KR940702505A - 신경교 유도 신경영양성 인자 - Google Patents
신경교 유도 신경영양성 인자Info
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Abstract
B49 신경교아종 세포의 무혈청 성장조절배지로부터 신경교 유도 신경영양성 인자(GDNF)라고 하는 신규의 신경영양성 인자가 확인되고 유리된다. GDNF를 클론화하는 쥐 및 인체 유전자가 클론화되어 배열결정된다.
재조합 DNA방법에 따라 생물학적 활성의 GDNF를 제조하기 위하여, GDNF를 클론화하는 유전자가 벡터로 서브클론화되고 백터는 숙주세포를 형질전환하는데 이용된다.
Description
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 농축된 B49 신경교아종 세포 무혈청 성장 조절배지 용액에 대한 헤파린 세파로우즈 크로마토그라피의 결과를 나타낸다. 이 결과는 용출액 0.D.290(-), 전도도(-△-),및 TU로 표시된 GDNF활성(-o-)을 나타낸다. 막대기로 표시된 분획은 다시 정제하기 위하여 수집되었다. 제2도는 수집된 제1도의 분획에 대한 FPLC 수퍼로즈(superose) 크로마토그라피의 결과를 나타낸다. 이 결과는 0.D.280(-)및 TU로 표시된 GDNF활성(-o-)을 보여주고 있다. 제3도는 제2도의 분획 14에 대한 RP-HPLC의 결과를 나타낸다. 이 결과는 0.D.214및 하부에 TU로 표시된 GDNF 활성을 보여주고 있다. 제4도는 상기 제3도로부터 얻어진 분획 3~10에 대한 은착색 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다. 레인 S는 분자량 표준체를 함유한다. 제5도는 제4도의 분획 5 및 6에 대한 예비 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. GDNF 활성(TU)에 대하여 겔 슬라이스가 시험되었다. 겔 슬라이스는 또한, 분자량 마커(Amersham사 제조)를 사용하여 분자량과 관련되었다.
Claims (74)
- 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제1항에 있어서, 비활성이 12,000TU/㎍ 이상인 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제1항에 있어서, 비활성이 B49 조절배지의 비활성보다 24,000배 이상인 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제1항에 있어서, 분자량이 비환원 SDS-PAGE 상에서 31~42kD인 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제4항에 있어서, 비활성이 12,000TU/㎍ 이상인 2량체 폴리펩티드류를 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제1항에 있어서, 분자량이 환원 SDS-PAGE 상에서 20~23kD인 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제6항에 있어서, 단량체 폴리펩티드 배열을 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제1항에 있어서, 다음과 같은 아미노산 배열을 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.(Ser)-Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala-Leu-Pro-Arg-Arg-Glu-(Arg)-Asn-( )-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-(Ser)-Pro-(Asp)-(Asn)
- 제1항에 있어서, 제14도(SEQ ID NO : 4)에 제시된 바와같은 성숙쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제1항에 있어서, 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와 같은 성숙인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 다음과 같은 사항을 특징으로 하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자 : (a)비환원 SDS-PAGE상에서의 겉보기 분자량이 31~42kD; (b) 환원 SDS-PAGE상에서의 겉보기 분자량이 20~23kD: 및 (c) 12,000 TU/㎍ 이상의 비활성.
- 제11항에 있어서, 제14도(SEQ ID NO:4)에 제시된 바와같은 성숙쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 것을 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제11항에 있어서, 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와같은 성숙인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 것을 또한 특징으로 하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제11항에 있어서, 재조합 DNA 기술에 의하여 제조된 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 1항에 있어서, 재조합 DNA 기술에 의하여 제조된 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제15항에 있어서, 제14도(SEQ ID NO:4)에 제시된 바와같은 성숙쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제15항에 있어서, 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와가은 성숙인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 약제학적으로 적절한 캐리어내에 유효한 양의 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 인자가 제14도(SEQ ID NO:4)에 제시된 바와같은 성숙쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 인자가 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와같은 성숙인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 인자가 재조합 DNA 기술에 의하여 제조되는 약제학적 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 인자가 제14도(SEQ ID NO:4)에 제시된 바와같은 성숙쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 인자가 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와같은 성숙인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 약제학적 조성물.
- 다음 단계를 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자의 제조방법: B49 신경교아종세포의 무혈청 성장조절 배지의 제조; 조절 배지의 농축; 농축된 조절배지에 대하여 헤파린 세파로우즈 크로마토그라피의 수행; 상기 헤라핀 세파로우즈 크로마토그라피로 부터 얻어진 분획에 대하여 고속 단백질 액체 크로마토그라피 처리; 및 상기 고속 단백질 액체 크로마토그라피로 부터 얻어진 분획에 대하여 가역상 고속액체 크로마토그라피 처리.
- 제24항에 있어서, 다음 단계를 또한 포함하는 방법:가역상 고속 액체 크로마토그라피에 의하여 얻어진 분획의 예비 SDS-PAGE처리; 및 예비 SDS-PAGE에 의하여얻어진 분획의 가역상 고속 액체 크로마토그라피 처리.
- 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 정제 및 유리된 핵산배열.
- 제26항에 있어서, 제13도(SEQ ID NO:3)에 제시된 바와 같은 성숙 쥐 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 쥐 핵산 배열을 포함하는 핵산 배열.
- 제26항에 있어서, 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와 같은 성숙 인체 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 인체 핵산 배열을 포함하는 핵산 배열.
- 프레-프로 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 정제 및 유리된 핵산배열.
- 제29항에 있어서, 제13도(SEQ ID NO:3)에 제시된 바와 같은 성숙 프레-프로 쥐 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 쥐 핵산 배열을 포함하는 핵산 배열.
- 제29항에 있어서, 제19도(SEQ ID NO:5) 및 제22도(SEQ ID NO: 8)에 제시된 바와 같은 성숙 프레-프로 인체 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 인체 핵산 배열을 포함하는 핵산 배열.
- 제26항에 있어서, 성숙 쥐 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 핵산배열.
- 제32항에 있어서, 제14도(SEQ ID NO:4)에 제시된 바와같은 성숙 쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열.
- 제26항에 있어서, 성숙 인체 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 핵산배열.
- 제34항에 있어서, 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와같은 성숙 인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열.
- 제26항에 있어서, 하기 (a)~(f)로 구성되는 군으로 부터 선택된 GDNF를 코드화하는 핵산배열:(a) 제13도(SEQ ID NO: 3)에 제시된 프레-프로 쥐 GDNF에 대한 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열:(b)제13도(SEQ ID NO:3)에 제시된 성숙 쥐 GDNF에 대한 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열: (c)제19도 (SEQ ID NO:5) 및 제22도(SEQ ID NO:8)에 제시된 프로-프로 인체 GDNF에 대한 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열; (d) 제19도 (SEQ ID NO:5)에 제시된 성숙인체 GDNF에 대한 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열: (e) 도파민 작동성 활성을 지니며, GDNF의 부분에 결합하는 항체에 의하여 인식되는 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열: 및 (f), (l), (a), (b), (c) 또는 (d)의 상보 배열로 잡종형성하며 및 (2) 도파민 작동성 활성을 지닌 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열.
- 해당 환자에게 치료적으로 유효한 양의 신경교 유도 신경영양성 인자를 투여하는 것을 포함하는, 신경손상의 예방 및 치료방법.
- 제37항에 있어서, 상기 신경손상이 파킨슨씨 병인 방법.
- 약제학적으로 적절한 케리어내의 유효량의 신경교 유도 신경영양성 인자를 포함하는, 파킨슨씨병의 예방 또는 치료용의 약제학적 조성물.
- 약제학적으로 적절한 캐리어내의 유효량의 신경교 유도 신경영양성 인자를 포함하는, 손상 또는 부적절하게 기능하는 도파민작동성 신경세포의 예방 또는 치료용의 약제학적 조성물.
- 해당 환자에게 치료적으로 유효한 양의 신경교 유도 신경영양성 인자를 투여하는 것을 포함하는, 손상 또는 부적절하게 가능하는 도파민작동성 신경세포의 예방 또는 치료방법.
- 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 핵산배열에 조작적으로 연결된 발현조절 인자를 포함하는 재조합 DNA 분자.
- 제42항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
- 다음 (a)~(d) 단계를 포함하는 신경교 유도 신경영양성 인자의 재조합 DNA 제조방법: (a) 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 DNA배열을, DNA배열의 발현에 필요한 조절인자를 포함하는 발현벡터로 서브클론화; (b) 상기 발현벡터로 숙주세포를 형질전환; (c) 벡터의 증폭 및 신경교 유도 신경영양성 인자의 발현 조건하에서 숙주세포를 배양; 및 (d) 숙주세료 배양주로부터 신경교 유도 신경영양성 인자를 수확.
- 제44항에 있어서, 상기 숙주세포가 동물세포인 재조합 DNA 제조방법.
- 제45항에 있어서, 상기 숙주세포가 COS-7세포인 재조합 DNA 제조방법.
- 제44항에 있어서, 상기 숙주세포가 박테리아세포인 재조합 DNA 제조방법.
- 제47항에 있어서, 상기 숙주세포가 대장균인 재조합 DNA 제조방법.
- 제48항에 있어서, 수확된 신경교 유도 신경영양성 인자를 재중첩하는 단계를 또한 포함하는 재조합 DNA 제조방법.
- 다음 (a) 및 (b) 단계를 포함하는, 신경교 유도 신경영양성 인자의 재조합 DNA 제조방법; (a) 벡터의 증폭 및 신경교 유도 신경영양성 인자의 발현조건하에서 제43항의 숙주세포를 배양; 및 (b) 숙주세포 배양주로 부터 신경교 유도 신경영양성 인자의 수화기.
- 제50항에 있어서, 상기 숙주세포가 동물세포인 재조합 DNA 제조방법.
- 제51항에 있어서, 상기 숙주세포가 COS-7세포인 재조합 DNA 제조방법.
- 제50항에 있어서, 상기 숙주세포가 박테리아세포인 재조합 DNA 제조방법.
- 제53항에 있어서, 상기 숙주세포가 대장균인 재조합 DNA 제조방법.
- 제54항에 있어서, 수확된 신경교 유도 신경영양성 인자를 재중첩하는 단계를 또한 포함하는 재조합 DNA 제조방법.
- 제24항의 방법에 의하여 제조된 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제55항의 방법에 의하여 제조된 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제44항의 방법에 의하여 제조된 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 제50항의 방법에 의하여 제조된 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
- 신경교 유도 신경영양성 인자를 인식하는 실질적으로 정제된 항체.
- 제60항에 있어서, 상기 항체가 단일클론성인 항체.
- 제60항에 있어서, 상기 항체가 폴리클론성인 항체.
- 신경교 유도 신경영양성 인자를 분비하는 세포를 해당 원자의 몸체에 이식하는 것을 포함하는 신경손상의 예방 또는 치료방법.
- 제63항에 있어서, 상기 환자가 파킨슨씨병을 앓고 있는 방법.
- 제63항에 있어서, 상기 세포가 제42항의 세포인 방법.
- 제63항에 있어서, 상기 세포가 신경교 유도 신경영양성 인자를 분비하는 천연발생 세포인 방법.
- 제63항에 있어서, 상기 세포가 생물학적으로 양립성의 반투막내에 유지되는 방법.
- 제63항에 있어서, 상기 신경교 유도 신경영양성 인자가 제19도 (SEQ ID NO :5)에 제시된 바와같은 성숙 인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을포함하는 방법.
- 제63항에 있어서, 상기 신경교 유도 신경영양성 인자가 제14도 (SEQ ID NO :4)에 제시된 바와같은 성숙 쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 방법.
- 하기 (a) 및 (b)를 포함하는, 환자에의 이식에 의한 신경손상의 예방 또는 치료기구: (a) 반투막; 및 (b) 상기 막으로 캡슐화된 신경교 유도 신경영양성 인자를 분비하는 세포, 여기서 상기 반투막은 상기 신경교 유도 신경영양성 인자에 대하여는 투과성이나, 환자로부터의 상기 세포에 해로운 요소에 대하여는 불투과성이다.
- 제70항에 있어서, 상기 세포가 제42항의 세포인 기구.
- 제70항에 있어서, 상기 세포가 신경교 유도 신경영양성 인자를 분비하는 천연발생 세포인 기구.
- 제70항에 있어서, 상기 신경교 유도 신경영양성 인자가 제14도 (SEQ ID NO :5)에 제시된 바와같은 성숙 인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을포함하는 방법.
- 제70항에 있어서, 상기 신경교 유도 신경영양성 인자가 제19도 (SEQ ID NO :4)에 제시된 바와같은 성숙 쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을포함하는 방법.※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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