ES2225819T3 - Factor neurotrofico de origen glial. - Google Patents
Factor neurotrofico de origen glial.Info
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Abstract
SE PRESENTA UN NUEVO FACTOR NEUROTROFICO REFERENCIADO COMO FACTOR NEUROTROFICO DERIVADO DEL GLIAL (GDNF) QUE HA SIDO IDENTIFICADO Y AISLADO A PARTIR DE UN MEDIO ACONDICIONADO PARA EL CRECIMIENTO LIBRE DE SUERO DE CELULAS DE GLIOBLASTOMA B49. LOS GENES HUMANOS Y DE LA RATA QUE CODIFICAN EL GDNF HAN SIDO CLONADOS Y SECUENCIADOS. UN GEN QUE CODIFICA GDNF HA SIDO SUBCLONADO EN UN VECTOR, Y EL VECTOR HA SIDO UTILIZADO PARA TRANSFORMAR UNA CELULA ANFITRIONA PARA PRODUCIR GDNF BIOLOGICAMENTE ACTIVO EN UN PROCESO DE DNA RECOMBINANTE.
Description
Factor neurotrófico de origen glial.
La presente invención se refiere a factores
neurotróficos y al factor neurotrófico de origen glial (GDNF,
"glial derived neurotrophic factor") en particular. También se
incluye dentro de esta invención a los procesos para la
purificación de GDNF de fuentes naturales y procesos para la
clonación de genes de ratas y humanos que codifican GDNF, como así
también a la secuencia de ácidos nucleicos de los genes de rata y
humanos que codifican al GDNF. El gen de GDNF ha sido subclonado en
un vector de expresión, y el vector fue utilizado para expresar
GDNF biológicamente activo. Adicionalmente, esta invención incluye
el uso de GDNF para prevenir y tratar el daño a los nervios y
trastornos relacionados con los nervios tales como la enfermedad de
Parkinson.
Se describen los anticuerpos de GDNF, como así
también los métodos para identificar miembros de la familia de GDNF
de factores neurotróficos. Y finalmente, se describen métodos para
prevenir o tratar el daño a los nervios implantando en pacientes
células que secretan GDNF.
Los factores neurotróficos son proteínas
naturales, encontradas en el sistema nervioso o en tejidos no
nerviosos inervados por el sistema nervioso, cuya función consiste
en promover la supervivencia y mantener la diferenciación
fenotípica de células nerviosas y/o gliales (Varon y Bunge 1979
Ann. Rev. Neuroscience 1:327; Thoenen y Edgar 1985
Science 229:238). Debido a este rol fisiológico, los factores
neurotróficos pueden ser útiles en el tratamiento de la
degeneración de células nerviosas y pérdida de la función
diferenciada que se produce en una variedad de enfermedades
neurodegenerativas.
A fin de que un factor neurotrófico en particular
sea potencialmente útil en el tratamiento del daño a los nervios,
la clase o clases de células nerviosas dañadas debe poder responder
al factor. Diferentes factores neurotróficos típicamente afectan en
forma distinta a diferentes clases de células nerviosas. Por lo
tanto, es conveniente tener a mano una variedad de diferentes
factores neurotróficos para tratar cada una de las clases de
neuronas dañadas que pueden aparecer con diferentes formas de
enfermedad o lesión.
Los factores neurotróficos pueden proteger a las
neuronas sensibles contra una variedad de ataques no relacionados.
Por ejemplo, el factor neurotrófico factor de crecimiento nervioso
(NGF, "nerve growth factor") rescatará a una porción
significativa de neuronas sensoriales de la muerte causada por el
corte de sus procesos axonales (Rich y col. 1987 J.
Neurocytol 16:261; Otto y col. 1987 J. Neurosci 83:156),
de la muerte ontogenética durante el desarrollo embriónico
(Hamburger y col. 1984 J. Neurosci. 4: 767) y del daño
causado por la administración de taxol o cisplatina (Apfel y col.
1991 Ann. Neurol. 29: 87). Esta aparente generalidad de
protección a conducido al concepto de que si un factor neurotrófico
protege a las neuronas sensibles contra el daño experimental, puede
ser útil en el tratamiento de enfermedades que involucran el daño a
aquellas neuronas en pacientes, si bien la etiología puede ser
desconocida.
Un factor neurotrófico determinado, además de
tener la especificidad neuronal correcta, debe estar disponible en
suficiente cantidad para ser utilizado como un tratamiento
farmacéutico. Puesto que los factores neurotróficos están
típicamente presentes en cantidades muy pequeñas en tejidos (por
ejemplo, Hofer y Barde 1988 Nature 331: 261; Lin y col. 1989
Science 246: 1023), sería inconveniente preparar cantidades
farmacéuticas de factores neurotróficos directamente de tejidos
animales. Como alternativa, sería conveniente ubicar al gen para un
factor neurotrófico y utilizar ese gen como la base para establecer
un sistema de expresión recombinante para producir cantidades
potencialmente ilimitadas de la proteína.
Los inventores de esta solicitud describen un
método para seleccionar muestras biológicas a fin de determinar la
actividad neurotrófica en los precursores embriónicos de las
neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra que se degeneran en
la enfermedad de Parkinson. Este bioensayo para identificar
factores neurotróficos que pueden ser útiles en el tratamiento de la
enfermedad de Parkinson se basa en un ensayo previamente descrito
(Friedman y col. 1987 Neuro. Sci. Lett. 79:
65-72, que se incorpora específicamente en la
presente solicitud por medio de esta referencia) e implementado con
modificaciones en la presente invención. Este ensayo fue utilizado
para seleccionar diversas fuentes potenciales para actividad
neurotrófica dirigida a neuronas dopaminérgicas. La presente
invención describe la caracterización de un nuevo factor
neurotrófico que fue purificado de una de esas fuentes, el medio de
cultivo acondicionado de una línea celular de glioblastoma, B49
(Schubert y col. 1974 Nature 249: 224-27, que
se incorpora a este documento específicamente por medio de esta
referencia). El medio acondicionado de esta línea celular fue
previamente reportado para contener actividad neurotrófica
dopaminérgica (Bohn y col. 1989 Soc. Neurosci. Abs. 15: 277).
En este informe previo, la fuente de la actividad neurotrófica no
fue purificada, químicamente caracterizada, o mostrada como la
consecuencia de un único agente en el medio acondicionado. El daño a
los nervios es causado por condiciones que comprometen la
supervivencia y/o función apropiada de uno o más tipos de células
nerviosas. Ese tipo de daño a los nervios puede ocurrir de una
amplia variedad de diferentes causas, algunas de las cuales son
indicadas a continuación.
El daño a los nervios puede producirse a través
de lesión física, la cual causa la degeneración de los procesos
axonales y/o cuerpos de células nerviosas cerca del sitio de la
lesión. El daño a los nervios también puede producirse debido a
cesación temporal o permanente del flujo sanguíneo a partes del
sistema nervioso, como en un accidente cerebrovascular. El daño a
los nervios también puede producirse debido a la exposición
intencional o accidental a neurotoxinas, tales como los agentes
quimioterapéuticos para el cáncer y el SIDA cisplatino y
didesoxicitidina (ddC), respectivamente. El daño a los nervios
también puede producirse debido a enfermedades metabólicas
crónicas, tales como la diabetes o la disfunción renal. El daño a
los nervios también puede producirse debido a enfermedades
neurodegenerativas tales como el mal de Parkinson, el mal de
Alzheimer y Esclerosis Lateral Amiotrófica (ALS, Amyotrophic Lateral
Sclerosis), las cuales son el resultado de la degeneración de
poblaciones neuronales específicas.
Esta solicitud describe un factor neurotrófico
novedoso. Los factores neurotróficos son proteínas naturales que
promueven las funciones normales de las células nerviosas
específicas y/o protegen a las mismas células contra una variedad
de formas diferentes de daño. Estas propiedades son las que sugieren
que el GDNF puede ser útil en el tratamiento de diversas formas de
daño a los nervios, incluyendo aquellas formas indicadas
específicamente anteriormente.
El mal de Parkinson es identificado por un único
conjunto de síntomas que incluyen rigidez, bradiquinesis, seborrea,
modo de andar apresurado, postura encorvada, salivación, y un
temblor "de rodamiento de píldora" ("pill rolling"). La
enfermedad es encontrada en todas las razas en todo el mundo, y la
edad promedio del inicio es 60 años.
Después de años de teorías en conflicto y
controversia, ha surgido una base bioquímica para el mal de
Parkinson como la causa principal. (Ver, por ejemplo, Bergman, 1990
Drug Store News, 12:IP19.) De importancia significativa para
la comprensión del mal de Parkinson son las áreas del cerebro
conocidas como la sustancia nigra, los ganglios basales y
particularmente, el cuerpo estriado. La sustancia nigra, una capa
bilateralmente apareada de materia gris pigmentada en el cerebro
medio, está involucrada en la transmisión de dopamina, mientras que
la función de los ganglios basales normal involucra una serie de
interacciones y sistemas de feedback los cuales están asociados con
la sustancia nigra y mediados en parte por dopamina, acetilcolina y
otras sustancias.
En el mal de Parkinson, existe una disfunción en
la actividad dopaminérgica de la sustancia nigra la cual es causada
por la degeneración neuronal. Esto da como resultado un estado de
deficiencia de dopamina y un cambio en el equilibrio de actividad a
una predominancia colinérgica. Por consiguiente, si bien no hay
aumento alguno en la concentración de acetilcolina, los efectos
excitatorios en el sistema nervioso central (es decir, temblores)
por este mediador colinérgico superan los efectos inhibitorios de la
dopamina agotada.
El tratamiento más efectivo para el mal de
Parkinson hasta la fecha es la administración oral de Levodopa.
Levodopa penetra el sistema nervioso central y es enzimáticamente
convertido a dopamina en los ganglios basales. Se cree que los
efectos beneficiosos de Levodopa, son, por ende, el aumento de la
concentración de dopamina en el cerebro. Desafortunadamente, ni
Levodopa o ninguno de los medicamentos utilizados menos comunes
realmente frenan la progresión de la enfermedad la cual es causada
por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas.
Otros investigadores han reportado la existencia
de actividad dopaminérgica en diversas fuentes biológicas. En la
publicación PCT WO91/01739 de Springer y col., se identificó una
actividad neurotrófica dopaminérgica en un extracto derivado de
células del sistema nervioso periférico. La actividad identificada
no fue purificada, aunque se atribuyó a un factor que tiene un peso
molecular inferior a 10.000 daltons. El factor fue aislado de
nervio ciático de rata aunque aparentemente no es CNTF, el cual
también es encontrado en el nervio (Lin y col. 1989 Science
246: 1023).
En la Patente de los Estados Unidos No. 5.017.735
de Appel y col., se identificó actividad dopaminérgica en un
extracto de tejido de caudado- putamen. Nuevamente, no se
purificaron factores que den origen a la actividad y el peso
molecular aparente de las fracciones que contienen actividad era
relativamente pequeño. Ver también, Niijima y col. 1990, Brain
Res. 528: 151-154 (estriado químicamente
desaferenciado de cerebro de rata adulto); Lo y col. 1990 Soc.
Neurosci. Abstr., 16:809 (factor neurotrófico derivado de
estriado). Adicionalmente, otros factores neurotróficos conocidos
también han demostrado que tienen actividad dopaminérgica, por
ejemplo, el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF, "Brain
derived neurotrophic factor"), y Factores del Crecimiento de
Fibroblasto ácido y básico.
El GNDF de la presente invención fue aislado en
base a su capacidad de promover la actividad funcional y
supervivencia en cultivo celular de células nerviosas
dopaminérgicas del mesencéfalo embrionario de rata. Estas células
nerviosas dopaminérgicas son el precursor embriónico de las células
nerviosas dopaminérgicas en la sustancia nigra adulta que se
degenera en el mal de Parkinson. Por lo tanto, el GDNF puede ser de
utilidad en la reducción de la degeneración neuronal que causa los
síntomas del mal de Parkinson.
Adicionalmente, el GDNF puede ser útil en el
tratamiento de otras formas de daño a o función inapropiada de las
células nerviosas dopaminérgicas en pacientes humanos. Ese tipo de
año o mala función puede ocurrir en la esquizofrenia y en otras
formas de sicosis. Los tratamientos actuales para ese tipo de
condiciones a menudo requieren fármacos activos en receptores de
dopamina, sugiriendo que la función inapropiada de las neuronas
dopaminérgicas que inerva estas poblaciones neuronales que llevan
receptor puede estar involucrada en el proceso de la enfermedad.
En base a la experiencia previa con otros
factores neurotróficos, nuevas formas de daño a los nervios que
pueden tratarse con GDNF surgirán a medida que se aprenda más
acerca de los diversos tipos de células nerviosas que son sensibles
a este factor neurotrófico. Por ejemplo, el factor de crecimiento
nervioso (NGF, "nerve growth factor") solo surgió como un
tratamiento potencialmente útil para el mal de Alzheimer cuando fue
recientemente descubierto que el NGF actúa como un factor
neurotrófico para las neuronas colinérgicas del cerebro anterior
basales que se degeneran en el mal de Alzheimer. (Williams y col.
1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9231). Se proveen métodos
en la presente invención para determinar otras formas de daño a los
nervios que pueden ser tratadas útilmente con GDNF.
Patrick Aebischer y colaboradores han descrito el
uso de dispositivos de membrana semipermeables, implantables que
son útiles como medios para suministrar fármacos o medicamentos en
ciertas circunstancias. Por ejemplo, han propuesto la encapsulación
de células que secretan factores neurotransmisores, y la
implantación de tales dispositivos en el cerebro de pacientes que
sufren del Mal de Parkinson. Ver, Patente de los Estados Unidos No.
4.892.538 de Aebischer y col.; Patente de los Estados Unidos No.
5.011.472 de Aebischer y col.; Patente de los Estados Unidos No.
5.106.627 de Aebischer y col.; Solicitud PCT WO 91/10425; Solicitud
PCT WO 91/10470; Winn y col. 1991 Exper. Neurol. 113: 322-
329; Aebischer y col. 1991 Exper. Neurol. 111: 269- 275; y
Tresco y col. 1992 ASAIO 38: 17-23.
Esta invención se refiere a y reivindica el
factor neurotrófico de origen glial sustancialmente purificado
(GDNF). En una realización de esta invención, el GDNF
sustancialmente purificado es obtenido con una actividad específica
al menos aproximadamente 24.000 veces superior a la actividad
específica de medio acondicionado B49. El GDNF sustancialmente
purificado tiene una actividad específica de por lo menos
aproximadamente 12.000 TU/ug.
El GDNF sustancialmente purificado de la presente
invención tiene un peso molecular aparente de aproximadamente
31-42 kD en SDS-PAGE no reductor, y
aproximadamente 20-23 kD en SDS-PAGE
de reducción. El GDNF sustancialmente purificado tiene una
secuencia de terminal amino formada sustancialmente por la
secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 1):
(Ser)-Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala-Leu-Pro-Arg-Arg-Glu-(Arg)-Asn-(
)-Gln-Ala-Ala-
Ala-Ala-(Ser)-Pro-(Asp)-(Asn).
La secuencia de aminoácidos de formas maduras y
"pre-pro" de GDNF de rata es según lo expuesto
en las Figs. 13 y 14 (SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4). La secuencia de
aminoácidos de GDNF humano maduro es según lo expuesto en la
porción subrayada de Fig. 19 residuos aminoácidos 1 a 134 de SEC ID
NO: 5 y los residuos aminoácidos 1 a 134 de SEC ID NO: 6. La
secuencia de aminoácidos de la forma pre-pro de
GDNF humano es expuesta en las Figuras 19 (SEC ID NO: 5) y 22 (SEC
ID NO: 8)
Un aspecto de la invención es un método para
obtener GDNF purificado que comprende: 1) preparar un medio
acondicionado de crecimiento libre de suero de células de
glioblastoma B49; 2) concentrar el medio acondicionado; 3) llevar a
cabo cromatografía de heparina sepharose en el medio acondicionado
concentrado; 4) llevar a cabo cromatografía líquida de proteína
rápida sobre las fracciones obtenidas de dicha cromatografía de
heparina sepharose; y 5) llevar a cabo una cromatografía líquida de
alto rendimiento de fase inversa sobre las fracciones obtenidas de
dicha cromatografía líquida de proteína rápida. En una realización,
el método para obtener GDNF purificado es adicionalmente comprendido
de las etapas de: 6) someter a las fracciones obtenidas por
cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa a
SDS-PAGE preparativa; 7) llevar a cabo la
cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa sobre
fracciones obtenidas por SDS-PAGE preparativa.
También se describe la clonación del gen de GDNF
de rata de una genoteca de ADNc preparada de la línea celular B49.
La secuencia de ácidos nucleicos que codifica GDNF de rata madura y
pre-pro es expuesta en la Fig. 13 (SEC ID NO: 3). El
método para obtener un gen humano que codifica GDNF es también
descrito. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica GDNF humano
maduro es según lo expuesto en la Fig. 19 (SEC ID NO: 5). La
secuencia de ácidos nucleicos que codifica los primeros 50
aminoácidos del segmento pre-pro de GDNF humano es
según lo expuesto en la Fig. 22 (SEC ID NO: 8).
Esta invención también incluye composiciones
farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de GDNF
purificado en un portador farmacéuticamente adecuado. Asimismo se
describe un método para prevenir o tratar el daño a los nervios el
cual comprende administrar a un paciente que lo necesita una
cantidad terapéuticamente efectiva de GDNF. En realizaciones
preferidas, el daño a los nervios es el mal de Parkinson o células
nerviosas dopaminérgicas que funcionan incorrectamente o
inadecuadas.
En la realización preferida de esta invención, se
produce GDNF por métodos de ADN recombinante, utilizando los genes
que codifican GDNF según lo descrito en el presente documento. La
presente invención incluye un vector para utilizar en la producción
de GDNF biológicamente activo compuesto por elementos reguladores
de la expresión ligados operativamente a una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica GDNF maduro o pre-pro, y una
célula huésped transformada por ese tipo de vector. También se
incluye un método de ADN recombinante para la producción de GDNF
que comprende: subclonar una secuencia de ADN que codifica GDNF en
un vector de expresión el cual comprende los elementos reguladores
necesarios para expresar la secuencia de ADN; transformar una célula
huésped con dicho vector de expresión; cultivar las células
huéspedes bajo condiciones para amplificación del vector y
expresión de GDNF; y cosechar el GDNF.
Un método de ADN recombinante es descrito para la
producción de GDNF que comprende: cultivar las células huéspedes de
esta invención en condiciones para amplificación del vector y
expresión de GDNF; y cosechar el GDNF.
Esta invención incluye anticuerpos
sustancialmente purificados que reconocen GDNF. También se incluye
un método para prevenir o tratar el daño a los nervios el cual
comprende implantar células que secretan el factor neurotrófico de
origen glial en el cuerpo de pacientes que lo necesitan. Finalmente,
la presente invención incluye un dispositivo para prevenir o tratar
el daño a los nervios por implantación en un paciente que comprende
una membrana semipermeable, y una célula que secreta GDNF
encapsulado dentro de dicha membrana y dicha membrana es permeable
a GDNF e impermeable a factores del paciente perjudiciales para las
células.
La Figura 1 ilustra los resultados de
cromatografía de heparina sepharose en una solución de medio
acondicionado de crecimiento libre de suero de células de
glioblastoma B49. Los resultados muestran el eluido O.D._{290}
(-), conductancia (-\Delta-) y actividad de GDNF en TU (-o-). Las
fracciones marcadas por una barra fueron agrupadas para más
purificación.
La Figura 2 ilustra los resultados de
cromatografía de superose FPLC de las fracciones agrupadas de la
Fig. 1. Los resultados se muestran de O.D._{280} (-), y actividad
de GDNF en TU (-o-).
La Figura 3 ilustra los resultados de
RP-HPLC en fracción 14 de la Fig. 2. Se muestran
los resultados de O.D._{214}, con la actividad de GDNF en TU
mostrada más adelante.
La Figura 4 ilustra los resultados de análisis
por SDS-PAGE con tinción de plata de fracciones
3-10 obtenidas de la Fig. 3 anterior. La senda S
contiene patrones de pesos moleculares.
La Figura 5 ilustra los resultados de
SDS-PAGE preparativa en fracciones 5 y 6 de la Fig.
4. Se analizaron las porciones de gel para determinar la actividad
de GDNF en TU. Las porciones de gel también fueron correlacionadas
a peso molecular mediante el uso de marcadores de peso molecular
(Amersham).
La Figura 6 ilustra los resultados de la
RP-HPLC en las fracciones 16-23 de
la Fig. 5. El cromatograma A contiene la muestra, y el cromatograma
B es un control (extracto de gel agrupado de las porciones
correspondientes de una senda en blanco).
La Figura 7 ilustra los resultados del análisis
por SDS-PAGE con tinción de plata de pico 3 de la
Figura 6A (senda 1) y un control del peso molecular (senda S).
La Figura 8 (SEC ID NO: 1) describe la secuencia
de aminoácidos de terminal amino obtenido de GDNF purificado. El
paréntesis vacío indica una posición donde el aminoácido no pudo
ser determinado utilizando la técnica de secuenciado empleada.
Cuando los residuos son proporcionados en paréntesis, había cierta
incertidumbre en cuanto a la identificación de ese residuo. La
secuencia de aminoácidos de terminal amino correcta completa se
muestra en la Figura 19 (SEC ID NO: 5) que aparece más abajo.
La Figura 9 ilustra los resultados de
RP-HPLC en GDNF purificado digerido con tripsina.
El cromatograma A contiene la muestra, y el cromatograma B es un
control (que contiene tripsina solamente).
La Figura 10 ilustra los resultados de la
RP-HPLC de pico 37 de la Fig. 9. luego del
tratamiento con bromuro de cianógeno.
La Figura 11 ilustra los resultados de la
RP-HPLC sobre el producto de reducción de pico 1 de
la Figura 10.
La Figura 12 (SEC ID NO: 2) describe una
secuencia de aminoácidos interna obtenida de GDNF purificado.
La Figura 13 (SEC ID NO: 3) ilustra la secuencia
de ácidos nucleicos obtenida para GDNF de rata derivado de un clon
de ADNc de genoteca de células B49 \lambdaZapII76.1. También se
ilustra la secuencia de aminoácidos inferida para GDNF. La
secuencia de ácidos nucleicos que codifica GDNF maduro está
subrayada. La secuencia de terminal amino de la forma
pre-pro más preferida de GDNF está marcada con un
*.
La Figura 14 (SEC ID NO: 4) ilustra la secuencia
de aminoácidos inferida de GDNF maduro.
La Figura 15 ilustra los resultados de GDNF de
células B49 purificado y CNTF recombinante humano para promover la
supervivencia de neuronas parasimpáticas de ganglios ciliares
embrionarios de polluelo. El aumento de la densidad óptica en el
eje Y representa un aumento en la supervivencia neuronal. El eje X
representa una disminución en las concentraciones de cada factor
neurotrófico. La curva rotulada control es volúmenes iguales de
fracciones de HPLC inactivas adyacentes a aquellas que contienen el
GDNF utilizado para generar el GDNF rotulado de la curva.
La Figura 16 ilustra los resultados de GDNF de
células B49 purificado y CNTF recombinante humano para promover la
supervivencia de neuronas simpáticas de ganglios de cadena
simpática embrionarios de polluelo. El aumento de la densidad
óptica en el eje Y representa un aumento en la supervivencia
neuronal. El eje X representa una disminución en las
concentraciones de cada factor neurotrófico. La curva rotulada
control es volúmenes iguales de fracciones de HPLC inactivas
adyacentes a aquellas que contienen el GDNF utilizado para generar
el GDNF rotulado de la curva.
La Figura 17 ilustra los resultados de bioensayo
de medio acondicionado de células COS para determinar la capacidad
de aumentar la captación de dopamina por neuronas dopaminérgicas
mesencefálicas en cultivo. El eje Y presenta la cantidad de
dopamina radiorotulada tomada contra cantidades en aumento de medio
de cultivo de células COS concentrado en el eje X. La curva rotulada
B-1 representa el medio acondicionado libre de
suero de células COS transfectadas con el gen GDNF en la
orientación apropiada para expresión de GDNF. La curva rotulada
C-1 representa el medio acondicionado libre de suero
de células COS transfectadas con el gen GDNF en la orientación
opuesta, lo cual previene la expresión de GDNF.
La Figura 18 ilustra los resultados del bioensayo
de medio acondicionado de células COS para determinar la capacidad
de aumentar la supervivencia en cultivo de neuronas simpáticas de
la cadena simpática en embriones de gallina. El eje Y presenta la
cantidad de tinte MTT reducido por los cultivos y es proporcional a
la supervivencia neuronal. El eje X representa el aumento de la
dilución de medio de cultivo de células COS concentrado. La curva
rotulada GDNF representa el medio acondicionado libre de suero de
células COS transfectadas con el gen GDNF en la orientación
apropiada para la expresión de GDNF. La curva rotulada CONTROL
representa el medio acondicionado libre de suero de células COS
transfectadas con el gen GDNF en la orientación opuesta, lo cual
evita la expresión de GDNF.
La Figura 19 (SEC ID NO: 5) ilustra una porción
de la secuencia de ácidos nucleicos obtenida para GDNF humano,
según lo descrito en el Ejemplo 2C que aparece a continuación,
incluyendo la porción entera del gen que codifica para GDNF humano
maduro. También se ilustra la secuencia de aminoácidos inferida para
GDNF humano maduro. La secuencia de aminoácidos para GDNF maduro
está subrayada.
La Figura 20 ilustra la capacidad de GDNF de
estimular la captación de dopamina y la inmunotinción de tirosina
hidroxilasa (TH) en neuronas dopaminérgicas. Los cultivos fueron
establecidos según lo ilustrado en el Ejemplo 1B. Se agregó GDNF en
el día de colocación en placas y se volvió a llenar después de nueve
días in vitro. A. se midió la captación de
^{3}H-DA después de 15 días in vitro. B.
Se fijaron los cultivos después de 16 días in vitro con 4%
paraformaldehído, se lavó extensamente, se permeabilizó con 0,2%
Triton x-100 y se tiñó con anticuerpo policlonal a
TH (Eugine Tech International, Allendale, NJ). Se visualizó la
unión al anticuerpo primario utilizando un kit Vectastain ABC
(Vector Labs, Burlingame, CA).
La Figura 21 ilustra la especificidad de GDNF a
neuronas dopaminérgicas. Los cultivos fueron establecidos según lo
descrito en el Ejemplo 1B. Se agregó GDNF en el día de la
colocación en placas. A. Se midió la captación de
^{3}H-DA después de siete días in vitro.
B. Se midió la captación de ^{14}C-GABA después
de ocho días in vitro. Se incubaron las células y se trataron
como para captación de ^{3}H-DA, salvo que el
buffer de captación consistía en buffer de fosfato de
Kreb-Ringer, pH 7.4, que contenía glucosa 5,6 mM,
EDTA 1,3 mM, ácido amino-oxiacético 10 uM (para
evitar la desintegración de GABA), B-alanina 2mM
(para inhibir la captación glial de GABA) y
^{14}C-GABA 0,1 uM (150 mC_{1}/mmol, New
England Nuclear, Boston, MA). En presencia de ácido diaminobutírico
1 mM (DABA), un inhibidor potente de captación de
^{14}C-GABA en neurona GABA, la captación de
^{14}C fue reducida al 10%. Los valores de control en presencia
de DABA, fueron restados de los valores experimentales.
La Figura 22 (SEC ID NO: 8) ilustra una porción
de la secuencia de ácidos nucleicos obtenidos para GDNF humano,
según lo descrito en el Ejemplo 2D que aparece más adelante,
incluyendo la secuencia codificadora de aminoácidos
1-50 de GDNF pre-pro humano.
También se ilustra la secuencia de aminoácidos inferida para los
primeros 50 aminoácidos de GDNF pre-pro humano. Esta
información conjuntamente con la información de secuencia
codificadora proporcionada en la Figura 19, provee la secuencia
codificadora completa para GDNF pre-pro humano, y
la secuencia de aminoácidos inferida para la proteína GDNF
pre-pro humana.
La Figura 23 ilustra un mapa de sitios
SacII y PstI dentro del plásmido de
pBSSK-\lambda3AluI, según lo descrito en el
Ejemplo 2D que aparece más adelante.
La Figura 24 ilustra la especificidad de GDNF a
neuronas dopaminérgicas. Se prepararon los cultivos según lo
descrito en el Ejemplo 1B. Se agregó GDNF en el día de la
colocación en placas, y se midió la captación después de 6 días
in vitro.
A ilustra la captación de dopamina y B ilustra la
captación de serotonina.
La Figura 25 ilustra SDS-PAGE con
tinción Azul Coomassie, operada en condiciones de reducción, de
fracciones de cromatografía de un extracto bacteriano que contiene
GDNF no replegado en una columna S-Sepharose antes
de repliegue (ver Ejemplo 6C). Las sendas 2-8
representan fracciones consecutivas del eluado en columna. Las
Fracciones 3-5, enriquecidas para GDNF, se agruparon
para repliegue. La Senda 1 es patrones de peso molecular
(SDS-70L, Sigma).
La Figura 26 ilustra SDS-PAGE con
tinción Azul Coomassie de la solución de GDNF; antes de repliegue
(sendas 6 & 13), después de repliegue (senda 2), y después de
repliegue y posterior retro-reducción con
2-mercaptoetanol 150 mM (senda 5). El material
antes del repliegue y después de la retro-reducción
opera como un monómero en aproximadamente 16 kDa. GDNF después de
repliegue exitoso opera (sin reducción) como un dímero en
aproximadamente 30 kDa (ver Ejemplo 6C). La senda 15 es patrones de
peso molecular (SDS-70L, Sigma).
La Figura 27 ilustra los resultados de un
bioensayo utilizando GDNF replegado; midiendo la capacidad de
promover la supervivencia de neuronas simpáticas de embrión de
polluelo en cultivo. El procedimiento de bioensayo es según lo
descrito en el Ejemplo 4A. La densidad óptica (proporcional al
número de neuronas supervivientes) en el eje Y se traza contra la
concentración de GDNF en el eje X (determinado por exploración de
densitometría láser de geles de SDS-PAGE con
tinción Azul Coomassie). El ED50 calculado de GDNF replegado para
la supervivencia de neuronas simpáticas de embrión de polluelo es
aproximadamente 3 ng/ml.
La Figura 28 ilustra los resultados de un
bioensayo utilizando GDNF replegado; midiendo la capacidad de
aumentar la captación de dopamina por neuronas dopaminérgicas
nigrales en cultivos de mesencéfalo embriónico de rata. El
procedimiento de bioensayo es según lo descrito en el Ejemplo 1B. La
captación de dopamina en el eje Y es trazada contra concentraciones
de GDNF en el eje X. El ED50 calculado de GDNF replegado para el
aumento de la captación de dopamina en estos cultivos es
aproximadamente 3 pg/ml.
Se hará ahora referencia en detalle a las
realizaciones actualmente preferidas de la invención, las cuales,
junto con los siguientes ejemplos, sirven para explicar los
principios de la invención.
Con anterioridad a esta invención, no se había
identificado al GDNF como una sustancia biológicamente activa
discreta y no había existido en una forma sustancialmente pura.
Según lo descrito en la presente memoria descriptiva, se provee una
descripción detallada de GDNF, junto con una descripción de: sus
características físicas, químicas y biológicas; su utilidad; cómo
prepararlo; composiciones útiles que lo contienen; secuencias de
ácidos nucleicos que lo codifican; vectores que contienen ese tipo
de secuencias de ácidos nucleicos; células huéspedes transformadas
por tales vectores; técnicas recombinantes para su producción; y
otros aspectos de la invención.
El GDNF es una proteína que puede ser
identificada en u obtenida de células gliales y que exhibe
actividad neurotrófica. Más específicamente, el GDNF es una
proteína neurotrófica dopaminérgica que está caracterizada en parte
por su capacidad de aumentar la captación de dopamina en
precursores embriónicos de las neuronas dopaminérgicas de la
sustancia nigra, y adicionalmente por su capacidad de promover la
supervivencia de células nerviosas parasimpáticas y simpáticas. El
GDNF sustancialmente purificado es caracterizado adicionalmente de
diversas maneras:
1. Tiene una actividad específica de por lo menos
aproximadamente 12.000 TU/ug.
2. Tiene un peso molecular en
SDS-PAGE reductor de aproximadamente
20-23 kD.
3. Tiene un peso molecular en
SDS-PAGE no reductor de aproximadamente
31-42 kD.
4. Tiene una actividad específica de por lo menos
aproximadamente 24.000 veces superior a la actividad específica de
medio acondicionado B49.
5. Tiene la capacidad de regular hacia arriba la
inmunoreactividad de tirosina hidroxilasa en cultivo
mesencefálico.
6. Tiene la secuencia de aminoácidos de terminal
amino según lo mostrado en la Figura 8 (SEC ID NO: 1).
7. Tiene la secuencia de aminoácidos interna como
se muestra en la Figura 12 (SEC ID NO: 2).
El GDNF de la presente invención es más
completamente descrito en detalle más adelante. Debe entenderse que
este aspecto de la invención cubre cualquier proteína neurotrófica
dopaminérgica que tiene una secuencia de aminoácidos de terminal
amino igual o sustancialmente homóloga a aquella proporcionada en la
Figura 8 (SEC ID NO: 1). Esta invención también incluye cualquier
proteína neurotrófica dopaminérgica que tiene una secuencia de
aminoácidos interna igual o sustancialmente homóloga a aquella
proporcionada en la Figura 12 (SEC ID NO: 2).
Esta invención incluye una novedosa proteína
neurotrófica dopaminérgica que es definida en la presente memoria
descriptiva como factor neurotrófico de origen glial (GDNF). GDNF
ha sido identificado en y aislado de un medio acondicionado de
crecimiento libre de suero de células de glioblastoma B49 en una
forma sustancialmente purificada.
El GDNF ha sido purificado y caracterizado, y las
secuencias de aminoácidos parciales del material purificado han
sido obtenidas. En base a la secuencia de aminoácidos parcial
obtenida, se diseñaron sondas de ADN para obtener un clon de ADNc
de rata que puede utilizarse en la producción recombinante de GDNF.
La secuencia de ácidos nucleicos de tal clon y la secuencia de
aminoácidos inferida de GDNF de rata se proporcionan en las Figs.
13 (SEC ID NO: 3) y 14 (SEC ID NO: 4).
La secuencia de aminoácidos de terminal amino de
GDNF ha sido determinada, y se muestra en la Figura 8 (SEC ID NO:
1). Una porción de la secuencia de aminoácidos interna de GDNF
también ha sido determinada, y se muestra en la Figura 12 (SEC ID
NO: 2). El GDNF purificado tiene un peso molecular aparente de
aproximadamente 31-42 kD en
SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras, y
aproximadamente 20-23 kD en SDS-PAGE
bajo condiciones reductoras. Si bien no se está limitados por tal
teoría, se postula que esta información es consistente con GDNF
siendo un dímero glicosilado, unido a disulfuro en su estado
natural.
Según lo descrito con más detalle en el Ejemplo
6C que aparece más adelante, la expresión del gen de GDNF humano en
un sistema de expresión bacteriano conduce a la producción de GDNF
humano recombinante o rhGDNF. El material aislado después de la
expresión es esencialmente biológicamente inactivo, y existe como un
monómero. Luego del repliegue, GDNF existe como un dímero unido a
disulfuro biológicamente activo. Por lo tanto, GDNF es un dímero
unido a disulfuro en su forma natural, biológicamente activa. Sin
embargo, esta invención incluye GDNF tanto en formas monoméricas
como diméricas, y biológicamente inactivas y biológicamente
activas.
Las sondas se prepararon en base a la secuencia
de ácidos nucleicos de GDNF de rata a fin de clonar el gen de ADN
genómico que codifica GDNF humano. El gen humano que codifica GDNF
maduro, y la secuencia de aminoácidos de GDNF maduro humano son
proporcionados en la Figura 19 (SEC ID NO: 5).
El GDNF también puede ser caracterizado por su
capacidad de aumentar la captación de dopamina en los precursores
embriónicos de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra,
según lo descrito en el Ejemplo 1 que aparece más adelante. GDNF
puede ser caracterizado adicionalmente por su capacidad de promover
la supervivencia de células nerviosas parasimpáticas y simpáticas,
según lo descrito en el Ejemplo 4 que aparece más adelante.
El GDNF puede ser caracterizado adicionalmente
por su capacidad de regular hacia arriba la inmunoreactividad de
tirosina hidroxilasa en cultivos mesenfálicos. Un ejemplo de esta
característica se describe en el Ejemplo 1E y se muestra en la
Figura 20. Adicionalmente, se ha demostrado que GDNF tiene cierta
especificidad para neuronas dopaminérgicas con relación a neuronas
generalmente. Por ejemplo, esto fue demostrado por el efecto
limitado sobre la captación de ácido
\gamma-aminobutírico (GABA) en neuronas que
contienen GABA. Esto también es descrito en el Ejemplo 1E y
mostrado en la Figura 21. GDNF también ha demostrado que tiene
efecto limitado, si lo hay, sobre la captación de serotonina en
neuronas serotonérgicas. Esto es descrito en el Ejemplo 1E y
mostrado en la Figura 24.
A lo largo de esta memoria descriptiva, cualquier
referencia al factor neurotrófico de origen glial debería
interpretarse como refiriéndose a factores neurotróficos de
cualquier origen los cuales son sustancialmente homólogos a y los
cuales son biológicamente equivalentes al GDNF caracterizado y
descrito en la presente memoria descriptiva. El grado de homología
entre la proteína de rata y la humana es de aproximadamente 93% y
todo GDNF de mamífero tendrá un grado similarmente elevado de
homología. Tales GDNFs pueden existir como dímeros en su forma
biológicamente activa.
La presente invención abarca formas glicosiladas
y no glicosiladas de GDNF así como también las formas truncadas del
GDNF natural y recombinante según lo descrito en la presente
memoria descriptiva. En una realización adicional, GDNF es
modificado mediante unión de uno o más polietilenglicol (PEG) u
otras porciones poliméricas repetitivas. La presente invención
también abarca GDNF recombinantemente producido en sistemas de
expresión bacteriana que contienen un residuo metionina de terminal
amino.
Por "biológicamente equivalente" como se
utiliza a lo largo de la memoria descriptiva y las
reivindicaciones, queremos decir composiciones de la presente
invención las cuales son capaces de demostrar cierta o la totalidad
de las mismas propiedades neurotróficas en forma similar, aunque no
necesariamente al mismo grado como el GDNF aislado del medio
acondicionado B49. Por "sustancialmente homólogo" como se
utiliza a lo largo de la memoria descriptiva y reivindicaciones, se
quiere decir un grado de homología al GDNF aislado del medio
acondicionado B49 en exceso de aquel exhibido por cualquier GDNF
previamente reportado. Preferentemente, el grado de homología está
en exceso de 70%, más preferentemente en exceso de 80%, y aun más
preferentemente en exceso de 90%, 95% o 99%. El porcentaje de
homología según lo descrito en la presente memoria descriptiva se
calcula como el porcentaje de residuos aminoácidos encontrados en
la más pequeña de las dos secuencias las cuales se alinean con
residuos aminoácidos idénticos en la secuencia que se está
comparando cuando pueden introducirse cuatro espacios en una
longitud de 100 aminoácidos para ayudar en esa alineación según lo
expuesto por Dayhoff, en Atlas of Protein Sequence and
Structure Vol. 5, pág. 124 (1972), National Biochemical
Research Foundation, Washington, D.C., incorporada específicamente
en la presente memoria descriptiva como referencia. También se
incluye como sustancialmente homólogo cualquier GDNF que puede ser
aislado en virtud de reactividad cruzada con anticuerpos para el
GDNF descrito en la presente memoria descriptiva o cuyos genes
pueden ser aislados a través de hibridación con el gen o con
segmentos del gen para GDNF descrito en la presente memoria
descriptiva.
Un GDNF preferido de la presente invención ha
sido aislado de medio acondicionado B49 y ha sido aislado en una
forma sustancialmente purificada. Un GDNF preferido adicional es
preparado por tecnología de ADN recombinante para producir GDNF en
una forma sustancialmente purificada. Para los propósitos de la
presente solicitud, "forma pura" o "forma sustancialmente
purificada", cuando se utiliza para hacer referencia al GDNF
descrito en la presente memoria descriptiva, significará una
preparación la cual está sustancialmente libre de otras proteínas
las cuales no son GDNF. Preferentemente, el GDNF de la presente
invención es por lo menos 50% por ciento puro, preferentemente 75%
puro y más preferentemente 80%, 95% o 99% puro. En una realización
de la presente invención, la preparación de proteína GDNF es de tal
forma sustancialmente purificada de modo de permitir a un experto en
la técnica que determine al menos porciones de su secuencia de
aminoácidos sin primero llevar a cabo pasos de purificación
adicionales.
En una realización preferida de esta invención,
GDNF es purificado de medio acondicionado B49 según lo descrito en
el Ejemplo 1 que aparece más adelante. Naturalmente, dada la
información expuesta en la presente memoria descriptiva, será
evidente para los expertos en la técnica que pueden identificarse
otras fuentes de GDNF, y que la purificación de GDNF de tales
fuentes puede lograrse generalmente de acuerdo con el método de
purificación presentado aquí.
La actividad dopaminérgica del GDNF se utiliza
para facilitar el proceso de purificación. El bioensayo para las
actividades neurotróficas dopaminérgicas se describe en el Ejemplo
1B que aparece más adelante. Brevemente, los cultivos de células
mesenfálicas disociadas son preparados, ya sea en ambientes ricos en
suero o libres de suero. Las muestras a ser ensayadas para
determinar la actividad dopaminérgica son desaladas y agregadas en
serie a los cultivos celulares y los platos son incubados durante 6
días a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía 6,5% de
CO_{2}. Los cultivos, en presencia del material de ensayo, son
luego incubados a 37ºC con dopamina tritiada
(^{3}H-DA). La captación de dopamina es
interrumpida, las células son lavadas, y la captación de dopamina
analizada por conteo por centelleo de tritio retenido en los
cultivos.
La purificación de GDNF se describe más adelante
en detalle en el Ejemplo 1C. El proceso de purificación es
detallado en la Tabla I. El material de partida del medio
acondicionado es preparado de células de glioblastoma B49 colocando
las células en medio libre de suero durante 2 días, cuando el medio
acondicionado es recogido y rellenado. Este ciclo es repetido para
dar 3 cosechas de medio acondicionado de cada tanda de células B49.
El medio acondicionado es centrifugado y concentrado aproximadamente
10 veces antes de purificación adicional.
El primer paso de preparación de esta mezcla
cruda definida en la presente memoria descriptiva como medio
acondicionado de crecimiento libre de suero de glioblastoma B49, es
introducir el medio acondicionado sobre una columna de Heparina
Sepharose equilibrada con buffers NaPi 50 mM, pH 8,0, que contiene
NaCl 0,15 N. Una solución buffer de gradiente compuesta por NaPi 50
mM, pH 8.0 que contenía NaCl 1.5 N se introduce a la columna
después de estabilizarse la elución. Las fracciones de esta
cromatografía se miden para actividad de GDNF, y aquellas
fracciones que contienen la actividad de GDNF son agrupadas para
purificación adicional.
Las fracciones agrupadas son sometidas a
cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC) en una columna
Superose, con un buffer disolvente de buffer NaPi 50 mM, pH 7.4,
que contiene NaCl 0,5 N. Nuevamente, se determina la actividad de
GDNF de las fracciones obtenidas. Luego, una única fracción de este
procedimiento es acidificada y cargada sobre una columna de
cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa
C-8 (HPLC). Las fracciones identificadas que
contienen actividad de GDNF son combinadas para purificación
adicional y para secuenciado de proteína. Como se muestra en la
Tabla 1 que aparece más adelante, el GDNF obtenido en este punto
tiene una actividad específica de aproximadamente 24.000 veces en
exceso de medio acondicionado. El secuenciado de terminal amino de
la proteína obtenida en este punto da la secuencia de terminal
amino según se muestra en la Figura 8 (SEC ID NO: 1).
La purificación adicional del GDNF obtenido de
HPLC puede lograrse llevando a cabo SDS-PAGE
preparativa sobre las fracciones que contienen la actividad de
GDNF. Se agregan a las fracciones que contienen proteína buffer que
contiene glicerol y SDS, y la solución es operada en
SDS-PAGE al 15% no reducido, con electroforesis
conducido a 10ºC a 40 mA/gel durante 2 horas. Se encontrado que la
porción del gel correspondiente a un peso molecular de
aproximadamente 30-42 kD contiene la actividad de
GDNF por bioensayo. Una segunda cromatografía de HPLC del material
aislado de SDS-PAGE da un solo pico de GDNF, según
lo mostrado en la Figura 6.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las secuencias de terminal amino de GDNF fueron
determinadas para el material a partir de la HPLC antes y después
de SDS-PAGE preparativa. Los procedimientos
utilizados para obtener las secuencias de aminoácidos de GDNF
purificado son proporcionados en el Ejemplo 1D. Se obtuvo la
secuencia de terminal amino con un secuenciador de proteína de fase
gaseosa. Las secuencias internas se obtuvieron a partir del material
obtenido mediante HPLC que no había sido adicionalmente purificado
por SDS-PAGE preparativa. Se obtuvo la secuencia de
aminoácidos interna incubando el GDNF purificado con tripsina. Los
fragmentos de tripsina obtenidos se separaron mediante HPLC. Se
descubrió que un fragmento contenía los primeros 13 residuos
aminoácidos de la secuencia de terminal amino de la proteína no
tratada. Se trató un segundo fragmento con CNBr, se purificó
mediante HPLC, se redujo, y nuevamente se purificó sobre HPLC. La
secuencia de aminoácidos obtenida se muestra en la Figura 12 (SEC
ID NO: 2). Aquellas secuencias dadas entre paréntesis se
determinaron hasta un pequeño grado de confianza.
Esta invención incluye el método para clonar el
gen para GDNF, y el gen que fue identificado que codifica GDNF. Un
procedimiento detallado para la clonación de genes de rata y
humanos para GDNF se brinda más adelante en el Ejemplo 2.
Nuevamente, aquellos expertos en la técnica apreciarán que otros
métodos para clonar ese tipo de gen son obvios a la luz de la
descripción en la presente memoria descriptiva. En particular, la
clonación de genes de otras especies que codifica GDNF será obvia en
vista de las descripciones y procedimientos descritos en el
presente documento.
El gen de GDNF de rata descrito en el presente
documento se obtuvo de una genoteca de ADNc construida de poli A+
ARN aislado de células B49, la cual se cribó con una sonda de
oligonucleótidos degenerada en base a la secuencia de aminoácidos
obtenida del GDNF purificado. Se obtuvo el ADNc de acuerdo con
procedimientos convencionales, se trató para contener ligantes
Eco-RI-digeridos, y se insertó en el
vector de clonación \lambdaZap II. La sonda de hibridación
utilizada fue ^{32}P-rotulada, y consistía en el
siguiente oligonucleótido degenerado (SEC ID NO: 7):
Se obtuvieron diversos clones positivos, y se
identificó positivamente un clon (\lambdaZapII76.1) por
secuenciado de ADN como codificando una porción de GDNF que no se
utilizó en el diseño de la sonda degenerada.
El procedimiento para obtener la secuencia de
nucleótidos del clon de ADNc contenido en \lambdaZapII76.1 se
brinda en el Ejemplo 2B el cual aparece más adelante. Se determinó
la secuencia de nucleótidos de los primeros 877 pares de bases del
extremo 5' del clon de ADNc, y se muestra en la Figura 13 (SEC ID
NO: 3). En la Figura 13, el clon mostrado contiene un marco de
lectura abierta (ORF "open reading frame") de 227 aminoácidos
que incluye el término amino de GDNF purificado y es consistente
con la secuencia para un péptido interno obtenido por disociación
de GDNF purificado.
La secuencia de aminoácidos inferida
proporcionada en la Figura 14 (SEC ID NO: 4) muestra la secuencia
de aminoácidos para el "GDNF maduro". Por "GDNF maduro",
se quiere decir la secuencia del GDNF purificado obtenido del medio
acondicionado B49. Naturalmente, el GDNF purificado puede existir
como un dímero u otro multímero y puede ser glicosilado o
químicamente modificado de otras maneras. El GDNF maduro puede ser
truncado en el término carboxilo, en particular por procesamiento
proteolítico de los residuos lys-arg 6 y 5 residuos
del extremo terminal carboxilo. El examen de la secuencia de ácidos
nucleicos del clon \lambdaZapII76.1 de rata como se muestra en la
Fig. 13 (SEC ID NO: 3) sugiere que GDNF se traduce inicialmente
como un polipéptido pre-pro-GDNF y
que el procesamiento proteolítico de la secuencia de señal y la
porción "pro" de esta molécula dan como resultado GDNF
purificado que tiene la misma secuencia madura que la obtenida del
medio acondicionado B49. Se postula, que el polipéptido
pre-pro-GDNF comienza en el primer
codón ATG -codificador de metionina- en el extremo 5' del clon
(posición 50 en la Figura 13). Por consiguiente, la presente
invención incluye cualquiera y la totalidad de los polipéptidos
pre-pro GDNF que pueden ser traducidos del gen
mostrado en la Figura 13, como así también cualquiera y la totalidad
de polipéptidos pre-pro GDNF traducidos de un clon
más completo que puede obtener más fácilmente por un experto en la
técnica utilizando procedimientos de laboratorio estándares y el
clon descrito en la presente memoria descriptiva.
La revisión de la secuencia de ácidos nucleicos
de rata proporcionada en la Fig. 13 (SEC ID NO: 2) muestra que la
secuencia de aminoácidos esperada ubicada entre las posiciones 518
y 538 es
Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu
la cual es consistente con la secuencia de aminoácidos determinada
para un péptido derivado de GDNF maduro purificado mediante el
proceso descrito en la sección sobre secuencia interna en el Ejemplo
1 que aparece más adelante. Un codón de detención TGA en posición
683 termina el ORF. La longitud esperada del GDNF purificado es así
de 134 residuos aminoácidos, y el peso molecular esperado de este
polipéptido es 14.931. Se producen dos sitios potenciales de
glicosilación ligados en N en las posiciones 425 y 533. La
glicosilación en cualquiera de los dos o en ambos de estos sitios
aumentaría el peso molecular de la molécula.
El residuo serina en posición 281, el cual
corresponde al inicio de la secuencia de GDNF maduro purificado, es
precedido por la secuencia Lys-Arg la cual provee
un sitio de disociación proteolítica potencial para el procesamiento
de una forma precursora putativa de GDNF para producir la forma de
la molécula que es purificada a partir de las células B49. Se
produce un codón de iniciación translacional potencial (ATG) en
posición 50 en la secuencia y es seguido cercanamente por una
secuencia de señal secretora potencial. Las secuencias que
flanquean este ATG muestran suficiente similitud con la secuencia de
consenso Kozak (Kozak 1987 Nucleic Acids Res. 15:
125-48) para indicar que este ATG podría utilizarse
como un sitio de iniciación translacional. Asimismo, este ATG es el
más 5' ATG en la secuencia del clon de ADNc. Estos hechos sugieren
que es un sitio de inicio potencial para la traducción de una forma
precursora de GDNF.
Estas características antes señaladas de la
secuencia de nucleótidos del clon de ADNc de rata sugieren la
posibilidad de que GDNF sea inicialmente traducido como un
polipéptido pre-pro-GDNF y que el
procesamiento proteolítico de la secuencia de señal y la porción
"pro" de esta molécula dan como resultado la producción de la
forma de GDNF que es purificada a partir del medio acondicionado de
células B49. Sin embargo, la aparición de otras formas de GDNF
también es consistente con los datos de las secuencias. Por ejemplo,
dos inicios translacionales de ATG potenciales diferentes se
producen dentro el ORF de 681 pb: uno en posición 206 y uno en 242.
Estos ATGs están ubicados corriente arriba del inicio de la
secuencia de terminal amino de GDNF purificado. No obstante, en
eucariotes, la iniciación translacional generalmente se produce en
el 5'-más ATG del ARNm (Kozak, antes mencionado) hay
casos en los cuales una proporción de las iniciaciones
translacionales se producen en un ATG corriente abajo. Por lo
tanto, las formas precursoras alternativas de GDNF podrían surgir en
forma concebible por iniciación translacional en estos codones ATG.
El procesamiento proteolítico de estos polipéptidos podría dar como
resultado la producción de la misma forma de GDNF purificado
observada en medio acondicionado de células B49. Asimismo, el marco
de lectura abierta se extiende a través del extremo 5' de la
secuencia del clon de ADNc. Por lo tanto, es posible que la
iniciación de la traducción ocurra en un ATG corriente arriba que
no está presente en el clon de ADNc. En esta eventualidad, GDNF se
traduciría como un precursor aun más grande que contiene la
secuencia de aminoácidos descrita aquí y secuencia adicional
corriente arriba. El procesamiento de ese tipo de forma precursora
hipotética también podría conducir a la producción de la forma
purificada de GDNF reportada aquí. Sería posible detectar inicios
de ATG corriente arriba potenciales por secuenciado del extremo 5'
del ARNm que contiene el gen GDNF por medio de la extensión de
cebador con transcriptasa inversa (Maniatis y col. más arriba).
Adicionalmente, podrían obtenerse otros clones de ADNc de genotecas
de B49 y los extremos 5' de estos clones podrían ser secuenciados.
El tamaño del ARNm 5' ubicado corriente arriba del primer ATG puede
determinarse más a groso modo mediante las técnicas de "mapeo de
S1" (Maniatis y col. más arriba) y/o simple selección de tamaño
de los productos de extensión de cebadores de la reacción de
transcriptasa inversa. Si bien puede postularse una variedad de
formas putativas del producto translacional primario que contiene
las secuencias que codifican GDNF purificado, la secuencia de ADN
parcial presentada aquí para el clon de ADNc llevada en el fago
recombinante \lambdaZapII76.1 define claramente la secuencia
codificadora que constituye el polipéptido de GDNF purificado
aislado del medio acondicionado de células B49.
En el Ejemplo 2C que aparece más adelante, la
clonación del gen humano que codifica GDNF, es descrita. Se
clasificó una genoteca genómica humana con una sonda derivada del
clon de ADNc de rata descrito en el Ejemplo 2B. Se identificó un
clon de ADN genómico del gen de GDNF humano y la secuencia del gen
que codifica GDNF humano maduro se proporciona en la Fig. 19 (SEC
ID NO: 5).
La secuencia proporcionada en la Figura 19 para
el gen para GDNF humano no da la secuencia codificadora entera para
la porción pre-pro de GDNF. El proceso para obtener
la secuencia codificadora para los primeros 50 aminoácidos de GDNF
pre-pro humano se describe más abajo en el Ejemplo
2D. La secuencia obtenida se proporciona en la Figura 22 (SEC ID
NO: 8). El mapa de plásmido pB55K-\lambda3Alu1
utilizado para obtener la secuencia es como se muestra en la Figura
23.
Esta invención incluye secuencias de ácidos
nucleicos que codifican GDNF. En la presente memoria descriptiva se
proporcionan secuencias relativamente altamente homólogas que
codifican para GDNF de rata (Fig. 13) (SEC ID NO: 3) y humana (Fig.
19) (SEC ID NO: 5). También se incluye dentro del alcance de esta
invención secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente similares
que codifican para las mismas secuencias de aminoácidos o altamente
homólogas. Por ejemplo, cuando se prepara una construcción para la
expresión de GDNF maduro en un sistema de expresión bacteriana tal
como E. coli, ciertos codones en la secuencia de ácidos
nucleicos dadas en la Fig. 19 (SEC ID NO: 5) pueden ser sustituidas
con codones más fácilmente expresados en E. coli de acuerdo
con procedimientos bien conocidos y estándares. Ese tipo de
secuencias de ácidos nucleicos modificadas serían incluidas dentro
del alcance de esta invención.
Las secuencias de ácidos nucleicos específicas
pueden ser modificadas por aquellos expertos en la técnica. Por lo
tanto, esta invención también incluye todas las secuencias de
ácidos nucleicos las cuales codifican las secuencias de aminoácidos
para GDNF de rata maduro y humano maduro según lo expuesto en las
Figuras 14 (SEC ID NO: 4) y 19 (SEC ID NO: 5), y GDNF de rata
pre-pro según lo expuesto en la Figura 13 (SEC ID
NO: 3) y para GDNF humano pre-pro según lo expuesto
en las Figuras 19 (SEC ID NO: 5) y 22 (SEC ID NO: 8). La presente
invención también incorpora secuencias de ácidos nucleicos las
cuales se hibridan con todas dichas secuencias de ácidos nucleicos
-o los complementos de las secuencias de ácidos nucleicos donde
fuese apropiado- y codifican un polipéptido que tiene actividad
dopaminérgica. La presente invención también incluye secuencias de
ácidos nucleicos las cuales codifican polipéptidos que tienen
actividad dopaminérgica y que son reconocidos por anticuerpos que
se unen a GDNF.
La presente invención también abarca vectores que
comprenden elementos reguladores de la expresión operativamente
ligados a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos
incluidas dentro del alcance de la invención. Esta invención también
incorpora células huéspedes -de cualquier variedad- que han sido
transformadas con vectores que comprenden elementos reguladores de
la expresión ligados operativamente a cualquiera de las secuencias
de ácidos nucleicos incluidas dentro del alcance de esta
invención.
La expresión de GDNF en células COS se describe
más adelante en el Ejemplo 5. El gen que codifica GDNF ilustrado en
la Figura 13 se subclonó en el vector plásmido pSG5, un vector
diseñado para la expresión transitoria de células de genes clonados
tales como células COS. Los plásmidos que contienen el gen GDNF en
la orientación apropiada e inapropiada se seleccionaron y el ADN fue
transfectado en células COS-7. Luego del cultivo,
se recolectaron las células transformadas. El medio acondicionado
COS-7 se ensayó para determinar la bioactividad en
el ensayo dopaminérgico y el ensayo de neuronas de ganglios
simpáticas. El medio acondicionado de las células que contienen el
gen para GDNF en la orientación apropiada se descubrió que tenía
actividad biológica en ambos ensayos, lo cual indica que GDNF
biológicamente activo había sido exitosamente producido mediante
procesos de ADN recombinante.
En una realización preferida de la presente
invención, se prepara GDNF maduro humano mediante tecnología de ADN
recombinante en un sistema de expresión bacteriana.
La expresión de GDNF humano en E. coli se
describe más adelante en el Ejemplo 6. La porción del gen de GDNF
humano que codifica GDNF humano maduro como se muestra en la Figura
19, se utilizó para preparar una construcción de GDNF humano. Tal
construcción se ligó en un vector plásmido, el cual se transformó en
la cepa JM107 de E. coli. Después del cultivo de las células
huéspedes transformadas, el GDNF producido fue recogido. Una
proteína del peso molecular esperado para GDNF humano maduro
(aproximadamente 15.000 daltons) fue obtenida, y el secuenciado de
termina amino confirmó que la proteína obtenida era GDNF humano
maduro.
El repliegue y naturalización de GDNF humano
expresado en E. coli se describe más adelante en el Ejemplo
6C. En la realización de la invención descrita, el extracto que
contiene proteína expresado obtenido fue parcialmente purificado
antes del repliegue por cromatografía de intercambio iónico sobre
resina S-Sepharose Fast Flow. El repliegue se
consiguió agregando: en primer lugar ditiotreitol, luego sal
disódica de glutationa, luego un buffer de repliegue al extracto
que contenía el GDNF. El rhGDNF replegado fue sustancialmente
completamente activo desde el punto de vista biológico y existía
como un dímero unido a disulfuro en su forma activa desde un punto
de vista biológico. El GDNF antes del repliegue -y después de
reducción del material replegado- existió en un estado monomérico y
fue sustancialmente inactivo desde un punto de vista biológico.
El GDNF también puede ser producido mediante la
expresión en otros sistemas de expresión. Por ejemplo, con la
secuencia de ácidos nucleicos que codifica GDNF humano maduro como
se muestra en la Figura 19, un experto en la técnica podría
producir GDNF en otros sistemas de expresión. Los vectores que
contenían la secuencia de ácidos nucleicos que codifica GDNF ligada
operativamente a elementos reguladores de la expresión pueden ser
transformados en otras células huéspedes de microorganismos
incluyendo Bacillus, Pseudomonas y levadura. Los
sistemas de expresión de baculovirus también pueden ser
empleados.
Como se señaló anteriormente, la presente
invención se refiere a métodos para tratar el daño a los nervios en
pacientes que sufren del mismo. Estos métodos comprenden la
administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un
factor neurotrófico de origen glial humano (GDNF) a un paciente que
sufre de daño a los nervios.
Se considera que una enfermedad o indicación
médica es un daño a los nervios si la supervivencia o función de
las células nerviosas y/o sus procesos axonales se encuentran
comprometidos. En una realización preferida, tal daño a los nervios
se produce como resultado de una de las siguientes condiciones: 1)
Lesión física, la cual causa la degeneración de los procesos
axonales y/o cuerpos de células nerviosas cerca del sitio de la
lesión; 2) Isquemia, como en el accidente cerebrovascular; 3)
Exposición a neurotoxinas, tales como los agentes quimioterapéuticos
para el cáncer o el SIDA cisplatino y didesoxicitidina (ddC),
respectivamente; 4) Enfermedades metabólicas crónicas, tales como
diabetes o disfunción renal; y 4) Enfermedades neurodegenerativas
tales como el mal de Parkinson, mal de Alzheimer y Esclerosis
Lateral Amiotrófica (ALS), las cuales causan la degeneración de
poblaciones neuronales específicas. Una lista no exclusiva de
afecciones que involucran el daño a los nervios incluye, el mal de
Parkinson, mal de Alzheimer, Esclerosis Lateral Amiotrófica,
Accidente Cerebrovascular, Polineuropatía Diabética, Neuropatía
Tóxica causada por los agentes quimioterapéuticos para el cáncer
taxol o cisplatina o vincristina, Neuropatía Tóxica causada por los
agentes quimioterapéuticos para el SIDA ddI o ddC, y daño físico al
sistema nervioso tal como aquel causado por lesión física del
cerebro y médula espinal o lesiones de corte o choque al brazo y a
la mano.
Los métodos para producir GDNF son también
descritos en la presente memoria descriptiva. Un método descrito
consiste en aislar GDNF de diversas fuentes, tal como medio
acondicionado de líneas celulares gliales. Un segundo método
involucra aislar los genes responsables de la codificación de GDNF,
clonación del gen en vectores adecuados y tipos celulares, y
expresar el gen a fin de producir el GDNF. El método último
mencionado, el cual es ejemplar de los métodos de ADN recombinante
en general, es un método preferido de la presente invención. Los
métodos de ADN recombinante son preferidos en parte debido a que
son capaces de lograr cantidades comparativamente superiores de
proteína a mayor pureza. El GDNF recombinante es la proteína más
preferida para la preparación de composiciones terapéuticas y para
el tratamiento del daño a los nervios.
Esta invención incluye medios para identificar y
clonar genes que codifican proteínas que comparten homología de
secuencias de aminoácidos con GDNF, como así también todas las
proteínas identificadas.
Una familia de genes de mamífero compuesta por
tres factores neurotróficos ha sido descrita (Leibrock y col. 1989
Nature 341: 149- 152, Maisonpierre y col. 1990 Science 247:
1446-1451). Las formas maduras de las tres proteínas
que comprenden esta familia [factor del crecimiento nervioso (NGF
"nerve growth factor"), factor neurotrófico derivado del
cerebro (BDNF "brain derived neurotrophic factor") y
neurotrofina-3 (NT-3)] comparten
\sim50% de identidad de aminoácidos entre sí. Las posiciones de
los seis residuos cisteína presentes en cada una de estas proteínas
son conservadas en forma precisa. Si bien son estructuralmente
similares, estas tres proteínas exhiben distribuciones de tejido
diferentes (Ernfors y col. 1990 Neuron 5:511-526,
Maisonpierre y col. 1990 Neuron 5: 501-509, y
Phillips y col. 1990 Science 250: 290-294) y
diferentes actividades in vitro (Rosenthal y col. 1990 Neuron
4: 767-773, Whittemore y col. 1987 Brain Res Rev
12: 439).
El GDNF no exhibe homología significativa a
cualquier proteína previamente descrita aunque genes no
identificados pueden existir que codifican proteínas que tienen
homología de secuencias de aminoácidos sustancial a GDNF y los
cuales podrían funcionar in vivo como factores neurotróficos
con diferentes patrones de distribución específica de tejidos y/o
diferentes espectros de actividades. Ese tipo de proteínas
constituiría miembros de la familia de GDNF de factores
neurotróficos. Las secuencias de ADN para los genes de GDNF de rata
y humano, presentadas en las Figuras 13 (SEC ID NO: 3) y 19 (SEC ID
NO: 5) y 22 (SEC ID NO: 8) respectivamente, podrían utilizarse para
identificar nuevos miembros de ese tipo de "familia de genes de
GDNF".
Como consecuencia de la conservación de secuencia
de aminoácidos entre los productos proteicos de los miembros de una
familia de genes tal como la "familia de genes de NGF" antes
señalado o la "familia de genes de GDNF", hay una conservación
considerable de secuencia en el nivel de ADN. Por consiguiente,
bajo condiciones de hibridación apropiadas, la "hibridación
cruzada" de ácidos nucleicos puede producirse entre genes dentro
de la familia, es decir, una sonda de ácidos nucleicos derivada de
la secuencia de uno de los miembros de la familia formará una
molécula dúplex híbrida estable con moléculas de ácidos nucleicos de
diferentes miembros de la familia los cuales tienen secuencias
relacionadas, aunque no idénticas, a la sonda (Beltz y col. 1983
Methods in Enzymology 100: 266-285). Por lo tanto,
se puede seleccionar genes relacionados por homología de secuencias
a GDNF preparando sondas de ADN (o ARN) únicas o degeneradas en
base a la secuencia de GDNF de la especie de rata, humana o
cualquier otra especie y llevando a cabo experimentos de
hibridación con una variedad de ADNs objetivo (o ARNs) en
condiciones que permitirán la formación estable de dúplex de ácidos
nucleicos apareados de manera imperfecta.
Tales condiciones de hibridación, a menudo
denominadas "severidad reducida" son bien descritas en la
bibliografía (Beltz y col., más arriba, Sambrook y col. 1989
Molecular Cloning, 2da edición, Cold Spring Harbor Press) e
involucran más frecuentemente la reducción de la temperatura de la
reacción de hibridación cuando se lleva a cabo en solución acuosa
y/o reducción de la concentración de formamida en sistema de
hibridación que normalmente emplean soluciones que contienen 50% de
formamida. Otros medios para reducir la severidad de la hibridación
también han sido descritos y podrían emplearse (Sambrook y col.,
más arriba). Los objetivos de ácido nucleico en estos experimentos
de hibridación podrían incluir:
1) Genotecas de ADN genómico que contienen
especie humana, rata o cualquier otra especie mamífera, o cualquier
otra especie de ADN clonado en cualquier vector conveniente
incluyendo bacteriófagos, plásmidos, cósmidos, cromosomas
artificiales de levadura, o cualquier otro tipo de vector;
2) Genotecas de ADNc generadas de ARN de
cualquier tipo de tejido obtenido de cualquiera de los organismos
antes señalados u obtenido de cultivo de cualquier tipo de célula
primaria obtenida de cualquiera de los organismos antes señalados,
o de cualquier tipo de línea celular estable actualmente existente o
producida de cualquier cultivo celular primario;
3) ADNs genómicos según lo descrito en el ítem #
1 anterior los cuales son digeridos con enzimas de restricción y
son preparados para análisis de Southern blot por electroforesis en
gel y transferencia sobre un soporte sólido;
4) ARNs según lo descrito en el ítem # 2 anterior
los cuales son sujetos a electroforesis y transferencia a un
soporte sólido para análisis de Northern blot. Tales ARNs podrían
incluir ARN celular total o fraccionado, poli A+ ARN.
5) Productos de reacciones en cadena de
polimerasa (PCR "polymerase chain reactions") las cuales
emplean cebadores de oligonucleótidos en base a secuencias que
ocurren en GDNF y que emplean como patrones cualquiera de las
fuentes de ácidos nucleicos descritas en los ítems #1 a 4.
Cualquier secuencia de ácidos nucleicos la cual
se demuestra que se hibrida a una sonda basada en GDNF bajo cierto
conjunto empíricamente determinado de condiciones de hibridación
puede ser clonada y secuenciada por cualquiera de una variedad de
técnicas bien conocidas por un experto en la técnica y el grado de
homología de secuencias puede ser determinado directamente para
identificar miembros de una familia de genes de GDNF. Ese tipo de
método de hibridación se utilizó para clonar NT-3
por screening (método de selección) con una sonda en base a la
secuencia de NGF (Kaisho y col. 1990 FEBS Letters 266:
187-191).
Un método alternativo para identificar miembros
de la familia de GDNF involucra el uso de la reacción en cadena de
polimerasa (PCR) para amplificar secuencias de los miembros de la
familia de GDNF seguido por clonación y análisis de secuencias
amplificadas. Los cebadores de oligonucleótidos degenerados (o no
degenerados) para PCR pueden ser sintetizados en base a la
secuencia de GDNF. Dada la conservación de la ubicación de cisteína
y la conservación de secuencias de aminoácidos en la vecindad
inmediata de los residuos cisteína que se observa para la familia
de NGF, las regiones alrededor de las cisteínas en GDNF maduro
representan candidatos obvios para la síntesis de cebadores aunque
también podrían seleccionarse una variedad de otros cebadores tanto
de las porciones maduras como pre-pro de la
proteína. Las reacciones de PCR pueden llevarse a cabo en
condiciones de temperatura de hibridación ("annealing")
reducida las cuales permitirían la amplificación de no solo la
secuencia de GDNF sino de las secuencias de cualquiera de los
miembros de la familia de GDNF. Ver, Innis y col. 1990 PCR
Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press. Los
productos de ese tipo de reacciones de PCR pueden seleccionarse por
tamaño mediante electroforesis en gel, pueden ser clonados en un
vector apropiado y el ADN clonado puede ser secuenciado para
identificar miembros de la familia de GDNF. Alternativamente, los
clones pueden ser primero sometidos a screening por hibridación a
una sonda específica para GDNF en condiciones de alta severidad para
identificar clones de GDNF. Cualquier clon que no se hibride a GDNF
bajo alta severidad luego sería secuenciado o tales clones podrían
ser hibridados a una sonda de GDNF en condiciones de severidad
reducida y cualquier clon que se hibridó a la sonda de GDNF bajo
estas condiciones sería luego secuenciado.
Un segundo método que utiliza PCR para clonación
de miembros de la familia de GDNF sería etiquetar los productos de
la reacción de PCR antes descrita y utilizar aquellos productos
como una sonda para seleccionar objetivos de ácido nucleico antes
enumerados bajo condiciones de alta y/o baja severidad. La
hibridación de clones o segmentos nucleicos podría analizarse según
lo antes detallado para identificar clones de GDNF y miembros de la
familia. Ese tipo de método ha sido utilizado para clonar
NT-3 en base a las secuencias de NGF y BDNF
(Maisonpierre y col. 1990 Science 247: 1446- 1451).
En una realización preferida de la presente
invención, una composición terapéutica o farmacéutica que comprende
GDNF se administra en una cantidad efectiva a pacientes que sufren
de daño a los nervios. En una realización preferida de la presente
invención, GDNF se utiliza terapéuticamente para tratar pacientes
que sufren del mal de Parkinson. Los expertos en la técnica conocen
la variedad de ensayos disponibles para indicar aquellas neuronas
que responderían al tratamiento con GDNF, y la determinación de
otras neuronas receptivas a GDNF podría efectuarse sin indebida
experimentación. Un experto en la técnica podría determinar
fácilmente si el mensaje para GDNF es expresado a lo largo de todo
el cuerpo y cuales son los niveles de proteína GDNF en cada una de
esas regiones. Un experto en la técnica también podría determinar
la ubicación de los sitios de unión para GDNF a lo largo de todo el
sistema nervioso. Esta información permitiría al experto en la
técnica determinar los tipos neuronales que probablemente
responderían a GDNF, los cuales a su vez sugieren las indicaciones
clínicas apropiadas para esta proteína. El cultivo celular adecuado
y los experimentos en animales luego podrían llevarse a cabo para
determinar la probabilidad de que GDNF fuera de utilidad en el
tratamiento de ese tipo de indicaciones.
El GDNF purificado aislado de medio acondicionado
B49 también ha demostrado promover la supervivencia de las células
nerviosas parasimpáticas y simpáticas en cultivos. Estos resultados
son descritos en detalle en el Ejemplo 4.
Debido a que es posible que la función
neurotrófica de GDNF es impartida por uno o más porciones discretas
y separables, también se prevé que el método de la presente
invención podría ser practicado administrando una composición
terapéutica cuyo componente activo consiste en esa porción (o
aquellas porciones) de GDNF que controla (o controlan) la función
neurotrófica de GDNF.
La composición terapéutica o farmacéutica de la
presente invención se administra, preferentemente, parenteralmente
por inyección o directamente en el fluido espinal cerebral (CSF
"cerebral spinal fluid") por infusión continua de una bomba
implantada. Asimismo, otras formas de administración efectivas,
tales como formulaciones de liberación lenta parenterales, vapores
inhalantes, formulaciones oralmente activas, o supositorios son
también contempladas. Asimismo, se contempla la administración con
relación a uno o más agentes capaces de promover la penetración de
GDNF a través de la barrera de sangre-cerebro. Un
vehículo preferido es solución salina fisiológica, aunque se
contempla que también pueden utilizarse otros portadores aceptables
desde el punto de vista farmacéutico, tales como CSF artificial. En
una realización preferida se contempla que el portador y el GDNF
constituyen una formulación de liberación lenta, fisiológicamente
compatible. El disolvente primario en ese tipo de portador puede
ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Adicionalmente, el portador
puede contener otros excipientes farmacológicamente aceptables para
modificar o mantener el pH, la osmolaridad, viscosidad, claridad,
color, esterilidad, estabilidad, índice de disolución, u olor de la
formulación. Similarmente, el portador puede contener aun otros
excipientes farmacológicamente aceptables para modificar o mantener
la estabilidad, índice de disolución, liberación o absorción o
penetración a través de la barrera de sangre- cerebro del GDNF. Ese
tipo de excipientes son aquellas sustancias usualmente y
habitualmente empleadas para formular dosificaciones para la
administración parenteral en forma de dosis unitaria o en múltiples
dosis para infusión directa en el CSF por infusión continua o
periódica desde una bomba implantada.
Una vez que la composición terapéutica ha sido
formulada, puede ser almacenada en frascos estériles como una
solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o
liofilizado. Ese tipo de formulaciones puede ser almacenado ya sea
en una forma lista para ser utilizada o que requiere la
reconstitución inmediatamente antes de la administración. El
almacenamiento preferido de ese tipo de formulaciones es a
temperaturas de por lo menos tan bajas como 4ºC y preferentemente a
-70ºC.
Preferentemente, la manera de parenteralmente
administrar las formulaciones que contienen GDNF es por medio de una
ruta subcutánea, intramuscular, intratecal o intracerebral. Para
lograr la dosis deseada de GDNF, pueden administrarse inyecciones
repetidas diariamente o subcutáneas o intramusculares menos
frecuentes, o puede ser infundido el GDNF en forma continua o
periódica desde una bomba implantada. La frecuencia de dosificación
dependerá de los parámetros farmacocinéticos de GDNF en la
formulación y ruta de administración utilizada.
Para lograr la dosis deseada de GDNF a células
dopaminérgicas y otras células nerviosas dañadas cuyos cuerpos
celulares están dentro del cerebro y la médula espinal, se
contempla que GDNF sea administrado en el espacio subaracnoideo del
cerebro o de la médula espinal o intracerebroventricularmente. La
administración puede ser continua o periódica y puede lograrse
mediante una bomba implantable de flujo constante o programable o
por inyecciones periódicas. La administración también puede
efectuarse conjuntamente con agentes que permiten que el GDNF
penetre la barrera de sangre- cerebro.
También se contempla que ciertas formulaciones
que contienen GDNF deben ser administradas oralmente.
Preferentemente, GDNF el cual es administrado de esta manera es
encapsulado. El GDNF encapsulado puede ser formulado con o sin
aquellos portadores habitualmente utilizados en el mezclado de
formas de dosificación sólidas. Preferentemente, la cápsula está
diseñada de modo que la porción activa de la formulación sea
liberada en ese punto en el tracto gastrointestinal cuando se
aumenta al máximo la biodisponibilidad y se reduce al mínimo la
degradación pre-sistémica. Pueden incluirse
excipientes adicionales para facilitar la absorción de GDNF.
También pueden emplearse diluyentes, saborizantes, ceras de bajo
punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de la
suspensión, agentes de la desintegración de las tabletas, y
aglutinantes.
Sin importar la forma de administración, la dosis
específica se calcula de acuerdo con el peso corporal aproximado o
el área de superficie corporal del paciente. Otro refinamiento de
los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada
para el tratamiento que involucra cada una de las formulaciones
antes mencionadas son efectuados en forma rutinaria por los
expertos en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas
llevadas a cabo en forma rutinaria por ellos son indebida
experimentación, especialmente a la luz de la información de la
dosificación y de los ensayos descritos en la presente memoria
descriptiva. Estas dosificaciones pueden ser discernidas a través
del uso de los ensayos establecidos para determinar las
dosificaciones utilizadas conjuntamente con datos de dosis-
respuesta apropiados.
En una realización de esta invención, GDNF puede
ser administrado terapéuticamente implantando en células de
pacientes capaces de sintetizar y secretar una forma biológicamente
activa de GDNF. Tales células productoras de GDNF pueden ser
células que son productoras naturales de GDNF (análogas a las
células B49) o podrían ser células cuya capacidad de producir GDNF
ha sido aumentada por transformación con el gen de GDNF en una forma
adecuada para promover su expresión y secreción. A fin de minimizar
una potencial reacción inmunológica en pacientes de la
administración del GDNF de una especie extraña, se prefiere que las
células productoras de GDNF naturales sean de origen humano y
produzcan GDNF humano. Asimismo, se transformarían células para
expresar GDNF humano utilizando una construcción de expresión que
codifica GDNF humano mediante métodos análogos a aquellos utilizados
en los Ejemplos 5 y 6 que aparecen más adelante.
Las células capaces de secretar en forma natural
GDNF humano pueden ser identificadas utilizando las siguientes
herramientas: (1) Oligonucleótidos que representan una porción del
ARN mensajero para GDNF humano o complementario a una porción del
ARN mensajero para GDNF humano puede utilizarse para descubrir
líneas celulares que producen el mensaje de GDNF humano por
análisis de Northern blot, protección de RNasa, hibridación in
situ, la Reacción en Cadena de Polimerasa, u otros métodos
relacionados; o (2) pueden utilizarse anticuerpos policlonales o
monoclonales que reconocen GDNF humano para descubrir líneas
celulares cuyos extractos o medio de cultivo acondicionado
contienen proteína GDNF por análisis de Western blot, ensayo ELISA,
ensayo radioinmunológico u otros métodos relacionados. Una
estrategia preferida consiste en seleccionar el medio de cultivo
acondicionado de una serie de células de origen humano con
anticuerpos de GDNF humano mediante los métodos de (2) anterior para
descubrir células que secretan GDNF en su medio de cultivo. La
confirmación del GDNF así producido vendría de purificación y
análisis de secuencias de aminoácidos, según la llevada a cabo con
el GDNF producido mediante células B49 y secretadas en su medio de
cultivo. El Ejemplo 7 que aparece más adelante describe la
producción y aislamiento de anticuerpos de GDNF recombinante
humano.
Las células que secretan naturalmente o células
transformadas para secretar GDNF humano pueden utilizarse para
tratar pacientes. Las células humanas o animales no humanas pueden
ser implantadas en pacientes en encerramientos poliméricos
semi-permeables para permitir la liberación de GDNF,
aunque evitan la destrucción de las células por el sistema
inmunológico del paciente. Alternativamente, las propias células del
paciente, transformadas para producir GDNF ex vivo, podrían
ser implantadas directamente en el paciente sin ese tipo de
encapsulación.
La metodología para la encapsulación de membrana
de células vivientes es conocida por los expertos en la técnica y
la preparación de las células encapsuladas y su implantación en
pacientes puede lograrse sin indebida experimentación. Ver, las
Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.892.538; 5.011.472; y
5.106.627, cada una de las cuales se incorpora en forma específica
en la presente memoria descriptiva como referencia. Un sistema para
encapsular células vivientes se describe en la Solicitud PCT WO
91/10425 de Aebischer y col., se incorpora específicamente en la
presente memoria descriptiva como referencia. Ver además, Solicitud
PCT WO 91/10470 de Aebischer y col.; Winn y col. 1991 Exper. Neurol.
113: 322-329; Aebischer y col. 1991 Exper. Neurol.
111: 269-275; Tresco y col. 1992 ASAIO 38:
17-23, cada uno de los cuales se incorpora
específicamente en la presente memoria descriptiva como
referen-
cia.
cia.
En particular, las células que secretan GDNF
pueden ser implantadas en pacientes con el mal de Parkinson en el
striátum para proveer GDNF a los campos terminales de neuronas
dopaminérgicas nigrales y en la sustancia nigra para proveer GDNF a
los cuerpos celulares dopaminérgicos. Tal GDNF localmente aplicado
promovería la germinación ("sprouting") y reinervación del
striátum por terminales dopaminérgicas y evitaría o alentaría la
degeneración adicional de las células nerviosas dopaminérgicas.
Por consiguiente, la presente invención incluye
un método para prevenir o tratar el daño a los nervios implantando
células en el cuerpo de un paciente que lo necesita; ese tipo de
células ya sea seleccionadas por su capacidad natural de generar
GDNF o construidas para secretar GDNF. Preferentemente, el GDNF
secretado es GDNF maduro humano cuando es paciente es humano.
Cabe señalar que las formulaciones de GDNF
descritas en la presente invención pueden utilizarse para
veterinaria como así también aplicaciones humanas y que el término
"paciente" no debe ser interpretado en forma limitativa. En el
caso de aplicaciones veterinarias, los rangos de dosificación
deberían ser iguales a los especificados anteriormente.
Cabe destacar que la aplicación de las enseñanzas
de la presente invención a un problema o ambiente específico estará
dentro de las capacidades de un experto en la técnica a la luz de
las enseñanzas contenidas en la presente memoria descriptiva.
Ejemplos de usos representativos de la presente invención aparecen
en los siguientes ejemplos.
Este ejemplo describe métodos para el bioensayo y
purificación de GDNF. También describe métodos para preparar el
medio acondicionado de línea celular B49 que es el material de
partida para la purificación. Los métodos para obtener una
secuencia de aminoácidos de GDNF purificado y secuencias de
aminoácidos parciales obtenidas a partir de la proteína purificada
son también descritos.
Las ratas preñadas en el tiempo eran de Zivie
Miller lab, Allison Park, PA. A menos que se especifique lo
contrario, todos los reactivos eran de Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO.
Condiciones de cultivo: Se prepararon
cultivos de células mesenfálicas disociadas según lo descrito
previamente (Friedman y Mytilineou 1987 Neurosci. Lett. 79: 65-
72), con modificaciones menores. Brevemente, tegumento
mesencefálico rostrado de cerebros de embriones de ratas
Sprague-Dawley, al décimo sexto día de gestación, se
cortaron en pedazos bajo el microscopio en condiciones estériles,
se recogieron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco
libre de Ca^{2+} - y Mg^{2+}- (Gibco, Gaithersburg, MD) y se
cortaron en pedazos mecánicamente por leve trituración. Las células
se colocaron en placas en 100 ul por pocillo sobre pocillos de
cultivo de tejido de 16 mm de diámetro (Falcon, Lincoln Park, NJ,
placa de 24 pocillos) que contienen 400 ul de medio para dar una
densidad de 2,5-3,5 x 10^{5} células por pocillo.
Los pocillos de cultivo habían sido previamente expuestos a 0,1
mg/ml de solución de poli L-ornitina en borato de
sodio 10 mM, pH 8,4, durante 3 horas a 37ºC, se lavó 3 veces en
milli-Q H_{2}O y una vez en solución salina
equilibrada de Earle (Gibco). El medio de alimentación (10/10)
consistía en medio esencial mínimo (MEM, Gibco) suplementado con
glucosa (33 mM), bicarbonato de sodio (24,5 mM), glutamina (2 mM),
HEPES (15 mM), penicilina G (5 U/ml), estreptomicina (5 ug/ml), 10%
suero de ternero fetal inactivado térmicamente (Gibco) y 10% suero
de caballo inactivado térmicamente (Gibco). Los cultivos se
mantuvieron a 37ºC en una atmósfera saturada con agua que contiene
6,5% de CO_{2}. Después de 3 horas, cuando la mayoría de las
células se habían adherido al fondo del pocillo, el medio fue
reemplazado con 500 ul de medio nuevo. En este momento, una
dilución serial de la muestra a ser ensayada para determinar la
actividad de GDNF se agregó a cada pocillo por duplicado y las
placas se incubaron en el incubador a 37ºC. Después de una semana,
los cultivos se trataron durante 24 horas con fluordesoxiuridina
(13 ug/ml) y uridina (33 ug/ml) para evitar la proliferación glial
excesiva y posteriormente se introdujeron con el medio antes
mencionado sin suero de ternero fetal. El medio de alimentación fue
cambiado semanalmente.
Alternativamente, se utilizó medio libre de suero
químicamente definido en el cual el suero fue reemplazado con una
mezcla de proteínas; hormonas y sales. El medio definido (DM)
consistía en una mezcla de MEM y mezcla nutriente F12 (ambos de
Gibco; 1:1; vol/vol) con glucosa (33 mM), glutamina (2 mM),
NaHCO_{3} (24,5 mM), HEPES (15 mM), suplementado con transferrina
(100 ug/ml), insulina (25 ug/ml), putrescina (60 uM), progesterona
(20 nM), selenita de sodio (30 nM), penicilina G (5 U/ml) y
estreptomicina (5 ug/ml). Se ajustó la osmolaridad del DM hasta 325
mediante la adición de H_{2}O milli-Q
(110-125 ml H_{2}O/l). Con el uso de DM, pocas
células no neuronales eran evidentes, mediante morfología o por
tinción para proteína ácida fibrilar glial (GFAP, "glial
fibrillary acidic protein"), la cual es una proteína
citoesquelética específica de astrocitos. GDNF es activo en la
estimulación de la captación de dopamina tanto en medio que contiene
suero como en medio definido. Todos los ensayos alcanzados en los
siguientes ejemplos se realizaron en medio que contiene suero.
El estado funcional de las neuronas
dopaminérgicas puede ser ensayado en estos cultivos midiendo la
captación de dopamina a través de los transportadores
"depuradores" específicos en las neuronas dopaminérgicas y
contando la cantidad de neuronas positivas para la enzima sintética
de dopamina tirosina hidroxilasa utilizando inmunohistoquímica. La
posibilidad de contaminación significativa de los cultivos con las
neuronas noradrenérgicas, las cuales también pueden transportar
dopamina y también contienen tirosina hidroxilasa, se descartó por
la cuidadosa división y demostrando que los transportadores de
dopamina tienen el perfil farmacológico característico de neuronas
dopaminérgicas, más que de las neuronas noradrenérgicas. La
captación de dopamina en estos cultivos es inhibida por GBR12909, un
inhibidor del transportador de monoamina en neuronas
dopaminérgicas, con un ED_{50} de 20 nM. En contraste, al menos
300 veces más desipramina, un inhibidor de transportador de
monoamina o neuronas noradrenérgicas, se requiere para inhibir la
captación de dopamina en sus cultivos. Estos valores son aquellos
que han sido reportados para el transportador de monoamina en
neuronas dopaminérgicas.
Preparación de muestras: Antes de
ensayarse para determinar la actividad neurotrófica dopaminérgica
en los cultivos de células mesencefálicas, todas las muestras
generadas del Paso 1 al Paso 3 de purificación (ver Sección C más
adelante) se desalaron de la siguiente manera. 100 ul del medio
10/10 (como un portador) se agregaron a un
Centricon-10 (Amicon) y se dejó asentar durante 10
minutos. Se agregaron las alícuotas de la muestra a ser ensayada al
Centricon, seguido por 1 ml de medio Eagle Modificado de alto
contenido de glucosa de Dulbecco, sin bicarbonato, aunque
conteniendo HEPES 10 mM, pH 7.2 (solución A), y se centrifugó a
5.000 xg durante 70 minutos. El material retenido (aproximadamente
0,1 ml) se llevó nuevamente a 1,1 ml con solución A fresca y se
reconcentró dos veces. La muestra se filtró a través de una unidad
Durapore estéril Ultrafree-MC 0,11 um (Millipore,
Bedford MA) antes de ser agregada al pocillo de cultivo.
Captación de
^{3}H-dopamina: La captación de dopamina
tritiada (^{3}H-DA) se llevó a cabo en cultivos
al día 6 o día 7 según lo descrito previamente (Friedman y
Mytilineou (1987) Neurosci. Lett. 79: 65-72) con
modificaciones menores, y todas las soluciones se mantuvieron a
37ºC. Brevemente, se eliminó el medio de cultivo, se enjuagó dos
veces con 0,25 ml del buffer de captación el cual consiste en
buffer de fosfato de Krebs-Ringer, pH 7.4, que
contenía glucosa 5.6 mM, EDTA 1,3 mM, ácido ascórbico 0,1 mM y
pargilina 0,5 mM, un inhibidor de monoamina oxidasa. Los cultivos se
incubaron con 0,25 ml de ^{3}H-DA (New England
Nuclear, Boston, MA sp. act 36-37 Ci/mmol) durante
15 minutos a 37ºC. Se detuvo la captación de
^{3}H-DA eliminando la mezcla de incubación y las
células luego se lavaron dos veces con 0,5 ml del buffer de
captación. A fin de liberar ^{3}H-DA de las
células, los cultivos se incubaron con 0,5 ml de etanol al 95%
durante 30 min a 37ºC, y luego se agregaron a 10 ml de EcoLite
(ICN, Irvine, CA) y se contaron en un contador de centelleo. Se
obtuvieron los valores blanco agregando al buffer de captación
GBR-12909 (RBI) 0,5 mM, un inhibidor específico de
la bomba de captación de alta afinidad de las neuronas de dopamina
(Heikkila y col. 1984 Euro J. Pharmacol. 103:
241-48) y generalmente eran inferiores al 5% de la
captación de ^{3}H-DA en cultivos control no
tratados. La cantidad de unidades tróficas (UT) de actividad de
GDNF se definió como la cantidad recíproca de la dilución que dio
50% de estimulación máxima de la captación de
^{3}H-DA del cultivo. La actividad específica se
determinó dividiendo la cantidad de UTs por la cantidad de proteína
presente en la muestra.
Material de partida: Células de
glioblastoma B49 obtenidas de D. Schubert, Salk Institute, La
Jolla, CA. (Ver Schubert y col. 1974 Nature 249:
224-27) se cultivaron hasta confluencia en medio
DMEM que contenía 10% suero de ternero fetal, glutamina 4 mM, 50
U/ml de penicilina-G y 50 ug/ml de estreptomicina en
frascos de cultivo (225 cm^{2}, Costar, Cambridge, MA). El medio
acondicionado de crecimiento libre de suero (CM) se preparó lavando
el cultivo una vez con 10 ml de medio libre de suero y luego se
colocó las células en 50 ml por frasco de medio libre de suero
durante 2 días. Se recogió CM y las células se rellenaron con medio
libre de suero fresco cada 2 días de allí en más hasta el día 6. El
CM combinado de 3 cosechas de cada tanda de células se centrifugó a
5000 xg durante 20 min a 4ºC para eliminar las células y los
desechos. El sobrenadante se concentró aproximadamente 10 veces por
medio de concentrador Amicon (membrana YM10) y se centrifugó a
40.000 xg durante 20 minutos a 4ºC. El sobrenadante se filtró a
través de Cápsula de Micro Cultivo 0,2 u (Gelman Sciences) y se
pudo almacenar a 4ºC durante hasta un mes.
Paso
1
La preparación antes mencionada (200 mg de
proteína) se cargó sobre una columna (1 x 25 cm) de Heparina
Sepharose CL-6B (Pharmacia, Piscataway, NJ)
equilibrada con buffer NaPi 50 mM, pH 8,0, que contenía NaCl 0,15 N
(buffer A). Luego, la columna se lavó con el mismo buffer hasta que
la densidad óptica a 280 nm (D.O._{280}) del efluente regresó a la
línea de base y eluyó con un gradiente lineal de 100 ml que va
desde el buffer A en NaPi 50 mM, pH 8,0, que contenía NaCl 1,5 N
(buffer B). Se recogieron fracciones de dos ml. Las fracciones se
analizaron para determinar la conductividad y la actividad de GDNF.
La Figura 1 muestra ese tipo de cromatografía. El perfil de
proteínas eluidas es trazado como D.O._{280}. Se superponen
trazados de la conductividad y actividad de GDNF medida en cada
fracción. Las fracciones indicadas por la barra con actividad de
GDNF pico (NaCl alrededor de 0,6 - 0,8 N) se agruparon para más
análisis.
Paso
2
Se concentró el grupo antes mencionado hasta 0,4
ml por medio de concentrador Amicon (Amicon, Beverly, MA, membrana
YM10) y se cromatografió en una columna Superose 12 de
cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC)(Pharmacia) en
buffer de NaPi 50 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 0,5 N con un índice
de flujo de 0,5 ml/min. Después de 14 min de elución, las fracciones
de 0,5 ml se recogieron en tubos de microcentrífuga siliconados que
contenían 5 ul de 0,4% Tween 20. Se analizaron alícuotas de cada
fracción para determinar la actividad de GDNF. La Figura 2 muestra
ese tipo de cromatografía con el perfil proteico trazado a
D.O._{280} y con el patrón de actividad de GDNF superpuesto. 85%
de la actividad de GDNF cargada en la columna se recuperó en
fracciones #12-15.
Paso
3
La fracción #14 de lo que antecede se acidificó
con 10 ul de ácido trifluoracético al 25% (TFA). La mitad del
material acidificado se cargó sobre una columna de HPLC de fase
inversa Aquapore RP-300 C-8 de
diámetro interior estrecho (columna Brownlee, Applied Biosystems,
San Jose, CA), 2,1 x 220 mm, y se eluyó con un gradiente de
H_{2}O/ TFA al 0,1%: acetonitrilo al 80%/ TFA al 0,085%. Las
fracciones que contenían proteína se recogieron manualmente en
tubos de microcentrífuga siliconados en base a la absorción de UV a
214 nm. Se analizaron alícuotas de cada fracción para determinar la
actividad de GDNF. La Figura 3 muestra ese tipo de cromatografía
con el perfil proteico trazado a D.O._{214} y con el patrón de
actividad en el panel inferior. Las fracciones 5 y 6 contenían
aproximadamente 90% de la actividad recuperada en
RP-HPLC, mientras que la fracción 7 representaba el
10% de la actividad restante. La Figura 4 muestra una operación de
gel de SDS-PAGE con tinción de plata de las
fracciones alrededor del pico de actividad de GDNF mostrado en la
Figura 3.
Paso
4
Las fracciones 5 y 6 que contenían la actividad
de GDNF pico se agruparon y concentraron hasta 20 ul en presencia de
10 ul de Tween 20 al 0,4% con vacío a velocidad. Se agregó a la
muestra 1 ul de la base de Tris 1 M y 5 ul de Tris- HCl 0,2 M, pH
6,8, que contenía 40% de glicerol y 5% de SDS, y se hizo funcionar
en SDS-PAGE al 15% no reducido (Laemmli 1970
Nature 277: 680- 684) (lámina gruesa de 0,075 x 14 x 11,5 cm,
peine de 20 pocillos, 0,075 x 0,4 x 2,8 cm/ pocillo de muestra). Se
llevó a cabo la electroforesis a 10ºC a 40 mA/gel durante 2 horas.
La tira de gel se cortó en rebanadas de 1,14 mm. Cada rebanada se
cortó en 2 pedazos más pequeños y se eluyó con 3 cambios
secuenciales de 25 ul de NaPi 5 mM, pH 6,7 que contenía 0,01% Tween
20, durante un período de 20 horas con sacudimiento continuo a 4ºC.
Las 3 alícuotas de material eluido se combinaron, ensayaron para
determinar la actividad de GDNF (Figura 5) y se agrupó el eluido con
actividad más alta (de rebanada de gel # 16-23
correspondiente a 30-42 kD en la Figura 5). Una tira
de gel de blanco (sobre la cual se cargó solamente el buffer de
muestra de SDS-PAGE antes de la electroforesis) se
procesó similarmente como un control.
Paso
5
El eluyente de gel agrupado se concentró hasta
aproximadamente 150 ul con vacío a velocidad, se acidificó con 20
ul de TFA al 25% y se colocó en RP-HPLC según lo
descrito en el Paso 3. Las fracciones que contenían proteína se
recogieron manualmente en tubos de microcentrífuga siliconados, en
base a la D.O._{214} y se ensayaron para determinar la actividad
de GDNF. La Figura 6 muestra los resultados de ese tipo de
cromatografía. Como control, el eluyente de rebanadas de gel de
blanco con tamaño similar también se sometió a
RP-HPLC. El único pico de D.O._{214}
significativo en la muestra antes mencionada por encima del perfil
de control (Figura 6, panel A vs. B) es el pico 3, el cual contiene
70% de la actividad de GDNF cargada en la columna de HPLC. La
Figura 7 muestra el pico 3 en un gel de SDS-PAGE con
tinción de plata. La única mancha visible es una banda muy amplia
entre 30-42 kD, coincidiendo con el perfil de
actividad de GDNF observado en SDS-PAGE preparativo
(Figura 5). El resumen de una purificación típica se brinda en la
Tabla I.
Secuencia de terminal amino: El pico 3 en
la Figura 6 se secuenció con un secuenciador de proteína de fase
gaseosa (Applied Biosystems). La secuencia obtenida se proporciona
en la Figura 8. El secuenciado de las fracciones con la actividad
de GDNF pico después del paso 3 de la purificación (fracciones 5 y 6
en la Fig. 3) también reveló una secuencia única, idéntica a
aquella en la Figura 8, obtenida con la muestra purificada. El único
material que estas fracciones diferentes tienen en común es el
material que es una mancha entre 30-42 kDa. Por lo
tanto, las bandas contaminantes fuera de las regiones de
30-42 kD vistas en gel con tinción de plata de las
fracciones 5 y 6 en la Figura 4 podrían ser a) demasiado pequeñas en
cantidad (<1 picomoles) para secuenciarse por la tecnología
actual; b) pueden estar relacionadas a la banda de mancha de
30-42 kD en secuencia; o c) pueden tener un término
amino bloqueado.
Secuencia interna: La preparación de GDNF
después del paso 3 de la purificación antes descrita se utilizó
como el material de partida para obtener secuencia interna. Las
Fracciones 5 y 6 en la Figura 3 se agruparon en un tubo de
microcentrifuga siliconado que contenía 9 ul de Tween 0,4% y se
concentró hasta 40 ul con vacío a velocidad. Se agregaron a la
muestra 160 ul de 1% NH_{4}HCO_{3} que contenía hidrocloruro de
guanidina 2,5 M y 1 ug de tripsina, y la muestra se incubó durante
la noche a 37ºC. La mezcla se acidificó con 20 ul de TFA al 25%, se
concentró hasta aproximadamente 150 ul con vacío a velocidad, y los
péptidos se separaron en una columna de HPLC de fase inversa
Aquapore RP-300 C8 de diámetro interior angosto
(columna Brownlee), 2,1 x 220 mm, y se eluyó con un gradiente de
H_{2}O/TFA al 0,1%: 80% acetonitrilo/ TFA al 0,085%. Las
fracciones que contenían péptidos se recogieron manualmente en tubos
de microcentrifuga siliconados en base a la absorción a 214 nm. La
Figura 9 muestra los resultados de ese tipo de cromatografía. Se
determinó que la secuencia de pico 10 en la Figura 9 era idéntica a
los primeros 13 residuos aminoácidos de la secuencia de terminal
amino de la proteína no tratada mostrada en la Figura 8 (SEC ID NO:
1). El pico 37 en la Figura 9 se trató adicionalmente con CNBr. La
muestra se concentró hasta 20 ul con vacío a velocidad. Se agregó a
la muestra 70 ul de ácido fórmico al 90% y 5 mg de CNBr, y la
muestra se incubó en la oscuridad durante la noche a temperatura
ambiente. Esta mezcla se concentró hasta 20 ul con vació a
velocidad, se diluyó con 100 ul de TFA al 0,1% y se separó en HPLC
de fase inversa según lo descrito anteriormente. La Figura 10
muestra los resultados de ese tipo de cromatografía. El pico 1 en la
Figura 10 se concentró hasta 20 ul en presencia de 5 ul de Tween 20
al 0,4% con vacío a velocidad. Se agregan a la muestra 100 ul de
NH_{4}HCO_{3} al 1% y 5 ul de ditiotreitol 50 mM y la muestra
se incubó a temperatura ambiente durante una hora. La mezcla se
acidificó con 10 ul de TFA al 25%, se concentró hasta 100 ul con
vacío a velocidad y se separó en HPLC de fase inversa según lo
antes descrito. La Figura 11 muestra los resultados de ese tipo de
cromatografía. Ambos picos 33 y 34 en la Figura 11 dieron una
secuencia idéntica (Figura 12) (SEC ID NO: 2).
Movilidad en SDS-PAGE: Sin
tratamiento término alguno de la muestra y bajo condiciones no
reductoras, GDNF funciona como una banda de mancha entre
31-42 kD en SDS-PAGE. Cuando la
muestra se calienta a 100ºC durante 3 min en presencia de agente
reductor (4% \beta-mercaptoetanol), GDNF funciona
como bandas múltiples discretas entre 20-23 kD.
Puesto que aproximadamente 50% de la bioactividad cargada sobre el
gel podría ser recuperada bajo las condiciones primero mencionadas
(no reductoras) aunque no bajo las últimas condiciones mencionadas
(de reducción), GDNF puede ser un dímero unido a disulfuro y
solamente activo como un dímero. Si bien un único término amino
sugiere que la preparación de GDNF es homogénea con respecto a la
estructura primaria central, la mancha o patrón de bandas múltiples
sugiere una proteína glicosilada heterogéneamente.
Actividad específica: GDNF purificado
tenía una actividad específica estimada de aproximadamente 17
unidades tróficas/ng, lo cual indica que la estimulación
media-máxima de la captación de dopamina se produce
a la concentración relativamente baja de aproximadamente 60 pg/ml.
La actividad específica medida para GDNF purificado puede ser
subestimada de algún modo debido a la inactivación parcial de GDNF
durante la purificación por exposición a los disolventes orgánicos
acidificados utilizados en RP-HPLC y a las
condiciones desnaturalizantes en SDS-PAGE.
Especificidad de GDNF: Se purificó GDNF
por su capacidad de aumentar la captación de dopamina en neuronas
de dopamina (Fig. 20A). Para determinar si GDNF también regulaba
hacia arriba otro índice de supervivencia y/o maduración de las
neuronas de dopamina, también se midió la inmunoreactividad de
tirosina hidroxilasa (TH) en los cultivos mesencefálicos. TH es un
marcador específico de las neuronas de dopamina en los cultivos. La
regulación ascendente de la inmunoreactividad por GDNF podría
deberse a la supervivencia incrementada de neuronas de dopamina y/o
a un incremento en la producción de TH por cada neurona de
dopamina. GDNF purificado agregado el día de la colocación en placas
y los cultivos examinados ocho días después dieron como resultado
un número superior a diez veces de neuronas TH^{+} con respecto a
los controles sin GDNF. Si se agrega una segunda dosis de GDNF al
día 9 y los cultivos se examinaban siete días después (16 días
in vitro), podría observarse aun un incremento
dosis-dependiente similar con respecto al control
(Fig. 20B). Por lo tanto, GDNF podría sostener la supervivencia de
las neuronas de dopamina y/o aumentar la expresión del gen de TH en
neuronas de dopamina mesencefálicas.
Para demostrar que GDNF ejerce un efecto
estimulante específico sobre la maduración y/o supervivencia de las
neuronas de dopamina y no una acción general sobre todas las
neuronas, se analizó la capacidad de respuesta a GDNF de las
neuronas que contienen ácido \gamma-aminobutírico
(GABA), las cuales están también presentes en cultivos
mesencefálicos. Se midieron la captación de
^{3}H-dopamina (^{3}H-DA) y
^{14}C-GABA en cultivos relacionados de células
mesencefálicas las cuales se habían cultivado con diversas
concentraciones de GDNF durante 15 y 16 días, respectivamente.
Según lo descrito anteriormente, GDNF aumentó la capacidad de
captación de ^{3}H-DA de neuronas de dopamina
mesencefálicas \sim150% con respecto al control sin GDNF (Fig.
21A). Sin embargo, GDNF no tuvo efecto significativo alguno sobre
la capacidad de las neuronas con GABA de absorber
^{14}C-GABA puesto que la captación de
^{14}C-GABA en presencia de GDNF fue solamente de
\sim20% mayor a aquella del control (Fig. 21B). Esto también es
ilustrado por el aumento en la relación de captación de
^{3}H-DA/^{14}C-GABA calculada
(Fig. 21C). Estos datos indican que las neuronas mesencefálicas con
dopamina y GABA responden en forma diferente a la presencia de GDNF
y el efecto estimulante de GDNF sobre la captación de
^{3}H-DA en cultivos mesencefálicos es específico
para dopamina en contraste con las neuronas que contienen GABA.
Estas observaciones ilustran adicionalmente el
porqué GDNF puede utilizarse para tratar el mal de Parkinson u otro
trastorno que involucra a las neuronas dopaminérgicas. Estos
resultados demuestran que GDNF regula ascendentemente al menos dos
propiedades importantes de las neuronas dopaminérgicas: captación
de dopamina y niveles de enzima TH. Los resultados también
demuestran que los efectos de GDNF son por lo menos parcialmente
específicos para las neuronas dopaminérgicas, puesto que las
neuronas que contienen GABA no son similarmente afectadas.
Además de neuronas dopaminérgicas y GABAérgicas,
hay otra población neuronal, las neuronas serotonérgicas, en los
cultivos mesencefálicos embrionarios de rata. Algunos factores,
tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF, "epidermal
growth factor") que aumentan la captación de dopamina por las
neuronas dopaminérgicas en los cultivos mesencefálicos, también
aumentan la captación de serotonina por las neuronas serotonérgicas
y captación de GABA por las neuronas GABAérgicas. Ver, Casper y
col. 1991 J. Neurosci., 30:372. Esto indica que estos factores no
son específicos para las neuronas dopaminérgicas.
En contraste, el GDNF no puede incrementar la
captación de serotonina por las neuronas serotonérgicas. Se midió
la captación de ^{3}H-serotonina de la misma
manera que para la captación de ^{3}H-DA según lo
descrito en el Ejemplo 1B, salvo que el buffer de captación
contenía ^{3}H-serotonina 50 nM (11 Ci/mol,
Amersham, Arlington Heights, IL) en lugar de
^{3}H-DA. En presencia de citalpram 10 uM
(obtenido del Dr. C. Mytilineou, Mount Sinai School of Medicine),
un potente inhibidor conocido de la captación de serotonina en las
neuronas con serotonina, se redujo la captación de
^{3}H-serotonina hasta un 15%. Los valores de
control en presencia de citalpram fueron restados de los valores
experimentales mostrados en la Figura 24.
A diferencia de los factores no específicos tal
como EGF, GDNF no puede incrementar la captación de GABA (Figura
21) y la captación de serotonina (Figura 24) bajo condiciones en
las que la captación de dopamina es incrementada significativamente.
Estos resultados y los resultados antes descritos indican que GDNF
es específico para las neuronas dopaminérgicas en los cultivos
mesencefálicos cuando se compara con las neuronas GABAérgicas y
serotonérgicas presentes en los mismos cultivos. Ese tipo de
especificidad aumenta la utilidad de GDNF para tratar el mal de
Parkinson, el cual es considerado como un mal específico de las
neuronas dopaminérgicas mesencefálicas (nigrales).
A fin de clonar el gen que codifica GDNF, se
construyó una genoteca de ADNc a partir de poli A^{+} ARN aislado
de células B49, y esta genoteca se cribó con una sonda de
oligonucleótidos degenerada en base a la secuencia de aminoácidos
obtenida de GDNF purificado. Se determinó un clon de ADNc que se
hibrida a esta sonda, por secuenciado de ADN, para contener
secuencias de ADN que están ubicadas 3' a las secuencias utilizadas
en la sonda de oligonucleótidos degenerada, que codificaba una
secuencia de aminoácidos presente en GDNF y ubicadas terminal
carboxi a la secuencia de aminoácidos de la cual se basó la sonda de
oligo del screening.
Las condiciones de cultivo para la línea de
células B49 se describen en detalle en el Ejemplo 1 anterior. Para
la preparación de ARN, se cultivaron las células hasta casi
confluencia en medio que contiene suero, se lavaron una vez en medio
libre de suero (DMEM) y se cultivaron durante 4 días en DMEM con un
cambio de medio después de 2 días. Luego, las células se
recolectaron y se extrajo ARN total mediante el método de
Chomczynski y Sacchi 1987 Analytical Biochemistry
162:156-159. Se preparó ARN poli adenilado a partir
de este ARN total por pasaje sobre una columna de afinidad oligo dT
celulosa según lo descrito por Maniatis y col. 1989 Molecular
Cloning 2da Edición, CSH Press.
Se llevó a cabo la síntesis de ADNc utilizando
transcriptasa inversa M-MLV RNaseH (Bethesda
Research Lab, Gaithersburg, MD) de acuerdo con los protocolos
descritos por el vendedor. La reacción de primera hebra se realizó
con un cebador oligo dT_{15} (Pharmacia) y también incluyó 8
unidades de RNasin (Promega, Madison, WI) por cada 5 ug de poli A+
RNA. Se dirigió la síntesis de segunda hebra por polimerasa I de
ADN de E. coli, RNaseH de E. coli y Ligasa de ADN de
E. coli (todos de BRL) de acuerdo con el protocolo del
vendedor. Para facilitar la clonación, se trató el ADNc con
polimerasa de ADN T4 (BRL) para producir extremos de crecimiento y
se metiló con metilasa EcoRI (BRL). Estos pasos se llevaron a cabo
de conformidad con los protocolos suministrados por el vendedor de
la enzima. Luego, el ADNc se extrajo dos veces con un volumen de
una mezcla 1:1 de fenol y cloroformo y la fracción acuosa precipitó
con ½ volumen de NH_{4}Ac 7,5 M y 3 vol de etanol a temperatura
ambiente. El precipitado se recuperó por centrifugación durante 15
min a temperatura ambiente, a 16.000 xg, se lavó con etanol al 70%,
se secó al vacío y resuspendió en 50 ul, Tris-HCl 50
mM (7,6), MgCl_{2} 10 mM, ATP 1 mM, DTT 1 mM, 5% PEG8000, que
contenía 500 picomoles de ligante fosforilado (CCCGAATTCGGG,
Pharmacia) (SEC ID NO: 9) y 3 unidades de ligasa de ADN T4 (BRL).
Se llevó a cabo la ligación de ligante a 16ºC durante la noche
(\sim 16 h). La mezcla de reacción se extrajo con fenol/
cloroformo y precipitó según se describió anteriormente. El pellet
lavado se secó y se resuspendió en 50 ul de buffer de digestión de
EcoRI (Tris-HCl 100 mM (7,5), MgCl_{2} 5 mM, NaCl
50 mM y 0,025% Triton X-100) al cual se agregaron
400 unidades de EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA). La
reacción se incubó a 37ºC durante 2 h. Luego de la precipitación
(según ya se mencionó) el pellet se resuspendió en buffer de
digestión de EcoRI y se efectuó una segunda vuelta de digestión con
EcoRI según lo descrito anteriormente. Esta reacción se precipitó
y resuspendió en 40 ul de Tris-HCl 10 mM (8,0), EDTA
1 mM, NaCl 100 mM. Este ADNc, el cual ahora contenía ligantes
digeridos con EcoRI, se fraccionó por tamaño mediante
centrifugación a través de una columna giratoria sephacryl
S-300 (Pharmacia) a aproximadamente 1100 g durante
5 min. El flujo a través de esta columna se recogió, el etanol
precipitó según ya se mencionó, y se resuspendió en
Tris-HCl 10 mM (8.0), EDTA 1 mM a una concentración
de aproximadamente 0,1 ug/ul.
Se construyó una genoteca de ADNc en el vector de
clonación \lambdaZapII (Stratagene, La Jolla, CA). Típicamente, 1
ug de los brazos de vector digerido con EcoRI y fosfatado
(adquiridos de Stratagene) se ligaron a 0,1 ug de ADNc con ligante
EcoRI en una ligación de 5 ul utilizando aproximadamente 3
unidades Weiss de ligasa de ADN T4 (NEB) en Tris-HCl
50 mM (7,6), MgCl_{2} 7 mM, DTT 1 mM, 5% PEG8000 y ATP 1 mM. Las
ligaciones se llevaron a cabo a 16ºC durante la noche. Las
ligaciones se empaquetaron en extractos de empaquetamiento
GigapackII Gold (adquiridos de Stratagene) de acuerdo con el
protocolo provisto por el vendedor. Las genotecas se plaquearon
para titulación y screening en el huésped XL1-Blue
provisto por Stratagene.
De una ligación y empaquetamiento de ese tipo,
aproximadamente 270.000 unidades formadoras de placas se sacaron de
las placas en un total de 12 platos de petri de 150 mm de diámetro.
Se prepararon elevaciones de filtro de nitrocelulosa por duplicado
de estas placas después de los procedimientos descritos por Maniatis
y col. Los filtros fueron hibridados al siguiente oligonucleótido
degenerado rotulado con ^{32}P (SEC ID NO: 7) (I = inosina):
Esta secuencia está basada en la secuencia de
aminoácidos (Figura 8) (SEC ID NO: 1) obtenida alrededor del
término amino de GDNF purificado (SEC ID NO: 10) según lo descrito
en el Ejemplo 1 anterior:
Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala
El oligonucleótido fue rotulado con ^{32}P
derivado de ^{32}P-ATP (Amersham, Arlington
Heights, IL) utilizando T4 polinucleótido quinasa (Pharmacia o
United States Biochemical, Cleveland, OH). Las reacciones de
hibridación se llevaron a cabo en 6X SSPE, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml tRNA
(Sigma, St. Louis, MO) y 2X reactivo Denhardt's (0,4 mg/ml cada
uno: ficoll, polivinilpirrolidina, fracción V de BSA) a 50ºC durante
la noche (aproximadamente 16 h). La solución de hibridación
contenía 2-3 x 10^{6} cpm de oligo rotulado por
cada ml de solución. Luego de la hibridación, los filtros se lavaron
dos veces a temperatura ambiente en 2X SSPE, 0,1% SDS y dos veces
en la misma solución precalentada hasta 50ºC. Los filtros se
dejaron secar al aire y fueron expuestos a película durante 7 días a
-70ºC utilizando pantallas intensificadoras.
Las películas reveladas fueron examinadas para
identificar placas las cuales se hibridaron al oligonucleótido del
screening. En este criado primario, se identificaron 24 positivos
por duplicado putativos. Las áreas de las placas de la genoteca
correspondientes a las señales positivas fueron separadas,
resuspendidas y colocadas nuevamente en placas para una segunda
vuelta de screening por medio del procedimiento de hibridación antes
detallado. En este segundo screening, 8 de los 24 originales fueron
reensayados como positivos, mientras que 16 dieron resultados
negativos. Estos ocho positivos se purificaron en placas a través de
1 ó 2 vueltas adicionales de hibridación y seis de estos fueron
posteriormente analizados por secuenciado de ADN para determinar si
contenían secuencias de ADN que podrían codificar GDNF.
La porción de fagomida del fago \lambdaZapII,
la cual contiene la inserción clonada, se denomina fagomida
pBluescript SK, pBluescript SK se cortó de cada uno de los
recombinantes de \lambdaZapII que se hibridó a la sonda de
oligonucleótido. El procedimiento para la separación in vivo
del plásmido pBluescript SK recombinante del vector \lambdaZapII
se da en detalle por las instrucciones del vendedor. Brevemente, la
coinfección de \lambdaZapII y un fago "ayudante" M13 da
como resultado el empaquetamiento de una copia de ADN de una sola
hebra del pBluescript recombinante dentro de un virión M13
infeccioso. Cuando un virión de ese tipo infecta una célula
sensible, el ADN de una sola hebra es convertido en un ADN de doble
hebra y es propagado verticalmente como un plásmido. La selección
para este evento es proporcionada por el gen de resistencia a la
ampicilina codificado en pBluescript SK-. Por lo tanto, los
derivados de XL1-Blue de E. coli que
contienen el plásmido pBluescript SK- recombinante "rescatado"
de cada uno de los ocho clones \lambdaZapII positivos se
obtuvieron rápidamente siguiendo las instrucciones descritas por
Stratagene y empleando el fago "ayudante" provisto junto con
el vector \lambdaZapII.
Para el secuenciado de ADN, se preparó un ADN
plásmido de doble hebra de seis de estos plásmidos recombinantes
mediante un procedimiento "mini-prep" basado
en Birnboim y Doily 1979 NAR 7:1513-1523. Las
reacciones de secuenciado de ADN que utilizan el método de
terminación de cadena dideoxi se llevaron a cabo utilizando estos
patrones y el oligo de screening como el cebador. Los reactivos
para el secuenciado se obtuvieron de United States Biochemical como
un kit (Sequenase Versión 2.0) y los procedimientos de secuenciado
se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones provistas por
el vendedor. Un clon, pBluescript SK-76.1,
derivado del clon \lambdaZapII76.1 dio la siguiente secuencia
(SEC ID NO: 11):
Esta secuencia puede ser traducida para dar la
siguiente secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 12):
Glu-Arg-Asn-Arg-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-Ser-Pro
la cual coincide con la secuencia
de aminoácidos determinada para una región del término amino de
GDNF comenzando 5 residuos aminoácidos carboxiterminal al extremo
de la secuencia de aminoácidos utilizada para generar el cebador
oligo/ secuenciador de screening. Este resultado demostró que el
clon de ADNc contenido en \lambdaZapII76.1 debe codificar una
porción de, o la totalidad de, la proteína GDNF purificada del medio
acondicionado celular
B49.
Se determinó la secuencia de nucleótidos de los
primeros 877 pares de bases del extremo 5' del clon de ADNc. Se
descubrió que esta región contenía un marco de lectura abierta
(ORF) de 227 aminoácidos que incluye la secuencia de aminoácidos
obtenida para el término amino de GDNF purificado y una secuencia
que es consistente con el péptido interno derivado por disociación
de GDNF purificado. Los 134 aminoácidos de terminal carboxi
esperados para este ORF comprenden la secuencia de aminoácidos
esperada de la proteína GDNF madura purificada. Los 93 aminoácidos
precedentes incluyen un codón ATG de iniciación potencial seguido
por una secuencia de señal de secreción putativa y contienen
potenciales sitios de procesamiento proteolítico para disociación
de un precursor o forma "pre-pro" de la
proteína para generar la forma madura, purificada de GDNF descrita
anteriormente en el Ejemplo 1.
El ADN patrón para reacciones de secuenciado
incluyó versiones de una sola hebra y de doble hebra del ADN de
pBluescript SK-76.1 plásmido. Se preparó ADN de
doble hebra de cultivos de XL1-Blue (pBluescript
SK-76.1) mediante un procedimiento "boiling
prep" (de "ebullición prep") (Anal. Biochem 114:193:97) y se
bandeó en un gradiente de densidad CsCl. Se produjo un patrón de
única hebra mediante infección de XL1-Blue
(pBluescript SK- 76.1) con un fago M13 "ayudante" suministrado
por el vendedor (Stratagene) utilizando las instrucciones
relevantes suministradas junto con el fago. Los cebadores de
oligonucleótidos de una sola hebra de 15 a 23 nucleótidos de
longitud fueron sintetizados en un Sintetizador de ADN de Applied
Biosystems (Foster City, CA), modelo 380A y utilizado generalmente
sin purificación. Se llevó a cabo la determinación de secuencia
utilizando el método de terminación de cadena dideoxi. Los
reactivos utilizados fueron incluidos en el kit Sequenase Versión
2.0 (United States Biochemical) y se utilizaron de conformidad con
las instrucciones suministradas por el vendedor.
La secuencia de nucleótidos de los primeros 877
nucleótidos del extremo 5' del clon de ADNc \lambdaZapII76.1, la
cual contiene la secuencia codificadora de la proteína GDNF madura
purificada se muestra en la Figura 13 (SEC ID NO: 3) junto con la
secuencia de aminoácidos inferida de un marco de lectura abierta
(ORF) de 681 pares de bases que se encuentra dentro de esta
secuencia. La secuencia correspondiente a GDNF maduro purificado
comienza en la posición 281 con un residuo serina, y se muestra en
la Figura 14 (SEC ID NO: 4). La secuencia de ADN obtenida para esta
región predice una secuencia de aminoácidos la cual concuerda
perfectamente con los primeros 23 residuos de la secuencia de
aminoácidos observada en el término amino de GDNF purificado (ver
el Ejemplo 1).
En base a un análisis del gen según lo ilustrado
en la Figura 13, es probable que GDNF sea inicialmente traducido
como un polipéptido de GDNF pre-pro y que el
procesamiento proteolítico de la secuencia de señal y la porción
"pro" de esta molécula den como resultado la producción de la
forma de GDNF que es purificada a partir del medio acondicionado
celular B49. El sitio más probable de iniciación de la traducción
para ese tipo de forma pre-pro es el codón ATG que
se produce en la posición 50 en la secuencia de la Figura 13 (SEC ID
NO: 3).
Las secuencias de aminoácidos de varios factores
neurotróficos son altamente conservadas a través de una variedad de
especies de mamíferos (Hallböok y col. 1991 Neuron 6:845- 858;
McDonald y col. 1991 BBA (en prensa)). Como consecuencia de la
conservación de las secuencias de aminoácidos existe una
considerable conservación de las secuencias de nucleótidos de los
genes que codifican estas proteínas. Por consiguiente, generalmente
es verdad que el gen que codifica un factor neurotrófico en una
especie mamíferas puede hibridarse en forma cruzada (es decir,
formar un híbrido de ADN de doble hebra estable) con los genes que
codifican ese factor en otras especies mamíferas bajo condiciones
de hibridación ("annealing") apropiadas. Esta propiedad se
utilizó para identificar segmentos de ADN humano clonados que
incluyen el gen para GDNF.
Una genoteca genómica humana construida en el
vector \lambdaFIXII se adquirió de Stratagene (catálogo #946203)
y se cribó utilizando una sonda rotulada con ^{32}P derivada del
clon de ADNc de rata de GDNF (pBluescript SK-76.1)
antes descrito en el Ejemplo 2B. La sonda consistía en
aproximadamente 250 pb de secuencia codificadora del GDNF maduro
mediante amplificación específica utilizando la reacción en cadena
de polimerasa (Saiki y col. 1985 Science 230: 1350) y se produjo de
la siguiente manera. Se llevó a cabo una reacción de PCR de 50 ul o
100 ul utilizando ADN <1ng \lambdaZapII76.1 como patrón y
10-20 pmol de dos cebadores oligonucleótidos a base
de secuencia de GDNF de rata. Un oligo fue el "oligo de
screening" (también llamado DHD-21) descrito en
el Ejemplo 2A anterior, mientras que el segundo oligo
(DHD-26) (SEC ID NO: 13) tenía la secuencia:
la cual se basa en la secuencia de
aminoácidos
(Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu)
(SEC ID NO: 14) obtenida de un producto peptídico interno de
disociación de GDNF (ver Ejemplo 1). La reacción se llevó a cabo en
Tris-HCl 10 mM (pH 8,3 a 25ºC), KCl 50 mM,
MgCl_{2} 1,5 mM, 10 ug/ml de BSA (Promega R3961), 0,2 mM cada uno
dNTPs (Pharmacia), utilizando 2,5-5 u de Polimerasa
(USB). La reacción consistía en 30 ciclos de: 95ºC durante 1
minuto, 44ºC durante 1 minuto ½ y 72ºC durante 1 minuto ½. El
producto de esta reacción fue observado mediante electroforesis en
gel de agarosa como de aproximadamente 250 pb lo cual es
consistente con las posiciones de los dos cebadores en la secuencia
de ADNc mostrada en la Figura 13. Este fragmento sin rotular se
eluyó del gel mediante centrifugación con una Unidad de Filtro
Ultrafree-MC (Millipore, Bedford, MA) de acuerdo con
las instrucciones del vendedor, y se utilizó como patrón en
reacciones de rotulación de PCR subsiguientes empleando los mismos
dos cebadores oligo. Estas reacciones se llevaron a cabo bajo
condiciones idénticas excepto que la concentración de dCTP frío se
redujo hasta 12,5 uM y 2,5 uM 3000-5000 Ci/mmol de
\alpha-^{32}P dCTP (AMERSHAM) se agregó a la
reacción. Los productos de la reacción de rotulación se pasaron
sobre una columna con rotación BioSpin 6 (Biorad, Richmond, CA). El
flujo directo de esta columna se utilizó como la sonda para
seleccionar la genoteca genómica
humana.
La genoteca se retiró de las placas utilizando la
cepa PLK17 de E. coli provista por STRATAGENE. Se prepararon
veinticuatro platos de petri de 150 mm que contenía cada una
aproximadamente 50.000 placas. Se prepararon elevaciones de filtro
de nitrocelulosa por duplicado de cada plato de acuerdo con los
procedimientos descritos por Maniatis y col. más arriba. Estos 48
filtros fueron sondeados con 250 x 10^{6} cpm de la sonda de PCR
(desnaturalizada mediante tratamiento con NaOH 0,5 N) antes descrita
en 250 ml 6x SSPE, 0,1% SDS, 2x reactivo Denhardt's, 0,1 mg/ml de
tRNA y formamida al 30% (USB) a 42ºC durante la noche (\sim16 h).
Luego, los filtros se lavaron dos veces en 250 ml 2 x SSPE, SDS
0,1% a temperatura ambiente y dos veces en 1.6 l 0,1x SSPE, SDS al
0,1% precalentado hasta 50ºC. Los filtros se dejaron secar a
temperatura ambiente y se colocaron bajo película durante 6 días a
-70ºC con pantallas intensificadoras. Las películas fueron
reveladas y clasificadas. Se observaron seis positivos de
duplicación fuertes. Las áreas de las placas de la genoteca
correspondientes a las señales positivas se separaron, se
resuspendieron y replaquearon durante una segunda vuelta de
screening por medio del procedimiento de hibridación detallado. Los
seis dieron positivo y se purificaron en placas por medio de una
vuelta adicional de colocación en placas e hibridación.
Es cuestión de operaciones de rutina para el
experto en la técnica la subclonación y secuenciado del segmento de
ADN alrededor de la región que se hibrida a la sonda, y así
determinar la totalidad o parte de la secuencia del gen humano para
GDNF. Si el gen de GDNF humano entero no está representado en estos
clones, también es una cuestión de rutina "caminar" a lo largo
del genoma y clonar segmentos superpuestos de ADN alrededor de esta
región para obtener y secuenciar cualquier porción remanente del
gen.
Los procedimientos antes señalados y una variedad
de otros procedimientos que serían obvios para un experto en la
técnica podrían aplicarse para seleccionar otras genotecas humanas.
Por ejemplo, utilizando la sonda antes descrita y el protocolo de
hibridación, se cribó una genoteca de ADNc humana que fue construida
de A^{+} RNA extraído de putamen humano. Esta genoteca, contenida
en el vector de clonación \lambdagt10, se adquirió de Clontech
(Palo Alto, CA) (catálogo #HL1092a, Lote #1561). Esta genoteca se
colocó en placa (\sum aproximadamente 250.000 placas) en LE392 de
E. coli (Maniatis y col. más arriba) a una densidad de
aproximadamente 20.000 placas por plato y se cribó por hibridación
bajo las condiciones antes descritas. Luego de la hibridación, se
lavaron los filtros dos veces a temperatura ambiente en 0,2x SSPE,
0,1% SDS y dos veces en 0,1x SSPE, 0,1% SDS precalentado hasta
50ºC. Los filtros se secaron al aire a temperatura ambiente y se
colocaron bajo película. Después de 3 días de exposición a 70ºC con
pantallas intensificadoras, las películas fueron reveladas y se
identificaron 8 positivos por duplicado.
Seis clones \lambdaFIX II de una genoteca
genómica humana se identificaron mediante hibridación con una sonda
de GDNF de rata y se purificaron en placas hasta homogeneidad (ver
más arriba). Los lisados de cada fago se prepararon mediante el
método de Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual;
1989). Se preparó el ADN a partir de estos clones mediante el
siguiente procedimiento: DNAase I (Pharmacia) y RNAase A (Sigma) se
agregaron a 5 ml de cada cultivo para dar una concentración final
de 1 ug/ml. La solución fue incubada a 37ºC durante 1 hora. Luego se
agregaron 5 ml de polietilenglicol al 20% (Sigma), NaCl 2 M y la
solución se incubó a 0ºC durante 1hora. Los \lambdafagos se
peletizaron mediante centrifugación a 12.000 x g durante 10 min. El
pellet de fago se resuspendió en 250 ul de TE (TRIS 10 mM, pH 7,4,
EDTA 1 mM) y se extrajo secuencialmente con un volumen igual de: a.
cloroformo; b. fenol; c. una mezcla 1:1 de cloroformo y fenol; y d.
cloroformo. Se agregó acetato de amonio para dar una concentración
final de 0,25 M y el ADN se precipitó mediante la adición de 2
volúmenes de etanol y centrifugación a 10.000 x g. El pellet de ADN
se resuspendió en TE.
El ADN de cada uno de los seis aislados \lambda
se digirió con diversas endonucleasas de restricción y los
fragmentos se separaron mediante electroforesis a través de un gel
de agarosa (Sambrook y col.). Los fragmentos de ADN se transfirieron
a dos membranas de nilón idénticas (Schleicher y Schuell) y se
hibridaron con sondas radiorotuladas de GDNF de rata. En GDNF de
rata, existe un sitio Eco RI entre los nucleótidos 356 y 357
(siguiendo la numeración de la Figura 13). Esto se disocia dentro
de la secuencia codificadora de GDNF maduro. Para determinar si los
clones de GDNF genómicos humanos tienen un sitio en una posición
homóloga, se utilizó Eco R1 como una de las endonucleasas de
restricción para digerir los clones humanos. Se prepararon las
sondas radiorotuladas específicas para regiones del gen ya sea
corriente arriba (sonda 1) o corriente abajo (sonda 2) del sitio
Eco R1 en GDNF de rata. La sonda 1 tenía 268 pb de largo y
consistía en 14 pb de secuencia no traducida en 5' de GDNF de rata y
254 pb de secuencia codificadora (aminoácidos 1 a 85). Se preparó
mediante amplificación de ADN de \lambdaZap II76.1 utilizando la
reacción en cadena de polimerasa y los cebadores oligonucleótidos
PD1 (GACGGGACTCTAAGATG) (SEC ID NO: 15) y DHD23 (GCIGCIGC (C/T) TG
(T/C) TT (A/G) TCIGG) (SEC ID NO: 16). Las condiciones de reacción
para preparar la sonda son según lo descrito anteriormente salvo que
la reacción consistió en 30 ciclos de: 95ºC durante 1 minuto, 50ºC
durante 1 minuto ½ y 72ºC durante 1 minuto ½. La sonda 2 tenía 195
pb de largo y consistía en 17 nucleótidos de secuencia no traducida
en 3' de GDNF de rata y 178 pb de secuencia codificadora
(aminoácidos 153 a 211). Se preparó utilizando la reacción en
cadena de polimerasa y los cebadores oligonucleótidos
(CGAGACAATGTACGACA) (SEC ID NO: 17) y PD2 (CTCTGGAGCCAGGGTCA) (SEC
ID NO: 18) y \lambdaZAPII76.1 como el patrón de ADN. Las
condiciones de reacción eran las mismas que para la sonda 1.
Cinco de los seis clones \lambda dieron
patrones de hibridación idénticos. La sonda 1 se hibridó a un
fragmento Eco RI de aproximadamente 700 pb y la sonda 2 se hibridó
a un fragmento Eco RI de aproximadamente 2,8 Kb. El hecho de que las
dos sondas se hibridaron a dos fragmentos de ADN Eco RI diferentes
sugiere fuertemente que el gen de GDNF humano contiene un sitio Eco
RI homólogo. Los fragmentos Eco RI de 700 pb y de 1,8 Kb fueron
subclonados separadamente en Bluescript SK- (Stratagene). Las
secuencias de nucleótidos de estos dos fragmentos se determinaron
según lo descrito en el Ejemplo 2B. La secuencia de estos
fragmentos de ADN se muestra en la Figura 19 (SEC ID NO: 5). A
partir de la secuencia es evidente que hay un intrón precediendo el
aminoácido 52 de pre-proDNF. No hay intrón alguno en
la porción del gen que codifica a GDNF humano maduro. La secuencia
de aminoácidos esperada de GDNF humano maduro es 93% homóloga a
GDNF de rata maduro. Esto es aproximadamente el mismo grado de
homología de secuencias de aminoácidos encontrada entre proteínas de
rata y humanas para otros factores neurotróficos (La homología de
secuencias de aminoácidos entre CNTF de rata y humano es 83%;
McDonald y col. BBA (1991) (en prensa). La homología de secuencias
de aminoácidos entre NGF de rata y humano es 95%, BDNF es 100% y
NT-3 es 100%; Hallbook y col. 1991 Neuron 6:845-
855).
Para obtener la secuencia de
pre-proGDNF humana completa, puede prepararse una
sonda de hibridación radiorotulada en base a la secuencia de GDNF
humano ya obtenida, y esta sonda puede ser utilizada para
seleccionar genotecas de ADNc humanas. Debido a que ADNcs son
copias del ARNm procesado, los intrones no están presentes y la
secuencia de la secuencia codificadora completa puede ser
obtenida.
Alternativamente, ahora que la posición del
intrón con relación a la secuencia codificadora es conocida, puede
prepararse una sonda de hibridación que es específica de las
secuencias corriente arriba del intrón a partir del clon de ADNc de
rata y esta sonda puede utilizarse para seleccionar una genoteca
genómica para clones que contienen el o los exones en 5'.
Según se detalla en el Ejemplo 2C, existe un
intrón que separa la secuencia de nucleótidos correspondiente al
aminoácido 51 de pre-proGDNF humano. A fin de
obtener la secuencia de esta porción de la molécula, se cribó una
genoteca genómica humana con una sonda derivada de la secuencia
codificadora de terminal amino de pre-proGDNF de
rata y se secuenció un clon de hibridación y se mostró que contenía
la secuencia codificadora de los aminoácidos 1 a 50 de
pre-proGDNF humano según lo mostrado en la Figura
22 (SEC ID NO: 8)
Para este screening de genoteca se sintetizó una
sonda de PCR según lo descrito en el Ejemplo 2C. Los cebadores de
oligonucleótidos empleados fueron:
PD1 = 5' > CCCGAATTCGACGGGACTCTAAGATG > 3'
(SEC ID NO: 19)
LFA = 5' > CGGTGGCCGAGGGAGTGGTCTTC > 3'
(SEC ID NO: 20)
Las condiciones para las reacciones de PCR (tanto
"frías" como rotulación con ^{32}P) fueron según lo descrito
en el Ejemplo 2B salvo que la reacción consistía en 25 ó 30 ciclos
de: 95ºC durante 1 min., 50ºC durante 1 min. y ½ y 72ºC durante 1
min. El producto de esta reacción contiene las primeras 122 pb de la
secuencia codificadora pre-proGDNF y 5' de 14 pares
de bases al iniciador putativo ATG (ver la Figura 13 y SEC ID NO:
3). Las condiciones para el screening de la genoteca genómica humana
con esta sonda fueron según lo descrito en el Ejemplo 2C. Los
mismos elevadores de filtro utilizados para identificar clones que
portan secuencias para GDNF humano maduro se lavaron dos veces
durante 15 min. en H_{2}O destilada- desionizada calentada hasta
ebullición, se sondearon durante la noche, y se lavaron de acuerdo
con el protocolo descrito en el Ejemplo 2C. Los filtros fueron
expuestos a película durante 3 días a -70ºC con pantallas
intensificadoras. Cuando se revelaron, se observaron numerosos
positivos por duplicado de intensidades variables. Se eligieron doce
positivos relativamente fuertes y 10 de estos fueron purificados en
placas mediante rondas sucesivas de hibridación bajo condiciones de
screening.
Los ADNs clonados de estos fagos recombinantes
fueron analizados por hibridación de Southern blot. Se descubrió
que un fragmento de aproximadamente 1000 pb AluI se hibrida
a la sonda de screening y se subclonó en pBluescript SK- digerido
con SmaI para producir pBSSK-\lambda2Alul.
Este fragmento AluI clonado fue subclonado adicionalmente
para facilitar el secuenciado del segmento de ADN relevante. El ADN
de pBSSK-\lambda3Alul purificado se digirió con
una serie de enzimas de restricción que disocian el vector solamente
una vez (dentro de la región de poliligante) y los productos de la
digestión fueron analizados mediante electroforesis en gel de
agarosa. Dos enzimas de restricción (PstI y SacII)
fueron así identificadas que se disocian una vez dentro del ADN
clonado. La figura 22 muestra un mapa de sitios SacII y
PstI. Los Southern blots revelaron que la región del segmento
clonado que se hibrida a la sonda de screening estaba ubicada entre
los sitios SacII y PstI del segmento AluI
clonado. Por lo tanto, para el secuenciado, se construyeron dos
derivados de deleción de pBSSK-\lambda3Alul. En
un caso el fragmento PstI pequeño de aproximadamente 300 pb
se delecionó de la siguiente manera: El plásmido se digirió con
PstI y el producto de la digestión se ligó y transformó en
E. coli. Los transformantes fueron sometidos a screening
para seleccionar aquellos que carecen del fragmento PstI
pequeño. En paralelo, el fragmento SacII de 300 pb fue
similarmente delecionado de pBSSK-\lambda3Alul
para producir un segundo derivado de deleción. Estos dos plásmidos
de deleción fueron utilizados como patrones para reacciones de
secuenciado. El secuenciado se llevó a cabo según lo descrito en el
Ejemplo 2B.
La Figura 22 (SEC ID NO: 8) presenta 233 pares de
bases de la secuencia así obtenida. Esta secuencia contiene una
región de 151 pb que exhibe un muy alto grado de homología con los
primeros 151 pb de la secuencia codificadora para
pre-proGDNF de rata; 88% de identidad en el nivel
de aminoácidos y 95% de identidad en el nivel de ADN. Por lo tanto,
se concluye que esta región es parte del exón que porta la
secuencia codificadora de los 50 residuos de terminal amino del
pre-proGDNF humano y el primer nucleótido del codón
para el residuo 51. La secuencia inmediatamente 3' a esta secuencia
de 151 pb es homóloga a la secuencia de consenso para el extremo 5'
de intrones de mamífero (Shapiro y Senapathy 1987 Nucl. Acids
Res.15: 7155- 7174]. La secuencia inmediatamente 5' al iniciador
putativo ATG muestra una fuerte homología a la secuencia de rata
para 28 pb; 27 de 28 residuos son idénticos. En este punto la
secuencia corriente arriba se desvía pronunciadamente. La secuencia
alrededor del punto de divergencia muestra una homología
considerable a la secuencia de consenso para el extremo 3' de
intrones de mamífero. (Shapiro y Senapathy, más arriba). Por lo
tanto, es probable que este sea un sitio de empalme si bien no hay
evidencia directa de esto. El marco de lectura abierta que contiene
pre-proGDNF humano se extiende al menos 27 pares de
bases corriente arriba del iniciador ATG. Según lo descrito en la
Descripción Detallada de las Realizaciones Preferidas anteriores,
es posible que podrían producirse otras formas de un
pre-proGDNF que podrían contener aminoácidos
corriente arriba adicionales. Estas formas también podrían ser
procesadas para producir la molécula de GDNF madura que ha sido
purificada y secuenciada (ver Ejemplo 1).
Las secuencias de nucleótidos presentadas aquí y
en el Ejemplo 2C, contienen la secuencia codificadora entera para
un pre-proGDNF humano que exhibe extensa homología
con el pre-proGDNF de rata el cual ha sido expresado
exitosamente en células de mamífero (véase el Ejemplo 5) para
producir GDNF de rata activo.
Este ejemplo describe métodos para crear
Parkinsonismo experimental en monos mediante la administración
apropiada a los animales del MPTP de neurotoxina
(1-metil-4-fenil-1,2,3,6
tetrahidro-piridina). También describe métodos para
administrar GDNF a animales expuestos a MPTP a fin de aliviar el
desarrollo del Parkinsonismo en tales animales.
Puede implantarse una cánula de acero inoxidable
en el ventrículo lateral derecho y conectarse a una minibomba
osmótica implantada subcutáneamente (Alzet 2002). La minibomba
contiene GDNF en diversas concentraciones o su diluyente como un
control negativo. La bomba suministra 0,5 ul/h durante 14 días. Dos
días después del implante de la cánula-bomba, los
monos (Cebus apella) recibieron una inyección de 0,6 mg/kg de
MPTP en la arteria carótida derecha. Seis semanas después del
implante inicial, los animales son perfundidos con solución salina
y el cerebro es retirado rápidamente. El cerebro es dividido en
hielo y se eliminan pedazos de tejido del núcleo caudado y putamen.
La sustancia nigra se coloca en fijativo. El tejido de caudado-
putamen es analizado por HPLC-EC para dopamina, la
sustancia nigra es procesada para determinar la inmunoreactividad
de tirosina hidroxilasa (TH).
La degeneración de células nerviosas
dopaminérgicas nigrales y sus proyecciones axonales al caudado/
putamen causan el Parkinsonismo experimental en este modelo de
mono. Hay varias indicaciones experimentales de que GDNF puede
evitar o reducir la severidad de esta degeneración neuronal. Por
ejemplo, GDNF puede evitar la pérdida de cuerpos de células
nerviosas positivos de TH en la sustancia nigra. Esto indica una
protección por GDNF de células nerviosas dopaminérgicas nigrales de
los efectos tóxicos de MPTP. GDNF también puede evitar la pérdida
de fibras positivas de TH en el caudado/ putamen. Esto indica una
protección por GDNF de las proyecciones axonales de las neuronas
dopaminérgicas nigrales de los efectos tóxicos de MPTP. GDNF
también puede evitar la pérdida de contenido de dopamina en el
caudado/ putamen. Esto indica una protección de los efectos tóxicos
de MPTP por GDNF de los axones y su contenido de dopamina
extendiéndose desde las neuronas dopaminérgicas nigrales al
caudado/ putamen.
GDNF purificado aumenta la captación de dopamina
por las neuronas dopaminérgicas presentes en cultivos de células
nerviosas mesencefálicas embrionarias tanto en medio de cultivo
enriquecido como en medio de cultivo definido, según lo demostrado
en el Ejemplo 1. Esto indica que GDNF es un factor neurotrófico para
estas células nerviosas dopaminérgicas. Como tal, GDNF puede probar
que es útil en el tratamiento de la degeneración de estas neuronas
que se produce en el mal de Parkinson. Adicionalmente, GDNF puede
probar que es útil en el tratamiento del funcionamiento inapropiado
de otras neuronas dopaminérgicas del cerebro. Tal funcionamiento
inapropiado puede producirse en la esquizofrenia y en otros
trastornos que requieren tratamiento con neurolépticos.
Se obtuvo bromuro de
3-[4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio
(MTT) de Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. Se adquirió suero
de ternero fetal de Hyclone Laboratories, Logan, Utah. Se
obtuvieron medios de cultivo y soluciones salinas de Irvine
Scientific, Santa Ana, California. Los platos de cultivo se
obtuvieron de Costar, Cambridge, Massachusetts. Se obtuvieron
huevos de embriones de polluelo fértiles libres de patógenos de
calidad de utilidad de Spafas, Roanoke, Illinois.
Los cultivos de ganglios ciliares de embriones de
polluelo primarios y ganglios de cadena simpáticos se prepararon
según lo descrito previamente (Collins 1978 Develop. Biol.
65:50; Manthorpe et al. 1986 Develop. Brain Res. 25:
191). Brevemente, los ganglios ciliares o simpáticos fueron
eliminados de huevos de gallina libres de patógeno, fértiles que
habían sido incubados durante 8 y 10 días, respectivamente, a 38ºC
en una atmósfera. Los ganglios fueron químicamente disociados por
exposición primero a Solución Salina Equilibrada de Hanks sin
cationes divalentes, que contenían buffer de HEPES 10 mM pH 7,2
durante 10 min a 37ºC, y luego por exposición a una solución de
0,125% bactotripsina 1:250 (Difco, Detroit, Michigan) en Solución
Salina Equilibrada de Hanks modificada como anteriormente durante
12 min a 37ºC. Se detuvo la tripsinización mediante adición de
suero de ternero fetal hasta una concentración final de 10%.
Después de este tratamiento, los ganglios fueron
transferidos a una solución que consistía en Medio Eagle Modificado
de alto contenido de glucosa de Dulbecco sin bicarbonato que
contenía suero de ternero fetal al 10% y HEPES 10 mM, pH 7,2 y
fueron mecánicamente disociados mediante titulación aproximadamente
10 veces a través de una pipeta Pasteur de vidrio cuya abertura
había sido pulida con fuego y reducida a un diámetro tal que tomó 2
segundos llenar la pipeta.
Los ganglios disociados fueron luego colocados en
placas en medio de cultivo (Medio Eagle Modificado de Dulbecco
suplementado con suero de ternero fetal al 10%, glutamina 4 mM, 60
mg/L penicilina-G, HEPES 25 mM, pH (7,2) en platos
de cultivos de tejido de 100 mm de diámetro (40 ganglios disociados
por plato) durante tres horas. Esta colocación en placas previa se
realizó a fin de separar las células no neuronales, las cuales se
adhieren al plato, de las células nerviosas, las cuales no se
adhieren. Después de tres horas, las células nerviosas no
adherentes se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en
medio de cultivo, y se colocaron en placas en 50 ul por pocillo
sobre placas de cultivo tisular de microtítulo de 96 pocillos de
área media a una densidad de 1500 células nerviosas por pocillo. Los
pocillos de microtítulo habían sido expuestos previamente a 1 mg/ml
de una solución de poli-L-ornitina
en borato de sodio 10 mM, pH 8,4 durante la noche a 4ºC, se lavaron
en agua destilada y se secaron al aire.
Se agregaron 10 ul de una dilución serial de la
muestra a ser ensayada para determinar la actividad neurotrófica a
cada pocillo y los platos se incubaron durante 20 horas a 37ºC en
una atmósfera humidificada que contenía 7,5% CO_{2}. Después de 18
horas para ganglios ciliares y 40 horas para ganglios simpáticos,
15 ul por pocillo de una solución 1,5 mg/ml del tinte de MTT de
tetrazolio en Medio Eagle Modificado de alto contenido de glucosa de
Dulbecco sin bicarbonato que contenía HEPES 10 mM, pH 7,2 se agregó
y los cultivos se colocaron en el incubador a 37ºC durante 4 horas.
Luego, se agregaron 75 ul de una solución de 6,7 ml de 12 M HCl por
cada litro de isopropanol y los contenidos de cada pocillo se
trituraron 30 veces para abrir por rotura las células y suspender
el tinte. La absorbancia de 570 nm fue determinada con relación a
una referencia de 690 nm para cada pocillo utilizando un lector de
placas de microtítulo automático (Dynatech, Chantilly, Virginia).
La absorbancia de los pocillos los cuales no habían recibido agente
neurotrófico alguno (controles negativos) se restó de la absorbancia
de los pocillos que contenían muestra. La absorbancia resultante es
proporcional a la cantidad de células vivientes en cada pocillo,
definido como aquellas células nerviosas capaces de reducir el
tinte. La cantidad de unidades tróficas de actividad neurotrófica
se definió como la cantidad recíproca de la dilución que dio 50% de
supervivencia máxima de células nerviosas. Se determinó la actividad
específica dividiendo la cantidad de unidades tróficas por la
cantidad de proteína presente en la muestra.
Según lo ilustrado en la Figura 15, el GDNF
purificado promueve la supervivencia en cultivo de células
nerviosas parasimpáticas de ganglios ciliares de embriones de
polluelo. Según lo ilustrado en la Figura 16, el GDNF purificado
también promueve la supervivencia en cultivo de células nerviosas
simpáticas de ganglios de cadena simpáticos de embriones de
polluelo.
Estos resultados indican que GDNF actúa como un
factor de supervivencia para neuronas parasimpáticas y simpáticas.
Como tal, puede ser útil para tratar diversas formas de daño a los
nervios al sistema nervioso autónomo (es decir, parasimpático y
simpático). Ese tipo de daño puede producirse de condiciones
metabólicas, tales como diabetes o disfunción renal. Ese tipo de
daño también puede producirse del tratamiento de pacientes con
diversos agentes quimioterapéuticos, tales como los agentes
quimioterapéuticos del cáncer, cisplatina y vincristina, o los
agentes quimioterapéuticos del SIDA, ddI y ddC. Ese tipo de daño
también puede producirse a partir de condiciones genéticas, tales
como disautonomía. Dicho daño también puede producirse a partir de
lesión traumática.
Un fragmento SmaI de aproximadamente 1,5
kb de pBluescript SK-76.1 que contiene la secuencia
codificadora de GDNF entera se subclonó en el vector plásmido pSG5
(Green y col., 1988 Nucl. Acids. Res. 16:369) el cual está
diseñado para la expresión transitoria de genes clonados en células
que expresan el antígeno SV40 T, tales como células COS.
La secuencia de ADN del ADNc de GDNF (Figura 13)
(SEC ID NO: 3) y el mapeo de endonucleasa de restricción
identificaron un fragmento SmaI delineado por un sitio
SmaI situado en el poliligante del vector (18 pb 5' al
extremo 5' del clon de ADNc) y un sitio SmaI (\sim1500 pb
distante) situado dentro del clon de ADNc aproximadamente 800 pb 3'
al extremo de secuencia codificadora para GDNF maduro. Este
fragmento SmaI se clonó en pSG5 de la siguiente manera. El
ADN plásmido pSG5 purificado (Stratagene) fue digerido con
EcoRI y tratado con fosfatasa alcalina intestinal de ternero
(CIAP), (Promega) de acuerdo con las instrucciones del vendedor.
Subsiguientemente, el vector fue sometido a electroforesis y eluido
de un gel de agarosa. El ADN plásmido pBluescript
SK-76.1 purificado se metiló con metilasa de
EcoRI, se digirió con SmaI y se ligó con la molécula
ligante de EcoRI descrita en el Ejemplo 2A. Luego de la
digestión con EcoRI y electroforesis con gel de agarosa, el
fragmento SmaI de aproximadamente 1,5 Kb de interés (ahora
EcoRI metilado y ligado) fue eluido y ligado al vector pSG5
digerido con EcoRI y tratado con fosfatasa. Se utilizaron
productos de ligación para transformar XL1-Blue de
E. coli competente utilizando el procedimiento de CaCl_{2}
(Maniatis y col. más arriba). Se seleccionaron los transformantes
resistentes a ampicilina y se analizaron para plásmidos
recombinantes mediante digestión con endonucleasa de restricción y
electroforesis en gel de agarosa. La digestión con EcoRI
indicó que la mayoría de los transformantes contenían plásmidos que
tenían la inserción deseada. La digestión con BamHI
identificó la orientación del gen de GDNF clonado con relación al
promotor SV40 presente en el vector (nótese el sitio BamHI en
posición 15 en la secuencia en la Figura 13). Ambas orientaciones
fueron obtenidas.
Se escogieron dos transformantes para análisis
adicional; uno contenía un plásmido, denominado pSG5:
rGDNF-7, que porta el gen GDNF en la orientación
apropiada para ser expresado en transcripciones de ARN iniciadas en
el promotor SV40, mientras que el segundo contenía un plásmido,
denominado pSG5: rGDNF-4, que porta el gen GDNF en
la orientación opuesta; en el cual las transcripciones de ARN que se
inician en el promotor SV40 no expresarán GDNF. Las preparaciones
purificadas de ambos de estos plásmidos se prepararon por
centrifugación de gradiente de densidad de CsCl para utilizar en
experimentos de expresión de células COS.
El ADN plásmido de estas construcciones se
preparó mediante el método de lisis alcalina seguido por
centrifugación de densidad de CsCl (Maniatis y col, más arriba).
Este ADN fue transfectado en células COS-7 mediante
el método de Sompayrac y Danna (1981 Proc. NAtl. Acad. Sci.
USA 78:7575-7578). Como un control, los
cultivos de células COS equivalentes fueron transfectados con ADN
de vector plásmido que contenía la inserción de GDNF en la
orientación opuesta, lo cual no permitiría la expresión de la
proteína GDNF. Se utilizaron por cada plato de cultivo de 100 mm,
30 ug de lipofectina y 0,3-1 ug de ADN
plásmido.
Después de transfectar durante 24 horas, el medio
fue separado por aspiración y reemplazado con OptiMEM I \pm 3%
FCS. Los cultivos fueron incubados durante 48 horas y recolectados
de la siguiente manera:
a) el medio (medio acondicionado o CM) fue
retirado y almacenado a -80ºC;
b) 5 ml de PBS + EDTA 2,5 mM se agregaron a las
células y se mantuvo a 25ºC durante 3 minutos; y, luego las células
fueron separados con pipeta del plato y centrifugadas a 1000 xg
durante 5 minutos. Se retiró el sobrenadante y los pellets
celulares fueron almacenados a -80ºC.
El CM se concentró 30 veces en concentradores
Centricon 10 y se ensayó para determinación de la bioactividad. Los
pellets celulares fueron sonicados en 100 ul de EDTA 10 mM, pH 7,0,
más benzamidina 1 mM, 100 uM PMSF, ácido
E-amino-N-caproico 1
mM. Los lisados celulares fueron centrifugados a 14.000 xg durante
5 minutos y los sobrenadantes ensayados para determinación de la
bioactividad.
El lisado celular y el medio de cultivo de
células COS transfectadas con plásmidos que expresan GDNF y control
(con la secuencia codificadora de GDNF en la orientación
incorrecta) se ensayaron tanto para determinar la capacidad de
incrementar la captación de dopamina en los cultivos de neuronas
mesencefálicas (ver Ejemplo 1) como para determinar la capacidad de
incrementar la supervivencia de neuronas de ganglios simpáticos (ver
Ejemplo 4). El medio de cultivo de células COS (Figura 17) y el
lisado celular (datos no mostrados) aumentó la captación de
dopamina, según lo esperado de GDNF. Según lo mostrado en la Figura
18, el medio de cultivo de células COS y el lisado celular
aumentaron la supervivencia de neuronas de cadena simpática, según
lo esperado de GDNF.
Estos resultados indican claramente que la
expresión del gen de GDNF en una célula animal da como resultado la
producción de una proteína con las actividades biológicas
demostradas para GDNF purificado.
Utilizando la información de secuencia del gen
GDNF humano (Ejemplo 2C), se prepararon oligonucleótidos sintéticos
PD3 y PD4 como cebadores para la amplificación del gen GDNF humano
y su expresión a partir de un vector de expresión plásmido en E.
coli. Las secuencias de oligonucleótidos PD3 (SEC ID NO: 21) y
PD4 (SEC ID NO: 22) son:
PD3: 5'
CGCGGATCCAATAAGGAGGAAAAAAAATGTCACCAGATAAACAAAT 3'
PD4: 5' CGCGGTACCCAGTCTCTGGAGCCGGA 3'
El oligonucleótido PD3 es 46 nucleótidos de
largo.
Los 17 nucleótidos en el extremo 3' son una
perfecta coincidencia con el gen GDNF humano en la región que
codifica para el término N de la proteína madura. Estos 17
nucleótidos son precedidos por un codón de iniciación de la
traducción, ATG, de modo que la síntesis de GDNF humano maduro
comenzará en el aminoácido correcto en E. coli. Los otros
nucleótidos son diseñados para proveer otras señales consideradas
necesarias para la buena expresión en E. coli como así
también un sitio de restricción de endonucleasa BamHI necesario para
la construcción del plásmido de expresión de GDNF.
El oligonucleótido PD4 es 26 nucleótidos de
largo. Los 17 nucleótidos en el extremo 3' son una coincidencia
perfecta con los 17 nucleótidos del gen GDNF humano 3' del codón de
detención. Este oligonucleótido también provee secuencias
necesarias para reconstruir un sitio de endonucleasa de restricción
KpnI para la construcción del plásmido de expresión de GDNF.
Las condiciones de reacción para la amplificación
del GDNF humano son las siguientes: El volumen de reacción total
fue 100 ul y contenía 1 ng de un clon de \lambdaADN que contenía
el gen GDNF humano, 20 pmoles cada uno de PD3 y PD4,
Tris-HCl 20 mM pH 8,8, KCl 10 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 6 mM, MgCl_{2} 1,5 mM y 0,1%
Triton X-100. La mezcla de reacción se calentó hasta
95ºC durante 5 minutos, se enfrió hasta 44ºC y se agregaron 2
unidades de polimerasa de ADN Pfu (Stratagene). La reacción
consistía en 30 ciclos de: 72ºC durante 1 minuto y medio, 95ºC
durante 1 minuto y 44ºC durante 1 minuto y medio. Al final de la
reacción, se agregó MgCl_{2} hasta una concentración final de 10
mM. Se agregaron 5 unidades de fragmento (Promega) de polimerasa
de ADN I grande (Klenow) y la reacción se incubó a 37ºC durante 10
minutos. Luego, se agregaron 10 ul de NaAc 3 M y 220 ul de EtOH y la
solución se centrifugó a 12.000 x g durante 15 minutos para
precipitar en ADN. El ADN precipitado se resuspendió en 100 ul de
Tris-HCl 50 mM (pH 8), NaCl 50 mM, MgCl_{2} 10 mM,
20 unidades de BamHI y 20 unidades de KpnI y se incubó a 37ºC
durante 1 hora. Se identificó un fragmento de ADN del tamaño
correcto después de electroforesis a través de un gel de agarosa y
se purificó utilizando una Unidad de Filtro
Ultrafree-MC (Millipore). Este fragmento se ligó en
un vector de expresión de E. coli, pT3XI-2
(descrito más adelante). Las condiciones de ligación fueron las
siguientes: el volumen de reacción total fue de 5 ul y contenía 10
ng de ADN de pT3XI-2 linearizado con KpnI y BamHI,
5 ng del fragmento de ADN de GDNF humano según lo descrito
anteriormente, Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MgCl_{2}
10 mM, ATP 1 mM, DTT 1 mM, 5% polietilenglicol-8000
y 1 unidad de ligasa de ADN T4 (Bethesda Research Laboratories). La
reacción se incubó a 14ºC durante 2 horas.
El vector pT3XI-2 se construyó de
la siguiente manera. El plásmido inicial para esta construcción fue
el plásmido pKK223-3 (Brosius y Holy, 1984)
adquirido en Pharmacia. El plásmido pKK223-3 porta
un gen parcial para resistencia a tetraciclina. Este gen no
funcional fue reemplazado por un gen de resistencia a tetraciclina
completo portado en el plásmido pBR322. El plásmido
pKK223-3 fue digerido completamente con SphI y
parcialmente con BamHI. Un fragmento de 4,4 pares de kilobases fue
purificado en gel y combinado con un adaptador sintético(SEC
ID NO: 23):
5' GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT 3'
3' ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC
5'
- BgIII
\hskip4.55cm
ClaI
y un fragmento de 539 pares de
bases de ADN de una digestión ClaI, SphI del gen de resistencia a
tetraciclina de pBR322 (PL Biochemicals,
27-4891-01). El plásmido resultante
fue designado
pCJ1.
A continuación, un ligante XhoI adquirido en New
England Biolabs fue insertado en el sitio PvuII de pCJ1 plásmido
para formar el plásmido pCJX-1. Esta inserción
interrumpe el gen rop el cual controla el número de copias
del plásmido. Luego, se purificó un fragmento EcoRI que contiene el
gen lacI a partir del plásmido pMC9 (Calos y col., 1983) y luego se
insertó en el sitio XhoI con los adaptadores XhoI a EcoRI. La región
poliligante en el plásmido pKK223-3 fue luego
reemplazada con un poliligante que contiene sitios adicionales
cortando con EcoRI y PstI (SEC ID NO: 24):
5' AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA
3'
\hskip1cm3' GGGCCC ATGGTCTAGA CTCGAGTGAT CAG 5'
El vector plásmido así obtenido es designado
pCJXI-1.
Finalmente, el gen de resistencia a tetraciclina
fue reemplazado con un gen similar el cual tenía los sitios de
reconocimiento para enzimas de restricción HindIII, BamHI y SalI
destruidos por mutagénesis con bisulfito. Se utilizó el siguiente
procedimiento para mutar el gen de resistencia a tetraciclina de
pBR322. El plásmido pBR322 se cortó con HindIII, luego se
mutagenizó con bisulfito de sodio (Shortle y Botstein, 1983). El ADN
mutagenizado se ligó para formar ADN circular, luego se cortó con
HindIII para delinear cualquier plásmido que escapó de la
mutagénesis. JM109 de E. coli (Yanisch-Perron
y col., 1985). Los plásmidos resistentes a tetraciclina se aislaron
y controlaron para determinar la pérdida del sitio HindIII en el gen
de resistencia a tetraciclina. El plásmido exitosamente mutado fue
designado pT1. Se siguió un procedimiento similar para mutagenizar
el sitio BamHI en pT1, proporcionando el plásmido pT2. El plásmido
pT2 a su vez fue mutagenizado para eliminar el sitio SalI, formando
el plásmido pT3. Un fragmento ClaI-StyI de pT3 que
porta el gen de resistencia a tetraciclina mutado se aisló y se
utilizó para reemplazar el fragmento homólogo de
pCJXI-1 para formar pT3XI-2. El gen
de resistencia a tetraciclina mutado aun codifica a una proteína
funcional. Corriente abajo de la región promotora tac, se introdujo
un poliligante el cual contiene, entre otros sitios, sitios de
restricción BamHI y KpnI útiles para clonar genes para la expresión
en E. coli.
Después de la ligación de 2 horas del vector con
la construcción de GDNF maduro humano, se utilizaron 2 ul de la
mezcla de reacción para transformar las células de E. coli
supercompetentes Epicurian Coli SURE® (Stratagene) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. La secuencia de ADN de uno de los
plásmidos recombinantes se determinó según lo descrito en el
Ejemplo 2B. La secuencia confirmó que este plásmido contenía la
secuencia codificadora completa del gen GDNF humano que codifica a
GDNF humano maduro.
El plásmido recombinante que contenía secuencias
de ADN que codifican a GDNF humano se transformó en la cepa de
E. coli JM107\phirMCB0005, una variante resistente a T1 de
JM107 (Yanisch-Perron y col. (1985)), utilizando el
método de CaCl_{2} descrito en Sambrook y col. (1989). Uno de los
recombinantes se cultivó en 50 ml de medio LB (Sambrook y col) con
100 ug/ml ampicilina (Sigma) con agitación a 37ºC durante toda la
noche. Al día siguiente, el cultivo se diluyó 1:70 en medio LB con
100 ug/ml de ampicilina y se cultivó durante 5 horas con agitación
a 37ºC. Se recolectaron 20 ml de células mediante centrifugación a
8000 x g durante diez minutos. El pellet se resuspendió en 4 ml de
EDTA 10 mM pH 7,4. Las células se rompieron utilizando un
instrumento French Press Pressure Cell (SLM Instruments) a 122,400
kPaM (18.000 psig). El lisado se centrifugó a 12.000 x g durante 15
minutos a 4ºC. El pellet se resuspendió en EDTA 1 mM. Se ha
descubierto que se acumula relativamente más cantidad de GDNF si se
deja que se produzca la fermentación a 42ºC más que a 37ºC o
30ºC.
El método preferido de la presente para obtener
altos niveles de expresión de GDNF en E. coli utilizando el
plásmido recombinante descrito en el Ejemplo 6A (en el cual la
secuencia codificadora para GDNF maduro humano es clonada en el
vector de expresión pT3XI-2) es de la siguiente
manera. Para una fermentación de 10 l se cultiva un inóculo de 500
ml en medio LB (pH 7) que contenía 15 ug/ml de tetraciclina a 37ºC
en un frasco de agitación con desviadores de 2 l hasta una densidad
óptica (A_{660}) de entre 2 y 3. Este cultivo se utiliza para
inocular 10 l de medio de cultivo que contenía: 12 g/l de triptona,
24 g/l de extracto de levadura, 25 g/l de glicerol, 1,3 g/l de
K_{2}HPO_{4}, 0,4 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,1 ml/l de mezcla
4:1 de Macol19:GE60, y 15 mg/l de HCl de tetraciclina. Este cultivo
es cultivado durante aproximadamente 12 a 18 horas a 42ºC hasta
densidades ópticas de aproximadamente 12 a 20 (A_{660}). El pH de
la fermentación se mantiene a 7,0 y el oxígeno disuelto se mantiene
a 30% de saturación. Luego de la fermentación, el cultivo es
enfriado a 4ºC y las células son recolectadas por
centrifugación.
La producción de GDNF humano a partir de este
plásmido antes descrito no es específica de esta cepa de E.
coli aunque puede ser producido en cualquier cepa adecuada. El
plásmido ha sido transformado en dos otras cepas E. coli,
JM108 (Yanisch Perron y col, 1985) y SURE® (Stratagene). En ambas
de estas cepas se ha visualizado una nueva banda proteica del peso
molecular correcto por tinción con Coomassie Blue después de
electroforesis a través de un gel de poliacrilamida.
Una alícuota del material resuspendido se sometió
a electroforesis a través de un gel de poliacrilamida. El gel se
coloreó con Coomassie Blue. Una proteína del peso molecular
esperado para GDNF (15.000 daltons) estaba presente solamente en
los cultivos que contenían el plásmido de GDNF humano recombinante
aunque no en los cultivos que contenían el vector
pT3XI-2 solo. La proteína recuperada se sometió a
procedimientos de secuenciado de terminal amino convencionales, y
los primeros 22 aminoácidos de esta proteína son idénticos a la
secuencia de aminoácidos de GDNF humano según lo mostrado en la
Fig. 19, confirmando que el GDNF humano está siendo correctamente
expresado en E. coli.
Preparación de material para repliegue. Se
cultivó el transformante JM107 de E. coli (pT3X12: huGDNF) a
fase estacionaria a 37ºC en un medio complejo a base de extracto de
levadura (#0127-01 Difco Laboratories, Detroit, MI)
y triptona (#0123-05 Difco Laboratories, Detroit,
MI) (24 g/L de extracto de levadura, 12 g/l de triptona, 5 g/L de
glicerol, 1,3 g/L de K_{2}HPO_{4}, 0,4 g/L de KH_{2}PO_{4},
0,1 ml/L de Macol 19/GE60 (4:1), 15 mg/L de tetraciclina) sin
inducción de IPTG. Las células fueron centrifugadas a 16.000 xg en
un rotor JA10 a 4ºC durante 20 minutos y la pasta celular se
almacenó a -20ºC.
Las células fueron procesadas de la siguiente
manera: 5 g de pasta celular se homogenizaron con 40 ml de EDTA 10
mM, pH 7,0 en hielo utilizando un homogenizador de OCI Instruments.
La suspensión fue prensada en el instrumento French (francés) antes
mencionado tres veces a 136.000 kPa (20.000 psi) y luego se
centrifugó a 30.000 xg en un rotor JA 20 durante 10 minutos a 4ºC.
El sobrenadante se descartó y el pellet se homogenizó y se
centrifugó según lo antes señalado. En una realización, el pellet de
la re-extracción se homogenizó con 40 ml de Tris 25
mM, pH 7,4, se centrifugó según se mencionó anteriormente, y el
sobrenadante se descartó. El pellet se homogenizó con 20 ml de Tris
50 mM, pH 8,0, que contenía urea 8 M con o sin la adición de
2-mercaptoetanol 30 mM, se centrifugó según lo antes
mencionado y se retuvo el sobrenadante. El sobrenadante es
denominado el extracto TU. En la realización preferida, el pellet
se homogenizó en 40 ml de Tris 10 mM, pH 8,0, que contenía EDTA 1
mM, 1% NP-40, se centrifugó como se mencionó
anteriormente, y el sobrenadante se descartó. El pellet se
solubilizó mediante sulfonilación de la siguiente manera: El pellet
se homogenizó en 25 ml de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,4 que
contenía urea 8 M, sulfito de sodio 100 mM y tetrationato de sodio
10 mM. La sulfonilación se dejó proceder a 4ºC durante toda la
noche con agitación y luego se centrifugó a 16.000 xg, 4ºC, durante
10 minutos para aclarar la solución.
Purificación parcial de extracto de TU antes
del repliegue. El extracto de TU fue parcialmente purificado
mediante cromatografía de intercambio iónico en resina
S-Sepharose Fast Flow (Pharmicia). La columna fue
equilibrada y se puso en funcionamiento a temperatura ambiente en
Tris 25 mM, pH 7,4, que contenía una urea 8 M y
2-mercaptoetanol 30 mM (buffer A). Después de cargar
la muestra y lavar con buffer A hasta densidad óptica de línea de
base, la columna se eluyó a un volumen de columna del 10% por minuto
con 5 volúmenes de columna cada uno de buffer A y Tris 100 mM, pH
9,0, que contenía urea 8 M, NaCl 500 mM y 2- mercaptoetanol 30 mM
(buffer B). Las fracciones de la columna fueron monitoreadas a 280
nM y analizadas por SDS-PAGE. El GDNF eluyó como el
pico de proteína principal a 60- 70% del gradiente. Las fracciones
enriquecidas en GDNF fueron agrupadas para el repliegue (Fig.
25).
Purificación parcial de extracto sulfonilado
antes de repliegue. El extracto sulfonilado fue parcialmente
purificado mediante cromatografía de intercambio iónico en resina
Q-Sepharose Fast Flow (Pharmicia). La columna fue
equilibrada y puesta en funcionamiento a 4ºC en Tris 10 mM, pH 8,0,
que contenía urea 4M (buffer A). Después de cargar la muestra y
lavar con buffer A hasta densidad óptica de línea de base, la
columna se eluyó como volumen de columna de 5% por minuto con 5
volúmenes de columna cada uno de buffer A y Tris 100 mM, pH 8,0,
que contenía urea 4 M y NaCl 500 mM (buffer B). Las fracciones de la
columna fueron monitoreadas a 280 nM y analizadas por
SDS-PAGE. El GDNF eluyó como el pico de proteína
principal a 50% del gradiente. Las fracciones enriquecidas en GDNF
fueron agrupadas para el repliegue.
GDNF, parcialmente purificado según lo descrito
anteriormente, se replegó de la siguiente manera: A 4 ml de eluido
de la columna agrupado que contenía GDNF a aproximadamente 1 mg/ml,
se agregó ditiotreitol hasta 5 mM. El tubo fue tapado de modo de
excluir el aire y se mantuvo a 25ºC durante 15 minutos. A
continuación, se agregó sal disódica de glutationa oxidada hasta 15
mM, el tubo fue tapado nuevamente de modo de excluir el aire, y se
mantuvo a 25ºC durante 15 minutos. Luego, esta solución fue diluida
con 14 volúmenes de buffer de repliegue (Na_{2}HPO_{4} 100 mM,
etanolamina 10 mM, pH 8,3, que contenía urea 4 M; 5%
polietilenglicol 300; y cisteína 2 mM) y se mantuvo bajo argón a
5ºC durante 3 días.
El GDNF, parcialmente purificado según lo
descrito anteriormente, se replegó de la siguiente manera: El
eluido de la columna agrupado que contenía GDNF a aproximadamente 3
mg/ml se diluyó con 19 volúmenes de buffer de repliegue
(Na_{2}HPO_{4} Tris 100 mM, pH 8,3, que contenía urea 4 M; 5%
polietilenglicol 300; y cisteína 3 mM) y se mantuvo bajo argón a
5ºC durante 3 días.
Análisis de GDNF replegado mediante
SDS-PAGE. GDNF extraído de bacterias sin previa
exposición a agentes reductores migra como un monómero en
SDS-PAGE, a un peso molecular aparente de
aproximadamente 16 kDa comparado con la migración de proteínas
estándares de peso molecular. No hay GDNF detectable en la posición
de un dímero. GDNF, expuesto a agente reductor
(2-mercaptoetanol 30-150 mM) durante
la extracción o justo antes de SDS-PAGE aunque con
anterioridad a repliegue, migra a una posición indistinguible de la
proteína bacteriana no reducida, con un peso molecular aparente de
aproximadamente 16 kDa (Fig. 26, sendas 6 & 13). Esto indica
que GDNF preparado a partir de las células bacterianas no es
dimerizado antes de repliegue.
Después del repliegue según lo antes mencionado,
la mayoría del GDNF recombinante bacterialmente producido migra en
SDS-PAGE no reductor como un dímero aparente a
aproximadamente 30 kDa (Fig. 26, senda 2). La reducción del GDNF
replegado con 2-mercaptoetanol 150 mM antes de
SDS-PAGE hace que migre nuevamente a la posición
del monómero a aproximadamente 16 kDa (Fig. 23, senda 5). Estos
resultados indican que el repliegue de GDNF hace que la proteína se
vuelva un dímero unido a disulfuro. El SDS-PAGE de
GDNF replegado se llevó a cabo sin reducción, y el gel se cortó en
rebanadas a lo largo de su longitud y las rebanadas se ensayaron
para determinar la bioactividad en el ensayo de supervivencia de
neuronas de ganglios simpáticos (ver más abajo). La única
bioactividad detectable fue en la posición del dímero, lo cual
indica que el dímero es biológicamente activo.
Análisis de GDNF replegado en HPLC de fase
inversa (RP-HPLC). GDNF parcialmente purificado
por cromatografía S-Sepharose o
Q-Sepharose, aunque antes del repliegue, migró en
RP-HPLC, llevada a cabo según lo indicado más
adelante, con un tiempo de retención de aproximadamente 21 minutos.
GDNF después del repliegue migró bajo condiciones idénticas con un
tiempo de retención de aproximadamente 15 minutos. Un cambio en el
tiempo de retención es esperado para el repliegue exitoso de GDNF. A
menudo se observa que hay un cambio en los tiempos de retención en
RP-HPLC después del repliegue de proteínas.
La RP-HPLC de estas muestras se
llevó a cabo de la siguiente manera: a un índice de flujo de 1
ml/minuto: Se desarrolló una columna C-4 de 0,46X25
cm (VyDac #214TP54) de la siguiente manera: Disolvente A = ácido
trifluoracético al 0,1% (TFA) en agua; Disolvente B = TFA al 0,1%
en acetonitrilo; De 0,5 a 1,5 minutos, B es incrementado de 5% a
25%; De 1,5 a 31,5 minutos, B es incrementado de 25% a 55%.
Se bioensayó GDNF replegado tanto en el bioensayo
de supervivencia de neuronas de ganglios simpáticos (E10) de
embriones de polluelos y en el bioensayo de captación de dopamina
en cultivo mesencefálico de embriones de rata (E16) (Ejemplo 1B).
Antes del repliegue, GDNF, expuesto a
2-mercaptoetanol 30 mM y purificado por
cromatografía S-Sepharose o
Q-Sepharose, no exhibió bioactividad detectable en
el ensayo de captación de dopamina en cultivo mesencefálico y
bioactividad altamente reducida en el bioensayo de supervivencia de
neuronas simpáticas. La ED50 aparente en el bioensayo de
supervivencia de neuronas simpáticas de material de cromatografía
de S-Sepharose fue de aproximadamente 1 ug/ml, el
cual es aproximadamente 333 veces inferior a rhGDNF replegado
(véase más abajo). Para el material de cromatografía de
Q-Sepharose el ED50 aparente en el bioensayo de
supervivencia de neuronas simpáticas fue de aproximadamente 3
ug/ml, el cual es aproximadamente 100 veces inferior a rhGDNF
replegado (véase más abajo). Después del repliegue, GDNF, con o sin
exposición previa a 2-mercaptoetanol, era
aparentemente completamente activo en ambos bioensayos (Figs.
27-28). Este resultado indica que GDNF adquirió
bioactividad significativa luego del repliegue y también que la
bioactividad reducida o ausente antes del repliegue no se debía a la
exposición a 2-mercaptoetanol.
El ED50 de GDNF humano recombinante replegado
(rhGDNF) en estos bioensayos era similar a aquel observado
previamente para GDNF de rata purificado a partir de medio
acondicionado de células B49. En el bioensayo de supervivencia de
neuronas simpáticas, el ED50 para rhGDNF era de aproximadamente 3
ng/ml (Fig. 27) y el ED50 para GDNF de rata era de aproximadamente
5 ng/ml. En el ensayo de captación de dopamina en cultivo
mesencefálico, el ED50 para rhGDNF era de aproximadamente 30 pg/ml
(Fig. 28) y para GDNF de rata aproximadamente 50 pg/ml. Estos
resultados indican que una proporción sustancial de rhGDNF era
exitosamente replegada y completamente biológicamente activa.
Se generaron anticuerpos para rhGDNF mediante el
siguiente procedimiento. Se observa que este procedimiento incluye
aunque no se limita a este adyuvante, protocolo de inmunización y
especie de animal. Asimismo, los anticuerpos para GDNF pueden ser
cultivados utilizando la proteína natural, replegada o la proteína
desnaturalizada, inactiva como en el procedimiento proporcionado
más abajo o con péptidos contiguos de la secuencia de GDNF de
especies humanas o de otras especies animales.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser generados
mediante uno de muchos procedimientos convencionales (ver
Antibodies, a laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory 1988
ISBN 087969-314-2 editor Ed Harlow y
David Lane). Brevemente, ese tipo de procedimiento para generar
anticuerpos monoclonales típicamente aunque no exclusivamente
involucra inmunizar a los animales apropiados y monitorear la
respuesta a los anticuerpos de estos animales al protocolo de
inmunización, aislando células productoras de anticuerpos tales
como de un órgano linfoide de uno o más animales sensibles,
fusionando estas células con una línea celular apropiada tal como
células de mieloma para producir hibridomas que son células
inmortales secretoras de anticuerpos, y screening para aislar en
forma progresiva hibridomas hasta que se obtienen clones de célula
única que producen el anticuerpo monoclonal deseado.
Se cultivaron anticuerpos policlonales en conejos
de la siguiente manera: Dos mililitros de solución salina estéril
que contiene 0,005-0,25 mg de rhGDNF se inyectaron
en un frasco de la emulsión
MPL-TDM-CWS de adyuvante RIBI (RIBI
ImmunoChem Research, Inc.) y se sometió a vórtice para formar una
emulsión según las instrucciones del fabricante. Se inyectaron
conejos blancos de Nueva Zelanda hembras anestesiados siguiendo el
protocolo de inmunización sugerido de RIBI. Se administró un
mililitro de emulsión de antígeno adyuvante de la siguiente
manera:
0,30 ml intradérmicos (0,05 ml en cada uno de
seis sitios)
0,40 ml intramuscular (0,20 ml en cada pata
trasera)
0,10 ml subcutáneos (región del cuello)
0,20 ml intraperitoneal
Los animales fueron inyectados nuevamente
(refuerzo) cada 4-6 semanas mediante el mismo
protocolo. Se extrajo sangre de los animales antes de la primera
inyección y a 10-14 días después de cada refuerzo
para ensayar para determinar la producción de anticuerpos con un
ensayo de neutralización o un ELISA estándar.
El ensayo de neutralización se llevó a cabo de la
siguiente manera utilizando el ensayo de cultivo mesencefálico E16
de rata. Se diluyó suero de ensayo de conejo en medio esencial
mínimo de Dulbecco tamponeado con HEPES 25 mM hasta pH 7,4
conteniendo 5 mg/ml de seroalbúmina bovina (denominada BSA5). Esto,
a su vez, fue agregado a los pocillos de ensayo (25 ul de suero de
ensayo diluido en 500 ul de solución de cultivo tisular) y se dejó
incubar a 37º durante 30 minutos. A continuación, se agregó rhGDNF
como 25 ul de una solución diluida como producto base en BSA5 que
contenía rhGDNF a 6,32 ngm/ml para una concentración de rhGDNF
final de 0,316 ngm/ml en el ensayo. Se midió la captación de
dopamina después de ocho días en cultivo mediante el procedimiento
previamente descrito. Los resultados con antisueros de los segundos
refuerzos son mostrados a continuación para el ensayo de
neutralización (Referirse a la Tabla 2 que aparece a
continuación).
* Dilución de antisuero para 50% de neutralización de captación de dopamina estimulada por GDNF |
+ dilución de antisuero para 50% de la señal máxima (meseta) en ELISA |
Los antisueros también fueron titulados para
anticuerpos de GDNF en un ELISA estándar mediante el siguiente
procedimiento: Placas de microtitulación (96 pocillos, Nunc
maxisorp) se revistieron con 100 ul por pocillo de rhGDNF a 1,0
ugm/ml en bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9,6 como buffer de
revestimiento durante toda la noche a 4ºC. Las placas fueron
lavadas cuatro veces con buffer de lavado de placas (PWB; solución
salina fisiológica con buffer de fosfato, pH 7,2 que contenía 0,5%
Tween 20) y luego se bloquearon durante 2 horas a 25ºC con 200 ul
por pocillo de 2% seroalbúmina bovina en solución salina fisiológica
con buffer de fosfato, pH 7,2. Las placas se lavaron nuevamente con
PWB y las muestras de suero a ser tituladas (100 ul diluidos en 20%
suero de cabra normal y PWB) se agregaron a los pocillos. Las
placas se incubaron durante 1,5 horas a 35ºC y se lavaron nuevamente
con PWB. Se agregó IgG anti-conejo de cabra
conjugado con fosfatasa alcalina (Jackson Immunochemicals) en una
dilución 1:2500 en PWB a cada pocillo (100 ul) y se incubaron
durante 1,5 horas a 35ºC. Las placas se lavaron con PWB como antes.
Luego, se agregó sustrato p-NPP (fosfato de
p-nitrofenilo disódico; Sigma Cat. no. MP389) a
cada pocillo (100 ul a 1,0 mg/ml de p-NPP en 10%
dietanolamina, pH 9,8) y la placa se incubó a 25ºC. El desarrollo
del color fue seguido por lectura de las placas a
405-490 nm en un lector de placa (Molecular Devices
Enax).
También se utilizaron antisueros para detectar y
cuantificar GDNF en Western Blots de la siguiente manera: Se llevó
a cabo la electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato de sodio (SDS PAGE) mediante el procedimiento básico
primero descrito por U.K. Laemmli (Nature 227:
680-685 (1970)) utilizando un gel de resolución de
acrilamida 12 1/2% y gel de superposición de acrilamida 4 ½%. Los
geles (16X14X0,15 cm) fueron sometidos a electroforesis a 40 m amp
corriente constante durante 3 horas. Para reducción/
desnaturalización, las muestras se calentaron a 100ºC durante 10
minutos en buffer de muestra que contenía SDS al 1% y
2-mercaptoetanol 150 mM.
Para Western blotting, el gel fue luego sometido
a transblotting sobre membrana Immobilon-P
(Millipore Cat. No. IPVH 151 50) a 80m amp de corriente constante
durante 16 horas en Trisbase 25 mM, glicina 192 mM, 0,1% SDS y
metanol al 20% y se procesó de la siguiente manera:
1) La membrana fue bloqueada durante una hora a
25ºC en buffer de bloqueo (Tris 10 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 150
mM; 0,05% Tween 20; 4% de leche descremada; y 0,02% de azida de
sodio) con suave oscilación.
2) La membrana se incubó a continuación a 25ºC
durante 2 horas con suave oscilación en buffer de bloqueo que
contenía antisueros primarios diluidos a GDNF.
3) La membrana se lavó (4 lavados de 5 minutos)
en buffer de bloqueo.
4) La membrana se incubó a continuación a 25ºC
durante 2 horas con suave oscilación en buffer de bloqueo que
contenía anticuerpo secundario diluido (IgG
anti-conejo de cabra purificado por afinidad
conjugado con fosfatasa alcalina; Cappel Cat. No. 59299).
5) La membrana se lavó (4 lavados de 5 minutos)
con buffer de bloqueo excluyendo la leche descremada.
6) La membrana fue desarrollada en 50 ml de
buffer desarrollador (Tris 100 mM, pH 9,5 que contenía NaCl 100 mM
y MgCl_{2} 5 mM) con 165 ul de NBT y 83 ul de BCIP (kit de
Promega con No. de Cat. P3771) a 25ºC con suave oscilación hasta
que se consigue la tinción deseada.
Las células que secretan GDNF pueden ser
encapsuladas en membranas semipermeables para implantación en
pacientes que sufren de daño a los nervios. En una realización
preferida, el paciente sufre de mal de Parkinson, y las células
encapsuladas que secretan GDNF son implantadas en el striátum del
paciente para proveer GDNF a los cuerpos de células
dopaminérgicas.
En una realización de la invención, las células
que han sido construidas para secretar GDNF, tales como aquellas
preparadas y descritas en los Ejemplos 5 y 6 anteriores, son
incorporadas en inserciones poliméricas biocompatibles,
implantables y recuperables. Las inserciones pueden estar diseñadas
de modo de permitir que el GDNF secretado entre en el tejido que
rodea a las células implantadas, mientras que evitan que factores
del tejido lindante que serían perjudiciales para las células entren
a las células.
Las células que han sido construidas para
secretar GDNF pueden estar encapsuladas en ese tipo de membranas
semipermeables de acuerdo con el método descrito en la solicitud
PCT publicada WO 91/10425, titulada Cell Capsule Extrusion Systems
(Sistemas de Extrusión de Cápsulas de Células). Las células
encapsuladas en membranas pueden ser implantadas en el striátum de
acuerdo con procedimientos quirúrgicos convencionales.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Lin et al.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Factor Neurotrófico de Origen Glial
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 24
\vskip0.800000\baselineskip
- (IV)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Beaton & Swanson, P.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 4582 South Ulster Street Parkway, Suite #403
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Denver
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Colorado
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 80237
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Diskette, 5,25 pulgadas, 360 Kb de almacenamiento
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Wordperfect 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: NINGUNO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUDES PREVIAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 07/788.423, 07/774.109, 07/764.685
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-NOV-1991, 08-OCT-1991, 20-SEP-1991
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL APODERADO/ AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Barry J. Swanson
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.215
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ CARPETA: SYNE-225c3
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (303) 850-9900
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (303) 850-9401
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. NO.: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: fragmento N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Pro Asp Lys Gln Ala Ala Ala Leu Pro Arg
Arg Glu Arg Asn Xaa}
\sac{Gln Ala Ala Ala Ala Ser Pro Asp Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO: Xaa es Lys o Gln
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Xaa Ile Leu Lys Asn Leu Gly Arg Val Arg
Arg Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 890 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NO. DE HEBRAS: única
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- CLAVE: (ilegible)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 134 residuos aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/ CLAVE: secuencia de aminoácidos inferida para GDNF de rata maduro
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 562 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NO. DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: secuencia de ácidos nucleicos para GDNF humano
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 134 residuos aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: secuencia de aminoácidos inferida para GDNF humano maduro
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: sonda de oligonucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: N en posiciones 3, 15 y 18 es inosina
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCNGAYAARC ARGCNGCNGC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 223 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: secuencia de ácidos nucleicos para GDNF humano
\vskip1.000000\baselineskip
(10) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- No de HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: ligante
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGAATTCG GG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(11) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 residuos aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Asp Lys Gln Ala Ala Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(12) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: secuencia de ácidos nucleicos de pBluescript SK-76.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAG AGG AAC CGG CAA GCT GCW GMW GYM WGM CCW
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(13) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 residuos aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Ser
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(14) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: oligonucleótido DHD-26
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: N en posiciones 9 y 12 son inosina
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipARRTTYTTNA RNATYTTRTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(15) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 residuos aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(16) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 15
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: cebador de oligonucleótidos PD1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACGGGACTC TAAGATG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(17) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 16
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: cebador de oligonucleótidos DHD23
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: N en posiciones 3, 6 y 18 es inosina
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCNGCNGCYT GYTTRTCNGG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(18) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 17
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: cebador de oligonucleótidos LF2
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAGACAATG TACGACA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(19) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCTGGAGCC AGGGTCA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(20) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 19
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- NO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: cebador de oligonucleótidos PD1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGAATTCG ACGGGACTCT AAGATG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(21) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 20
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: cebador de oligonucleótidos LFA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGTGGCCAG AGGGAGTGGT CTTC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(22) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 21
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: cebador de oligonucleótidos PD3
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGATCCA ATAAGGAGGA AAAAAAATGT CACCAGATAA ACAAAT
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
(23) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 22
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NO DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: cebador de oligonucleótidos PD4
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGTACCC AGTCTCTGGA GCCGGA
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(24) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 23
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: fragmento adaptador para plásmido pCJ1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
(25) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 24
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: secuencia poliligante para plásmido pCJX1- 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (37)
1. Un método para preparar una proteína factor
neurotrófico purificado y aislado en donde el método comprende la
preparación de una proteína la cual comprende una secuencia de
aminoácidos según los expuesto en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6 o
dicha proteína tiene un grado de homología en exceso de 70% con las
secuencias expuestas en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6, en donde dicha
proteína tiene la capacidad de promover la captación de dopamina en
neuronas dopaminérgicas.
2. El método de preparación de una proteína de
acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de
aminoácidos es homóloga en exceso de 80% a las secuencias expuestas
en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6.
3. El método de preparación de una proteína de
acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha proteína comprende
la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 6.
4. El método de preparación de una proteína de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha proteína es
glicosilada.
5. El método de preparación de una proteína de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha proteína es
no glicosilada.
6. El método de preparación de una proteína de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 ó 5, en el cual la proteína
tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un residuo metionina
en la terminal amino.
7. El método de preparación de una proteína de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6 cuya proteína es obtenible
por tecnología recombinante.
8. El método de preparación de una proteína de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha proteína es
modificada por unión de una o más porciones poliméricas.
9. El método de preparación de una proteína de
acuerdo con la reivindicación 8, en el cual la porción polimérica
es polietilenglicol.
10. Un método para preparar una secuencia de
ácidos nucleicos en donde el método comprende la preparación de un
ácido nucleico que codifica una proteína factor neurotrófico según
lo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
11. Un método para preparar una secuencia de
ácidos nucleicos purificada y aislada en donde el método comprende
la preparación de un ácido nucleico que codifica a una proteína
factor neurotrófico, en donde dicha secuencia de ácidos
nucleicos:
(a) comprende a los nucleótidos 304 al 705 de SEC
ID NO: 3 o los nucleótidos 105 al 506 de SEC ID NO: 5; o
(b) codifica una proteína que comprende una
secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6;
o
(c) codifica una proteína que comprende una
secuencia de aminoácidos con un grado de homología en exceso de 70%
con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 4 o SEC ID
NO: 6; o
(d) hibrida a una secuencia de ácidos nucleicos
complementaria a una sonda de oligonucleótidos que codifica una
secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 4 o SEC ID
NO: 6;
y en donde dicha proteína tiene la
capacidad de promover la captación de dopamina en neuronas
dopaminérgicas.
12. Un método para preparar un vector en donde el
método comprende la preparación de un vector que comprende
elementos reguladores de la expresión ligados operativamente a una
secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con las reivindicaciones
10 u 11.
13. Un método para preparar una célula huésped
transformada o transfectada aislada de su ambiente natural en donde
el método comprende transformar o transfectar una célula huésped
con un vector obtenible de acuerdo con la reivindicación 12.
14. El método para preparar una célula huésped de
acuerdo con la reivindicación 13, en donde la célula huésped se
selecciona entre el grupo que consiste en células de mamífero y
microorganismos.
15. El método para preparar una célula huésped de
acuerdo con la reivindicación 14 en donde la célula huésped es una
célula COS-7 o una célula de E. coli.
16. El método para preparar una célula huésped de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde
dicha célula es adecuada para implantación humana y en donde dicha
célula expresa y secreta un factor neurotrófico.
17. El método para preparar una célula huésped de
acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicha célula es
transformada o transfectada ex vivo.
18. El método para preparar una célula huésped
de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, en donde dicha célula es
encerrada en una membrana semipermeable adecuada para implantación
humana.
19. Un método para la producción de factor
neurotrófico que comprende los pasos de:
(a) cultivar una célula huésped de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 bajo condiciones
adecuadas para la expresión de factor neurotrófico por dicha célula
huésped; y
(b) opcionalmente, aislar el factor neurotrófico
expresado por dicha célula huésped.
20. El método de acuerdo con la reivindicación
19, el cual comprende además el paso de replegar el factor
neurotrófico aislado.
21. Un método para preparar un factor
neurotrófico purificado, en donde dicho factor es obtenible de
acuerdo con el método de las reivindicaciones 19 ó 20.
22. Un método para preparar una composición
farmacéutica en donde el método comprende la preparación de una
proteína neurotrófica de acuerdo con un método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 y 21, o de acuerdo con un método de la
reivindicación 19 ó 20.
23. Un método para preparar una composición
farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 22 para utilizar en la
prevención o tratamiento del daño o enfermedad de las células
nerviosas o células nerviosas que funcionan en forma
incorrecta.
24. Un método para preparar una composición
farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 23 para utilización en
la prevención o tratamiento del mal de Parkinson.
25. Un método para preparar una composición
farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 23 para utilización en
la prevención o tratamiento del mal de Alzheimer.
26. Un método para preparar una composición
farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 23 para utilización en
la prevención o tratamiento de la esclerosis lateral
amiotrófica.
27. Un método para preparar una composición
farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 23 para utilización en
la prevención o tratamiento del daño o enfermedad de células
nerviosas debido a lesión física, isquemia, exposición a
neurotoxinas, enfermedades metabólicas crónicas o enfermedades
neurodegenerativas.
28. Un método para preparar una composición
farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 27 para utilización en
el tratamiento del daño a las células nerviosas debido a accidente
cerebrovascular, polineuropatía diabética, o neuropatía tóxica
causada por un agente terapéutico.
29. Un método para preparar un anticuerpo, en el
cual el método comprende inmunizar a un animal con una proteína
factor neurotrófico que comprende una secuencia de aminoácidos
según lo expuesto en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6.
30. El método de preparación de un anticuerpo de
acuerdo con la reivindicación 29, en el cual dicho anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal.
31. El método de preparación de un anticuerpo de
acuerdo con la reivindicación 29, en el cual dicho anticuerpo es un
anticuerpo policlonal.
32. Un método para preparar un dispositivo para
tratar el daño a los nervios, en donde el dispositivo es preparado
utilizando:
(a) una membrana adecuada para implantación;
y
(b) células recombinantemente modificadas
obtenibles de acuerdo con la reivindicación 13 las cuales expresan
y secretan la proteína factor neurotrófico encapsulada dentro de
dicha membrana;
para encapsular las células en la
membrana y en donde dicha membrana es permeable a la proteína
factor neurotrófico e impermeable a materiales perjudiciales para
dichas
células.
33. El método de preparación de un dispositivo de
acuerdo con la reivindicación 32, en donde dicho factor
neurotrófico comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:
6.
34. Un método de preparación de un hibridoma que
comprende pasos, en donde las células productoras de anticuerpos
son fusionadas con una línea celular apropiada, produciendo dicho
hibridoma un anticuerpo monoclonal que se une a un factor
neurotrófico que comprende una secuencia de aminoácidos según lo
expuesto en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6.
35. Un proceso para aislar factor neurotrófico
poniendo en contacto dicho factor con un anticuerpo que se une
específicamente a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4 o
SEC ID NO: 6.
36. Un método para la producción de factor
neurotrófico que comprende los pasos de:
(a) cultivar una célula huésped transformada o
transfectada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que
codifica una proteína factor neurotrófico bajo condiciones
adecuadas para la expresión de dicha proteína,
en donde dicha secuencia de ácidos nucleicos está
ligada operativamente a un promotor no natural; y en donde dicha
secuencia de ácidos nucleicos codifica a una proteína que comprende
una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO:
6; y
(b) aislar dicha proteína expresada en una forma
sustancialmente purificada de dicho cultivo de células
huéspedes,
en donde dicha proteína tiene la
capacidad de promover la captación de dopamina en neuronas
dopaminérgicas.
37. El método de acuerdo con la reivindicación
36, que comprende además replegar la proteína factor neurotrófico
expresada para formar un dímero unido a disulfuro.
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