguido de uma sequência sinal de secreção putativa, e contém potenciais sítios de processamento proteolítico para clivagem de uma forma precursora ou pre-pro da proteína, para produzir a forma-madura purificada do GDNF acima descrita no Exemplo 1.

O ADN molde para as reacções de sequenciação, inclui as versões de cadeia simples e cadeia dupla do ADN plasmídico pBluescript SK-76.1. O ADN de cadeia dupla, foi preparado a partir de culturas de XLl-Blue (pBluescript SK-76.1) por um processo de preparação por fervura (Anal. Biochem. 114:193-97) e separado numa banda por gradiente de densidade de CsCl. O molde de cadeia simples foi produzido por infecção de XLl-Blue (pBluescript SK-76.1) com um fago auxiliar M13, fornecido pelo vendedor (Stratagene), utilizando os protocolos relevantes fornecidos com o fago. Foram sintetizados num sintetizador de ADN da Applied Biosystems modelo 380A (Foster City, CA), oligonuleótidos iniciadores de cadeia simples de 15 a 23

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nucleótidos de comprimento, utilizados geralmente sem purificação. A determinação da sequência foi efectuada utilizando o processo de terminação de cadeia didesoxi. Os reagentes utilizados estavam incluídos no conjunto da Sequenase versão 2.0 (United States Biochemical) e utilizados de acordo com os protocolos fornecidos pelo vendedor.

A sequência nucleotídica dos primeiros 877 nucleótidos da extremidade 5' do clone de ADNc AZapII76.1, que contém a sequência que codifica a proteína GDNF madura está apresentada na Figura 13 (SEQ ID NO:3) em conjunto com a sequência de aminoácidos inferida de uma estrutura de leitura aberta (ORF) de 681 pares de bases, que se encontra nesta sequência. A sequência correspondente ao GDNF maduro purificado, começa na posição 281 com um resíduo de serina, e é apresentado na Figura 14 (SEQ ID NO:4). A sequência de ADN obtida desta região prevê uma sequência de aminoácidos que concorda perfeitamente com os primeiros 23 resíduos da sequência de aminoácidos observada na extremidade amino do GDNF purificado (ver exemplo 1).

Com base numa análise do gene como apresentado na Figura 13 é provável que o GDNF seja inicialmente traduzido como um polipéptido GDNF pre-pro e que o processamento proteolítico da sequência sinal e a porção pro desta molécula resultem na produção da forma de GDNF que é purificada do meio condicionado das células B49. O sítio mais provável de iniciação de tradução para esta forma pre-pro, é o codão ATG que ocorre na posição 50 na sequência da figura 13 (SEQ ID NO:3).

C. Clonaqem do Gene Humano que Codifica o GDNF.

As sequências de aminoácidos de muitos factores neurotróficos são altamente conservadas entre uma variedade de espécies de mamíferos (HallbOOk et al. 1991 Neuron 6:845-858;

McDonald et al. 1991 BBA (em publicação)). Como consequência da conservação das sequências de aminoácidos, existe uma conservação considerável das sequências de nucleótidos dos genes que codificam estas proteínas. Deste modo, é geralmente verdade

-5974 374

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que o gene que codifica um factor neurotrófico numa espécie mamífera pode apresentar hibridação cruzada (isto é, forma um híbrido de ADN de cadeia dupla estável) com os genes que codificam esse factor em outras espécies de mamíferos sob condições de hibridação apropriadas. Esta propriedade foi utilizada para identificar segmentos de ADN humano clonado que incluem o gene do GDNF.

Uma biblioteca genómica humana construída no vector /FiXII foi adquirida à Stratagene (#946203 do catálogo), pesquisada com uma sonda marcada com ³²P derivada do clone de ADNc de ratazana de GDNF (pBluescript SK-76.1) descrito acima no Exemplo 2B. A sonda consistiu em cerca de 250 bases da sequência codificante do GDNF maduro por amplificação específica utilizando a reacção em cadeia de polimerase (Saiki et al. 1985 Science 230:1350), e foi produzido como se segue. Foi efectuada uma reacção de PCR de 50 ou 100 μΐ utilizando <1 ng de ADN de AZapII76.1 como molde e 10-20 pmol de cada um dos dois oligonucleótidos iniciadores baseados na sequência de GDNF de ratazana. Um oligonucleótido era o oligo de pesquisa (também denominado DHD-21) descrito no Exemplo 2A acima, enquanto o segundo oligonucleótido (DHD-26) (SEQ ID NO:13) tinha a sequência:

5' > AAATTTTTIAAIATTTTATC >3' GG C G C G que se baseia na sequência de aminoácidos (Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu) (SEQ ID NO:14) obtida de um pêptido interno produto da clivagem de GDNF (ver Exemplo 1). À reacção foi efectuada em Tris-HCl 10 mM (pH 8,3 a 25’C), KC1 50 mM, MgCl₂ 1,5 mM, BSA 10 pg/ml (Promega R3961), dNTP 2mM cada (Pharmacia), utilizando 2,5-5 U de polimerase (USB). A reacção consistiu em 30 ciclos: 95’C durante 1 minuto, 44°C durante 1 1/2 minutos e 72°C durante 1 1/2 minutos. Foi observado por electroforese em gel de agarose que o produto da reacção possuía cerca de 250 bp o que é consistente com as posições dos dois iniciadores na sequência de ADNc apresentada na Figura 13. Este fragmento não marcado foi eluído do gel por centrifugação com uma unidade de filtração

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Ultrafree-MC (Millipore, Bedford, MA) de acordo com o protocolo do vendedor, e utilizado como molde nas reacções de marcação por PCR subsequentes, utilizando os mesmos dois oligonucleótidos iniciadores. Estas reacções foram efectuadas sob condições idênticas, excepto que a concentração de dCTP frio foi reduzida para 12,5 μΜ, e foi adicionado à reacção ³²P-dCTP 2,5 μΜ 30005000 Ci/mmol (Amersham). Os produtos da reacção de marcação foram passados por uma coluna BioSpin 6 (Biorad, Richmond, CA). O eluido desta coluna foi utilizado como sonda para pesquisar a biblioteca genómica humana.

A biblioteca foi plaqueada utilizando a estirpe PLK17 de E. coli fornecida pela Stratagene. Foram preparadas 24 placas de petri de 150 mm, contendo cada uma aproximadamente 50 000 placas. Foram preparadas folhas de filtros de nitrocelulose em duplicado de cada placa de acordo com os procedimentos descritos por Maniatis et al.supra. Estes 48 filtros foram pesquisados com 250 x 10⁶ cpm da sonda do PCR (desnaturada pelo tratamento com NaOH 0,5N) acima descrita, em 250 ml de 6x SSPE, SDS 0,1%, 2x reagente de Denhardt, ARNt 0,1 mg/ml e formamida a 30 % (USB) a 42°C durante a noite (~16 horas). Os filtros foram então lavados duas vezes em 250 ml de 2x SSPE, 0,1 % de SDS à temperatura ambiente e duas vezes em 1,6 1 de 0,lx SSPE, SDS 0,1% préaquecido a 50’C. Os filtros foram deixados a secar ao ar, à f -temperatura ambiente, e colocados sob o filme durante 6 dias a -70’C com écrans de intensificação. Os filmes foram revelados e contados. Foram observados seis positivos fortes em duplicado. As áreas das placas da biblioteca correspondentes aos sinais positivos foram excisadas, ressuspensas, e replaqueadas para uma segunda pesquisa através do procedimento de hibridação acima detalhado. Todos os seis apresentaram novo sinal positivo e foram purificados da placa através de plaqueamento e hibridação adicionais.

Para um perito na arte, subclonar e sequenciar o segmento de ADN à volta da região que hibrida com a sonda, é uma questão de operações de rotina, e assim determinar toda ou parte da sequência do gene humano para o GDNF. Se o gene completo do GDNF

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humano não está representado nestes clones, é também matéria de rotina andar” ao longo do genoma e clonar segmentos de ADN sobreponíveis à volta desta região, para obter e sequenciar qualquer restante porção do gene.

Os procedimentos acima mencionados, e uma variedade de outros que serão óbvios para um perito na arte, podem ser aplicados para pesquisar outras bibliotecas genómicas humanas. Por exemplo, utilizando a sonda acima descrita e o protocolo de hibridação, foi pesquisada uma biblioteca de ADNc humana que foi construída de ARN A+ extraído do putâmen humano. Esta biblioteca, contida no vector AgtlO, foi comprada à Clontech (Paio Alto, CA) (#HL1092a, Lote #1561 do católogo). Esta biblioteca foi plaqueada (cerca de 250 000 placas no total) em E. coli LE392 (Maniatis et al. supra) com uma densidade de cerca de 20 000 placas por placa, e pesquisadas por hibridação sob as condições acima descritas. Após hibridação, os filtros foram lavados duas vezes à temperatura ambiente em 0,2x SSPE, SDS 0,1% e duas vezes em 0,lx SSPE, SDS 0,1% pré-aquecido a 50°C. Os filtros foram secos ao ar e colocados sob o filme. Após 3 dias de exposição a 70C com écran de intensificação, os filmes foram revelados e foram identificados 8 positivos em duplicado.

Seis clones AfíxII de uma biblioteca genómica humana, foram identificados por hibridação com uma sonda .de GDNF.de ratazana e as placas purificadas até à homogeneidade (ver acima). Foram preparados lisados de cada fago pelo processo de Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 1989). O ADN foi preparado destes clones pelo seguinte procedimento: Foram adicionadas a 5 ml de cada cultura DNAasel (Pharmacia) e RNAase A (Sigma) para uma concentração final de 1 gg/ml. A solução foi incubada a 37 ° C durante 1 hora. Então, foram adicionados 5 ml de polietilenoglicol a 20% (Sigma), NaCl 2 M, e a solução foi incubada a 0°C durante 1 hora. Os fagos foram precipitados por centrifugação a 12 OOOx g durante 10 minutos. Os fagos precipitados foram ressuspensos em 250 μΐ de TE (Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM) e subsequentemente extractados com um igual volume de a. clorofórmio; b. fenol; c. uma mistura de 1:1

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de fenol:clorofórmio;

e d. clorofórmio.

Foi adicionado acetato de amónio para uma concentração final de 0,25 M e o ADN foi precipitado pela adição de 2 volumes de etanol e centrifugação a 10 OOOx g. 0 ADN precipitado foi ressuspendido em TE.

O ADN de cada um dos seis isolados /] foi digerido com várias endonucleases de restrição e os fragmentos separados por electroforese através de um gel de agarose (Sambrook et al.). Os fragmentos de ADN foram transferidos para duas membranas de nylon idênticas (Scleicher e Schuell) e hibridados com sondas de GDNF de ratazana marcadas radioactivamente. No GDNF de ratazana, existe um sítio EcoRI entre os nucleotidos 356 e 357 (seguindo a numeração da Figura 13). Isto cliva na sequência de codificação do GDNF maduro. Para determinar se os clones genómicos humanos de GDNF possuem um sítio na mesma posição, foi utilizada a EcoRI como uma das endonucleases de restrição para digerir os clones humanos. Sondas específicas marcadas radioactivamente foram produzidas para regiões do gene seja a montante (sonda 1) ou a jusante (sonda 2) do sítio EcoRI no GDNF de ratazana. A sonda 1 possuía 268 pb de comprimento e consistia em 14 pb da sequência 5' não traduzida de GDNF de ratazana e 254 pb de sequência de codificação (aminoâcidos 1 a 85). Foi preparado por amplificação de ADN de z\ZapII76.1, por reacção em cadeia de polimerase utilizando os oligonucleótidos iniciadores PD1 Λ . -(GACGGGACTCTAAGATG) . (SEQ . ID . N0:15) e DHD23 • (GCIGCIGC(C/T)TG(T/C)TT(A/G)TCIGG) (SEQ ID NO:16). As condições de reacção para preparação da sonda foram as descritas acima, excepto que a reacção consistiu em 30 ciclos de: 95°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 1/2 minutos e 72°C durante 1 1/2 minutos. A sonda 2 possuía 195 pb de comprimento e consistiu em 17 nucleotidos da sequência 3' não traduzida de GDNF de ratazana e 178 pb de sequência de codificação (aminoâcidos 153 a 211). Foi preparada utilizando a reacção em cadeia de polimerase e os oligonucleótidos iniciadores LF2 (CGAGACAATGTACGACA) (SEQ ID NO:17) e PD2 (CTCTGGAGCCAGGGTCA) (SEQ ID NO:18) e À ZapII76.1 como ADN molde. As condições de reacção foram as mesmas da sonda

1.

^{74 374}

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-63Cinco dos seis clones de A apresentaram padrões idênticos de hibridação. A sonda 1 hibridou com um fragmento EcoRI de aproximadamente 700 pb e a sonda 2 hibridou com um fragmento EcoRI de aproximadamente 2,8 Kb. O facto de as duas sondas hibridarem com dois fragmentos diferentes de ADN EcoRI, sugere fortemente que o gene humano para o GDNF contém um sítio EcoRI homólogo. Os fragmentos EcoRI de 700 pb e 1,8 Kb foram subclonados separadamente no Bluescript SK- (Stratagene). As sequências nucleotídicas destes dois fragmentos foram determinadas como descrito no Exemplo 2B. A sequência destes fragmentos de ADN é apresentada na Figura 19 (SEQ ID N0:5). Está claro a partir da sequência que existe um intrão a preceder o aminoácido 52 do GDNF pre-pro. Não existe nemhum intrão na porção do gene que codifica para o GDNF maduro de humano. A sequência de aminoácidos prevista para o GDNF maduro humano é 93% homóloga com o GDNF maduro de ratazana. Isto está aproximadamente no mesmo grau de homologia da sequência de aminoácidos encontrada entre as proteínas de ratazana e humano para outros factores neurotróficos (Homologia da sequência de aminoácidos entre CNTF de ratazana e humano é de 83%; McDonald et al. 1991 BBA (em publicação)). A homologia da sequência de aminoácidos entre NGF de ratazana e humano é de 95%, BDNF é 100%, e NT—3 é 100%; Hallbook et al. 1991 Neuron 6:845-855).

' · :Para obter a sequência completa do GDNF pre-pro humano, , pode ser construída uma sonda de hibridação marcada radioactivamente, com base na sequência do GDNF humano já obtida e utilizada na pesquisa de bibliotecas genómicas de ADNc humano. Porque os ADNc são cópias do ARNm processado, os intrões não estão presentes e a sequência da sequência de codificação completa pode ser obtida. Alternativamente, agora que a posição do intrão relativamente à sequência de codificação é conhecida, pode ser feita uma sonda de hibridação que é específica para sequências a montante do intrão, a partir do clone de ADNc de ratazana e esta sonda pode ser utilizada para pesquisar uma biblioteca genómica para clones que contenham os exão (e/ou exões) 5'.

-6474 374

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D. Sequência Nucleotídica Codificante dos Primeiros 50 Aminoâcidos do Pre-pro-GDNF Humano

Como detalhado no Exemplo 2C, existe um intrão que se separa na sequência nucleotídica correspondente ao aminoácido 51 do pre-pro-GDNF humano. De modo a obter a sequência desta porção da molécula, uma biblioteca genómica humana foi pesquisada com uma sonda derivada da sequência de codificação do terminal amino do pre-pro-GDNF de ratazana, e um clone de hibridação foi sequenciado e mostrou conter a sequência de codificação dos aminoâcidos 1 a 50 do pre-pro-GDNF humano como apresentado na Figura 22 (SEQ ID N0:8).

Para a pesquisa desta biblioteca, foi sintetizada uma sonda de PCR como descrito no Exemplo 2C. Os iniciadores oligonucleotídicos empregues foram:

PD1 = 5' > CCCGAATTCGACGGGACTCTAAGATG > 3' (SEQ ID NO:19)

LFA = 5' > CGGTGGCCGAGGGAGTGGTCTTC > 3' (SEQ ID NO:20)

As condições para as reacções de PCR (tanto as frias como as marcadas com ³²P) foram as descritas no Exemplo 2B, excepto que a reacção consistiu de 25 ou 30 ciclos de: 95’C durante 1 minuto, 50°C durante 1 1/2 minuto, e 72’C durante 1 minuto. O produto desta reacção contém os primeiros 122 pb da sequência de codificação de pre-pro-GDNF de ratazana e 14 pares de bases»5' em relação ao ATG iniciador putativo (ver Figura 13 e SEQ ID NO:3). As condições para a pesquisa da biblioteca genómica humana com esta sonda são as descritas no Exemplo 2C. As mesmas folhas de filtro utilizadas para identificar os clones portadores das sequências do GDNF maduro humano, foram lavadas duas vezes durante 15 minutos em àgua destilada desionizada aquecida até à fervura, sondadas durante a noite, e lavadas de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 2C. Os filtros foram expostos ao filme durante 3 dias a -70°C com écrans de intensificação. Foram observados numerosos positivos em duplicado de várias intensidades quando os filmes foram revelados. Doze positivos relativamente fortes foram seleccionados e 10 destes foram purificados da placa por

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-65sucessivas hibridações nas condições de pesquisa.

Os ADN clonados destes fagos recombinantes foram analisados por hibridação em transferência de Southern. Verificou-se que um fragmento Alui de aproximadamente 1000 pb hibridava com a sonda de pesquisa, e este foi subclonado em pBluescript SK- digerido com Smal para produzir pBSSK- /A3AluI. Este fragmento Alui clonado foi pósteriormente subclonado para facilitar a sequenciação do fragmento relevante de ADN. ADN de pBSSK-A3AluI purificado, foi digerido com uma série de enzimas de restrição que clivam o vector apenas uma vez (na região de poliligador) e os produtos de digestão foram analisados por electroforese em gel de agarose. Foram então identificadas duas enzimas de restrição (PstI e SaciI) que clivavam apenas uma vez o ADN clonado. A Figura 22 apresenta o mapa dos sítios SacII e PstI. As transferências de Southern revelaram que a região do segmento clonado que hibridava com a sonda de pesquisa se situava entre os sítios SacII e PstI do segmento Alui clonado. Desta forma, foram construídos dois derivados por delecção do pBSSK- /\3AluI, para seguenciação. Por um lado, o fragmento pequeno PstI, cerca de 300 pb, sofreu delecção como se segue: o plasmídeo foi digerido com PstI e o digerido foi ligado e transformado em E. coli. Os transformantes foram seleccionados por não possuírem o fragmento pequeno PstI. Em paralelo, o fragmento SacII de 300 pb ' sofreu - de)ecção de modo semelhante a partir dos pBSSK-^A 3Alui para produzir um segundo derivado com delecção. Estes dois plasmídeos que sofreram delecção foram utilizados como molde parà as reacções de sequenciação. A sequenciação foi efectuada como descrito no Exemplo 2B.

A Figura 22 (SEQ ID NO:8) apresenta 233 pares de bases da sequência assim obtida. Esta sequência contém uma região de 151 pb que exibe um grau de homologia muito elevado com os primeiros 151 pb da sequência de codificação do pre-pro-GDNF de ratazana; 88% de identidade ao nível dos aminoâcidos e 95% de identidade ao nível do ADN. Desta forma, foi concluído que esta região é parte de um exão que transporta a sequência de codificação dos

> ,.7 ·'

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SYN225/PO —67 — ^rísía y»

A. Administração de GDNF em macacos tratados com MPTP para produzir Parkinsonismo experimental. Uma cânula de aço inoxidável pode ser implantada no ventrículo lateral direito e ligada a uma mini bomba osmótica implantada subcutâneamente (Alzet 2002). A mini bomba contém GDNF a várias concentrações ou o seu diluente para controlo negativo. A bomba distribui 0,5 μΐ/h durante 14 dias. Dois dias após o implante bomba-cânula, os macacos (Cebus appella) recebem uma injecção de 0,6 mg/kg de MPTP na artéria carótida direita. Seis semanas após o implante inicial, os animais são submetidos a perfusão com solução salina e o cérebro é rápidamente removido. O cérebro é dissecado em gêlo e os pedaços de tecido foram removidos dc núcleo caudato e putâmen. A substância negra é colocada em fixador. O tecido caudado-putâmen é analisado por HPLC-EC para a dopamina, a substância nigra é processada para imunoreactividade da tirosina-hidroxilase (TH).

B. Eficácia do GDNF. A degeneração das células nervosas dopaminérgicas da substância negra e suas protuberâncias axonais /N ...

para o caudado/putamen causam Parkinsonismo experimental neste modelo de macaco. Existem várias indicações experimentais de que o GDNF pode prevenir ou reduzir a gravidade desta degeneração neuronal. Por exemplo, o GDNF pode prevenir a perda dos corpos celulares das células nervosas positivas para TH na substância negra . · Isto -indica· diminuição pelo GDNF, dos efeitos tóxicos do MPTP nas células nervosas dopaminérgicas da substância negra. 0 GDNF pode também prevenir a perda das fibras positivas a TH no caudado/putâmen. Isto indica diminuição pelo GDNF, dos efeitos tóxicos do MPTP nas protuberâncias axonais dos neurónios dopaminérgicos da substância negra. O GDNF pode também prevenir a perda no conteúdo de dopamina no caudado/putâmen. Isto indica a diminuição dos efeitos tóxicos do MPTP pelo GDNF, dos axónios e seu conteúdo de dopamina, extendendo-se dos neurónios dopaminérgicos da substância negra até ao caudado/putâmen.

Exemplo 4: Actividades Biológicas e Potenciais Indicações Clínicas para o GDNF.

GDNF purificado aumenta a incorporação de dopamina pelos

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neurónios dopaminérgicos presentes em culturas de células nervosas mesencefálicas embriónicas tanto em meio enriquecido como em meio de cultura definido, como apresentado no Exemplo 1. Isto indica que o GDNF é um factor neurotrófico para estas células nervosas dopaminérgicas. Como tal, o GDNF pode vir a ser útil no tratamento de degeneração destes neurónios que ocorre na doença de Parkinson. Adicionalmente, o GDNF pode vir a ser útil no tratamento de funcionamento impróprio de outros neurónios dopaminérgicos do cérebro. Tal funcionamento impróprio pode ocorrer na esquizofrenia e outras desordens que necessitam do tratamento com neurolépticos.

A. GDNF purificado promove a sobrevivência de células nervosas simpáticas e parassimpáticas em cultura:

1. Ensaio para a sobrevivência neuronal:

Materiais:

O brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difenil tetrazólio (MTT), foi obtido na Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. O soro de vitelo fetal foi comprado em Hyclone Laboratories, Logan, Utah. Os meios de cultura e soluções salinas foram obtidas em Irvine Cientific, Santa Ana, Califórnia. As placas de cultura foram obtidas de Costar, Cambridge, Massachussets. Os ovos férteis de embrião de pinto isentos de patogénios e de grau utilitário, foram obtidos em -Spafas, Roanoke, Illinois.

Ensaio

Culturas de gânglios ciliares de embrião primário de pinto e gânglios da cadeia simpática foram preparados como descrito anteriormente (Collins 1987 Develop. Biol. 65:50; Manthorpe et al. 1986 Develop. Brain Res. 25:191). Resumidamente, gânglios ciliares ou simpáticos foram removidos de ovos férteis de pinto isentos de patogénios, que tinham sido incubados durante 8 e 10 dias, respectivamente, a 38°C numa atmosfera húmida. Os gânglios foram quimicamente dissociados por exposição a, primeiro, Solução Salina Equilibrada de Hanks sem catiões divalentes, contendo tampão Hepes 10 mM (pH 7,2), durante 10 minutos a 37°C, e foram então expostos a uma solução de bactotripsina 0,125%

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1:250 (Difco, Detroit, Michigan) em Solução Salina Equilibrada de Hanks modificada como acima, durante 12 minutos a 37 °C. A tripsinação foi interrompida pela a adição de soro de vitelo fetal para uma concentração final de 10%.

Após este tratamento, os gânglios foram transferidos para uma solução consistindo de Meio Eagle Modificado de Dulbecco rico em glucose, sem bicarbonato, contendo soro de vitelo fetal a 10% e Hepes 10 mM, pH 7,2, e foram mecanicamente dissociados por trituração, aproximadamente 10 vezes, através de uma pipeta de Pasteur cuja abertura tinha sido polida à chama e constrangida até um diâmetro tal que demora 2 segundos a encher a pipeta.

Os gânglios dissociados foram então plaqueados em meio de cultura (Meio Eagle modificado de Dulbecco suplementado com, soro de vitelo fetal a 10%, glutamina 4 mM, penicilina G 60 mg/1, HEPES 25 mM, pH 7,2), em placas de cultura de tecidos com 100 mm de diâmetro (40 gânglios dissociados por placa) durante 3 horas. Este pré-plaqueamento foi efectuado de modo a separar as células não neuronais, que aderem à placa, das células nervosas, que não aderem. Após três horas, as células nervosas não aderentes foram recolhidas por centrifugação, ressuspensas em meio de cultura, e plaqueadas em 50 μΐ por poço em metade da área de uma placa-dc cultura de tecidos de microtitulação de 96 poços, a uma densidade de 1 500 células nervosas por poço. Os poços de microtitulação tinham sido préviamente expostos a 1 mg/ml de solução de poli-L-ornitina em borato de sódio 10 mM, pH

8,4, durante a noite a 4’C, lavados com água destilada e secos ao ar.

Foram adicionados a cada poço dez μΐ de uma diluição seriada da amostra a ser ensaiada para a actividade neurotrófica, e as placas foram incubadas durante 20 horas a 37“C numa atmosfera húmida contendo 7,5% de CO₂. Após 18 horas para os gânglios ciliares, e 40 horas para os gânglios simpáticos, foram adicionados 15 μΐ por poço de uma solução do corante tetrazólio MTT 1,5 mg/ml, no Meio Eagle Modificado de

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Dulbecco rico em glucose, sem bicarbonato e contendo

mM, pH 7,2, e as culturas foram colocadas num incubador a 37°C durante 4 horas. Então, foram adicionados 75 μΐ de uma solução

6,7 ml de HC1 12 M por litro de isopropanol, e o conteúdo de cada poço triturado 30 vezes para quebrar as células e ressuspender o corante. A absorvância a 570 nm foi determinada em relação a uma referência a 690 nm para cada poço, utilizando um leitor automático de placas de microtitulação (Dynatech, Chantilly, Virginia). A absorvância dos poços que não receberam qualquer agente neurotrófico (controlos negativos), foi subtraída da absorvância dos poços contendo as amostras. A absorvância resultante é proporcional ao número de células vivas em cada poço, definido como as células nervosas capazes de reduzirem o corante. O número de unidades tróficas de actividade neurotrófica foi definido como o recíproco da diluição que apresentou 50% da sobrevivência máxima das células nervosas. A actividade específica foi determinada por divisão do número de unidades tróficas pela quantidade de proteína presente na amostra.

Resultados

Como ilustrado na Figura 15, o GDNF purificado promove a sobrevivência em cultura das células nervosas parassimpáticas de gânglios ciliares do embrião de pinto. Como ilustrado na Figura Ί6-, o GDNF purificado promove também a sobrevivência em cultura das células nervosas simpáticas dos gânglios da cadeia simpática de embrião de pinto.

Estes resultados indicam que o GDNF actua como um factor de sobrevivência para os neurónios simpáticos e parassimpáticos. Como tal, pode ser útil no tratamento de várias formas de lesão de nervos do sistema nervoso autónomo (isto é, simpático e parassimpático). Tais lesões podem ocorrer de condições metabólicas, como a diabetes ou disfunção renal. Tais lesões podem também ocorrer do tratamento de pacientes com vários agentes quimioterapêuticos, como os agentes quimioterapêuticos do cancro, cisplatina e vicristina, ou agentes terapêuticos da SIDA, ddl e ddC. Tais lesões podem também ocorrer de condições

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genéticas, como a disautonomia. Tais lesões podem também ocorrer por lesão traumática.

Exemplo 5: Expressão de GDNF Recombinante em Células Animais

A. Construção de plasmídeos recombinantes para expressão em células COS.

Um fragmento Smal de aproximadamente 1,5 kb do pBluescript SK-76.1 que contém a sequência completa de codificação do GDNF, foi subclonado no vector plasmidico pSG5 (Green et al. 1988 Nucl. Acid. Res. 16:369) que é concebido para expressão transitória de genes clonados em células que expressam o antigénio SV40 T, tal como as células COS.

A sequência de ADN do ADNc de GDNF (Figura 13) (SEQ ID NO: 3 ) e o mapeamento por endonucleases de restrição, identificaram um fragmento Smal delineado por um sítio Smal localizado no poliligador do vector (18 pb 5' à extremidade 5' do ADNc do clone) e um sítio Smal (~1 500 pb de distância) localizado no ADNc do clone, aproximadamente 800 pb 3' à extremidade da sequência de codificação para o GDNF maduro. Este fragmento Smal foi clonado no pSG5 como se segue. ADN purificado do plasmídeo pSG5 (Stratagene) foi digerido com EcoRI e tratado com fosfatase alcalina de intestino de vitela (CIAP) (Promega) de·acordo com o protocolo do vendedor. Subsequentemente, o vector foi sujeito a electroforese e eluído de um gel de agarose. O ADN purificado de plasmídeo pBluescript SK-76.1 foi metilado com metilase EcoRI. digerido com Smal e ligado com a molécula ligadora EcoRI descrita no Exemplo 2A. Após a digestão com EcoRI e electroforese em gel de agarose, o fragmento de aproximadamente 1,5 kb de interesse (agora EcoRI metilado e ligado), foi eluído e ligado ao vector pSG5 digerido com EcoRI e desfosforilado. Os produtos da ligação foram utilizados para transformar E. coli XLl-Blue competentes utilizando o processo do CaCl₂ (Maniatis et al., supra). Os transformantes resistentes a ampicilina foram seleccionados e analisados em relação a plasmídeos por digestão com enzimas de restrição e electroforese em gel de agarose para os plasmídeos

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recombinantes. A digestão com EcoRI indicou que a maior parte dos transformantes continha plasmídeos com a inseerção desejada. A digestão com BamHI identificou a orientação do gene GDNF clonado em relação ao promotor SV40 presente no vector (Note-se o sítio BamHI na posição 15 da sequência da Figura 13). Ambas as orientações foram obtidas.

Foram escolhidos dois transformantes para análise posterior; um continha um plasmídeo, denominado pSG5::rGDNF-7, transportando o gene de GDNF na orientação própria para ser expresso em transcritos de ARN iniciados no promotor SV40, enquanto o segundo continha um plasmídeo denominado pSG5::rGDNF-4, transportando o gene de GDNF na orientação oposta; em que os transcritos de ARN iniciados no promotor SV40 não vão expressar o GDNF. Preparações purificadas de ambos os plasmídeos foram preparadas por centrifugação em gradiente de densidade de CsCl, para utilização nas experiências de expressão nas células COS.

B. Expressão de GDNF nas células COS-7.

O ADN plasmídico destas construções foi preparado pelo processo de lise alcalina seguida por centrifugação em gradiente de densidade de CsCl (Maniatis et al.,supra). Este ADN foi transfectado em células COS-7 pelo processo de Sompayrac e Danna '1981 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:7575-7578). Como controlo, culturas equivalentes de células COS foram transfectadas com o ADN do vector plasmídico contendo a inserção do GDNF na orientação oposta, que não permite a expressão da proteína de GDNF. Por cada placa de cultura de 100 mm, foram utilizadas 30 gg de lipofectina e 0,3-1 μg de ADN plasmídico.

Após 24 horas de transfecção, o meio foi aspirado e substituído por OptiMEM I ± FCS a 3%. As culturas foram incubadas durante 48 horas e recolhidas como se segue:

a) o meio (meio condicionado ou CM) foi drenado e armazenado a -80°C;

b) 5 ml de PBS + EDTA 2,5 mM foram adicionados à camada de células e deixados durante 3 minutos a 25°C; e então as células

-7374 374

SYN225/PO foram pipetadas da placa e centrifugadas a 1 OOOx g durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido e o precipitado de células foi armazenado a -80°C.

O CM foi concentrado 30 vezes no concentrador Centricon 10 e foi ensaiada a bioactividade. Os precipitados celulares foram sonicados em 500 μΐ de EDTA 10 mM, pH 7,0, com benzamidina 1 mM, PMSF 100 μΜ, e ácido E-amino-N-capróico 1 mM. Os lisados celulares foram centrifugados a 14 OOOx g durante 5 minutos e os sobrenadantes foram ensaiados quanto à bioactividade.

C. Bioensaio do GDNF expresso

O lisado celular e os meios de cultura das células COS transfectadas com os plasmídeos de controlo e que expressam GDNF (com a sequência de codificação de GDNF na orientação incorrecta), foram ensaiados quanto à capacidade de aumentar a incorporação de dopamina em culturas de neurónios mesencefálicos (ver Exemplo 1) e quanto à capacidade de aumentar a sobrevivência dos neurónios de gânglios simpáticos (ver Exemplo 4). O meio de cultura das células COS (Figura 17) e o lisado celular (dados não apresentados) aumentam a incorporação de dopamina, como se esperava para o GDNF. Como apresentado na Figura 18, o meio de cultura das células COS e o lisado celular aumentam a sobrevivência dos neurónios da cadeia simpática, como se esperava para o GDNF,

Estes resultados indicam claramente que a expressão do gene do GDNF em células animais resulta na produção de uma proteína com as actividades biológicas demonstradas para o GDNF purificado.

Exemplo 6: Expressão do GDNF Humano em E. coli

A. Construção de um plasmideo que codifica o GDNF humano.

Utilizando a informação da sequência do gene de GDNF humano (Exemplo 2C), foram sintetizados oligonucleótidos sintéticos PD3 e PD4 como iniciadores para a amplificação do gene de GDNF humano e sua expressão a partir de um vector plasmídico em E. coli. As sequências dos oligonucleótidos PD3 (SEQ ID NO:21) e

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SYN225/P0

-74PD4 (SEQ ID NO:22) são:

PD3: 5' CGCGGATCCAATAAGGAGGAAAAAAAATGTCACCAGATAAACAAAT 3'

PD4: 5' CGCGGTACCCAGTCTCTGGAGCCGGA 3'

O oligonucleótido PD3 tem um comprimento de 46 nucleótidos. Os 17 nucleótidos na extremidade 3' são uma perfeita coincidência com o gene do GDNF humano na região que codifica a extremidade N da proteína madura. Estes 17 nucleótidos são precedidos por um codão de iniciação da tradução, ATG, de modo que a síntese de GDNF maduro humano começará na E. coli no aminoácido correcto. Os outros nucleótidos são concebidos para proporcionar outros sinais que se julgam necessários para uma boa expressão em E. coli, assim como um sítio de restrição da endonuclease BamHI necessário para a construção do plasmídeo de expressão para o GDNF.

O oligonucleótido PD4 tem 26 nucleótidos de comprimento. Os 17 nucleótidos da extremidade 3' são uma perfeita coincidência com os 17 nucleótidos do gene de GDNF humano a 3' do codão de paragem. Este oligonucleótido proporciona também sequências necessárias para reconstruir um sítio da endonuclease de restrição Kpnl para construção do plasmídeo de expressão para o GDNF.

As condições de reacção para a amplificação do GDNF humano são as seguintes: o volume total de reacção foi de 100 μΐ e continha 1 ng de um clone de AADN contendo o gene do GDNF humano, PD3 e PD4 20 pmoles de cada, Tris-HCl 20 mM, pH 8,8, KC1 10 mM, (NH₄)₂SO₄ 6 mM, Mgci₂ 1,5 mM, e Triton X-100 a 0,1%. A mistura de reacção foi aquecida a 95°C durante 5 minutos, arrefecida a 4 4 ° C , e foram adicionadas 2 unidades de ADN-polimerase Pfu (Stratagene). A reacção consistiu em 30 ciclos de: 72°C durante 1 1/2 minutos, 95’C durante 1 minuto, e 44C durante 1 1/2 minutos. No final da reacção, foi adicionado MgCl₂ até uma concentração final de 10 mM. Foram adicionadas 5 unidades do fragmento grande da ADN-polimerase I (Klenow) (Promega), e a reacção foi incubada a 37°C durante 10 minutos.

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SYN225/PO

Então, foram adicionados 10 μΐ de NaAc 3M e 220 μΐ de EtOH, e a solução foi centrifugada a 12 OOOx g durante 15 minutos para precipitar o ADN. O ADN precipitado foi ressuspenso em 100 μΐ de Tris-HCl 50 mM (pH 8), NaCl 50 mM, MgCl₂ 10 mM, 20 unidades de BamHI e 20 unidades de Kpnl, e incubado durante 1 hora a 37 °C. Foi identificado um fragmento de ADN do tamanho correcto, após electroforese através de um gel de agarose, e foi purificado utilizando uma unidade de filtração Ultrafree-MC (Millipore). Este fragmento foi ligado a um vector de expressão para E. coli, o pT3XI —2, (abaixo descrito). As condições de ligação foram as seguintes: o volume total de reacção foi de 5 μΐ e continha 10 ng de ADN de pT3XI-2 linearizado com ΚρηI e BamHI. 5 ng do fragmento de ADN do GDNF humano como acima descrito, Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MgCl₂ 10 mM, ATP 1 mM, DTT 1 mM, 5% de polietileno glicol 8 000, e 1 unidade de ADN-ligase de T4 (Bethesda Research Laboratories). A reacção foi incubada a 14°C durante 2 horas.

O vector pT3XI-2 foi construído da seguinte maneira: o plasmídeo de partida para esta construção foi o plasmídeo pKK223-3 (Brosius e Holy, 1984) adquirido à Pharmacia. O plasmídeo pKK223-3 é portador de um gene parcial para a resistência à tetraciclina. Este gene não funcional foi substituído por um gene completo de resistência à tetraciclina, existente no plasmídeo pBR322. O plasmídeo pKK223-3 foi .completamente digerido, com Snhl. e parc.ialmp.nte com BamHI. Foi purificado do gel um fragmento de 4,4 kilopares de bases e combinado com um adaptador sintético (SEQ ID NO:23):

5' GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT 3'

3' ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 5'

BglII - Ciai e um fragmento de ADN de 539 pares de bases de uma digestão com Ciai e Sphl do gene para a resistência à tetraciclina do pBR322 (PL Biochemicals, 27-4891-01). O plasmídeo resultante foi designado pCJl.

A seguir, um ligante Xhol adquirido à New England Biolabs,

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. Ζ>

r·· ___________

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foi inserido no sítio PvuII do plasmídeo pCJl para formar o plasmídeo pCJX-1. Esta inserção desmembra o gene rop que controla o número de cópias do plasmídeo. A seguir, um fragmento EcoRI contendo o gene para o lacl foi purificado do plasmídeo pMC9 (Calos et al. 1983), foi então inserido no sítio Xhol com adaptadores de Xhol para EcoRI. A região poliligadora no plasmídeo pKK223-3 foi a seguir substituída com um poliligador contendo sítios adicionais por corte com EcoRI e PstI (SEQ ID NO:24 ) :

5' AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTÀ GTCTGCA 3'

3' GGGCCC ATGGTCTAGA CTCGAGTGAT CAG 5'

O vector plasmidico assim obtido foi designado pCJXI-1.

Finalmente, o gene de resistência à tetraciclina foi substituído com um gene semelhante que possuía os sítios de reconhecimento para as enzimas de restrição HindIII. BamHI. e Sall destruídos por mutagénese por bisulfito. O procedimento seguinte foi utilizado para mutar o gene de resistência à tetraciclina do pBR322. O plasmídeo pBR322 foi cortado com HindIII. e então mutado com bisulfito de sódio (Shortle e Botstein, 1983). O ADN mutado foi ligado para formar ADN circular, depois cortado com HindIII para linearizar qualquer plasmídeo que-escapou à mutagénese. E. coli JM109 (Yanish-Perron et al.. 1985). Os plasmideos resistentes à tetraciclina foram isolados e testados para a perda do sítio HindIII no gene da resistência à tetraciclina. Os plasmideos mutados com sucesso foram designados pTl. Um procedimento semelhante foi seguido para mutar o sítio BamHI no pTl, produzindo o plasmídeo pT2. O plasmídeo pT2, por sua vez, foi mutado para remover o sítio Sall. formando o plasmídeo pT3. Foi isolado um fragmento Clal-Styl de pT3, contendo o gene mutado da resistência à tetraciclina e utilizado para substituir o fragmento homólogo de pCJXI-1 para formar pT3XI-2. O gene de resistência à tetraciclina mutado codifica ainda uma proteína funcional. Foi introduzido um poliligador a jusante da região do promotor tac.

contendo, entre outros, os sítios de restrição BamHI e Kpnl.

-77úteis para a clonagem de genes para expressão em E. coli.

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SYN225/PO

Após a segunda hora de ligação do vector com a construção do GDNF maduro humano, foram utilizados 2 μΐ da mistura de reacção para transformar células E. coli supercompetentes Epicurian Coli SURE^ (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência de ADN de um dos plasmídeos recombinantes foi determinada como descrito no Exemplo 2B. A sequência confirmou que este plasmídeo continha a sequência de codificação completa do gene para o GDNF humano, codificando o GDNF maduro humano.

B. Expressão do GDNF humano em E. coli.

O plasmídeo recombinante contendo as sequências de ADN codificando o GDNF humano foi transformado na estirpe JM1O70RMCBOOO5 de E. coli. uma variante TI resistente da JM107 (Yanich-Perron et al. 1985), utilizando o processo do CaCl₂ descrito em Sambrook et al. (1989). Um dos recombinantes foi cultivado em 50 ml de meio LB (Sambrook et al. ) com 100 gg/ml de ampicilina (Sigma) com agitação a 37'C durante a noite. No dia seguinte a cultura foi diluída a 1:70 em meio LB com 100 Mg/ml de ampicilina e cultivada durante 5 horas com agitação a 37°C. Recolheram-se 20 ml de células por centrifugação a 8 000 xg durante 10 minutos. O precipitado foi ressuspenso em 4 ml de EDT?. 10 mM pH 7,4. As células foram rebentadas utilizando uma célula de pressão de prensa francesa (SLM Instruments) l,24xl0⁵ kPa (18 000 psig). O lisado foi centrifugado a 12 OOOx g durante 15 minutos a 4°C. O precipitado foi ressuspenso em EDTA 10 mM. Verificou-se que se acumulava relativamente mais GDNF se a fermentação se realizasse a 4 2’C em vez de 37C ou 30°C.

O processo presentemente preferido para a obtenção de elevados níveis de expressão de GDNF em E. coli utilizando o plasmídeo recombinante descrito no Exemplo 6A (em que a sequência de codificação para o GDNF humano está clonada no vector de expressão pT3XI-2) é como se segue. Para 10 1 de fermentação, um inóculo de 500 ml é cultivado em meio LB (pH 7) contendo tetraciclina 15 Mg/ml a 37 “C, num frasco nefelómetro de

ΊΑ 374

SYN225/P0 agitação de 2 1 até uma densidade óptica (A₆₆₀) entre 2 e 3. Esta cultura é utilizada para inocular 10 1 de meio de crescimento contendo: triptona 12 g/1, extracto de levedura 24 g/1, glicerol 25 g/1, K₂HPO₄ 1,3 g/1, KH₂PO₄ 0,4 g/1, 0,1 ml/1 de uma mistura Macoll9:GE60 4:1, e 15 mg/1 de tetraciclina HC1. Esta cultura foi cultivada durante aproximadamente 12 a 18 horas a 42°C, até densidades ópticas de 12 a 20 (A₆₆₀). O pH da fermentação é mantido a 7,0 e o oxigénio dissolvido é mantido a uma saturação de 30%. Após fermentação, a cultura foi arrefecida a 4°C e as células foram recolhidas por centrifugação.

A produção de GDNF humano a partir deste plasmídeo acima descrito, não é específica para esta estirpe de E. coli, mas pode ser produzido em qualquer estirpe adequada. O plasmídeo foi transformado em duas outras estirpes de E. coli, JM108 (Yanhisch-Perron et al., 1985) e SURE^' (Stratagene). Em ambas as estirpes uma nova banda proteica com a massa molecular correcta foi visualizada por coloração com azul de Coomassie, após electroforese através de um gel de poliacrilamida.

Uma alíquota do material ressuspenso foi aplicado numa electroforese em gel de poliacrilamida. O gel foi corado com azul de Coomassie. Uma proteína com a massa molecular esperada para o GDNF (15 000 daltons) estava presente apenas nas culturas que continham.o plasmídeo recombinante do GDNF humano, mas não em culturas que continham apenas o vector pT3XI-2. A proteína recuperada foi sujeita a procedimentos padrão de sequenciação da extremidade amino, e os primeiros 22 aminoácidos desta proteína são idênticos à sequência de aminoácidos do GDNF humano como apresentado na Fig. 19, confirmando que o GDNF humano é correctamente expresso em E. coli.

C. Redobraqem e bioactividade do GDNF recombinante, humano, produzido na bactéria.

Preparação do material para a redobraqem. O JM107 transformante de E. coli (pT3X12::huGDNF) foi cultivado até à fase estacionária a 37’C em meio complexo com base em extracto de levedura (#0127-01 Difco Laboratories, Detroit, MI) e

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SYN225/PO triptona (#0123-05 Difco Laboratories, Detroit, MI) (extracto de levedura 24 g/1, triptona 12 g/1, glicerol 5g/l, K₂HPO₄ 1,3 g/1, ΚΗ₂ΡΟ₄ 0,4 g/1, Macol 19/GE60 (4:1) 0,1 ml/1, tetraciclina 15 mg/1) sem indução pelo IPTG. As células foram centrifugadas a 16 OOOx g num rotor JA10 a 4’C durante 20 minutos e a pasta celular foi armazenada a -20’C.

As células foram processadas como se segue: 5 g de pasta celular foram homogeneizadas com 40 ml de EDTA 10 mM, pH 7,0 em gêlo utilizando um homogeneizador OCI Instruments. A pasta fluida foi passada três vezes pela prensa francesa l,39xl0⁵ kPa (20 000 psi), e então centrifugada a 30 OOOx g num rotor JA20 durante 10 minutos a 4’C. O sobrenadante foi rejeitado e o precipitado foi homogeneizado e centrifugado como acima. Numa concretização o precipitado da re-extracção foi homogeneizado com 40 ml de Tris 25 mM, centrifugado como acima e o sobrenadante rejeitado. 0 precipitado foi homogeneizado com 20 ml de Tris 50 mM, pH 8,0, contendo ureia 8 M com ou sem adição de 2-mercaptoetanol 30 mM, centrifugado como acima e o sobrenadante retido, o sobrenadante é referido como o extracto de TU. Na concretização preferida, o precipitado foi homogeneizado em 40 ml de Tris 10 mM, pH 8,0, contendo EDTA 1 mM, NP-40 1%, centrifugado como acima, e o sobrenadante rejeitado. O precipitado foi solubilizado por sulfonilação como -s-e. segue: n precipitado foi homogeneizado em 25 ml de fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, contendo ureia 8 M, sulfito de sódio 100 mM e tetrationato de sódio 10 mM. Deixou-se proceder à sulfonilação a 4’C durante a noite com agitação, e então foi centrifugada a 16 OOOx g, 4’C durante 10 minutos, para clarificar a solução.

Purificação parcial do extracto TU antes da redobragem. O extracto TU foi parcialmente purificado por cromatografia de permuta iónica em resina S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia). A coluna foi equilibrada e operada à temperatura ambiente em Tris 25 mM, pH 7,4, contendo ureia 8 M e 2-mercaptoetanol 30 mM (Tampão A). Após aplicação da amostra e lavagem com tampão A até se obter a densidade óptica da linha de base, a coluna foi eluída com 10% do volume da coluna por minuto com 5 volumes da

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coluna cada um de tampão A e Tris 100 mM, pH 9,0, contendo ureia 8 M, NaCl 500 mM, e 2-mercaptoetanol 30 mM (tampão B). As fracções da coluna foram monotorizadas a 280 nm e analisadas por SDS-PAGE. 0 GDNF eluiu como pico principal de proteína entre 60-70% de gradiente. Aas fracçes ricas em GDNF foram combinadas para redobragem (Fig. 25).

Purificação parcial do extracto sulfonilado antes da redobragem. O extracto sulfonilado foi parcialmente purificado por cromatografia de permuta iónica em resina Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia). A coluna foi equilibrada e operada a 4°C em Tris 10 mM, pH 8,0, contendo ureia 4 M (Tampão A). Após aplicação da amostra e lavagem com o tampão A até se obter a densidade óptica da linha de base, a coluna foi eluída com 5% do volume da coluna por minuto com 5 volumes de coluna de cada, tampão A e Tris 10 mM, pH 8,0, contendo ureia 4 M e NaCl 500 mM (tampão B). As fracções da coluna foram monotorizadas a 280 nm e analisadas por SDS-PAGE. O GDNF eluiu no pico principal de proteína a 50% do gradiente. As fracções ricas em GDNF foram combinadas para redobragem.

Redobragem do extracto TU parcialmente purificado. O GDNF parcialmente purificado como acima descrito, foi redobrado como se segue: a 4 ml do eluído combinado da coluna, contendo GDNF a aproximadamente. 1 .mg/ml, foi -dicionado ditiotreitol até 5 mM. O tubo foi tapado de forma a excluir o ar e mantido a 25°C durante 15 minutos. Em seguida, o sal de di-sódio de glutationa oxidado foi adicionado para 15 mM, o tubo foi novamente tapado de forma a excluir o ar e mantido a 25’C durante 15 minutos. Esta solução foi então diluída com 14 volumes de tampão de redobragem (Na₂HPO₄ 100 mM> etanolamina 10 mM, pH 8,3, contendo ureia 4 M; 5% de polietilenoglicol 300; e cistína 2 mM), e mantido sob atmosfera de árgon a 5’C durante 3 dias.

Redobragem do extracto sulfonilado parcialmente purificado. GDNF parcialmente purificado como acima, foi redobrado como se segue: o eluído combinado da coluna contendo GDNF aproximadamente a 3 mg/ml foi diluído com 19 volumes de tampão

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SYN225/PO de redobragem (Na₂HPO₄ 100 mM, Tris, pH 8,3, contendo ureia 4 M; 5% de polietilenoglicol 300; e cisteína 3 mM), e mantido numa atmosfera de árgon a 5°C durante 3 dias.

Análise do GDNF redobrado por SDS-PAGE. O GDNF extraído de bactéria sem exposição prévia a agentes redutores, migra como um monómero em SDS-PAGE, com uma massa molecular aparente de cerca de 16 kDa comparada com a migração das proteínas de massas moleculares padrão. Não existe GDNF detectável na posição de dímero. O GDNF exposto a um agente redutor (2-mercaptoetanol 30-150 mM) durante a extracção ou imediatamente antes da SDS-PAGE, mas antes da redobragem, migra a uma posição indistinguível da proteína bacteriana não reduzida, com uma massa molecular aparente de cerca de 16 kDa (Fig.26, faixas 6 & 13). Isto indica que o GDNF preparado das células bacterianas não está dimerizado antes da redobragem.

Após redobragem como acima indicado, a maior parte do GDNF produzido bacterianamente, migra em SDS-PAGE nào redutora como um dímero aparente de aproximadamente 30 kDa (Fig. 26, faixa 2). A redução do GDNF redobrado com 2-mercaptoetanol 150 mM antes da SDS-PAGE, faz com que ele migre de novo na posição de monómero de aproximadamente 16 kDa (Fig. 23, faixa 5). Estes resultados indicam que a redobragem do GDNF faz com que a proteína se torne num dímero ligado por pontes de dissulfureto. Foi efectuada a migração de GDNF redobrado em SDS-PAGE sem redução, e o gel foi cortados em tiras no sentido do comprimento e as tiras ensaiadas quanto a bioactividade no ensaio da sobrevivência dos neurónios

Jja dos gânglios simpáticos (ver abaixo). A única bioactividade detectada foi na posição do dímero, indicando que o dímero é biologicamente activo.

Análise do GDNF Redobrado por HPLC de Fase Inversa (RP-HPLC). O GDNF parcialmente purificado por cromatografia em

S-Sepharose ou Q-Sepharose, mas antes da redobragem, migrava na RP-HPLC, efectuada como indicado abaixo, com um tempo de retenção de cerca de 21 minutos. Após redobragem, o GDNF migrou sob as mesmas condições com um tempo de retenção de cerca de 15

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minutos. Um deslocamento no tempo de retenção é esperado para o GDNF redobrado com sucesso. Verifica-se frequentemente que se observa um deslocamento nos tempos de retenção na RP-HPLC após a redobragem de proteínas.

A RP-HPLC destas amostras foi efectuada como se segue: a um caudal de 1 ml/minuto uma coluna C-4 0,46 x 25 cm (VyDac #214TP54), foi resolvida como se segue: Solvente A = 0,1% de ácido trifluoracético (TFA) em água; Solvente B = 0,1% de TFA em acetonitrilo; de 0,5 a 1,5 minutos, B é aumentado de 5% para 25%; de 1,5 para 31,5 minutos , B é aumentado de 25% para 55%.

Análise da Redobragem do GDNF por Bioensaio. O GDNF redobrado foi bioensaiado tanto no bioensaio para a sobrevivência dos neurónios dos gânglios simpáticos do embrião de pinto (E10) (Exemplo 4A), e no bioensaio da incorporação de dopamina em culturas mesencefálicas de embrião de ratazana (E16) (Exemplo 1B). Antes da redobragem, o GDNF exposto a

2-mercaptoetanol 30 mM e purificado por cromatografia em

S-Sepharose ou Q-Sepharose, como acima, não exibia qualquer bioactividade detectável no ensaio de incorporação de dopamina em cultura mesencefálica, e bioactividade muito reduzida no ensaio de sobrevivência dos neurónios simpáticos. A ED50 aparente no bioensaio de sobrevivência dos neurónios simpáticos, do material da cromatografia em S-Sepharose foi cerca de 1 ng/ml, que é cerca de 333 vezes inferior à do rhGDNF redobrado (ver abaixo). Para o material da cromatografia em Q-Sepharose, a ED50 aparente no bioensaio para o ensaio de sobrevivência dos neurónios simpáticos foi de cerca de 3 ng/ml, o que é cerca de 100 vezes inferior à do rhGDNF (ver abaixo). Após a redobragem, o GDNF, com ou sem exposição prévia ao 2-mercaptoetanol, era aparentemente completamente activo em ambos os bioensaios (Figs 27 e 28). Este resultado indica que o GDNF adquire bioactividade significativa com a redobragem, e também que a bioactividade reduzida ou ausente antes da redobragem não era devida à exposição ao 2-mercaptoetanol.

A ED50 do GDNF humano recombinante redobrado (rhGDNF)

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nestes bioensaios foi semelhante à observada préviamente para o GDNF de ratazana purificado do meio condicionado das células B49. No bioensaio de sobrevivência dos neurónios simpáticos, a ED50 foi de 3 ng/ml para o rhGDNF (Fig. 27) e de ED50 de 5 ng/ml para o GDNF de ratazana. No ensaio de incorporação de dopamina pela cultura mesencefálica, a ED50 para rhGDNF foi de 30 pg/ml (Fig. 28) e para o GDNF de ratazana foi de 50 pg/ml.

Estes resultados indicam que uma proporção substancial de rhGDNF foi redobrado com sucesso e é completamente biologicamente activo.

Exemplo 7: Produção e Isolamento de Anticorpos Contra o GDNF

Foram produzidos anticorpos contra o rhGDNF pelo procedimento seguinte. Verificou-se que este procedimento inclui, mas não está limitado, a este adjuvante, protocolo de imunização e espécie animal. Também se podem produzir anticorpos para o GDNF utilizando a proteína redobrada, proteína nativa ou desnaturada, proteína inactiva como no procedimento apresentado a seguir, ou com péptidos contíguos da sequência de GDNF humano ou de outras espécies animais.

Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por um de muitos procedimentos padrão (ver Anticorpos, laboratory manual; Cold Spring .Harbor Laboratory 1988 ISBN 08969-314-2 editor Ed Harlow e David Lane). Em resumo, este procedimento para produzir anticorpos monoclonais, envolve tipicamente, mas não exclusivamente, a imunização dos animais apropriados e a monotorização da resposta do anticorpo destes animais ao protocolo de imunização, isolamento das células produtoras de anticorpo, como as de um orgão linfóide de um ou mais animais com resposta, fusão destas células com uma linha celular apropriada como as células de mieloma, para produzir hibridomas que são células imortais que segregam anticorpos, e selecção progressiva para isolar hibridomas até que sejam obtidos clones de célula única que produzem o anticorpo monoclonal de interesse.

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SYN225/PO

Os anticorpos policlonais em coelhos foram produzidos como se segue: dois mililitros de solução salina estéril contendo 0,005-0,25 mg de rhGDNF, foram injectados num recipiente de emulsão MPL-TDM-CWS de adjuvante RIBI (RIBI Immunochem Research, Inc.) e vortexados para formar uma emulsão como as instruções do fabricante. Coelhos fêmeas, brancos anestesiados Neo Zelandezes, foram injectados segundo o protocolo de imunização sugerido pelo RIBI. Um mililitro de emulsão de adjuvante de antigénio foi administrado como se segue:

0,30 ml intradérmicos (0,05 ml em cada um de seis sítios)

0,40 ml intramuscular (0,20 ml em cada uma das patas posteriores)

0,10 ml subcutâneos (na região do pescoço)

0,20 ml intraperitoneal

Os animais foram injectados de novo (reforçados), todas as

4-6 semanas pelo mesmo protocolo. O sangue foi retirado dos animais antes da primeira injecção e a 10-14 dias depois de cada reforço para testar a produção de anticorpos com um ensaio de neutralização ou por um ELISA padrão.

O ensaio de neutralização foi efectuado como se segue utilizando o ensaio da cultura mesencefálica de ratazanas E16. O soro de coelho a testar foi diluído em meio essencial mínimo de Dulbecco, tamponado com HEPES 25 mM para pH 7,4, contendo albumina de soro de bovino.5 mg/ml (referida como BSA5). Por sua vez, isto foi adicionado aos poços de ensaio (25 μΐ de soro de teste diluído em 500 μΐ de solução de cultura de tecidos) e incubado a 37°C durante 30 minutos. A seguir, foi adicionado ao ensaio, rhGDNF como 25 μΐ de uma solução de armazenamento diluída em BSA5, contendo rhGDNF a 6,32 ng/ml para uma concentração final no ensaio de rhGDNF de 0,316 ng/ml. A incorporação de dopamina foi medida depois de oito dias em cultura, pelo procedimento préviamente descrito. Os resultados com os antissoros dos segundos reforços são apresentados abaixo para o ensaio de neutralização (referente à tabela 2 abaixo).

-85Tabela 2

Antigénio________*Neut. EC_5Q +ELISA EC₅θ

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SYN225/PO

Coelho Número

1604	rhGDNF	redobrado	20xl03	25x10
2257	rhGDNF	redobrado	12X103	7x10
2506	rhGDNF	redobrado	2xl03	3x10
9380	rhGDNF	desnaturado	2xl03	2x10

*diluição do antissoro para 50% de neutralização da incorporação de dopamina estimulada por GDNF.

+diluição do antissoro para 50% do máximo do sinal em ELISA (plataforma).

Os antissoros foram também titulados para anticorpos contra GDNF num ELISA padrão pelo seguinte procedimento: placas de microtitulação (96 poços, Nunc maxisorp) foram revestidas com ΙΟΟμΙ por poço de rhGDNF a 1,0 gg/ml, em tampão de revestimento, bicarbonato de sódio 50 mM, pH 9,6, durante a noite a 4‘C. As placas foram lavadas 4 vezes com tampão de lavagem de placas (PWB; solução salina fisiológica tamponada com fosfato, pH 7,2 contendo 0,5% de Tween 20), e então bloqueadas durante 2 horas a 25’C com 200 μΐ por poço de 2% de albumina de soro de bovino em solução salina fisiológica tamponada com fosfato, pH 7,2. As placas foram lavadas de novo com PWB e as amostras de soro a titular (100 μΐ diluídos em 20% de soro normal de cabra c PWB) foram adicionadas aos poços. As placas foram incubadas durante

1,5 horas a 35°C e lavadas de novo com PWB. Foi adicionado a cada poço (100 μΐ), fosfatase alcalina conjugada com IgG de anti-coelho de cabra (Jackson Immunochemicals), a uma diluição de 1:2500 em PWB, e incubados durante 1,5 horas a 35”C. As placas foram lavadas com PWB como antes. A seguir, foi adicionado a cada poço substrato p-NPP (p-nitrofenilfosfato de di-sódio; Sigma Cat. N^B MP389) (100 μΐ de p-NPP 1,0 mg/ml em 10% de dietanolamina, pH 9,8) e a placa foi incubada a 25’C. O desenvolvimento de cor foi seguido pela leitura das placas num leitor de placas a 405-490 nm (Molecular Devices Enax).

Os antissoros foram também utilizados para detectar e

374

SYN225/PO quantificar o GDNF em transferências de Western como se segue: Efectuou-se electroforese em gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) pelo procedimento básico, primeiro descrito por U. K. Laemmli (Nature 227:680-685) (1970)) utilizando um gel resolvente de poliacrilamida a 12 1/2% e um gel de poliacrilamida de aplicação de 4 1/2%. Os geles (16x14x0,15 cm) foram sujeitos a êlectroforese com uma corrente constante de 40 mAmp durante 3 horas. Para redução/renaturação, as amostras foram aquecidas a 100°C durante 10 minutos, em tampão da amostra contendo 1% de SDS e 2-mercaptoetanol 150 mM.

Para a transferência de Western, o gel foi então transferido para uma membrana Immobilon-P (Millipore Cat. N° IPVH 151 50) a 80 mAmp de corrente constante durante 16 horas em Tris-base 25 mM, glicina 192 mM, 0,1% de SDS, e 20% de metanol, processados como se segue:

1) A membrana foi bloqueada durante uma hora a 25’C em tampão de bloqueio (Tris 10 mM, pH 7,4 contendo NaCl 150 mM; 0,05% de Tween 20; 4% de leite desnatado; e 0,02% de azida de sódio) com agitação suave.

2) A membrana foi a seguir incubada a 25°C durante 2 horas com agitação suave em tampão de bloqueio contendo antissoros primários contra o GDNF diluídos.

3) A membrana foi lavada (lavagens de 4-5 minutos) em tampão de bloqueio.

4) A membrana foi a seguir incubada a 25°C durante 2 horas com agitação suave em tampão de bloqueio contendo anticorpo secundário diluído (fosfatase alcalina conjugada com IgG de cabra anti-coelho, purificada por afinidade; Capei Cat. N° 59299).

5) A membrana foi lavada (lavagens de 4-5 minutos) com tampão de bloqueio excluindo o leite desnatado.

6) A membrana foi revelada em 50 ml de tampão de revelação (Tris 100 mM, pH 9,5, contendo NaCl 100 mM e MgCl₂ 5 mM) com 165 μΐ de NBT e 83 μΐ de BCIP (conjunto da Promega, Cat. Ν^β P3771) a 25’C, com agitação suave até atingir a coloração desejada.

-8774 374

SYN225/PO

Exemplo 8: Preparação das Células Encapsuladas em Membrana que segregam GDNF e Implantação no Paciente.

As células que segregam GDNF podem ser encapsuladas em membranas semi-permeáveis, para implantação em pacientes que sofrem de lesões nos nervos. Numa concretização preferida, o paciente que sofre da doença de Parkinson, e as células encapsuladas que segregam GDNF, são implantadas no corpo estriado, do paciente para fornecerem GDNF aos corpos celulares dopaminérgicos.

Numa concretização do invento, as células que foram manipuladas para segregar GDNF - como aquelas preparadas e descritas nos Exemplos 5 e 6 acima - são incorporadas em inserções poliméricas recuperáveis, implantáveis e biocompatíveis. As inserções podem ser concebidas de modo a permitir ao GDNF segregado entrar no tecido que envolve as células implantadas, enquanto evita factores do tecido envolvente que seriam prejudiciais às células se a elas tivessem acesso.

As células que foram manipuladas para segregar GDNF podem ser encapsuladas em tais membranas semi-permeáveis, de acordo com o processo descrito no pedido PCT publicado WO 91/10425, intitulado Cell Capsule Extrusion Systems. As células encapsuladas na membrana, podem ser implantadas no corpo estriado de acordo com os procedimentos cirúrgicos padrão.

V/ 74 374

SYN225/PO (1) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N^a. 1:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 25 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear

(v) TIPO DE FRAGMENTO: Fragmento da extremidade N (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID Ν’. 1:

<···	Ser	Pro	Asp	Lys	Gin	Ala	Ala	Ala	Leu	Pro	Arg Arg Glu Arg Asn Xaa
					5					10	15
	Gin	Ala	Ala	Ala	Ala	Ser	Pro	Asp	Asn
				20					25

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID Ν’. 2:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (v) TIPO DE FRAGMENTO: Fragmento interno (ix) CARACTERÍSTICA: Xaa é Lis ou Gin (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ IDN». 2:

Asp Xaa Ile Leu Lys Asn Leu Gly Arg Val Arg Arg Leu (3) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N^a . 3:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 890 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: ácido nucleico para o GDNF de rata- zana

-89(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ IDN⁵. 3:

374

SYN225/PO

CCCCCGGGCT GCAGGAATTC GGGG GTC TAC GGA GAC CGG ATC CGA GGT GCC GCC Vai Tyr Gly Asp Arg Ile Arg Gly Ala Ala -90 -85

GCC Ala

GGA Gly

CGG Arg

GAC À3G -80

TCT Ser

AAG T « . -

ATG Met

AAu T , ,

TTA Leu -75

TGG Trp

GAT Asp

GTC Vai

GTG Vai

GCT Ala -70

GTC Vai

TGC Cys

92

CTG

GTG

TTG

CTG

CAC

ACC

GCG

TCT

GCC

TTC

CCG

CTG

CCC

GCC

GGT

AAG

140

Leu

Vai

Leu

Leu

His

Thr

Ala

Ser

Ala

Phe

Pro

Leu

Pro

Ala

Gly

Lys

-65

-60

-55

AGG

CTT

CTC

GAA

GCG

CCC

GCC

GAA

GAC

CAC

TCC

CTC

GGC

CAC

CGC

CGC

188

Arg

Leu

Leu

Glu

Ala

Pro

Ala

Glu

Asp

His

Ser

Leu

Gly

His

Arg

Arg

-50

-4 5

-40

GTG

CCC

TTC

GCG

CTG

ACC

AGT

GAC

TCC

AAT

ATG

CCC

GAA

GAT

TAT

CCT

236

Vai

Pro

Phe

Ala

Leu

Thr

Ser

Asp

Ser

Asn

Met

Pro

Glu

Asp

Tyr

Pro

-35

-30

-25

-20

GAC

CAG

TTT

GAT

GAC

GTC

ATG

GAT

TTT

ATT

CAA

GCC

ACC

ATC

AAA

AGA

284

Asp

Gin

Phe

Asp

Asp

Vai

Met

Asp

Phe

Ile

Gin

Ala

Thr

Ile

Lys

Arg

-15

-10

-5

CTG

AAA

AGG

TCA

CCA

GAT

ΛΑΑ

CAA

GCG

GCG

GCA

CTT

CCT

CGA

AGA

GAG

332

Leu

Lys

Arg

Ser

Pro

Asp

Lys

Gin

Ala

Ala

Ala

Leu

Pro

Arg

Arg

Glu

1

5

10

AGG

AAC

CGG

CAA

GCT

GCA

GCT

GCC

AGC

CCA

GAG

AAT

TCC

AGA

GGG

AAA

380

Arg

Asn

Arg

Gin

Ala

Ala

Ala

Ala

Ser

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg

Gly

Lys

15

20

25

GGT

CGC

AGA

GGC

CAG

AGG

GGC

AAA

AAT

CGG

GGG

TGC

GTC

TTA

ACT

GCA

4 2 8

Gly

Arg

Arg

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

Cys

Vai

Leu

Thr

Ala

30

35

40

4 5

ATA

CAC

TTA

AAT

GTC

ACT

GAC

TTG

GGT

TTG

GGC

TAC

GAA

ACC

AAG

GAG

476

Ile

His

Leu

Asn

Vai

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

50

55

60

GAA

CTG

ATC

TTT

CGA

TAT

TGT

AGC

GGT

TCC

TGT

GAA

GCG

GCC

GAG

ACA

524

Glu

Leu

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Glu

Ala

Ala

Glu

Thr

65

70

75

ATG

TAC

GAC

ΑΛΑ

ATACTA AAA AAT CTG TCT CGA AGT AGA AGG CTA ACA

572

Met

Tyr

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Ser

Arg

Arg

Leu

Thr

80

85

90

AGT

GAC

AAG

GTA

GGC

CAG

GCA

TGT

TGC

AGG

CCG

GTC

GCC

TTC

GAC

GAC

620

Ser

Asp

Lys

Va 1

Gly

Gin

Ala

Cys

Cys

Arg

Pro

Vai

Ala

Phe

Asp

Asp

95

100

105

GAC

CTG

TCG

TTT

TTA

GAC

GAC

AGC

CTG

GTT

TAC

CAT

ATC

CTA

AGA

AAG

668

Asp

Leu

Ser

Phe

Leu

Asp

Asp

Ser

Leu

Vai

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

110

115

120

125

CAT

TCC

GCT

rr\ ,—· rt > 1 u *

GGA

TGT

ATC

TGA

CCCTGGCTCC ACACACTCCT

71Θ

His

Ser

Ala

Lys

Arg

Cys

Gly

Cys

Ile

130

GTGTATTGCA TTCCTGCTAC ACTGCGAAGA AAGGGACCAA GGTTCCCAGG

AAATATTTGC

778

CCAGAAAGGA AGATAAGGAC CAAGAAGGCA GAGGCAGAGG

CGGAAGAAGA AGAAGAAAAG

838

AAGGACGAAG GCAGCCATCT GTGGGAGCCT GTAGAAGGAG GCCCAGCTAC AG

890

-90ΊΑ 374

SYN225/PO

(4) INFORMAÇÃO PARA SEQ IDN“. 4:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 134 resíduos de aminoácido (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: Sequência de aminoácidos inferida para o GDNF maduro de ratazana

(Xi)

DESCRIÇÃO

DA

SEQUÊNCIA:

SEQ

ID

NB .

4:

Ser

Pro

Asp

Lys

Gin

Ala

Ala

Ala

Leu

Pro

Arg

Arg

Glu

Arg

Asn

Arg

1

5

10

15

Gin

Ala

Ala

Ala

Ala

Ser

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

Arg

20

2 5

30

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

cys

Vai

Leu

Thr

Ala

Ile

His

Leu

35

40

45

Asn

Vai

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Glu

Leu

Ile

50

55

60

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Glu

Ala

Ala

Glu

Thr

Met

Tyr

Asp

6 5

70

75

80

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Ser

Arg

Arg

Leu

Thr

Ser

Asp

Lys

85

90

95

Vai

Gly

Gin

Al a

Cys

Cys

Arg

Pro

Vai

Ala

Phe

Asp

Asp

Asp

Leu

Ser

100

105

110

Phe

Leu

Aso

Asp

Ser

Leu

Vai

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

Ala

115

120

125

Lys

Arg

Cys

Gly

Cys

Ile

130 (5) INFORMAÇÃO PARA SEQ IDN. 5:

(i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 562 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: sequência de ácido nucleico para o

GDNF humano

-91(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ IDN’. 5:

374

SYN225/PO

ATTTTCTCTT TTCTTTTTGA ACAGCA AAT ATG CCA GAG GAT TAT CCT GAT CAG 5 3

Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gin

TTC

GAT

GAT

GTC

ATG

GAT

TTT

ATT

CAA

GCC

ACC

ATT

AAA

AGA

CTG

AAA

101

Phe

Asp

Asp

Val

Met

Asp

Phe

Ile

Gin

Ala

Thr

Ile

Lys

Arg

Leu

Lys

AGG

TCA

CCA

GAT

AAA

CAA

ATG

GCA

GTG

CTT

CCT

AGA

AGA

GAG

CGG

AAT

149

Arg

Ser

Pro

Asp

Lys

Gin

Met

Ala

Val

Leu

Pro

Arg

Arg

Glu

Arg

Asn

1

5

10

15

CGG

CAG

GCT

GCA

GCT

GCC

AAC

CCA

GAG

AAT

TCC

AGA

GGA

AAA

GGT

CGG

197

Arg

Gin

Ala

Ala

Ala

Ala

Asn

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

20

25

30

AGA

GGC

CAG

AGG

GGC

AAA

AAC

CGG

GGT

TGT

GTC

TTA

ACT

GCA

ATA

CAT

245

Arg

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

Cys

Val

Leu

Thr

Ala

I le

His

35

40

4 5

TTA

AAT

GTC

ACT

GAC

TTG

GGT

CTG

GGC

TAT

GAA

ACC

AAG

GAG

GAA

CTG

293

Leu

Asn

Val

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Glu

Leu

50

55

6 0

ATT

TTT

AGG

TAC

TGC

AGC

GGC

TCT

TGC

GAT

GCA

GCT

GAG

ACA

ACG

TAC

341

Ile

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Ala

Glu

Thr

Thr

Tyr

65

70

75

GAC

AAA

ATA

TTG

AAA

AAC

TTA

TCC

AGA

AAT

AGA

AGG

CTG

GTG

ACT

GAC

389

Asp

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Arg

Leu

Val

Ser

Asp

80

85

90

95

AAA

GTA

GGG

CAG

GCA

TGT

TGC

AGA

CCC

ATC

GCC

TTT

GAT

GAT

GAC

CTG

437

Lys

Val

Gly

Gin

Ala

Cys

Cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Asp

Asp

Leu

100

105

110

TCG

TTT

TTA

GAT

GAT

AAC

CTG

GTT

TAC

CAT

ATT

CTA

AGA

AAG

CAT

TCC

4 8 5

Ser

Phe

Leu

Asp

Asp

Asn

Leu

Val

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

115

120

125

GCT

AAA

AGG

TGT

GGA

TGT

ATC

TGA

CTCCGGCTCC AGAGA

>C'TGCT GTGTATTGCA

539

Ala

Lys

Arg

Cys

Gly

Cys

Ile

130

TTCCTGCTAC AGTGCAAAGA AAG

562 (6) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID Ν’. 6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 134 resíduos de aminoácido (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE:	sequência de aminoácidos inferida
para o GDNF	maduro humano

-92(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^B. 6:

374

SYN225/PO

Ser 1

Pro

Asp

Lys

Gin 5

Met

Al a

Vai

Leu

Pro 10

Arg

Arg

Glu

Arg

Asn 15

Arg

Gin

Ala

Ala

Ala

Ala

Asn

Pro

Glu

Asn

Ser

Arg

Gly

Lys

Gly

Arg

Arg

20

25

30

Gly

Gin

Arg

Gly

Lys

Asn

Arg

Gly

Cys

Vai

Leu

Thr

Ala

Ile

His

Leu

35

40

4 5

Asn

Vai

Thr

Asp

Leu

Gly

Leu

Gly

Tyr

Glu

Thr

Lys

Glu

Glu

Leu

Ile

. 50

55

60

Phe

Arg

Tyr

Cys

Ser

Gly

Ser

Cys

Asp

Ala

Ala

Glu

Thr

Thr

Tyr

Asp

65

70

75

80

Lys

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

Arg

Leu

Vai

Ser

Asp

Lys

85

90

95

Vai

Gly

Gin

Ala

cys

Cys

Arg

Pro

Ile

Ala

Phe

Asp

Asp

Asp

Leu

Ser

100

105

110

Phe

Leu

Asp

Asp

Asn

Leu

Vai

Tyr

His

Ile

Leu

Arg

Lys

His

Ser

Ala

115

120

125

Lys

Arg

Cys

Gly

Cys

Ile

130 (7) INFORMAÇÃO PARA SEQ IDN. 7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ! ·' (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: sonda de oligonucleótidos (D) OUTRA INFORMAÇÃO: N nas posições 3, 15 e 18 é a inosina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ IDN». 7:

CCNGAYAARC ARGCNGCNGC (8) INFORMAÇÃO PARA SEQ IDN». 8:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 223 pares de bases

374

SYN225/PO (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: sequência de ácido nucleico para o

GDNF humano

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ IDN». 8:

TTCTCTCCCC CACCTCCCGC CTGCCCGCGC A

AAG Lys	ATG Met 1	AAG Lvs	TTA Leu	TGG Trp	GAT Asp 5	GTC Val	GTG Val	GCT Ala
ACC	GCG	TCC	GCC	TTC	CCG	CTG	CCC	GCC
Thr	Ala	Ser	Ala	Phe 20	Pro	Leu	Pro	Ala
CCC	GCC	GAA	GAC	CGC	TCC	CTC	GGC	CGC
Pro	Ala	Glu	Asp 35	Arg	Ser	Leu	Gly	Arg 40

AGC AGT GAC TGTAÀGAACC GTTCC

Ser Ser Asp

GGT Gly	GCC Ala	GCC Ala	GCC Ala	GGA Gly	CGG Arg	GAC TTT Asp Phe	5 5
GTC	TGC	CTG	GTG	CTG	CTC	CAC	103
Val	Cys	Leu	Val	Leu	Leu	His
	10					15
GGT	AAG	AGG	CCT	CCC	GAG	GCG	151
Gly	Lys	Arg	Pro	Pro	Glu	Ala
25					30
CGC	CGC	GCG	CCC	TTC	GCG	CTG	199
Arg	Arg	Al a	Pro	Phe	Ala	Leu
				45
							223

(9) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N^e. 9:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: ligador (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ IDN^a. 9:

CCCGAATTCG GG (10) INFORMAÇÃO PARA SEQ IDN. 10:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 7 resíduos de aminoácido

-94(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 10:

374

SYN225/PO (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear

Pro Asp Lys Gin Ala Ala Ala (11) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°.ll:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: sequência do ácido nucleico do pBluescript SK-76.1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N». 11:

GAG AGG AAC CGG CAA GCT GCW GMW GYM WGM CCW 3 3 (12) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N. 12:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácido (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID Ν’. 12:

Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Ser Pro (13) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°. 13:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

-95CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: oligonucleótido DHD-26 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: N nas posições inosina (ix)

374

SYN225/PO

e 12 são (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^B . 13:

ARRTTYTTNA RNATYTTRTC 20 (14) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N^B . 14:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 7 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°. 14:

Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu (15) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N». 15:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D.) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: oligonucleótido iniciador PD1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID Ν’. 15:

GACGGGACTC TAAGATG (16) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N^B. 16:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples

	74 374 SYN225/PO	-96-
		(D) TOPOLOGIA: linear

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: oligonucleótido iniciador DHD23 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: N nas posições 3, 6 e 18 é inosina (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a. 16:

GCNGCNGCYT GYTTRTCNGG (17) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N». 17:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: oligonucleótido iniciador LF2 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^e. 17:

CGAGACAATG TACGACA (18) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°. 18:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: oligonucleótido iniciador PD2 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N. 18:

CTCTGGAGCC AGGGTCA

374

SYN225/PO

(19) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N^D. 19:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: oliginucleótido iniciador PD1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N«. 19:

CCCGAATTCG ACGGGACTCT AAGATG 26 (20) INFORMAÇÃO PARA SEQ IDN’. 20:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: oligonucleótido iniciador LFA (xi) DESCRIÇÃO.DA SEQUÊNCIA: SEQ ID Ν’. 20:

CGGTGGCCAG AGGGAGTGGT CTTC 24 (21) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N⁸ . 21:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 46 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: oligonucleótido iniciador PD3

X;\

ΊΑ 374

SYN225/PO

-98(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N^a. 21:

CGCGGATCCA ATAAGGAGGA AAAAAAATGT CACCAGATAA ACAAAT (22) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N^a. 22:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: oligonucleótido iniciador (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° . 22:

CGCGGTACCC AGTCTCTGGA GCCGGA 26 (23) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N^a. 23:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: fragmento adaptador para o pCJl (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° . 23:

GATCTAGAAT TGTCATGTTT GACAGCTTAT CAT (24) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N^a. 24:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 37 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla

Claims (3)

1. Reivindicações

   1 - Proteína neurotrófica caracterizada por compreender uma sequência de aminoácidos tal como apresentada nas sequências seguintes

   Ser Pro Aso Lys Gin 5 Ala A â .Al a Leu Pro 10 2^ Arg Glu Arg Asn 15 Arg Gin Ala Ala Ala 20 Ala Ser Pto Glu As n 2 5 Ser Arg Gly Lys Gly 2C‘ Arg Arg Gly Gin Arg 35 Gly Lys Asn Arg Gly 40 Cys Vai Leu Thr Ala le 4 5 His Leu Asn Vai 50 Thr Asp Leu Gly Leu 5 5 Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu 50 Leu 1 e Phe Arg 5 5 Tyr Cys Ser Gly 70 Ser cys Glu A_ a Al a Glu Thr M e r Tyr Asp 30 Lys lie Leu Lys Asn 85 Leu Ser Arg Ser Arg 90 Λ ——- Leu Thr Ser Asp 95 Lys Vai G1y Gin Ala 100 Cys Cys Arg Pro /al· 10 5 Ala Phe Asp Asp Asp 110 Leu Ser Phe Leu Asp 115 Asp Ser Leu Vai Tyr 120 His T 1 o Leu Arg Lys His 125 Ser Ala Lys Arg 130 Cys Gly Cys Lie

   (SEQ.

   ID NO:4)

   Ser Pro Asp Lys Glr. 5 Me· Ala Val Gin Ala Ala Ala 20 Ala As n Pro Glu Gly Gin Arg 35 Gly Lys Asn Arg Gly 40 Asn Val 50 Thr Asp Leu Gly Leu 5 5 Gly Phe 5 5 Arg Tyr Cys Ser Gly 70 Ser Cys Lys Ile Leu Lys Asn 85 Leu Ser Arg Val Gly Gin Ala 100 Cys Cys Arg Pro Phe Leu Aso 115 Asp Asn Leu Val Tyr 120 Lys Arg 130 cys Gly Cys lie

   Leu Pro 10 Arg Arg u_U Arg As n Arg Asn 25 Ser Arg Gly Lys Gly 30 .n rg Arg Cys Val Leu Thr A-a 4 5 Ile Γ. IS Leu Tyr Glu ^hr Lvs 60 Glu Glu Leu Ile Asp Ala Ala 75 Glu Thr Thr Tyr Asp 30 Asn Arg 90 Arg Leu Val Ser As? 9 5 Lys Ile 105 A — a Phe Asp Asp Asp 110 Leu Ser His Ile Leu Arg Lys 12 5 His Ser Ala

   (SEQ. ID. NO:6)

   74 374

   SYN225/PO

   101 ou uma proteína biologicamente equivalente com um grau de homologia superior a 70% ccm as sequências acima referidas.
2. 2 - Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a sequência de aminoácidos ter uma homologia

   superior a 80% com NO:4 e SEQ. ID NO:6 as sequências apresentadas na estabelecidas nas SEQ. reivindicação 1. τ n 3 Proteína de acordo com a reivindicação Ί — / caracterizada por compreender a sequência de aminoáci .dos estabel ecida na SEQ. ID NO:6, apresentada na reivindicação /1 Proteína de acordo com as reivindicações 1 a 3/

   caracterizada por ser glicosilada.

   5 - Proteína de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizada por ser r.ão-glicosilada.

   6 - Proteína de acordo com as reivindicações 1 a 3 ou 5, caracterizada por a sequência de aminoácidos ter um resíduo metionina no terminal amino.

   Proteína de acordo com as reivindicações caracterizada por ser produzida por tecnologia recombinante.

   8 - Proteína de caracterizada por ser porções poliméricas.

   acordo com modi ficada as reivindicações 1 a 7, por ligação de uma ou mais de acordo polimérica ser polietilenoglicol com a reivindicação
3. 3,

   Sequência de codificar uma proteína qualquer das reivindicações 1 a 6.

   ácido núcleico neurotrófica tal por em caracterizada por

   74 374

   SYN225/PO

   102 (a) uma sequência tal como apresentada a seguir (SEQ.

   ID NO:3 ou 5) codificando o factor neurotrófico derivado de uma linha de células gliais.

   CCCCCGGGCT GCAGGAATTC GGGG GTC Vai TAC GGA Tyr Gly GAC Asp -9Ò CGG Arg ATC Ile CGA Arg GGT GCC GCC □ 4 Gly Ala Ala -8 5 GCC C-GA CGG GAC TCT AAG ATG AAG TTA TGG GAT GTC GTG GCT GTC TGC 92 Al â Gly Arg Asp Ser Lys Met Lys Leu Trp Asp Vai Vai Ala Vai Cys -80 -7 5 -70 CTG GTG TTG CTG CAC ACC GCG TCT GCC TTC CCG CTG CCC GCC GGT AAG 140 Leu Vai Leu Leu His Thr Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys -6 5 -60 -55 AGG CTT CTC GAA GCG CCC GCC GAA GAC CAC TCC CTC GGC CAC CGC CG 138 Arg Leu Leu Glu Ala Pro Ala Glu Asp His Ser Leu Gly His Arg Arg -50 -4 5 -40 GTG CCC TTC GCG CTG ACC AGT GAC TCC .AAT ATG CCC GAA GAT TAT CCT 236 Vai Pro Phe Ala Leu Thr Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu As p Tyr Pro -35 -30 -2 5 -20 GA.C CAG -pmrr GAT j _ C A — G GAT TTT ATT CAA uu — ATC AAA AGA 234 Asp z- 1 — «J 3. . . Phe Asp Aso Vai Met Asp Dho ”'o Gin Ala Thr I Le Lys Arg -15 -10 - 5 CTG AAA AGG TCA CCA GAT AAA CAA G^-G GCG GCA CTT CCT CGA AGA GAG 332 Leu Lys Arg Ser Pro Asp Lys Gin A _ a A j. a Al a Leu Pro Arg Arg Glu T. 5 10 AGvu AAC GG CAA GCT GCA GCT GCC AGC CCA GAG AAT AC-A GGG AAA 33C Arg As — Arg Gin A _ a A _ a A — a Ala Ser Pro u 1'J Asn Ser Arg G j.'<* Lys 1 = 2 0 2 5 GGT CGC AGA GGC CAG AGu u-GC AAA AAT CGG GGG TGC GTC TTA ACT GCA 4 2 3 Gly Arg Arg Gly G * r. Arg G r y Lys Asn Arg Gly Cys Vai Leu —'U >. u — Ala 3Ò 3 5 40 *t 3 ATA CAC TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT TTG GGC TAC GAA ACC AAG GAG 4 7o 2 L s — r s Leu Asn Vai Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tv r Glu Thr Lys Glu 50 55 60 GAA CTG ATC TTT CGA TAT TGT AGC GGT TCC TGT GAA GCG GCC GAG ACA 5 2 4 Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Glu Ala Ala Glu 'Π’ 6 5 70 7 5 ATG TAC GAC AAA ATACTA AAA AAT CTG TCT CGA AGT AGA AGG ( CTA ACA 572 Met Tyr Asp Lvs Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr 80 85 90 AGT GAC AAG GTA GGC CAG GCA TGT TGC AGG CCG GTC GCC GAC GAC 62C Ser Asp Lys Vai G r y Gin A.i<a Cys Cys Arg Pro Vai Ala Phe Asp Asp 95 100 105 GAC CTG TCG TTT TTA GAC GAC AGC CTG GTT TAC CAT ATC CTA AGA AAG 6 66 Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Ser Leu Vai Tyr .1X s lie Leu Arg Lys 110 .2.3 120 125 CAT TCC GCT AAA G<j TG 2 GGA -ir’” X kj Λ ATC TGA CCCTGGCTCC AC-AGACTGí «•Ή v X 713 His Ser Ala Lys Arg Cys Gly cys Ile

   130

   103

   ΊΑ 3 74

   SYN225/PO

   GTGTATTGCA TTCCTGCTAC ACTGCGAAC-A AAGGGACCAA GGTTCCCAGG AAATATTTGC 773 C A G AAA G G A AGATAAC-GAC C AA G AA G G C A GAGGCAGAGG CGG AAGAA.GA AGAAGAAAAG 333 AAu-oACGAAG GCAGCCATCT G T G G λ G C G 'V C-TAGAAGGAG GCCCAGCTAC AG 390

   (SEQ. ID. NO :3)

   ATTTTCTCTT TTCTTTTTGA ACAGCA AAT ATG CGA GAG GAT TAT CCT GAT CAG Asn Met. Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gin

   GAT Asp GAT Asp GTC Vai ATG Met GAT Asp Phe ATT ;ia CAA G1 n GCC Ala ACC Thr Ile AAA Lys AGA Arg CTG Leu AAA Lys 101 AGG TCA CCA GAT AAA CAA ATG GCA GTG CTT CCT AGA GAG AAT 149 Arg Ser Pro Asp Lys Gin Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn 1 5 10 15 CGG CAG ,*«· Z^rr? i. GCA GCT Aa<- «—k» Λ GAG AAT TCC AGA ÍJVJ A AAA GGT CGG 19-7 Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn ?ro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg 20 25 30 AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAC CGG GGT TGT GTC TTA ACT GCA ATA CAT 245 Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn A” Gly Cys Vai Leu Thr Ala Ile His 35 40 4 5 TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT CTG GGC TAT GAA ACC AAG GAG GAA CTG 293 Teu Asn Vai *P H y* Aso Leu G1 y Leu Gly Tyr -ru »- Lys Glu Glu Leu 5 0 5 2 60 ATT TTT AGG TAC t.— — AC-C '^rC' TGC GAT GCA «--m GAG ACA ACG TAC 34 1 T ' Λ ?r.e Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Lj — U Thr Th Tvr 6 5 70 75 GAC AAA ATA TTG AAA AAC λ TCC AGA AAT AGA AGG CTG GTG ACT GAC 339 Asp Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Vai Ser Asp 3 0 3 5 90 9 5 AAA GTA GGG CAG GCA TGT TGC AGA CCC ATC GCC £Ί^ι<1' GAT GAT GAC CTG 437 Lys Vai Glv Gin Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala ?he Asp Asp Asp Leu 100 105 11Ò TCG TTT TTA GAT GAT AAC CTG kj i. - TAC CAT ATT CTA AGA AAG CAT TCC 435 Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Vai Tyv» His Ile Leu Arg Lys His Ser 115 120 125 GCT AAA AGG rT*Q<-n GGA TGT ATC TGA CTC: 2GGCTCC AGAGí _lCTGCT GTGTATTGCA 539 Ale Lys Arg Cys Gly Cys Ile

   130

   TTCCTGCTAC AGTGCAAAGA AAG

   562 (SEQ. ID. NO:5)

   74 374

   SYN225/PO

   104 (b) uma combinação das sequências SEQ. ID. NO: 5 apresentada anteriormente e SEQ. ID. NO: 8 apresentada em seguida, codificando uma forma pre-pro humana de comprimento total do factor neurotrófico derivado de uma linha de células gliais;

   AAG Lys ATG Mec AAG Lys TTA Leu TGG -r Ur AT Asp 5 GTC Val· val GCT Ala GTC val TGC Cys io CTG Leu GTG Val CTG Leu Leu cÀC ?ÍLS 15 10 3 ACC <— kJX-xJ TCC GCC rprpo CTG CCC GGT AAG AC-G CCT CCC GAG uCG 151 Thr Ala Ser Ala Phe Prc Leu Pro Ala Gly Lys X Pro Pro Glu Au a 20 25* 30 CCC GCC GAA GAC CGC TCC C^C GGC CGC CGC CGC CCC TTC GCG 199 ?ro Ala Gin Asp Ar? Ser Leu Gly Ar? Ar? Ar? Au a Pro Phe A_a Leu 35' 40 4 5

   AGC AGT GAC TGTAAGAACC GTTCC

   Ser Ser Asp (SEQ. ID. NO:8) (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que aumenta a absorção de dopamina em neurónios dopaminérgicos, em que à referida sequência de aminoácidos é reconhecida por um anticorpo que se liga a uma porção das sequências estabelecidas nas sequências apresentadas na reivindicação 1 (SEQ. ID NO:4 ou SEQ. ID NO:6); ou (d) uma sequência de ácido nucleico que (1) híbrida com a sequência complementar de (a) , (b) ou (c) e (2) codifica uma sequência de aminoácidos que aumenta a absorção de dopamina em neurónios dopaminérgicos.

   12 - Vector caracterizado por compreender elementos reguladores da expressão operativamence ligados a uma sequência de ácido nucleico de acordo com as reivindicações 10 ou 11 .

   74 374

   SYN225/PO

   13 - Célula hospedeira ou transfectada com o vector da reivindicação 12.

   14 - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por ser seleccionaàa do grupo constituído por células de mamífero e microrganismos.

   15 - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por ser uma célula COS-7 ou uma célula de E. coli .

   16 - Célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizada por ser adequada para implantação humana e por expressar e segregar factor neurotrófico derivado de uma linha de células gliais.

   17 - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por ser transformada ou transfectada ex vivo.

   13 - Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada por estar encerrada numa membrana semipermeável adequada para implantação humana.

   19 - Célula hospedeira, caracterizada por ser transformada ou transfeccada para expressar a proceína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6. (gene therapy/homologous recombination)

   20 - Método para a produção de um factor neurotrófico derivado de uma linha de células gliais, caracterizado por compreender os passos de .

   (a) cultura de uma célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15;

   (b) manutenção da referida célula hospedeira sob condições adequadas para a expressão de factor neurotrófico derivado de uma linha de células gliais pela referida célula hospedeira; e (c) opcionalmente, isolamento do factor neurotrófico derivado de uma linha de células gliais expresso pela

   74 374

   SYN225/PO

   106 referida célula hospedeira.

   21 - Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por compreender ainda o passo de redobragem do factor neurotrófico derivado ds uma linha de células gliais, isolado.

   22 - Factor neurotrófico derivado de uma linha de células gliais substancialmente purificado, caracterizado por ser preparado de acordo com o método das reivindicações 20 ou 21.

   23 - Composição farmacêutica, caracterizada por compreender uma proteína neurotrófica de acordo com oualcuer uma das reivindicações 1 a 9 e 22, ou produzida de acordo com as reivindicações 21 ou 22.

   24 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 23, caracterizada por ser para utilização na prevenção ou tratamento de lesões ou doenças de células nervosas, ou do funcionamento impróprio de células nervosas.

   25 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por ser para utilização na prevenção ou tratamento da doença de Parkinson.

   26 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por ser para utilização na prevenção ou tratamento da doença de Alzheimer.

   27 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por ser para utilização na prevenção ou tratamento da esclerose amiotrófica lateral.

   28 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por ser para utilização na prevenção ou tratamento de lesão ou doença de células nervosas devido a lesão física, isquémia, exposição a neurotoxinas, doenças metabólicas crónicas ou doença neurodegenerativa.

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   SYN225/PO

   107

   29 - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 28 caracterizada por ser para utilização no tratamento de lesão de células nervosas devido a choque, polineuropatia diabética ou neuropacia tóxica causada por um agente terapêutico.

   30 Anticorpo caraccerizado por ligar a proteína neurotróf ica de accrdo ccm qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou 22. 31 .Anticorpo de acordo com a reivindicação 30,

   caracterizado por ser um anticorpo monoclonal.

   32 - Anticorpo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por ser um anticorpo policlonal.

   33 - Dispositivo para o tratamento de uma lesão nervosa, caracterizado por compreender:

   (a) uma membrana semipermeável adequada para implantação,· e (b) células encapsuladas dentro da referida membrana, em que as referidas células segregam um factor neurotrófico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e 22;

   sendo a referida membrana permeável ao factor neurotrófico e impermeável a materiais prejudiciais para as referidas células.

   34 - Dispositivo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por as referidas células serem células de ocorrência natural que segregam o referido factor neurotrófico. 35 - Dispositivo de acordo com a reivindicação 33,

   caracterizado por as referidas células terem sido modificadas para segregar o referido factor neurotrófico por meio de uma