KR940702505A - 신경교 유도 신경영양성 인자 - Google Patents

신경교 유도 신경영양성 인자

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KR940702505A
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프랭클린 디 콜린스
다니엘 에이치. 도헐티
잭 릴
수잔 벡티쉬
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그레고리 아보트
시너겐 인크.
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Abstract

B49 신경교아종 세포의 무혈청 성장조절배지로부터 신경교 유도 신경영양성 인자(GDNF)라고 하는 신규의 신경영양성 인자가 확인되고 유리된다. GDNF를 클론화하는 쥐 및 인체 유전자가 클론화되어 배열결정된다.
재조합 DNA방법에 따라 생물학적 활성의 GDNF를 제조하기 위하여, GDNF를 클론화하는 유전자가 벡터로 서브클론화되고 백터는 숙주세포를 형질전환하는데 이용된다.

Description

신경교 유도 신경영양성 인자
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 농축된 B49 신경교아종 세포 무혈청 성장 조절배지 용액에 대한 헤파린 세파로우즈 크로마토그라피의 결과를 나타낸다. 이 결과는 용출액 0.D.290(-), 전도도(-△-),및 TU로 표시된 GDNF활성(-o-)을 나타낸다. 막대기로 표시된 분획은 다시 정제하기 위하여 수집되었다. 제2도는 수집된 제1도의 분획에 대한 FPLC 수퍼로즈(superose) 크로마토그라피의 결과를 나타낸다. 이 결과는 0.D.280(-)및 TU로 표시된 GDNF활성(-o-)을 보여주고 있다. 제3도는 제2도의 분획 14에 대한 RP-HPLC의 결과를 나타낸다. 이 결과는 0.D.214및 하부에 TU로 표시된 GDNF 활성을 보여주고 있다. 제4도는 상기 제3도로부터 얻어진 분획 3~10에 대한 은착색 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다. 레인 S는 분자량 표준체를 함유한다. 제5도는 제4도의 분획 5 및 6에 대한 예비 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. GDNF 활성(TU)에 대하여 겔 슬라이스가 시험되었다. 겔 슬라이스는 또한, 분자량 마커(Amersham사 제조)를 사용하여 분자량과 관련되었다.

Claims (74)

  1. 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  2. 제1항에 있어서, 비활성이 12,000TU/㎍ 이상인 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  3. 제1항에 있어서, 비활성이 B49 조절배지의 비활성보다 24,000배 이상인 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  4. 제1항에 있어서, 분자량이 비환원 SDS-PAGE 상에서 31~42kD인 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  5. 제4항에 있어서, 비활성이 12,000TU/㎍ 이상인 2량체 폴리펩티드류를 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  6. 제1항에 있어서, 분자량이 환원 SDS-PAGE 상에서 20~23kD인 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  7. 제6항에 있어서, 단량체 폴리펩티드 배열을 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  8. 제1항에 있어서, 다음과 같은 아미노산 배열을 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
    (Ser)-Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala-Leu-Pro-Arg-Arg-Glu-(Arg)-Asn-( )-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-(Ser)-Pro-(Asp)-(Asn)
  9. 제1항에 있어서, 제14도(SEQ ID NO : 4)에 제시된 바와같은 성숙쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  10. 제1항에 있어서, 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와 같은 성숙인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  11. 다음과 같은 사항을 특징으로 하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자 : (a)비환원 SDS-PAGE상에서의 겉보기 분자량이 31~42kD; (b) 환원 SDS-PAGE상에서의 겉보기 분자량이 20~23kD: 및 (c) 12,000 TU/㎍ 이상의 비활성.
  12. 제11항에 있어서, 제14도(SEQ ID NO:4)에 제시된 바와같은 성숙쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 것을 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  13. 제11항에 있어서, 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와같은 성숙인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 것을 또한 특징으로 하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  14. 제11항에 있어서, 재조합 DNA 기술에 의하여 제조된 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  15. 1항에 있어서, 재조합 DNA 기술에 의하여 제조된 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  16. 제15항에 있어서, 제14도(SEQ ID NO:4)에 제시된 바와같은 성숙쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  17. 제15항에 있어서, 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와가은 성숙인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  18. 약제학적으로 적절한 캐리어내에 유효한 양의 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자를 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 인자가 제14도(SEQ ID NO:4)에 제시된 바와같은 성숙쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 인자가 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와같은 성숙인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 제18항에 있어서, 상기 인자가 재조합 DNA 기술에 의하여 제조되는 약제학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 인자가 제14도(SEQ ID NO:4)에 제시된 바와같은 성숙쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 약제학적 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 상기 인자가 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와같은 성숙인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 약제학적 조성물.
  24. 다음 단계를 포함하는 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자의 제조방법: B49 신경교아종세포의 무혈청 성장조절 배지의 제조; 조절 배지의 농축; 농축된 조절배지에 대하여 헤파린 세파로우즈 크로마토그라피의 수행; 상기 헤라핀 세파로우즈 크로마토그라피로 부터 얻어진 분획에 대하여 고속 단백질 액체 크로마토그라피 처리; 및 상기 고속 단백질 액체 크로마토그라피로 부터 얻어진 분획에 대하여 가역상 고속액체 크로마토그라피 처리.
  25. 제24항에 있어서, 다음 단계를 또한 포함하는 방법:가역상 고속 액체 크로마토그라피에 의하여 얻어진 분획의 예비 SDS-PAGE처리; 및 예비 SDS-PAGE에 의하여얻어진 분획의 가역상 고속 액체 크로마토그라피 처리.
  26. 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 정제 및 유리된 핵산배열.
  27. 제26항에 있어서, 제13도(SEQ ID NO:3)에 제시된 바와 같은 성숙 쥐 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 쥐 핵산 배열을 포함하는 핵산 배열.
  28. 제26항에 있어서, 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와 같은 성숙 인체 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 인체 핵산 배열을 포함하는 핵산 배열.
  29. 프레-프로 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 정제 및 유리된 핵산배열.
  30. 제29항에 있어서, 제13도(SEQ ID NO:3)에 제시된 바와 같은 성숙 프레-프로 쥐 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 쥐 핵산 배열을 포함하는 핵산 배열.
  31. 제29항에 있어서, 제19도(SEQ ID NO:5) 및 제22도(SEQ ID NO: 8)에 제시된 바와 같은 성숙 프레-프로 인체 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 인체 핵산 배열을 포함하는 핵산 배열.
  32. 제26항에 있어서, 성숙 쥐 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 핵산배열.
  33. 제32항에 있어서, 제14도(SEQ ID NO:4)에 제시된 바와같은 성숙 쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열.
  34. 제26항에 있어서, 성숙 인체 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 핵산배열.
  35. 제34항에 있어서, 제19도(SEQ ID NO:5)에 제시된 바와같은 성숙 인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열.
  36. 제26항에 있어서, 하기 (a)~(f)로 구성되는 군으로 부터 선택된 GDNF를 코드화하는 핵산배열:(a) 제13도(SEQ ID NO: 3)에 제시된 프레-프로 쥐 GDNF에 대한 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열:(b)제13도(SEQ ID NO:3)에 제시된 성숙 쥐 GDNF에 대한 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열: (c)제19도 (SEQ ID NO:5) 및 제22도(SEQ ID NO:8)에 제시된 프로-프로 인체 GDNF에 대한 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열; (d) 제19도 (SEQ ID NO:5)에 제시된 성숙인체 GDNF에 대한 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열: (e) 도파민 작동성 활성을 지니며, GDNF의 부분에 결합하는 항체에 의하여 인식되는 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열: 및 (f), (l), (a), (b), (c) 또는 (d)의 상보 배열로 잡종형성하며 및 (2) 도파민 작동성 활성을 지닌 아미노산 배열을 코드화하는 핵산배열.
  37. 해당 환자에게 치료적으로 유효한 양의 신경교 유도 신경영양성 인자를 투여하는 것을 포함하는, 신경손상의 예방 및 치료방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 신경손상이 파킨슨씨 병인 방법.
  39. 약제학적으로 적절한 케리어내의 유효량의 신경교 유도 신경영양성 인자를 포함하는, 파킨슨씨병의 예방 또는 치료용의 약제학적 조성물.
  40. 약제학적으로 적절한 캐리어내의 유효량의 신경교 유도 신경영양성 인자를 포함하는, 손상 또는 부적절하게 기능하는 도파민작동성 신경세포의 예방 또는 치료용의 약제학적 조성물.
  41. 해당 환자에게 치료적으로 유효한 양의 신경교 유도 신경영양성 인자를 투여하는 것을 포함하는, 손상 또는 부적절하게 가능하는 도파민작동성 신경세포의 예방 또는 치료방법.
  42. 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 핵산배열에 조작적으로 연결된 발현조절 인자를 포함하는 재조합 DNA 분자.
  43. 제42항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  44. 다음 (a)~(d) 단계를 포함하는 신경교 유도 신경영양성 인자의 재조합 DNA 제조방법: (a) 신경교 유도 신경영양성 인자를 코드화하는 DNA배열을, DNA배열의 발현에 필요한 조절인자를 포함하는 발현벡터로 서브클론화; (b) 상기 발현벡터로 숙주세포를 형질전환; (c) 벡터의 증폭 및 신경교 유도 신경영양성 인자의 발현 조건하에서 숙주세포를 배양; 및 (d) 숙주세료 배양주로부터 신경교 유도 신경영양성 인자를 수확.
  45. 제44항에 있어서, 상기 숙주세포가 동물세포인 재조합 DNA 제조방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 숙주세포가 COS-7세포인 재조합 DNA 제조방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 숙주세포가 박테리아세포인 재조합 DNA 제조방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 숙주세포가 대장균인 재조합 DNA 제조방법.
  49. 제48항에 있어서, 수확된 신경교 유도 신경영양성 인자를 재중첩하는 단계를 또한 포함하는 재조합 DNA 제조방법.
  50. 다음 (a) 및 (b) 단계를 포함하는, 신경교 유도 신경영양성 인자의 재조합 DNA 제조방법; (a) 벡터의 증폭 및 신경교 유도 신경영양성 인자의 발현조건하에서 제43항의 숙주세포를 배양; 및 (b) 숙주세포 배양주로 부터 신경교 유도 신경영양성 인자의 수화기.
  51. 제50항에 있어서, 상기 숙주세포가 동물세포인 재조합 DNA 제조방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 숙주세포가 COS-7세포인 재조합 DNA 제조방법.
  53. 제50항에 있어서, 상기 숙주세포가 박테리아세포인 재조합 DNA 제조방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 숙주세포가 대장균인 재조합 DNA 제조방법.
  55. 제54항에 있어서, 수확된 신경교 유도 신경영양성 인자를 재중첩하는 단계를 또한 포함하는 재조합 DNA 제조방법.
  56. 제24항의 방법에 의하여 제조된 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  57. 제55항의 방법에 의하여 제조된 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  58. 제44항의 방법에 의하여 제조된 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  59. 제50항의 방법에 의하여 제조된 실질적으로 정제된 신경교 유도 신경영양성 인자.
  60. 신경교 유도 신경영양성 인자를 인식하는 실질적으로 정제된 항체.
  61. 제60항에 있어서, 상기 항체가 단일클론성인 항체.
  62. 제60항에 있어서, 상기 항체가 폴리클론성인 항체.
  63. 신경교 유도 신경영양성 인자를 분비하는 세포를 해당 원자의 몸체에 이식하는 것을 포함하는 신경손상의 예방 또는 치료방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 환자가 파킨슨씨병을 앓고 있는 방법.
  65. 제63항에 있어서, 상기 세포가 제42항의 세포인 방법.
  66. 제63항에 있어서, 상기 세포가 신경교 유도 신경영양성 인자를 분비하는 천연발생 세포인 방법.
  67. 제63항에 있어서, 상기 세포가 생물학적으로 양립성의 반투막내에 유지되는 방법.
  68. 제63항에 있어서, 상기 신경교 유도 신경영양성 인자가 제19도 (SEQ ID NO :5)에 제시된 바와같은 성숙 인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을포함하는 방법.
  69. 제63항에 있어서, 상기 신경교 유도 신경영양성 인자가 제14도 (SEQ ID NO :4)에 제시된 바와같은 성숙 쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을 포함하는 방법.
  70. 하기 (a) 및 (b)를 포함하는, 환자에의 이식에 의한 신경손상의 예방 또는 치료기구: (a) 반투막; 및 (b) 상기 막으로 캡슐화된 신경교 유도 신경영양성 인자를 분비하는 세포, 여기서 상기 반투막은 상기 신경교 유도 신경영양성 인자에 대하여는 투과성이나, 환자로부터의 상기 세포에 해로운 요소에 대하여는 불투과성이다.
  71. 제70항에 있어서, 상기 세포가 제42항의 세포인 기구.
  72. 제70항에 있어서, 상기 세포가 신경교 유도 신경영양성 인자를 분비하는 천연발생 세포인 기구.
  73. 제70항에 있어서, 상기 신경교 유도 신경영양성 인자가 제14도 (SEQ ID NO :5)에 제시된 바와같은 성숙 인체 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을포함하는 방법.
  74. 제70항에 있어서, 상기 신경교 유도 신경영양성 인자가 제19도 (SEQ ID NO :4)에 제시된 바와같은 성숙 쥐 신경교 유도 신경영양성 인자의 아미노산 배열을포함하는 방법.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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