JPH06500016A - キメラ神経栄養因子 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、得られるキメラ分子が神経栄養活性をもつように、天然因子の一部分
と、少なくとも1つのその他の分子の一部分とからなるキメラ神経栄養因子に関
する。本発明は、部分的には、2つの異なる神経栄養因子の部分からなるキメラ
分子が実質的に完全な生物活性を保持し、また少なくともいくつかの場合におい
ては、単一の分子が両方の親分子の活性を有するような神経栄養活性の独特の領
域をもつ、という発見に基づく。
体内のある種の細胞は、メツセンジャーとして作用して他の細胞と連絡しあい、
これによって生物的機能を調整するサイトカインと呼ばれる因子を生産すること
ができる。例えばリンパ球は、免疫系の各種成分と相互作用して免疫応答を有効
に統合する因子であるリンホカインを生産する。神経栄養因子は神経系の成分の
生存および/または分化を促進することができるサイトカインである。
細胞間メツセンジャーとして、サイトカインは通常サイトカイン受容体分子を介
して特定の細胞集団と相互作用する。したがって、サイトカインは特定の受容体
保持細胞を標的とする。サイトカインは、サイトカインを毒性物質と結合するこ
とによって毒性物質を細胞集団に送達するのに用いられることが示されていた。
例えば、Siegallら(1989,Fed、A+n、 Soc、 Exp、
Biol、 3:2847−2652)はサイトカイン形質転換成長因子アル
ファをコードするcDNAを、細胞認識ドメインを欠くシュードモナス外毒素(
Pseudmonas exotoxin)Aの修飾形をコードする遺伝子の5
°末端と融合した。得られたキメラ分子を大腸菌(Escherichia c
oli)中で発現させ、単離したところ、上皮増殖因子受容体を特異的に表す細
胞にとって極めて細胞障害性であることが見いだされた。Ogataら(198
9゜Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 U、S、A、86:42
15−4219)は、シュードモナス外毒素(P E)の結合細胞ドメインをマ
ウスリンホカイン・インターロイキン4 (IL−4)で置き換えた組換えキメ
ラ毒素を作成したところ、キメラタンパク質IL−4−PE40はマウスIL−
4受容体保持細胞系にとって細胞障害性であることが見いだされた。Banke
rら(1989,J、 Ce1l Physiol、 139:5l−57)は
、上皮成長因子−リシンA鎖キメラを記載する。Williamsら(1987
,Protein Bng、 1:493−498)は、ジフテリア毒素受容体
結合ドメインを、インターロイキン2 (IL−2)と翻訳停止シグナルをコー
ドする合成遺伝子で置き換えた。ジフテリア毒素/IL−2融合タンパク質はI
L−2受容体保持細胞中のタンパク質合成を選択的に阻害するが、IL−2受容
体を発現しない細胞系は毒素作用に耐性であることが分かった。
その他の研究者もサイトカイン遺伝子とバクテリア遺伝子の少なくとも一部から
なる組換えDNA分子を構築した。Dicouら(1989,J、 Neuro
sci、 Res、 22:13−19)は、完全なマウスプレプロ神経成長因
子DNAを、大腸菌のベーターガラクトシダーゼ遺伝子のカルボキシル末端と融
合し、またヒト神経成長因子遺伝子のコドン11から106に対応するゲノムD
NA断片を、ベーターガラクトシダーゼのアミノ末端の第5コドンと融合した。
どちらのバクテリアベクターも大量のキメラタンパク質の発現に関与していた。
バクテリア細胞の溶菌後はキメラマウスプレプロ神経成長因子の大半は不溶性と
なるように思われたが、ヒトキメラベータ神経成長因子の大部分は上清中に存在
するように思われた。
神経栄養活性は報告されていない。
最近の研究において、Ibanezら(1990,EMBOJ、 9+1477
−1483)は部位特異的突然変異誘発によって改変した神経成長因子の研究を
記載する。Xieら(1990,Proc、 Natl、 Acad、 Sci
。
U、S、A、 87:3180−3184)は、アヘン剤受容体の研究において
キメラオピオイドペプチドの使用を記載する。Rayら(1990,Mol。
Bndocrinol、 102:101)は、ゲノムエキランの交換から得ら
れる成長ホルモン特異性の受容体結合特異性における改変を議論している。Cu
nn i nghamら(1990,5cience 247:1330)は、
成長ホルモン受容体と結合することのできない突然変異ホルモンを同定するため
に、成長ホルモンの部分を系統的に置換した。Cunn i nghamら(1
990,5cience 247:1461)は、観察されたプロラクチンの部
分特異的突然変異誘発を関連づけて、成長ホルモン受容体に結合することのでき
るプロラクチン変異体を作成した。
2.2.神経栄養因子
神経系の発生と維持は神経栄養因子として知られるタンパク質に依存する。広範
な神経細胞死は中枢および末梢神経系の正常な発生を伴い、一定の標的領域に突
出するニューロンの数を制御する(Berg、 D、 K、、 1982. N
euronal Development 297−331)o発生途中での末
梢標的組織の切除および移植研究によって、その突出領域において生産される限
られた量の生存因子(″神経栄養因子″)に対してニューロンが競合する結果、
神経細胞死がおきることが示された。今までに同定された4つの重要な神経栄養
因子とは、神経成長因子(nerve growth factor:NGF
; Levi−Montalcini and Angeletti、 196
8. Phys、 Rev、 48:534) ;ニューロトロフィン−3(n
eurotrophin−3: NT −3; Hohn et al、、 1
990. Nature 344:339; Maisonpjerre et
al、、 1990.5cience 247:1446);脳由来神経栄養
因子(brain−derived neurotrophic fac t
o r : BDNF ;Barde et al、、 1982. EMBO
J、 1:549)、および毛様体神経栄養因子(ciliary neuro
trophic factor:CNTF;Linetal、、1979,5c
ience246:1023)である。
2、 2. 1.神経成長因子
神経成長因子(NGF)はこれらの神経栄養分子のうちで最もよく解明されたも
のであり、ヒナとラットの発生初期における交感神経および神経稜由来の知覚ニ
ューロンの生存にとって、1nvitroおよびin vivoの両方で不可欠
であることが示された(Levi−Montalcini and Angel
etti、 1963. Develop、 Biol、 7:653−659
; Levi−Montalcini et al、、 1968. Phys
iol、 Rev。
48 :524−569)。発生中のヒナ胚に精製NGFを注射すると、を髄知
覚ニューロンおよび交感神経ニューロンの生存性と肥大化の増加をもたらすこと
が見いだされた(Levi−Montalcini hnd Booker、1
960. Proc、Natl、 Acad、 Sci、 U、S、A、 46
:373−384; Hamburger et al、、 1981. J、
Neurosci、 1:6O−71)。逆に新生児ラットに毎日抗NGF抗
体を注射することによって、内在性NGFを除去または隔離することが交感神経
系の事実上の破壊と関連する(Levi−Montalcini and Bo
oker、 1960. Proc、 Na1t、 Acad、 Sci、 4
6:384−391; Levi−Montalcini and Angel
etti、 1966、 Pharmacol、 Rev、 18:619−6
28)。子宮内での抗体注射によるか、あるいは母親の抗体の受動的経胎盤移入
によって、たとえ発生の初期にでもNGF抗体にさらされると、を髄および背面
内側の三叉神経知覚ニューロンのような神経稜由来の知覚ニューロンの実質的欠
失をもたらすことが示された(Goedert et al、、 1984.
Proc、 Natl、 Acad、 Sei、 U、S、A、 81:158
0−1584; Gorin and Johnson、 1979. Pr。
c、 Natl、 Acad、 Sci、 U、S、A、 76:5382−5
386)。最近に至るまで、NGFのほとんど全ての研究は末梢神経系における
その役割に的を絞って来たが、NGFは中枢神経系における特定のニューロン集
団の発生と維持にも影響を及ぼすように思われる(Thoemen etal、
、 1987. Rev、 Physiol、 Bjochem、 Pharm
acol、 109:145−178;Whittemore and Sei
ger、 1987. Brain Res、 Rev、 12:439−46
4)。
マウス下顎腺における大量のNGFタンパク質のおかげで比較的慣用的なタンパ
ク質化学手法によって一次配列が決定された(Angeletti and B
radshaw、 1971. Proc、 Natl、 Acad、 Sci
、 68:2417−2420)。適当なオリゴヌクレオチドプローブをデザイ
ンするためのマウスNGFのタンパク質配列の利用可能性に基づく実質的には慣
用的分子生物学を用いて、NGF遺伝子は今や多くの種、例えばマウス(Sco
tt et al、、 1983. Nature 302:538−540)
、ヒト(Uilrich et al、、 1983. Nature 303
:821−825)、ウシおよびヒナ(Meier et al、、 1986
. EMBOJ、 5:1489−1493)、ならびにラット(Whitte
more et al、、 1988. J、 Neurosci、 Res、
、 20:402−410)からクローニングされている。大量のNGFが入手
できるようになったことは、NGF受容体についての研究をもおおいに容易なも
のとし、ついにはヒトおよびラットからのNGF受容体の1成分の分子クローニ
ングに至った(Johnson et al、、 1986. Ce11、47
:545−554; Radeke et al、、 1987. Natur
e 325:593−597)。
NGFは偏在する神経栄養因子ではないことが今や確立されている。in vi
troおよびin vivoの研究から決定されたように、末梢神経系において
は、NGFは副交感神経ニューロン、神経板由来知覚ニューロンまたは腸ニュー
ロンに対する生存因子ではないように思われる。さらにNGFは発生期の運動ニ
ューロンに対する生存因子でもないように思われる(Oppenheim。
1982、 J、 Comp、 Neural、 210:174−189)。
もつとも、これらのニューロンは発生中のNGF受容体の少なくとも低親和性種
を発現すると思われる(Raivich et al、、 1985. EMB
OJ、 4:637−644)。
これらのタイプのニューロンに対するNGFの影響の欠如が神経栄養因子、特に
を髄運動ニューロンおよび/または毛様体神経節の副交感神経ニューロンの生存
性を支えるような因子の探索を促進した。
2、 2. 2.脳由来神経栄養因子
in VitrOでヒナ胚のを髄神経節ニューロンの生存性を保持することので
きる神経栄養活性が、う・ソトC−6グリオーマ細胞を培養しておいた”ならし
培地”中で同定された(Barde etal、、 1978. Nature
274:818)。この活性はマウスNGFに対する抗体によっては中和され
ず、このことはならし培地中に他の神経栄養因子の存在することを示唆する。N
GF抗体によって阻害されない同様の活性が次いで正常成人ラット脳天グリア細
胞の培養(Lindsay、 1979. Nature 282:80−82
; Lindsay et al、、 1982゜Brain Res、 24
3:329−343)および発生期と成人ラット脳ノ抽出物(Barde et
al、、 1980. Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 U
、S、A、 77:1199−1203)ならびに発生期と成熟ヒナを髄(Li
ndsay and Peters。
1984、 Neurosci、 12:45−51)中に報告された。しかし
ながら、いずれの場合にも活性因子は単離も同定もされず、これらの観察された
活性が同じ因子によるのか、異なる因子によるのかは疑問のままである。
ブタ脳を出発材料として用いて、Bardeら(1982,EMBOJ、 1:
549−553)は、現在脳由来神経栄養因子(BDNF)と呼ばれる、EIO
/Ellヒナ胚からのを髄神経節ニューロンの生存性を促進すると思われる因子
を報告した。神経栄養活性は、ドデシル硫酸ナトリウム(S D S)ゲル電気
泳動で12.3kDの分子量の単一バンドとなるきわめて塩基性のタンパク質(
等電点pI:10.1)中に存在することが見いだされた。BDNFの高塩基的
性質および分子サイズがNGFモノマーにきわめてよく似ていることが注目され
る。
BDNF遺伝子のクローニングは1989年8月30日出願の米国特許出願5e
rial Number 07/400,591 (本明細書に参照として包含
される)に記載の方法で最初に実施された。簡単に説明すると、微量のBDNF
タンパク質をブタ脳から精製して、アミノ酸配列の断片を決定し、次いでこれを
用いて対応するオリゴヌクレオチドをデザインした。次にこれらの合成オリゴヌ
クレオチドを、BDNF生産細胞から調製したcDNA鋳型を用いるポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR)のプライマーとして用いた。PCRの産物をプローブとし
て用いて、ヒト、ブタ、ラットおよびマウスを含む多くの種からの完全長cDN
Aおよび/またはゲノムBDNF遺伝子のクローニングが可能となり、これら遺
伝子の配列が決定された。組換えBDNFの発現はCO8細胞で実施した。NG
Fとは異なるBDNFの神経特異性を最初に示したのは、in vitroで精
製BDNFが、E6、E9またはE12のヒナ胚の神経板由来の節状神経節から
解離した知覚ニューロンの40−50%の生存を支持することを示したことであ
った(Lindsay et al、、 1985. J、 Ce11. Sc
i、 5upp、 3:115−129)。NGFはそれ自体またはBDNFと
共に、これらニューロンに明確な影響を与えなかった。BDNFが、生存ならび
に錐体、膠状および腹側外側三叉神経節を含むその他の神経板由来の知覚神経節
(これらのいずれも今までにNGFに対して反応性であるとはわかっていなかっ
た)からの神経突起伸出を支持することが、後になって移植片培養の研究で示さ
れた(Davies et al、、 1986. J、 Neurosci、
6:1897−1904)、上記研究の全てにおいて、NGFに対する中和抗
体は観察されたBDNF活性に何ら影響を与えなかった。末梢神経節からの培養
ニューロンに対する影響に加えて、BDNFはウズラ神経稜からの細胞培養物の
生存と神経分化を刺激することが見いだされた(Kalcheim and G
endreau。
1988、 Develop、 Brain Res、 41ニア9−86)。
しかしながら、最近のBDNFに関する2つの研究(Kalcheinet a
l、、 1987. RMBOJ、 6:2871−2873; Hofer
and Barde、 1988゜Nature 331:261−262)は
、鳥類PNS発生におけるBDNFの生理学的役割を示唆してきた。E3/E4
(3日目または4日目の胚)の卵で、発生中のを髄神経節(dorsal r
oot ganglia:DRG)と神経管におけるそのCNS標的との間に障
害物を置くと、多くのDRGニューロンが死んでしまうことが観察された(Ka
loheim and Le Dourarin、 1986. Develo
p、 Bi。
1、116:451−46)。このニューロンの死は、CNS (神経管)由来
の神経栄養因子が奪われたためであったことが推測された。ラミニンコートのシ
アラスティック(s ia las t i c)膜に付けたBDNFがこの細
胞死を防ぐことができる、ことが次いで観察された’(Kalcheim et
al、、 1987. EMBOJ、 6:2871−2873)。発生中の
ウズラの卵にBDNFを注射すると、節状神経節における自然の細胞死を減少す
ることが発見されたが、これはNGFには見られない効果である(Hofer
and Barde、 1988. Nature 331:261−262)
。神経稜および神経板由来の末梢知覚ニューロンに対するその効果に加えて、B
DNFは発生期のCNSニューロンの生存を支持することが見いだされた。Jo
hnsonら(1986,J、 Neurosci、 6:3031−3938
)は、BDNFがE17ラツト胚から培養した網膜神経節細胞の生存を支持する
ことを示唆するデータを提出した。これによって、ならし培地と網膜神経節細胞
の標的領域から調製した脳抽出物がこれらニューロンの生存を支持する、ことを
示した以前の研究をさらに広げた(McCaffery et al、、 19
82゜Ex、 Brain Res、 48:37−386; 5arthy
et al、、 1983. J、 Neurosci、 3:2532−25
44; Turner et al、、 1983. Dew、 Brain
Res、 6:77−83)。
培養状態での発生期のニューロンの生存に対するその効果に加えて、BDNFは
培養成人末梢および中枢神経系ニューロンに対しても効果を有することが示され
た。成人知覚ニューロンは3ないし4週間の間in VitrOで維持するのに
神経栄養因子を必要としないように思われたが、BDNFはNGFと同様、培養
下での成人ラットDRGニューロンからの軸索の再生を刺激することが示された
(Lindsay、 1988. J、 Neurosci、 8:2394−
2405)。
さらに、成人ラット網膜の培養において、BDNFは生存と網膜神経節細胞から
の軸索の伸長との両方を促進することが観察された(Thanos et al
、、1989. Eur、 J、 Neurosci、1:19−26)。さら
↓こ、免疫細胞化学を用いるチロシンヒドロキシラーゼにポジティブな細胞の数
によって測定したところ、BDNFは腹側中脳培養での細胞の生存を長くするこ
とが示された。さらに、BDNFはラット中隔領域から由来の解離細胞培養にお
けるコリン作動性ニューロンの生存を増強する(1989年8月30日出願の米
国特許出願5erial Number 07/400,591)。NGFとB
DNFの生物学的効果の比較を表1に示す。
(本頁以下余白)
表1
成熟BDNFの予測される一次構造の分析によって、NGFとの驚く程の類似性
が明らかになった。最大のマツチングを得るためにはたった3つのギャップをN
GF配列に導入すればよく、各種NGF (ヘビからヒトまで)とBDNFとの
間に51の同一性があった。この同一性のうちには6つのシスティン残基が含ま
れることは重要である。
2.2.3.ニューロトロフィン−3
−NGFとBDNFとの間の顕著な類似性は、両者が密接に関連する神経栄養分
子の大きな族の一員であることを示唆する。相同領域を用いてBDNF/NGF
遺伝子族の新しい構成員を同定するためのポリメラーゼ連鎖反応用オリゴヌクレ
オチドプライマーを作成する際に、二二一口トロフィン−3と命名されるこの族
の別の構成員が発見され、NT−3遺伝子をマウス、ラットおよびヒトからクロ
ーニングした(1990年3月7日出願の米国特許出願5erial No、0
7/490,004参照、なお該特許は参照としてその全てを本明細書に包含さ
れる)。119アミノ酸からなり、約9.5のpIと推定される成熟マウスNT
−3タンパク質の全体の構造はNGFおよびBDNFで確立された構造に類似す
ることがわかった。18アミノ酸(そのうちのそれぞれ5および9アミノ酸がB
DNFおよびNGFと同一である)からなる推定のシグナル配列に、121アミ
ノ酸のプロ配列(マウスNGFでの103アミノ酸のプロ配列およびマウスBD
NFでは112アミノ酸のプロ配列と比較されたい)が続くと思われる。成熟マ
ウスNGF、BDNFおよびNT−3の比較から、54アミノ酸の同一性が明ら
かとなった(図1)。NGFおよびBDNFではジスルフィド架橋の形成に関与
することが知られている(Leibrock et al、、 1989. N
ature 341:149−152; Angeletti、 1973、
Biochem、 12:100−115) 6つのシスティン全てが保存残基
にある。同様に、成熟ラットNT−3はラットNGFとは57%のアミノ酸相同
性を有し、ラットBDNFとは58%の相同性を有しており、120残基のうち
の57(48%)がこれら3つのタンパク質の全てに共通である(図ID)。ま
た、ラットNGFおよびBDNFの6つのシスティン残基はラットNT−3にお
いても完全に保存されており、3つのタンパク質の間で最も相同な領域はこれら
システィン残基のクラスター周囲に集まっている。
棟内のNT−3、NGFおよびBDNFの相同性に加えて、ラットとヒトNT−
3の間には成熟ポリペプチド(119アミノ酸)をコードする領域での核酸配列
に高度の保存が見られた。ヒトおよびラット遺伝子はDNA配列で約92%の相
同性であることが見いだされた。しかしながら、この領域でのヒトとラットの間
のヌクレオチド配列における相違はいずれもアミノ酸置換には至らず、すなわち
成熟ラットおよびヒト(マウスNT−3でも同様)の推定されるアミノ酸配列は
全く同一であり、ラット、マウス、ヒトおよびブタの成熟ポリペプチドのアミノ
酸配列に完全な同一性を示すBDNFの高度の保存を暗示するものである。これ
とは対照的に、成熟ヒトNGFおよびげっし類NGF (マウスまたはラット)
のアミノ酸配列は約lO%異なる。
NT−3の神経栄養活性に関する研究は、NT−3が培養下での解離を髄神経節
ニューロンの神経突起の生存と伸出を促進することができることを示唆している
。さらに、NT−3は節状神経節および交感神経神経節の両方の移植片培養から
の神経突起の伸出を促進するのが見られたが、BDNFは節状神経節からの伸出
は促進したが、交感神経神経節からの伸出は促進せず、NGFは交感神経神経節
からの伸出は促進したが、節状神経節移植片がらの伸出は促進しなかった。した
がって、NT−3はBDNFまたはNGFよりも広い特異的活性をもつと思われ
る。
NT−3は神経系の発生に重要であるかもしれない。新生児と成人マウスの脳中
のNGF、BDNFおよびNT−3転写物の相対量を比較すると、新生児脳のN
T−3レベルは成人脳でのレベルよりも高いことがわかった。中枢神経系におけ
るNT−3RNAレベルは胎児発生期にきわめて高く、次いで成人レベルへと減
少することが見られた。
2、 2. 4.毛様体神経栄養因子
毛様体神経栄養因子(CNTF)は、胚状ヒナの毛様神経節(ciliary
ganglion:CG)=ニー0ンが1nvitroで生存するのを特異的に
促進するタンパク質である(MOnthOrpe etal、、 1980.
J、 Neurochem、 34:69−75) o毛様神経節は解剖学的に
は眼窩洞内に位置し、側方直筋と視神経の鞘との間にあり、毛様筋および瞳孔括
約筋を刺激する眼球運動神経から副交換神経繊維を受け取る。
毛様神経節ニューロンは、一定期間での細胞死を示す神経細胞集団に属すること
が見いだされた。ヒナ毛様神経節においては、8日胚(embryonic d
ay 8:E8)で存在するニューロンのうちの半数がE14までに死ぬことが
観察された(Landmesser and Pillar、 1974. J
、 Physiol、 241ニア5l−736) 。この同じ期間内で毛様神
経節ニューロンはその標的組織、すなわち毛様体および眼の脈絡膜との関係を形
成する。Landme s s er and P i I I a r (1
974,J、 Physiol、 241ニア5l−736)は、細胞死の期間
の前に眼を摘出すると、同側神経節における毛様神経節ニューロンが完全に失わ
れることを観察した。逆に、Narayanan and Narayanan
(1978,J、Embryol、 Ex、 Morphol、 44+53
−70)は、別の眼原基を移植して、これによって使用できる標的組織の数を増
加することによって、毛様神経節ニューロンの細胞死が減少することを観察した
。これらの結果は、毛様神経節ニューロンに作用する神経栄養因子が存在するこ
とと一致する。
培養下では、毛様神経節(CG)ニューロンは生存のための1または複数の因子
を必要としていることが観察された。毛様体神経栄養因子(CNTF)の活性は
ヒナ筋肉細胞ならし培地内(helfand et al、、 1976、 D
ev、 Biol、 50:541−547; He1fand et al、
。
1978、 Exp、 Ce1l Es、 113二39−45; Benne
tt and Nurcombe、 1979、 Brain Res、 17
3:543−548; N15hi and Berg、 1979. Nat
ure 277:232−234; Varon et al、、 1979.
Brain Res、 173:29−45 ) ;筋肉抽出物内(McLe
nnan and Hendry、 1978. Neurosci、 Let
t、工0:269−273; Bonahandy et al、、 1980
. Neurosci、 Lett、 18:l97−201):ヒナ胚抽出物
内(Varon et al、、 1979. Brain Res、 173
:29−45; Tuttle et al、、 1980. Brain R
es、 183:161−180) 、および心臓細胞でならした培地内で同定
された(議論のためには、さらにAdler et at、、1979.5ci
ence 204:1434−1436およびRarbjnet al、、 1
984. J、 Neurochem、 43:1468−1478参照)。
CNTFがラット座骨神経から精製され、各種断片のアミノ酸配列が気相微量配
列決定法によって決定され、得られたアミノ酸配列をポリメラーゼ連鎖反応に基
づくクローニング法によるラン1−CNTF遺伝子のクローニングに用いた(1
989年9月15日出願の米国特許出願5erial No、07/408,1
72および1989年10月31日出願の米国特許出願5erial No、0
7/429,517:これらは参照としてその全てを本明細書に包含する)。次
いでラットCNTFプローブを用いてヒトCNTF遺伝子をクローニングした。
ヒトとラットのCNTF遺伝子の核酸配列を比較すると、ヒト遺伝子はラットC
NTF遺伝子と同じ位置に単一のイントロンを有することを示唆した。このイン
トロン中では、コード領域での実質的保存とはきわめて対照的に、ヒト配列はラ
ットとはかなり分岐したように思われる。
ヌクレオチド配列に基づいて、CNTFは約22.8KDの分子量をもつと予測
され(約200アミノ酸の大きさと予測して計算)、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動分析からの天然CNTFの予測値(22,5KD ; 5aadat e
t al、、 1989. J、 Ce1l Riol。
108:1807−1816)と合致する。したがって、CNTFのアミノ酸配
列は、細胞質ゾルタンパク質の性質を示す、すなわちシグナルペプチドがなく、
グリコジル化のためのコンセンサス配列がなく、また位置17にただ1つのシス
ティン残基をもつ。CNTFおよびNGF、BDNF、または繊維芽細胞増殖因
子(fibr。
blast growth factor:FGF)およびプルプリン(これら
の各々はCNTFの生存活性と同様な生存活性に関連する)の間に相同性は見ら
れなかった (Unsjcker et al、。
1987、 Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 U、S、A、、
84: 5459−5463; 5chubert et al、、 198
6. J、 Ce11. Biol、 102:2295−2301 )。
多数の生物学的効果がCNTFにより生ずるものと見なされていた。CNTFは
元来、副交換神経系の成分であるE8ヒナ毛様神経節のニューロンの生存を支え
る活性として記載された。5aadatら(1989,J、 Ce11.Bio
l、 108:1807−1816)は、彼らの最もよく精製したラット座骨神
経CNTF調製物が、培養下のラット交換神経ニューロンのコリン作動性分化を
誘導することを観察した。また、Ho f f m a n (1988,J、
Neurochem、 51:109−113)は、ヒナの眼由来のCNTF
活性が網膜細胞単層培養においてコリン−O−アセチルトランスフェラーゼ活性
のレベルを増加することを見いだした。
Hughesら(1988,Nature 335ニア0−73)は、周産期の
ラット視神経および脳の、2種の異なった組織に発育しつるグリア始原細胞の集
団を研究したところ、この細胞集団はまず最初に寡突起神経膠細胞となり、次い
でタイプ2星状膠細胞となると考えられる。研究によれば、寡突起神経膠細胞の
分化は寡突起神経膠細胞−タイブ2−星状膠細胞(0−2A)始原細胞がらなん
ら特定の成長因子が存在しなくてもおこることを示唆しており、一方タイブ2星
状膠細胞の分化は特定の誘導タンパク質の存在を必要とするように思われる。H
ughesらは、タイプ2星状膠細胞誘導タンパク質はCNTFと同一であるが
、または類似のものであることを観察した(Anderson、 1989.
Trends Neurosci、 12−83−85も参照されたい)。
さらに、組換えCNTFが培養下における中央背面を髄ニューロンの生存を促進
することが示され、精製ラット座骨神経CNTFは新生ラットの損傷頭面神経に
おける運動ニューロンの損傷誘導化細胞死を防ぐことが観察された(1989年
lo月31日出願の米国特許出願5erial No、07/429,517:
参照として本明細書にその全てを包含する)。
表2はNGF、BDNF、NT−3およびCN T F i、:関連する活性リ
ストの要約であり、まだ同定されていない追加の活性が記載される予定である。
(本頁以下余白)
表2
1、NGFに応答する細胞
A、交感神経
B、神経稜由来の知覚ニューロン
C,E6−E12を髄神経節
り、基底前脳コリン作動性ニューロン
I1.BDNFに応答する細胞
A、神経稜由来の知覚ニューロン
(i)を髄神経節(E 10/E 11)(ii)頚動脈神経節
(iii)背中線三叉神経神経節
(iv )三又神経中脳核
B、外胚葉板由来の知覚ニューロン
(i)節状神経節
(if)前庭神経節
(ii)錐体神経節
(iv )原状神経節
(v)腹側外側三叉神経神経節
C1網膜神経節
り、腹側中脳ドーパミン作動性ユニーロンE、基底前庭コリン作動性ニューロン
I[r、NT−3に応答する細胞
A、を髄神経節
B、交感神経神経節
C9節状神経節
IV、CNTFに応答する細胞
A、E8毛様体神経節
B、交感神経コリン作動性ニューロン
C,タイプ2星状膠細胞
り、背面中部を髄ニューロン
E、運動ニューロン(例えば、顔面神経運動ニューロン)F、Elo DRGニ
ューロン
3、 発明の要約
本発明は、天然に存在する細胞因子の少なくとも一部と少なくとも1つの他の分
子の一部を含むキメラ神経栄養因子(chfmerfc ’neurotrop
hic factor)に関するものであり、得られるキメラ分子は神経栄養活
性を有する。本発明は、幾分かは、NGFとBDNFの両方の一部分を含むキメ
ラ分子が神経栄養活性をもつらしく、ある事例ではどちらの親分子よりも大きい
活性スペクトルを示すという発見に基づいている。さらに、それは、神経栄養因
子配列と他のペプチド配列を含むキメラ分子が神経栄養活性を保持し、ある事例
では親因子よりも強力な活性を示しつるという発見に基づいている。
本発明は、キメラ神経栄養因子をコードする核酸、これらのキメラ神経栄養因子
の発現方法、キメラ神経栄養因子タンパク質およびそのペプチドフラグメント並
びに誘導体、特異的決定基を規定するためにキメラ神経栄養因子に対して誘導さ
れた抗体、および本発明のキメラ神経栄養因子を利用する神経障害の診断・治療
法を提供する。また、本発明は生物学的に活性なニューロトロフィン(neur
otrophin)をコードする多くの特定の組換えプラスミドを提供する。
本発明のキメラ神経栄養因子は自然界に存在する神経栄養因子と比べて多くの利
点をもたらす。キメラ神経栄養因子は、例えば単一の分子で2種の神経栄養因子
の活性を与えたり、あるいは内因性の神経栄養因子のスーパーアゴニストとして
作用して、より低い用量で生物学的応答を増強させたりする。さらに、本発明の
キメラ神経栄養因子は、神経栄養因子に応答する細胞へ活性化合物を運搬するの
に有用であろう。その上、特定の生物学的活性を保持するが、あるサブセットの
因子応答性細胞に向かうキメラ神経栄養因子のデザインは、親分子のより広範な
活性の合併症を回避しつつ神経障害の治療を可能にするだろう。
4、 図面の説明
図1. 3つのオリゴヌクレオチドブライマーと1段階ポリメラーゼ・チェーン
・リアクションを用いたBDNF−NGFキメラの構築において採用された戦略
の模式図。プライマーは、反応生成物がNarlおよびNotl制限酵素切断部
位(pC8hB(Pl)発現プラスミド中のBDNFプレプロ領域の後に生成物
を挿入させる)を含むようにデザインされた。斜線の領域はNGF配列を表し、
中空の領域はBDNF配列を表す。
図2.3段階ポリメラーゼ・チェーン・リアクションで4つのオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いたBDNF−NGFキメラの構築において採用された戦略の
模式図。斜線の領域はNGF配列を表し、中実の領域はベクター配列を表し、そ
して中空の領域はBDNF配列を表す。
図3.myc付加した神経栄養因子キメラの構築において採用された戦略の模式
図。
A、myc付加NGFの構築;myc配列には細線を引いてあり、中空の領域は
NGF配列を表す。
B、myc付加BDNFの構築;myc配列には細線を引いてあり、中空の領域
はBDNF配列を表す。
図4.50μIのasS標識COS細胞上清を15%SDS PAGEで分割し
、標識タンパク質をナイロンメンブランに電気泳動的に移行させた。このメンプ
ランをフィルムに一晩露光させ、得られたオートラジオグラフの写真を撮った。
レーンi、cos擬似;レーン2.ヒトBDNF 、レーン3.hBDNF/3
°mVc (BMI);レーン4.mNGF ;レーン5.mNGF/3’ m
yc (NMI)。分子量標準を示しである。
図5.キメラ神経栄養因子R1−RIO,BMIおよびNMIの推定アミノ酸配
列。
図6.(A)BDNF ; (B)NGFまたは(C)BMI、myc付加BD
NFで処理したを髄神経節(DRG)または交感神経節(SG)のMTT比色定
量アッセイの結果。570−650nmでの吸光度を、神経栄養活性を含むco
s細胞上清の次第に増加する希釈度の関数としてプロットしである。
図7.3段階ポリメラーゼ・チェーン・リアクションで4つのオリゴヌクレオチ
ドブライマーを用いたNGF−BDNFキメラの構築において採用された戦略の
模式図。プライマーAはT7プライマーであり、プライマーBとCは作製された
12のキメラの間で異なり、表10に示され、そしてプライマーDはT3プライ
マーである。斜線の領域はベクター配列を表し、中空の領域はプレプロ配列を表
し、点刻した領域は成熟NGF配列を表し、そして中実の領域はBDNF配列を
表す。
図8.A、NGF−BDNFキメラ神経栄養因子の発現に使用した修飾pBJ−
5ベクター。このベクターはアンピシリン耐性遺伝子(中実の矢印)、pBR3
22複製起点(中空の矢印)、SRプロモーター(点刻した矢印ゴakebe
et al、、 1988. Mol。
Ce1l、 Biol、 8: 466−472)およびスプライス接合部、ポ
リA部位、Notl、5aclIおよびEcoRI制限エンドヌクレアーゼ切断
部位を含むクローニング部位(斜線の矢印)を含んでいる。
B、野生型NGF、ベクター(対照)およびNGF−BDNFキメラ5l−S1
2でトランスフェクトしたCO8細胞の代謝標識付けの結果。40μlのCO8
細胞上清を直接12.5%5DS−ポリアクリルアミドゲルに負荷し、電気泳動
を行った。
C0抗NGF抗体て免疫沈降させた、野生型NGF、ベクター(対照)およびN
GF−BDNFキメラ5t−312でトランスフェクトしたCO8細胞の上清中
の代謝標識タンパク質の5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動。400μm
の上清に対して免疫沈降を行った。電気泳動は12.5%5DS−ポリアクリル
アミド上で行った。
図9、キメラ5l−312の図。中空の領域はNGF配列を、中実の領域はBD
NF配列を表す。
A)上段パネル:異なる種から単離されたNGF分子のアミノ酸配列比較。
B)下段パネル:NGFとBDNF配列のアミノ酸配列比較。
高い棒:この位置では高度に変化するアミノ酸が可能である。
低い棒:この位置では保存的アミノ酸変化のみが可能である。
棒なし:この位置でのアミノ酸はあらゆる既知のNGFとBDNFを通して保存
されている。
図10.キメラ神経栄養因子5l−812の推定アミノ酸配列。
図11.NGF、BDNFおよびNT−3のアミノ酸配列。矢印はシスティン残
基を示す。可変領域Vl−V4は上位の横線で示しである。
5、 発明の詳細な説明
発明の詳細な説明を限定せずに明瞭なものとするために、次の小分節に分けて記
載することにする:
(i)本発明のキメラ神経栄養因子;
(ii)キメラ神経栄養因子の構築;
(iii)キメラ神経栄養因子の発現;(iv)キメラ神経栄養因子の活性およ
びニューロン特異性を同定するための神経栄養因子アッセイ;
(v)キメラ神経栄養因子に対して誘導された抗体;および(vi)本発明の有
用性。
5.1. 本発明のキメラ神経栄養因子本発明は、(i)細胞因子の少なくとも
一部と少なくとも1つの他のタンパク質の一部を含み、かつ(ii)神経栄養活
性を有するキメラ神経栄養因子を提供する。本発明のキメラ神経栄養因子は細胞
因子またはその一部を含み、それら自体が神経栄養活性をもっていてもいなくて
もよ(、細胞因子の数種の名を挙げると、神経成長因子、脳由来の成長因子、ニ
ューロトロフィン−3、毛様体神経栄養因子、繊維芽細胞増殖因子(酸性または
塩基性および関連ファミリーのメンバー)、上皮増殖因子、腫瘍増殖因子β、腫
瘍増殖因子α、インターロイキン1、インターロイキン2、αインターフェロン
、βインターフェロン、γインターフェロン、成長ホルモン、バソアクティブ・
インテステイナル・ペプチド、バソプレッシン、インシュリンなどが含まれるが
、これらに限定されない。
本発明のキメラ分子は細胞因子の少なくとも一部と少なくとも1つの他のペプチ
ドまたはタンパク質の一部を含み、前記ペプチドまたはタンパク質は神経栄養活
性をもつ化合物に由来してもしなくてもよい。このペプチドまたはタンパク質は
、例えば神経栄養因子、細胞因子、トキシン、酵素、免疫グロブリン、または機
能的活性と関連がある又はない、あるいは抗原性がある又はない他のペプチド配
列の全部または一部を含むだろう。
例えば、制限するものではないが、本発明は、以下の第5.40節に記載するよ
うな神経栄養活性を示す次のキメラ分子を提供する:
(i)−緒に結合された2つの完全な神経栄養因子を含むキメラ分子;
(ii) 1つの完全な非神経栄養細胞因子に結合された1つの完全な神経栄養
因子を含むキメラ分子;
(iii) 2つの神経栄養因子の一部を含むキメラ分子;(iv)神経栄養因
子の一部と非神経栄養細胞因子の一部を含むキメラ分子;
(v)神経栄養因子の少なくとも一部と抗原性がある又はないペプチド配列を含
むキメラ分子;
(vi) 2つの神経栄養因子の少なくとも一部と抗原性がある又はないペプチ
ド配列を含むキメラ分子。
本発明のキメラ神経栄養因子はペプチド以外の化合物に結合されていてもよい。
例えば、キメラ神経栄養因子に炭水化物、リピド成分または他の有機化合物を結
合させることが望ましいだろう。
このような化合物には毒性物質、抗増殖剤、高度免疫原性物質、血管形成剤、抗
血管形成剤、凝血剤、抗凝血剤、蛍光化合物、放射性化合物などが含まれる。
神経栄養因子または他の細胞因子の一部と別の神経栄養因子または他の細胞因子
の一部を結合させる場合は、1つの因子の一部を欠失して別の因子の一部で置き
換え、これにより親因子の一方の大体の大きさを維持するようにキメラ分子をデ
ザインすることが好ましいが、本発明はこれに限定されない。さらに、2つの因
子が相同領域を含む場合は、その相同領域を互いに交換し、これにより両方の親
因子に相同であるが親因子とは異なるキメラ分子を作ることが好適である。別の
態様では、最小の機能をもつと考えられる因子の領域を、生物学的に活性である
と考えられる他の因子または他のペプチドの領域と置き換えることもできる。こ
のようなキメラは親因子と比べて増強された生物学的活性を示すだろう。また、
望ましくない生物学的活性と関連していると思われる因子の領域は、望ましくな
い活性が軽減または排除されるように、他の因子またはペプチドの一部と置き換
えてもよい。かかる態様は望ましくない副作用や毒性が最小限のキメラ神経栄養
因子の開発に有用であろう。
これとは別に、本発明のキメラ分子は、細胞因子をコードする配列がペプチドま
たはタンパク質をコードする配列によって中断される核酸配列によりコードされ
てもよく、このような分子によりコードされるキメラ神経栄養因子は因子タンパ
ク質内部への挿入により特徴づけられる。さらに、本発明は、因子の少なくとも
一部と他のペプチドとのアミノ末端またはカルボキシ末端融合体を提供する。
いくつかの事例において、2つの因子の相同部分が交換される場合、キメラ分子
は1個のアミノ酸によってその鋭化合物の一方と効果的に相違することがある。
このようなキメラ神経栄養因子は本発明によって意図され、以下の第8節で論じ
られるキメラS−6および5−11により例示される。
本発明の好適な態様では、関連した神経栄養因子の対応部分を交換することによ
りキメラ神経栄養因子が作製される。本発明の好ましい特定の態様において、キ
メラ神経栄養因子の分子は、最近確認された“ニューロトロフィン”ファミリー
(NGFSBDNF、NT−3およびこれまでに確認された他のメンバーを含む
)の2以上のメンバーの一部を含む。これらの特定の態様によれば、ニューロト
ロフィンファミリーのメンバーの一部がこの分子の二次および/または三次構造
を保持するように再配列されよう。本発明の別の態様では、ニューロトロフィン
ファミリーのメンバーと関連した二次および/または三次構造とコンホメーショ
ンが保持されるように、非ニューロトロフィンファミリーのペプチド配列の挿入
、またはニューロトロフィンファミリーのコード配列の一部と非ニューロトロフ
ィンファミリーのペプチド配列との置換が達成されよう。ここで用いる「二二一
口トロフィンファミリーのメンバーと関連した二次および/または三次構造とコ
ンホメーション」なる表現は、ニューロトロフィンファミリーのメンバーにより
共有される配列、構造および化学的特徴を意味するように解釈され、これらの特
徴はつまり約120アミノ酸残基の長さ、約9−10のpI、およびアミノ酸1
4.57.67.79.10Bおよび110付近(約5アミノ酸以内)に、また
は二二一口トロフィンファミリーのメンバーにより共有される相同配列中の挿入
または欠失に関連した同様の位置に、位置づけられた6個のシスティン残基のこ
とである。例えば、魚のNGF配列は成体アミノ酸65に22bpの挿入を保有
し、これは哺乳類のNGFに類似したコンホメーションをこの分子の残部の構造
がとるように多分ループを作っているだろう。本発明の好ましい特定の態様にお
いて、少なくとも1つのニューロトロフィンファミリーメンバーの一部を含むキ
メラ神経栄養因子は、上記の位置付近に少なくとも4個のシスティン残基を含む
。より好ましい特定の態様では、本発明のキメラ神経栄養因子は上記の位置付近
に少な(とも5個のシスティン残基を含む。本発明の最も好ましい特定の態様で
は、キメラ分子は上記の位置付近に6個のシスティン残基を含む。本発明の別の
好ましい特定の態様では、キメラ神経栄養因子は上記の位置付近に少なくとも4
個のシスティン残基を含み、かつ約9−1OのpIを示す。本発明のより好まし
い特定の態様では、キメラ神経栄養因子は上記の位置付近に少なくとも5個のシ
スティン残基を含み、かつ約9−1OのpIを示す。本発明の最も好ましい特定
の態様では、キメラ分子は上記の位置付近に6個のシスティン残基を含み、かつ
約9−1OのpIを示す。
本発明は、キメラ神経栄養因子をコードする核酸、並びにキメラ神経栄養因子タ
ンパク質およびそのペプチドフラグメントおよび誘導体を提供する。本発明の好
ましい態様において、キメラ神経栄養因子はNGF、BDNFおよびNT−3(
これらの配列は図11に示す)を含むがこれらに限定されない少なくとも1つの
二二一口トロフィンファミリーメンバー(上記参照)の一部を含む。本発明の好
ましい特定の態様では、キメラ神経栄養因子はキメラ分子R1−RIO1BMI
、NMIおよび5l−S12について図5および10に示したようなアミノ酸配
列を有する。本発明のキメラ神経栄養因子の分子は、−次アミノ酸配列として、
実質的に図5およびlOに示したアミノ酸配列(この配列内の残基を機能的に等
しいアミノ酸残基で置換して、サイレント変化を生じさせた改変配列を含む)の
全部または一部を含むものであるが、これらに限定されない。例えば、この配列
内の1個以上のアミノ酸は、機能的均等物として作用してサイレント変化をもた
らす類似の極性の他のアミノ酸と置き換えることができる。この配列内のアミノ
酸の代替アミノ酸はそのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選ばれる。
例えば、無極性(疎水性)アミノ酸としてはアラニン、ロイシン、イソロイシン
、ノくリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが
ある。極性中性アミノ酸としてはグリシン、セリン、トレオニン、システィン、
チロシン、アスパラギンおよびグルタミンがある。正に荷電した(塩基性)アミ
ノ酸としてはアルギニン、リシンおよびヒスチジンがある。負に荷電した(酸性
)アミノ酸としてはアスノ(ラギン酸とグルタミン酸がある。翻訳の間または後
に、例えばグリコジル化、加水分解切断、抗体分子や他の細胞リガンドへの結合
などにより、修飾されたキメラ神経栄養因子タンノ(り質またはそのフラグメン
トもしくは誘導体も本発明の範囲内に含まれる。また、本発明は図5およびIO
に示したアミノ酸配列をコードする核酸分子、またはその一部もしくは機能的均
等物を提供する。さらに、本発明は第10節に示したプラスミドpBJ51mN
/hB−siないし12、p C8h B/hN−R1ないし10、pC81m
N/myc−NMlおよびpC8hB/myc−BMI、並びにそれらが含む核
酸配列によりコードされるキメラ神経栄養因子を提供する。
本発明は、ヒト、サル、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、鰯歯類または
トリの細胞因子を含むがこれらに限定されない生きている生物由来の細胞因子を
含むキメラ神経栄養因子を提供する。
5.2. キメラ神経栄養因子の構築
キメラ神経栄養因子をコードする核酸は標準的な組換えDNA法を使って、例え
ば細胞因子および/または他のペプチドをコードする核酸を制限酵素とDNAリ
ガーゼで切断およびスプライスすることにより構築することができる。別法とし
て、核酸配列は固相ホスホルアミダイト法のような化学合成により構築すること
もできる。本発明の好ましい態様では、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション
(P CR; 5aiki et al、、 1985.5cience 23
0:1350−1354)を用いて、重複伸長(Horton et al、、
1989. Gene77:6l−68)による核酸配列のスプライシングを
達成し、これにより本発明のキメラ神経栄養因子を作製する。以下の第6節で詳
述するように、キメラ神経栄養因子は3つのオリゴヌクレオチドブライマーを用
いた1段階PCRにより、または4つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた
3段階PCRにより作製される。図1および2はこれら2つの技法の模式図であ
る。例えば、細胞因子(X)の少なくとも一部をコードする核酸は、3つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーを作製することにより真核生物ペプチド(Y)をコー
ドする核酸配列にスプライスされる。3つのプライマーのうち1つはX配列の一
部に対応しくXプライマー)、もう1つはY配列の一部に対応しくYプライマー
)、そして3つ目はX配列とY配列の両方の一部を含む(XYプライマー)。さ
ら(こ、プライマー中に有用な制限エンドヌクレアーゼの切断部位を組み込むこ
とが好ましい。以下の表3はBDNF−NGFキメラを作るために使用しうるプ
ライマーの例を示している。これら3つのオリゴヌクレオチド(図1ではそれぞ
れプライマーA、CおよびBで表される)を1段階PCRで一緒にするが、Xと
YプライマーはXYプライマーよりも多量に、例えば約100:1:100のX
:XY:Yの比で存在することが望ましい。PCRで使用される鋳型はスプライ
スすべき細胞因子とタン、<り質またはペプチドをコードする核酸の混合物であ
りうる。スプライス部位の位置は架橋ヌクレオチド(例えば、XYプライマー)
により決定される。当分野で日常的に用いられる増幅条件を採用することができ
、例えば標準PCR反応溶液および方法を使って、約94℃で1分、約43℃で
2分、および約72℃で3分を35サイクル行う。その後、得られたPCRフラ
グメントはゲル電気泳動によりゲル精製し、適切な制限エンドヌクレアーゼ酵素
で切断し、そして適当なりローニングベクターに挿入する。
また、図2に示すように、キメラ神経栄養因子は4つのオリゴヌクレオチドを用
いた3段階PCRにより作製することもできる。
例えば、BDNF−NGFまたはNGF−BDNFキメラを作るために使用しう
るオリゴヌクレオチドはそれぞれ表4と10に示しである。ヌクレオチド配列X
とYの間でスプライスを行うために、次のプライマーが構築されよう=(i)プ
ライマーX、X配列に対応する(図2のプライマーA);プライマーY、Y配列
に対応する(図2のプライマーD);プライマーxy、xとYの両方の部分配列
に対応する(図2のプライマーB);およびプライマーXY’ 、これもXとY
の両方の部分配列に対応するが、さらにプライマーXYに相同である(図2のプ
ライマーC)。1つのPCR反応では、プライマーXとXYを配列X鋳型から増
幅し、XおよびY配列の一部を含む核酸を作る。別のPCR反応で、プライマー
YとXY’ を配列X鋳型から増幅し、他のPCR反応で得られた核酸分子のY
部分と重複するXおよびY配列の一部を含む核酸を作る。2つのPCRの生産物
を一緒にしてPCRで増幅すると、X配列にY配列が挿入された核酸分子が作製
される。2つの異なる鋳型を用いるこの方法の変法も本発明に従って採用するこ
とができる。その後、得られたキメラ神経栄養因子遺伝子をクローン化するため
に、PCR,PCR産物の精製、制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断が上記
のように使用されよう。
DNA反応産物は当分野で知られた方法を使ってクローン化することができる。
当分野で知られた多くのベクター/宿主系を使用しうる。可能なベクターとして
はコスミド、プラスミドまたは修飾ウィルスがあり、これらに限定されないが、
ベクター系は用いる宿主細胞と適合しうるちのでなければならない。このような
ベクターにはラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、pBR322、pUC
またはBluescript■(Stratagene)プラスミド誘導体のよ
うなプラスミドが含まれるが、これらに限定されない。
組換え分子は形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション
などにより宿主細胞に導入することができる。
5.3. キメラ神経栄養因子の発現
キメラ神経栄養因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列は適当な発現ベク
ター、すなわち挿入されたタンパク質コード配列の転写・翻訳に必要な要素を含
むベクターに挿入される。必要な転写・翻訳シグナルは天然のキメラ神経栄養因
子遺伝子および/またはそのフランキング領域によって供給されてもよい。タン
パク質コード配列を発現させるために、種々のベクター/宿主系を利用しうる。
これらにはウィルス(例えば、ワクシニアウィルス、アデノウィルスなど)に感
染した補乳動物細胞系;ウィルス(例えば、バキュロウィルス)に感染した昆虫
細胞系;酵母ベクターを含む酵母、バクテリオファージDNA、プラスミドDN
AまたはコスミドDNAで形質転換された細菌のような微生物が含まれるが、こ
れらに限定されない。これらのベクターの発現要素はそれらの強さおよび特異性
が異なっている。使用する宿主/ベクター系に応じて、多くの転写・翻訳要素の
いずれか1つが使用されよう。
ベクターへのDNAフラグメントの挿入について以前に記載された方法のどれか
を用いて、適当な転写/翻訳調節シグナルとタンパク質コード配列から成るキメ
ラ神経栄養因子遺伝子を含む発現ベクターを構築する。これらの方法にはin
vHro組換えDNA法、合成法およびin vivo組換え(遺伝的組換え)
が含まれる。
キメラ神経栄養因子タンパク質またはペプチドフラグメントをコードする核酸配
列の発現は、キメラ神経栄養因子タンパク質またはペプチドが組換えDNA分子
で形質転換された宿主において発現されるように、第二の核酸配列により調節す
ることができる。
例えば、キメラ神経栄養因子の発現は当分野で知られたプロモーター/エンハン
サ−要素によりコントロールできる。キメラ神経栄養因子の発現をコントロール
するために使用しつるプロモーターとしてはサイトメガロウィルス(CMV)プ
ロモーター、5V40初期プロモーター領域(Bernoist and Ch
ambon、 1981゜Nature 290:304−310) 、ラウス
肉腫ウィルスの3° ロング・ターミナル・リピートに含まれるプロモーター(
Yamamoto et al、。
1980、 Ce1l 22ニア87−797) 、ヘルペスチミジンキナーゼ
プロモーター(Wagner et al、、 1981. Proc、 Na
tl、 Acad、 Sci、 U、S、A。
78:144−1445) 、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brins
teret al、、 1982. Nature 296:39−42);原
核生物発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター(Villa−Ka
maroff et al、。
1978、 Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 U、S、A、
75:3727−3731)、またはtacプロモーター(DeBoer et
al、、 1983. Proc、 Natl、 Acad。
Sci、 U、S、A、 80:2l−25)、また5cientific A
merican、 1980゜242ニア4−94中の“組換えバクテリアがら
の有用なタンパク質”も参照;ツバリンシンターゼプロモーター領域(Herr
era−Estrellaet al、、 Nature 303:209−2
13)またはカリフラワーモザイクウィルス35S RNAプロモーター(Ga
rdner et al、、 1981. Nucl。
Ac1ds Res、 9:2871)を含む植物発現ベクター、および光合成
酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター(Herrer
a−Estrella et &1.,1984+ Nature 310:1
15−120);酵母や他の真菌からのプロモーター要素、例えばGa14プロ
モータ+、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホス
ホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター
、および組織特異性を示しかつトランスジェニック動物において利用された次の
動物転写調節領域:膵臓の線屑細胞において活性のエラスターゼI遺伝子調節領
域(Swift et al、、 1984. Ce1l 38:639−64
6; 0rnitz et al、、 1986゜Co1d Spring H
arbor Symp、 Quant、 Biol、 50:399−409;
MacDonald、 1987. Hepatology 7:425−51
5);膵臓のベータ細胞において活性のインシュリン遺伝子調節領域(Hana
han、 1985゜Nature 315:115−122)、リンパ球系細
胞において活性の免疫グロブリン遺伝子調節領域(Grosschedl et
al、、 1984. Ce1l 38:647−658; Adames
et at、、1985. Nature 318:533−538;Alex
ander et al、、 1987. Mo1. Ce11. Biol、
7:1436−1444)、畢丸、***、リンパ球系およびマスト細胞におい
て活性のマウス乳癌ウィルス調節領域(Leder et al、、 1986
. Ce1l 45:485−495)、肝臓において活性のアルブミン遺伝子
調節領域(Pinkert et al、。
1987、 Genes and Devel、 I:268−276) 、肝
臓において活性のα−フェトプロティン遺伝子調節領域(Krumlauf e
t at、、 1985. Mol。
Ce11. Biol、 5:1639−1648; Hammer et a
t、、 1987.5cience 235:53−58) ;肝臓において活
性のαl−アンチトリプシン遺伝子調節領域(Kelsey et at、、
1987. Genes and Devel、 1:161−171)、骨髄
球様細胞において活性のβ−グロビン遺伝子調節領域(Mogramet al
、、 1985. Nature 315:338−340; Kollias
et al、、 1988゜Ce1l 46:89−94);脳の乏突起神経
膠細胞において活性のミニリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域(Readhe
ad et al、、 1987゜Ce1l 48ニア03−712);骨格筋
において活性のミオシン軽鎖−2遺伝予調節領域(Sani、 1985. N
ature 314:283−286) 、および視床下部において活性の性腺
刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域(Mason et al、、 19
86.5cience 234:1372−1378)が含まれるが、これらに
限定されない。
キメラ神経栄養因子遺伝子の挿入物を含む発現ベクターは3通りの一般的手法:
(a)DNA−DNAハイブリダイゼーション、(b) “マーカー”遺伝子機
能の有無、および(C)挿入配列の発現により同定することができる。最初の方
法では、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在を、挿入したキメラ神経栄
養因子遺伝子に相同な配列から成るプローブを用いてDNA−DNAハイブリダ
イゼーションにより検出できる。2番目の方法では、ベクターへの外来遺伝子の
挿入によってもたらされるある種の“マーカー”遺伝子機能(例えば、チミジン
キナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウィルスでの封入体の
形成など)の有無に基づいて、組換えベクター/宿主系を同定し、選択すること
ができる。例えば、キメラ神経栄養因子遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列
の内部に挿入されると、キメラ神経栄養因子挿入物を含む組換え体はマーカー遺
伝子機能の不在により同定できる。3番目の方法では、組換え体により発現され
た外来遺伝子産物を検定することにより組換え発現ベクターを同定しうる。この
ような検定は、例えば、以下の第5.41節に記載するようなバイオアッセイ系
でのキメラ神経栄養因子遺伝子産物の物理的または機能的性質に基づくものであ
る。
ひとたび特定の組換えDNA分子が同定されて単離されると、それを増殖させる
ために当分野で知られた幾つかの方法が用いられる。適当な宿主系と増殖条件が
確立されたら、組換え発現ベクターを増殖させて大量に調製することができる。
先に説明したように、使用できる発現ベクターには次のベクターまたはそれらの
誘導体:2.3の名を挙げると、ワタシニアウイルスやアデノウィルスのような
ヒトまたは動物ウィルス;バキュロウィルスのような昆虫ウィルス;酵母ベクタ
ー;バクテリオファージベクター(例えば、ラムダ);プラスミドおよびニスミ
ドDNAベクターが含まれるが、これらに限定されない。
さらに、挿入配列の発現を調整するか、あるいは希望する特定の様式で遺伝子産
物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株を選択することもできる。ある種
のプロモーターからの発現はある種の誘導物質の存在下で高められる。かくして
、遺伝子操作されたキメラ神経栄養因子タンパク質の発現をコントロールするこ
とができよう。さらに、個々の宿主細胞はタンパク質の翻訳および翻訳後のプロ
セッシングと修飾(例えば、グリコジル化、切断)のための特殊な機構をもって
いる。発現された外来タンパク質の希望する修飾およびプロセッシングを確実に
するように、適切な細胞系や宿主系が選ばれる。例えば、細菌系による発現は非
グリコジル化コアタンパク質産物の生産に用いられよう。酵母による発現はグリ
コジル化産物をもたらすだろう。哺乳動物細胞による発現は異種キメラ神経栄養
因子タンパク質の“天然”グリコジル化を確実にするよう用いられる。さらに、
種々のベクター/宿主発現系は加水分解切断のようなプロセッシング反応に様々
な程度で影響を及ぼすだろう。
本発明の特定の態様において、キメラ神経栄養因子をコードするDNAは、以下
の第6および8節に記載する方法に従ってCO8細胞系で発現される。ひとたび
キメラ神経栄養因子遺伝子を発現する組換え体が同定されたら、その遺伝子産物
を分析すべきである。これは遺伝子産物の物理的または機能的性質に基づいたア
ッセイにより達成されよう。第5.49節を参照されたい。
キメラ神経栄養因子タンパク質が同定されたら、それをクロマトグラフィー(例
えば、イオン交換、アフィニティー、および大きさにより分画化するカラムクロ
マトグラフィー)、遠心、分別溶解といった標準方法、またはタンパク質精製の
ための他の標準手法により単離・精製する。
さらに、本発明のキメラ神経栄養因子タンパク質およびペプチドは当分野で公知
の標準ペプチド化学合成法を使って製造するこ本発明のキメラ神経栄養因子は神
経栄養活性を示す。ここで用いる“神経栄養活性”という用語は、ニューロン、
星状細胞、ダリア細胞、乏突起神経膠細胞、小ダリア細胞およびシュヴアン細胞
を含むがこれらに限定されない神経系細胞に対する生物学的作用を意味すると解
釈されるべきである。生物学的作用とは、キメラ神経栄養因子に直接または間接
的にさらすことにより生じる神経系細胞の構造および/または生理現象の変化の
ことである。生物学的作用の例としては生存の延長、神経突起の発生、分化した
機能(例えば、コリンアセチルトランスフェラーゼやチロシンヒドロキシラーゼ
のような酵素の発現)の維持または発生、あるいは逆に、細胞の死または老化、
もしくは脱分化がある。
神経栄養活性の存在はこのような活性の既知のアッセイや今後開発されうる系を
用いて調べることができる。アッセイ系には、例えば組織移植片、組織から調製
された細胞または不死化細胞系(例えば、脳、を髄、末梢神経系に由来するもの
)を用いる組織培養バイオアッセイ系のようなrn vitro試験系、および
キメラ神経栄養因子を動物に投与し、このような動物における神経栄養作用を化
学的、組織学的または挙動試験により検出するin viv。
試験系が含まれる。さらに、ヒト以外のトランスジェニック動物にトランスジー
ンとしてキメラ神経栄養因子を組み込み、前記動物においてその生物学的作用を
測定することもできよう。
例えば、限定するものではないが、神経栄養活性は次の公知のバイオアッセイ系
のいずれかを用いて測定することができる=(i)を髄神経節アッセイ系、Ba
rde et al、、 1980. Proc、 Natl。
Acad、 Sci、USA、 77:1199−1203に記載される(参照
によりその全体をここに引用する);
(ii)下神経節アッセイ系、Lindsay et al、、 1985.
Dev、 Biol。
112:319−328に記載される(参照によりその全体をここに引用する)
;
(iii)交感神経節アッセイ、Barde et al、、 1982. E
MBOJ、 1:549−553に記載される(参照によりその全体をここに引
用する);(iv)毛様体神経節アッセイ、Adler et al、、 19
79.5cience204:1434−1436に記載される(参照によりそ
の全体をここに引用する);
(V)を髄ニューロン:簡単に説明すると、を髄を試験動物から無菌的に摘出し
、延髄の後端で切断し、知覚神経節と髄膜を取り除く。次に、別々に培養するた
めにを髄を腹側セグメントと中背側セグメントに分割し、組織を細かく刻み、そ
して33mMグルコース、2mMグルタミン、15mM NaHCOl 、lo
mM HEPES、 258g/mlインシュリン、100μg/mI トラン
スフェリン、60μmプトレシン、20nMプロゲステロン、30nM Naセ
レナイト、0.5 μg/mlペニシリンG、0.5μg/mlストレプトマイ
シン、および2.5μg/mlウシ血清アルブミンを補給した50%DMEM
(Gibco)および50%Ham’ s栄養培地F12 (Gibco)中で
パスツールピペットにより摩砕して解離させる。その後、摩砕を2回繰り返し、
上清をプールし、40μmTetkoフィルターを通して濾過する。解離した腹
側細胞はポリーD−リシ、ン被覆(10μg/mり培養皿に35 mm皿あたり
50万個の細胞の密度でまく。解離した中背側細胞はポリー〇−リシン(10μ
g/ml) 、ポリーL−オルニチン(10t1g/ml)またはポリーL−オ
ルニチンとラミニン(5μg/ml)を被覆した35 mm皿あたり150万個
の細胞の密度でまく;
(vi)基底前脳コリン作動性ニューロン(米国特許出願S、N。
07/400.591参照);
(vii)腹側中脳ドパミン作動性ニューロン(米国特許出願S、 N。
07/400.591参照);および
(viii)P C12細胞。
5.5. キメラ神経栄養因子に対して誘導された抗体本発明によれば、キメラ
神経栄養因子タンパク質、またはそのフラグメントもしくは誘導体は、抗キメラ
神経栄養因子抗体を生産するための免疫原として使用される。抗キメラ神経栄養
因子免疫応答を生ずる可能性を改善するために、キメラ神経栄養因子のアミノ酸
配列を分析して、免疫原性の増強と関連する分子の部分を同定することができる
。例えば、アミノ酸配列をコンピュータ分析にかけて、B型肝炎表面抗原の抗原
性ペプチドの同定に使用して成功を収めたHopp and Woodsの方法
(1981,Proc、 Natl。
Acad、 Sci、 U、S、A、 78:3824−3828)により表面
エピトープを同定しつる。また、異なる種からのキメラ神経栄養因子の推定アミ
ノ酸配列を比較し、相対的に非相同性の領域を同定することができよう。これら
の非相同領域はいろいろな種にわたって免疫原性があるようだ。
キメラ神経栄養因子に対するモノクローナル抗体を調製するために、培養下の連
続細胞系による抗体分子の生産をもたらす技術はどれも使用できる。例えば、K
ohler and Milstein (1975゜Nature 256:
495−497)によって最初に開発されたハイブリドーマ技法、トリオーマ技
法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法(Kozboret al、、 1983.
rmmunology Today 4ニア2) 、およびヒトモノクローナ
ル抗体を製造するためのEBVハイブリドーマ技法(Cafeet al、、1
985. in Monoclonal Antibodies and Ca
ncerTherapy” 、 Alan R,Li5s、Inc、 pp、
77−96)などが本発明の範囲内である。
治療用のモノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体またはキメラ・ヒト−マ
ウス(または他の種)モノクローナル抗体でありうる。ヒトモノクローナル抗体
は当分野で知られた多くの技術により作ることができる(例えば、Teng e
t al、、 1983. Proc。
Natl、 Acad、 Sci、 U、S、A、 80ニア308−7312
; Kozbor et al、、 1983゜Immunology Tod
ay 4ニア2−79; 01sson et al、、1982. Meth
。
Enzymol、 92:3−16)。キメラ抗体分子はマウス抗原結合領域と
ヒト不変領域を含むものを製造しうる(Morrison et al、、 1
984゜Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 U、S、A、 81
:6851; Takeda et at、。
1985、 Nature 314:452)。
当分野で知られた種々の方法が、キメラ神経栄養因子のエピトープに対するポリ
クローナル抗体を製造するために使用できる。
抗体の製造のために、種々の宿主動物(ウサギ、マウス、ラットなどを含み、こ
れらに限定されない)はキメラ神経栄養因子タンパク質またはそのフラグメント
もしくは誘導体を注射して免疫する。免疫応答を高めるために、宿主動物種に応
じて、各種アジュバントを使用することができ、アジュバントとしてはフロイン
ト(完全および不完全)、水酸化アルミニウムのような無機ゲル、リゾレシチン
のような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油
エマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、
およびBCG(Bacille Calmette−Guerin)やコリネバ
クテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)のよ
うな有用でありうるヒトアジュバントがあるが、これらに限定されない。
キメラ神経栄養因子のエピトープに対する抗体の分子クローンは既知の方法によ
り作製することができる。組換えDNA法(例えば、Maniatis et
at、、 1982. Mo1ecular Cloning、 ALabor
atory Manual、 Co1d Spring Harbor Lab
oratory、 ColdSpring Harbor、 New York
を参照)を使って、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードす
る核酸配列を構築しうる。
抗体分子は既知の方法、例えば免疫吸着またはイムノアフィニティークロマトグ
ラフィー、HPLC(高性能液体クロマトグラフィー)のようなりロフトグラフ
ィー法、あるいはこれらの組合せにより精製することができる。
抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは既知の方法により作製する
ことができる。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化
により生成されるF(ab“)2フラグメント、F (ab’ ) iフラグメ
ントのジスルフィド橋を還元することにより得られるFab’ フラグメント、
および抗体分子をパパインと還元剤で処理することにより得られる2Fabまた
はFabフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
(本頁以下余白)
5.68発明の用途
本発明は、多様な診断および治療への応用に利用できるキメラ神経栄養因子遺伝
子とタンパク質を提供するものである。本発明のキメラ神経栄養因子としては、
(i)2つの神経栄養因子の活性を単一の分子中で結合させ、(ii)天然に存
在する因子に対応する活性の独特のスペクトルを示し、(iii)天然に存在す
る因子のスーパーアゴニストとして機能するか、または(iv)天然に存在する
因子のアンタゴニストもしくはインヒビターとして機能する分子が挙げられる。
本発明のキメラ神経栄養因子は、診断的応用に利用できる。例えば、本発明のキ
メラ神経栄養因子は、抗原性ペプチド付加、例えば、標識した抗体に結合するこ
とのできるmyc付加物(下記第7章を参照)からなっていてもよい。そのよう
なキメラ神経栄養因子は、神経栄養因子に応答する細胞に結合してもよく、間接
的に標識を結合させることにより、神経栄養因子応答細胞のインディケータ−と
して働き、神経系の障害の診断または研究に有用となりうる手法として役立つで
あろう。最小の向神経性活性を有するキメラ神経栄養因子を診断目的のために設
計することは望ましいものであろう。
また、本発明は多様な診断的応用におけるキメラ神経栄養因子の用途も提供する
ものである。キメラ神経栄養因子は、特別な例において、単一分子中で幾つかの
神経栄養因子に典型的に関連のある活性を与えるという利点を提供し、および/
または、活性の範囲をキメラの親分子の活性以上に拡げるという利点を提供する
。
例えば、キメラNMIは、myc抗原性ペプチドに結合したNGFからなリ、を
髄神経節、節状神経節、および交感神経節を用いるバイオアッセイにおいて活性
を示した; 対照的に、天然のNGFは、節状神経節アッセイにおいて、殆ども
しくは全く活性を有していない。従って、NMIは、その親分子であるNGFに
一般的には応答しない細胞タイプにその影響を与えるので、拡がった範囲の活性
を示す。このことは、交感神経系ニューロン、副交感神経系二ニー−ロン、およ
び感覚ニューロンにおける応答、例えばアミロイド多発神経障害、糖尿病性神経
障害、および自律異常多発性神経障害−における応答を誘導することが望ましい
ような状況において特に重要であることを表わすものであろう。を髄神経節、交
感神経節、および節状神経節も、ニューロトロフィンの組合せ、例えばBDNF
とNGFの組合せに対して、またはNT−3因子のみに対して応答するであろう
が、全ての3つの細胞タイプに影響を与えているキメラ分子は、BDNFプラス
NGFまたはNT−3のみの投与により引き起こされうる副作用が比較的無いこ
とであろう。更に、キメラ神経栄養因子は、それらの天然に存在する対応物より
も高い活性を示すであろう; 例えば、第6図に示すように、BDNFとmyc
ペプチドの部分からなるBMIは、を髄神経節および交感神経節アッセイにおい
て、BDNFよりも高い生存促進活性を示すことが発見された。NGFおよびB
DNFは、付加的な向神経性活性を有することが観察された; 本発明によれば
、単一のキメラ神経栄養因子を利用して、多数の親因子の活性を単一分子で提供
できる。
更に別の実施態様において、キメラ神経栄養因子は毒素成分を含んでもよく、キ
メラ神経栄養因子に応答する細胞、例えば、神経系起源の、ウィルス感染の細胞
もしくは腫瘍に応答する病的細胞の除去のために用いてもよい。
本発明の多様な実施態様において、キメラ神経栄養因子タンパク質、ペプチドフ
ラグメントまたはペプチド誘導体は、神経系が、外傷、手術、虚血、感染(例え
ば、ポリオまたはエイズ)、代謝異常、栄養不足、悪性腫瘍、または毒物により
損傷しているような患者に投与することができる。本発明の更に別の実施態様に
おいて、キメラ神経栄養因子タンパク質もしくはそれに由来するペプチドフラグ
メントまたは誘導体は、アルツハイマー病、老化、末梢神経障害、パーキンソン
病、ハンチングトン舞踏病および運動性ニューロンの疾患と異常などの、しがし
これらに限定されることのない先天的条件または神経変性異常を治療するために
用いることができる。
発明の具体的な実施態様において、キメラ神経栄養因子タンパク質、または、そ
れに由来するペプチドフラグメントまたは誘導体の投与は、アルツハイマー病、
筋萎縮性側索硬化症および他の運動性ニューロン疾患(例えば、ウェルドニゲ・
ホフマン病を含む)、およびパーキンソン病の治療において、組織の外科的移植
または他の持続的放出性組成物と連係させて用いることができる。アルツハイマ
ー病は、基部大脳でコリン作動性の選択的損失を伴うものであることが示されて
おり、パーキンソン病の約35パーセントの患者が、アルツハイマータイプの痴
呆に苦しんでいる; 本発明により作られるキメラ神経栄養因子は、この病気複
合のための有用な単一薬剤治療であることが判明するであろう。同様に、本発明
により作られるキメラ神経栄養因子を治療的に用いて、ダウン・シンドロームに
連係するアルツハイマー病を治療できるであろう。本発明により作られるキメラ
神経栄養因子は、多様な痴呆並びに生来的学習障害の治療に用いることができる
。
本発明の更に別の実施態様において、キメラ神経栄養因子タンパク質、フラグメ
ントまたは誘導体は、他のサイトカインと連係させて用いて、所望の向神経性効
果を達成することができる。キメラ神経栄養因子、それから作られたタンパク、
ペプチドフラグメントまたは誘導体、もしくは(キメラ神経栄養因子タンパク質
、ペプチドフラグメント、または誘導体に対する)抗体または抗体フラグメント
、または、キメラ神経栄養因子と第2の薬剤(例えばNGF)の組合せからなっ
てもよい本発明の活性組成物は、塩溶液、綬衝性塩溶液、デキストロース、およ
び水等の、しかしそれらに限定されることのないどんな滅菌生物適合性担体中に
おいて投与してもよい。
特別な障害や状態の治療に効果的となるであろうキメラ神経栄養因子タンパク、
ペプチドフラグメント、誘導体、または抗体の量は、その障害または状態の性質
に依存するであろうし、標準的な臨床技術により決定することができる。可能で
あれば、投与・応答曲線と本発明の医薬組成物を、最初にインビトロで、例えば
、上記のキメラ神経栄養因子バイオアッセイ系で決定し、次に、ヒトでの試験前
に有用な動物モデル系で決定することが望ましい。
投入の方法として、皮肉、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、および鼻内が
あるが、これらに限定されない。更に、本発明の医薬組成物を、心室内および包
膜内の注入等の適当な経路により中枢神経系中に投入することは望ましいもので
あろう;心室内注入は、例えば、Ommayaリザーバーなどのりザーバーに取
り付けられた心室内用カテーテルにより容易になるであろう。投入の方法は、再
充填可能もしくは生物的分解の可能な器具によってもよい。
更に、本発明の医薬組成物を治療の必要な部分に局所的に投与することも望まし
いものであろう; これは、例えば、手術中の局所注入により、注射により、カ
テーテルの手段により、またはラジウム挿入管(該ラジウム挿入管は、シアルア
エティック(sialaetic)膜などの膜またはファイバー等の多孔性、非
多孔性、もしくはゲル状の材質からなる)によって達成することができるが、こ
れらに限定されることはない。
また、本発明は、リポソーム、マイクロ粒子、またはマイクロカプセルを経て投
与されたキメラ神経栄養因子タンパク質、ペプチドフラグメント、または誘導体
も提供するものである。本発明の多様な実施態様において、キメラ神経栄養因子
およびキメラ神経栄養因子関連生成物の持続的放出を達成するために、そのよう
な組成物を用いることは有用であろう。
6、実施例: BDNF/NGFおよびmycで付加されたキメラ神経栄養因子
の作成と発現
多くの遺伝的に修飾されたNGFおよびBDNFの分子は、そのような修飾がN
GFまたはBDNFの作用の特異性を変えるものであるかを調べるために作成し
た。コンストラクト(構築体)は、重複伸長による遺伝子スプライシングを達成
するために、ポリメラーゼ鎖反応を用いて作った(Horton et al、
、 1989. Gene 77:6l−68)。
6、l、材料と方法
6、l、1.キメラ分子の構築
3つのオリゴヌクレオチドブライマーを利用する一段階のポリメラーゼ鎖反応、
または、その代わりに4つのオリゴヌクレオチドプライマーを利用する3段階ポ
リメラーゼ鎖反応によりキメラ分子を作るプロトコールを設計した。これらの方
法を用いて、8ONFとNGFをコードする配列の部分からなるR2〜RIOと
称される9種類のキメラおよびNMIとBMIの2種類のキメラ(この2種類の
キメラは、それぞれがNGFとBDNF上に「付加されたJ mycタンパク質
の部分をコードする核酸からなる; この付加配列は、glu−1ys−1eu
−ile−ser−glu−glu−asp−1euである)を作った。
キメラR1のために、hNGFを、C1al制限部位を含む5°−オリ培とNo
t1部位を含む3゛−オリゴにより増幅した。次に、PCRフラグメントをpC
8hB (PI)のNarl/Not1部位にサブクローン化した。
キメラR1を作るために用いたオリゴヌクレオチドは以下の通り5 ’ −GC
TATGCGCCGCGGATCCTTATCATCTCACAGCC第1図は
、ttortonらにより記載された方法(1989,Gene 77:6l−
68)の改良法を用いて、重複伸長による遺伝子スプライシングを行なうために
、3種類のオリゴヌクレオチド(ASB、およびCと称する)を一段階ポリメラ
ーゼ鎖反応(PCR; 5aikf et al。
1985、5cience 230: 1350−1354)に使用することを
示す図である。
3種類のオリゴA”、B″、および“C′″は、100:l:100の比率で、
hBDNF (pC8−ha (PI)と称される、pCDMa中のヒトBDN
Fのための発現プラスミド)およびhNGF (British Biotec
hnology Ltd、より購入したヒト合成NGF遺伝子)である二つの鋳
型を用いる一段階PCR反応に用いた。最初の2〜3ステツプ中の非対称増幅の
結果として、主として一末鎖生成物A−Bができた。
次に、これはオリゴCで増幅され、融合生成物A−Cを形成した。
この方法を用いて、BDNF分子の主な部分の置換は、成熟BDNP分子の一部
をNGF分子の一部と融合させることにより行なった。融合の位置は、5°末端
のNGF配列と3′末端のBDNF配列から構成される中間オリゴ(“B″)に
より規定される。通常用いられる増幅条件は、35サイクルのために、94℃で
1分間、43℃で2分間それに72℃で3分間であった。PCRフラグメントは
ゲルにより精製し、Narl/Notlで消化し、pc8hB (PI)の対応
部位中にサブクローン化した。この方法を用いて、キメラR2〜5 (pc8h
B/hN−R1−9C8hB/、hN−R5と称する)を構築した。表3は、5
°オリゴヌクレオチド(図1のプライマーAに対応する)、中間オリゴヌクレオ
チド(図1のプライマーBに対応する)、および3′オリゴヌクレオチド(図1
のプライマーCに対応する)を含む、キメラR2、R3、R4、およびR5を作
るために用いた3種類のオリゴヌクレオチドを示している。
(本頁以下余白)
表3
R2、R3、R4およびR5キメラの構築に用いたオリゴヌクレオチドプライマ
ー
中間オリゴ
同じ5°−オリゴと3°−オリゴをキメラR3〜R5のために用いた(本頁以下
余白)
6.1.l、2.三段階ポリメラーゼ鎖反応を用いるキメラ分子第2図は、重複
伸長による遺伝子スプライシングを行なうために、4種類のオリゴヌクレオチド
(A、B、C,およびDと称する)を3段階PCR反応に使用することを示す概
要図である。プライマーBおよびCは、NGF配列の部分を含んでいたので、最
終的な反応生成物は、BDNFの比較的小さい配列がNGF配列により置換され
たキメラ分子であった。
第2図に示すように、ブルースクリプト・ベクター(Stratagene)中
のhBDNFを5°オリゴ(A)および中間オリゴ(B)により増幅L、一方、
900M8中ノhBDNFハ、中間オリゴ(C)および3゜−オリゴ(D)によ
り増幅した。これらの2種類のPCRフラグメントは、ゲルにより精製し、アリ
コートをそれに続く反応で結合した。その2種類の中間オリゴヌクレオチドは、
それらの5′末端で重複するNGF配列を含んでいたので、その2種類のPCR
フラグメントA〜BとC〜Dは、重複域において互いにハイブリダイズすること
ができ、従って、5゛および3°オリゴヌクレオチドにより増幅することができ
、その結果、NGFによる小さい置換を含んだPCRフラグメントができた。こ
のフラグメントは、Narl/Notlで消化し、pC8−hB (PI)中の
対応する部位の中にクローン化した。
出発物質として異なるベクター中にクローン化された、各々が独自の末端オリゴ
(それぞれプライマーAおよびD)を有する2種類のBDNF鋳型を用いること
により、偽のネガティブ(false negatives)が得られる可能性
を回避した。この方法を用いて、キメラR6〜10 (pC8hB/hN−R6
、pC8hB/ mN−R7〜pC8hB/ mN−RIO)を作成した。キメ
ラR6のために、pBS−heをプライマーAおよびBのための鋳型として用い
、一方、合成hNGFをプライマーCおよびDのための鋳型として用いた。
表4は、キメラR6、R7、R8、R9、およびRIOの構築に用いたオリゴヌ
クレオチドブライマーを示している。
(本頁以下余白)
表4
R6、R7、R8、R9およびRIONMIおよびBMIキメラの作成に用いた
オリゴヌクレオチド
同じ5′−オリゴと3°−オリゴをキメラR8〜RIOのために用いたキメラ
RlO
hi
中間オリゴ
M1
6.1.1.3. myc付加を含むキメラ分子の作製前述の、3つのオリゴヌ
クレオチドプライマーを利用する一段階PCR反応を使用して、ヒトmyc蛋白
質の10個のアミノ酸より成る抗原ペプチド断片で付加しである、NGFもしく
はBDNFをコードする発現プラスミド類を作製した(本明細書中に参照により
引用される、1990年6月1日付けの、米国特許出願No、071532,2
85を参照)。この一段階PCR技術を用いて、2つのグリシンをコードする架
橋を通して10個のアミノ酸のmycエピトープをコードする配列に接続されて
いるマウスのNGF遺伝子(長いNGF前駆体をコードするプラスミドであるp
B15−NGFに由来する)を含むPCR産物を作成したが、このPCRCラプ
ライマー類然のNGF遺伝子の最後の2つのコドンを削除したPCR産物をもた
らすように設計されており、その理由は、これらのコドンによりコードされてい
るアミノ酸がmycエピトープの欠失を結果的に招く蛋白質分解の開裂部位に相
当する可能性があるためである。3°端にmycを付加しであるmNGF (p
C81mN/myc−NMIと表示する)を作製するために、長いプレプロを有
するマウスのNGF (20n g)を、5“オリゴヌクレオチド、中間部分の
オリゴヌクレオチド、及び、3′オリゴヌクレオチドをそれぞれ100.11及
び1100nの濃度で用いて増幅させた(図3A)。使用した増幅条件は以下に
示すとおりである294℃で1分、43℃で2分、及び、72℃で3分を35サ
イクル。結果として生じるPCR産物を、その後、Xhol/Notlで消化し
、更に、Xhol/N。
tlで消化しであるCDM8ベクター内にクローン化した。3゛端にmycエピ
トープを付加しであるBDNF (pC8hB/myc−BMIと表示する)を
同様の手法を使用して作製した(図3B)。
同様の技術を使用して、2つのグリシンをコードする架橋を通して、10個のア
ミノ酸より成るmycエピトープをコードする配列に接続しであるヒトBDNF
遺伝子を含むPCR産物を作製したが、NGF/myCキメラについてと同様に
、このPCRCラプライマー類然のBDNF遺伝子の最後の3つのコドンが除去
されたPCR産物を生じるように設計されており、その理由は、これらのコドン
によりコードされているアミノ酸類がmycエピトープの欠失を結果として生じ
る蛋白質分解の開裂部位に相当する可能性があるためである。このPCR産物を
、その後、Nar1/Notlで消化し、更に、親プラスミドであるヒトBDN
F発現プラスミド、pC8hB (PI)内にサブクローン化して発現プラスミ
ドpC8hB/myc (BMI)を作製した。
8、 1. 2.キメラ神経栄養因子発現構造物のトランスフェクション及びC
O8細胞中における発現前述の哺乳類の発現構造物類の各々についてのプラスミ
ドDNAを、塩化セシウム濃度勾配を通して2回のバンド形成(ダブルバンディ
ング)を行うことにより調製した。精製したプラスミドDNAを、その後、リン
酸カルシウム共沈殿法(Chen and Okayama、Mo1. Ce1
1. Biol、 7:2745 (1987) )によりC08−M5細胞中
にトランスフェクトさせた。C08−M5細胞を、トランスフェクションの24
時間前に、60mmプレート内に、グルコース(4500ttg/ml)及び1
0%のウシ胎児血清を含む2.5m1のダルベラ:I (Dulbecco)改
変型イーグル(Eagle)培地中で、プレート当たり5X10’細胞の密度で
まいた。トランスフェクトさせた細胞からの培地を、バイオアッセイのためにト
ランスフェクションの48時間後に収集した。代謝ラベル化もこの時に行った(
下記)。
トランスフェクション後48時間して、CO8−M5細胞を、メチオニン及びシ
スティンを含まず、かつ、インシュリン、トランスフェリン及びセレニウムを含
む、3mlのDMEM (無血清)中に入れた。この細胞を、5%のCO2中に
おいて37℃で1時間、アミノ酸飢餓状態に曝した。1ミリリツトルの無血清D
MEMを除去し、更に、C08−M5細胞を、3′s−メチオニン及び358−
システィン(各100μCi/ml)で4時間ラベルした。ラベル化したC08
−M5細胞上清を回収してSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し
た。図4は、代謝的にラベル化したhBDNF、mNGF、hBDNF/myc
(キメラBMI)、及び、mNGF/myc (キメラNMI)の分割を示N
GF及びBDNF遺伝子の一部分を、ポリメラーゼ・チェーン・リアクションに
おけるプライマーの重複伸長を利用して一緒にスプライスした。比較的大きい(
キメラ R1−R5)もしくは小さい(R6−RIO)領域がNGF配列に置換
されているキメラ分子が作製された。R1−R1Oのアミノ酸配列を図5に示し
である。キメラ R1からR6はヒトBDNF及びヒトNGFの一部分を含み、
かつ、キメラ R7がらRIOはヒトBDNF及びマウスNGFの一部分を含む
。表5は、キメラ R1がらFloにおけるBDNF及びNGF配列の大まがな
領域の概略を示(本頁以下余白)
表5
R1プレプロ配列 完全な成熟配列
R2プレプロ配列 残基18−120
残基1〜17
R3プレプロ配列 残基59−120
残基1−58
R4プレプロ配列 残基73−120
残基1−72
残基67−118
残基80−118
更に、myc蛋白質の10アミノ酸抗原ペプチドで付加しであるNGF及びBD
NFをコードするキメラ分子類を作製した。NGF/myc (キメラ NMI
)及びBDNF/myc (キメラBMI)の推定アミノ酸配列を図5に示しで
ある。
このキメラ構造を各々リン酸カルシウム共沈殿によりCOS −M5細胞中にト
ランスフェクトさせた。キメラ R1−RIOの発現は代謝ラベル化及び生物活
性アッセイにより検証される。NMl及びBMIの発現を証明する目的で、NM
IもしくはBMIでトランスフェクトさせたCO8細胞を[’S] −メチオニ
ンで代謝的にラベル化し、その上清をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、
更にその後、電気泳動的に分離した蛋白質をナイロン膜に移してオートラジオグ
ラフィーを行った(図4)。BDNF及びキメラ BMIについては、同定され
たラベル化蛋白質の主要バンドはこれらの蛋白質類の前駆体型に相当する31k
Dのバンドであった。前駆体バンドの強度を比較することにより、これら2つの
蛋白質はほぼ同等に発現されていることが明白である。
この31kDの蛋白質バンドはCO3−擬似レーン(レーンl)には存在しない
。NGF及びキメラ NMIについては、これらの蛋白質類の成熟型(約12.
5kD)の同等の発現が観察された。予想されたように、mycが付加されてい
るNGF (NMI)は、NGFに比較して若干遅れて泳動した。全てのBDN
F/NGFキメラ(R1−RIO)は、BDNFに類似するレベルで31kDの
前駆体蛋白質を主に発現した。
全てのキメラ(R1−RIOl並びに、BMI、及び、NMI)、及び、天然の
BDNF及びNGFを先に記載したようにC03−M5細胞中で発現させた。ト
ランスフェクトさせた細胞から収集した上清は、組織移植片及び解離させた細胞
培養物を利用して特定の神経節の神経突起の発生を誘発させる能力についてバイ
オアッセイで測定した。
キメラ類の活性は、を髄神経節(D RG)もしくは交感神経節(SG)からの
培養解離細胞の生存率の測定により検定した。簡単に述べると、R8−9のニワ
トリの胚から神経節を切り出し、血清含有培地(10%のFBS、ストレプトマ
イシン、ペニシリン、及び、グルタミンを補給しであるDMEM)中に集めた。
0.5%のトリプシン(Worthington社)でのトリプシン処理後、細
胞を緩やかに摩砕し、その後、60mmの表面未処理プラスティック皿上に予備
プレートした。この予備プレート段階(2−3時間)により非ニューロン細胞が
付着する。付着しなかったニューロン細胞をその後−まとめにし、遠心し、血清
含有培地中に再懸濁させ、更に、血球針によりカウントした。ニューロンの生存
は、細胞数の定量化、あるいは、MTT (3−(4゜5−ジメチルチアゾール
−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)の生存細胞によ
る紫色の産物への変換に基づく比色定量アッセイのいずれかにより評価すること
ができる。細胞計測法については、細胞を、24,000細胞735mm皿の密
度でまき、細胞数測定の前に、発現されたキメラ蛋白質を含むCO8上清の存在
もしくは非存在下で48時間培養した。MTT法については、細胞を、1000
細胞/A2ウエルの密度でまいた。まいた後40時間目に、MTT染料を0.5
mg/mlの濃度で添加した。生存細胞に取り込まれた染料を8時間後にイソプ
ロパツール中の0.08NのHCIの添加により可溶化させ、更に、吸光度(5
70−650nm)を測定した。吸光度は添加したCO8上清の様々な希釈度の
関数としてプロットした。
?、1.2. PC12細胞のバイオアッセイトランスフェクトさせた細胞から
のC08−M5細胞上清を、PCI2細胞分化アッセイのために、トランスフェ
クト後48時開目に収集した。PCI2細胞を、ウェル当たりlXl06細胞の
密度で24ウエルのプレー)(Costar社)にまいた。PCI2細胞を、6
%のウシ胎児血清及び6%のウマ血清を含むRPM11640中で培養した。C
OS上清を、1:5と1:500との間の様々な希釈率で、PC12細胞培養物
(総容量1m1)に添加した。神経突起の発生を、+(大部分の細胞が神経突起
を発現する)、もしくは、−(あるとしてもほんの僅かな細胞が神経突起を発現
する)のいずれかで評価した。
ニワトリの末梢神経節を使用するインビトロアッセイが、NGFとBDNFの生
物活性を識別するために使用されている。両方の因子が神経層に由来するを髄神
経節(DRG)中に存在する知覚ニューロン群に作用する一方、BDNFのみが
板(Plac。
de)由来の節状神経節(NG)の知覚ニューロンに作用する。
対照的に、NGFはを椎傍鎖系の交感神経節(SG)のニューロンの生存及び増
殖を促進することができるが、BDNFにはその作用がない。我々は、これらの
インビトロでの神経節アッセイを使用して、特定のキメラ構造が、BDNF、N
GF、もしくは、BDNFとNGFの両方の生物活性を発現しているか否かを決
定した。
キメラ R7、R8、R9、RIOlBMI、及び、NMIは、を髄神経節、節
状神経節、あるいは、交感神経節の移植片アッセイにおいて、神経栄養活性につ
いて測定した。
既に証明したように、NGFとBDNFとの両方が、R8のニワトリのを髄神経
節(DRG)からの神経突起の成長を促進する。BDNFのみが、節状神経節(
NG)と共にアッセイした場合に神経突起成長の活性を発現したが、NGFは交
感神経節(SG;表6)についての活性を発現し、BDNFは発現しなかった。
BDNF/NGFキメラ R8は、DRG及びSGの両方からの神経突起の発生
を促進し、NGF様生物活性の特性を示した。
c−mycプロト腫瘍遺伝子のlOアミノ酸エピトープで付加したキメラの内の
BMIはSG活性を発現してNGF様活性の特性を示す一方、NMIはBDNF
様活性に特徴的なNGについての幾分かの活性を発現した(表6)。
(本頁以下余白)
表6
移植したニワトリの胚のを髄神経節(DRG) 、節状神経節(NG) 、及び
、交感神経節(SG)についてアッセイした場合のBDNFSNGF、BDNF
/NGFキメラ類及びmycで付加見ム豊旦未!恩五q焦軟−一一−−一一−−
−−−−−−−−−R7(250μl) 3 1 0
R8(250μm) 3−4 2 3
R9(250μm) 2−3 2 0
RIO(250μm) 3−4 2 0NGF 5 1 5
BDNF ・ 3 2 0.5
pCDM8対照(250μm)O−10,50,5BMI(250μm) 2−
3 2 12NMI(100μl) 5 3 5
評定値は観察された神経突起の成長及び分岐の程度を反映し、5が最高評定値で
あり、かつ、0は神経突起の成長が無い場合である。評定値は3回の独立した実
験の代表値である。神経突起の成長は、神経栄養因子の添加後24時間と48時
間の間に評定した。
表8から、用量反応実験において、神経突起の成長の誘導に関して、NMIはを
髄神経節及び交感神経節アッセイにおいてNGFに匹敵する活性を有することが
わかったが、NMIは節状神経節アッセイにおいてより活性が高かったことがわ
かる。mycで付加したNGFに関して、表7からは、NMIが50μlでを髄
神経節ニューロンの約63パーセントを救済する一方、NGFは約47パーセン
トのみを救済することがわかった。これにより、NMIはニューロン生存に関し
てNGFのアゴニストとして作用しうろことが判明した。
図6は、BDNF、NG、もしくは、BMIにさらしたDRG及びSGニューロ
ンについてのMTTを用いた比色定量アッセイの結果を示している。図6中に示
されているように、BMIの生存促進活性は、DRG及びSGの両方において、
BDNFよりも有意に高かった。NGFに類似して、DRG及びSGの両方にお
けるこの活性は、BMIのCO8上清の1:1000希釈液においてさえも滴定
値が0にならなかった。従って、BDNF分子の3’ mycの付加はその分子
にSG活性を付与する。
(本貫以下余白)
表7
E8のニワトリ胚からの解離したDRGニューロンの生存についてアッセイした
場合のNGF及びNMI活性の比較DRGニューロンの数
NGF 5μ 336
20μ 440
50μ 408
NMI 5μ 334
20μ 446
50μ 542
カウントされたDRGニューロンの数は総面積の3.6%に相当し、これは、2
つの皿から得られた結果の平均値である。NGFのCO8上清は50μlで約4
7%のDRGニューロンを救済するが、等容量のNMIは約63%のニューロン
を救済する。
(本頁以下余白)
表8
E8のニワトリのDRGSNG、及び、SCGの移植片についてアッセイした場
合のNGF及びNMI活性の比較DRG NG SCG
神経突起の成長は、神経栄養因子の添加の24時間後に評定した。
7.2.2. PC12バイオアッセイラットPCI2細胞は神経成長因子を初
めとする数々の作用因子に反応して分化することがわかっている。神経成長因子
により誘導される分化反応は、細胞増殖の停止及び長い神経突起伸長部の成長に
関連している。従って、この分化アッセイは、神経成長因子様活性を有する分子
を同定するために有用である。我々は我々のキメラ構造物類の全て及び天然のB
DNFとNGFとを、それらがPC12細胞の神経突起の成長を誘導する能力に
ついてテストした。
表9に示されているように、NGFは、1:250の希釈においてさえ有意な神
経突起促進活性を有した。NMIもやはり1:250希釈において活性であった
。キメラ R8(これは交感神経節に対して活性を発現した一表1を参照)は、
l:50希釈において、PCI2細胞の神経突起の成長を誘導することが可能で
あった。驚いたことに、同様の結果がBMIについても得られ、BMIは親分子
であるBDNFにおいては存在しない神経栄養活性を示した。BDNFのみが、
1:5の希釈で、PC12細胞について弱い神経突起の成長活性を発現した。C
O3−擬似は活性を示さなかった。キメラ R1−R5、及び、R7、R9、及
び、R10は活性を示さなかった。
従って、組織移植片及びPCI2細胞の両方についてのアッセイでは、BDNF
及びNGF分子のC末端への無関係な配列の付加が、親分子中に存在しない新規
な生物学的活性を付与している。
(本頁以下余白)
表9
キメラ 1:5 1:25 1:50 1:100 1:250 1:500C
oS−MOCK −−−−−+
PC12細胞は、神経栄養因子の添加後24時間と48時間の間に、神経突起の
成長について評定した。
(本頁以下余白)
8、実施例: NGF/BDNFキメラ神経栄養因子類の作製及NGFの領域を
BDNFの対応する領域で置換したキメラ神経栄養因子類を作製した。
NGF/BDNFキメラを、前述の第6.1.1.2節において記載したように
、4つのオリゴヌクレオチドを用いる3段階PCR反応により作製した。各事例
においては、最も外側のプライマー(図2及び図7中のA及びDに対応する)は
オリゴヌクレオチド T7及びT3 (Stratagene社)であった。図
7はキメラの作製に使用した方法の概略図であり、表1Oは図7中のプライマー
B及びCに対応するオリゴヌクレオチドプライマーの配列を示している。T3プ
ライマーの配列は、5’ −ATTAACCCTCA CTAAAG−3°であ
り、かつ、T7プライマーの配列は、5’ −AATACGACTCACTAT
AG−3°である。簡単に述べると、マウスのベーターNGFをコードするcD
NAを、もとのSma I及びPstI部位で切断しく5cott et al
、、1983、Nature 302:538) 、更に、pKS(Strat
agene社)のSmaI/PstI制限部位内へサブクローン化させた。結果
として生じるプラスミドKS−NGFは、以下に続<PCR増幅全てのための鋳
型として役立てた。
キメラ分子類は、NGF及びBDNFの希望する部分に広がるオリゴヌクレオチ
ドブライマーと共にT7プライマーを使用して5°断片を増幅することにより作
製した。その後、3°断片を、T3プライマー及び2回目用に設計したNGF/
BDNFプライマーを使用して増幅させた。第2PCR増幅段階においては、1
100−300nの各断片を−まとめにし、融合させ、更に、T7及びT3プラ
イマーを使用して増幅させた。全てのPCR反応は、以下に示す条件下において
行った。
変性は、94℃において3分間行い、次に、94℃において1分、50℃におい
て2分、及び、72℃において3分からなる25サイクルの変性/復元を行った
。その後、72℃において10分間伸長反応を行わせた。PCRGene−Am
p k i t (Cetus)を、製造元の指示に従って使用した。
増幅させた断片を、その後、EcoRI及び5acIIで切断し、更に、SRア
ルファープロモーターを含む改変させたpBJ−5発現ベクターの対応する制限
部位内にサブクローン化させた(図8 ; Takebe et al、、19
88、Mo1. Ce11. Biol、 8:466) o しかしながら、
キメラIにおいてはサブクローニングについて5acIIの代わりにNot■を
使用したが、それは、内部のSac I■部位を既に作製してあったためである
。全てのキメラは、シークエナーゼプロトコール(Stratagene社)を
使用して、完全に増幅した領域にわたる配列を決定した。
(本頁以下余白)
表10
プライマー2(C) (コ3−mar)51 − CG GACCCCGCCC
GCCGCGGG GAG TrCTCA GTG ? −31プライ7− C
NGF’TYR−54B: 5l−CTT GGT CTCATA AAA G
TA CTG −3#(C) NGFSER−108B= 5’ −CA CA
CACA GGA AGT GTCTAT C−3’8.1,2. CO8細胞
中におけるキメラ神経栄養因子類CO8−7細胞をDEAE−デキストラン−ク
ロロキン法を使用してキメラ構造物でトランスフェクトさせた。簡単に述べると
、細胞培養物をトランスフェクションの一日前にそぎ取り、60mmの培養皿当
たり約750.000細胞が存在するようにした。5μmのDNA (約5μg
)、1mlのDMEM (無血清)、及び、25μmの20mg/mlのDEA
E−デキストランを含むトランスフェクション混合物を調製した。培養したC0
8−7細胞を、その後、5 m lの無血清DMEMで3回洗浄した。先のトラ
ンスフェクション混合物(上述)を添加し、更に、37℃において30分間イン
キュベートした。2mlの無血清DMEMをその後20μmの8mMクロロキン
と合わせ、更に、CO8−7細胞/DNA/DEAE−デキストラン混合物に直
接添加し、それをその後、37℃において2時間30分インキュベートした。
上清をその後細胞から吸引して除き、10%のジメチルスルフオキシド(DMS
O)を含む2mlの無血清DMEMで置換した。
この細胞をその後室温で2分30秒インキュベートし、この後、細胞を5mlの
DMEで洗浄し、この洗浄液を吸引で除去し、更に、6%のウマ血清及び6%の
鉄分を補給したウシ血清を添加しである約2.5mlの新鮮なりMEMで置換し
た。細胞はその後以下に述べであるように48から72時間後にキメラ神経栄養
因子の発現についてアッセイした。
8.2. 結果及び考察
NGFをコードするDNAの一部分が一定の間隔で対応するBDNF領域により
置換されているキメラ核酸分子を作製した。表11には、各キメラについて、N
GF領域の欠失を対応するBDNF領域の挿入と共に示しである。S−6及び5
−11は、3段階PCRによっても作製される点突然変異のみを有することに留
意されたい。
(本頁以下余白)
表11
5−10 8GF (Δ92−101 / BDNF 92−102)BDNF
配列の置換領域を図9にグラフで示し、更に、5l−12のアミノ酸配列を図1
0に示した。5l−12の各々は、マウスNGFのコーディング配列及びヒトB
DNFのコーディング配列の一部分を含むことに留意されたい。
このキメラ神経栄養因子5l−12を、各々、DEAE−デキストラン−クロロ
キン法を使用してCO5−7細胞中にトランスフェクトさせた。キメラ神経栄養
因子類の発現は、[”S] −メチオニンでの代謝ラベル化及びそれに続くラベ
ル化細胞上清のポリアクリルアミドゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーに
より測定した。データは、野生型NGFに対するパーセントとして表12に示し
た。このデータは、約13kdにおける成熟NGFバンド上に特別に焦点を当て
たオートラジオグラフィー(図8B)、及び、抗−NGF抗体を使用した野生型
NGF及びNGF/BDNFキメラ類の免疫沈降後のオートラジオグラフィー(
図80)のラベル化強度を比較することにより作製される。
を髄神経節(DRG) 、交感神経節(sG)、節状神経節(NG)、及び、P
C12好クローム性細胞腫細胞株を利用するバイオアッセイを、主に、上述の第
7節において記載されているようキメラ 5l−12のNGF活性は、最初にP
C12細胞を使用して評価した。PCl3の神経突起成長を、NGF活性の指標
さして使用した。各キメラの活性は、トランスフェクトさせたC08−7細胞に
より発現される組換え野生型NGF (NGF−wt)の活性に比較して決定す
るが、この組換え野生型NGF活性を任意に100パーセントの発現値とした(
表12)。各キメラについての特異活性を、代謝ラベル化してトランスフェクト
させたCO3−7細胞の上清の5DS−PAGE分析を使用してキメラ神経栄養
因子濃度を推定することにより決定したが、やはり、NGF−wtでトランスフ
ェクトさせたC08−7細胞に関連する神経栄養活性を任意に100パーセント
の値とした。
E8のニワトリ胚から取得されたを髄神経節(DRG)、節状神経節(NG)
、及び、交感神経節(S G)の移植片培養物を、その後、等量の5L−12、
NGF−wt、及び、ベクター(陰性対照)でトランスフェクトしたCO3−7
細胞上清にさらした。24時間培養後、組換え野生型NGF、陰性対照ベクター
、もしくは、キメラ 5l−12に反応する繊維の成長を、用量範囲0から20
ng/mlのNGFに対するE8ニワトリのDRGのピコグラム/mlのNGF
に対する典型的な応答に等しい)を有する検出可能な活性を意味し、評定2は明
らかなハロ(hal。
の豊富な成長を伴う強い活性を意味し、かつ、評定5は飽和レベルのNGF (
約1−10ナノグラム/m1)に対する最大反応に匹敵する大量の繊維の成長を
意味する。表12における移植片の結果は、用量反応アッセイにおいて決定され
た各上清の飽和レベルにおいて観察された最大の繊維成長を示している。上清は
、最終容量2mlとして、0. 1から83μmの範囲にわたりアッセイした。
他の移植片実験においては、より高い濃度の84が、より高い成長評定値に関係
していた。
(本頁以下余白)
表12
相対発現 PC12細胞に 移植片データネクローン レベル 対する比活性
DRG NG S、C。
NGF−wt loom 1ook 5 1 5ベクター −−−−−−o o
0
5−1 200% 25% 5 1 5S−2100m loom 5 2 5
S−31ootlook5コ5
S−420% Loot l 1 1
g−55% Root l l 1
5−61oot1oot−535
S−75(n loom 5 2 5
B−8Loot 1ook 5 2 5S−91oot 1oot 5 4 5
s−101oot 100m 5 4 5S−LL Sot 50智 5 15
g−121oot 50% 5 3 5* 24時間にわたる繊維の成長
9.3. 考察
驚くべきことに、このデータは、BDNF配列でのNGF領域の置換にもかかわ
らず、多くのNGF−BDNFキメラ類が、NGF応答細胞に対して完全な活性
を保持していることを示唆している。等量の大部分のキメラ神経栄養因子がPC
12細胞についての高レベルの神経突起成長促進活性を示し、この活性は野生型
NGFの活性に匹敵するものであった。例外が存在し、つまり、S−1は野生型
NGFと比較して著しく低い活性を示しているようであり、更に、キメラ 5−
11及び5−12はNGFの比活性の約50パーセントを示すことが観察された
。しかしながら、大部分のキメラにおける完全なNGF活性の保持は予期できな
いことであった。というのも、NGF配列の重要な領域におけるいくつかの小さ
い変化が実質的な活性消失へ導きうろことが当初より予測されていたためである
。
更に、NGFのように、本明細書中において論議されている多くのキメラ神経栄
養因子類は、を髄神経節及び交感神経節の移植片に対して最大の反応を誘導する
ことが観察されている。表12に示されるように、テストした全てのキメラは実
質上、を髄神経節及び交感神経節に対して最大の活性を示した。キメラ 5−1
2は、を髄神経節の移植片に対して、NGFよりも3−5倍強い比活性を有する
ことが観察され、これにより、5−12は少なくともある種の標的細胞に対する
NGF活性の「スーパーアゴニスト」であることがわかる。5−12のスーパー
アゴニスト活性についての可能な説明は、BDNF配列の置換がNGFの構造に
おけるコンホメーシコンの変化を生じさせ、それが結果的にNGFレセプターに
ついての5−12の親和性を増大させるか、あるいは、分解過程に対する5−1
2の安定性を増大させることがあるということかもしれない。
更に、多くのキメラ類は、NGFよりもBDNFに対して通常より反応性が高い
神経節に対して、追加的な活性を示すことが観察された。NGFはニワトリ胚の
を髄神経節の知覚ニューロン及びニワトリ胚のを椎傍の交感神経節の移植片培養
物の生存及びそれからの神経突起の成長を促進するが、板(P l a c o
d e)由来の節状神経節の知覚ニューロンの移植片には何の効果も示さなか
った(Lindsay et al、、1985、Dev、 Biol、 11
2:319) 、逆に言えば、BDNFは、を髄神経節の移植片及び節状神経節
の移植片の生存及びそれからの神経突起の成長を促進するが、交感神経節には何
の効果も示さない。表12に示されているように、多くのNGF−BDNFキメ
ラ神経栄養因子類はを髄神経節の移植片の中程度から強い繊維の成長を誘導し、
これにより、BDNF様活性が示される。キメラ 3.4.6.9、lOl及び
、12の全てのものは、NGFで観察された効果に比較するとかなり強い、節状
神経節についての活性を示すことが観察された。従って、NGFのアミノ末端か
らカルボキシ末端にわたる範囲の多様な配列変換は、BDNF様活性もしくはニ
ューロトロフィンファミリーの他のメンバーの活性を付与しつることが明らかで
あろう。
10、微生物類の寄託
以下に示すcDNAは、アメリカン タイプ カルチャー コレクション(メリ
ーランド州ロックビル)に寄託した。
キメラ分子名 略称 受託番号
pBJ51mN/hB−84S4 40859pBJ51mN/hB−89S9
408611)BJ51mN/hB−8LOSIo 408581BJ51m
N/hB−812S12 40860pC8hB/mN−R8R840862p
C8mN/myc−NMI NMI 40864pC8hB/myc−BMI
BMI8 40863本発明は、本明細書中において記載されている特別な実施
態様による範囲内に限定されるものではない。実際に、本明細書中において記載
されているものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の記載及び添付の図面か
ら当業者には明白となることであろう。このような改変は、添付される特許請求
の範囲内に含まれるものである。
(本貫以下余白)
FfG、4
50μz cos上清からの希釈
FIG、6A
50μz cos上清がらの希釈
FjG、6B
−O−E9cDRG 8MI
FIG、6C
FfG、7
FIG、8A
ベクター
野生型
嘲し
−偕吟:、 −喫一−am≠湯費臂好浄・コシか19゛”−% −−1、
ベクター
M NGF S−I S−2S−35−45−5S−6野生型
FIG、 8G
ベクター
M S−7S−8S−95−10NGF 5−11 5−12野生堅
賑
区
区
区
国際調査報告
’Eerisl No、PCT/LI891105g1@^rt Unit 1
814
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Summer of Claims Grou in @The elai*s
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ly exel“1゛°1°6゛2°ndent@11 follovs+
フロントページの続き
(72)発明者 スーター、ウルリックアメリカ合衆国 94025 カリフォ
ルニア州 メン口 パーク、シャロン パークドライブ エフナンバー304.
350(72)発明者 アイビー、ナンシー
アメリカ合衆国 06902 コネチカット州スタムフォード、エメリー ドラ
イブ
(72)発明者 スクイント、ステファン ピー。
アメリカ合衆国 10533 ニューヨーク州アーヴイントン、バーク レーン
281(72)発明者 ファース、マーク イー。
アメリカ合衆国 10803 ニューヨーク州ペラム、バイブルック アベニュ
ー 斜(72)発明者 リンゼイ、ロナルド エム。
アメリカ合衆国 10510 ニューヨーク州プライアークリフ メイナー、チ
ャッパカ ロード 479
(72)発明者 ヤンコパウロス、ジョージ ディー。
アメリカ合衆国 10510 ニューヨーク州プライアークリフ メイナー、ス
リーピー ホロー ロード 428
Claims (98)
- 1.神経栄養活性を有し、かつ(i)細胞因子の少なくとも一部および(ii) 他のペプチドの少なくとも一部を含む、キメラ神経栄養因子。
- 2.細胞因子が神経栄養因子である、請求項1記載のキメラ神経栄養因子。
- 3.細胞因子が神経成長因子である、請求項1記載のキメラ神経栄養因子。
- 4.細胞因子が脳由来の神経栄養因子である、請求項1記載のキメラ神経栄養因 子。
- 5.細胞因子がニューロトロフィン−3である、請求項1記載のキメラ神経栄養 因子。
- 6.細胞因子が毛様体の神経栄養因子である、請求項1記載のキメラ神経栄養因 子。
- 7.ペプチドが細胞因子である、請求項1記載のキメラ神経栄養因子。
- 8.ペプチドが神経栄養因子である、請求項1記載のキメラ神経栄養因子。
- 9.ペプチドが神経成長因子である、請求項1記載のキメラ神経栄養因子。
- 10.ペプチドが脳由来の神経栄養因子である、請求項1記載のキメラ神経栄養 因子。
- 11.ペプチドがニューロトロフィン−3である、請求項1記載のキメラ神経栄 養因子。
- 12.ペプチドが毛様体の神経栄養因子である、請求項1記載のキメラ神経栄養 因子。
- 13.ペプチドが抗原性ペプチドである、請求項1記載のキメラ神経栄養因子。
- 14.ペプチドがmycタンパク質の一部である、請求項1記載のキメラ神経栄 養因子。
- 15.ペプチドが配列【配列があります】を有するペプチドである、請求項14 記載のキメラ神経栄養因子。
- 16.細胞因子がニューロトロフィン遺伝子ファミリーのメンバーの神経栄養因 子である、請求項1記載のキメラ神経栄養因子。
- 17.約9−10のpIを有する、請求項16記載のキメラ神経栄養因子。
- 18.キメラ神経栄養因子のアミノ酸配列中の次の位置:アミノ酸14付近、 アミノ酸57付近、 アミノ酸67付近、 アミノ酸79付近、 アミノ酸108付近、 およびアミノ酸110付近、 のうちの4つの位置に、またはニューロトロフィンファミリーのメンバーにより 共有される相同配列中の挿入または欠失に関連した同様の位置に、4個のシステ イン残基を含む、請求項16記載のキメラ神経栄養因子。
- 19.キメラ神経栄養因子のアミノ酸配列中の次の位置:アミノ酸14付近、 アミノ酸57付近、 アミノ酸67付近、 アミノ酸79付近、 アミノ酸108付近、 およびアミノ酸110付近、 のうちの5つの位置に、またはニューロトロフィンファミリーのメンバーにより 共有される相同配列中の挿入または欠失に関連した同様の位置に、5個のシステ イン残基を含む、請求項16記載のキメラ神経栄養因子。
- 20.キメラ神経栄養因子のアミノ酸配列中の次の位置:アミノ酸14付近、 アミノ酸57付近、 アミノ酸67付近、 アミノ酸79付近、 アミノ酸108付近、 およびアミノ酸110付近、 のうちの6つの位置に、またはニューロトロフィンファミリーのメンバーにより 共有される相同配列中の挿入または欠失に関連した同様の位置に、6個のシステ イン残基を含む、請求項16記載のキメラ神経栄養因子。
- 21.キメラ神経栄養因子のアミノ酸配列中の次の位置:アミノ酸14付近、 アミノ酸57付近、 アミノ酸67付近、 アミノ酸79付近、 アミノ酸108付近、 およびアミノ酸110付近、 のうちの4つの位置に、またはニューロトロフィンファミリーのメンバーにより 共有される相同配列中の挿入または欠失に関連した同様の位置に、4個のシステ イン残基を含む、請求項17記載のキメラ神経栄養因子。
- 22.キメラ神経栄養因子のアミノ酸配列中の次の位置:アミノ酸14付近、 アミノ酸57付近、 アミノ酸67付近、 アミノ酸79付近、 アミノ酸108付近、 およびアミノ酸110付近、 のうちの5つの位置に、またはニューロトロフィンファミリーのメンバーにより 共有される相同配列中の挿入または欠失に関連した同様の位置に、5個のシステ イン残基を含む、請求項17記載のキメラ神経栄養因子。
- 23.キメラ神経栄養因子のアミノ酸配列中の次の位置:アミノ酸14付近、 アミノ酸57付近、 アミノ酸67付近、 アミノ酸79付近、 アミノ酸108付近、 およびアミノ酸110付近、 のうちの6つの位置に、またはニューロトロフィンファミリーのメンバーにより 共有される相同配列中の挿入または欠失に関連した同様の位置に、6個のシステ イン残基を含む、請求項17記載のキメラ神経栄養因子。
- 24.実質的に図10でキメラS1について示した通りのアミノ酸配列を有する キメラ神経栄養因子をコードするプラスミドpBJ51mN/hB−S1または その機能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 25.実質的に図10でキメラS2について示した通りのアミノ酸配列を有する キメラ神経栄養因子をコードするプラスミドpBJ51mN/hB−S2または その機能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 26.実質的に図10でキメラS3について示した通りのアミノ酸配列を有する キメラ神経栄養因子をコードするプラスミドpBJ51mN/hB−S3または その機能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 27.実質的に図10でキメラS4について示した通りのアミノ酸配列を有する キメラ神経栄養因子をコードする、ATCCに寄託されて受託番号40859を 指定されたプラスミドpBJ51mN/hB−S4またはその機能的均等物によ りコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 28.実質的に図10でキメラS5について示した通りのアミノ酸配列を有する キメラ神経栄養因子をコードするプラスミドpBJ51mN/hB−S5または その機能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 29.実質的に図10でキメラS6について示した通りのアミノ酸配列を有する キメラ神経栄養因子をコードするプラスミドpBJ51mN/hB−S6または その機能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 30.実質的に図10でキメラS7について示した通りのアミノ酸配列を有する キメラ神経栄養因子をコードするプラスミドpBJ51mN/hB−S7または その機能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 31.実質的に図10でキメラS8について示した通りのアミノ酸配列を有する キメラ神経栄養因子をコードするプラスミドpBJ51mN/hB−S8または その機能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 32.実質的に図10でキメラS9について示した通りのアミノ酸配列を有する キメラ神経栄養因子をコードする、ATCCに寄託されて受託番号40861を 指定されたプラスミドpBJ51mN/hB−S4またはその機能的均等物によ りコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 33.実質的に図10でキメラS10について示した通りのアミノ酸配列を有す るキメラ神経栄養因子をコードする、ATCCに寄託されて受託番号40858 を指定されたプラスミドpBJ51mN/hB−Sl0またはその機能的均等物 によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 34.実質的に図10でキメラS11について示した通りのアミノ酸配列を有す るキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドPBJ51mN/hB−S11ま たはその機能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子 。
- 35.実質的に図10でキメラS12について示した通りのアミノ酸配列を有す るキメラ神経栄養因子をコードする、ATCCに寄託されて受託番号40860 を指定されたプラスミドpBJ51mN/hB−S12またはその機能的均等物 によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 36.実質的に図5でキメラR1について示した通りのアミノ酸配列を有するキ メラ神経栄養因子をコードするプラスミドpC8hB/hN−R1またはその機 能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 37.実質的に図5でキメラR2について示した通りのアミノ酸配列を有するキ メラ神経栄養因子をコードするプラスミドpC8hB/hN−R2またはその機 能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 38.実質的に図5でキメラR3について示した通りのアミノ酸配列を有するキ メラ神経栄養因子をコードするプラスミドpC8hB/hN−R3またはその機 能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 39.実質的に図5でキメラR4について示した通りのアミノ酸配列を有するキ メラ神経栄養因子をコードするプラスミドpC8hB/hN−R4またはその機 能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 40.実質的に図5でキメラR5について示した通りのアミノ酸配列を有するキ メラ神経栄養因子をコードするプラスミドpC8hB/hN−R5またはその機 能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 41.実質的に図5でキメラR6について示した通りのアミノ酸配列を有するキ メラ神経栄養因子をコードするプラスミドpC8hB/hN−R6またはその機 能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 42.実質的に図5でキメラR7について示した通りのアミノ酸配列を有するキ メラ神経栄養因子をコードする、ATCCに寄託されて受託番号−を指定された プラスミドpC8hB/hN−R7またはその機能的均等物によりコードされる 、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 43.実質的に図5でキメラR8について示した通りのアミノ酸配列を有するキ メラ神経栄養因子をコードするプラスミドpC8hB/hN−R8またはその機 能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 44.実質的に図5でキメラR9について示した通りのアミノ酸配列を有するキ メラ神経栄養因子をコードするプラスミドpC8hB/hN−R9またはその機 能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 45.実質的に図5でキメラR10について示した通りのアミノ酸配列を有する キメラ神経栄養因子をコードするプラスミドpC8hB/hN−R10またはそ の機能的均等物によりコードされる、請求項2記載のキメラ神経栄養因子。
- 46.図5におけるNM1をコードする、ATCCに寄託されて受託番号408 64を有するプラスミドpC8hmN/myc−NM1またはその機能的均等物 によりコードされる、請求項1記載のキメラ神経栄養因子。
- 47.図5におけるBM1をコードする、ATCCに寄託されて受託番号408 63を有するプラスミドpC8hB/myc−BM1またはその機能的均等物に よりコードされる、請求項1記載のキメラ神経栄養因子。
- 48.神経栄養活性を有し、かつ(j)細胞因子の少なくとも一部および(ii )他のペプチドの少なくとも一部を含むキメラ神経栄養因子を含有する医薬組成 物。
- 49.細胞因子が神経栄養因子である、請求項48記載の医薬組成物。
- 50.請求項16、17または18記載のキメラ神経栄養因子を含有する医薬組 成物。
- 51.請求項1記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする 核酸分子。
- 52.請求項2記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする 核酸分子。
- 53.請求項3記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする 核酸分子。
- 54.請求項4記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする 核酸分子。
- 55.請求項5記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする 核酸分子。
- 56.請求項6記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする 核酸分子。
- 57.請求項7記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする 核酸分子。
- 58.請求項8記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする 核酸分子。
- 59.請求項9記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする 核酸分子。
- 60.請求項10記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 61.請求項11記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 62.請求項12記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 63.請求項13記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 64.請求項14記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 65.請求項15記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 66.請求項16記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 67.請求項17記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 68.請求項18記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 69.請求項19記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 70.請求項20記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 71.請求項21記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 72.請求項22記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 73.請求項23記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 74.請求項24記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 75.請求項25記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 76.請求項26記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 77.請求項27記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 78.請求項28記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 79.請求項29記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 80.請求項30記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 81.請求項31記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 82.請求項32記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 83.請求項33記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 84.請求項34記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 85.請求項35記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 86.請求項36記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 87.請求項37記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 88.請求項38記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 89.請求項39記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 90.請求項40記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 91.請求項41記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 92.請求項42記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 93.請求項43記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 94.請求項44記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 95.請求項45記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 96.請求項46記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 97.請求項47記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
- 98.請求項48記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードす る核酸分子。
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