JP2001527402A

JP2001527402A - Ｎｇｆ変異体

Info

Publication number: JP2001527402A
Application number: JP54714498A
Authority: JP
Inventors: ジープレスタ，レオナ−ド; ウルファー，ローマン; ダブリュウィンスロウ，ジョン
Original assignee: ジェネンテック，インコーポレーテッド
Priority date: 1997-04-25
Filing date: 1998-04-23
Publication date: 2001-12-25
Also published as: AU2002300365A1; WO1998049308A1; AU2002300365B2; EP0977860A1; AU2002300365B9; CA2286558A1; IL132251A0; AU7154698A

Abstract

(57)【要約】ｔｒｋＣ結合活性及びｔｒｋＣシグナル誘導活性を有するＮＧＦ変異体が提供される。該変異体は任意に、ｔｒｋＡまたはｔｒｋＢ結合及びシグナル誘導活性を有する。本発明のＮＧＦ変異体は、ニューロン疾患の治療において有用である。ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンをコードする核酸及び発現ベクターもまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】ＮＧＦ変異体発明の背景技術分野本出願は、神経組織、特にニューロンの成長、調節または維持に関与するタンパク質に関する。特にそれは、もう一つの神経栄養因子ＮＴ−３の活性を有するＮＧＦ変異体に関する。ｔｒｋＣ結合活性及びｔｒｋＣシグナル誘導活性を有するＮＧＦ変異体が提供される。該変異体は任意に、ｔｒｋＡまたはｔｒｋＢ結合及びシグナル誘導活性を有する。本発明のＮＧＦ変異体は、ニューロン疾患の治療に有用である。ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンをコードする核酸及び発現ベクターもまた提供される。序論脊椎動物ニューロンの分化した機能の生存及び維持は、ニューロトロフィンと称される特異的なタンパク質の利用によって影響される。ニューロトロフィンは、脊椎動物神経系の発達及び成熟段階の間、ニューロンの生存及び維持に対して重要である成長因子の非常に相同なファミリーを形成している(文献として９９を参照)。ニューロトロフィンの制限された生産は、過剰なニューロンの死を引き起こす(文献として(１)；(２)を参照)。様々なニューロトロフィンが、中枢及び末梢神経系における別個のニューロン集団の生存を助ける能力において機能的に分化している(３)、(４)；(５)、(８０)。ニューロトロフィンのファミリー(family)は、ＮＴ−３(６，７，５，８，９，１０)、神経成長因子（ＮＧＦ）(１１，１２)、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（１３，１４）並びにニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）(１５，１６，１７)及びニューロトロフィン−６（ＮＴ−６）(９１，９２)を含む非常に相同なファミリーである。研究は、ニューロトロフィンが、ｔｒｋとして周知なＭ_r＝１４０−１４５，０００のチロシンキナーゼ含有レセプターのクラスのリガンド依存的活性化を通じて、少なくとも部分的に細胞内シグナリングを伝達することを示唆する(１８) ；(１９)(２１)；(２０)(２２)；(２３)；(２４)；(２５)；(２６)。ニューロトロフィンの結合は、シグナル伝達カスケードにおける後の段階の誘発するｔｒｋレセプターの自己リン酸化を誘導する(９５)。それ故、ニューロトロフィンのシグナル伝達経路は、特異的なチロシンキナーゼレセプターに対する高親和性結合及びそれらの活性化、並びに引き続くレセプター自己リン酸化によって開始される(１９)；(２７)。ニューロトロフィンと様々なｔｒｋの間にはある程度の交差レセプター相互作用が存在するが、顕著な特異性は、ＮＧＦ／ｔｒｋＡ、ＢＤＮＦ／ｔｒｋＢ、及びＮＴ−３／ｔｒｋＣに存在すると思われ、その一方で、ＮＴ −４／５はＢＤＮＦと同程度の効率性でｔｒｋＢと主に相互作用するように思われる(２７)；(１９)(２１)；(２５)；(２２)；(２８)；(１８)；(２８ａ)。ＮＧＦはｔｒｋＡと過度に相互作用する（２１）一方で、ＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５はｔｒｋＢに結合する(２９)。ｔｒｋＡおよびｔｒｋＢは、複数のニューロトロフィンに対して特定の環境下、インビトロで応答することができる(６)；(２３)。ｔｒｋＣは、ＮＴ−３に対して過度に応答する(２５)；(２６)。ＮＴ−３は、ｔｒｋＣを通じて好ましくはシグナル伝達するが、より低い親和性でｔｒｋＡおよびｔｒｋＢにも結合する（２５；１０１)(図１)。それ故、特異性の観点からｔｒｋレセプターの最もストリンジェントなメンバー（ｔｒｋＣ）は、ニューロトロフィンファミリーの最も相手を選ばないリガンド（ＮＴ−３）と過度に相互作用する。しかしながら、ニューロンの環境は、好ましくないニューロトロフィンリガンドに対して応答する能力においてｔｒｋＡ及びｔｒｋＢを制限している(２９)。レセプターのｔｒｋファミリーに加えて、ニューロトロフィンは、ｐ７５低親和性ＮＧＦレセプター（ｐ７５；(３０)；(３１)）と称される異なるクラスのレセプターにも結合することができ、該レセプターは、膜貫通シグナリングの未知の機構を有しているが、腫瘍壊死因子レセプター(ＴＮＦＲ)、ＣＤ４０、ＯＸ４０、及びＣＤ２７を含むレセプター遺伝子ファミリーに構造的に関連している(３２)；(３３)；(３４)；(３５)；(３６)；(３７)。ニューロトロフィンの高親和性結合部位の形成及びシグナル伝達経路における、ｇｐ７５の役割は、未だ明らかではない(文献として(３８)；(３９)を参照)。ニューロトロフィンの一次アミノ酸配列の調査により、ファミリーのメンバーの間の配列の多様性の８５％を説明する、それぞれ７−１０残基の７個の領域が明らかにされている。神経成長因子（ＮＧＦ）は、末梢神経系の感覚及び交感ニューロンを発達することに顕著な効果を有する１２０アミノ酸ポリペプチドホモダイマータンパク質である。ＮＧＦは、ニューロンの生存を助け、軸索成長を促進し、及び神経化学的分化を増大するために、応答ニューロン上の特異的な細胞表面レセプターを介して機能する。ＮＧＦ機能は、ニューロン膜(４０)、（４１）における、ニューロンタンパク質のリン酸化の状態(４２)、（４３）における、並びにニューロンの分化及び機能において役割を果たすと思われる特定のｍＲＮＡ及びタンパク質の富化（例えば（４４）参照）における改変を伴う。前脳コリン作用性ニューロンもＮＧＦに応答し、栄養の補助のためにＮＧＦを必要とする(４５)。実際、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＮＧＦ及びそのレセプターの配置及び発生は、ＮＧＦが基底の前脳コリン作用性ニューロンに対する標的由来神経栄養因子として機能することを示唆する(４６)、(８１)。ＮＴ−３の転写は、広範囲の末梢組織（例えば腎臓、肝臓、皮膚）と同様に、中枢神経系（例えば小脳、海馬）においても検出されている(５)；(７)、(８２) 。発育の間、ＮＴ−３ｍＲＮＡの転写は、ニューロンの増殖、移動及び分化が生じている、中枢神経系の領域において最も著しい(５０)。ニューロンの発展における役割についての証拠を支えることには、神経堤細胞（５１）に対するＮＴ− ３の促進効果、及びインビボにおける稀突起神経膠前駆細胞の増殖の刺激が含まれる。ＮＴ−３はまた、結節性神経節（ＮＧ）由来の感覚ニューロン(７)；(５) 、（８３）及び脊髄神経節（ＤＲＧ）由来の筋感覚ニューロンの集団（５２）の生存をインビトロでも助ける。これらのインビトロでの研究に加えて、最近の研究により、アルツハイマー病で見出される細胞欠損のパターンに似たモデルで、ＮＴ−３が青斑（locus coemlus）の成人中枢ノルアドレナリン性ニューロンの分解をインビボで妨げることが示された。ヒトＮＴ−３（１０１）並びにマウス及びヒトＮＧＦ（５５；９８）の高範囲にわたる突然変異分析により、ｔｒｋＣ及びｔｒｋＡのそれぞれに対する結合部位が示唆された。いくつかのニューロトロフィンの三次元構造が、Ｘ線結晶解析によって解明されている(２９；９３；９６)。ＮＧＦにおいて、Ｎ末端残基はｔｒｋＡに対する親和性に顕著に寄与し、特異性に対する最も重要な決定因子を提供する(５５；１０１)。生物学的活性及びレセプター結合の顕著な欠損が、アミノ及びカルボキシ末端で修飾された相同な切り詰めた形態を表す、ヒト及びマウスＮＧＦの精製されたホモダイマーで観察された(４７)；(４８)；(４９)。精製組換えヒトＮＧＦのＮ末端の最初の９残基及びＣ末端の最後の２残基の欠損から導かれる１０９アミノ酸種（１０−１１８）ｈＮＧＦは、（１−１１８）ｈＮＧＦと比較してヒトｔｒｋＡレセプターからマウス［¹²⁵Ｉ］ＮＧＦを解離させることにおいて３００倍効率的ではない。(４９)。それは、（１−１１８）ｈＮＧＦと比較して脊髄神経節及び交感神経節の生存において５０から１００倍活性が低い(４８)。（１０−１１８）ｈＮＧＦは、顕著に低いｔｒｋＡチロシンキナーゼ自己リン酸化活性を有することが報告されている(４９)。ＮＴ−３について、ｔｒｋＣに対するエピトープは、中央のβ鎖束領域における残基によって形成されているが、非保存的なループまたはＮ末端の最初の６残基由来の残基を含まないことが示されている(１０１)。しかしながら、４０−４９残基（ＮＧＦ残基数は本明細書を通じて使用されるであろう）を包含する非保存的なβヘアピンループは、ｔｒｋＡ／ｔｒｋＣ特異性を介在することを示すが (９４)、このループはｔｒｋＣのＮＴ−３の結合には寄与しない(１０１)。しかしながら、特にｔｒｋＣに対する結合に関与するＮＴ−３中の最も重要な残基、Ｒ１０３が全てのニューロトロフィンで保存されているため、ｔｒｋＣの識別の機構は不明である。ニューロトロフィン特異性に対する構造的な決定因子の解明は、このファミリーの成長因子の機能及び進化を理解するために重要である。さらに、神経病変のモデルに対するニューロトロフィンの投与は、ニューロンの再生及び生存に対して有益であることが示されている(９７；１０３)。ニューロトロフィンは様々な神経変性疾患に対する治療薬の候補となっているため、ニューロトロフィンの特異性及び機能の構造的な機構の知見は、新規なニューロトロフィンベースの治療薬の開発の助けになるであろう。キメラまたは全ニューロトロフィン因子を作製する制限された試みが存在する ((５３)；(５６)；(５４)、（５５）を参照)。神経変性疾患に関与するニューロン集団は、一つ以上のｔｒｋレセプターを発現し、それ故ＭＮＴＳ−１（１０１）またはＰＮＴ−１（５５）のような複数の特異性を有する分子の投与が、単一の特異性を有するニューロトロフィンまたは単一の特異性を有するニューロトロフィンの混合物の投与と比較して有利であろう。例えば、ニューロトロフィンのファミリーの様々なメンバーが、異なる薬物生体反応を有し、それ故ニューロトロフィン混合物の挙動は、予測されたものまたは制御されたものとは異なるであろう。一つ以上のニューロトロフィン活性を有し、及び／または改良された薬物生体反応学的性質を有し、及び投与される準備が整い、有効性を維持しているニューロトロフィン分子に対する必要性が存在する。これらの及び他の利点は、ここで提示される分子及び方法によって提供される。要約本発明は、ＮＴ−３の中央のβ鎖束の部分であり、ニューロトロフィンの間で保存されていない特定の残基が、ＮＧＦに接合された場合ｔｒｋＣ結合及びｔｒｋＣシグナル誘導活性を与えることができるという発見に一部基づく。ＮＴ−３相補体による１８，２０，２３，２９，８４及び８９位のＮＧＦ残基の交換は、ｔｒｋＡに対する親和性を維持する一方で、ｔｒｋＣに結合するＮＧＦ変異体を導き、ｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞の自己リン酸化および分化を誘導することができた。これらのＮＧＦ変異体は、２３位（ＮＧＦにおいてグリシン／ＮＴ −３においてトレオニン）でのアミノ酸はｔｒｋＣ認識にとって必須であり、その一方で他の残基はｔｒｋＣに対するＮＴ−３の特異性を微調整する。この結果により、ｔｒｋＣとのＮＴ−３の相互作用に対する中央のβ鎖束領域の非保存的な残基の重要性が示され、ＮＴ−３／ｔｒｋＣおよびＮＧＦ／ｔｒｋＡリガンド／レセプターペアで使用される特異性の決定因子の異なる機構が強調される。従って、ｔｒｋＣ結合及びシグナル誘導活性を有するＮＧＦ変異体が提供される。ＮＧＦ変異体は、任意にｔｒｋＡ結合及びシグナル誘導活性を有し、及び任意にｔｒｋＢ結合及びシグナル誘導活性を有する。一つの実施態様として、該変異体はｔｒｋＡ及びｔｒｋＣ活性の両者を有する。もう一つの実施態様として、該変異体はｔｒｋＣ活性を有するが、ｔｒｋＡ活性を欠いている。ＮＧＦ変異体のアミノ酸配列は、典型的には天然のＮＧＦ配列である元となるＮＧＦアミノ酸配列の一つ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって得られる。好ましくは、ＮＧＦは、天然で生じる哺乳動物ＮＧＦである。最も好ましくは、それはヒトＮＧＦである。ＮＧＦ変異体は、それが得られたＮＧＦの元の分子と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を典型的に維持するであろう。これらのＮＧＦ変異体の実質的な量は、組換えＤＮＡ法を使用して提供される。さらに、本発明の一面として、ＮＧＦ変異体をコードする組換え核酸、並びにこれらの核酸を含む発現ベクター及び宿主細胞が提供される。本発明のさらなる一面として、本発明の核酸、ベクター及び宿主細胞を使用する方法を含む、ＮＧＦ変異体を生産する方法が提供される。一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体をコードする核酸を含む発現ベクターを使用して形質転換された宿主細胞が、組換えＮＧＦ変異体を生産するために核酸の発現が可能となるように培養される。さらに、本発明のＮＧＦ変異体を使用する、哺乳動物のニューロン疾患を治療するための方法及び組成物が提供される。神経変性疾患に関与するニューロン集団は、一つ以上のｔｒｋレセプターを発現するので、ここでのＮＧＦ変異体のような、複数の特異性を有する分子の投与は、単一の特異性を有するニューロトロフィンまたは単一の特異性を有するニューロトロフィンの混合物の投与と比較して有利である。例えば、ニューロトロフィンのファミリーの様々なメンバーが、異なる薬物生体反応を有し、それ故、ニューロトロフィン混合物の挙動は、ここでのＮＧＦ変異体のものとは対照的に予測または制御し難い。神経病変モデルは、ニューロンの再生及び生存におけるニューロトロフィン活性を調べるために利用可能である(９７；１０３)。本発明の他の利点及び面は、以下の詳細な説明、図面、及び請求の範囲から明らかとなるであろう。図面の簡単な説明図１は、ニューロトロフィン／ｔｒｋレセプター相互作用の特異性を示す図表である。図２は、ヒトＮＧＦ及びヒトＮＴ−３の配列のアライメントを示す。ＮＧＦ配列に対して与えられる残基数は、本出願を通じて使用されている。星印は、本研究で分析された変異体において突然変異されたＮＧＦ残基を強調する。横線は、ネズミＮＧＦのＸ線構造におけるβ鎖の位置を示す(５９)。図３ＡはヒトＮＴ−３のモデルを表し、図３ＢはネズミＮＧＦの結晶構造を示す。各ニューロトロフィンの二つのモノマーが、濃淡で示されている；ＮＧＦ淡色モノマーにおける残基数は、^*によって表されている。特徴的な残基について、側鎖の酸素原子は赤色に、側鎖の窒素原子は青色に示されている。１０３残基（ＮＧＦとＮＴ−３の両者においてＡｒｇ）は紫色である。ＮＴ−３相補体を使用して置換され、結合及び特異性に影響するＮＧＦ残基は黄色である；結合及び特異性に影響しない残基は緑色である。ＮＧＦ結晶構造に見られる最初の残基（１０残基）は茶色である。特異性に影響すると以前に提案されていた（９４）可変βヘアピンループ（４０−４９残基）は青緑色で示されている。図４Ａ及び４Ｂは、ラットｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞におけるｔｒｋＡのチロシンリン酸化を表す。細胞を５分間、１００ｎｇ／ｍｌのそれぞれのニューロトロフィンを使用して処理する。溶解物を細胞タンパク質について等量化し、抗ｔｒｋＡ特異的ポリクローナル抗血清を使用して免疫沈降し、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。チロシンリン酸化を、抗ホスホチロシンｍＡｂ４Ｇ１０を使用して検出した。ＮＧＦ／Ｐ、精製されたＮＧＦ；ＮＧＦ／Ｕ、ＮＧＦ発現２９３細胞の濃縮上清；ＮＴ−３／Ｐ、精製されたＮＴ−３：ＮＴ−３／Ｕ、ＮＴ−３発現２９３細胞の濃縮上清；０，偽処理化２９３細胞。図４Ａ及び４Ｂは、上記各レーンに挙げたニューロトロフィンを使用した二つの別々の実験からの結果を示す。図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、ラットｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞におけるｔｒｋＣのチロシンリン酸化を表す。細胞を５分間、１００ｎｇ／ｍｌのそれぞれのニューロトロフィンを使用して処理する。溶解物を細胞タンパク質について等量化し、抗ｔｒｋＣ特異的抗血清６５６を使用して免疫沈降し、７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。チロシンリン酸化を、抗ホスホチロシンｍＡｂ４Ｇ１０を使用して検出した。ＮＧＦ／Ｐ、精製されたＮＧＦ；ＮＧＦ／Ｕ、ＮＧＦ発現２９３細胞の濃縮上清；ＮＴ−３／Ｐ、精製されたＮＴ− ３；ＮＴ−３／Ｕ、ＮＴ−３発現２９３細胞の濃縮上清；０，偽処理化２９３細胞。図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、上記各レーンに挙げたニューロトロフィンを使用した三つの別々の実験由来の結果を示す。発明の詳細な説明定義アミノ酸に対する一文字コードは、以下の表１に従って本分野で周知なようにここで使用される：表１それ故、アミノ酸残基の識別は、一文字のアミノ酸コード、引き続き該残基の位置数で表記される。位置数は、特定のニューロトロフィン骨格に相当するものと理解される；それ故、Ｄ１５ＡＮＴ３は、ＮＴ３の１５位のアスパラギン酸が、アラニンに変化することを意味する。以下に定義される「定常領域」内に見出されるこのアスパラギン酸は、ＮＧＦはＮ末端で一つのさらなるアミノ酸を有するため、ＮＧＦのＤ１６位に相当する。本発明は、ｔｒｋＣ結合及びシグナル誘導活性を有するニューロトロフィンＮＧＦ変異体を提供する。一般的にニューロトロフィンは、神経系、特にニューロンの発達、再生及び維持に関与するタンパク質である。現在では、いくつかの周知の重要な神経栄養因子が存在する：神経成長因子(ＮＧＦ)、ニューロトロフィン−３(ＮＴ３)、ニューロトロフィン−４(ＮＴ４、また場合によりニューロトロフィン−５（ＮＴ５）またはＮＴ４／５とも呼ばれる)、脳由来神経栄養因子( ＢＤＮＦ)、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）及びＮＴ−６。ここでの用語、「ＮＧＦ変異体」は、天然で生じるＮＧＦとは異なり、ｔｒｋＣ結合及びｔｒｋＣシグナル誘導に対するＮＴ−３のニューロトロフィン特異性を有するニューロトロフィンを意味する。つまり、該変異体はこれらのＮＴ−３活性を与えるまたは授ける変化を含む。一つの実施態様としてこれは、本発明のＮＧＦ変異体が少なくともｔｒｋＣに結合し、任意に好ましくはｔｒｋＡ及び／またはｔｒｋＢといった様々なニューロトロフィンレセプターに結合することを意味する。それ故例えば、ｔｒｋＡレセプターに対する天然のまたは本来のリガンドである天然で生じるＮＧＦは、高い親和性を有してｔｒｋＢまたはｔｒｋＣレセプターのそれぞれに対して検出できるようには結合しない；例えばＮＧＦは、ＢＤＮＦまたはＮＴ−３のそれぞれよりも、５００−３０００倍高いＫ_Dを有してこれらのレセプターに結合する。しかしながらＮＧＦ変異体、すなわちそのアミノ酸骨格がＮＧＦに基づくニューロトロフィンは、少なくともｔｒｋＣに結合することができる。一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体は、ｔｒｋＣ及びｔｒｋＡに結合するが、ｔｒｋＢには結合しない。好ましい実施態様として、それはｔｒｋＣに結合するが、ｔｒｋＡまたはｔｒｋＢには結合しない。代わりに一つの実施態様として、該変異体はｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ及びｔｒｋＣ、同様にｐ７５レセプターに結合する。もう一つの実施態様として、該変異体はｔｒｋＣ及びｔｒｋＢに結合するが、ｔｒｋＡには結合しない。一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体は、ＮＧＦについて天然で見出されるものより高い親和性を有してｔｒｋＡ以外のレセプターに結合し、親和性は実質的にそのレセプターの天然のリガンドのものである。例えば、ＮＧＦはｔｒｋＡに強力に結合し、ｔｒｋＢ及びｔｒｋＣには非常に弱く結合するかまたは全く結合しない。それ故、一つのＮＧＦ変異体の実施態様は、正常なまたは実質的に正常な結合親和性を有してｔｒｋＡに結合し、ｔｒｋＣの天然のリガンド、ＮＴ−３と実質的に同様な親和性を有してｔｒｋＣに、またはｔｒｋＢの天然のリガンド、ＢＤＮＦまたはＮＴ４／５または両者と実質的に同様な親和性を有してｔｒｋＢに結合する。一つの実施態様として、ニューロトロフィンレセプターに対してＮＧＦ変異体は、ｔｒｋＣに対するＮＴ−３と比較して約５０倍以下に減少した、好ましくは約２０倍未満に減少した、さらに好ましくは約１５倍未満に減少した、よりさらに好ましくは約１０倍未満に減少した、そしてまたよりさらに好ましくはｔｒｋＣに対するＮＴ−３より約５倍未満に減少したｔｒｋＣに対する結合親和性を示す。もう一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体は、ＮＴ−３よりも約３倍未満のｔｒｋＣに対する親和性を有するであろう。ＮＧＦ変異体は、ＮＴ−３と同様のまたは実質的に同様の親和性を有することができ、若しくはそれらはＮＴ−３より１０倍以下の高い活性を有することができる。上記親和性の比較は、ＢＤＮＦと比較したＮＧＦ変異体ｔｒｋＢ結合にも適用される。この親和性は、当業者に理解される様々な方法によって測定される。好ましい方法は、（８４）及び実施例中で示されている競合アッセイの使用である。一般的に結合親和性は、ＩＣ₅₀、つまりレセプターに対する標識化リガンドの結合の５０％を阻害する非標識競合物の濃度として記録される。代わりの実施態様として、ニューロトロフィン活性は、ニューロトロフィンレセプターに対する結合親和性によってではなく、むしろニューロン生存アッセイまたは軸索成長アッセイによって測定される。これは、ｔｒｋ細胞シグナリングに対する変異体の能力を示す。それ故、多くのニューロトロフィンが、胚神経堤由来感覚ニューロンの生存を助長する(７７)、(７８)、(７)、(１７)。胚交感ニューロンの生存はＮＧＦによってのみ助長される一方で、プラコード由来感覚ニューロンの生存はＮＴ−３及びＢＤＮＦによって助長される(８５)。脊髄神経節の感覚ニューロンは、ＮＧＦとＢＤＮＦの両者によって助長される(１３)。ＮＴ −３は、脊髄神経節、交感神経鎖神経節、及び結節神経節由来の感覚ニューロンの軸索成長を導き、同様に結節神経節ニューロン及び脊髄神経節ニューロンの生存を助長する。それ故、ニューロン生存アッセイまたは軸索成長アッセイは、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの活性を測定するために機能することができる。運動ニューロンの生存は、もう一つの好ましいＮＧＦ変異体活性である。一つの好ましい実施態様として、ＮＧＦ変異体の活性は、ｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞の分化を刺激する能力によって測定される。ｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞（２６；１００）は、コラーゲン被膜組織培養皿上に置かれ、軸索所有細胞の集団に対してアッセイすることができる。軸索所有細胞は、３日後の細胞体の長さが少なくとも２倍になる工程を含むものとして定義される。代わりに、ｔｒｋＢを発現するＰＣ１２細胞を、ｔｒｋＢシグナル誘導活性に対して試験するために使用することができ、ｔｒｋＡを発現するＰＣ１２細胞を、ｔｒｋＡシグナル誘導活性に対して試験するために使用することができる。好ましいＮＧＦ変異体は、培地中で同じ濃度で比較した場合、最も好ましくは最大の応答に必要なＮＴ−３の濃度で比較した場合、少なくとも約２５％のＮＴ−３の最大の応答、より好ましくは約５０％、さらにより好ましくは約７５％、またさらにより好ましくは約９０％、最も好ましくは約１００％の最大のＮＴ−３応答で軸索成長を達成するであろう。例えば表４中で、好ましい比較は、培地のｍｌ当たりの因子の１ナノグラムでなされる。それ故、ニューロトロフィン特異性は、ニューロトロフィンレセプター結合、及びニューロン生存アッセイ及び／または軸索成長アッセイによって測定される。それ故、ここで定義されるＮＧＦ変異体は、少なくともＮＴ−３の結合性質、ニューロン生存アッセイ特異性、または軸索成長アッセイ特異性を示すニューロトロフィンＮＧＦである。任意に、ＢＤＮＦまたはＮＴ４／５特異性を有するＮＧＦ変異体は、ＮＴ−３活性について議論された向性を有して、ＢＤＮＦまたはＮＴ４／５のそれぞれの少なくとも結合特異性、ニューロン生存アッセイ特異性、または軸索成長アッセイ特異性を示し、例えばそれはＢＤＮＦの少なくとも約２５％の最大の応答、より好ましくは約５０％での軸索成長等である。ｔｒｋＣ結合及びシグナル誘導活性を有するＮＧＦ変異体は典型的に、それが由来するＮＧＦの元となる分子と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を維持するであろう。他の実施態様として、該ＮＧＦ変異体は、それが由来するＮＧＦの元となる分子と好ましくは８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を維持するであろう。ＮＴ−３上のｔｒｋＣ結合部位は、中央のβ鎖束領域における残基によって占められているので、ｔｒｋＣは他のニューロトロフィンからＮＴ−３を区別するためにこの一連の残基を認識すると仮定された(１０１)。本研究において、この構造領域に位置する一連の５個の残基を、ヒトＮＴ−３からヒトＮＧＦに変換した(図２)。ｔｒｋＣに結合する、生じたＮＧＦ変異体Ｇ２３Ｔ／Ｖ１８Ｅ／Ｖ２０Ｌ／Ｔ８１Ｋ／Ｈ８４Ｑ（ＮＧＦ１２）はｔｒｋＡに対する親和性を維持し、ｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞の自己リン酸化および分化を刺激した。さらなる突然変異誘発により、特異的なｔｒｋＣ結合に対する最も重要な決定因子が２３位及び８４位に位置し、１８，２０，２９及び８６位の残基がｔｒｋＣに対する特異性を微調整することが明らかにされた。これらの結果は、ｔｒｋＣとのＮＴ−３の相互作用のための中央のβ鎖束領域の非保存的な残基の重要性によって、ＮＴ−３／ｔｒｋＣ及びＮＧＦ／ｔｒｋＡリガンド／レセプターペアにおいて使用される特異性の決定因子の異なる機構が強調され、短いアミノ酸「活性部位」とは対照的にニューロトロフィンの全体の構造が、ニューロトロフィン特異性を決定することを支持することを示す(５６)。本発明のＮＧＦ変異体は、ｔｒｋＣを結合し、レセプターシグナリングを誘導するＮＧＦ変異体を得るために、ｔｒｋＣ結合を与えるまたは補充するＧ２３，Ｈ８４およびＶ１８またはＶ２０のいずれか（または両者）のアミノ酸位置での置換によってＮＧＦから得ることができる。好ましい実施態様として、Ｖ２０が置換される。任意にさらに、ＮＧＦ変異体は、ＮＴ−３特異性を増大または微調整することができるＦ８６，Ｔ８１またはＴ２９の置換をさらに含むことができる。好ましいＮＧＦ変異体は、実施例（表３参照）に提供されるようなヒトＮＧＦ配列における置換を有するＮＧＦ１３０，ＮＧＦ１３１，ＮＧＦＲ２及びＮＧＦＲ３を含む。ｔｒｋＣ結合を得るために、これらの部位での好ましい置換は、Ｇ２３Ｔ、Ｈ８４Ｑ、Ｖ１８Ｅ、Ｖ２０Ｌ、Ｆ８６Ｙ、Ｔ８１Ｋ及びＴ２９Ｉである。しかしながら、例えば保存的及び相同的な一連の置換といった、ｔｒｋＣ結合及びシグナル誘導活性を補充するこれらの部位での他の置換をなすことができる。例えばＶ１８は、好ましい置換の保存的なものまたは相同体一例えばｔｒｋＣ結合を増大するためにアスパラギン酸またはグルタミンを使用したグルタミン酸の置換−であるアミノ酸置換を使用して置換することができる。Ｖ２０は、ｔｒｋＣ結合を増大するために、トレオニンまたはより大きい疎水性アミノ酸（イソロイシン、メチオニン）を使用して置換することができる。Ｇ２３は、セリンまたはアラニンを使用して置換することができる。Ｔ２９は、イソロイシン、バリンまたはロイシンを使用して置換することができる。好ましくは、Ｔ２９Ｉは、Ｆ８６Ｙが存在する場合に存在する。Ｈ８４は、アスパラギンまたはグルタミンを使用して置換することができる。Ｆ８６は、ｔｒｋＣ結合に影響するために、メチオニンまたはトリプトファンを使用して置換することができる。ｔｒｋＣ補充を微調整するために、実質的なｔｒｋＣ結合を補充するように置換されていない中央のβ鎖束における天然のＮＧＦアミノ酸は、好ましくはこの場合維持される。しかしながらあまり好ましくはない置換も存在する：１８位のバリンは、ロイシンまたはトレオニンを使用して保存的に置換することができ、Ｖ２０は、アラニンを使用して置換することができ、Ｔ２９は、セリンを使用して置換することができ、そしてＴ８１は、アルギニン、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはセリンを使用して置換することができる。Ｙ７９は、グルタミン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファンまたはアスパラギンを使用して置換することができるが、好ましくはＹ７９は維持される。さらにＮＧＦ変異体は、ｔｒｋＣに加えてｔｒｋＢをも結合するＮＧＦ変異体を生産するためにｔｒｋＢ結合を補充するまたは与えるＮＧＦ配列に対する修飾を含むことができる。該修飾は、該分子に対するいかなる化学的変化でもあり得る。修飾には、置換、挿入、欠失、及び脱アミド化、アセチル化、アシル化、ＰＥＧ化、リン酸化、ミリスチル化および酸化を制限することなく含む化学的修飾が含まれる。好ましい修飾は、Ｄ１６でのアミノ酸置換である。好ましい変異体は、Ｄ１６Ａ置換を有する。Ｄ１６ＡＮＧＦを開示する１９９５年１２月１４日に印刷された国際特許出願ＷＯ９５／３３８２９は、参考としてここに取り込まれる。Ｄ１６での他のアラニン保存的置換は、ｔｒｋＢ結合を得るために成され得る。ある実施態様として、特定のニューロトロフィンに依存するであろうニューロトロフィン特異性を与えることができるニューロトロフイン内の一つ以上のドメインが存在する。例えばＢＤＮＦは、ＢＤＮＦ特異性を与えると思われる数多くのドメインを有する。例えば９３−９９位（ＳＫＫＲＩＧ）由来のＢＤＮＦ配列の置換は、ＮＧＦにおけるＢＤＮＦ特異性を与えるであろう(５５)。ＮＧＦは、修飾された場合ＮＧＦ特異性に影響することができる数多くのドメインを有する。ＮＧＦのＮ末端アミノ酸は、ｔｒｋＡ結合に対して影響のあるＮＧＦにおける主要な領域である。生物学的活性及びレセプター結合の顕著な損失が、ヒト及びマウスＮＧＦの精製されたホモダイマーを使用して観察され、アミノ及びカルボキシ末端で修飾された相同な切り詰められた形態を表す。精製組換えヒトＮＧＦのＮ末端の最初の９残基及びＣ末端の最後の２残基の損失から導かれる１０９アミノ酸種（１０−１１８）ｈＮＧＦは、（１−１１８）ｈＮＧＦと比較してヒトｔｒｋＡレセプターからマウス［¹²⁵Ｉ］ＮＧＦを置換するのに３００倍のより小さい有効性を有する。それは、（１−１１８）ｈＮＧＦと比較して脊髄神経節及び交感神経節の生存において５０から１００倍不活性である。ＮＧＦ変異体は、ｔｒｋＡ結合を減少または除去するために１０アミノ酸Ｎ末端領域の修飾を含むことができる。一つの実施態様として、ＮＧＦの７個のＮ末端アミノ酸（ＳＳＳＨＰＩＦ）が、例えば減少または損失したｔｒｋＡ結合活性を有するＮＧＦ変異体を得るために、欠失またはＮＴ−３のＮ末端アミノ酸（ＹＡＥＨＫＳ）を使用して置換することができる。約４個から約１０個のＮ末端残基が交換された場合、修飾されたＮＧＦＮ末端残基の正確な数は必須ではないが、ある実施態様として、単一のアミノ酸変化が重要であろう。一つの実施態様として、１０個のＮ末端アミノ酸の少なくとも一つが、ｔｒｋＡ結合を減少または除去するために欠失または置換される。修飾の特に好ましい位置は、ＮＧＦ特異性に非常に重要であると思われる４位のアミノ酸のヒスチジン、同様に５位のプロリンである。同様に、ＮＧＦの他の残基の数は、ＮＧＦｔｒｋＡレセプター結合、同様に生物学的活性アッセイにおいて重要であることが示されている。例えば、突然変異させた場合、ＮＧＦ活性を喪失する数多くの残基が存在する。これらの残基には、Ｄ３０，Ｙ５２，Ｒ５９，Ｒ６９およびＨ７５が制限されることなく含まれる。アラニンを、ｔｒｋＡ結合を破壊するためにこれらの位置で置換することができる一方、該位置でのアミノ酸に対して非保存的な他のアミノ酸もまた、使用することができる。ＮＧＦ活性を喪失したＮＧＦ変異体を開示する１９９５年１２月１４日に印刷された国際特許出願ＷＯ９５／３３８２９は、参考としてここに取り込まれる。ｔｒｋＢ補充修飾は、ｔｒｋＣ及びｔｒｋＢの両者を結合するが、ｔｒｋＡは結合しない変異体を生産するためにｔｒｋＡ減少修飾と組み合わせることができる。Ｖ１８，Ｖ２０，Ｇ２３，Ｈ８４及びＦ８６，Ｙ７９またはＴ８１のいずれか若しくはこれらの三つのいずれかの組み合わせのアミノ酸位置でｔｒｋＣ補充置換を有するＮＧＦを含むＮＧＦ変異体もまた提供され、この場合該変異体はｔｒｋＣを結合する。好ましい実施態様として、これらの変異体は、ｔｒｋＣ結合活性を増大または微調整するためにＴ８１及びＦ８６の両者で置換される。さらにＮＧＦ変異体は、Ｔ２９の置換を含むことができる。置換には、Ｇ２３Ｔ、Ｇ２３Ａ、Ｙ７９Ｙ、Ｙ７９Ｑ、Ｙ７９Ｆ、Ｙ７９Ｉ、Ｙ７９Ｌ、Ｙ７９Ｗ、Ｙ７９Ｎ、Ｈ８４Ｑ、Ｈ８４Ｎ、Ｖ１８Ｅ、Ｖ１８Ｄ、Ｖ１８Ｑ、Ｖ２０Ｌ、Ｖ２０Ｔ、Ｖ２０Ｉ、Ｖ２０Ｍ、Ｆ８６Ｙ、Ｆ８６Ｗ、Ｔ８１Ｋ及びＴ２９Ｉを含むことができる。しかしながら、ｔｒｋＣ結合及びシグナル誘導活性を与えるこれらの位置での他の置換、例えば保存的及び相同な一連の置換をなすことができる。好ましい置換は、Ｇ２３Ｔ、Ｈ８４Ｑ、Ｖ１８Ｅ、Ｖ２０Ｌ、Ｆ８６Ｙ、Ｔ８１Ｋ及びＴ２９Ｉであり、７９位ではＹが好ましい。このタイプの好ましいＮＧＦ変異体には、ＮＧＦ１２６，ＮＧＦ１２３４，ＮＧＦ１２４，ＮＧＦ１２５，ＮＧＦ１２，ＮＧＦＲ４及びＮＧＦ１２３，及びＮＧＦ１２７が含まれ、ヒトＮＧＦにおける特異的なアミノ酸置換は、実施例の表３に提供される。ＮＧＦは、１２０アミノ酸ポリペプチドホモダイマータンパク質である。ＮＧＦは１２０の形態で生産することができる一方、ＮＧＦ変異体のより好ましいパターンまたは骨格は、１１８アミノ酸形態であり、好ましくはダイマー形態である。１１８形態において、Ｒ１１９及びＡ１２０は存在しない。この形態は、１１８ＮＧＦコード核酸を使用した発現によって、または１２０形態の選択的な翻訳後タンパク質溶解、例えばトリプシンを使用して得ることができる。もう一つの実施態様として、１１７ＮＧＦ形態が、ＮＧＦのパターンまたは骨格として機能することができる。ＮＧＦ変異体及び生理学的に許容できる担体を含む組成物もまた提供される。さらに、上述の残基の近傍における残基は、ＮＴ−３特異性を増大するまたは微調整することもできる。ある実施態様として、定常領域における変化は、ＮＴ３特異性を与えることもある。代わりに、ｔｒｋＣに対するＮＴ−３結合の増大を引き起こすＮＴ−３におけるＲ３１及びＥ９２位での突然変異、特にＲ３１Ａ及びＥ９２ＡＮＴ３は、以下に記載された方法を使用して、ＮＧＦにおける相当する位置内に取り込むことができる。さらに、ＮＧＦ結合及び／または生物学的活性を増大するＮＧＦにおける数多くのアミノ酸置換が存在する。従って、これらの置換は、ＮＧＦ特異性を増大するためのＮＧＦ変異体骨格中に含まれる。これらの残基には、Ｅ１１，Ｆ１２，Ｄ２４，Ｅ４１，Ｎ４６，Ｓ４７，Ｋ５７，Ｄ７２，Ｎ７７，Ｄ１０５及びＫ１１５が制限されることなく含まれる。アラニンは、ｔｒｋＡ結合を維持または増大するためにこれらの位置で置換することができる一方、アラニンまたはその位置でのアミノ酸に保存的な他のアミノ酸もまた使用することができる。以下に概略を示す。ニューロトロフィン特異性において重要である残基は、実施例で記載された方法、及び部位特異的突然変異誘発として周知の方法を使用して、他のアミノ酸残基のいずれかによって置換することができる。一般的に、置換されるアミノ酸は、当業者に理解されている特性に基づいて選択される。例えば、特性における小さな改変が要求される場合、置換は一般的に以下の表に従ってなされる：表２機能における実質的な変化または免疫学的同一性は、表１に示されたものより保存性でない置換を選択することによってなされる。例えば、より顕著に影響する置換がなされる：改変の領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えばアルファヘリックスまたはベータシート構造；標的部位での該分子の電荷または疎水性度；または側鎖の大きさ。一般的にポリペプチドの性質における最大の変化を生ずると予測される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリルまたはトレオニルを、疎水性の残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルで（またはそれらによって）置換すること；（ｂ）システインまたはプロリンをいずれかの他の残基で（またはそれらによって）置換すること；（ｃ）正電荷の側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニルまたはヒスチジルを、負電荷残基、例えばグルタミルまたはアスパルチルで（またはそれらによって）置換すること；若しくは（ｄ）大きな側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニルを、側鎖を有さないもの、例えばグリシルで（またはそれらによって）置換することである。好ましい実施態様として、残基はアラニン残基に変化される。さらに、相同的走査突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、カセット突然変異誘発が、推定のＮＧＦ変異体を生産するために全て使用することができ、それから実施例に記載された方法及び本分野で周知の方法を使用して、レセプター結合に対してスクリーニングされる。ここでの用語、「ニューロトロフィンレセプター」または文法的な類義語は、ニューロトロフィンリガンドを結合するレセプターを意味する。ある実施態様として、ニューロトロフィンレセプターは、一般的に「ｔｒｋ」レセプターと称されるチロシンキナーゼファミリーのレセプターのメンバーであり、それは別個のニューロン集団の表面で発現される。ｔｒｋファミリーには、ｔｒｋＡ(ｐ１４０^t ^rk としても知られる)；ｔｒｋＢ(ｐ１４５^trkBとしても知られる)；ｔｒｋＣ（ｐ１４５^trkCとしても知られる）が制限されることなく含まれる。他の実施態様として、ニューロトロフィンレセプターはｐ７５^NGFRであり、それはｐ７５または低親和性神経成長因子レセプター（ＬＮＧＦＲ）とも称される。他の未だ発見されていないニューロトロフィンレセプターもまた、本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンに結合できることが理解され、それは当業者によって容易に確認できる。一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体によるｐ７５レセプターに対する結合は、実質的に減少または除去されている。例えば、突然変異が減少したｐ７５結合を導くｐ７５結合に寄与する様々なアミノ酸残基が存在する。ＮＧＦにおいて、Ｆ１２，１３１，Ｋ３２，Ｋ３４，Ｋ５０，Ｙ５２，Ｒ６９，Ｋ７４，Ｋ８８，Ｌ１１２，Ｓ１１３，Ｒ１１４及びＫ１１５位での突然変異は、全て減少したｐ７５結合を引き起こす。Ｆ１２，１３１，Ｋ５０，Ｙ５２，Ｒ６９及びＫ７４は全て定常領域内に存在する。上記記載したアミノ酸に加えて、当業者は、アミノ酸配列のいくつかの可変性が、ニューロトロフィンの特異性及び特徴を改変することなく許容されることを理解するであろう。それ故、ＮＧＦ変異体は、ｔｒｋ結合に影響することはないが単に該配列の変異型である野生型配列と比較して、アミノ酸の置換、挿入または欠失を有することができる。ある実施態様として、これらの突然変異は、特異性に対して重要であると同定されたものと同じ位置内で見出されるであろう、すなわちある場合、中立の突然変異が、ニューロトロフィンの特異性を変化することなくなされるであろう。本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、組換え法を使用して、様々な方法で作成することができる。ここでの用語、「組換え核酸」は、天然では通常見出されない形態における核酸を意味する。つまり、組換え核酸は、核酸を天然では接合されないヌクレオチド配列によって接合する、または天然では通常見出されない配列を有する。組換え核酸は、もともと制限エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によってインビトロで形成され、または代わりにポリメラーゼ連鎖反応のような方法を使用して形成することができる。一度組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物内に再導入されると、それは非組換え的に複製される、すなわちインビトロの操作よりむしろ宿主細胞のインビボの細胞機構を使用して複製されるであろうことが理解される；しかしながら、一度組換え的に生産された上記核酸は、実質的に非組換え的に複製されるが、本発明の目的のために未だ組換え体と考えられる。同様に、用語、「組換えタンパク質」は、組換え法を使用して、すなわち上記記載のような組換え核酸の発現を通じて作製されたタンパク質である。組換えタンパク質は、少なくとも一つ以上の特徴によって天然で生じるタンパク質とは区別される。例えば、該タンパク質は、野生型宿主に通常それが関連しているいくつかのまたは全てのタンパク質及び化合物から単離される。該定義には、同じまたは異なる生物または宿主細胞における一つの生物からのＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの生産が含まれる。例えば、該タンパク質は、その増大したレベルが作製されるような誘導可能または高発現プロモーターの使用を通じて、通常見出されるよりも顕著に高い濃度で、それが由来する同じ生物において作製される。代わりに、該タンパク質は、エピトープ標識またはアミノ酸置換、挿入及び欠失を加えることのような、天然では通常見出されない形態で存在するであろう。ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンをコードする本発明の核酸を使用して、様々な発現ベクターが作製される。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノム内に挿入するベクターのいずれかである。一般的に、発現ベクターには、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンをコードする核酸に機能的に連結した転写及び翻訳調節核酸が含まれる。本文脈で用語、「機能的に連結した」とは、転写が開始される態様のように、転写及び翻訳調節ＤＮＡがＮＧＦ変異体ニューロトロフィンのコード配列に関して位置することを意味する。一般的にこれは、プロモーター及び転写開始またはスタート配列が、ＮＧＦニューロトロフィンコード領域に対して５’側に位置することを意味するであろう。転写及び翻訳調節核酸は一般的に、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンを発現するために使用される宿主細胞に対して適切なものであろう；例えば、哺乳動物細胞に対する転写及び翻訳調節核酸配列は、哺乳動物細胞においてＮＧＦ変異体ニューロトロフィンを発現するために使用される。数多くのタイプの適切な発現ベクター及び適切な調節配列が、様々な宿主細胞に対して本分野で周知である。一般的に、転写及び翻訳調節配列には、プロモーター配列、シグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、ターミネーション及びポリＡシグナル配列、及びエンハンサーまたはアクチベーター配列が制限されることなく含まれる。好ましい実施態様として、調節配列には、プロモーター並びに翻訳開始及び終結配列が含まれる。組換え脊椎動物細胞培養物におけるＮＧＦ変異体の合成に対する応用のための適切な方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等,Nature,293:620-625(1981);Mantei等,Nature,281:40-46(1979) ;欧州特許出願EP 117,060;及び欧州特許出願EP 117,058に記載されている。ＮＧＦ変異体の哺乳動物細胞培養発現のための特に有様なプラスミドは、ｐＲＫ５( 欧州特許出願EP 307,247)、ｐＲＫ７またはｐＳＶ１６Ｂである。１９９１年６月１３日に印刷された国際特許出願WO 91/08291は、参考としてここに取り込まれる。プロモーター配列は、構成的または誘導可能プロモーターのいずれかをコードする。一つ以上のプロモーターの要素を組み合わせるハイブリッドプロモーターもまた本分野で周知であり、本発明において有用である。さらに発現ベクターは、さらなる要素を含むであろう。例えば発現ベクターは、二つの複製系を有し、それ故二つの生物において、例えば発現のために哺乳動物細胞において、並びにクローン化及び増幅のために原核生物宿主において維持することが可能である。さらに組み込み発現ベクターについては、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも一つの配列、好ましくは発現構築物の両端に並んだ二つの相同な配列を含む。組み込みベクターは、ベクター内の挿入物に対して適切な相同な配列を選択することによって宿主細胞における特異的な部位に向けられる。組み込みベクターのための構築物は、本分野で周知である。さらに好ましい実施態様として、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を許容する選択可能マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は本分野で周知であり、使用される宿主細胞について多様である。本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの発現を誘導または導く適切な条件の下で、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンをコードする核酸を含む発現ベクターを使用して形質転換された宿主細胞を培養することによって生産される。ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの発現のための適切な条件は、選択される発現ベクター及び宿主細胞によって変化し、当業者に容易に確立されるであろう。例えば、発現ベクターにおける構成的プロモーターの使用には、宿主細胞の成長及び増殖を最適化することが必要とされ、一方で誘導可能または抑制的プロモーターの使用には、誘導または抑制のために適切な増殖条件が必要とされる。好ましい実施態様として、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、発現の後に精製または単離される。ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、サンプル中に存在する他の構成成分に依存して、当業者に周知の様々な方法において単離または精製される。標準的な精製法には、電気泳動、イオン交換、ハイブリッド、アフィニティー及び逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含む分子的、免疫学的及びクロマトグラフィー的方法、クロマトフォーカシングが含まれる。タンパク質濃縮物に連結した限外濾過及び二重濾過法もまた有用である。適切な精製法における一般的な手順としては、（５７）を参照。必要とされる精製の程度は、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの使用に依存するであろう。いくつかの場合には、精製は必要とされないであろう。適切な宿主細胞には、酵母、細菌、古細菌、糸状菌のような真菌、並びに植物細胞及び哺乳動物細胞を含む動物細胞が含まれる。特に興味あるものは、Saccha romyces cerevisiae及び他の酵母、大腸菌、枯草菌、Pichia pastoris，ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Neurospora及びＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ細胞、固定化哺乳動物ミエロイド及びリンパ細胞系である。好ましい宿主細胞は哺乳動物細胞であり、最も好ましい宿主細胞には、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、及びヒト胎児腎細胞系２９３が含まれる。好ましい実施態様として、本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、哺乳動物細胞で発現される。哺乳動物発現系もまた本分野で周知である。いくつかの遺伝子は、イントロンが存在する場合より効率的に発現される。しかしながら、いくつかのｃＤＮＡは、スプライシング配列を欠くベクターから効率的に発現されている。それ故、いくつかの実施態様においては、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンをコードする核酸はイントロンを含む。哺乳動物宿主、同様に他の宿主内に外来の核酸を導入する方法は本分野で周知であり、使用される宿主によって変化し、そしてデキストラン介在トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドのカプセル化、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが含まれる。一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは酵母細胞で生産される。酵母発現系は本分野で周知であり、Saccharomyces cerevisiaeに対する発現ベクターが含まれる。Candida albicans及びC.maltasa,Hansenula polymorpha ,Kluyveromyces fragilis及びK.lactis,Pichia Guilerimondii及びP.pastoris,S chizosaccharomyces pombe及びYarrowia lipolyticaに対する発現ベクターが含まれる。酵母宿主、同様に他の宿主内に外来核酸を導入する方法は本分野で周知であり、使用される宿主細胞によって変化するであろう。好ましい実施態様として、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、細菌系において発現される。細菌のための発現ベクターは本分野で周知であり、枯草菌、大腸菌、Streptococcus cremoris及びStrcptococcus lividans及び他のものに対するベクターが含まれる。細菌発現ベクターは、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーション、及び他の方法のような本分野で周知の方法を使用して細菌宿主内に形質導入される。一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、昆虫細胞において生産される。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター、特にバキュロウイルス−ベースの発現ベクターが、本分野で周知である。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための物質及び方法は、キットの形態で商業的に入手可能である；例えばSan DiegoにおけるInvitrogcn社製の”ＭａｘＢａｃ”キットが挙げられる。組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞内への感染のために開発されている。例えば、組換えバキュロウイルスは、Aedes acgypti,Auto grapha califomica,Bombyx mori,Drosophila melangaster,Spodoptera frugiper da及びTrichoplusia niに対して開発されている。一度発現されると、ＮＧＦ変異体ニュートロフィンは、神経栄養因子として使用される。これらのＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、様々な診断及び治療上の応用において利用される。ＮＧＦ変異体はまた、動物の食料としても使用可能である。本発明のＮＧＦ変異体ニュートロフィンは、ニュートロフィンレセプターを検出する診断方法において有用である。例えば、本発明のＮＧＦ変異体ニュートロフィンは標識することができる。ここでの用語、「標識されたＮＧＦ変異体ニュートロフィン」は、ＮＧＦ変異体ニユートロフィンまたはニュートロフィンレセプターに結合したＮＧＦ変異体ニュートロフィンの検出を可能にするように付着した放射性同位元素または化合物である、少なくとも一つの要素を有するＮＧＦ変異体ニュートロフィンを意味する。一般的に、標識は三つのクラスに分類される：ａ）放射性同位元素または重同位元素である同位元素標識；ｂ）抗体または抗原である免疫学的標識；及びｃ）色素または蛍光染料。標識はいずれかの位置でＮＧＦ変異体ニューロトロフィン内に取り込まれる。一度標識化されると、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、インビトロまたはインビボのいずれかで、ニューロトロフィンレセプターを検出するために使用される。例えば、ニューロトロフィンレセプターの存在は、特定の細胞タイプの存在の指標となり得、診断において有用である。つまり、特定の細胞タイプの二次集団は、レセプターを介して該細胞に標識化されたＮＧＦ変異体ニューロトロフィンを結合することによって示される。さらに、本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、ニューロトロフィンアッセイの標準として有用である。例えば、いずれかの特定のアッセイにおけるＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの活性は、周知のニューロトロフィン標準を使用して測定され、それからＮＧＦ変異体ニューロトロフィンを、ニューロトロフィンの診断及び定量において使用する。さらに、本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、多くの神経細胞が成長因子を必要とするため、インビボにおける神経細胞の培養における使用のための培養培地の構成成分として有用である。当業者に理解されるように、本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、培地の構成成分として頻繁に使用される他の神経栄養因子の代わりとなることができる。標準的なアッセイで使用される、添加されるＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの量は、容易に測定することができる。本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンはまた、生物または患者内のニューロトロフィンまたはニューロトロフィン抗体の診断、同定及び局在において使用することができる抗体を生産するためにも有用である。例えば、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、当業者に周知なようにポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作製するために使用することができる。それから該抗体を標識化し、ニューロトロフィンの存在または非存在を検出するために使用する。それ故、ニューロトロフィンと関連する神経疾患の診断が検出される。代わりに、該抗体は二次抗体を使用することによって間接的に検出される。例えば、一次抗体をマウスまたはウサギにおいて作製し、それから標識化された抗マウスまたは抗ウサギ抗体を一次抗体を検出するために使用する。これらの方法のそれぞれ、同様に類似の方法は本分野で周知であり、様々な組織においてニューロトロフィンを検出することを可能にする。さらに、本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンに対して生産された抗体は、ニューロトロフィン及びＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの精製のためにも有用である。一般的にＮＧＦ変異体ニューロトロフィンのアミノ酸置換は少ないため、多くの免疫学的エピトープをニューロトロフィン及びＮＧＦ変異体ニューロトロフィンが共有する。それ故、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンに対して向けられた抗体は、天然で生じるニューロトロフィンに結合し、それ故精製において有用である。例えば本分野で周知なように、アフィニティークロマトグラフィー法に基づく精製スキームを使用することができる。本発明のＮＧＦ変異体製剤は、中枢(脳及び脊髄)、末梢(交感、副交感、感覚及び内臓ニューロン)、及び運動ニューロンを含む、インビトロ及びインビボでのニューロンの形成、維持または再生を促進する場合に有用であると考えられる。従って、本発明のＮＧＦ変異体製剤は、様々な神経学的疾患及び疾病の治療のための方法において有用である。好ましい実施態様として、本発明の製剤は、神経疾患を治療するために患者に投与される。ここでの用語、「神経疾患」は、ニューロンの変質または損傷と関連する中枢及び／または末梢神経系の疾患を意味する。神経疾患の特徴的な例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、発作、ＡＬＳ、末梢神経障害、及び中枢、末梢、または運動ニューロンのいずれかの、ニューロンの壊死または損失によって特徴付けされる他の疾患が制限されることなく含まれ、さらに外傷、火傷、腎機能障害、傷害、並びにガン及びＡＩＤＳを治療するために使用される化学療法試薬の毒性効果のために、損傷された神経を治療することが含まれる。例えば、糖尿病、ＡＩＤＳまたは化学療法と関連する神経障害のような、特定の病気と関連する末梢神経障害が、本発明の製剤を使用して治療される。それはまた、インビトロまたはエクスビボで神経細胞を培養する際の使用のため、培養培地の構成成分としても有用である。本発明の様々な実施態様において、ＮＧＦ変異体処法は、ニューロンの生存または成長を促進するために、外傷、手術、発作、虚血、感染、代謝疾患、栄養失調、悪性腫瘍、または毒性試薬によって損傷された神経系を有する患者、またはＮＧＦ、ＮＴ−３，ＢＤＮＦまたはＮＴ４−５を使用して治療されているいずれかの疾患を有する患者に投与される。予測されるように、治療または効果は、特定のｔｒｋ結合機能またはＮＧＦ変異体に存在する機能に依存する。例えば、本発明のＮＧＦ変異体製剤は、外傷または手術によって損傷された運動ニューロンの生存または成長を促進するために使用することができる。本発明のＮＧＦ変異体製剤はまた、筋萎縮性側索硬化症(ルー・ゲーリック病)、ベル麻痺、及び棘筋萎縮症または麻痺を含む様々な疾患のような、運動ニューロン疾患を治療するために使用することができる。本発明のＮＧＦ変異体製剤は、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、ハンティングトン舞踏病、ダウン症、神経性難聴、及びメニエール病のような、ヒト神経変性疾患を治療するために使用することができる。本発明のＮＧＦ変異体製剤は、特に痴呆または外傷における認識を促進するために、認識エンハンサーとして使用することができる。熟年層における痴呆の５０％以上の原因としてNational Institutes of Agingによって確認されているアルツハイマー病は、６５歳を越えるアメリカ人において第四位または第五位の死を導く原因である。８５歳を越えるアメリカ人（米国人口の最も急速に増える部分である）の４０％である４百万人のアメリカ人が、アルツハイマー病に罹患している。パーキンソン病を有する全ての患者の２５パーセントもまた、アルツハイマー病様の痴呆に苦しんでいる。そして痴呆を有する患者の約１５％において、アルツハイマー病及び多梗塞痴呆が共存している。アルツハイマー病と血管性痴呆症に次いで、痴呆の第三の一般的な原因は、アルコール中毒に間接的に関連した器質脳症候群のための認識障害であり、それはアルコール中毒患者の約１０％で生じている。しかしながら、アルツハイマー病、同様に血管性痴呆症、及びアルコール中毒に関連する器質脳症候群による認識障害についての、最も一致した異常は、基底の前脳（ＢＦ）からコデックス(codex)及び海馬の両者に生じるコリン作用系の変質である(Bigl等,Brain Cholinergic Systems,M. Steliade及びD.Biesold編、Oxford University Press,Oxford,pp.364-386(1990) )。そして、アルツハイマー病によって影響を受ける数多くの他の神経伝達物質系が存在する(Davies,Med.Res.Rev.3:221(1983))。しかしながら、例えばコリン作用性神経伝達物質系の変質に関連する認識障害は、痴呆に苦しんでいる患者に制限されない。それはまた、他の健康な高齢の成人及びラットにも見られる。高齢のラットにおける減少した大脳皮質血液流の程度と、認識障害の程度を比較する研究は、適切な相関関係を示す(Berman等,Neurobiol.Aging 9:691(1988))。慢性アルコール中毒患者においては、アルツハイマー病及び正常な加齢と同様の、生じた器質脳症候群もまた、コリン作用性ニューロンが生じ(前脳基底)、それらが機能する（大脳皮質）脳の領域における大脳皮質血液流の拡散した減少によって特徴付けされる(Lofti等,Cerebrovasc.and Brain Metab.Rev 1:2(1989))。上記痴呆は、本発明のＮＧＦ変異体製剤の投与によって治療することができる。さらに本発明のＮＧＦ変異体製剤は、神経障害、特に末梢神経障害を治療するために、好ましくは使用される。用語、「末梢神経障害」は、末梢神経系に作用する疾患を示し、最も頻繁には、運動、感覚、感覚運動、または自律神経機能不全の一つまたは組み合わせとして表される。末梢神経障害によって示される広範囲の形態はそれぞれ、同様に多数の原因に独特に基づいている。例えば、末梢神経障害は一般的に後天的であり、全身性の疾患から由来し、または毒性試薬によって誘導され得る。例として、糖尿病性末梢神経障害、遠位の感覚運動神経障害、または胃腸管の減少した動きや膀胱の無緊張症のような自律神経障害が制限されることなく含まれる。全身性の疾患と関連した神経障害の例として、ポストポリオ症候群またはＡＩＤＳ関連性神経障害が含まれる；遺伝的な神経障害の例として、シャルコー-マリー-ツース病、レフサム病、無β-リポ蛋白血症、タンジアー病、クラッベ病、異染性白質萎縮症、ファブリー病、及びドゥジュリーヌ-ソッタ病が含まれる。そして毒性試薬によって引き起こされる神経障害の例として、ビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキセート、または3'-アジド-3'-デオキシチミジンのような化学療法試薬を使用した治療によって引き起こされるものが含まれる。従って、ＮＧＦ変異体の治療上の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における神経障害を治療する方法が提供される。好ましくは、神経疾患は、末梢神経障害であり、より好ましくは糖尿病性末梢神経障害、化学療法誘発性末梢神経障害、またはＨＩＶ関連性神経障害である。好ましくは、末梢神経障害は、運動ニューロンに影響する。さらに、ＮＴ−３の投与は、アルツハイマ一病で見出される細胞損失のパターンに似たモデルにおいて、青斑(locus coerulus)の成人中枢ノルアドレナリン作用性ニューロンのインビトロでの変質を妨げる(８６)。さらに、ＮＴ３の添加により、発生の間、同様に成人の脊髄病変の後に、皮質脊髄路の新芽発生を促進することが示されている。実際、ＮＴ３を、ミエリン関連性成長阻害タンパク質を阻害する抗体と共に投与した場合、長距離の再生が見られた。それ故、本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、この応用においてＮＴ３の代わりに使用することができる。本実施態様では、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの治療上の有効量が、患者に投与される。ここでの用語、「治療上の有効量」は、それが投与されるものに対して治療上の効果を生ずる投与量を意味する。正確な投与量は、例えば治療される疾患、投与の形態、及び治療される患者の臨床上の状態に依存し、周知の方法を使用して当業者によって確立されるであろう。一般的に、本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、一日当たり約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇで投与される。さらに、本分野で周知なように、年齢、同様に体重、通常の健康状態、性別、食事、投与時間、薬剤の相互作用、及び疾患の程度に対する調節が必要とされ、当業者によって通常の実験により確立されるであろう。ある実施態様では、０．０７から２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０８から１５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．０９から１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．１から２ｍｇ／ｍｌの量のＮＧＦ変異体を含む組成物が調製される。末梢神経障害に苦しんでいるヒト患者に対する投与におけるこれらの組成物の使用について、例えばこれらの組成物は、上記治療のための現在企図されているＮＧＦ投与量に相当する、約０．１ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌのＮＧＦ変異体を含む。ＮＧＦ変異体は、ＮＧＦと同様に良好な許容性を有すると考えられ、必要であれば臨床医によって測定されるように、より高い投与量を投与することができる。１μｇ／ｋｇのＮＧＦの単一のＩＶまたはＳＣ投与量が、ヒト患者において注射部位の痛覚過敏及び全体または部分的な筋肉痛を引き起こすことが観察されるので、好ましい単一のＩＶまたはＳＣ投与量は、好ましくは１μｇ／ｋｇのＮＧＦより少ないが、本分野で周知なように痛覚過敏及び筋肉痛を改善する段階を踏めば、より高い投与量を与えることができる。末梢神経障害に対する好ましい摂生は、一週間に３回ＳＣで０．１μｇ／ｋｇ、または一週間に一度ＳＣで０．３ μｇ／ｋｇである。本発明の目的に対して用語、「患者」は、ヒト及び他の動物と生物の両者を含む。それ故本方法は、ヒトの治療及び獣医学的応用の両者に応用可能である。本発明のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンの投与は、例えば経口、皮下、静脈内、大脳下、鼻孔間、経皮的、腹膜内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内、動脈内、病変内、脳内の心室間、眼内を制限することなく含む特異適応に対して周知の経路といった様々な方法でなすことができる。ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、ＣＮＳの液体貯蔵内への点滴によって継続的に投与されるが、ポンプまたは移植のような、本分野で周知の方法を使用した、丸薬注射も許容することができる。ある例として、例えば外傷の治療において、ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは、溶液またはスプレーとして直接に適用される。持続放出系を使用することもできる。一般的に、疾患が許す場合には、部位特異的な輸送としてＮＧＦ変異体を処方または投与すべきである。投与は、継続的または断続的であることができる。投与は、一定のまたはプログラム化された循環の移植可能ポンプ、若しくは断続的な注射によって成し遂げることができる。半透過性移植可能膜器具は、特定の環境に薬剤を輸送する手段として有用である。例えば、可溶性ＮＧＦ変異体を分泌する細胞をカプセル化でき、上記器具を患者内に、例えばパーキンソン病に苦しんでいる患者の脳または脊髄（ＣＳＦ）内に移植することができる。Aebischer等の米国特許第4,892,538号；Aebischer 等の米国特許第5,011,472号；Aebischer等の米国特許第5,106,627号；国際特許出願WO 91/10425；国際特許出願WO 91/10470；Winn等,Exper.Neurology,113:322 -329(1991)；Aebischer等,Exper.Neurology,111:269-275(1991)；及びTresco等, ASAIO,38:17-23(1992)参照。最後に本発明は、半透過性膜及び該膜内にカプセル化されたＮＧＦ変異体を分泌する細胞を含む、神経損傷またはここで教示される他の細胞に対する損傷を予防または治療するための移植器具を含み、該膜はＮＧＦ変異体に対して透過性であり、該細胞に有害な患者由来の因子に透過性ではない。エクスビボでＮＧＦ変異体を生産するように形質転換された患者自身の細胞は、任意に上記カプセル化することなく患者内に直接移植することができる。生きた細胞の膜カプセル化のための方法体系は当業者に周知であり、カプセル化細胞の調製及び患者内への移植は、本分野で周知なように容易に成し遂げることができる。好ましくは、分泌ＮＧＦ変異体は、患者がヒトである場合ヒト成熟ＮＧＦ骨格変異体である。移植物は好ましくは非免疫原性であり、及び／または免疫原性移植化細胞が免疫系によって認識されることを妨げる。ＣＮＳ輸送のために、好ましい移植の部位は、脊髄の大脳脊髄液である。本発明の製薬組成物には、患者への投与に適した形態のＮＧＦ変異体ニューロトロフィンが含まれる。好ましい実施態様として、製薬組成物は水溶性形態であり、担体、賦形剤、安定剤、緩衝液、塩類、抗酸化剤、親水性ポリマー、アミノ酸、炭化水素、イオン性または非イオン性界面活性剤、及びポリエチレンまたはプロピレングリコールのような生理学的に許容可能な物質を含む。ＮＧＦ変異体ニューロトロフィンは移植のための一定時間放出形態で存在し、または本分野で周知の方法を使用してマイクロカプセル内にカプセル化される。ＮＧＦ変異体は好ましくは、これらの組成物の安定性を著しく増大するために、ｐＨ５からｐＨ６までの生理学的に許容可能な酢酸緩衝液内に調剤化される。酢酸濃度は、０．１から２００ｍＭ、さらに好ましくは１から５０ｍＭ、またさらに好ましくは５から３０ｍＭ、そして最も好ましくは１０から２０ｍＭの範囲であり得る。一つの好ましい実施態様は２０ｍＭの酢酸を有し、もう一つは溶液内に１０ｍＭの酢酸を有する。安定性を増大させ容量を緩衝するための好ましい酢酸塩は、酢酸ナトリウムである。ここでの組成物の調製のための適切なｐＨの範囲は５から６，好ましくは５．４から５．９，より好ましくは５．５から５．８である。好ましいｐＨは５．５であり、それは安定性を増大し容量を緩衝する。もう一つの好ましい実施態様は、ｐＨ５．８である。任意に、しかし好ましくは、製剤は製薬学的に許容可能な塩、好ましくは塩化ナトリウムを好ましくはほぼ生理学的な濃度で含む。低濃度、例えば０．３Ｍから０．５Ｍより低い、好ましくは０．１６から０．２０ＭのＮａＣｌ、より好ましくは０．１３から０．１５Ｍが好ましい。好ましい実施態様として、塩化ナトリウム濃度は１３６ｍＭである。もう一つの好ましい実施態様として、該濃度は１４２ｍＭである。任意に本発明の製剤は、製薬学的に許容可能な防腐剤を含むことができる。ある実施態様として、防腐剤の濃度は０．１から２０％、典型的にはｖ／ｖの範囲である。適切な防腐剤には、製薬学の分野で周知のものが含まれる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、及びプロピルパラベンが、好ましい防腐剤である。ベンジルアルコールは増大したＮＧＦ安定性を導く特に好ましい防腐剤である。特に好ましいベンジルアルコール濃度は、０．７から１．２％、より好ましくは０．８から１．０％であり、特に好ましい濃度は０．９％である。任意に本発明の製剤は、製薬学的に許容可能な界面活性剤を含むことができる。好ましい界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。好ましい界面活性剤には、Ｔｗｅｅｎ２０及びプルロン酸（Ｆ６８）が含まれる。Ｆ６８は、ＮＧＦ変異体安定性を増大するために特に好ましい。適切な界面活性剤濃度は、０．００５から０．０２％である。界面活性剤のための好ましい濃度は０．０１％である。界面活性剤は、特定の形態を最小化するために使用される。特に好ましい実施態様として、該組成物は、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＮＧＦ変異体、２０ｍＭ、ｐＨ５．５の濃度の酢酸ナトリウム、１３６ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、及び０．９％（ｖ／ｖ）の濃度のベンジルアルコールを含む。もう一つの実施態様として、ＮＧＦ変異体濃度は２．０ｍｇ／ｍｌ、酢酸ナトリウム濃度は１０ｍＭ、ｐＨ５．５，及び塩化ナトリウム濃度は１４２ｍＭである。本発明のもう一つの実施態様として、製薬学的な有効量のＮＧＦ変異体及び製薬学的に許容可能な酢酸含有緩衝液を含む、本発明の製薬組成物を含むバイアルまたは容器を含む、ＮＧＦ変異体投与のためのキットが提供される。好ましいバイアル容量は、サンプルの繰り返される使用中止が可能である、複数投与量の使用のために適したものである。本発明の製剤に関して達成される増大した安定性のため、複数投与量液体製剤が可能である。典型的に複数投与量のバイアルは、一月間、好ましくは一週間一人の患者に対して十分な投与量を提供するような十分な製剤を提供するであろう。例えば組成物の容量は一般的に、投与濃度、頻度及び使用の容易性に依存して、０．３から１０．０ｍｌ、より好ましくは１．６から２．０ｍｌの範囲である。例えば１．８ｍｌの容量は、０．３μｇ／ｋｇまたは０．１μｇ／ｋｇのそれぞれが使用される場合、それぞれ７または２４の投与が可能であり簡便である。ベンジルアルコールのような光感作性構成成分が存在する場合、バイアルは強烈な光から保護される。一般的に、暗い冷蔵庫または不透明な箱内にバイアルを貯蔵することで十分である。しかしながらバイアルの壁は、光透過減少物質を含むことができる。例えば、半透明コハクまたは茶色バイアル若しくは半透明バイアルを使用することができる。好ましい実施態様として、バイアルは複数投与量製剤を含む。バイアルの形態については、選択された複数投与量液体製剤が、１．８ｍＬの満たされた容量を有する３ｃｃタイプＩガラスバイアルに満たすことができる。栓の選択は、選択された製剤と様々なタイプの栓の適合性に基づくであろう。本発明の組成物は、典型的には２から８℃で貯蔵される。該製剤は、ここに示されるような数多くの凍結解凍サイクルに対して安定である。もう一つの実施態様として、製剤は上記酢酸濃度で調製される。製剤の調製のための好ましい手段は、最終処方緩衝液内に大量のＮＧＦ変異体溶液を溶解することである。最終ＮＧＦ変異体濃度は、ＮＧＦ変異体の非存在の処方緩衝液を使用して、製剤を適切に調節することによって成し遂げられる。凍結乾燥形態を含むここでの組成物は、本質的に周知である一般的に利用可能な製薬学的混合法を使用して構成成分を混合することによって一般的に調製される。同様に、標準的な凍結乾燥法及び本分野で周知の装置が使用される。ここでのＮＧＦ変異体製薬組成物を調製するための特定の方法は、ゲル濾過または透析のようないくつかの周知の緩衝液交換法のいずれか一つにおいて、（いずれかの標準的なタンパク質精製スキームに従って）精製されたＮＧＦ変異体、好ましくはｒｈＮＧＦ変異体を利用することを含む。ここで議論されるＮＧＦ変異体コード遺伝子構築物は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム／ＤＥＡＥデキストラン法、及び細胞銃を制限することなく含む、本分野で周知のいずれかの方法を使用して、標的細胞内に挿入することができる。構築物及び加工された標的細胞を、ＮＧＦ変異体発現標的細胞が議論されている方法を使用して選択される、導入遺伝子として上記記載の構築物を有するトランスジェニック動物の生産のために使用することができる。代わりに、ＮＧＦ変異体を、ＮＧＦ変異体コード核酸を使用した遺伝子治療によって輸送することができる。適切な細胞における組換えＮＧＦ変異体の選択的な発現が、組織特異的または誘導可能プロモーターによって、または本分野で周知の特定のアデノウイルスのような、組換えＮＧＦ変異体遺伝子を運ぶ複製欠損ウイルスを使用した局在化した感染を生ずることによって、制御されたＮＧＦ変異体遺伝子を使用して達成することができる。遺伝子治療応用において、遺伝子は、例えば欠損遺伝子の置換のために、治療上有効な遺伝子産物のインビボでの合成を達成するように細胞内に導入される。用語、「遺伝子治療」は、継続した効果が単一の治療によって達成される伝統的な遺伝子治療、及び治療上有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの一度または繰り返しの投与を含む遺伝子治療薬剤の投与の両者を含む。生存細胞内に核酸を導入するために利用可能な様々な方法が存在する。該方法は、インビトロで培養細胞内に、または企図された宿主の細胞にインビボで核酸を導入するかどうかに依存して変化する。インビトロで哺乳動物細胞内に核酸を導入するために適した方法は、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法等が含まれる。現在好ましいインビボでの遺伝子導入法には、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターを使用したトランスフェクション、及びウイルスコートタンパク質−リポソーム介在トランスフェクションが含まれる(Dzau等,Trends in Biotechnology,11:2 05-210(1993))が、裸のＤＮＡも有効である。ある場合には、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等のような、標的細胞を標的化する試薬を使用して核酸源を提供することが望ましい。リポソームを利用する場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば特定の細胞タイプに反応性のカプシドタンパク質またはその断片、サイクリングにおいて中和を受けるタンパク質に対する抗体、及び細胞内局在を標的化し細胞半減期を増大するタンパク質を、標的化するため及び／または取り込みを容易にするために使用する。レセプター介在エンドサイトーシスの方法は、例えばWu等,J.Biol.Chem.,262:4429-4432(1987)；及びWargner等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:3410-3414(1990)に記載されている。遺伝子操作及び遺伝子治療プロトコールの文献としては、Anderson等,Science ,256:808-813(1992)参照。ＮＧＦの生物学的有用性は、ＮＴ−３のものより優れている。従って、本発明はＮＴ−３の活性及びＮＧＦの優れた生物学的有用性を有するニューロトロフィン分子を提供する。さらに、本発明は、以前の因子と比較して予測できない優れた全ニューロトロフィン活性を有するニューロトロフィン分子を提供し、それ故個々のニューロトロフィンの混合物と関連したいずれかの問題を除去するさらなる利点を有する。以下の実施例は、上記記載の発明を使用する方法をより十分に記載するように機能し、同様に本発明の様々な面を実施することを企図した最適な方法を示す。いずれの場合にもこれらの実施例は、本発明の真の範囲を制限するために機能するものではなく、むしろ説明の目的で提供される。本明細書中の全ての引用文献の開示は、完全にここで明白に取り込まれる。実施例実施例ＩｔｒｋＣに結合するＮＧＦ変異体のデザインと合成ＮＧＦ変異体のデザイン：ヒトＮＴ−３の完全なミューテーション分析により、そのレセプターｔｒｋＣに対するＮＴ−３の結合エピトープの詳細な調査が導かれた(１０１)。結合部位は、単一の残基、Ｒ１０３によって支配されている(図３Ａ)。Ｒ１０３の構造的近傍の分析により、ＮＴ−３／ｔｒｋＣ相互作用に対するさらなる重要な残基が明らかにされた：ベータ鎖Ｃ中のＫ８１およびＱ８４，ベータ鎖Ａ及びＡ’を連結するループ中のＴ２３、及びより小さな効果を有するものとしてベータ鎖Ｂ中の二つの保存的な残基Ｅ５５及びＲ５７である(図２，３Ａ)。マウスＮＧＦにおいては、ＮＴ−３Ｋ８１及びＱ８４の対応する残基であるＴ８１及びＨ８４（図２，３Ｂ）が、ｔｒｋＡに対するＮＧＦ結合に関与することが示されており(５５)、それ故それらは特異性に関与していると考えられる。ヒトＮＧＦにおいては、Ｖ１８，Ｇ２３，Ｔ８１及びＨ８４が、ｔｒｋＡ結合に関与していることが示されている。他の非保存的なＮＴ−３残基、Ｔ２３は、種を通じてニューロトロフィンの各種類の中で保存された領域に位置しているが、ＮＴ−３，ＢＤＮＦ及びＮＧＦの間で多様化している。Ｔ２３の近傍及び該分子の同じ面に位置しているのがＥ１８及びＬ２０である(図３Ａ)。それらはｔｒｋＣへの結合に直接は関与していないが、ＮＧＦ（Ｖ１８及びＶ２０）(図３Ｂ)及びＢＤＮＦ（１１８及びＥ２０）におけるそれらの構造的に大変異なった相補体が、ｔｒｋＣへの結合を妨げている。これは、ＮＧＦ残基Ｖ１８，Ｖ２０，Ｇ２３，Ｔ８１及びＨ８４並びにＮＴ−３におけるそれらのそれぞれの相補体が、ｔｒｋＣに対する特異性を決定することに関与していることを示唆した( １０１)。それ故、これらの位置でＮＴ−３アミノ酸を有するＮＧＦの変異体が構築され、ｔｒｋＣ結合の補充に対して分析された。ＮＧＦ変異体の合成：ＮＧＦ及びＮＴ−３は以前にクローン化され、シークエンスされ、大腸菌における二本鎖及び一本鎖ＤＮＡの生産、同様にサイトメガロウイルスプロモーターの制御の下での哺乳動物系におけるニューロトロフィンの発現を可能にするベクター内にサブクローン化された(８３)。このベクター上での突然変異誘発を、Kunkelの方法にしたがって実施した(６６)。大腸菌株ＸＬ１− Ｂｌｅｕ(Stratagene,San Diego,CA)内への形質転換の後、コロニーを、Sequena s eバージョン2.0kit(U.S.Biochemical Corp.,Cleveland,OH)を使用して二本鎖ＤＮＡをシークエンスすることによって所望の突然変異の存在についてスクリーニングした。成熟ＮＧＦ及びＮＧＦ変異体をコードする完全なＤＮＡ配列を、全ての陽性クローンについて確認した。二本鎖ＤＮＡを、QIAGEN DNA精製キット(Qia gen Inc.,Chatsworth CA)を使用してＸＬ−１Ｂｌｅｕから単離した。野生型及び変異体ニューロトロフィンの発現：ＮＧＦまたは変異体コード配列のそれぞれを含有するプラスミドＤＮＡを、リン酸カルシウム沈降によってヒト胎児腎細胞系２９３内に導入した(７０)。７５％の融合細胞を、１５ｍｍ細胞培養皿当たり１０μｇのプラスミドＤＮＡ及び１μｇのＡｄＶＡプラスミドを使用して共トランスフェクトし、血清含有培地で１５時間インキュベートした。次いで培地を除去し、１０ｍｇ／Ｌの組換えウシインスリン、１ｍｇ／Ｌのトランスフェリン及び微量元素を補った血清非含有培地（ＰＳＯ４）と交換した。４８及び９６時間後に上清を回収し、Centriprep-10濾過ユニット(Amicon,Berverly,MA) を使用しておよそ２０倍に濃縮し、滅菌濾過した。ニューロトロフィン変異体の定量：特異的ＮＧＦＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）は、ハムスター由来のプロテインＡ精製抗血清(Genentech,Inc.)に基づき、引き続き標準的なＥＬＩＳＡ法を実施した。ポリクローナル血清を、抗体に対する変異体の様々な交差反応性に対する能力を減少するために使用した。標準曲線を、精製組換えＮＧＦを使用して測定した。濃縮後のＮＧＦ変異体の量は、０．３μｇ／ｍｌから３０μｇ／ｍｌの間で変化した。ＥＬＩＳＡアッセイは、偽のトランスフェクト細胞由来の上清においてはいずれのＮＧＦも検出しなかった。ＮＧＦ変異体の各発現セットについて、野生型ＮＧＦ発現を実施し、レセプター結合研究に対する比較野生型濃度を得るために並行してＥＬＩＳＡによって定量した。全ての変異体を発現し、定量し、少なくとも二度アッセイした。実施例ＩＩＮＧＦの中央のベータ鎖束での突然変異は、ｔｒｋＣに結合する変異体を導く変異体ＮＧＦ１及びＮＧＦ２は、それぞれＴ８１Ｋ及びＧ２３Ｔ／Ｖ１８Ｅ／Ｖ２０Ｌのミューテーションを有する。５個の点突然変異を変異体ＮＧＦ１２で組み合わせた。これらの３個の変異体、同様にＮＧＦ及びＮＴ−３を発現させ、ｔｒｋＣ細胞外ドメインに結合する能力についてアッセイした。レセプターイムノアドヘシンタンパク質を、免疫グロブリン定常ドメインに融合したヒトｔｒｋＡ及びｔｒｋＣ細胞外ドメインを使用して構築した(８８)。結合アッセイを、９６穴プレートフォーマットを使用して記載されたように（８８）実施した。各ウェル内の標識されたニューロトロフィンの最終濃度は、ｔｒｋＡ及びｔｒｋＣ結合アッセイのためにおよそ３０ｐＭであった。精製組換えヒトＮＴ−３，ＢＤＮＦ及びＮＧＦ(Genentech)を記載されたようにヨウ素化した(１０１)。通常２０μｇのニューロトロフィンを、２０００−３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲の特異的な活性にヨウ素化した。標識された物質を４℃に貯蔵し、調製の２週間以内に使用した。変異体を、複数の発現物のそれぞれに対し少なくとも２回ｔｒｋＡ及びｔｒｋＣレセプターに対する結合親和性のためアッセイした。本方法は、それぞれの変異体に対する親和性測定における誤差の見積もりが可能であった。全てのデータを、Kaleidagraphソフトウェアーパッケージを使用して一連のデータに対して４パラメータ適合法を適用することによって分析した。表３における結合結果は、ＩＣ５０ｍｕｔ／ＩＣ５０ｗｔ比として表されている。ＩＣ５０は、天然のニューロトロフィンの結合の５０％阻害を導く変異体の濃度である。競合的置換結合アッセイにおいて、ＮＴ−３野生型は、ｔｒｋＣに対して２１．０±４．９ｐＭの親和性を示す一方、ＮＧＦは、ＮＴ−３に比較して３５８７倍まで減少した親和性を有してこのレセプターに結合した(表３)。変異体ＮＧＦ１及びＮＧＦ２は、それぞれＮＴ−３より１０３６倍及び２９１倍低い親和性を有してｔｒｋＣに結合した(表３)；これはＮＧＦと比較した場合、それぞれ３．５倍及び１２倍のｔｒｋＣに対する親和性の増大を表す。ＮＧＦ１及びＮＧＦ２における突然変異を変異体ＮＧＦ１２で組み合わせた場合、ｔｒｋＣに対する親和性は共同的な方法で実質的に増大した。この変異体は、ＮＴ−３と比較した場合１４．７倍のみの減少した親和性でｔｒｋＣに結合し、ＮＧＦと比較した場合２４４倍の増大した親和性を表す(表３)。表３：ｔｒｋＣ及びｔｒｋＡに対するＮＧＦ変異体の相対的親和性実施例ＩＩＩ中央のベータ鎖束中の突然変異を有するＮＧＦ変異体はｔｒｋＡ結合を維持する全てのＮＧＦ変異体、ＮＧＦ及びＮＴ−３を、ｔｒｋＡ結合についてアッセイした。ＮＧＦは３３．９±７．５ｐＭの親和性を示す一方、ＮＴ−３はＮＧＦと比較して１３７倍減少した親和性を有して結合した(表３)。親和性のこの減少は、初期の結果と一致する(１０１)。変異体ＮＧＦ１，ＮＧＦ２及びＮＧＦ１２は、それぞれ０．７倍、２．１倍及び１．５倍減少した親和性を有してｔｒｋＡに結合する(表３)。これは、ＮＧＦ２における変化が、ｔｒｋＡに対するわずかに減少した親和性を導く一方、ＮＧＦ１における変化が、親和性の小さな増大を導くことを示す。ＮＧＦ１及びＮＧＦ２をＮＧＦ１２として組み合わせた場合、ｔｒｋＡに対するＮＧＦ１２の親和性は累積的である；ｔｒｋＣに対するＮＧＦ１２の親和性と対照的に、ＮＧＦ１及びＮＧＦ２と比較した場合共同的であった( 表３)。実施例ＩＶｔｒｋＣ特異性に対する個々の残基の重要性ＮＧＦ１２において変化した個々の残基の特異性に対する重要性を測定するために、これらの残基のそれぞれをＮＧＦ配列に戻すように変化した。変異体ＮＧＦＲ１，ＮＧＦＲ２，ＮＧＦＲ３，ＮＧＦＲ４及びＮＧＦＲ５（表３）は、それぞれＧ２３，Ｖ１８，Ｖ２０，Ｔ８１及びＨ８４の特異性に対する寄与を試験した。変異体ＮＧＦＲ１は、ｔｒｋＣとの相互作用の能力のほとんどを喪失し、ＮＧＦＲ３及びＮＧＦＲ５は、わずかに減少した親和性を有する一方、ＮＧＦＲ２及びＮＧＦＲ４は、ＮＧＦ１２と同様のｔｒｋＣに対する親和性を有した(表３) 。これらのデータは、ｔｒｋＣ結合に対する最も重要な特異性決定因子が、Ｔ２３／Ｇ２３，Ｑ８４／Ｈ８４及びＬ２０／Ｖ２０（ＮＴ３／ＮＧＦ）であることを示唆した。実施例ＶｔｒｋＣに対する増大した親和性を有するＮＧＦ１２変異体ヒトＮＴ−３のモデル（１０１）及びマウスＮＧＦのＸ線構造（５９）の比較により、二つの分子の間の差異である主要な特異性決定因子に近いいくつかの残基が明らかにされた。さらにｔｒｋＣに対するＮＧＦ１２の親和性を増大するために、これらの残基のいくつかを類似するＮＴ−３アミノ酸に変化した。ＮＧＦ１２に対してＦ５４Ｙ／Ｋ５７Ｒの変化を加えることは、ｔｒｋＣ結合を改良しなかった(ＮＧＦ１２５，表３)。対照的に、Ｙ７９Ｑ／Ｆ８６Ｙを加えることは、ＮＧＦ１２と比較して２倍の結合を増大した(ＮＧＦ１２４，表３)。ＮＧＦ１２を背景にこれらの二つの残基を個々に変化することにより、Ｆ８６Ｙ変化が有益な変化を示す一方で、Ｙ７９Ｑ変化は有害な変化であることが示された(ＮＧＦ１２６及びＮＧＦ１２７，表３)。最後に、Ｔ２９Ｉの変化を評価した。ＮＧＦ１２の背景においては、Ｔ２９Ｉは結合においてわずかな減少を与えた（ＮＧＦ１１２３に対してＮＧＦ１２を比較する、表３）が、ＮＧＦ１２４及びＮＧＦ１２６の背景においては、それはわずかに結合を改良した(ＮＧＦ１２３４に対してＮＧＦ１２４変異体を、及びＮＧＦ１３１に対してＮＧＦ１３０を比較する、表３)。これは１０３残基を２９及び８６残基の間に配置したため、５９，８６及び１０３位で側鎖の相互作用が生じたためであろう(図３)。代わりに、２９及び８６位の側鎖は、ｔｒｋＣ中の同じアミノ酸と相互作用し、それによってｔｒｋＣアミノ酸を介して互いに影響するであろう。これらのデータに基づいて、二つのさらなる変異体をデザインした。変異体ＮＧＦ１３１は、Ｖ２０Ｌ、Ｇ２３Ｔ、Ｖ１８Ｅ、Ｔ２９Ｉ、Ｈ８４Ｑ及びＦ８６Ｙの５個の変化を含み、ＮＴ−３に比較して３．３倍だけ減少した親和性を有してｔｒｋＣに結合した。これらの変化は、ｔｒｋＡ結合に影響しなかった(表３）。ＮＧＦ１２６及びＮＧＦ１３１は、ｔｒｋＣ及びｔｒｋＡに等しく十分に結合する。両変異体は、共通にＶ２０Ｌ、Ｇ２３Ｔ、Ｈ８４Ｑ及びＦ８６Ｙの突然変異を有する；ＮＧＦ１２６は、さらにＶ１８Ｅ及びＴ８１Ｋの突然変異を有する一方で、ＮＧＦ１３１は、さらにＴ２９Ｉの突然変異を有する。これは、ＮＧＦにおけるＶ２０Ｌ、Ｇ２３Ｔ、Ｈ８４Ｑ及びＦ８６Ｙの変化が、ｔｒｋＣ結合の補充に必要とされる最小のものであることを示唆する。実際、これらの４つの突然変異を有するＮＧＦ１３０は、ＮＧＦ１２６及びＮＧＦ１３１と同様にｔｒｋＣに結合した(表３)。実施例ＶＩＮＧＦ変異体はｔｒｋＣレセプター自己リン酸化を誘導するＰＣ１２細胞系でｔｒｋレセプター自己リン酸化を刺激するＮＧＦ変異体の能力を測定した。およそ１×１０⁷ＰＣ１２細胞（２６）を、１００ｎｇ／ｍｌのニューロトロフィンを使用して３７℃で５分処理した。ＮＰ−４０プレート溶解及び抗ｔｒｋＡ特異的ポリクローナル抗血清（Dr.Louis Reichardt,University of California,San Francisco由来）または抗ｔｒｋＣ特異的ポリクローナル抗血清６５６（１０１）を使用した免疫沈降を、以前に記載されたように実施した (２６)。ホスホチロシン含有量を、以前に記載されたようにモノクローナル抗体４Ｇ１０を使用してウエスタンブロットによって分析した(２３；２６)。全ての自己リン酸化アッセイを、アッセイされた各ニューロトロフィンについて少なくとも二度実施した。ラットｔｒｋＣを継続的に発現するように操作されたＰＣ１２細胞は、ｔｒｋＣの強力な自己リン酸化の誘導及び軸索伸長の形成によってＮＴ−３に応答する (２６)。精製ＮＧＦ(ＮＧＦ／Ｐ)、同様にＮＧＦ発現２９３細胞の上清（ＮＧＦ／Ｕ）は、ｔｒｋＡ自己リン酸化に対する強力なシグナルを導く（図４）が、ｔｒｋＣの自己リン酸化を誘導しなかった(図５Ａ)。精製ＮＴ−３（ＮＴ−３／Ｐ）及びＮＴ−３発現２９３細胞の上清（ＮＴ−３／Ｕ）は、ｔｒｋＣの自己リン酸化を誘導する（図５Ａ）が、ｔｒｋＡは誘導しなかった(図４Ａ)。ｔｒｋＣに対するＮＧＦ１２の親和性から予測されるように、この変異体は、ｔｒｋＣ自己リン酸化に対する強力なシグナルを導く（図５Ａ）が、ｔｒｋＡの自己リン酸化を引き出す能力を維持していた(図４Ａ)。変異体ＮＧＦ１及びＮＧＦ２のｔｒｋＣに対するかなり低い親和性は、ｔｒｋＣ自己リン酸化における弱いシグナルに反映される(図５Ａ)。しかしながら、両変異体は未だ、ＮＧＦと比較した場合、わずかに減少した活性のみを有してｔｒｋＡレセプターの自己リン酸化を誘導した(図４Ａ)。変異体ＮＧＦＲ１及びＮＧＦＲ５を、ＰＣ１２／ｔｒｋＣ細胞の自己リン酸化の誘導に対してアッセイし、ＮＧＦＲ１は大変弱いシグナルを導く一方で、ＮＧＦＲ５の応答はＮＧＦ１２とＮＧＦＲ１の間のものであった(図５Ｂ)。これらの結果は、ｔｒｋＣに対する変異体の測定された親和性と相関した。ｔｒｋＣに対する親和性をさらに増大するＮＧＦの変異体（ＮＧＦ１２３，ＮＧＦ１２４，ＮＧＦ１２５及びＮＧＦ１２３４）は、ＮＴ−３によって引き出されるものと同様であるｔｒｋＣ自己リン酸化に対するシグナルを導いた(図５Ｂ)。ｔｒｋＣに対して最も結合する３つの変異体−−ＮＧＦ１２６，ＮＧＦ１３０及びＮＧＦ１３１−−もまた、ｔｒｋＣ(図５Ｃ)、同様にｔｒｋＡ（図４Ｂ）の自己リン酸化のための強力なシグナルを引き出した。これらの結果は、ｔｒｋＣに対する増大した親和性を有するＮＧＦ変異体は、モデルのニューロン様の細胞系に対してもこのレセプターと相互作用することができることを示す。さらに、これらの細胞は、ｔｒｋＡもまた発現すること、及び両レセプター（ｔｒｋＡ及びｔｒｋＣ）は多機能性リガンドと競合することに注意することは重要である。ＮＧＦ変異体がｔｒｋＡ／ｔｒｋＣヘテロダイマーの形成を導くことができる一方で、これは二つのレセプターのトランスリン酸化を導かない(９０)。実施例ＶＩＩＮＧＦ変異体はｔｒｋＣ細胞シグナリングを誘導するｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞の分化を刺激するＮＧＦ変異体の能力を測定した。これは、ｔｒｋＣ細胞シグナリングを誘導する変異体の能力を示す。ｔｒｋＣを発現するおよそ１０³ＰＣ１２細胞（２６；１００）を、全部で２ｍｌの培地を含む３５ｍｍコラーゲンコート組織培養皿上にまいた。ＰＣ１２／ｔｒｋＣ細胞を、２５０ｐｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの範囲のニューロトロフィン濃度でアッセイした。軸索所有細胞の集団を、３日後に細胞体の長さを少なくとも二度測定することを含む細胞の数をカウントすることによって測定した。全ての軸索伸長アッセイを少なくとも二度実施した。ＰＣ１２／ｔｒｋＣ細胞の軸索成長の誘導からの結果は、結合及び自己リン酸化アッセイと一致する(表４)。ＰＣ１２／ｔｒｋＣ細胞がｔｒｋＡ及びｔｒｋＣの両者を所有する一方で、ＮＴ−３は、ニューロトロフィンの適用後の最初の３日間で軸索の顕著な誘導を導くが、ＮＧＦは導かないことが以前に示されている；しかしながら１０日目でＮＧＦ及びＮＴ−３は、同様な軸索成長を誘導する( １００)。そこでＰＣ１２／ｔｒｋＣ細胞を、３日後の軸索について評価した。ｔｒｋＣに対する減少した結合を示す変異体もまた減少した応答を示した。ＮＧＦ１２は、天然のＮＴ−３と比較してより高い値にシフトする投与量−応答性を示し、最も少ない結合を有する変異体（ＮＧＦ１，ＮＧＦ２，ＮＧＦＲ１及びＮＧＦＲ５）は、試験された最も高い投与量の場合さえ最大の応答性に到達しなかった(表４)。ＮＧＦ１２６は、天然のＮＴ−３と同様の軸索誘導の能力を有し、変異体ＮＧＦ１２６，ＮＧＦ１３０及びＮＧＦ１３１を通じてｔｒｋＣ結合は同量である（表３）が、ＮＧＦ１２６は、軸索を誘導する点でより有効であり、ＮＧＦ１３０及びＮＧＦ１３１の１０ｎｇ／ｍｌと比較して１ｎｇ／ｍｌで最大の応答に到達した(表４)。特に、これらのＮＧＦ変異体は、ｔｒｋＡがその結合についてｔｒｋＣと競合する環境においてｔｒｋＣを通じて軸索を誘導することができた。１０日目、ＮＧＦ１２，ＮＧＦ１及びＮＧＦ２変異体は、ｔｒｋＡに対するこれらの変異体の結合から予期されるように、軸索を誘導する点でＮＧＦ（データは示されていない）と同様に機能した(表３)。表４：ラットｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞における軸索成長の誘導議論ニューロトロフィンは、ｔｒｋレセプターチロシンキナーゼとの相互作用によって細胞内へシグナルを伝達する(９５)。ニューロトロフィン及びｔｒｋの両者は、高い相同性を有するタンパク質ファミリーを形成する。各ファミリーの中で、異なるメンバーが同様な構造を有しているようであるが、二つのファミリーの個々のメンバーは、大変特異的な方法で互いに相互作用する。ニューロトロフィンのこの本質的な特異性は、その生物学的な機能にとって必要であり、それ故特異性決定因子の機構の情報は、ニューロトロフィーファミリーの機能及び進化の理解に寄与する。ヒトＮＴ−３の分子モデリング及びアラニンスキャン突然変異誘発(１０１)、並びにヒトｔｒｋのドメイン欠失／置換（１０２）は、このリガンド／レセプター系の結合エピトープを決定した。以前の研究により、レセプターｔｒｋＣに対するＮＴ−３の結合部位が、Ｒ１０３残基及びさらなる近傍の決定因子によって支配されていることが明らかにされた。結合部位は中央のβ鎖束の周りに広がり、ｔｒｋＡに対するＮＧＦ結合部位とは対照的に、ループ由来の残基及びＮ末端の最初の６個の残基を含まない(図３)。結合部位の一部を構成する非保存的残基には、Ｔ２３，Ｋ８１及びＱ８４が含まれる。Ｌ１８及びＥ２０と共に残基Ｔ２３は、ニューロトロフィンファミリーのメンバーのそれぞれ内で全ての種を通じて保存されている領域に位置するが、ＮＴ−３，ＮＧＦ及びＢＤＮＦの間では多様化している。それ故、これらの５個の残基は、ｔｒｋＣ結合に対するＮＴ−３における特異性決定因子の考え得る候補であると思われる。ｔｒｋＣに結合するための重要性を試験するために、ＮＧＦ中の残基（Ｖ１８，Ｖ２０，Ｇ２３，Ｔ８１及びＨ８４）を、相当するＮＴ−３アミノ酸（Ｅ１８，Ｌ２０，Ｔ２３，Ｋ８１及びＱ８４）に変化し、生じたタンパク質ＮＧＦ１２を、ｔｒｋＣ結合の補充及びｔｒｋＣ介在生物学的活性について分析した。ＮＧＦ１２はｔｒｋＣに結合し、ＰＣ１２細胞上で発現されたｔｒｋＣの自己リン酸化を誘導するが、ｔｒｋＡに対する親和性を喪失していなかった(表３，図４，５)。ここで示されるように、グリシン２３からトレオニンへの変化は、ＮＧＦ１２における補充効果を示す。各突然変異残基が個々に元のＮＧＦアミノ酸に戻って変化したＮＧＦ１２のさらなる変異体（すなわちＥ１８Ｖ、Ｌ２０Ｖ、Ｔ２３Ｇ、Ｋ８１Ｔ、Ｑ８４Ｈ）は、ＮＴ−３においてｔｒｋＣ特異性に対する最も重要な決定因子がＴ２３であり、次いでＱ８４及びＬ２０であることを示した。いずれか一つの理論に制限されるものではないが、ＮＧＦにおけるグリシンからトレオニンへの変化は、ｔｒｋへの結合に必須である側鎖を導入する；代わりにＧ２３Ｔの変化は、骨格構造の変化に影響し、それによってその近傍で側鎖の構造に影響する。８４位では、ヒスチジンからグルタミンへの変化が、ｔｒｋＣに対して反発する潜在的な電荷残基を除去し、グルタミン側鎖が特異的な水素結合に必要である。最後に、２０位でのバリンよりロイシンを好むことは、結合部位での疎水性相互作用のかなり厳格な空間的必要性のためであろう。Ｔ２３，Ｑ８４及びＬ２０に加えて、８６位のアミノ酸は、ｔｒｋＣに対するニューロトロフィン特異性に重要である。ＮＧＦ１２にＮＴ−３残基を加えることは、ｔｒｋＣに対する結合に４．５倍の改良で影響する一方、ｔｒｋＡに対する結合を維持する(変異体ＮＧＦ１２６，表３)。残基８６は、ｔｒｋＣに対する結合のための最も重要な決定因子であるＲ１０３（図３）に近く、さらにｔｒｋＣ認識のための構造的領域の支配性を確認する。ＮＧＦにおいては、８６位はフェニルアラニンであり、ＮＴ−３においてはそれはチロシンであることは、いずれかの一つの理論に制限されるものではないが、側鎖ヒドロキシル基がｔｒｋＣ認識に必要とされる特異的水素結合に関与していることを示唆する。最後に、１８及び２９位の残基は、ｔｒｋＣに対するＮＴ−３の特異性を微調整する。２９位での影響は、８６位のアミノ酸の特性に依存しているようである。Ｔ２９Ｉの変化がＮＧＦ１２（それはＦ８６を有する）内に導入された場合、ｔｒｋＣ結合はわずかに減少し、一方でＴ２９Ｉが二つの他の変異体（それらはＹ８６を有する）に導入された場合、結合はわずかに改良される(ＮＧＦ１２３４に対してＮＧＦ１２４を、ＮＧＦ１３１に対してＮＧＦ１３０を比較した場合、表３)。８６残基と同様に、２９残基は重要なＲ１０３の近傍に存在する(図３) 。１８位では、Ｖ１８Ｅの突然変異が、ｔｒｋＣ結合にわずかにのみ寄与する( すなわちＮＧＦ１２及びＮＧＦＲ２，表３)。しかしながら、ＮＧＦ１２６及びＮＧＦ１３０による軸索成長の誘導の比較により、Ｖ１８Ｅの突然変異を含むことが軸索成長の誘導を改良することが示された；Ｖ１８Ｅを含むＮＧＦ１２６は、天然のＮＴ−３と同様の軸索成長を導く（すなわち、１ｎｇ／ｍｌで最大の応答に到達する）一方で、ＮＧＦ１３０は、最大の応答を引き出すために１０倍のニューロトロフィンを必要とした（１０ｎｇ／ｍｌ）(表４)。要約すると、ここに提示された結果は、ヒトＮＧＦにヒトＮＴ−３由来の中央のβ鎖束の特異的な一連の残基を接合することは、非同種レセプター（ｔｒｋＣ）に対する結合を補充することができる一方で、同種レセプター（ｔｒｋＡ）に対する親和性を維持することを示す。ｔｒｋＣに対するＮＴ−３上の主要な特異性決定因子には、Ｌ２０，Ｔ２３，Ｑ８４及びＹ８６が含まれる。残基Ｅ１８及び１２９は、特異性において小さな役割を演じるであろう。６個の残基は二つのクラスターを形成する：Ｑ８４及びＹ８６は、ｔｒｋＣ結合に関与する最も重要な残基であるＲ１０３の近傍に位置し、Ｅ１８及びＴ２３は共に位置するが、Ｒ１０３クラスターからは離れている(図３)。これらは、いずれかの一つの理論に制限されるものではないが、ｔｒｋＣが、様々なニューロトロフィンの間を識別するために、少なくとも二つの独特な空間的に離れた部位を使用することを示唆する。ネズミ及びヒトニューロトロフィンの初期の突然変異分析により、ＮＧＦのＮ末端の最初の５個の残基が、ｔｒｋＡに対する特異的な結合に対して重要であることが提案された(５５；１０１；９８)。ＮＧＦ由来のＮ末端を有するＮＧＦ変異体を構築し、生じた分子ＭＮＴＳ−１及びＰＮＴ−１は実際にＮＧＦと同様なｔｒｋＡに対する親和性を獲得した(１０１；５５)。ＭＮＴＳ−１がｔｒｋＣに対する親和性を失わないという観察は、ＮＴ−３のＮ末端残基が、ｔｒｋＣ認識に関与しないことを意味し、その結論はＮＴ−３Ｎ末端の部位特異的突然変異誘発によって確認された(１０１)。本研究は、ＮＴ−３の機能及び特異性に対する中央のβ鎖束に位置する残基の重要性を確立する。ここに示されるように、ＮＴ −３の非保存的なアミノ酸−−Ｔ２３及びＱ８４−−は、ＮＧＦにおいて置換することができ、ｔｒｋＣ結合を補充する。さらに、ＮＴ−３における非保存的なアミノ酸−−Ｅ１８，Ｌ２０，１２９及びＹ８６−−もまた、ＮＧＦ変異体／ｔｒｋＣ相互作用の特異性に寄与することができるが、Ｔ２３及びＱ８４と比較して減少した効果を示す。ＮＴ−３相補体を使用してＮＧＦ中のこれらの６個の残基を置換することは、ｔｒｋＡに対する十分な親和性を維持する。ここで提示される研究に関して、中央のβ鎖束中のＮＴ−３残基は特異性に影響する一方で、ＮＧＦにおいてはＮ末端残基が特異性に影響すると思われる。異なる種由来のＮＧＦ中の配列保存に基づいて、初期の研究により、Ｙ７９，Ｔ８１及びＨ８４がｔｒｋＡとＮＧＦの相互作用を介在しているものと提案された(５５)。本研究において、残基８１はｔｒｋＡまたはｔｒｋＣに対する結合または特異性に影響せず(ＮＧＦ１２及びＮＧＦＲ４参照，表３)、残基８４がｔｒｋＣ特異性に対して重要であるがｔｒｋＡ特異性に対しては重要ではない（ＮＧＦ１２及びＮＧＦＲ５参照、表３）ことが決定した。本研究はまた、ＮＧＦ残基７９がｔｒｋＡ特異性には関与しない一方で、ｔｒｋＣに対して天然のヒトＮＧＦ変異体（Ｙ７９）は、ヒトＮＴ−３Ｑ７９と比較してわずかに好ましいことが解った(ＮＧＦ１２７，表３)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 21/02 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:91）Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ウィンスロウ，ジョンダブリュアメリカ合衆国カリフォルニア 94018 エルグレナダピー．オー．ボックス 1232

Claims

【特許請求の範囲】１．ｔｒｋＣを結合することを特徴とする、ｔｒｋＣ結合を与えるアミノ酸Ｇ２３及びＨ８４、及びＶ１８またはＶ２０位のいずれかで置換を有するＮＧＦを含むＮＧＦ変異体。２．Ｖ２０が置換されていることを特徴とする請求項１記載のＮＧＦ変異体。３．さらにＦ８６，Ｔ８１及びＴ２９のいずれか一つ以上の置換を含む請求項１記載のＮＧＦ変異体。４．置換が、Ｇ２３Ｔ、Ｇ２３Ｓ、Ｇ２３Ａ、Ｈ８４Ｑ、Ｈ８４Ｎ、Ｖ１８Ｅ、Ｖ１８Ｄ、Ｖ１８Ｑ、Ｖ２０Ｌ、Ｖ２０Ｉ、Ｖ２０Ｍ及びＶ２０Ｔより成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載のＮＧＦ変異体。５．置換が、Ｆ８６Ｙ、Ｆ８６Ｍ、Ｆ８６Ｗ、Ｆ８６Ｓ、Ｆ８６Ｔ、Ｔ８１Ｋ、Ｔ２９Ｉ、Ｔ２９Ｖ、Ｔ２９Ｌ及びＴ８１Ｎより成る群から選択されることを特徴とする請求項３記載のＮＧＦ変異体。６．ＮＧＦ１３０，ＮＧＦ１３１，ＮＧＦＲ２及びＮＧＦＲ３より成る群から選択される請求項１記載のＮＧＦ変異体。７．ｔｒｋＢを結合することを特徴とする、さらにｔｒｋＢ結合を与えるアミノ酸置換を含む請求項１記載のＮＧＦ変異体。８．ｔｒｋＢを与えるアミノ酸置換がＤ１６で存在することを特徴とする請求項７記載のＮＧＦ変異体。９．さらにｔｒｋＡ結合を減少または除去する１０アミノ酸Ｎ末端領域の修飾を含む請求項１記載のＮＧＦ変異体。１０．１０個のＮ末端アミノ酸の少なくとも一つが、ｔｒｋＡ結合を減少または除去するために欠失または置換されていることを特徴とする請求項９記載のＮＧＦ変異体。１１．Ｎ末端アミノ酸ＳＳＳＨＰＩＦが、存在しないまたはＹＡＥＨＫＳを使用して置換されていることを特徴とする請求項１０記載のＮＧＦ変異体。１２．ｔｒｋＢを結合することを特徴とする、さらにｔｒｋＢ結合を与えるアミノ酸置換を含む請求項９記載のＮＧＦ変異体。１３．ｔｒｋＢを与えるアミノ酸置換がＤ１６で存在することを特徴とする請求項１２記載のＮＧＦ変異体。１４．さらにアミノ酸Ｒ１１９またはＡ１２０またはその両者の欠失を含む請求項１記載のＮＧＦ変異体。１５．さらにアミノ酸Ｒ１１８の欠失を含む請求項１４記載のＮＧＦ変異体。１６．請求項１記載のＮＧＦ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。１７．請求項１６記載の核酸を含む発現ベクター。１８．請求項１６記載の核酸を含む宿主細胞。１９．ＮＧＦ変異体の発現を許容する条件の下で請求項１８記載の宿主細胞を培養することを含む、ＮＧＦ変異体を生産する方法。２０．さらにＮＧＦ変異体を単離する工程を含む請求項１９記載の方法。２１．請求項１記載のＮＧＦ変異体及び担体を含む組成物。２２．請求項１記載のＮＧＦ変異体の治療上の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における神経疾患を治療する方法。２３．神経疾患が末梢神経障害であることを特徴とする請求項２２記載の方法。２４．神経疾患が糖尿病性末梢神経障害であることを特徴とする請求項２３記載の方法。２５．神経疾患が毒素誘導性末梢神経障害であることを特徴とする請求項２３記載の方法。２６．神経疾患が化学療法誘導性末梢神経障害であることを特徴とする請求項２５記載の方法。２７．末梢神経障害がＨＩＶ関連性であることを特徴とする請求項２３記載の方法。２８．末梢神経障害が運動ニューロンに影響することを特徴とする請求項２３記載の方法。２９．ｔｒｋＣを結合することを特徴とする、ｔｒｋＣ結合を与えるアミノ酸Ｖ１８，Ｖ２０，Ｇ２３及びＨ８４，及びＦ８６，Ｙ７９またはＴ８１位のいずれかで置換を有するＮＧＦを含むＮＧＦ変異体。３０．Ｔ８１及びＦ８６の両者が置換されていることを特徴とする請求項２９記載のＮＧＦ変異体。３１．さらにＴ２９の置換を含む請求項２９記載のＮＧＦ変異体。３２．ＮＧＦ１２６、ＮＧＦ１２３４、ＮＧＦ１２４、ＮＧＦ１２５、ＮＧＦ１２，ＮＧＦＲ４、及びＮＧＦ１２３、及びＮＧＦ１２７より成る群から選択される請求項２９記載のＮＧＦ変異体。３３．さらにｔｒｋＢ結合を与えるアミノ酸置換、若しくはｔｒｋＡ結合を減少または除去する修飾のいずれか、若しくは両者を含む請求項２９記載のＮＧＦ変異体。３４．請求項２９記載のＮＧＦ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。３５．請求項３４記載の核酸を含む発現ベクター。３６．請求項３４記載の核酸を含む宿主細胞。３７．ＮＧＦ変異体の発現を許容する条件の下で請求項３６記載の宿主細胞を培養することを含む、ＮＧＦ変異体を生産する方法。３８．さらにＮＧＦ変異体を単離する工程を含む請求項３７記載の方法。３９．請求項２９記載のＮＧＦ変異体及び担体を含む組成物。４０．請求項２９記載のＮＧＦ変異体の治療上の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における神経疾患を治療する方法。