ES2225819T3 - Factor neurotrofico de origen glial. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN NUEVO FACTOR NEUROTROFICO REFERENCIADO COMO FACTOR NEUROTROFICO DERIVADO DEL GLIAL (GDNF) QUE HA SIDO IDENTIFICADO Y AISLADO A PARTIR DE UN MEDIO ACONDICIONADO PARA EL CRECIMIENTO LIBRE DE SUERO DE CELULAS DE GLIOBLASTOMA B49. LOS GENES HUMANOS Y DE LA RATA QUE CODIFICAN EL GDNF HAN SIDO CLONADOS Y SECUENCIADOS. UN GEN QUE CODIFICA GDNF HA SIDO SUBCLONADO EN UN VECTOR, Y EL VECTOR HA SIDO UTILIZADO PARA TRANSFORMAR UNA CELULA ANFITRIONA PARA PRODUCIR GDNF BIOLOGICAMENTE ACTIVO EN UN PROCESO DE DNA RECOMBINANTE.

Description

Factor neurotrófico de origen glial.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a factores neurotróficos y al factor neurotrófico de origen glial (GDNF, "glial derived neurotrophic factor") en particular. También se incluye dentro de esta invención a los procesos para la purificación de GDNF de fuentes naturales y procesos para la clonación de genes de ratas y humanos que codifican GDNF, como así también a la secuencia de ácidos nucleicos de los genes de rata y humanos que codifican al GDNF. El gen de GDNF ha sido subclonado en un vector de expresión, y el vector fue utilizado para expresar GDNF biológicamente activo. Adicionalmente, esta invención incluye el uso de GDNF para prevenir y tratar el daño a los nervios y trastornos relacionados con los nervios tales como la enfermedad de Parkinson.

Se describen los anticuerpos de GDNF, como así también los métodos para identificar miembros de la familia de GDNF de factores neurotróficos. Y finalmente, se describen métodos para prevenir o tratar el daño a los nervios implantando en pacientes células que secretan GDNF.

Antecedentes de la invención

Los factores neurotróficos son proteínas naturales, encontradas en el sistema nervioso o en tejidos no nerviosos inervados por el sistema nervioso, cuya función consiste en promover la supervivencia y mantener la diferenciación fenotípica de células nerviosas y/o gliales (Varon y Bunge 1979 Ann. Rev. Neuroscience 1:327; Thoenen y Edgar 1985 Science 229:238). Debido a este rol fisiológico, los factores neurotróficos pueden ser útiles en el tratamiento de la degeneración de células nerviosas y pérdida de la función diferenciada que se produce en una variedad de enfermedades neurodegenerativas.

A fin de que un factor neurotrófico en particular sea potencialmente útil en el tratamiento del daño a los nervios, la clase o clases de células nerviosas dañadas debe poder responder al factor. Diferentes factores neurotróficos típicamente afectan en forma distinta a diferentes clases de células nerviosas. Por lo tanto, es conveniente tener a mano una variedad de diferentes factores neurotróficos para tratar cada una de las clases de neuronas dañadas que pueden aparecer con diferentes formas de enfermedad o lesión.

Los factores neurotróficos pueden proteger a las neuronas sensibles contra una variedad de ataques no relacionados. Por ejemplo, el factor neurotrófico factor de crecimiento nervioso (NGF, "nerve growth factor") rescatará a una porción significativa de neuronas sensoriales de la muerte causada por el corte de sus procesos axonales (Rich y col. 1987 J. Neurocytol 16:261; Otto y col. 1987 J. Neurosci 83:156), de la muerte ontogenética durante el desarrollo embriónico (Hamburger y col. 1984 J. Neurosci. 4: 767) y del daño causado por la administración de taxol o cisplatina (Apfel y col. 1991 Ann. Neurol. 29: 87). Esta aparente generalidad de protección a conducido al concepto de que si un factor neurotrófico protege a las neuronas sensibles contra el daño experimental, puede ser útil en el tratamiento de enfermedades que involucran el daño a aquellas neuronas en pacientes, si bien la etiología puede ser desconocida.

Un factor neurotrófico determinado, además de tener la especificidad neuronal correcta, debe estar disponible en suficiente cantidad para ser utilizado como un tratamiento farmacéutico. Puesto que los factores neurotróficos están típicamente presentes en cantidades muy pequeñas en tejidos (por ejemplo, Hofer y Barde 1988 Nature 331: 261; Lin y col. 1989 Science 246: 1023), sería inconveniente preparar cantidades farmacéuticas de factores neurotróficos directamente de tejidos animales. Como alternativa, sería conveniente ubicar al gen para un factor neurotrófico y utilizar ese gen como la base para establecer un sistema de expresión recombinante para producir cantidades potencialmente ilimitadas de la proteína.

Los inventores de esta solicitud describen un método para seleccionar muestras biológicas a fin de determinar la actividad neurotrófica en los precursores embriónicos de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra que se degeneran en la enfermedad de Parkinson. Este bioensayo para identificar factores neurotróficos que pueden ser útiles en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson se basa en un ensayo previamente descrito (Friedman y col. 1987 Neuro. Sci. Lett. 79: 65-72, que se incorpora específicamente en la presente solicitud por medio de esta referencia) e implementado con modificaciones en la presente invención. Este ensayo fue utilizado para seleccionar diversas fuentes potenciales para actividad neurotrófica dirigida a neuronas dopaminérgicas. La presente invención describe la caracterización de un nuevo factor neurotrófico que fue purificado de una de esas fuentes, el medio de cultivo acondicionado de una línea celular de glioblastoma, B49 (Schubert y col. 1974 Nature 249: 224-27, que se incorpora a este documento específicamente por medio de esta referencia). El medio acondicionado de esta línea celular fue previamente reportado para contener actividad neurotrófica dopaminérgica (Bohn y col. 1989 Soc. Neurosci. Abs. 15: 277). En este informe previo, la fuente de la actividad neurotrófica no fue purificada, químicamente caracterizada, o mostrada como la consecuencia de un único agente en el medio acondicionado. El daño a los nervios es causado por condiciones que comprometen la supervivencia y/o función apropiada de uno o más tipos de células nerviosas. Ese tipo de daño a los nervios puede ocurrir de una amplia variedad de diferentes causas, algunas de las cuales son indicadas a continuación.

El daño a los nervios puede producirse a través de lesión física, la cual causa la degeneración de los procesos axonales y/o cuerpos de células nerviosas cerca del sitio de la lesión. El daño a los nervios también puede producirse debido a cesación temporal o permanente del flujo sanguíneo a partes del sistema nervioso, como en un accidente cerebrovascular. El daño a los nervios también puede producirse debido a la exposición intencional o accidental a neurotoxinas, tales como los agentes quimioterapéuticos para el cáncer y el SIDA cisplatino y didesoxicitidina (ddC), respectivamente. El daño a los nervios también puede producirse debido a enfermedades metabólicas crónicas, tales como la diabetes o la disfunción renal. El daño a los nervios también puede producirse debido a enfermedades neurodegenerativas tales como el mal de Parkinson, el mal de Alzheimer y Esclerosis Lateral Amiotrófica (ALS, Amyotrophic Lateral Sclerosis), las cuales son el resultado de la degeneración de poblaciones neuronales específicas.

Esta solicitud describe un factor neurotrófico novedoso. Los factores neurotróficos son proteínas naturales que promueven las funciones normales de las células nerviosas específicas y/o protegen a las mismas células contra una variedad de formas diferentes de daño. Estas propiedades son las que sugieren que el GDNF puede ser útil en el tratamiento de diversas formas de daño a los nervios, incluyendo aquellas formas indicadas específicamente anteriormente.

El mal de Parkinson es identificado por un único conjunto de síntomas que incluyen rigidez, bradiquinesis, seborrea, modo de andar apresurado, postura encorvada, salivación, y un temblor "de rodamiento de píldora" ("pill rolling"). La enfermedad es encontrada en todas las razas en todo el mundo, y la edad promedio del inicio es 60 años.

Después de años de teorías en conflicto y controversia, ha surgido una base bioquímica para el mal de Parkinson como la causa principal. (Ver, por ejemplo, Bergman, 1990 Drug Store News, 12:IP19.) De importancia significativa para la comprensión del mal de Parkinson son las áreas del cerebro conocidas como la sustancia nigra, los ganglios basales y particularmente, el cuerpo estriado. La sustancia nigra, una capa bilateralmente apareada de materia gris pigmentada en el cerebro medio, está involucrada en la transmisión de dopamina, mientras que la función de los ganglios basales normal involucra una serie de interacciones y sistemas de feedback los cuales están asociados con la sustancia nigra y mediados en parte por dopamina, acetilcolina y otras sustancias.

En el mal de Parkinson, existe una disfunción en la actividad dopaminérgica de la sustancia nigra la cual es causada por la degeneración neuronal. Esto da como resultado un estado de deficiencia de dopamina y un cambio en el equilibrio de actividad a una predominancia colinérgica. Por consiguiente, si bien no hay aumento alguno en la concentración de acetilcolina, los efectos excitatorios en el sistema nervioso central (es decir, temblores) por este mediador colinérgico superan los efectos inhibitorios de la dopamina agotada.

El tratamiento más efectivo para el mal de Parkinson hasta la fecha es la administración oral de Levodopa. Levodopa penetra el sistema nervioso central y es enzimáticamente convertido a dopamina en los ganglios basales. Se cree que los efectos beneficiosos de Levodopa, son, por ende, el aumento de la concentración de dopamina en el cerebro. Desafortunadamente, ni Levodopa o ninguno de los medicamentos utilizados menos comunes realmente frenan la progresión de la enfermedad la cual es causada por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas.

Otros investigadores han reportado la existencia de actividad dopaminérgica en diversas fuentes biológicas. En la publicación PCT WO91/01739 de Springer y col., se identificó una actividad neurotrófica dopaminérgica en un extracto derivado de células del sistema nervioso periférico. La actividad identificada no fue purificada, aunque se atribuyó a un factor que tiene un peso molecular inferior a 10.000 daltons. El factor fue aislado de nervio ciático de rata aunque aparentemente no es CNTF, el cual también es encontrado en el nervio (Lin y col. 1989 Science 246: 1023).

En la Patente de los Estados Unidos No. 5.017.735 de Appel y col., se identificó actividad dopaminérgica en un extracto de tejido de caudado- putamen. Nuevamente, no se purificaron factores que den origen a la actividad y el peso molecular aparente de las fracciones que contienen actividad era relativamente pequeño. Ver también, Niijima y col. 1990, Brain Res. 528: 151-154 (estriado químicamente desaferenciado de cerebro de rata adulto); Lo y col. 1990 Soc. Neurosci. Abstr., 16:809 (factor neurotrófico derivado de estriado). Adicionalmente, otros factores neurotróficos conocidos también han demostrado que tienen actividad dopaminérgica, por ejemplo, el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF, "Brain derived neurotrophic factor"), y Factores del Crecimiento de Fibroblasto ácido y básico.

El GNDF de la presente invención fue aislado en base a su capacidad de promover la actividad funcional y supervivencia en cultivo celular de células nerviosas dopaminérgicas del mesencéfalo embrionario de rata. Estas células nerviosas dopaminérgicas son el precursor embriónico de las células nerviosas dopaminérgicas en la sustancia nigra adulta que se degenera en el mal de Parkinson. Por lo tanto, el GDNF puede ser de utilidad en la reducción de la degeneración neuronal que causa los síntomas del mal de Parkinson.

Adicionalmente, el GDNF puede ser útil en el tratamiento de otras formas de daño a o función inapropiada de las células nerviosas dopaminérgicas en pacientes humanos. Ese tipo de año o mala función puede ocurrir en la esquizofrenia y en otras formas de sicosis. Los tratamientos actuales para ese tipo de condiciones a menudo requieren fármacos activos en receptores de dopamina, sugiriendo que la función inapropiada de las neuronas dopaminérgicas que inerva estas poblaciones neuronales que llevan receptor puede estar involucrada en el proceso de la enfermedad.

En base a la experiencia previa con otros factores neurotróficos, nuevas formas de daño a los nervios que pueden tratarse con GDNF surgirán a medida que se aprenda más acerca de los diversos tipos de células nerviosas que son sensibles a este factor neurotrófico. Por ejemplo, el factor de crecimiento nervioso (NGF, "nerve growth factor") solo surgió como un tratamiento potencialmente útil para el mal de Alzheimer cuando fue recientemente descubierto que el NGF actúa como un factor neurotrófico para las neuronas colinérgicas del cerebro anterior basales que se degeneran en el mal de Alzheimer. (Williams y col. 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9231). Se proveen métodos en la presente invención para determinar otras formas de daño a los nervios que pueden ser tratadas útilmente con GDNF.

Patrick Aebischer y colaboradores han descrito el uso de dispositivos de membrana semipermeables, implantables que son útiles como medios para suministrar fármacos o medicamentos en ciertas circunstancias. Por ejemplo, han propuesto la encapsulación de células que secretan factores neurotransmisores, y la implantación de tales dispositivos en el cerebro de pacientes que sufren del Mal de Parkinson. Ver, Patente de los Estados Unidos No. 4.892.538 de Aebischer y col.; Patente de los Estados Unidos No. 5.011.472 de Aebischer y col.; Patente de los Estados Unidos No. 5.106.627 de Aebischer y col.; Solicitud PCT WO 91/10425; Solicitud PCT WO 91/10470; Winn y col. 1991 Exper. Neurol. 113: 322- 329; Aebischer y col. 1991 Exper. Neurol. 111: 269- 275; y Tresco y col. 1992 ASAIO 38: 17-23.

Síntesis de la invención

Esta invención se refiere a y reivindica el factor neurotrófico de origen glial sustancialmente purificado (GDNF). En una realización de esta invención, el GDNF sustancialmente purificado es obtenido con una actividad específica al menos aproximadamente 24.000 veces superior a la actividad específica de medio acondicionado B49. El GDNF sustancialmente purificado tiene una actividad específica de por lo menos aproximadamente 12.000 TU/ug.

El GDNF sustancialmente purificado de la presente invención tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 31-42 kD en SDS-PAGE no reductor, y aproximadamente 20-23 kD en SDS-PAGE de reducción. El GDNF sustancialmente purificado tiene una secuencia de terminal amino formada sustancialmente por la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 1):

(Ser)-Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala-Leu-Pro-Arg-Arg-Glu-(Arg)-Asn-( )-Gln-Ala-Ala- Ala-Ala-(Ser)-Pro-(Asp)-(Asn).

La secuencia de aminoácidos de formas maduras y "pre-pro" de GDNF de rata es según lo expuesto en las Figs. 13 y 14 (SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4). La secuencia de aminoácidos de GDNF humano maduro es según lo expuesto en la porción subrayada de Fig. 19 residuos aminoácidos 1 a 134 de SEC ID NO: 5 y los residuos aminoácidos 1 a 134 de SEC ID NO: 6. La secuencia de aminoácidos de la forma pre-pro de GDNF humano es expuesta en las Figuras 19 (SEC ID NO: 5) y 22 (SEC ID NO: 8)

Un aspecto de la invención es un método para obtener GDNF purificado que comprende: 1) preparar un medio acondicionado de crecimiento libre de suero de células de glioblastoma B49; 2) concentrar el medio acondicionado; 3) llevar a cabo cromatografía de heparina sepharose en el medio acondicionado concentrado; 4) llevar a cabo cromatografía líquida de proteína rápida sobre las fracciones obtenidas de dicha cromatografía de heparina sepharose; y 5) llevar a cabo una cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa sobre las fracciones obtenidas de dicha cromatografía líquida de proteína rápida. En una realización, el método para obtener GDNF purificado es adicionalmente comprendido de las etapas de: 6) someter a las fracciones obtenidas por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa a SDS-PAGE preparativa; 7) llevar a cabo la cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa sobre fracciones obtenidas por SDS-PAGE preparativa.

También se describe la clonación del gen de GDNF de rata de una genoteca de ADNc preparada de la línea celular B49. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica GDNF de rata madura y pre-pro es expuesta en la Fig. 13 (SEC ID NO: 3). El método para obtener un gen humano que codifica GDNF es también descrito. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica GDNF humano maduro es según lo expuesto en la Fig. 19 (SEC ID NO: 5). La secuencia de ácidos nucleicos que codifica los primeros 50 aminoácidos del segmento pre-pro de GDNF humano es según lo expuesto en la Fig. 22 (SEC ID NO: 8).

Esta invención también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de GDNF purificado en un portador farmacéuticamente adecuado. Asimismo se describe un método para prevenir o tratar el daño a los nervios el cual comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de GDNF. En realizaciones preferidas, el daño a los nervios es el mal de Parkinson o células nerviosas dopaminérgicas que funcionan incorrectamente o inadecuadas.

En la realización preferida de esta invención, se produce GDNF por métodos de ADN recombinante, utilizando los genes que codifican GDNF según lo descrito en el presente documento. La presente invención incluye un vector para utilizar en la producción de GDNF biológicamente activo compuesto por elementos reguladores de la expresión ligados operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica GDNF maduro o pre-pro, y una célula huésped transformada por ese tipo de vector. También se incluye un método de ADN recombinante para la producción de GDNF que comprende: subclonar una secuencia de ADN que codifica GDNF en un vector de expresión el cual comprende los elementos reguladores necesarios para expresar la secuencia de ADN; transformar una célula huésped con dicho vector de expresión; cultivar las células huéspedes bajo condiciones para amplificación del vector y expresión de GDNF; y cosechar el GDNF.

Un método de ADN recombinante es descrito para la producción de GDNF que comprende: cultivar las células huéspedes de esta invención en condiciones para amplificación del vector y expresión de GDNF; y cosechar el GDNF.

Esta invención incluye anticuerpos sustancialmente purificados que reconocen GDNF. También se incluye un método para prevenir o tratar el daño a los nervios el cual comprende implantar células que secretan el factor neurotrófico de origen glial en el cuerpo de pacientes que lo necesitan. Finalmente, la presente invención incluye un dispositivo para prevenir o tratar el daño a los nervios por implantación en un paciente que comprende una membrana semipermeable, y una célula que secreta GDNF encapsulado dentro de dicha membrana y dicha membrana es permeable a GDNF e impermeable a factores del paciente perjudiciales para las células.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra los resultados de cromatografía de heparina sepharose en una solución de medio acondicionado de crecimiento libre de suero de células de glioblastoma B49. Los resultados muestran el eluido O.D._{290} (-), conductancia (-\Delta-) y actividad de GDNF en TU (-o-). Las fracciones marcadas por una barra fueron agrupadas para más purificación.

La Figura 2 ilustra los resultados de cromatografía de superose FPLC de las fracciones agrupadas de la Fig. 1. Los resultados se muestran de O.D._{280} (-), y actividad de GDNF en TU (-o-).

La Figura 3 ilustra los resultados de RP-HPLC en fracción 14 de la Fig. 2. Se muestran los resultados de O.D._{214}, con la actividad de GDNF en TU mostrada más adelante.

La Figura 4 ilustra los resultados de análisis por SDS-PAGE con tinción de plata de fracciones 3-10 obtenidas de la Fig. 3 anterior. La senda S contiene patrones de pesos moleculares.

La Figura 5 ilustra los resultados de SDS-PAGE preparativa en fracciones 5 y 6 de la Fig. 4. Se analizaron las porciones de gel para determinar la actividad de GDNF en TU. Las porciones de gel también fueron correlacionadas a peso molecular mediante el uso de marcadores de peso molecular (Amersham).

La Figura 6 ilustra los resultados de la RP-HPLC en las fracciones 16-23 de la Fig. 5. El cromatograma A contiene la muestra, y el cromatograma B es un control (extracto de gel agrupado de las porciones correspondientes de una senda en blanco).

La Figura 7 ilustra los resultados del análisis por SDS-PAGE con tinción de plata de pico 3 de la Figura 6A (senda 1) y un control del peso molecular (senda S).

La Figura 8 (SEC ID NO: 1) describe la secuencia de aminoácidos de terminal amino obtenido de GDNF purificado. El paréntesis vacío indica una posición donde el aminoácido no pudo ser determinado utilizando la técnica de secuenciado empleada. Cuando los residuos son proporcionados en paréntesis, había cierta incertidumbre en cuanto a la identificación de ese residuo. La secuencia de aminoácidos de terminal amino correcta completa se muestra en la Figura 19 (SEC ID NO: 5) que aparece más abajo.

La Figura 9 ilustra los resultados de RP-HPLC en GDNF purificado digerido con tripsina. El cromatograma A contiene la muestra, y el cromatograma B es un control (que contiene tripsina solamente).

La Figura 10 ilustra los resultados de la RP-HPLC de pico 37 de la Fig. 9. luego del tratamiento con bromuro de cianógeno.

La Figura 11 ilustra los resultados de la RP-HPLC sobre el producto de reducción de pico 1 de la Figura 10.

La Figura 12 (SEC ID NO: 2) describe una secuencia de aminoácidos interna obtenida de GDNF purificado.

La Figura 13 (SEC ID NO: 3) ilustra la secuencia de ácidos nucleicos obtenida para GDNF de rata derivado de un clon de ADNc de genoteca de células B49 \lambdaZapII76.1. También se ilustra la secuencia de aminoácidos inferida para GDNF. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica GDNF maduro está subrayada. La secuencia de terminal amino de la forma pre-pro más preferida de GDNF está marcada con un *.

La Figura 14 (SEC ID NO: 4) ilustra la secuencia de aminoácidos inferida de GDNF maduro.

La Figura 15 ilustra los resultados de GDNF de células B49 purificado y CNTF recombinante humano para promover la supervivencia de neuronas parasimpáticas de ganglios ciliares embrionarios de polluelo. El aumento de la densidad óptica en el eje Y representa un aumento en la supervivencia neuronal. El eje X representa una disminución en las concentraciones de cada factor neurotrófico. La curva rotulada control es volúmenes iguales de fracciones de HPLC inactivas adyacentes a aquellas que contienen el GDNF utilizado para generar el GDNF rotulado de la curva.

La Figura 16 ilustra los resultados de GDNF de células B49 purificado y CNTF recombinante humano para promover la supervivencia de neuronas simpáticas de ganglios de cadena simpática embrionarios de polluelo. El aumento de la densidad óptica en el eje Y representa un aumento en la supervivencia neuronal. El eje X representa una disminución en las concentraciones de cada factor neurotrófico. La curva rotulada control es volúmenes iguales de fracciones de HPLC inactivas adyacentes a aquellas que contienen el GDNF utilizado para generar el GDNF rotulado de la curva.

La Figura 17 ilustra los resultados de bioensayo de medio acondicionado de células COS para determinar la capacidad de aumentar la captación de dopamina por neuronas dopaminérgicas mesencefálicas en cultivo. El eje Y presenta la cantidad de dopamina radiorotulada tomada contra cantidades en aumento de medio de cultivo de células COS concentrado en el eje X. La curva rotulada B-1 representa el medio acondicionado libre de suero de células COS transfectadas con el gen GDNF en la orientación apropiada para expresión de GDNF. La curva rotulada C-1 representa el medio acondicionado libre de suero de células COS transfectadas con el gen GDNF en la orientación opuesta, lo cual previene la expresión de GDNF.

La Figura 18 ilustra los resultados del bioensayo de medio acondicionado de células COS para determinar la capacidad de aumentar la supervivencia en cultivo de neuronas simpáticas de la cadena simpática en embriones de gallina. El eje Y presenta la cantidad de tinte MTT reducido por los cultivos y es proporcional a la supervivencia neuronal. El eje X representa el aumento de la dilución de medio de cultivo de células COS concentrado. La curva rotulada GDNF representa el medio acondicionado libre de suero de células COS transfectadas con el gen GDNF en la orientación apropiada para la expresión de GDNF. La curva rotulada CONTROL representa el medio acondicionado libre de suero de células COS transfectadas con el gen GDNF en la orientación opuesta, lo cual evita la expresión de GDNF.

La Figura 19 (SEC ID NO: 5) ilustra una porción de la secuencia de ácidos nucleicos obtenida para GDNF humano, según lo descrito en el Ejemplo 2C que aparece a continuación, incluyendo la porción entera del gen que codifica para GDNF humano maduro. También se ilustra la secuencia de aminoácidos inferida para GDNF humano maduro. La secuencia de aminoácidos para GDNF maduro está subrayada.

La Figura 20 ilustra la capacidad de GDNF de estimular la captación de dopamina y la inmunotinción de tirosina hidroxilasa (TH) en neuronas dopaminérgicas. Los cultivos fueron establecidos según lo ilustrado en el Ejemplo 1B. Se agregó GDNF en el día de colocación en placas y se volvió a llenar después de nueve días in vitro. A. se midió la captación de ^{3}H-DA después de 15 días in vitro. B. Se fijaron los cultivos después de 16 días in vitro con 4% paraformaldehído, se lavó extensamente, se permeabilizó con 0,2% Triton x-100 y se tiñó con anticuerpo policlonal a TH (Eugine Tech International, Allendale, NJ). Se visualizó la unión al anticuerpo primario utilizando un kit Vectastain ABC (Vector Labs, Burlingame, CA).

La Figura 21 ilustra la especificidad de GDNF a neuronas dopaminérgicas. Los cultivos fueron establecidos según lo descrito en el Ejemplo 1B. Se agregó GDNF en el día de la colocación en placas. A. Se midió la captación de ^{3}H-DA después de siete días in vitro. B. Se midió la captación de ^{14}C-GABA después de ocho días in vitro. Se incubaron las células y se trataron como para captación de ^{3}H-DA, salvo que el buffer de captación consistía en buffer de fosfato de Kreb-Ringer, pH 7.4, que contenía glucosa 5,6 mM, EDTA 1,3 mM, ácido amino-oxiacético 10 uM (para evitar la desintegración de GABA), B-alanina 2mM (para inhibir la captación glial de GABA) y ^{14}C-GABA 0,1 uM (150 mC_{1}/mmol, New England Nuclear, Boston, MA). En presencia de ácido diaminobutírico 1 mM (DABA), un inhibidor potente de captación de ^{14}C-GABA en neurona GABA, la captación de ^{14}C fue reducida al 10%. Los valores de control en presencia de DABA, fueron restados de los valores experimentales.

La Figura 22 (SEC ID NO: 8) ilustra una porción de la secuencia de ácidos nucleicos obtenidos para GDNF humano, según lo descrito en el Ejemplo 2D que aparece más adelante, incluyendo la secuencia codificadora de aminoácidos 1-50 de GDNF pre-pro humano. También se ilustra la secuencia de aminoácidos inferida para los primeros 50 aminoácidos de GDNF pre-pro humano. Esta información conjuntamente con la información de secuencia codificadora proporcionada en la Figura 19, provee la secuencia codificadora completa para GDNF pre-pro humano, y la secuencia de aminoácidos inferida para la proteína GDNF pre-pro humana.

La Figura 23 ilustra un mapa de sitios SacII y PstI dentro del plásmido de pBSSK-\lambda3AluI, según lo descrito en el Ejemplo 2D que aparece más adelante.

La Figura 24 ilustra la especificidad de GDNF a neuronas dopaminérgicas. Se prepararon los cultivos según lo descrito en el Ejemplo 1B. Se agregó GDNF en el día de la colocación en placas, y se midió la captación después de 6 días in vitro.

A ilustra la captación de dopamina y B ilustra la captación de serotonina.

La Figura 25 ilustra SDS-PAGE con tinción Azul Coomassie, operada en condiciones de reducción, de fracciones de cromatografía de un extracto bacteriano que contiene GDNF no replegado en una columna S-Sepharose antes de repliegue (ver Ejemplo 6C). Las sendas 2-8 representan fracciones consecutivas del eluado en columna. Las Fracciones 3-5, enriquecidas para GDNF, se agruparon para repliegue. La Senda 1 es patrones de peso molecular (SDS-70L, Sigma).

La Figura 26 ilustra SDS-PAGE con tinción Azul Coomassie de la solución de GDNF; antes de repliegue (sendas 6 & 13), después de repliegue (senda 2), y después de repliegue y posterior retro-reducción con 2-mercaptoetanol 150 mM (senda 5). El material antes del repliegue y después de la retro-reducción opera como un monómero en aproximadamente 16 kDa. GDNF después de repliegue exitoso opera (sin reducción) como un dímero en aproximadamente 30 kDa (ver Ejemplo 6C). La senda 15 es patrones de peso molecular (SDS-70L, Sigma).

La Figura 27 ilustra los resultados de un bioensayo utilizando GDNF replegado; midiendo la capacidad de promover la supervivencia de neuronas simpáticas de embrión de polluelo en cultivo. El procedimiento de bioensayo es según lo descrito en el Ejemplo 4A. La densidad óptica (proporcional al número de neuronas supervivientes) en el eje Y se traza contra la concentración de GDNF en el eje X (determinado por exploración de densitometría láser de geles de SDS-PAGE con tinción Azul Coomassie). El ED50 calculado de GDNF replegado para la supervivencia de neuronas simpáticas de embrión de polluelo es aproximadamente 3 ng/ml.

La Figura 28 ilustra los resultados de un bioensayo utilizando GDNF replegado; midiendo la capacidad de aumentar la captación de dopamina por neuronas dopaminérgicas nigrales en cultivos de mesencéfalo embriónico de rata. El procedimiento de bioensayo es según lo descrito en el Ejemplo 1B. La captación de dopamina en el eje Y es trazada contra concentraciones de GDNF en el eje X. El ED50 calculado de GDNF replegado para el aumento de la captación de dopamina en estos cultivos es aproximadamente 3 pg/ml.

Descripción detallada de realizaciones preferidas

Se hará ahora referencia en detalle a las realizaciones actualmente preferidas de la invención, las cuales, junto con los siguientes ejemplos, sirven para explicar los principios de la invención.

Con anterioridad a esta invención, no se había identificado al GDNF como una sustancia biológicamente activa discreta y no había existido en una forma sustancialmente pura. Según lo descrito en la presente memoria descriptiva, se provee una descripción detallada de GDNF, junto con una descripción de: sus características físicas, químicas y biológicas; su utilidad; cómo prepararlo; composiciones útiles que lo contienen; secuencias de ácidos nucleicos que lo codifican; vectores que contienen ese tipo de secuencias de ácidos nucleicos; células huéspedes transformadas por tales vectores; técnicas recombinantes para su producción; y otros aspectos de la invención.

El GDNF es una proteína que puede ser identificada en u obtenida de células gliales y que exhibe actividad neurotrófica. Más específicamente, el GDNF es una proteína neurotrófica dopaminérgica que está caracterizada en parte por su capacidad de aumentar la captación de dopamina en precursores embriónicos de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra, y adicionalmente por su capacidad de promover la supervivencia de células nerviosas parasimpáticas y simpáticas. El GDNF sustancialmente purificado es caracterizado adicionalmente de diversas maneras:

1. Tiene una actividad específica de por lo menos aproximadamente 12.000 TU/ug.

2. Tiene un peso molecular en SDS-PAGE reductor de aproximadamente 20-23 kD.

3. Tiene un peso molecular en SDS-PAGE no reductor de aproximadamente 31-42 kD.

4. Tiene una actividad específica de por lo menos aproximadamente 24.000 veces superior a la actividad específica de medio acondicionado B49.

5. Tiene la capacidad de regular hacia arriba la inmunoreactividad de tirosina hidroxilasa en cultivo mesencefálico.

6. Tiene la secuencia de aminoácidos de terminal amino según lo mostrado en la Figura 8 (SEC ID NO: 1).

7. Tiene la secuencia de aminoácidos interna como se muestra en la Figura 12 (SEC ID NO: 2).

El GDNF de la presente invención es más completamente descrito en detalle más adelante. Debe entenderse que este aspecto de la invención cubre cualquier proteína neurotrófica dopaminérgica que tiene una secuencia de aminoácidos de terminal amino igual o sustancialmente homóloga a aquella proporcionada en la Figura 8 (SEC ID NO: 1). Esta invención también incluye cualquier proteína neurotrófica dopaminérgica que tiene una secuencia de aminoácidos interna igual o sustancialmente homóloga a aquella proporcionada en la Figura 12 (SEC ID NO: 2).

Esta invención incluye una novedosa proteína neurotrófica dopaminérgica que es definida en la presente memoria descriptiva como factor neurotrófico de origen glial (GDNF). GDNF ha sido identificado en y aislado de un medio acondicionado de crecimiento libre de suero de células de glioblastoma B49 en una forma sustancialmente purificada.

El GDNF ha sido purificado y caracterizado, y las secuencias de aminoácidos parciales del material purificado han sido obtenidas. En base a la secuencia de aminoácidos parcial obtenida, se diseñaron sondas de ADN para obtener un clon de ADNc de rata que puede utilizarse en la producción recombinante de GDNF. La secuencia de ácidos nucleicos de tal clon y la secuencia de aminoácidos inferida de GDNF de rata se proporcionan en las Figs. 13 (SEC ID NO: 3) y 14 (SEC ID NO: 4).

La secuencia de aminoácidos de terminal amino de GDNF ha sido determinada, y se muestra en la Figura 8 (SEC ID NO: 1). Una porción de la secuencia de aminoácidos interna de GDNF también ha sido determinada, y se muestra en la Figura 12 (SEC ID NO: 2). El GDNF purificado tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 31-42 kD en SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras, y aproximadamente 20-23 kD en SDS-PAGE bajo condiciones reductoras. Si bien no se está limitados por tal teoría, se postula que esta información es consistente con GDNF siendo un dímero glicosilado, unido a disulfuro en su estado natural.

Según lo descrito con más detalle en el Ejemplo 6C que aparece más adelante, la expresión del gen de GDNF humano en un sistema de expresión bacteriano conduce a la producción de GDNF humano recombinante o rhGDNF. El material aislado después de la expresión es esencialmente biológicamente inactivo, y existe como un monómero. Luego del repliegue, GDNF existe como un dímero unido a disulfuro biológicamente activo. Por lo tanto, GDNF es un dímero unido a disulfuro en su forma natural, biológicamente activa. Sin embargo, esta invención incluye GDNF tanto en formas monoméricas como diméricas, y biológicamente inactivas y biológicamente activas.

Las sondas se prepararon en base a la secuencia de ácidos nucleicos de GDNF de rata a fin de clonar el gen de ADN genómico que codifica GDNF humano. El gen humano que codifica GDNF maduro, y la secuencia de aminoácidos de GDNF maduro humano son proporcionados en la Figura 19 (SEC ID NO: 5).

El GDNF también puede ser caracterizado por su capacidad de aumentar la captación de dopamina en los precursores embriónicos de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra, según lo descrito en el Ejemplo 1 que aparece más adelante. GDNF puede ser caracterizado adicionalmente por su capacidad de promover la supervivencia de células nerviosas parasimpáticas y simpáticas, según lo descrito en el Ejemplo 4 que aparece más adelante.

El GDNF puede ser caracterizado adicionalmente por su capacidad de regular hacia arriba la inmunoreactividad de tirosina hidroxilasa en cultivos mesenfálicos. Un ejemplo de esta característica se describe en el Ejemplo 1E y se muestra en la Figura 20. Adicionalmente, se ha demostrado que GDNF tiene cierta especificidad para neuronas dopaminérgicas con relación a neuronas generalmente. Por ejemplo, esto fue demostrado por el efecto limitado sobre la captación de ácido \gamma-aminobutírico (GABA) en neuronas que contienen GABA. Esto también es descrito en el Ejemplo 1E y mostrado en la Figura 21. GDNF también ha demostrado que tiene efecto limitado, si lo hay, sobre la captación de serotonina en neuronas serotonérgicas. Esto es descrito en el Ejemplo 1E y mostrado en la Figura 24.

A lo largo de esta memoria descriptiva, cualquier referencia al factor neurotrófico de origen glial debería interpretarse como refiriéndose a factores neurotróficos de cualquier origen los cuales son sustancialmente homólogos a y los cuales son biológicamente equivalentes al GDNF caracterizado y descrito en la presente memoria descriptiva. El grado de homología entre la proteína de rata y la humana es de aproximadamente 93% y todo GDNF de mamífero tendrá un grado similarmente elevado de homología. Tales GDNFs pueden existir como dímeros en su forma biológicamente activa.

La presente invención abarca formas glicosiladas y no glicosiladas de GDNF así como también las formas truncadas del GDNF natural y recombinante según lo descrito en la presente memoria descriptiva. En una realización adicional, GDNF es modificado mediante unión de uno o más polietilenglicol (PEG) u otras porciones poliméricas repetitivas. La presente invención también abarca GDNF recombinantemente producido en sistemas de expresión bacteriana que contienen un residuo metionina de terminal amino.

Por "biológicamente equivalente" como se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, queremos decir composiciones de la presente invención las cuales son capaces de demostrar cierta o la totalidad de las mismas propiedades neurotróficas en forma similar, aunque no necesariamente al mismo grado como el GDNF aislado del medio acondicionado B49. Por "sustancialmente homólogo" como se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva y reivindicaciones, se quiere decir un grado de homología al GDNF aislado del medio acondicionado B49 en exceso de aquel exhibido por cualquier GDNF previamente reportado. Preferentemente, el grado de homología está en exceso de 70%, más preferentemente en exceso de 80%, y aun más preferentemente en exceso de 90%, 95% o 99%. El porcentaje de homología según lo descrito en la presente memoria descriptiva se calcula como el porcentaje de residuos aminoácidos encontrados en la más pequeña de las dos secuencias las cuales se alinean con residuos aminoácidos idénticos en la secuencia que se está comparando cuando pueden introducirse cuatro espacios en una longitud de 100 aminoácidos para ayudar en esa alineación según lo expuesto por Dayhoff, en Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5, pág. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., incorporada específicamente en la presente memoria descriptiva como referencia. También se incluye como sustancialmente homólogo cualquier GDNF que puede ser aislado en virtud de reactividad cruzada con anticuerpos para el GDNF descrito en la presente memoria descriptiva o cuyos genes pueden ser aislados a través de hibridación con el gen o con segmentos del gen para GDNF descrito en la presente memoria descriptiva.

Un GDNF preferido de la presente invención ha sido aislado de medio acondicionado B49 y ha sido aislado en una forma sustancialmente purificada. Un GDNF preferido adicional es preparado por tecnología de ADN recombinante para producir GDNF en una forma sustancialmente purificada. Para los propósitos de la presente solicitud, "forma pura" o "forma sustancialmente purificada", cuando se utiliza para hacer referencia al GDNF descrito en la presente memoria descriptiva, significará una preparación la cual está sustancialmente libre de otras proteínas las cuales no son GDNF. Preferentemente, el GDNF de la presente invención es por lo menos 50% por ciento puro, preferentemente 75% puro y más preferentemente 80%, 95% o 99% puro. En una realización de la presente invención, la preparación de proteína GDNF es de tal forma sustancialmente purificada de modo de permitir a un experto en la técnica que determine al menos porciones de su secuencia de aminoácidos sin primero llevar a cabo pasos de purificación adicionales.

En una realización preferida de esta invención, GDNF es purificado de medio acondicionado B49 según lo descrito en el Ejemplo 1 que aparece más adelante. Naturalmente, dada la información expuesta en la presente memoria descriptiva, será evidente para los expertos en la técnica que pueden identificarse otras fuentes de GDNF, y que la purificación de GDNF de tales fuentes puede lograrse generalmente de acuerdo con el método de purificación presentado aquí.

La actividad dopaminérgica del GDNF se utiliza para facilitar el proceso de purificación. El bioensayo para las actividades neurotróficas dopaminérgicas se describe en el Ejemplo 1B que aparece más adelante. Brevemente, los cultivos de células mesenfálicas disociadas son preparados, ya sea en ambientes ricos en suero o libres de suero. Las muestras a ser ensayadas para determinar la actividad dopaminérgica son desaladas y agregadas en serie a los cultivos celulares y los platos son incubados durante 6 días a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía 6,5% de CO_{2}. Los cultivos, en presencia del material de ensayo, son luego incubados a 37ºC con dopamina tritiada (^{3}H-DA). La captación de dopamina es interrumpida, las células son lavadas, y la captación de dopamina analizada por conteo por centelleo de tritio retenido en los cultivos.

La purificación de GDNF se describe más adelante en detalle en el Ejemplo 1C. El proceso de purificación es detallado en la Tabla I. El material de partida del medio acondicionado es preparado de células de glioblastoma B49 colocando las células en medio libre de suero durante 2 días, cuando el medio acondicionado es recogido y rellenado. Este ciclo es repetido para dar 3 cosechas de medio acondicionado de cada tanda de células B49. El medio acondicionado es centrifugado y concentrado aproximadamente 10 veces antes de purificación adicional.

El primer paso de preparación de esta mezcla cruda definida en la presente memoria descriptiva como medio acondicionado de crecimiento libre de suero de glioblastoma B49, es introducir el medio acondicionado sobre una columna de Heparina Sepharose equilibrada con buffers NaPi 50 mM, pH 8,0, que contiene NaCl 0,15 N. Una solución buffer de gradiente compuesta por NaPi 50 mM, pH 8.0 que contenía NaCl 1.5 N se introduce a la columna después de estabilizarse la elución. Las fracciones de esta cromatografía se miden para actividad de GDNF, y aquellas fracciones que contienen la actividad de GDNF son agrupadas para purificación adicional.

Las fracciones agrupadas son sometidas a cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC) en una columna Superose, con un buffer disolvente de buffer NaPi 50 mM, pH 7.4, que contiene NaCl 0,5 N. Nuevamente, se determina la actividad de GDNF de las fracciones obtenidas. Luego, una única fracción de este procedimiento es acidificada y cargada sobre una columna de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa C-8 (HPLC). Las fracciones identificadas que contienen actividad de GDNF son combinadas para purificación adicional y para secuenciado de proteína. Como se muestra en la Tabla 1 que aparece más adelante, el GDNF obtenido en este punto tiene una actividad específica de aproximadamente 24.000 veces en exceso de medio acondicionado. El secuenciado de terminal amino de la proteína obtenida en este punto da la secuencia de terminal amino según se muestra en la Figura 8 (SEC ID NO: 1).

La purificación adicional del GDNF obtenido de HPLC puede lograrse llevando a cabo SDS-PAGE preparativa sobre las fracciones que contienen la actividad de GDNF. Se agregan a las fracciones que contienen proteína buffer que contiene glicerol y SDS, y la solución es operada en SDS-PAGE al 15% no reducido, con electroforesis conducido a 10ºC a 40 mA/gel durante 2 horas. Se encontrado que la porción del gel correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 30-42 kD contiene la actividad de GDNF por bioensayo. Una segunda cromatografía de HPLC del material aislado de SDS-PAGE da un solo pico de GDNF, según lo mostrado en la Figura 6.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

Las secuencias de terminal amino de GDNF fueron determinadas para el material a partir de la HPLC antes y después de SDS-PAGE preparativa. Los procedimientos utilizados para obtener las secuencias de aminoácidos de GDNF purificado son proporcionados en el Ejemplo 1D. Se obtuvo la secuencia de terminal amino con un secuenciador de proteína de fase gaseosa. Las secuencias internas se obtuvieron a partir del material obtenido mediante HPLC que no había sido adicionalmente purificado por SDS-PAGE preparativa. Se obtuvo la secuencia de aminoácidos interna incubando el GDNF purificado con tripsina. Los fragmentos de tripsina obtenidos se separaron mediante HPLC. Se descubrió que un fragmento contenía los primeros 13 residuos aminoácidos de la secuencia de terminal amino de la proteína no tratada. Se trató un segundo fragmento con CNBr, se purificó mediante HPLC, se redujo, y nuevamente se purificó sobre HPLC. La secuencia de aminoácidos obtenida se muestra en la Figura 12 (SEC ID NO: 2). Aquellas secuencias dadas entre paréntesis se determinaron hasta un pequeño grado de confianza.

Esta invención incluye el método para clonar el gen para GDNF, y el gen que fue identificado que codifica GDNF. Un procedimiento detallado para la clonación de genes de rata y humanos para GDNF se brinda más adelante en el Ejemplo 2. Nuevamente, aquellos expertos en la técnica apreciarán que otros métodos para clonar ese tipo de gen son obvios a la luz de la descripción en la presente memoria descriptiva. En particular, la clonación de genes de otras especies que codifica GDNF será obvia en vista de las descripciones y procedimientos descritos en el presente documento.

El gen de GDNF de rata descrito en el presente documento se obtuvo de una genoteca de ADNc construida de poli A+ ARN aislado de células B49, la cual se cribó con una sonda de oligonucleótidos degenerada en base a la secuencia de aminoácidos obtenida del GDNF purificado. Se obtuvo el ADNc de acuerdo con procedimientos convencionales, se trató para contener ligantes Eco-RI-digeridos, y se insertó en el vector de clonación \lambdaZap II. La sonda de hibridación utilizada fue ^{32}P-rotulada, y consistía en el siguiente oligonucleótido degenerado (SEC ID NO: 7):

100

Se obtuvieron diversos clones positivos, y se identificó positivamente un clon (\lambdaZapII76.1) por secuenciado de ADN como codificando una porción de GDNF que no se utilizó en el diseño de la sonda degenerada.

El procedimiento para obtener la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc contenido en \lambdaZapII76.1 se brinda en el Ejemplo 2B el cual aparece más adelante. Se determinó la secuencia de nucleótidos de los primeros 877 pares de bases del extremo 5' del clon de ADNc, y se muestra en la Figura 13 (SEC ID NO: 3). En la Figura 13, el clon mostrado contiene un marco de lectura abierta (ORF "open reading frame") de 227 aminoácidos que incluye el término amino de GDNF purificado y es consistente con la secuencia para un péptido interno obtenido por disociación de GDNF purificado.

La secuencia de aminoácidos inferida proporcionada en la Figura 14 (SEC ID NO: 4) muestra la secuencia de aminoácidos para el "GDNF maduro". Por "GDNF maduro", se quiere decir la secuencia del GDNF purificado obtenido del medio acondicionado B49. Naturalmente, el GDNF purificado puede existir como un dímero u otro multímero y puede ser glicosilado o químicamente modificado de otras maneras. El GDNF maduro puede ser truncado en el término carboxilo, en particular por procesamiento proteolítico de los residuos lys-arg 6 y 5 residuos del extremo terminal carboxilo. El examen de la secuencia de ácidos nucleicos del clon \lambdaZapII76.1 de rata como se muestra en la Fig. 13 (SEC ID NO: 3) sugiere que GDNF se traduce inicialmente como un polipéptido pre-pro-GDNF y que el procesamiento proteolítico de la secuencia de señal y la porción "pro" de esta molécula dan como resultado GDNF purificado que tiene la misma secuencia madura que la obtenida del medio acondicionado B49. Se postula, que el polipéptido pre-pro-GDNF comienza en el primer codón ATG -codificador de metionina- en el extremo 5' del clon (posición 50 en la Figura 13). Por consiguiente, la presente invención incluye cualquiera y la totalidad de los polipéptidos pre-pro GDNF que pueden ser traducidos del gen mostrado en la Figura 13, como así también cualquiera y la totalidad de polipéptidos pre-pro GDNF traducidos de un clon más completo que puede obtener más fácilmente por un experto en la técnica utilizando procedimientos de laboratorio estándares y el clon descrito en la presente memoria descriptiva.

La revisión de la secuencia de ácidos nucleicos de rata proporcionada en la Fig. 13 (SEC ID NO: 2) muestra que la secuencia de aminoácidos esperada ubicada entre las posiciones 518 y 538 es Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu la cual es consistente con la secuencia de aminoácidos determinada para un péptido derivado de GDNF maduro purificado mediante el proceso descrito en la sección sobre secuencia interna en el Ejemplo 1 que aparece más adelante. Un codón de detención TGA en posición 683 termina el ORF. La longitud esperada del GDNF purificado es así de 134 residuos aminoácidos, y el peso molecular esperado de este polipéptido es 14.931. Se producen dos sitios potenciales de glicosilación ligados en N en las posiciones 425 y 533. La glicosilación en cualquiera de los dos o en ambos de estos sitios aumentaría el peso molecular de la molécula.

El residuo serina en posición 281, el cual corresponde al inicio de la secuencia de GDNF maduro purificado, es precedido por la secuencia Lys-Arg la cual provee un sitio de disociación proteolítica potencial para el procesamiento de una forma precursora putativa de GDNF para producir la forma de la molécula que es purificada a partir de las células B49. Se produce un codón de iniciación translacional potencial (ATG) en posición 50 en la secuencia y es seguido cercanamente por una secuencia de señal secretora potencial. Las secuencias que flanquean este ATG muestran suficiente similitud con la secuencia de consenso Kozak (Kozak 1987 Nucleic Acids Res. 15: 125-48) para indicar que este ATG podría utilizarse como un sitio de iniciación translacional. Asimismo, este ATG es el más 5' ATG en la secuencia del clon de ADNc. Estos hechos sugieren que es un sitio de inicio potencial para la traducción de una forma precursora de GDNF.

Estas características antes señaladas de la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc de rata sugieren la posibilidad de que GDNF sea inicialmente traducido como un polipéptido pre-pro-GDNF y que el procesamiento proteolítico de la secuencia de señal y la porción "pro" de esta molécula dan como resultado la producción de la forma de GDNF que es purificada a partir del medio acondicionado de células B49. Sin embargo, la aparición de otras formas de GDNF también es consistente con los datos de las secuencias. Por ejemplo, dos inicios translacionales de ATG potenciales diferentes se producen dentro el ORF de 681 pb: uno en posición 206 y uno en 242. Estos ATGs están ubicados corriente arriba del inicio de la secuencia de terminal amino de GDNF purificado. No obstante, en eucariotes, la iniciación translacional generalmente se produce en el 5'-más ATG del ARNm (Kozak, antes mencionado) hay casos en los cuales una proporción de las iniciaciones translacionales se producen en un ATG corriente abajo. Por lo tanto, las formas precursoras alternativas de GDNF podrían surgir en forma concebible por iniciación translacional en estos codones ATG. El procesamiento proteolítico de estos polipéptidos podría dar como resultado la producción de la misma forma de GDNF purificado observada en medio acondicionado de células B49. Asimismo, el marco de lectura abierta se extiende a través del extremo 5' de la secuencia del clon de ADNc. Por lo tanto, es posible que la iniciación de la traducción ocurra en un ATG corriente arriba que no está presente en el clon de ADNc. En esta eventualidad, GDNF se traduciría como un precursor aun más grande que contiene la secuencia de aminoácidos descrita aquí y secuencia adicional corriente arriba. El procesamiento de ese tipo de forma precursora hipotética también podría conducir a la producción de la forma purificada de GDNF reportada aquí. Sería posible detectar inicios de ATG corriente arriba potenciales por secuenciado del extremo 5' del ARNm que contiene el gen GDNF por medio de la extensión de cebador con transcriptasa inversa (Maniatis y col. más arriba). Adicionalmente, podrían obtenerse otros clones de ADNc de genotecas de B49 y los extremos 5' de estos clones podrían ser secuenciados. El tamaño del ARNm 5' ubicado corriente arriba del primer ATG puede determinarse más a groso modo mediante las técnicas de "mapeo de S1" (Maniatis y col. más arriba) y/o simple selección de tamaño de los productos de extensión de cebadores de la reacción de transcriptasa inversa. Si bien puede postularse una variedad de formas putativas del producto translacional primario que contiene las secuencias que codifican GDNF purificado, la secuencia de ADN parcial presentada aquí para el clon de ADNc llevada en el fago recombinante \lambdaZapII76.1 define claramente la secuencia codificadora que constituye el polipéptido de GDNF purificado aislado del medio acondicionado de células B49.

En el Ejemplo 2C que aparece más adelante, la clonación del gen humano que codifica GDNF, es descrita. Se clasificó una genoteca genómica humana con una sonda derivada del clon de ADNc de rata descrito en el Ejemplo 2B. Se identificó un clon de ADN genómico del gen de GDNF humano y la secuencia del gen que codifica GDNF humano maduro se proporciona en la Fig. 19 (SEC ID NO: 5).

La secuencia proporcionada en la Figura 19 para el gen para GDNF humano no da la secuencia codificadora entera para la porción pre-pro de GDNF. El proceso para obtener la secuencia codificadora para los primeros 50 aminoácidos de GDNF pre-pro humano se describe más abajo en el Ejemplo 2D. La secuencia obtenida se proporciona en la Figura 22 (SEC ID NO: 8). El mapa de plásmido pB55K-\lambda3Alu1 utilizado para obtener la secuencia es como se muestra en la Figura 23.

Esta invención incluye secuencias de ácidos nucleicos que codifican GDNF. En la presente memoria descriptiva se proporcionan secuencias relativamente altamente homólogas que codifican para GDNF de rata (Fig. 13) (SEC ID NO: 3) y humana (Fig. 19) (SEC ID NO: 5). También se incluye dentro del alcance de esta invención secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente similares que codifican para las mismas secuencias de aminoácidos o altamente homólogas. Por ejemplo, cuando se prepara una construcción para la expresión de GDNF maduro en un sistema de expresión bacteriana tal como E. coli, ciertos codones en la secuencia de ácidos nucleicos dadas en la Fig. 19 (SEC ID NO: 5) pueden ser sustituidas con codones más fácilmente expresados en E. coli de acuerdo con procedimientos bien conocidos y estándares. Ese tipo de secuencias de ácidos nucleicos modificadas serían incluidas dentro del alcance de esta invención.

Las secuencias de ácidos nucleicos específicas pueden ser modificadas por aquellos expertos en la técnica. Por lo tanto, esta invención también incluye todas las secuencias de ácidos nucleicos las cuales codifican las secuencias de aminoácidos para GDNF de rata maduro y humano maduro según lo expuesto en las Figuras 14 (SEC ID NO: 4) y 19 (SEC ID NO: 5), y GDNF de rata pre-pro según lo expuesto en la Figura 13 (SEC ID NO: 3) y para GDNF humano pre-pro según lo expuesto en las Figuras 19 (SEC ID NO: 5) y 22 (SEC ID NO: 8). La presente invención también incorpora secuencias de ácidos nucleicos las cuales se hibridan con todas dichas secuencias de ácidos nucleicos -o los complementos de las secuencias de ácidos nucleicos donde fuese apropiado- y codifican un polipéptido que tiene actividad dopaminérgica. La presente invención también incluye secuencias de ácidos nucleicos las cuales codifican polipéptidos que tienen actividad dopaminérgica y que son reconocidos por anticuerpos que se unen a GDNF.

La presente invención también abarca vectores que comprenden elementos reguladores de la expresión operativamente ligados a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos incluidas dentro del alcance de la invención. Esta invención también incorpora células huéspedes -de cualquier variedad- que han sido transformadas con vectores que comprenden elementos reguladores de la expresión ligados operativamente a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos incluidas dentro del alcance de esta invención.

La expresión de GDNF en células COS se describe más adelante en el Ejemplo 5. El gen que codifica GDNF ilustrado en la Figura 13 se subclonó en el vector plásmido pSG5, un vector diseñado para la expresión transitoria de células de genes clonados tales como células COS. Los plásmidos que contienen el gen GDNF en la orientación apropiada e inapropiada se seleccionaron y el ADN fue transfectado en células COS-7. Luego del cultivo, se recolectaron las células transformadas. El medio acondicionado COS-7 se ensayó para determinar la bioactividad en el ensayo dopaminérgico y el ensayo de neuronas de ganglios simpáticas. El medio acondicionado de las células que contienen el gen para GDNF en la orientación apropiada se descubrió que tenía actividad biológica en ambos ensayos, lo cual indica que GDNF biológicamente activo había sido exitosamente producido mediante procesos de ADN recombinante.

En una realización preferida de la presente invención, se prepara GDNF maduro humano mediante tecnología de ADN recombinante en un sistema de expresión bacteriana.

La expresión de GDNF humano en E. coli se describe más adelante en el Ejemplo 6. La porción del gen de GDNF humano que codifica GDNF humano maduro como se muestra en la Figura 19, se utilizó para preparar una construcción de GDNF humano. Tal construcción se ligó en un vector plásmido, el cual se transformó en la cepa JM107 de E. coli. Después del cultivo de las células huéspedes transformadas, el GDNF producido fue recogido. Una proteína del peso molecular esperado para GDNF humano maduro (aproximadamente 15.000 daltons) fue obtenida, y el secuenciado de termina amino confirmó que la proteína obtenida era GDNF humano maduro.

El repliegue y naturalización de GDNF humano expresado en E. coli se describe más adelante en el Ejemplo 6C. En la realización de la invención descrita, el extracto que contiene proteína expresado obtenido fue parcialmente purificado antes del repliegue por cromatografía de intercambio iónico sobre resina S-Sepharose Fast Flow. El repliegue se consiguió agregando: en primer lugar ditiotreitol, luego sal disódica de glutationa, luego un buffer de repliegue al extracto que contenía el GDNF. El rhGDNF replegado fue sustancialmente completamente activo desde el punto de vista biológico y existía como un dímero unido a disulfuro en su forma activa desde un punto de vista biológico. El GDNF antes del repliegue -y después de reducción del material replegado- existió en un estado monomérico y fue sustancialmente inactivo desde un punto de vista biológico.

El GDNF también puede ser producido mediante la expresión en otros sistemas de expresión. Por ejemplo, con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica GDNF humano maduro como se muestra en la Figura 19, un experto en la técnica podría producir GDNF en otros sistemas de expresión. Los vectores que contenían la secuencia de ácidos nucleicos que codifica GDNF ligada operativamente a elementos reguladores de la expresión pueden ser transformados en otras células huéspedes de microorganismos incluyendo Bacillus, Pseudomonas y levadura. Los sistemas de expresión de baculovirus también pueden ser empleados.

Como se señaló anteriormente, la presente invención se refiere a métodos para tratar el daño a los nervios en pacientes que sufren del mismo. Estos métodos comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor neurotrófico de origen glial humano (GDNF) a un paciente que sufre de daño a los nervios.

Se considera que una enfermedad o indicación médica es un daño a los nervios si la supervivencia o función de las células nerviosas y/o sus procesos axonales se encuentran comprometidos. En una realización preferida, tal daño a los nervios se produce como resultado de una de las siguientes condiciones: 1) Lesión física, la cual causa la degeneración de los procesos axonales y/o cuerpos de células nerviosas cerca del sitio de la lesión; 2) Isquemia, como en el accidente cerebrovascular; 3) Exposición a neurotoxinas, tales como los agentes quimioterapéuticos para el cáncer o el SIDA cisplatino y didesoxicitidina (ddC), respectivamente; 4) Enfermedades metabólicas crónicas, tales como diabetes o disfunción renal; y 4) Enfermedades neurodegenerativas tales como el mal de Parkinson, mal de Alzheimer y Esclerosis Lateral Amiotrófica (ALS), las cuales causan la degeneración de poblaciones neuronales específicas. Una lista no exclusiva de afecciones que involucran el daño a los nervios incluye, el mal de Parkinson, mal de Alzheimer, Esclerosis Lateral Amiotrófica, Accidente Cerebrovascular, Polineuropatía Diabética, Neuropatía Tóxica causada por los agentes quimioterapéuticos para el cáncer taxol o cisplatina o vincristina, Neuropatía Tóxica causada por los agentes quimioterapéuticos para el SIDA ddI o ddC, y daño físico al sistema nervioso tal como aquel causado por lesión física del cerebro y médula espinal o lesiones de corte o choque al brazo y a la mano.

Los métodos para producir GDNF son también descritos en la presente memoria descriptiva. Un método descrito consiste en aislar GDNF de diversas fuentes, tal como medio acondicionado de líneas celulares gliales. Un segundo método involucra aislar los genes responsables de la codificación de GDNF, clonación del gen en vectores adecuados y tipos celulares, y expresar el gen a fin de producir el GDNF. El método último mencionado, el cual es ejemplar de los métodos de ADN recombinante en general, es un método preferido de la presente invención. Los métodos de ADN recombinante son preferidos en parte debido a que son capaces de lograr cantidades comparativamente superiores de proteína a mayor pureza. El GDNF recombinante es la proteína más preferida para la preparación de composiciones terapéuticas y para el tratamiento del daño a los nervios.

Esta invención incluye medios para identificar y clonar genes que codifican proteínas que comparten homología de secuencias de aminoácidos con GDNF, como así también todas las proteínas identificadas.

Una familia de genes de mamífero compuesta por tres factores neurotróficos ha sido descrita (Leibrock y col. 1989 Nature 341: 149- 152, Maisonpierre y col. 1990 Science 247: 1446-1451). Las formas maduras de las tres proteínas que comprenden esta familia [factor del crecimiento nervioso (NGF "nerve growth factor"), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF "brain derived neurotrophic factor") y neurotrofina-3 (NT-3)] comparten \sim50% de identidad de aminoácidos entre sí. Las posiciones de los seis residuos cisteína presentes en cada una de estas proteínas son conservadas en forma precisa. Si bien son estructuralmente similares, estas tres proteínas exhiben distribuciones de tejido diferentes (Ernfors y col. 1990 Neuron 5:511-526, Maisonpierre y col. 1990 Neuron 5: 501-509, y Phillips y col. 1990 Science 250: 290-294) y diferentes actividades in vitro (Rosenthal y col. 1990 Neuron 4: 767-773, Whittemore y col. 1987 Brain Res Rev 12: 439).

El GDNF no exhibe homología significativa a cualquier proteína previamente descrita aunque genes no identificados pueden existir que codifican proteínas que tienen homología de secuencias de aminoácidos sustancial a GDNF y los cuales podrían funcionar in vivo como factores neurotróficos con diferentes patrones de distribución específica de tejidos y/o diferentes espectros de actividades. Ese tipo de proteínas constituiría miembros de la familia de GDNF de factores neurotróficos. Las secuencias de ADN para los genes de GDNF de rata y humano, presentadas en las Figuras 13 (SEC ID NO: 3) y 19 (SEC ID NO: 5) y 22 (SEC ID NO: 8) respectivamente, podrían utilizarse para identificar nuevos miembros de ese tipo de "familia de genes de GDNF".

Como consecuencia de la conservación de secuencia de aminoácidos entre los productos proteicos de los miembros de una familia de genes tal como la "familia de genes de NGF" antes señalado o la "familia de genes de GDNF", hay una conservación considerable de secuencia en el nivel de ADN. Por consiguiente, bajo condiciones de hibridación apropiadas, la "hibridación cruzada" de ácidos nucleicos puede producirse entre genes dentro de la familia, es decir, una sonda de ácidos nucleicos derivada de la secuencia de uno de los miembros de la familia formará una molécula dúplex híbrida estable con moléculas de ácidos nucleicos de diferentes miembros de la familia los cuales tienen secuencias relacionadas, aunque no idénticas, a la sonda (Beltz y col. 1983 Methods in Enzymology 100: 266-285). Por lo tanto, se puede seleccionar genes relacionados por homología de secuencias a GDNF preparando sondas de ADN (o ARN) únicas o degeneradas en base a la secuencia de GDNF de la especie de rata, humana o cualquier otra especie y llevando a cabo experimentos de hibridación con una variedad de ADNs objetivo (o ARNs) en condiciones que permitirán la formación estable de dúplex de ácidos nucleicos apareados de manera imperfecta.

Tales condiciones de hibridación, a menudo denominadas "severidad reducida" son bien descritas en la bibliografía (Beltz y col., más arriba, Sambrook y col. 1989 Molecular Cloning, 2da edición, Cold Spring Harbor Press) e involucran más frecuentemente la reducción de la temperatura de la reacción de hibridación cuando se lleva a cabo en solución acuosa y/o reducción de la concentración de formamida en sistema de hibridación que normalmente emplean soluciones que contienen 50% de formamida. Otros medios para reducir la severidad de la hibridación también han sido descritos y podrían emplearse (Sambrook y col., más arriba). Los objetivos de ácido nucleico en estos experimentos de hibridación podrían incluir:

1) Genotecas de ADN genómico que contienen especie humana, rata o cualquier otra especie mamífera, o cualquier otra especie de ADN clonado en cualquier vector conveniente incluyendo bacteriófagos, plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales de levadura, o cualquier otro tipo de vector;

2) Genotecas de ADNc generadas de ARN de cualquier tipo de tejido obtenido de cualquiera de los organismos antes señalados u obtenido de cultivo de cualquier tipo de célula primaria obtenida de cualquiera de los organismos antes señalados, o de cualquier tipo de línea celular estable actualmente existente o producida de cualquier cultivo celular primario;

3) ADNs genómicos según lo descrito en el ítem # 1 anterior los cuales son digeridos con enzimas de restricción y son preparados para análisis de Southern blot por electroforesis en gel y transferencia sobre un soporte sólido;

4) ARNs según lo descrito en el ítem # 2 anterior los cuales son sujetos a electroforesis y transferencia a un soporte sólido para análisis de Northern blot. Tales ARNs podrían incluir ARN celular total o fraccionado, poli A+ ARN.

5) Productos de reacciones en cadena de polimerasa (PCR "polymerase chain reactions") las cuales emplean cebadores de oligonucleótidos en base a secuencias que ocurren en GDNF y que emplean como patrones cualquiera de las fuentes de ácidos nucleicos descritas en los ítems #1 a 4.

Cualquier secuencia de ácidos nucleicos la cual se demuestra que se hibrida a una sonda basada en GDNF bajo cierto conjunto empíricamente determinado de condiciones de hibridación puede ser clonada y secuenciada por cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas por un experto en la técnica y el grado de homología de secuencias puede ser determinado directamente para identificar miembros de una familia de genes de GDNF. Ese tipo de método de hibridación se utilizó para clonar NT-3 por screening (método de selección) con una sonda en base a la secuencia de NGF (Kaisho y col. 1990 FEBS Letters 266: 187-191).

Un método alternativo para identificar miembros de la familia de GDNF involucra el uso de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar secuencias de los miembros de la familia de GDNF seguido por clonación y análisis de secuencias amplificadas. Los cebadores de oligonucleótidos degenerados (o no degenerados) para PCR pueden ser sintetizados en base a la secuencia de GDNF. Dada la conservación de la ubicación de cisteína y la conservación de secuencias de aminoácidos en la vecindad inmediata de los residuos cisteína que se observa para la familia de NGF, las regiones alrededor de las cisteínas en GDNF maduro representan candidatos obvios para la síntesis de cebadores aunque también podrían seleccionarse una variedad de otros cebadores tanto de las porciones maduras como pre-pro de la proteína. Las reacciones de PCR pueden llevarse a cabo en condiciones de temperatura de hibridación ("annealing") reducida las cuales permitirían la amplificación de no solo la secuencia de GDNF sino de las secuencias de cualquiera de los miembros de la familia de GDNF. Ver, Innis y col. 1990 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press. Los productos de ese tipo de reacciones de PCR pueden seleccionarse por tamaño mediante electroforesis en gel, pueden ser clonados en un vector apropiado y el ADN clonado puede ser secuenciado para identificar miembros de la familia de GDNF. Alternativamente, los clones pueden ser primero sometidos a screening por hibridación a una sonda específica para GDNF en condiciones de alta severidad para identificar clones de GDNF. Cualquier clon que no se hibride a GDNF bajo alta severidad luego sería secuenciado o tales clones podrían ser hibridados a una sonda de GDNF en condiciones de severidad reducida y cualquier clon que se hibridó a la sonda de GDNF bajo estas condiciones sería luego secuenciado.

Un segundo método que utiliza PCR para clonación de miembros de la familia de GDNF sería etiquetar los productos de la reacción de PCR antes descrita y utilizar aquellos productos como una sonda para seleccionar objetivos de ácido nucleico antes enumerados bajo condiciones de alta y/o baja severidad. La hibridación de clones o segmentos nucleicos podría analizarse según lo antes detallado para identificar clones de GDNF y miembros de la familia. Ese tipo de método ha sido utilizado para clonar NT-3 en base a las secuencias de NGF y BDNF (Maisonpierre y col. 1990 Science 247: 1446- 1451).

En una realización preferida de la presente invención, una composición terapéutica o farmacéutica que comprende GDNF se administra en una cantidad efectiva a pacientes que sufren de daño a los nervios. En una realización preferida de la presente invención, GDNF se utiliza terapéuticamente para tratar pacientes que sufren del mal de Parkinson. Los expertos en la técnica conocen la variedad de ensayos disponibles para indicar aquellas neuronas que responderían al tratamiento con GDNF, y la determinación de otras neuronas receptivas a GDNF podría efectuarse sin indebida experimentación. Un experto en la técnica podría determinar fácilmente si el mensaje para GDNF es expresado a lo largo de todo el cuerpo y cuales son los niveles de proteína GDNF en cada una de esas regiones. Un experto en la técnica también podría determinar la ubicación de los sitios de unión para GDNF a lo largo de todo el sistema nervioso. Esta información permitiría al experto en la técnica determinar los tipos neuronales que probablemente responderían a GDNF, los cuales a su vez sugieren las indicaciones clínicas apropiadas para esta proteína. El cultivo celular adecuado y los experimentos en animales luego podrían llevarse a cabo para determinar la probabilidad de que GDNF fuera de utilidad en el tratamiento de ese tipo de indicaciones.

El GDNF purificado aislado de medio acondicionado B49 también ha demostrado promover la supervivencia de las células nerviosas parasimpáticas y simpáticas en cultivos. Estos resultados son descritos en detalle en el Ejemplo 4.

Debido a que es posible que la función neurotrófica de GDNF es impartida por uno o más porciones discretas y separables, también se prevé que el método de la presente invención podría ser practicado administrando una composición terapéutica cuyo componente activo consiste en esa porción (o aquellas porciones) de GDNF que controla (o controlan) la función neurotrófica de GDNF.

La composición terapéutica o farmacéutica de la presente invención se administra, preferentemente, parenteralmente por inyección o directamente en el fluido espinal cerebral (CSF "cerebral spinal fluid") por infusión continua de una bomba implantada. Asimismo, otras formas de administración efectivas, tales como formulaciones de liberación lenta parenterales, vapores inhalantes, formulaciones oralmente activas, o supositorios son también contempladas. Asimismo, se contempla la administración con relación a uno o más agentes capaces de promover la penetración de GDNF a través de la barrera de sangre-cerebro. Un vehículo preferido es solución salina fisiológica, aunque se contempla que también pueden utilizarse otros portadores aceptables desde el punto de vista farmacéutico, tales como CSF artificial. En una realización preferida se contempla que el portador y el GDNF constituyen una formulación de liberación lenta, fisiológicamente compatible. El disolvente primario en ese tipo de portador puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Adicionalmente, el portador puede contener otros excipientes farmacológicamente aceptables para modificar o mantener el pH, la osmolaridad, viscosidad, claridad, color, esterilidad, estabilidad, índice de disolución, u olor de la formulación. Similarmente, el portador puede contener aun otros excipientes farmacológicamente aceptables para modificar o mantener la estabilidad, índice de disolución, liberación o absorción o penetración a través de la barrera de sangre- cerebro del GDNF. Ese tipo de excipientes son aquellas sustancias usualmente y habitualmente empleadas para formular dosificaciones para la administración parenteral en forma de dosis unitaria o en múltiples dosis para infusión directa en el CSF por infusión continua o periódica desde una bomba implantada.

Una vez que la composición terapéutica ha sido formulada, puede ser almacenada en frascos estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o liofilizado. Ese tipo de formulaciones puede ser almacenado ya sea en una forma lista para ser utilizada o que requiere la reconstitución inmediatamente antes de la administración. El almacenamiento preferido de ese tipo de formulaciones es a temperaturas de por lo menos tan bajas como 4ºC y preferentemente a -70ºC.

Preferentemente, la manera de parenteralmente administrar las formulaciones que contienen GDNF es por medio de una ruta subcutánea, intramuscular, intratecal o intracerebral. Para lograr la dosis deseada de GDNF, pueden administrarse inyecciones repetidas diariamente o subcutáneas o intramusculares menos frecuentes, o puede ser infundido el GDNF en forma continua o periódica desde una bomba implantada. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de GDNF en la formulación y ruta de administración utilizada.

Para lograr la dosis deseada de GDNF a células dopaminérgicas y otras células nerviosas dañadas cuyos cuerpos celulares están dentro del cerebro y la médula espinal, se contempla que GDNF sea administrado en el espacio subaracnoideo del cerebro o de la médula espinal o intracerebroventricularmente. La administración puede ser continua o periódica y puede lograrse mediante una bomba implantable de flujo constante o programable o por inyecciones periódicas. La administración también puede efectuarse conjuntamente con agentes que permiten que el GDNF penetre la barrera de sangre- cerebro.

También se contempla que ciertas formulaciones que contienen GDNF deben ser administradas oralmente. Preferentemente, GDNF el cual es administrado de esta manera es encapsulado. El GDNF encapsulado puede ser formulado con o sin aquellos portadores habitualmente utilizados en el mezclado de formas de dosificación sólidas. Preferentemente, la cápsula está diseñada de modo que la porción activa de la formulación sea liberada en ese punto en el tracto gastrointestinal cuando se aumenta al máximo la biodisponibilidad y se reduce al mínimo la degradación pre-sistémica. Pueden incluirse excipientes adicionales para facilitar la absorción de GDNF. También pueden emplearse diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de la suspensión, agentes de la desintegración de las tabletas, y aglutinantes.

Sin importar la forma de administración, la dosis específica se calcula de acuerdo con el peso corporal aproximado o el área de superficie corporal del paciente. Otro refinamiento de los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada para el tratamiento que involucra cada una de las formulaciones antes mencionadas son efectuados en forma rutinaria por los expertos en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas llevadas a cabo en forma rutinaria por ellos son indebida experimentación, especialmente a la luz de la información de la dosificación y de los ensayos descritos en la presente memoria descriptiva. Estas dosificaciones pueden ser discernidas a través del uso de los ensayos establecidos para determinar las dosificaciones utilizadas conjuntamente con datos de dosis- respuesta apropiados.

En una realización de esta invención, GDNF puede ser administrado terapéuticamente implantando en células de pacientes capaces de sintetizar y secretar una forma biológicamente activa de GDNF. Tales células productoras de GDNF pueden ser células que son productoras naturales de GDNF (análogas a las células B49) o podrían ser células cuya capacidad de producir GDNF ha sido aumentada por transformación con el gen de GDNF en una forma adecuada para promover su expresión y secreción. A fin de minimizar una potencial reacción inmunológica en pacientes de la administración del GDNF de una especie extraña, se prefiere que las células productoras de GDNF naturales sean de origen humano y produzcan GDNF humano. Asimismo, se transformarían células para expresar GDNF humano utilizando una construcción de expresión que codifica GDNF humano mediante métodos análogos a aquellos utilizados en los Ejemplos 5 y 6 que aparecen más adelante.

Las células capaces de secretar en forma natural GDNF humano pueden ser identificadas utilizando las siguientes herramientas: (1) Oligonucleótidos que representan una porción del ARN mensajero para GDNF humano o complementario a una porción del ARN mensajero para GDNF humano puede utilizarse para descubrir líneas celulares que producen el mensaje de GDNF humano por análisis de Northern blot, protección de RNasa, hibridación in situ, la Reacción en Cadena de Polimerasa, u otros métodos relacionados; o (2) pueden utilizarse anticuerpos policlonales o monoclonales que reconocen GDNF humano para descubrir líneas celulares cuyos extractos o medio de cultivo acondicionado contienen proteína GDNF por análisis de Western blot, ensayo ELISA, ensayo radioinmunológico u otros métodos relacionados. Una estrategia preferida consiste en seleccionar el medio de cultivo acondicionado de una serie de células de origen humano con anticuerpos de GDNF humano mediante los métodos de (2) anterior para descubrir células que secretan GDNF en su medio de cultivo. La confirmación del GDNF así producido vendría de purificación y análisis de secuencias de aminoácidos, según la llevada a cabo con el GDNF producido mediante células B49 y secretadas en su medio de cultivo. El Ejemplo 7 que aparece más adelante describe la producción y aislamiento de anticuerpos de GDNF recombinante humano.

Las células que secretan naturalmente o células transformadas para secretar GDNF humano pueden utilizarse para tratar pacientes. Las células humanas o animales no humanas pueden ser implantadas en pacientes en encerramientos poliméricos semi-permeables para permitir la liberación de GDNF, aunque evitan la destrucción de las células por el sistema inmunológico del paciente. Alternativamente, las propias células del paciente, transformadas para producir GDNF ex vivo, podrían ser implantadas directamente en el paciente sin ese tipo de encapsulación.

La metodología para la encapsulación de membrana de células vivientes es conocida por los expertos en la técnica y la preparación de las células encapsuladas y su implantación en pacientes puede lograrse sin indebida experimentación. Ver, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4.892.538; 5.011.472; y 5.106.627, cada una de las cuales se incorpora en forma específica en la presente memoria descriptiva como referencia. Un sistema para encapsular células vivientes se describe en la Solicitud PCT WO 91/10425 de Aebischer y col., se incorpora específicamente en la presente memoria descriptiva como referencia. Ver además, Solicitud PCT WO 91/10470 de Aebischer y col.; Winn y col. 1991 Exper. Neurol. 113: 322-329; Aebischer y col. 1991 Exper. Neurol. 111: 269-275; Tresco y col. 1992 ASAIO 38: 17-23, cada uno de los cuales se incorpora específicamente en la presente memoria descriptiva como referen-
cia.

En particular, las células que secretan GDNF pueden ser implantadas en pacientes con el mal de Parkinson en el striátum para proveer GDNF a los campos terminales de neuronas dopaminérgicas nigrales y en la sustancia nigra para proveer GDNF a los cuerpos celulares dopaminérgicos. Tal GDNF localmente aplicado promovería la germinación ("sprouting") y reinervación del striátum por terminales dopaminérgicas y evitaría o alentaría la degeneración adicional de las células nerviosas dopaminérgicas.

Por consiguiente, la presente invención incluye un método para prevenir o tratar el daño a los nervios implantando células en el cuerpo de un paciente que lo necesita; ese tipo de células ya sea seleccionadas por su capacidad natural de generar GDNF o construidas para secretar GDNF. Preferentemente, el GDNF secretado es GDNF maduro humano cuando es paciente es humano.

Cabe señalar que las formulaciones de GDNF descritas en la presente invención pueden utilizarse para veterinaria como así también aplicaciones humanas y que el término "paciente" no debe ser interpretado en forma limitativa. En el caso de aplicaciones veterinarias, los rangos de dosificación deberían ser iguales a los especificados anteriormente.

Cabe destacar que la aplicación de las enseñanzas de la presente invención a un problema o ambiente específico estará dentro de las capacidades de un experto en la técnica a la luz de las enseñanzas contenidas en la presente memoria descriptiva. Ejemplos de usos representativos de la presente invención aparecen en los siguientes ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1 Purificación y secuenciado de GDNF

Este ejemplo describe métodos para el bioensayo y purificación de GDNF. También describe métodos para preparar el medio acondicionado de línea celular B49 que es el material de partida para la purificación. Los métodos para obtener una secuencia de aminoácidos de GDNF purificado y secuencias de aminoácidos parciales obtenidas a partir de la proteína purificada son también descritos.

A. Materiales

Las ratas preñadas en el tiempo eran de Zivie Miller lab, Allison Park, PA. A menos que se especifique lo contrario, todos los reactivos eran de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.

B. Bioensayo para actividades neurotróficas dopaminérgicas

Condiciones de cultivo: Se prepararon cultivos de células mesenfálicas disociadas según lo descrito previamente (Friedman y Mytilineou 1987 Neurosci. Lett. 79: 65- 72), con modificaciones menores. Brevemente, tegumento mesencefálico rostrado de cerebros de embriones de ratas Sprague-Dawley, al décimo sexto día de gestación, se cortaron en pedazos bajo el microscopio en condiciones estériles, se recogieron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco libre de Ca^{2+} - y Mg^{2+}- (Gibco, Gaithersburg, MD) y se cortaron en pedazos mecánicamente por leve trituración. Las células se colocaron en placas en 100 ul por pocillo sobre pocillos de cultivo de tejido de 16 mm de diámetro (Falcon, Lincoln Park, NJ, placa de 24 pocillos) que contienen 400 ul de medio para dar una densidad de 2,5-3,5 x 10^{5} células por pocillo. Los pocillos de cultivo habían sido previamente expuestos a 0,1 mg/ml de solución de poli L-ornitina en borato de sodio 10 mM, pH 8,4, durante 3 horas a 37ºC, se lavó 3 veces en milli-Q H_{2}O y una vez en solución salina equilibrada de Earle (Gibco). El medio de alimentación (10/10) consistía en medio esencial mínimo (MEM, Gibco) suplementado con glucosa (33 mM), bicarbonato de sodio (24,5 mM), glutamina (2 mM), HEPES (15 mM), penicilina G (5 U/ml), estreptomicina (5 ug/ml), 10% suero de ternero fetal inactivado térmicamente (Gibco) y 10% suero de caballo inactivado térmicamente (Gibco). Los cultivos se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera saturada con agua que contiene 6,5% de CO_{2}. Después de 3 horas, cuando la mayoría de las células se habían adherido al fondo del pocillo, el medio fue reemplazado con 500 ul de medio nuevo. En este momento, una dilución serial de la muestra a ser ensayada para determinar la actividad de GDNF se agregó a cada pocillo por duplicado y las placas se incubaron en el incubador a 37ºC. Después de una semana, los cultivos se trataron durante 24 horas con fluordesoxiuridina (13 ug/ml) y uridina (33 ug/ml) para evitar la proliferación glial excesiva y posteriormente se introdujeron con el medio antes mencionado sin suero de ternero fetal. El medio de alimentación fue cambiado semanalmente.

Alternativamente, se utilizó medio libre de suero químicamente definido en el cual el suero fue reemplazado con una mezcla de proteínas; hormonas y sales. El medio definido (DM) consistía en una mezcla de MEM y mezcla nutriente F12 (ambos de Gibco; 1:1; vol/vol) con glucosa (33 mM), glutamina (2 mM), NaHCO_{3} (24,5 mM), HEPES (15 mM), suplementado con transferrina (100 ug/ml), insulina (25 ug/ml), putrescina (60 uM), progesterona (20 nM), selenita de sodio (30 nM), penicilina G (5 U/ml) y estreptomicina (5 ug/ml). Se ajustó la osmolaridad del DM hasta 325 mediante la adición de H_{2}O milli-Q (110-125 ml H_{2}O/l). Con el uso de DM, pocas células no neuronales eran evidentes, mediante morfología o por tinción para proteína ácida fibrilar glial (GFAP, "glial fibrillary acidic protein"), la cual es una proteína citoesquelética específica de astrocitos. GDNF es activo en la estimulación de la captación de dopamina tanto en medio que contiene suero como en medio definido. Todos los ensayos alcanzados en los siguientes ejemplos se realizaron en medio que contiene suero.

El estado funcional de las neuronas dopaminérgicas puede ser ensayado en estos cultivos midiendo la captación de dopamina a través de los transportadores "depuradores" específicos en las neuronas dopaminérgicas y contando la cantidad de neuronas positivas para la enzima sintética de dopamina tirosina hidroxilasa utilizando inmunohistoquímica. La posibilidad de contaminación significativa de los cultivos con las neuronas noradrenérgicas, las cuales también pueden transportar dopamina y también contienen tirosina hidroxilasa, se descartó por la cuidadosa división y demostrando que los transportadores de dopamina tienen el perfil farmacológico característico de neuronas dopaminérgicas, más que de las neuronas noradrenérgicas. La captación de dopamina en estos cultivos es inhibida por GBR12909, un inhibidor del transportador de monoamina en neuronas dopaminérgicas, con un ED_{50} de 20 nM. En contraste, al menos 300 veces más desipramina, un inhibidor de transportador de monoamina o neuronas noradrenérgicas, se requiere para inhibir la captación de dopamina en sus cultivos. Estos valores son aquellos que han sido reportados para el transportador de monoamina en neuronas dopaminérgicas.

Preparación de muestras: Antes de ensayarse para determinar la actividad neurotrófica dopaminérgica en los cultivos de células mesencefálicas, todas las muestras generadas del Paso 1 al Paso 3 de purificación (ver Sección C más adelante) se desalaron de la siguiente manera. 100 ul del medio 10/10 (como un portador) se agregaron a un Centricon-10 (Amicon) y se dejó asentar durante 10 minutos. Se agregaron las alícuotas de la muestra a ser ensayada al Centricon, seguido por 1 ml de medio Eagle Modificado de alto contenido de glucosa de Dulbecco, sin bicarbonato, aunque conteniendo HEPES 10 mM, pH 7.2 (solución A), y se centrifugó a 5.000 xg durante 70 minutos. El material retenido (aproximadamente 0,1 ml) se llevó nuevamente a 1,1 ml con solución A fresca y se reconcentró dos veces. La muestra se filtró a través de una unidad Durapore estéril Ultrafree-MC 0,11 um (Millipore, Bedford MA) antes de ser agregada al pocillo de cultivo.

Captación de ^{3}H-dopamina: La captación de dopamina tritiada (^{3}H-DA) se llevó a cabo en cultivos al día 6 o día 7 según lo descrito previamente (Friedman y Mytilineou (1987) Neurosci. Lett. 79: 65-72) con modificaciones menores, y todas las soluciones se mantuvieron a 37ºC. Brevemente, se eliminó el medio de cultivo, se enjuagó dos veces con 0,25 ml del buffer de captación el cual consiste en buffer de fosfato de Krebs-Ringer, pH 7.4, que contenía glucosa 5.6 mM, EDTA 1,3 mM, ácido ascórbico 0,1 mM y pargilina 0,5 mM, un inhibidor de monoamina oxidasa. Los cultivos se incubaron con 0,25 ml de ^{3}H-DA (New England Nuclear, Boston, MA sp. act 36-37 Ci/mmol) durante 15 minutos a 37ºC. Se detuvo la captación de ^{3}H-DA eliminando la mezcla de incubación y las células luego se lavaron dos veces con 0,5 ml del buffer de captación. A fin de liberar ^{3}H-DA de las células, los cultivos se incubaron con 0,5 ml de etanol al 95% durante 30 min a 37ºC, y luego se agregaron a 10 ml de EcoLite (ICN, Irvine, CA) y se contaron en un contador de centelleo. Se obtuvieron los valores blanco agregando al buffer de captación GBR-12909 (RBI) 0,5 mM, un inhibidor específico de la bomba de captación de alta afinidad de las neuronas de dopamina (Heikkila y col. 1984 Euro J. Pharmacol. 103: 241-48) y generalmente eran inferiores al 5% de la captación de ^{3}H-DA en cultivos control no tratados. La cantidad de unidades tróficas (UT) de actividad de GDNF se definió como la cantidad recíproca de la dilución que dio 50% de estimulación máxima de la captación de ^{3}H-DA del cultivo. La actividad específica se determinó dividiendo la cantidad de UTs por la cantidad de proteína presente en la muestra.

C. Purificación de GDNF

Material de partida: Células de glioblastoma B49 obtenidas de D. Schubert, Salk Institute, La Jolla, CA. (Ver Schubert y col. 1974 Nature 249: 224-27) se cultivaron hasta confluencia en medio DMEM que contenía 10% suero de ternero fetal, glutamina 4 mM, 50 U/ml de penicilina-G y 50 ug/ml de estreptomicina en frascos de cultivo (225 cm^{2}, Costar, Cambridge, MA). El medio acondicionado de crecimiento libre de suero (CM) se preparó lavando el cultivo una vez con 10 ml de medio libre de suero y luego se colocó las células en 50 ml por frasco de medio libre de suero durante 2 días. Se recogió CM y las células se rellenaron con medio libre de suero fresco cada 2 días de allí en más hasta el día 6. El CM combinado de 3 cosechas de cada tanda de células se centrifugó a 5000 xg durante 20 min a 4ºC para eliminar las células y los desechos. El sobrenadante se concentró aproximadamente 10 veces por medio de concentrador Amicon (membrana YM10) y se centrifugó a 40.000 xg durante 20 minutos a 4ºC. El sobrenadante se filtró a través de Cápsula de Micro Cultivo 0,2 u (Gelman Sciences) y se pudo almacenar a 4ºC durante hasta un mes.

Paso 1

Cromatografía de Heparina Sepharose

La preparación antes mencionada (200 mg de proteína) se cargó sobre una columna (1 x 25 cm) de Heparina Sepharose CL-6B (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada con buffer NaPi 50 mM, pH 8,0, que contenía NaCl 0,15 N (buffer A). Luego, la columna se lavó con el mismo buffer hasta que la densidad óptica a 280 nm (D.O._{280}) del efluente regresó a la línea de base y eluyó con un gradiente lineal de 100 ml que va desde el buffer A en NaPi 50 mM, pH 8,0, que contenía NaCl 1,5 N (buffer B). Se recogieron fracciones de dos ml. Las fracciones se analizaron para determinar la conductividad y la actividad de GDNF. La Figura 1 muestra ese tipo de cromatografía. El perfil de proteínas eluidas es trazado como D.O._{280}. Se superponen trazados de la conductividad y actividad de GDNF medida en cada fracción. Las fracciones indicadas por la barra con actividad de GDNF pico (NaCl alrededor de 0,6 - 0,8 N) se agruparon para más análisis.

Paso 2

Cromatografía Superose de FPLC

Se concentró el grupo antes mencionado hasta 0,4 ml por medio de concentrador Amicon (Amicon, Beverly, MA, membrana YM10) y se cromatografió en una columna Superose 12 de cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC)(Pharmacia) en buffer de NaPi 50 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 0,5 N con un índice de flujo de 0,5 ml/min. Después de 14 min de elución, las fracciones de 0,5 ml se recogieron en tubos de microcentrífuga siliconados que contenían 5 ul de 0,4% Tween 20. Se analizaron alícuotas de cada fracción para determinar la actividad de GDNF. La Figura 2 muestra ese tipo de cromatografía con el perfil proteico trazado a D.O._{280} y con el patrón de actividad de GDNF superpuesto. 85% de la actividad de GDNF cargada en la columna se recuperó en fracciones #12-15.

Paso 3

RP-HPLC

La fracción #14 de lo que antecede se acidificó con 10 ul de ácido trifluoracético al 25% (TFA). La mitad del material acidificado se cargó sobre una columna de HPLC de fase inversa Aquapore RP-300 C-8 de diámetro interior estrecho (columna Brownlee, Applied Biosystems, San Jose, CA), 2,1 x 220 mm, y se eluyó con un gradiente de H_{2}O/ TFA al 0,1%: acetonitrilo al 80%/ TFA al 0,085%. Las fracciones que contenían proteína se recogieron manualmente en tubos de microcentrífuga siliconados en base a la absorción de UV a 214 nm. Se analizaron alícuotas de cada fracción para determinar la actividad de GDNF. La Figura 3 muestra ese tipo de cromatografía con el perfil proteico trazado a D.O._{214} y con el patrón de actividad en el panel inferior. Las fracciones 5 y 6 contenían aproximadamente 90% de la actividad recuperada en RP-HPLC, mientras que la fracción 7 representaba el 10% de la actividad restante. La Figura 4 muestra una operación de gel de SDS-PAGE con tinción de plata de las fracciones alrededor del pico de actividad de GDNF mostrado en la Figura 3.

Paso 4

SDS-PAGE Preparativo

Las fracciones 5 y 6 que contenían la actividad de GDNF pico se agruparon y concentraron hasta 20 ul en presencia de 10 ul de Tween 20 al 0,4% con vacío a velocidad. Se agregó a la muestra 1 ul de la base de Tris 1 M y 5 ul de Tris- HCl 0,2 M, pH 6,8, que contenía 40% de glicerol y 5% de SDS, y se hizo funcionar en SDS-PAGE al 15% no reducido (Laemmli 1970 Nature 277: 680- 684) (lámina gruesa de 0,075 x 14 x 11,5 cm, peine de 20 pocillos, 0,075 x 0,4 x 2,8 cm/ pocillo de muestra). Se llevó a cabo la electroforesis a 10ºC a 40 mA/gel durante 2 horas. La tira de gel se cortó en rebanadas de 1,14 mm. Cada rebanada se cortó en 2 pedazos más pequeños y se eluyó con 3 cambios secuenciales de 25 ul de NaPi 5 mM, pH 6,7 que contenía 0,01% Tween 20, durante un período de 20 horas con sacudimiento continuo a 4ºC. Las 3 alícuotas de material eluido se combinaron, ensayaron para determinar la actividad de GDNF (Figura 5) y se agrupó el eluido con actividad más alta (de rebanada de gel # 16-23 correspondiente a 30-42 kD en la Figura 5). Una tira de gel de blanco (sobre la cual se cargó solamente el buffer de muestra de SDS-PAGE antes de la electroforesis) se procesó similarmente como un control.

Paso 5

RP-HPLC

El eluyente de gel agrupado se concentró hasta aproximadamente 150 ul con vacío a velocidad, se acidificó con 20 ul de TFA al 25% y se colocó en RP-HPLC según lo descrito en el Paso 3. Las fracciones que contenían proteína se recogieron manualmente en tubos de microcentrífuga siliconados, en base a la D.O._{214} y se ensayaron para determinar la actividad de GDNF. La Figura 6 muestra los resultados de ese tipo de cromatografía. Como control, el eluyente de rebanadas de gel de blanco con tamaño similar también se sometió a RP-HPLC. El único pico de D.O._{214} significativo en la muestra antes mencionada por encima del perfil de control (Figura 6, panel A vs. B) es el pico 3, el cual contiene 70% de la actividad de GDNF cargada en la columna de HPLC. La Figura 7 muestra el pico 3 en un gel de SDS-PAGE con tinción de plata. La única mancha visible es una banda muy amplia entre 30-42 kD, coincidiendo con el perfil de actividad de GDNF observado en SDS-PAGE preparativo (Figura 5). El resumen de una purificación típica se brinda en la Tabla I.

D. Secuencia de aminoácidos de GDNF purificado

Secuencia de terminal amino: El pico 3 en la Figura 6 se secuenció con un secuenciador de proteína de fase gaseosa (Applied Biosystems). La secuencia obtenida se proporciona en la Figura 8. El secuenciado de las fracciones con la actividad de GDNF pico después del paso 3 de la purificación (fracciones 5 y 6 en la Fig. 3) también reveló una secuencia única, idéntica a aquella en la Figura 8, obtenida con la muestra purificada. El único material que estas fracciones diferentes tienen en común es el material que es una mancha entre 30-42 kDa. Por lo tanto, las bandas contaminantes fuera de las regiones de 30-42 kD vistas en gel con tinción de plata de las fracciones 5 y 6 en la Figura 4 podrían ser a) demasiado pequeñas en cantidad (<1 picomoles) para secuenciarse por la tecnología actual; b) pueden estar relacionadas a la banda de mancha de 30-42 kD en secuencia; o c) pueden tener un término amino bloqueado.

Secuencia interna: La preparación de GDNF después del paso 3 de la purificación antes descrita se utilizó como el material de partida para obtener secuencia interna. Las Fracciones 5 y 6 en la Figura 3 se agruparon en un tubo de microcentrifuga siliconado que contenía 9 ul de Tween 0,4% y se concentró hasta 40 ul con vacío a velocidad. Se agregaron a la muestra 160 ul de 1% NH_{4}HCO_{3} que contenía hidrocloruro de guanidina 2,5 M y 1 ug de tripsina, y la muestra se incubó durante la noche a 37ºC. La mezcla se acidificó con 20 ul de TFA al 25%, se concentró hasta aproximadamente 150 ul con vacío a velocidad, y los péptidos se separaron en una columna de HPLC de fase inversa Aquapore RP-300 C8 de diámetro interior angosto (columna Brownlee), 2,1 x 220 mm, y se eluyó con un gradiente de H_{2}O/TFA al 0,1%: 80% acetonitrilo/ TFA al 0,085%. Las fracciones que contenían péptidos se recogieron manualmente en tubos de microcentrifuga siliconados en base a la absorción a 214 nm. La Figura 9 muestra los resultados de ese tipo de cromatografía. Se determinó que la secuencia de pico 10 en la Figura 9 era idéntica a los primeros 13 residuos aminoácidos de la secuencia de terminal amino de la proteína no tratada mostrada en la Figura 8 (SEC ID NO: 1). El pico 37 en la Figura 9 se trató adicionalmente con CNBr. La muestra se concentró hasta 20 ul con vacío a velocidad. Se agregó a la muestra 70 ul de ácido fórmico al 90% y 5 mg de CNBr, y la muestra se incubó en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente. Esta mezcla se concentró hasta 20 ul con vació a velocidad, se diluyó con 100 ul de TFA al 0,1% y se separó en HPLC de fase inversa según lo descrito anteriormente. La Figura 10 muestra los resultados de ese tipo de cromatografía. El pico 1 en la Figura 10 se concentró hasta 20 ul en presencia de 5 ul de Tween 20 al 0,4% con vacío a velocidad. Se agregan a la muestra 100 ul de NH_{4}HCO_{3} al 1% y 5 ul de ditiotreitol 50 mM y la muestra se incubó a temperatura ambiente durante una hora. La mezcla se acidificó con 10 ul de TFA al 25%, se concentró hasta 100 ul con vacío a velocidad y se separó en HPLC de fase inversa según lo antes descrito. La Figura 11 muestra los resultados de ese tipo de cromatografía. Ambos picos 33 y 34 en la Figura 11 dieron una secuencia idéntica (Figura 12) (SEC ID NO: 2).

E. Características de GDNF

Movilidad en SDS-PAGE: Sin tratamiento término alguno de la muestra y bajo condiciones no reductoras, GDNF funciona como una banda de mancha entre 31-42 kD en SDS-PAGE. Cuando la muestra se calienta a 100ºC durante 3 min en presencia de agente reductor (4% \beta-mercaptoetanol), GDNF funciona como bandas múltiples discretas entre 20-23 kD. Puesto que aproximadamente 50% de la bioactividad cargada sobre el gel podría ser recuperada bajo las condiciones primero mencionadas (no reductoras) aunque no bajo las últimas condiciones mencionadas (de reducción), GDNF puede ser un dímero unido a disulfuro y solamente activo como un dímero. Si bien un único término amino sugiere que la preparación de GDNF es homogénea con respecto a la estructura primaria central, la mancha o patrón de bandas múltiples sugiere una proteína glicosilada heterogéneamente.

Actividad específica: GDNF purificado tenía una actividad específica estimada de aproximadamente 17 unidades tróficas/ng, lo cual indica que la estimulación media-máxima de la captación de dopamina se produce a la concentración relativamente baja de aproximadamente 60 pg/ml. La actividad específica medida para GDNF purificado puede ser subestimada de algún modo debido a la inactivación parcial de GDNF durante la purificación por exposición a los disolventes orgánicos acidificados utilizados en RP-HPLC y a las condiciones desnaturalizantes en SDS-PAGE.

Especificidad de GDNF: Se purificó GDNF por su capacidad de aumentar la captación de dopamina en neuronas de dopamina (Fig. 20A). Para determinar si GDNF también regulaba hacia arriba otro índice de supervivencia y/o maduración de las neuronas de dopamina, también se midió la inmunoreactividad de tirosina hidroxilasa (TH) en los cultivos mesencefálicos. TH es un marcador específico de las neuronas de dopamina en los cultivos. La regulación ascendente de la inmunoreactividad por GDNF podría deberse a la supervivencia incrementada de neuronas de dopamina y/o a un incremento en la producción de TH por cada neurona de dopamina. GDNF purificado agregado el día de la colocación en placas y los cultivos examinados ocho días después dieron como resultado un número superior a diez veces de neuronas TH^{+} con respecto a los controles sin GDNF. Si se agrega una segunda dosis de GDNF al día 9 y los cultivos se examinaban siete días después (16 días in vitro), podría observarse aun un incremento dosis-dependiente similar con respecto al control (Fig. 20B). Por lo tanto, GDNF podría sostener la supervivencia de las neuronas de dopamina y/o aumentar la expresión del gen de TH en neuronas de dopamina mesencefálicas.

Para demostrar que GDNF ejerce un efecto estimulante específico sobre la maduración y/o supervivencia de las neuronas de dopamina y no una acción general sobre todas las neuronas, se analizó la capacidad de respuesta a GDNF de las neuronas que contienen ácido \gamma-aminobutírico (GABA), las cuales están también presentes en cultivos mesencefálicos. Se midieron la captación de ^{3}H-dopamina (^{3}H-DA) y ^{14}C-GABA en cultivos relacionados de células mesencefálicas las cuales se habían cultivado con diversas concentraciones de GDNF durante 15 y 16 días, respectivamente. Según lo descrito anteriormente, GDNF aumentó la capacidad de captación de ^{3}H-DA de neuronas de dopamina mesencefálicas \sim150% con respecto al control sin GDNF (Fig. 21A). Sin embargo, GDNF no tuvo efecto significativo alguno sobre la capacidad de las neuronas con GABA de absorber ^{14}C-GABA puesto que la captación de ^{14}C-GABA en presencia de GDNF fue solamente de \sim20% mayor a aquella del control (Fig. 21B). Esto también es ilustrado por el aumento en la relación de captación de ^{3}H-DA/^{14}C-GABA calculada (Fig. 21C). Estos datos indican que las neuronas mesencefálicas con dopamina y GABA responden en forma diferente a la presencia de GDNF y el efecto estimulante de GDNF sobre la captación de ^{3}H-DA en cultivos mesencefálicos es específico para dopamina en contraste con las neuronas que contienen GABA.

Estas observaciones ilustran adicionalmente el porqué GDNF puede utilizarse para tratar el mal de Parkinson u otro trastorno que involucra a las neuronas dopaminérgicas. Estos resultados demuestran que GDNF regula ascendentemente al menos dos propiedades importantes de las neuronas dopaminérgicas: captación de dopamina y niveles de enzima TH. Los resultados también demuestran que los efectos de GDNF son por lo menos parcialmente específicos para las neuronas dopaminérgicas, puesto que las neuronas que contienen GABA no son similarmente afectadas.

Además de neuronas dopaminérgicas y GABAérgicas, hay otra población neuronal, las neuronas serotonérgicas, en los cultivos mesencefálicos embrionarios de rata. Algunos factores, tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF, "epidermal growth factor") que aumentan la captación de dopamina por las neuronas dopaminérgicas en los cultivos mesencefálicos, también aumentan la captación de serotonina por las neuronas serotonérgicas y captación de GABA por las neuronas GABAérgicas. Ver, Casper y col. 1991 J. Neurosci., 30:372. Esto indica que estos factores no son específicos para las neuronas dopaminérgicas.

En contraste, el GDNF no puede incrementar la captación de serotonina por las neuronas serotonérgicas. Se midió la captación de ^{3}H-serotonina de la misma manera que para la captación de ^{3}H-DA según lo descrito en el Ejemplo 1B, salvo que el buffer de captación contenía ^{3}H-serotonina 50 nM (11 Ci/mol, Amersham, Arlington Heights, IL) en lugar de ^{3}H-DA. En presencia de citalpram 10 uM (obtenido del Dr. C. Mytilineou, Mount Sinai School of Medicine), un potente inhibidor conocido de la captación de serotonina en las neuronas con serotonina, se redujo la captación de ^{3}H-serotonina hasta un 15%. Los valores de control en presencia de citalpram fueron restados de los valores experimentales mostrados en la Figura 24.

A diferencia de los factores no específicos tal como EGF, GDNF no puede incrementar la captación de GABA (Figura 21) y la captación de serotonina (Figura 24) bajo condiciones en las que la captación de dopamina es incrementada significativamente. Estos resultados y los resultados antes descritos indican que GDNF es específico para las neuronas dopaminérgicas en los cultivos mesencefálicos cuando se compara con las neuronas GABAérgicas y serotonérgicas presentes en los mismos cultivos. Ese tipo de especificidad aumenta la utilidad de GDNF para tratar el mal de Parkinson, el cual es considerado como un mal específico de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas (nigrales).

Ejemplo 2 Clonación del gen para GDNF A. Clonación de una copia de ADNc del gen de rata que codifica GDNF

A fin de clonar el gen que codifica GDNF, se construyó una genoteca de ADNc a partir de poli A^{+} ARN aislado de células B49, y esta genoteca se cribó con una sonda de oligonucleótidos degenerada en base a la secuencia de aminoácidos obtenida de GDNF purificado. Se determinó un clon de ADNc que se hibrida a esta sonda, por secuenciado de ADN, para contener secuencias de ADN que están ubicadas 3' a las secuencias utilizadas en la sonda de oligonucleótidos degenerada, que codificaba una secuencia de aminoácidos presente en GDNF y ubicadas terminal carboxi a la secuencia de aminoácidos de la cual se basó la sonda de oligo del screening.

Las condiciones de cultivo para la línea de células B49 se describen en detalle en el Ejemplo 1 anterior. Para la preparación de ARN, se cultivaron las células hasta casi confluencia en medio que contiene suero, se lavaron una vez en medio libre de suero (DMEM) y se cultivaron durante 4 días en DMEM con un cambio de medio después de 2 días. Luego, las células se recolectaron y se extrajo ARN total mediante el método de Chomczynski y Sacchi 1987 Analytical Biochemistry 162:156-159. Se preparó ARN poli adenilado a partir de este ARN total por pasaje sobre una columna de afinidad oligo dT celulosa según lo descrito por Maniatis y col. 1989 Molecular Cloning 2da Edición, CSH Press.

Se llevó a cabo la síntesis de ADNc utilizando transcriptasa inversa M-MLV RNaseH (Bethesda Research Lab, Gaithersburg, MD) de acuerdo con los protocolos descritos por el vendedor. La reacción de primera hebra se realizó con un cebador oligo dT_{15} (Pharmacia) y también incluyó 8 unidades de RNasin (Promega, Madison, WI) por cada 5 ug de poli A+ RNA. Se dirigió la síntesis de segunda hebra por polimerasa I de ADN de E. coli, RNaseH de E. coli y Ligasa de ADN de E. coli (todos de BRL) de acuerdo con el protocolo del vendedor. Para facilitar la clonación, se trató el ADNc con polimerasa de ADN T4 (BRL) para producir extremos de crecimiento y se metiló con metilasa EcoRI (BRL). Estos pasos se llevaron a cabo de conformidad con los protocolos suministrados por el vendedor de la enzima. Luego, el ADNc se extrajo dos veces con un volumen de una mezcla 1:1 de fenol y cloroformo y la fracción acuosa precipitó con ½ volumen de NH_{4}Ac 7,5 M y 3 vol de etanol a temperatura ambiente. El precipitado se recuperó por centrifugación durante 15 min a temperatura ambiente, a 16.000 xg, se lavó con etanol al 70%, se secó al vacío y resuspendió en 50 ul, Tris-HCl 50 mM (7,6), MgCl_{2} 10 mM, ATP 1 mM, DTT 1 mM, 5% PEG8000, que contenía 500 picomoles de ligante fosforilado (CCCGAATTCGGG, Pharmacia) (SEC ID NO: 9) y 3 unidades de ligasa de ADN T4 (BRL). Se llevó a cabo la ligación de ligante a 16ºC durante la noche (\sim 16 h). La mezcla de reacción se extrajo con fenol/ cloroformo y precipitó según se describió anteriormente. El pellet lavado se secó y se resuspendió en 50 ul de buffer de digestión de EcoRI (Tris-HCl 100 mM (7,5), MgCl_{2} 5 mM, NaCl 50 mM y 0,025% Triton X-100) al cual se agregaron 400 unidades de EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA). La reacción se incubó a 37ºC durante 2 h. Luego de la precipitación (según ya se mencionó) el pellet se resuspendió en buffer de digestión de EcoRI y se efectuó una segunda vuelta de digestión con EcoRI según lo descrito anteriormente. Esta reacción se precipitó y resuspendió en 40 ul de Tris-HCl 10 mM (8,0), EDTA 1 mM, NaCl 100 mM. Este ADNc, el cual ahora contenía ligantes digeridos con EcoRI, se fraccionó por tamaño mediante centrifugación a través de una columna giratoria sephacryl S-300 (Pharmacia) a aproximadamente 1100 g durante 5 min. El flujo a través de esta columna se recogió, el etanol precipitó según ya se mencionó, y se resuspendió en Tris-HCl 10 mM (8.0), EDTA 1 mM a una concentración de aproximadamente 0,1 ug/ul.

Se construyó una genoteca de ADNc en el vector de clonación \lambdaZapII (Stratagene, La Jolla, CA). Típicamente, 1 ug de los brazos de vector digerido con EcoRI y fosfatado (adquiridos de Stratagene) se ligaron a 0,1 ug de ADNc con ligante EcoRI en una ligación de 5 ul utilizando aproximadamente 3 unidades Weiss de ligasa de ADN T4 (NEB) en Tris-HCl 50 mM (7,6), MgCl_{2} 7 mM, DTT 1 mM, 5% PEG8000 y ATP 1 mM. Las ligaciones se llevaron a cabo a 16ºC durante la noche. Las ligaciones se empaquetaron en extractos de empaquetamiento GigapackII Gold (adquiridos de Stratagene) de acuerdo con el protocolo provisto por el vendedor. Las genotecas se plaquearon para titulación y screening en el huésped XL1-Blue provisto por Stratagene.

De una ligación y empaquetamiento de ese tipo, aproximadamente 270.000 unidades formadoras de placas se sacaron de las placas en un total de 12 platos de petri de 150 mm de diámetro. Se prepararon elevaciones de filtro de nitrocelulosa por duplicado de estas placas después de los procedimientos descritos por Maniatis y col. Los filtros fueron hibridados al siguiente oligonucleótido degenerado rotulado con ^{32}P (SEC ID NO: 7) (I = inosina):

2

Esta secuencia está basada en la secuencia de aminoácidos (Figura 8) (SEC ID NO: 1) obtenida alrededor del término amino de GDNF purificado (SEC ID NO: 10) según lo descrito en el Ejemplo 1 anterior:

Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala

El oligonucleótido fue rotulado con ^{32}P derivado de ^{32}P-ATP (Amersham, Arlington Heights, IL) utilizando T4 polinucleótido quinasa (Pharmacia o United States Biochemical, Cleveland, OH). Las reacciones de hibridación se llevaron a cabo en 6X SSPE, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml tRNA (Sigma, St. Louis, MO) y 2X reactivo Denhardt's (0,4 mg/ml cada uno: ficoll, polivinilpirrolidina, fracción V de BSA) a 50ºC durante la noche (aproximadamente 16 h). La solución de hibridación contenía 2-3 x 10^{6} cpm de oligo rotulado por cada ml de solución. Luego de la hibridación, los filtros se lavaron dos veces a temperatura ambiente en 2X SSPE, 0,1% SDS y dos veces en la misma solución precalentada hasta 50ºC. Los filtros se dejaron secar al aire y fueron expuestos a película durante 7 días a -70ºC utilizando pantallas intensificadoras.

Las películas reveladas fueron examinadas para identificar placas las cuales se hibridaron al oligonucleótido del screening. En este criado primario, se identificaron 24 positivos por duplicado putativos. Las áreas de las placas de la genoteca correspondientes a las señales positivas fueron separadas, resuspendidas y colocadas nuevamente en placas para una segunda vuelta de screening por medio del procedimiento de hibridación antes detallado. En este segundo screening, 8 de los 24 originales fueron reensayados como positivos, mientras que 16 dieron resultados negativos. Estos ocho positivos se purificaron en placas a través de 1 ó 2 vueltas adicionales de hibridación y seis de estos fueron posteriormente analizados por secuenciado de ADN para determinar si contenían secuencias de ADN que podrían codificar GDNF.

La porción de fagomida del fago \lambdaZapII, la cual contiene la inserción clonada, se denomina fagomida pBluescript SK, pBluescript SK se cortó de cada uno de los recombinantes de \lambdaZapII que se hibridó a la sonda de oligonucleótido. El procedimiento para la separación in vivo del plásmido pBluescript SK recombinante del vector \lambdaZapII se da en detalle por las instrucciones del vendedor. Brevemente, la coinfección de \lambdaZapII y un fago "ayudante" M13 da como resultado el empaquetamiento de una copia de ADN de una sola hebra del pBluescript recombinante dentro de un virión M13 infeccioso. Cuando un virión de ese tipo infecta una célula sensible, el ADN de una sola hebra es convertido en un ADN de doble hebra y es propagado verticalmente como un plásmido. La selección para este evento es proporcionada por el gen de resistencia a la ampicilina codificado en pBluescript SK-. Por lo tanto, los derivados de XL1-Blue de E. coli que contienen el plásmido pBluescript SK- recombinante "rescatado" de cada uno de los ocho clones \lambdaZapII positivos se obtuvieron rápidamente siguiendo las instrucciones descritas por Stratagene y empleando el fago "ayudante" provisto junto con el vector \lambdaZapII.

Para el secuenciado de ADN, se preparó un ADN plásmido de doble hebra de seis de estos plásmidos recombinantes mediante un procedimiento "mini-prep" basado en Birnboim y Doily 1979 NAR 7:1513-1523. Las reacciones de secuenciado de ADN que utilizan el método de terminación de cadena dideoxi se llevaron a cabo utilizando estos patrones y el oligo de screening como el cebador. Los reactivos para el secuenciado se obtuvieron de United States Biochemical como un kit (Sequenase Versión 2.0) y los procedimientos de secuenciado se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones provistas por el vendedor. Un clon, pBluescript SK-76.1, derivado del clon \lambdaZapII76.1 dio la siguiente secuencia (SEC ID NO: 11):

3

Esta secuencia puede ser traducida para dar la siguiente secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 12):

Glu-Arg-Asn-Arg-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-Ser-Pro

la cual coincide con la secuencia de aminoácidos determinada para una región del término amino de GDNF comenzando 5 residuos aminoácidos carboxiterminal al extremo de la secuencia de aminoácidos utilizada para generar el cebador oligo/ secuenciador de screening. Este resultado demostró que el clon de ADNc contenido en \lambdaZapII76.1 debe codificar una porción de, o la totalidad de, la proteína GDNF purificada del medio acondicionado celular B49.

B. Secuencia de nucleótidos de la región del clon de ADNc \lambdaZapII76.1 que incluye la secuencia codificadora de GDNF

Se determinó la secuencia de nucleótidos de los primeros 877 pares de bases del extremo 5' del clon de ADNc. Se descubrió que esta región contenía un marco de lectura abierta (ORF) de 227 aminoácidos que incluye la secuencia de aminoácidos obtenida para el término amino de GDNF purificado y una secuencia que es consistente con el péptido interno derivado por disociación de GDNF purificado. Los 134 aminoácidos de terminal carboxi esperados para este ORF comprenden la secuencia de aminoácidos esperada de la proteína GDNF madura purificada. Los 93 aminoácidos precedentes incluyen un codón ATG de iniciación potencial seguido por una secuencia de señal de secreción putativa y contienen potenciales sitios de procesamiento proteolítico para disociación de un precursor o forma "pre-pro" de la proteína para generar la forma madura, purificada de GDNF descrita anteriormente en el Ejemplo 1.

El ADN patrón para reacciones de secuenciado incluyó versiones de una sola hebra y de doble hebra del ADN de pBluescript SK-76.1 plásmido. Se preparó ADN de doble hebra de cultivos de XL1-Blue (pBluescript SK-76.1) mediante un procedimiento "boiling prep" (de "ebullición prep") (Anal. Biochem 114:193:97) y se bandeó en un gradiente de densidad CsCl. Se produjo un patrón de única hebra mediante infección de XL1-Blue (pBluescript SK- 76.1) con un fago M13 "ayudante" suministrado por el vendedor (Stratagene) utilizando las instrucciones relevantes suministradas junto con el fago. Los cebadores de oligonucleótidos de una sola hebra de 15 a 23 nucleótidos de longitud fueron sintetizados en un Sintetizador de ADN de Applied Biosystems (Foster City, CA), modelo 380A y utilizado generalmente sin purificación. Se llevó a cabo la determinación de secuencia utilizando el método de terminación de cadena dideoxi. Los reactivos utilizados fueron incluidos en el kit Sequenase Versión 2.0 (United States Biochemical) y se utilizaron de conformidad con las instrucciones suministradas por el vendedor.

La secuencia de nucleótidos de los primeros 877 nucleótidos del extremo 5' del clon de ADNc \lambdaZapII76.1, la cual contiene la secuencia codificadora de la proteína GDNF madura purificada se muestra en la Figura 13 (SEC ID NO: 3) junto con la secuencia de aminoácidos inferida de un marco de lectura abierta (ORF) de 681 pares de bases que se encuentra dentro de esta secuencia. La secuencia correspondiente a GDNF maduro purificado comienza en la posición 281 con un residuo serina, y se muestra en la Figura 14 (SEC ID NO: 4). La secuencia de ADN obtenida para esta región predice una secuencia de aminoácidos la cual concuerda perfectamente con los primeros 23 residuos de la secuencia de aminoácidos observada en el término amino de GDNF purificado (ver el Ejemplo 1).

En base a un análisis del gen según lo ilustrado en la Figura 13, es probable que GDNF sea inicialmente traducido como un polipéptido de GDNF pre-pro y que el procesamiento proteolítico de la secuencia de señal y la porción "pro" de esta molécula den como resultado la producción de la forma de GDNF que es purificada a partir del medio acondicionado celular B49. El sitio más probable de iniciación de la traducción para ese tipo de forma pre-pro es el codón ATG que se produce en la posición 50 en la secuencia de la Figura 13 (SEC ID NO: 3).

C. Clonación del gen humano que codifica GDNF

Las secuencias de aminoácidos de varios factores neurotróficos son altamente conservadas a través de una variedad de especies de mamíferos (Hallböok y col. 1991 Neuron 6:845- 858; McDonald y col. 1991 BBA (en prensa)). Como consecuencia de la conservación de las secuencias de aminoácidos existe una considerable conservación de las secuencias de nucleótidos de los genes que codifican estas proteínas. Por consiguiente, generalmente es verdad que el gen que codifica un factor neurotrófico en una especie mamíferas puede hibridarse en forma cruzada (es decir, formar un híbrido de ADN de doble hebra estable) con los genes que codifican ese factor en otras especies mamíferas bajo condiciones de hibridación ("annealing") apropiadas. Esta propiedad se utilizó para identificar segmentos de ADN humano clonados que incluyen el gen para GDNF.

Una genoteca genómica humana construida en el vector \lambdaFIXII se adquirió de Stratagene (catálogo #946203) y se cribó utilizando una sonda rotulada con ^{32}P derivada del clon de ADNc de rata de GDNF (pBluescript SK-76.1) antes descrito en el Ejemplo 2B. La sonda consistía en aproximadamente 250 pb de secuencia codificadora del GDNF maduro mediante amplificación específica utilizando la reacción en cadena de polimerasa (Saiki y col. 1985 Science 230: 1350) y se produjo de la siguiente manera. Se llevó a cabo una reacción de PCR de 50 ul o 100 ul utilizando ADN <1ng \lambdaZapII76.1 como patrón y 10-20 pmol de dos cebadores oligonucleótidos a base de secuencia de GDNF de rata. Un oligo fue el "oligo de screening" (también llamado DHD-21) descrito en el Ejemplo 2A anterior, mientras que el segundo oligo (DHD-26) (SEC ID NO: 13) tenía la secuencia:

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la cual se basa en la secuencia de aminoácidos (Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu) (SEC ID NO: 14) obtenida de un producto peptídico interno de disociación de GDNF (ver Ejemplo 1). La reacción se llevó a cabo en Tris-HCl 10 mM (pH 8,3 a 25ºC), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 10 ug/ml de BSA (Promega R3961), 0,2 mM cada uno dNTPs (Pharmacia), utilizando 2,5-5 u de Polimerasa (USB). La reacción consistía en 30 ciclos de: 95ºC durante 1 minuto, 44ºC durante 1 minuto ½ y 72ºC durante 1 minuto ½. El producto de esta reacción fue observado mediante electroforesis en gel de agarosa como de aproximadamente 250 pb lo cual es consistente con las posiciones de los dos cebadores en la secuencia de ADNc mostrada en la Figura 13. Este fragmento sin rotular se eluyó del gel mediante centrifugación con una Unidad de Filtro Ultrafree-MC (Millipore, Bedford, MA) de acuerdo con las instrucciones del vendedor, y se utilizó como patrón en reacciones de rotulación de PCR subsiguientes empleando los mismos dos cebadores oligo. Estas reacciones se llevaron a cabo bajo condiciones idénticas excepto que la concentración de dCTP frío se redujo hasta 12,5 uM y 2,5 uM 3000-5000 Ci/mmol de \alpha-^{32}P dCTP (AMERSHAM) se agregó a la reacción. Los productos de la reacción de rotulación se pasaron sobre una columna con rotación BioSpin 6 (Biorad, Richmond, CA). El flujo directo de esta columna se utilizó como la sonda para seleccionar la genoteca genómica humana.

La genoteca se retiró de las placas utilizando la cepa PLK17 de E. coli provista por STRATAGENE. Se prepararon veinticuatro platos de petri de 150 mm que contenía cada una aproximadamente 50.000 placas. Se prepararon elevaciones de filtro de nitrocelulosa por duplicado de cada plato de acuerdo con los procedimientos descritos por Maniatis y col. más arriba. Estos 48 filtros fueron sondeados con 250 x 10^{6} cpm de la sonda de PCR (desnaturalizada mediante tratamiento con NaOH 0,5 N) antes descrita en 250 ml 6x SSPE, 0,1% SDS, 2x reactivo Denhardt's, 0,1 mg/ml de tRNA y formamida al 30% (USB) a 42ºC durante la noche (\sim16 h). Luego, los filtros se lavaron dos veces en 250 ml 2 x SSPE, SDS 0,1% a temperatura ambiente y dos veces en 1.6 l 0,1x SSPE, SDS al 0,1% precalentado hasta 50ºC. Los filtros se dejaron secar a temperatura ambiente y se colocaron bajo película durante 6 días a -70ºC con pantallas intensificadoras. Las películas fueron reveladas y clasificadas. Se observaron seis positivos de duplicación fuertes. Las áreas de las placas de la genoteca correspondientes a las señales positivas se separaron, se resuspendieron y replaquearon durante una segunda vuelta de screening por medio del procedimiento de hibridación detallado. Los seis dieron positivo y se purificaron en placas por medio de una vuelta adicional de colocación en placas e hibridación.

Es cuestión de operaciones de rutina para el experto en la técnica la subclonación y secuenciado del segmento de ADN alrededor de la región que se hibrida a la sonda, y así determinar la totalidad o parte de la secuencia del gen humano para GDNF. Si el gen de GDNF humano entero no está representado en estos clones, también es una cuestión de rutina "caminar" a lo largo del genoma y clonar segmentos superpuestos de ADN alrededor de esta región para obtener y secuenciar cualquier porción remanente del gen.

Los procedimientos antes señalados y una variedad de otros procedimientos que serían obvios para un experto en la técnica podrían aplicarse para seleccionar otras genotecas humanas. Por ejemplo, utilizando la sonda antes descrita y el protocolo de hibridación, se cribó una genoteca de ADNc humana que fue construida de A^{+} RNA extraído de putamen humano. Esta genoteca, contenida en el vector de clonación \lambdagt10, se adquirió de Clontech (Palo Alto, CA) (catálogo #HL1092a, Lote #1561). Esta genoteca se colocó en placa (\sum aproximadamente 250.000 placas) en LE392 de E. coli (Maniatis y col. más arriba) a una densidad de aproximadamente 20.000 placas por plato y se cribó por hibridación bajo las condiciones antes descritas. Luego de la hibridación, se lavaron los filtros dos veces a temperatura ambiente en 0,2x SSPE, 0,1% SDS y dos veces en 0,1x SSPE, 0,1% SDS precalentado hasta 50ºC. Los filtros se secaron al aire a temperatura ambiente y se colocaron bajo película. Después de 3 días de exposición a 70ºC con pantallas intensificadoras, las películas fueron reveladas y se identificaron 8 positivos por duplicado.

Seis clones \lambdaFIX II de una genoteca genómica humana se identificaron mediante hibridación con una sonda de GDNF de rata y se purificaron en placas hasta homogeneidad (ver más arriba). Los lisados de cada fago se prepararon mediante el método de Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 1989). Se preparó el ADN a partir de estos clones mediante el siguiente procedimiento: DNAase I (Pharmacia) y RNAase A (Sigma) se agregaron a 5 ml de cada cultivo para dar una concentración final de 1 ug/ml. La solución fue incubada a 37ºC durante 1 hora. Luego se agregaron 5 ml de polietilenglicol al 20% (Sigma), NaCl 2 M y la solución se incubó a 0ºC durante 1hora. Los \lambdafagos se peletizaron mediante centrifugación a 12.000 x g durante 10 min. El pellet de fago se resuspendió en 250 ul de TE (TRIS 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM) y se extrajo secuencialmente con un volumen igual de: a. cloroformo; b. fenol; c. una mezcla 1:1 de cloroformo y fenol; y d. cloroformo. Se agregó acetato de amonio para dar una concentración final de 0,25 M y el ADN se precipitó mediante la adición de 2 volúmenes de etanol y centrifugación a 10.000 x g. El pellet de ADN se resuspendió en TE.

El ADN de cada uno de los seis aislados \lambda se digirió con diversas endonucleasas de restricción y los fragmentos se separaron mediante electroforesis a través de un gel de agarosa (Sambrook y col.). Los fragmentos de ADN se transfirieron a dos membranas de nilón idénticas (Schleicher y Schuell) y se hibridaron con sondas radiorotuladas de GDNF de rata. En GDNF de rata, existe un sitio Eco RI entre los nucleótidos 356 y 357 (siguiendo la numeración de la Figura 13). Esto se disocia dentro de la secuencia codificadora de GDNF maduro. Para determinar si los clones de GDNF genómicos humanos tienen un sitio en una posición homóloga, se utilizó Eco R1 como una de las endonucleasas de restricción para digerir los clones humanos. Se prepararon las sondas radiorotuladas específicas para regiones del gen ya sea corriente arriba (sonda 1) o corriente abajo (sonda 2) del sitio Eco R1 en GDNF de rata. La sonda 1 tenía 268 pb de largo y consistía en 14 pb de secuencia no traducida en 5' de GDNF de rata y 254 pb de secuencia codificadora (aminoácidos 1 a 85). Se preparó mediante amplificación de ADN de \lambdaZap II76.1 utilizando la reacción en cadena de polimerasa y los cebadores oligonucleótidos PD1 (GACGGGACTCTAAGATG) (SEC ID NO: 15) y DHD23 (GCIGCIGC (C/T) TG (T/C) TT (A/G) TCIGG) (SEC ID NO: 16). Las condiciones de reacción para preparar la sonda son según lo descrito anteriormente salvo que la reacción consistió en 30 ciclos de: 95ºC durante 1 minuto, 50ºC durante 1 minuto ½ y 72ºC durante 1 minuto ½. La sonda 2 tenía 195 pb de largo y consistía en 17 nucleótidos de secuencia no traducida en 3' de GDNF de rata y 178 pb de secuencia codificadora (aminoácidos 153 a 211). Se preparó utilizando la reacción en cadena de polimerasa y los cebadores oligonucleótidos (CGAGACAATGTACGACA) (SEC ID NO: 17) y PD2 (CTCTGGAGCCAGGGTCA) (SEC ID NO: 18) y \lambdaZAPII76.1 como el patrón de ADN. Las condiciones de reacción eran las mismas que para la sonda 1.

Cinco de los seis clones \lambda dieron patrones de hibridación idénticos. La sonda 1 se hibridó a un fragmento Eco RI de aproximadamente 700 pb y la sonda 2 se hibridó a un fragmento Eco RI de aproximadamente 2,8 Kb. El hecho de que las dos sondas se hibridaron a dos fragmentos de ADN Eco RI diferentes sugiere fuertemente que el gen de GDNF humano contiene un sitio Eco RI homólogo. Los fragmentos Eco RI de 700 pb y de 1,8 Kb fueron subclonados separadamente en Bluescript SK- (Stratagene). Las secuencias de nucleótidos de estos dos fragmentos se determinaron según lo descrito en el Ejemplo 2B. La secuencia de estos fragmentos de ADN se muestra en la Figura 19 (SEC ID NO: 5). A partir de la secuencia es evidente que hay un intrón precediendo el aminoácido 52 de pre-proDNF. No hay intrón alguno en la porción del gen que codifica a GDNF humano maduro. La secuencia de aminoácidos esperada de GDNF humano maduro es 93% homóloga a GDNF de rata maduro. Esto es aproximadamente el mismo grado de homología de secuencias de aminoácidos encontrada entre proteínas de rata y humanas para otros factores neurotróficos (La homología de secuencias de aminoácidos entre CNTF de rata y humano es 83%; McDonald y col. BBA (1991) (en prensa). La homología de secuencias de aminoácidos entre NGF de rata y humano es 95%, BDNF es 100% y NT-3 es 100%; Hallbook y col. 1991 Neuron 6:845- 855).

Para obtener la secuencia de pre-proGDNF humana completa, puede prepararse una sonda de hibridación radiorotulada en base a la secuencia de GDNF humano ya obtenida, y esta sonda puede ser utilizada para seleccionar genotecas de ADNc humanas. Debido a que ADNcs son copias del ARNm procesado, los intrones no están presentes y la secuencia de la secuencia codificadora completa puede ser obtenida.

Alternativamente, ahora que la posición del intrón con relación a la secuencia codificadora es conocida, puede prepararse una sonda de hibridación que es específica de las secuencias corriente arriba del intrón a partir del clon de ADNc de rata y esta sonda puede utilizarse para seleccionar una genoteca genómica para clones que contienen el o los exones en 5'.

D. Secuencia de nucleótidos que codifica los primeros 50 aminoácidos de Pre-proGDNF humano

Según se detalla en el Ejemplo 2C, existe un intrón que separa la secuencia de nucleótidos correspondiente al aminoácido 51 de pre-proGDNF humano. A fin de obtener la secuencia de esta porción de la molécula, se cribó una genoteca genómica humana con una sonda derivada de la secuencia codificadora de terminal amino de pre-proGDNF de rata y se secuenció un clon de hibridación y se mostró que contenía la secuencia codificadora de los aminoácidos 1 a 50 de pre-proGDNF humano según lo mostrado en la Figura 22 (SEC ID NO: 8)

Para este screening de genoteca se sintetizó una sonda de PCR según lo descrito en el Ejemplo 2C. Los cebadores de oligonucleótidos empleados fueron:

PD1 = 5' > CCCGAATTCGACGGGACTCTAAGATG > 3' (SEC ID NO: 19)

LFA = 5' > CGGTGGCCGAGGGAGTGGTCTTC > 3' (SEC ID NO: 20)

Las condiciones para las reacciones de PCR (tanto "frías" como rotulación con ^{32}P) fueron según lo descrito en el Ejemplo 2B salvo que la reacción consistía en 25 ó 30 ciclos de: 95ºC durante 1 min., 50ºC durante 1 min. y ½ y 72ºC durante 1 min. El producto de esta reacción contiene las primeras 122 pb de la secuencia codificadora pre-proGDNF y 5' de 14 pares de bases al iniciador putativo ATG (ver la Figura 13 y SEC ID NO: 3). Las condiciones para el screening de la genoteca genómica humana con esta sonda fueron según lo descrito en el Ejemplo 2C. Los mismos elevadores de filtro utilizados para identificar clones que portan secuencias para GDNF humano maduro se lavaron dos veces durante 15 min. en H_{2}O destilada- desionizada calentada hasta ebullición, se sondearon durante la noche, y se lavaron de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 2C. Los filtros fueron expuestos a película durante 3 días a -70ºC con pantallas intensificadoras. Cuando se revelaron, se observaron numerosos positivos por duplicado de intensidades variables. Se eligieron doce positivos relativamente fuertes y 10 de estos fueron purificados en placas mediante rondas sucesivas de hibridación bajo condiciones de screening.

Los ADNs clonados de estos fagos recombinantes fueron analizados por hibridación de Southern blot. Se descubrió que un fragmento de aproximadamente 1000 pb AluI se hibrida a la sonda de screening y se subclonó en pBluescript SK- digerido con SmaI para producir pBSSK-\lambda2Alul. Este fragmento AluI clonado fue subclonado adicionalmente para facilitar el secuenciado del segmento de ADN relevante. El ADN de pBSSK-\lambda3Alul purificado se digirió con una serie de enzimas de restricción que disocian el vector solamente una vez (dentro de la región de poliligante) y los productos de la digestión fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa. Dos enzimas de restricción (PstI y SacII) fueron así identificadas que se disocian una vez dentro del ADN clonado. La figura 22 muestra un mapa de sitios SacII y PstI. Los Southern blots revelaron que la región del segmento clonado que se hibrida a la sonda de screening estaba ubicada entre los sitios SacII y PstI del segmento AluI clonado. Por lo tanto, para el secuenciado, se construyeron dos derivados de deleción de pBSSK-\lambda3Alul. En un caso el fragmento PstI pequeño de aproximadamente 300 pb se delecionó de la siguiente manera: El plásmido se digirió con PstI y el producto de la digestión se ligó y transformó en E. coli. Los transformantes fueron sometidos a screening para seleccionar aquellos que carecen del fragmento PstI pequeño. En paralelo, el fragmento SacII de 300 pb fue similarmente delecionado de pBSSK-\lambda3Alul para producir un segundo derivado de deleción. Estos dos plásmidos de deleción fueron utilizados como patrones para reacciones de secuenciado. El secuenciado se llevó a cabo según lo descrito en el Ejemplo 2B.

La Figura 22 (SEC ID NO: 8) presenta 233 pares de bases de la secuencia así obtenida. Esta secuencia contiene una región de 151 pb que exhibe un muy alto grado de homología con los primeros 151 pb de la secuencia codificadora para pre-proGDNF de rata; 88% de identidad en el nivel de aminoácidos y 95% de identidad en el nivel de ADN. Por lo tanto, se concluye que esta región es parte del exón que porta la secuencia codificadora de los 50 residuos de terminal amino del pre-proGDNF humano y el primer nucleótido del codón para el residuo 51. La secuencia inmediatamente 3' a esta secuencia de 151 pb es homóloga a la secuencia de consenso para el extremo 5' de intrones de mamífero (Shapiro y Senapathy 1987 Nucl. Acids Res.15: 7155- 7174]. La secuencia inmediatamente 5' al iniciador putativo ATG muestra una fuerte homología a la secuencia de rata para 28 pb; 27 de 28 residuos son idénticos. En este punto la secuencia corriente arriba se desvía pronunciadamente. La secuencia alrededor del punto de divergencia muestra una homología considerable a la secuencia de consenso para el extremo 3' de intrones de mamífero. (Shapiro y Senapathy, más arriba). Por lo tanto, es probable que este sea un sitio de empalme si bien no hay evidencia directa de esto. El marco de lectura abierta que contiene pre-proGDNF humano se extiende al menos 27 pares de bases corriente arriba del iniciador ATG. Según lo descrito en la Descripción Detallada de las Realizaciones Preferidas anteriores, es posible que podrían producirse otras formas de un pre-proGDNF que podrían contener aminoácidos corriente arriba adicionales. Estas formas también podrían ser procesadas para producir la molécula de GDNF madura que ha sido purificada y secuenciada (ver Ejemplo 1).

Las secuencias de nucleótidos presentadas aquí y en el Ejemplo 2C, contienen la secuencia codificadora entera para un pre-proGDNF humano que exhibe extensa homología con el pre-proGDNF de rata el cual ha sido expresado exitosamente en células de mamífero (véase el Ejemplo 5) para producir GDNF de rata activo.

Ejemplo 3 Uso de GDNF para prevenir el Parkinsonismo experimental

Este ejemplo describe métodos para crear Parkinsonismo experimental en monos mediante la administración apropiada a los animales del MPTP de neurotoxina (1-metil-4-fenil-1,2,3,6 tetrahidro-piridina). También describe métodos para administrar GDNF a animales expuestos a MPTP a fin de aliviar el desarrollo del Parkinsonismo en tales animales.

A. Administración de GDNF en monos tratados con MPTP para producir Parkinsonismo experimental

Puede implantarse una cánula de acero inoxidable en el ventrículo lateral derecho y conectarse a una minibomba osmótica implantada subcutáneamente (Alzet 2002). La minibomba contiene GDNF en diversas concentraciones o su diluyente como un control negativo. La bomba suministra 0,5 ul/h durante 14 días. Dos días después del implante de la cánula-bomba, los monos (Cebus apella) recibieron una inyección de 0,6 mg/kg de MPTP en la arteria carótida derecha. Seis semanas después del implante inicial, los animales son perfundidos con solución salina y el cerebro es retirado rápidamente. El cerebro es dividido en hielo y se eliminan pedazos de tejido del núcleo caudado y putamen. La sustancia nigra se coloca en fijativo. El tejido de caudado- putamen es analizado por HPLC-EC para dopamina, la sustancia nigra es procesada para determinar la inmunoreactividad de tirosina hidroxilasa (TH).

B. Eficacia de GDNF

La degeneración de células nerviosas dopaminérgicas nigrales y sus proyecciones axonales al caudado/ putamen causan el Parkinsonismo experimental en este modelo de mono. Hay varias indicaciones experimentales de que GDNF puede evitar o reducir la severidad de esta degeneración neuronal. Por ejemplo, GDNF puede evitar la pérdida de cuerpos de células nerviosas positivos de TH en la sustancia nigra. Esto indica una protección por GDNF de células nerviosas dopaminérgicas nigrales de los efectos tóxicos de MPTP. GDNF también puede evitar la pérdida de fibras positivas de TH en el caudado/ putamen. Esto indica una protección por GDNF de las proyecciones axonales de las neuronas dopaminérgicas nigrales de los efectos tóxicos de MPTP. GDNF también puede evitar la pérdida de contenido de dopamina en el caudado/ putamen. Esto indica una protección de los efectos tóxicos de MPTP por GDNF de los axones y su contenido de dopamina extendiéndose desde las neuronas dopaminérgicas nigrales al caudado/ putamen.

Ejemplo 4 Actividades biológicas e indicaciones clínicas potenciales para GDNF

GDNF purificado aumenta la captación de dopamina por las neuronas dopaminérgicas presentes en cultivos de células nerviosas mesencefálicas embrionarias tanto en medio de cultivo enriquecido como en medio de cultivo definido, según lo demostrado en el Ejemplo 1. Esto indica que GDNF es un factor neurotrófico para estas células nerviosas dopaminérgicas. Como tal, GDNF puede probar que es útil en el tratamiento de la degeneración de estas neuronas que se produce en el mal de Parkinson. Adicionalmente, GDNF puede probar que es útil en el tratamiento del funcionamiento inapropiado de otras neuronas dopaminérgicas del cerebro. Tal funcionamiento inapropiado puede producirse en la esquizofrenia y en otros trastornos que requieren tratamiento con neurolépticos.

A. GDNF purificado promueve la supervivencia de células nerviosas parasimpáticas y simpáticas en cultivo 1. Ensayo para supervivencia neuronal Materiales

Se obtuvo bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio (MTT) de Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. Se adquirió suero de ternero fetal de Hyclone Laboratories, Logan, Utah. Se obtuvieron medios de cultivo y soluciones salinas de Irvine Scientific, Santa Ana, California. Los platos de cultivo se obtuvieron de Costar, Cambridge, Massachusetts. Se obtuvieron huevos de embriones de polluelo fértiles libres de patógenos de calidad de utilidad de Spafas, Roanoke, Illinois.

Ensayo

Los cultivos de ganglios ciliares de embriones de polluelo primarios y ganglios de cadena simpáticos se prepararon según lo descrito previamente (Collins 1978 Develop. Biol. 65:50; Manthorpe et al. 1986 Develop. Brain Res. 25: 191). Brevemente, los ganglios ciliares o simpáticos fueron eliminados de huevos de gallina libres de patógeno, fértiles que habían sido incubados durante 8 y 10 días, respectivamente, a 38ºC en una atmósfera. Los ganglios fueron químicamente disociados por exposición primero a Solución Salina Equilibrada de Hanks sin cationes divalentes, que contenían buffer de HEPES 10 mM pH 7,2 durante 10 min a 37ºC, y luego por exposición a una solución de 0,125% bactotripsina 1:250 (Difco, Detroit, Michigan) en Solución Salina Equilibrada de Hanks modificada como anteriormente durante 12 min a 37ºC. Se detuvo la tripsinización mediante adición de suero de ternero fetal hasta una concentración final de 10%.

Después de este tratamiento, los ganglios fueron transferidos a una solución que consistía en Medio Eagle Modificado de alto contenido de glucosa de Dulbecco sin bicarbonato que contenía suero de ternero fetal al 10% y HEPES 10 mM, pH 7,2 y fueron mecánicamente disociados mediante titulación aproximadamente 10 veces a través de una pipeta Pasteur de vidrio cuya abertura había sido pulida con fuego y reducida a un diámetro tal que tomó 2 segundos llenar la pipeta.

Los ganglios disociados fueron luego colocados en placas en medio de cultivo (Medio Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con suero de ternero fetal al 10%, glutamina 4 mM, 60 mg/L penicilina-G, HEPES 25 mM, pH (7,2) en platos de cultivos de tejido de 100 mm de diámetro (40 ganglios disociados por plato) durante tres horas. Esta colocación en placas previa se realizó a fin de separar las células no neuronales, las cuales se adhieren al plato, de las células nerviosas, las cuales no se adhieren. Después de tres horas, las células nerviosas no adherentes se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en medio de cultivo, y se colocaron en placas en 50 ul por pocillo sobre placas de cultivo tisular de microtítulo de 96 pocillos de área media a una densidad de 1500 células nerviosas por pocillo. Los pocillos de microtítulo habían sido expuestos previamente a 1 mg/ml de una solución de poli-L-ornitina en borato de sodio 10 mM, pH 8,4 durante la noche a 4ºC, se lavaron en agua destilada y se secaron al aire.

Se agregaron 10 ul de una dilución serial de la muestra a ser ensayada para determinar la actividad neurotrófica a cada pocillo y los platos se incubaron durante 20 horas a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía 7,5% CO_{2}. Después de 18 horas para ganglios ciliares y 40 horas para ganglios simpáticos, 15 ul por pocillo de una solución 1,5 mg/ml del tinte de MTT de tetrazolio en Medio Eagle Modificado de alto contenido de glucosa de Dulbecco sin bicarbonato que contenía HEPES 10 mM, pH 7,2 se agregó y los cultivos se colocaron en el incubador a 37ºC durante 4 horas. Luego, se agregaron 75 ul de una solución de 6,7 ml de 12 M HCl por cada litro de isopropanol y los contenidos de cada pocillo se trituraron 30 veces para abrir por rotura las células y suspender el tinte. La absorbancia de 570 nm fue determinada con relación a una referencia de 690 nm para cada pocillo utilizando un lector de placas de microtítulo automático (Dynatech, Chantilly, Virginia). La absorbancia de los pocillos los cuales no habían recibido agente neurotrófico alguno (controles negativos) se restó de la absorbancia de los pocillos que contenían muestra. La absorbancia resultante es proporcional a la cantidad de células vivientes en cada pocillo, definido como aquellas células nerviosas capaces de reducir el tinte. La cantidad de unidades tróficas de actividad neurotrófica se definió como la cantidad recíproca de la dilución que dio 50% de supervivencia máxima de células nerviosas. Se determinó la actividad específica dividiendo la cantidad de unidades tróficas por la cantidad de proteína presente en la muestra.

Resultados

Según lo ilustrado en la Figura 15, el GDNF purificado promueve la supervivencia en cultivo de células nerviosas parasimpáticas de ganglios ciliares de embriones de polluelo. Según lo ilustrado en la Figura 16, el GDNF purificado también promueve la supervivencia en cultivo de células nerviosas simpáticas de ganglios de cadena simpáticos de embriones de polluelo.

Estos resultados indican que GDNF actúa como un factor de supervivencia para neuronas parasimpáticas y simpáticas. Como tal, puede ser útil para tratar diversas formas de daño a los nervios al sistema nervioso autónomo (es decir, parasimpático y simpático). Ese tipo de daño puede producirse de condiciones metabólicas, tales como diabetes o disfunción renal. Ese tipo de daño también puede producirse del tratamiento de pacientes con diversos agentes quimioterapéuticos, tales como los agentes quimioterapéuticos del cáncer, cisplatina y vincristina, o los agentes quimioterapéuticos del SIDA, ddI y ddC. Ese tipo de daño también puede producirse a partir de condiciones genéticas, tales como disautonomía. Dicho daño también puede producirse a partir de lesión traumática.

Ejemplo 5 Expresión de GDNF recombinante en células animales A. Construcción de plásmidos recombinantes para la expresión de células COS

Un fragmento SmaI de aproximadamente 1,5 kb de pBluescript SK-76.1 que contiene la secuencia codificadora de GDNF entera se subclonó en el vector plásmido pSG5 (Green y col., 1988 Nucl. Acids. Res. 16:369) el cual está diseñado para la expresión transitoria de genes clonados en células que expresan el antígeno SV40 T, tales como células COS.

La secuencia de ADN del ADNc de GDNF (Figura 13) (SEC ID NO: 3) y el mapeo de endonucleasa de restricción identificaron un fragmento SmaI delineado por un sitio SmaI situado en el poliligante del vector (18 pb 5' al extremo 5' del clon de ADNc) y un sitio SmaI (\sim1500 pb distante) situado dentro del clon de ADNc aproximadamente 800 pb 3' al extremo de secuencia codificadora para GDNF maduro. Este fragmento SmaI se clonó en pSG5 de la siguiente manera. El ADN plásmido pSG5 purificado (Stratagene) fue digerido con EcoRI y tratado con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIAP), (Promega) de acuerdo con las instrucciones del vendedor. Subsiguientemente, el vector fue sometido a electroforesis y eluido de un gel de agarosa. El ADN plásmido pBluescript SK-76.1 purificado se metiló con metilasa de EcoRI, se digirió con SmaI y se ligó con la molécula ligante de EcoRI descrita en el Ejemplo 2A. Luego de la digestión con EcoRI y electroforesis con gel de agarosa, el fragmento SmaI de aproximadamente 1,5 Kb de interés (ahora EcoRI metilado y ligado) fue eluido y ligado al vector pSG5 digerido con EcoRI y tratado con fosfatasa. Se utilizaron productos de ligación para transformar XL1-Blue de E. coli competente utilizando el procedimiento de CaCl_{2} (Maniatis y col. más arriba). Se seleccionaron los transformantes resistentes a ampicilina y se analizaron para plásmidos recombinantes mediante digestión con endonucleasa de restricción y electroforesis en gel de agarosa. La digestión con EcoRI indicó que la mayoría de los transformantes contenían plásmidos que tenían la inserción deseada. La digestión con BamHI identificó la orientación del gen de GDNF clonado con relación al promotor SV40 presente en el vector (nótese el sitio BamHI en posición 15 en la secuencia en la Figura 13). Ambas orientaciones fueron obtenidas.

Se escogieron dos transformantes para análisis adicional; uno contenía un plásmido, denominado pSG5: rGDNF-7, que porta el gen GDNF en la orientación apropiada para ser expresado en transcripciones de ARN iniciadas en el promotor SV40, mientras que el segundo contenía un plásmido, denominado pSG5: rGDNF-4, que porta el gen GDNF en la orientación opuesta; en el cual las transcripciones de ARN que se inician en el promotor SV40 no expresarán GDNF. Las preparaciones purificadas de ambos de estos plásmidos se prepararon por centrifugación de gradiente de densidad de CsCl para utilizar en experimentos de expresión de células COS.

B. Expresión de GDNF en células COS-7

El ADN plásmido de estas construcciones se preparó mediante el método de lisis alcalina seguido por centrifugación de densidad de CsCl (Maniatis y col, más arriba). Este ADN fue transfectado en células COS-7 mediante el método de Sompayrac y Danna (1981 Proc. NAtl. Acad. Sci. USA 78:7575-7578). Como un control, los cultivos de células COS equivalentes fueron transfectados con ADN de vector plásmido que contenía la inserción de GDNF en la orientación opuesta, lo cual no permitiría la expresión de la proteína GDNF. Se utilizaron por cada plato de cultivo de 100 mm, 30 ug de lipofectina y 0,3-1 ug de ADN plásmido.

Después de transfectar durante 24 horas, el medio fue separado por aspiración y reemplazado con OptiMEM I \pm 3% FCS. Los cultivos fueron incubados durante 48 horas y recolectados de la siguiente manera:

a) el medio (medio acondicionado o CM) fue retirado y almacenado a -80ºC;

b) 5 ml de PBS + EDTA 2,5 mM se agregaron a las células y se mantuvo a 25ºC durante 3 minutos; y, luego las células fueron separados con pipeta del plato y centrifugadas a 1000 xg durante 5 minutos. Se retiró el sobrenadante y los pellets celulares fueron almacenados a -80ºC.

El CM se concentró 30 veces en concentradores Centricon 10 y se ensayó para determinación de la bioactividad. Los pellets celulares fueron sonicados en 100 ul de EDTA 10 mM, pH 7,0, más benzamidina 1 mM, 100 uM PMSF, ácido E-amino-N-caproico 1 mM. Los lisados celulares fueron centrifugados a 14.000 xg durante 5 minutos y los sobrenadantes ensayados para determinación de la bioactividad.

C. Bioensayo de GDNF expresado

El lisado celular y el medio de cultivo de células COS transfectadas con plásmidos que expresan GDNF y control (con la secuencia codificadora de GDNF en la orientación incorrecta) se ensayaron tanto para determinar la capacidad de incrementar la captación de dopamina en los cultivos de neuronas mesencefálicas (ver Ejemplo 1) como para determinar la capacidad de incrementar la supervivencia de neuronas de ganglios simpáticos (ver Ejemplo 4). El medio de cultivo de células COS (Figura 17) y el lisado celular (datos no mostrados) aumentó la captación de dopamina, según lo esperado de GDNF. Según lo mostrado en la Figura 18, el medio de cultivo de células COS y el lisado celular aumentaron la supervivencia de neuronas de cadena simpática, según lo esperado de GDNF.

Estos resultados indican claramente que la expresión del gen de GDNF en una célula animal da como resultado la producción de una proteína con las actividades biológicas demostradas para GDNF purificado.

Ejemplo 6 Expresión de GDNF humano en E. coli A. Construcción de un plásmido el cual codifica GDNF humano

Utilizando la información de secuencia del gen GDNF humano (Ejemplo 2C), se prepararon oligonucleótidos sintéticos PD3 y PD4 como cebadores para la amplificación del gen GDNF humano y su expresión a partir de un vector de expresión plásmido en E. coli. Las secuencias de oligonucleótidos PD3 (SEC ID NO: 21) y PD4 (SEC ID NO: 22) son:

PD3: 5' CGCGGATCCAATAAGGAGGAAAAAAAATGTCACCAGATAAACAAAT 3'

PD4: 5' CGCGGTACCCAGTCTCTGGAGCCGGA 3'

El oligonucleótido PD3 es 46 nucleótidos de largo.

Los 17 nucleótidos en el extremo 3' son una perfecta coincidencia con el gen GDNF humano en la región que codifica para el término N de la proteína madura. Estos 17 nucleótidos son precedidos por un codón de iniciación de la traducción, ATG, de modo que la síntesis de GDNF humano maduro comenzará en el aminoácido correcto en E. coli. Los otros nucleótidos son diseñados para proveer otras señales consideradas necesarias para la buena expresión en E. coli como así también un sitio de restricción de endonucleasa BamHI necesario para la construcción del plásmido de expresión de GDNF.

El oligonucleótido PD4 es 26 nucleótidos de largo. Los 17 nucleótidos en el extremo 3' son una coincidencia perfecta con los 17 nucleótidos del gen GDNF humano 3' del codón de detención. Este oligonucleótido también provee secuencias necesarias para reconstruir un sitio de endonucleasa de restricción KpnI para la construcción del plásmido de expresión de GDNF.

Las condiciones de reacción para la amplificación del GDNF humano son las siguientes: El volumen de reacción total fue 100 ul y contenía 1 ng de un clon de \lambdaADN que contenía el gen GDNF humano, 20 pmoles cada uno de PD3 y PD4, Tris-HCl 20 mM pH 8,8, KCl 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 6 mM, MgCl_{2} 1,5 mM y 0,1% Triton X-100. La mezcla de reacción se calentó hasta 95ºC durante 5 minutos, se enfrió hasta 44ºC y se agregaron 2 unidades de polimerasa de ADN Pfu (Stratagene). La reacción consistía en 30 ciclos de: 72ºC durante 1 minuto y medio, 95ºC durante 1 minuto y 44ºC durante 1 minuto y medio. Al final de la reacción, se agregó MgCl_{2} hasta una concentración final de 10 mM. Se agregaron 5 unidades de fragmento (Promega) de polimerasa de ADN I grande (Klenow) y la reacción se incubó a 37ºC durante 10 minutos. Luego, se agregaron 10 ul de NaAc 3 M y 220 ul de EtOH y la solución se centrifugó a 12.000 x g durante 15 minutos para precipitar en ADN. El ADN precipitado se resuspendió en 100 ul de Tris-HCl 50 mM (pH 8), NaCl 50 mM, MgCl_{2} 10 mM, 20 unidades de BamHI y 20 unidades de KpnI y se incubó a 37ºC durante 1 hora. Se identificó un fragmento de ADN del tamaño correcto después de electroforesis a través de un gel de agarosa y se purificó utilizando una Unidad de Filtro Ultrafree-MC (Millipore). Este fragmento se ligó en un vector de expresión de E. coli, pT3XI-2 (descrito más adelante). Las condiciones de ligación fueron las siguientes: el volumen de reacción total fue de 5 ul y contenía 10 ng de ADN de pT3XI-2 linearizado con KpnI y BamHI, 5 ng del fragmento de ADN de GDNF humano según lo descrito anteriormente, Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 10 mM, ATP 1 mM, DTT 1 mM, 5% polietilenglicol-8000 y 1 unidad de ligasa de ADN T4 (Bethesda Research Laboratories). La reacción se incubó a 14ºC durante 2 horas.

El vector pT3XI-2 se construyó de la siguiente manera. El plásmido inicial para esta construcción fue el plásmido pKK223-3 (Brosius y Holy, 1984) adquirido en Pharmacia. El plásmido pKK223-3 porta un gen parcial para resistencia a tetraciclina. Este gen no funcional fue reemplazado por un gen de resistencia a tetraciclina completo portado en el plásmido pBR322. El plásmido pKK223-3 fue digerido completamente con SphI y parcialmente con BamHI. Un fragmento de 4,4 pares de kilobases fue purificado en gel y combinado con un adaptador sintético(SEC ID NO: 23):

5' GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT 3'

3' ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 5'

BgIII

\hskip4.55cm

ClaI

y un fragmento de 539 pares de bases de ADN de una digestión ClaI, SphI del gen de resistencia a tetraciclina de pBR322 (PL Biochemicals, 27-4891-01). El plásmido resultante fue designado pCJ1.

A continuación, un ligante XhoI adquirido en New England Biolabs fue insertado en el sitio PvuII de pCJ1 plásmido para formar el plásmido pCJX-1. Esta inserción interrumpe el gen rop el cual controla el número de copias del plásmido. Luego, se purificó un fragmento EcoRI que contiene el gen lacI a partir del plásmido pMC9 (Calos y col., 1983) y luego se insertó en el sitio XhoI con los adaptadores XhoI a EcoRI. La región poliligante en el plásmido pKK223-3 fue luego reemplazada con un poliligante que contiene sitios adicionales cortando con EcoRI y PstI (SEC ID NO: 24):

5' AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA 3'

\hskip1cm

3' GGGCCC ATGGTCTAGA CTCGAGTGAT CAG 5'

El vector plásmido así obtenido es designado pCJXI-1.

Finalmente, el gen de resistencia a tetraciclina fue reemplazado con un gen similar el cual tenía los sitios de reconocimiento para enzimas de restricción HindIII, BamHI y SalI destruidos por mutagénesis con bisulfito. Se utilizó el siguiente procedimiento para mutar el gen de resistencia a tetraciclina de pBR322. El plásmido pBR322 se cortó con HindIII, luego se mutagenizó con bisulfito de sodio (Shortle y Botstein, 1983). El ADN mutagenizado se ligó para formar ADN circular, luego se cortó con HindIII para delinear cualquier plásmido que escapó de la mutagénesis. JM109 de E. coli (Yanisch-Perron y col., 1985). Los plásmidos resistentes a tetraciclina se aislaron y controlaron para determinar la pérdida del sitio HindIII en el gen de resistencia a tetraciclina. El plásmido exitosamente mutado fue designado pT1. Se siguió un procedimiento similar para mutagenizar el sitio BamHI en pT1, proporcionando el plásmido pT2. El plásmido pT2 a su vez fue mutagenizado para eliminar el sitio SalI, formando el plásmido pT3. Un fragmento ClaI-StyI de pT3 que porta el gen de resistencia a tetraciclina mutado se aisló y se utilizó para reemplazar el fragmento homólogo de pCJXI-1 para formar pT3XI-2. El gen de resistencia a tetraciclina mutado aun codifica a una proteína funcional. Corriente abajo de la región promotora tac, se introdujo un poliligante el cual contiene, entre otros sitios, sitios de restricción BamHI y KpnI útiles para clonar genes para la expresión en E. coli.

Después de la ligación de 2 horas del vector con la construcción de GDNF maduro humano, se utilizaron 2 ul de la mezcla de reacción para transformar las células de E. coli supercompetentes Epicurian Coli SURE® (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia de ADN de uno de los plásmidos recombinantes se determinó según lo descrito en el Ejemplo 2B. La secuencia confirmó que este plásmido contenía la secuencia codificadora completa del gen GDNF humano que codifica a GDNF humano maduro.

B. Expresión de GDNF humano en E. coli

El plásmido recombinante que contenía secuencias de ADN que codifican a GDNF humano se transformó en la cepa de E. coli JM107\phirMCB0005, una variante resistente a T1 de JM107 (Yanisch-Perron y col. (1985)), utilizando el método de CaCl_{2} descrito en Sambrook y col. (1989). Uno de los recombinantes se cultivó en 50 ml de medio LB (Sambrook y col) con 100 ug/ml ampicilina (Sigma) con agitación a 37ºC durante toda la noche. Al día siguiente, el cultivo se diluyó 1:70 en medio LB con 100 ug/ml de ampicilina y se cultivó durante 5 horas con agitación a 37ºC. Se recolectaron 20 ml de células mediante centrifugación a 8000 x g durante diez minutos. El pellet se resuspendió en 4 ml de EDTA 10 mM pH 7,4. Las células se rompieron utilizando un instrumento French Press Pressure Cell (SLM Instruments) a 122,400 kPaM (18.000 psig). El lisado se centrifugó a 12.000 x g durante 15 minutos a 4ºC. El pellet se resuspendió en EDTA 1 mM. Se ha descubierto que se acumula relativamente más cantidad de GDNF si se deja que se produzca la fermentación a 42ºC más que a 37ºC o 30ºC.

El método preferido de la presente para obtener altos niveles de expresión de GDNF en E. coli utilizando el plásmido recombinante descrito en el Ejemplo 6A (en el cual la secuencia codificadora para GDNF maduro humano es clonada en el vector de expresión pT3XI-2) es de la siguiente manera. Para una fermentación de 10 l se cultiva un inóculo de 500 ml en medio LB (pH 7) que contenía 15 ug/ml de tetraciclina a 37ºC en un frasco de agitación con desviadores de 2 l hasta una densidad óptica (A_{660}) de entre 2 y 3. Este cultivo se utiliza para inocular 10 l de medio de cultivo que contenía: 12 g/l de triptona, 24 g/l de extracto de levadura, 25 g/l de glicerol, 1,3 g/l de K_{2}HPO_{4}, 0,4 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,1 ml/l de mezcla 4:1 de Macol19:GE60, y 15 mg/l de HCl de tetraciclina. Este cultivo es cultivado durante aproximadamente 12 a 18 horas a 42ºC hasta densidades ópticas de aproximadamente 12 a 20 (A_{660}). El pH de la fermentación se mantiene a 7,0 y el oxígeno disuelto se mantiene a 30% de saturación. Luego de la fermentación, el cultivo es enfriado a 4ºC y las células son recolectadas por centrifugación.

La producción de GDNF humano a partir de este plásmido antes descrito no es específica de esta cepa de E. coli aunque puede ser producido en cualquier cepa adecuada. El plásmido ha sido transformado en dos otras cepas E. coli, JM108 (Yanisch Perron y col, 1985) y SURE® (Stratagene). En ambas de estas cepas se ha visualizado una nueva banda proteica del peso molecular correcto por tinción con Coomassie Blue después de electroforesis a través de un gel de poliacrilamida.

Una alícuota del material resuspendido se sometió a electroforesis a través de un gel de poliacrilamida. El gel se coloreó con Coomassie Blue. Una proteína del peso molecular esperado para GDNF (15.000 daltons) estaba presente solamente en los cultivos que contenían el plásmido de GDNF humano recombinante aunque no en los cultivos que contenían el vector pT3XI-2 solo. La proteína recuperada se sometió a procedimientos de secuenciado de terminal amino convencionales, y los primeros 22 aminoácidos de esta proteína son idénticos a la secuencia de aminoácidos de GDNF humano según lo mostrado en la Fig. 19, confirmando que el GDNF humano está siendo correctamente expresado en E. coli.

C. Repliegue y bioactividad de GDNF humano recombinante producido en bacterias

Preparación de material para repliegue. Se cultivó el transformante JM107 de E. coli (pT3X12: huGDNF) a fase estacionaria a 37ºC en un medio complejo a base de extracto de levadura (#0127-01 Difco Laboratories, Detroit, MI) y triptona (#0123-05 Difco Laboratories, Detroit, MI) (24 g/L de extracto de levadura, 12 g/l de triptona, 5 g/L de glicerol, 1,3 g/L de K_{2}HPO_{4}, 0,4 g/L de KH_{2}PO_{4}, 0,1 ml/L de Macol 19/GE60 (4:1), 15 mg/L de tetraciclina) sin inducción de IPTG. Las células fueron centrifugadas a 16.000 xg en un rotor JA10 a 4ºC durante 20 minutos y la pasta celular se almacenó a -20ºC.

Las células fueron procesadas de la siguiente manera: 5 g de pasta celular se homogenizaron con 40 ml de EDTA 10 mM, pH 7,0 en hielo utilizando un homogenizador de OCI Instruments. La suspensión fue prensada en el instrumento French (francés) antes mencionado tres veces a 136.000 kPa (20.000 psi) y luego se centrifugó a 30.000 xg en un rotor JA 20 durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante se descartó y el pellet se homogenizó y se centrifugó según lo antes señalado. En una realización, el pellet de la re-extracción se homogenizó con 40 ml de Tris 25 mM, pH 7,4, se centrifugó según se mencionó anteriormente, y el sobrenadante se descartó. El pellet se homogenizó con 20 ml de Tris 50 mM, pH 8,0, que contenía urea 8 M con o sin la adición de 2-mercaptoetanol 30 mM, se centrifugó según lo antes mencionado y se retuvo el sobrenadante. El sobrenadante es denominado el extracto TU. En la realización preferida, el pellet se homogenizó en 40 ml de Tris 10 mM, pH 8,0, que contenía EDTA 1 mM, 1% NP-40, se centrifugó como se mencionó anteriormente, y el sobrenadante se descartó. El pellet se solubilizó mediante sulfonilación de la siguiente manera: El pellet se homogenizó en 25 ml de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,4 que contenía urea 8 M, sulfito de sodio 100 mM y tetrationato de sodio 10 mM. La sulfonilación se dejó proceder a 4ºC durante toda la noche con agitación y luego se centrifugó a 16.000 xg, 4ºC, durante 10 minutos para aclarar la solución.

Purificación parcial de extracto de TU antes del repliegue. El extracto de TU fue parcialmente purificado mediante cromatografía de intercambio iónico en resina S-Sepharose Fast Flow (Pharmicia). La columna fue equilibrada y se puso en funcionamiento a temperatura ambiente en Tris 25 mM, pH 7,4, que contenía una urea 8 M y 2-mercaptoetanol 30 mM (buffer A). Después de cargar la muestra y lavar con buffer A hasta densidad óptica de línea de base, la columna se eluyó a un volumen de columna del 10% por minuto con 5 volúmenes de columna cada uno de buffer A y Tris 100 mM, pH 9,0, que contenía urea 8 M, NaCl 500 mM y 2- mercaptoetanol 30 mM (buffer B). Las fracciones de la columna fueron monitoreadas a 280 nM y analizadas por SDS-PAGE. El GDNF eluyó como el pico de proteína principal a 60- 70% del gradiente. Las fracciones enriquecidas en GDNF fueron agrupadas para el repliegue (Fig. 25).

Purificación parcial de extracto sulfonilado antes de repliegue. El extracto sulfonilado fue parcialmente purificado mediante cromatografía de intercambio iónico en resina Q-Sepharose Fast Flow (Pharmicia). La columna fue equilibrada y puesta en funcionamiento a 4ºC en Tris 10 mM, pH 8,0, que contenía urea 4M (buffer A). Después de cargar la muestra y lavar con buffer A hasta densidad óptica de línea de base, la columna se eluyó como volumen de columna de 5% por minuto con 5 volúmenes de columna cada uno de buffer A y Tris 100 mM, pH 8,0, que contenía urea 4 M y NaCl 500 mM (buffer B). Las fracciones de la columna fueron monitoreadas a 280 nM y analizadas por SDS-PAGE. El GDNF eluyó como el pico de proteína principal a 50% del gradiente. Las fracciones enriquecidas en GDNF fueron agrupadas para el repliegue.

Repliegue de extracto de TU parcialmente purificado

GDNF, parcialmente purificado según lo descrito anteriormente, se replegó de la siguiente manera: A 4 ml de eluido de la columna agrupado que contenía GDNF a aproximadamente 1 mg/ml, se agregó ditiotreitol hasta 5 mM. El tubo fue tapado de modo de excluir el aire y se mantuvo a 25ºC durante 15 minutos. A continuación, se agregó sal disódica de glutationa oxidada hasta 15 mM, el tubo fue tapado nuevamente de modo de excluir el aire, y se mantuvo a 25ºC durante 15 minutos. Luego, esta solución fue diluida con 14 volúmenes de buffer de repliegue (Na_{2}HPO_{4} 100 mM, etanolamina 10 mM, pH 8,3, que contenía urea 4 M; 5% polietilenglicol 300; y cisteína 2 mM) y se mantuvo bajo argón a 5ºC durante 3 días.

Repliegue de extracto sulfonilado parcialmente purificado

El GDNF, parcialmente purificado según lo descrito anteriormente, se replegó de la siguiente manera: El eluido de la columna agrupado que contenía GDNF a aproximadamente 3 mg/ml se diluyó con 19 volúmenes de buffer de repliegue (Na_{2}HPO_{4} Tris 100 mM, pH 8,3, que contenía urea 4 M; 5% polietilenglicol 300; y cisteína 3 mM) y se mantuvo bajo argón a 5ºC durante 3 días.

Análisis de GDNF replegado mediante SDS-PAGE. GDNF extraído de bacterias sin previa exposición a agentes reductores migra como un monómero en SDS-PAGE, a un peso molecular aparente de aproximadamente 16 kDa comparado con la migración de proteínas estándares de peso molecular. No hay GDNF detectable en la posición de un dímero. GDNF, expuesto a agente reductor (2-mercaptoetanol 30-150 mM) durante la extracción o justo antes de SDS-PAGE aunque con anterioridad a repliegue, migra a una posición indistinguible de la proteína bacteriana no reducida, con un peso molecular aparente de aproximadamente 16 kDa (Fig. 26, sendas 6 & 13). Esto indica que GDNF preparado a partir de las células bacterianas no es dimerizado antes de repliegue.

Después del repliegue según lo antes mencionado, la mayoría del GDNF recombinante bacterialmente producido migra en SDS-PAGE no reductor como un dímero aparente a aproximadamente 30 kDa (Fig. 26, senda 2). La reducción del GDNF replegado con 2-mercaptoetanol 150 mM antes de SDS-PAGE hace que migre nuevamente a la posición del monómero a aproximadamente 16 kDa (Fig. 23, senda 5). Estos resultados indican que el repliegue de GDNF hace que la proteína se vuelva un dímero unido a disulfuro. El SDS-PAGE de GDNF replegado se llevó a cabo sin reducción, y el gel se cortó en rebanadas a lo largo de su longitud y las rebanadas se ensayaron para determinar la bioactividad en el ensayo de supervivencia de neuronas de ganglios simpáticos (ver más abajo). La única bioactividad detectable fue en la posición del dímero, lo cual indica que el dímero es biológicamente activo.

Análisis de GDNF replegado en HPLC de fase inversa (RP-HPLC). GDNF parcialmente purificado por cromatografía S-Sepharose o Q-Sepharose, aunque antes del repliegue, migró en RP-HPLC, llevada a cabo según lo indicado más adelante, con un tiempo de retención de aproximadamente 21 minutos. GDNF después del repliegue migró bajo condiciones idénticas con un tiempo de retención de aproximadamente 15 minutos. Un cambio en el tiempo de retención es esperado para el repliegue exitoso de GDNF. A menudo se observa que hay un cambio en los tiempos de retención en RP-HPLC después del repliegue de proteínas.

La RP-HPLC de estas muestras se llevó a cabo de la siguiente manera: a un índice de flujo de 1 ml/minuto: Se desarrolló una columna C-4 de 0,46X25 cm (VyDac #214TP54) de la siguiente manera: Disolvente A = ácido trifluoracético al 0,1% (TFA) en agua; Disolvente B = TFA al 0,1% en acetonitrilo; De 0,5 a 1,5 minutos, B es incrementado de 5% a 25%; De 1,5 a 31,5 minutos, B es incrementado de 25% a 55%.

Análisis de GDNF replegado por bioensayos

Se bioensayó GDNF replegado tanto en el bioensayo de supervivencia de neuronas de ganglios simpáticos (E10) de embriones de polluelos y en el bioensayo de captación de dopamina en cultivo mesencefálico de embriones de rata (E16) (Ejemplo 1B). Antes del repliegue, GDNF, expuesto a 2-mercaptoetanol 30 mM y purificado por cromatografía S-Sepharose o Q-Sepharose, no exhibió bioactividad detectable en el ensayo de captación de dopamina en cultivo mesencefálico y bioactividad altamente reducida en el bioensayo de supervivencia de neuronas simpáticas. La ED50 aparente en el bioensayo de supervivencia de neuronas simpáticas de material de cromatografía de S-Sepharose fue de aproximadamente 1 ug/ml, el cual es aproximadamente 333 veces inferior a rhGDNF replegado (véase más abajo). Para el material de cromatografía de Q-Sepharose el ED50 aparente en el bioensayo de supervivencia de neuronas simpáticas fue de aproximadamente 3 ug/ml, el cual es aproximadamente 100 veces inferior a rhGDNF replegado (véase más abajo). Después del repliegue, GDNF, con o sin exposición previa a 2-mercaptoetanol, era aparentemente completamente activo en ambos bioensayos (Figs. 27-28). Este resultado indica que GDNF adquirió bioactividad significativa luego del repliegue y también que la bioactividad reducida o ausente antes del repliegue no se debía a la exposición a 2-mercaptoetanol.

El ED50 de GDNF humano recombinante replegado (rhGDNF) en estos bioensayos era similar a aquel observado previamente para GDNF de rata purificado a partir de medio acondicionado de células B49. En el bioensayo de supervivencia de neuronas simpáticas, el ED50 para rhGDNF era de aproximadamente 3 ng/ml (Fig. 27) y el ED50 para GDNF de rata era de aproximadamente 5 ng/ml. En el ensayo de captación de dopamina en cultivo mesencefálico, el ED50 para rhGDNF era de aproximadamente 30 pg/ml (Fig. 28) y para GDNF de rata aproximadamente 50 pg/ml. Estos resultados indican que una proporción sustancial de rhGDNF era exitosamente replegada y completamente biológicamente activa.

Ejemplo 7 Producción y aislamiento de anticuerpos para GDNF

Se generaron anticuerpos para rhGDNF mediante el siguiente procedimiento. Se observa que este procedimiento incluye aunque no se limita a este adyuvante, protocolo de inmunización y especie de animal. Asimismo, los anticuerpos para GDNF pueden ser cultivados utilizando la proteína natural, replegada o la proteína desnaturalizada, inactiva como en el procedimiento proporcionado más abajo o con péptidos contiguos de la secuencia de GDNF de especies humanas o de otras especies animales.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser generados mediante uno de muchos procedimientos convencionales (ver Antibodies, a laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory 1988 ISBN 087969-314-2 editor Ed Harlow y David Lane). Brevemente, ese tipo de procedimiento para generar anticuerpos monoclonales típicamente aunque no exclusivamente involucra inmunizar a los animales apropiados y monitorear la respuesta a los anticuerpos de estos animales al protocolo de inmunización, aislando células productoras de anticuerpos tales como de un órgano linfoide de uno o más animales sensibles, fusionando estas células con una línea celular apropiada tal como células de mieloma para producir hibridomas que son células inmortales secretoras de anticuerpos, y screening para aislar en forma progresiva hibridomas hasta que se obtienen clones de célula única que producen el anticuerpo monoclonal deseado.

Se cultivaron anticuerpos policlonales en conejos de la siguiente manera: Dos mililitros de solución salina estéril que contiene 0,005-0,25 mg de rhGDNF se inyectaron en un frasco de la emulsión MPL-TDM-CWS de adyuvante RIBI (RIBI ImmunoChem Research, Inc.) y se sometió a vórtice para formar una emulsión según las instrucciones del fabricante. Se inyectaron conejos blancos de Nueva Zelanda hembras anestesiados siguiendo el protocolo de inmunización sugerido de RIBI. Se administró un mililitro de emulsión de antígeno adyuvante de la siguiente manera:

0,30 ml intradérmicos (0,05 ml en cada uno de seis sitios)

0,40 ml intramuscular (0,20 ml en cada pata trasera)

0,10 ml subcutáneos (región del cuello)

0,20 ml intraperitoneal

Los animales fueron inyectados nuevamente (refuerzo) cada 4-6 semanas mediante el mismo protocolo. Se extrajo sangre de los animales antes de la primera inyección y a 10-14 días después de cada refuerzo para ensayar para determinar la producción de anticuerpos con un ensayo de neutralización o un ELISA estándar.

El ensayo de neutralización se llevó a cabo de la siguiente manera utilizando el ensayo de cultivo mesencefálico E16 de rata. Se diluyó suero de ensayo de conejo en medio esencial mínimo de Dulbecco tamponeado con HEPES 25 mM hasta pH 7,4 conteniendo 5 mg/ml de seroalbúmina bovina (denominada BSA5). Esto, a su vez, fue agregado a los pocillos de ensayo (25 ul de suero de ensayo diluido en 500 ul de solución de cultivo tisular) y se dejó incubar a 37º durante 30 minutos. A continuación, se agregó rhGDNF como 25 ul de una solución diluida como producto base en BSA5 que contenía rhGDNF a 6,32 ngm/ml para una concentración de rhGDNF final de 0,316 ngm/ml en el ensayo. Se midió la captación de dopamina después de ocho días en cultivo mediante el procedimiento previamente descrito. Los resultados con antisueros de los segundos refuerzos son mostrados a continuación para el ensayo de neutralización (Referirse a la Tabla 2 que aparece a continuación).

TABLA 2

6

* Dilución de antisuero para 50% de neutralización de captación de dopamina estimulada por GDNF

+ dilución de antisuero para 50% de la señal máxima (meseta) en ELISA

Los antisueros también fueron titulados para anticuerpos de GDNF en un ELISA estándar mediante el siguiente procedimiento: Placas de microtitulación (96 pocillos, Nunc maxisorp) se revistieron con 100 ul por pocillo de rhGDNF a 1,0 ugm/ml en bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9,6 como buffer de revestimiento durante toda la noche a 4ºC. Las placas fueron lavadas cuatro veces con buffer de lavado de placas (PWB; solución salina fisiológica con buffer de fosfato, pH 7,2 que contenía 0,5% Tween 20) y luego se bloquearon durante 2 horas a 25ºC con 200 ul por pocillo de 2% seroalbúmina bovina en solución salina fisiológica con buffer de fosfato, pH 7,2. Las placas se lavaron nuevamente con PWB y las muestras de suero a ser tituladas (100 ul diluidos en 20% suero de cabra normal y PWB) se agregaron a los pocillos. Las placas se incubaron durante 1,5 horas a 35ºC y se lavaron nuevamente con PWB. Se agregó IgG anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Jackson Immunochemicals) en una dilución 1:2500 en PWB a cada pocillo (100 ul) y se incubaron durante 1,5 horas a 35ºC. Las placas se lavaron con PWB como antes. Luego, se agregó sustrato p-NPP (fosfato de p-nitrofenilo disódico; Sigma Cat. no. MP389) a cada pocillo (100 ul a 1,0 mg/ml de p-NPP en 10% dietanolamina, pH 9,8) y la placa se incubó a 25ºC. El desarrollo del color fue seguido por lectura de las placas a 405-490 nm en un lector de placa (Molecular Devices Enax).

También se utilizaron antisueros para detectar y cuantificar GDNF en Western Blots de la siguiente manera: Se llevó a cabo la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS PAGE) mediante el procedimiento básico primero descrito por U.K. Laemmli (Nature 227: 680-685 (1970)) utilizando un gel de resolución de acrilamida 12 1/2% y gel de superposición de acrilamida 4 ½%. Los geles (16X14X0,15 cm) fueron sometidos a electroforesis a 40 m amp corriente constante durante 3 horas. Para reducción/ desnaturalización, las muestras se calentaron a 100ºC durante 10 minutos en buffer de muestra que contenía SDS al 1% y 2-mercaptoetanol 150 mM.

Para Western blotting, el gel fue luego sometido a transblotting sobre membrana Immobilon-P (Millipore Cat. No. IPVH 151 50) a 80m amp de corriente constante durante 16 horas en Trisbase 25 mM, glicina 192 mM, 0,1% SDS y metanol al 20% y se procesó de la siguiente manera:

1) La membrana fue bloqueada durante una hora a 25ºC en buffer de bloqueo (Tris 10 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 150 mM; 0,05% Tween 20; 4% de leche descremada; y 0,02% de azida de sodio) con suave oscilación.

2) La membrana se incubó a continuación a 25ºC durante 2 horas con suave oscilación en buffer de bloqueo que contenía antisueros primarios diluidos a GDNF.

3) La membrana se lavó (4 lavados de 5 minutos) en buffer de bloqueo.

4) La membrana se incubó a continuación a 25ºC durante 2 horas con suave oscilación en buffer de bloqueo que contenía anticuerpo secundario diluido (IgG anti-conejo de cabra purificado por afinidad conjugado con fosfatasa alcalina; Cappel Cat. No. 59299).

5) La membrana se lavó (4 lavados de 5 minutos) con buffer de bloqueo excluyendo la leche descremada.

6) La membrana fue desarrollada en 50 ml de buffer desarrollador (Tris 100 mM, pH 9,5 que contenía NaCl 100 mM y MgCl_{2} 5 mM) con 165 ul de NBT y 83 ul de BCIP (kit de Promega con No. de Cat. P3771) a 25ºC con suave oscilación hasta que se consigue la tinción deseada.

Ejemplo 8 Preparación de células encapsuladas de membrana que secretan GDNF, e implantación en paciente

Las células que secretan GDNF pueden ser encapsuladas en membranas semipermeables para implantación en pacientes que sufren de daño a los nervios. En una realización preferida, el paciente sufre de mal de Parkinson, y las células encapsuladas que secretan GDNF son implantadas en el striátum del paciente para proveer GDNF a los cuerpos de células dopaminérgicas.

En una realización de la invención, las células que han sido construidas para secretar GDNF, tales como aquellas preparadas y descritas en los Ejemplos 5 y 6 anteriores, son incorporadas en inserciones poliméricas biocompatibles, implantables y recuperables. Las inserciones pueden estar diseñadas de modo de permitir que el GDNF secretado entre en el tejido que rodea a las células implantadas, mientras que evitan que factores del tejido lindante que serían perjudiciales para las células entren a las células.

Las células que han sido construidas para secretar GDNF pueden estar encapsuladas en ese tipo de membranas semipermeables de acuerdo con el método descrito en la solicitud PCT publicada WO 91/10425, titulada Cell Capsule Extrusion Systems (Sistemas de Extrusión de Cápsulas de Células). Las células encapsuladas en membranas pueden ser implantadas en el striátum de acuerdo con procedimientos quirúrgicos convencionales.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: Lin et al.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Factor Neurotrófico de Origen Glial

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(IV)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Beaton & Swanson, P.C.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 4582 South Ulster Street Parkway, Suite #403

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Denver

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Colorado

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 80237

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Diskette, 5,25 pulgadas, 360 Kb de almacenamiento

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

COMPUTADORA: IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: MS DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Wordperfect 5.1

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: NINGUNO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUDES PREVIAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 07/788.423, 07/774.109, 07/764.685

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-NOV-1991, 08-OCT-1991, 20-SEP-1991

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/ AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Barry J. Swanson

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 33.215

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/ CARPETA: SYNE-225c3

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (303) 850-9900

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (303) 850-9401

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. NO.: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: fragmento N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Pro Asp Lys Gln Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Xaa}

\sac{Gln Ala Ala Ala Ala Ser Pro Asp Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(3) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO: Xaa es Lys o Gln

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Xaa Ile Leu Lys Asn Leu Gly Arg Val Arg Arg Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(3) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 890 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NO. DE HEBRAS: única

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

CLAVE: (ilegible)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(5) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 134 residuos aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/ CLAVE: secuencia de aminoácidos inferida para GDNF de rata maduro

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 4:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(6) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 562 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NO. DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: secuencia de ácidos nucleicos para GDNF humano

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 5:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(7) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 134 residuos aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: secuencia de aminoácidos inferida para GDNF humano maduro

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 6:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(8) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: sonda de oligonucleótidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: N en posiciones 3, 15 y 18 es inosina

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCNGAYAARC ARGCNGCNGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(9) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 223 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: secuencia de ácidos nucleicos para GDNF humano

12

\vskip1.000000\baselineskip

(10) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

No de HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: ligante

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCGAATTCG GG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(11) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 residuos aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Asp Lys Gln Ala Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(12) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: secuencia de ácidos nucleicos de pBluescript SK-76.1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAG AGG AAC CGG CAA GCT GCW GMW GYM WGM CCW

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(13) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 12

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 residuos aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Ser Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(14) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: oligonucleótido DHD-26

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: N en posiciones 9 y 12 son inosina

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ARRTTYTTNA RNATYTTRTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(15) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 residuos aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(16) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: cebador de oligonucleótidos PD1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACGGGACTC TAAGATG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(17) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 16

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: cebador de oligonucleótidos DHD23

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: N en posiciones 3, 6 y 18 es inosina

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCNGCNGCYT GYTTRTCNGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(18) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: cebador de oligonucleótidos LF2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAGACAATG TACGACA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(19) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTGGAGCC AGGGTCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(20) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

NO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: cebador de oligonucleótidos PD1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCGAATTCG ACGGGACTCT AAGATG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(21) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 20

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: cebador de oligonucleótidos LFA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGTGGCCAG AGGGAGTGGT CTTC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(22) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 21

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: cebador de oligonucleótidos PD3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGATCCA ATAAGGAGGA AAAAAAATGT CACCAGATAA ACAAAT

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(23) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 22

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: cebador de oligonucleótidos PD4

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGTACCC AGTCTCTGGA GCCGGA

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(24) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 23

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: fragmento adaptador para plásmido pCJ1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

(25) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NO DE HEBRAS: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: secuencia poliligante para plásmido pCJX1- 1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (37)

1. Un método para preparar una proteína factor neurotrófico purificado y aislado en donde el método comprende la preparación de una proteína la cual comprende una secuencia de aminoácidos según los expuesto en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6 o dicha proteína tiene un grado de homología en exceso de 70% con las secuencias expuestas en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6, en donde dicha proteína tiene la capacidad de promover la captación de dopamina en neuronas dopaminérgicas.

2. El método de preparación de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos es homóloga en exceso de 80% a las secuencias expuestas en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6.

3. El método de preparación de una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 6.

4. El método de preparación de una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha proteína es glicosilada.

5. El método de preparación de una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha proteína es no glicosilada.

6. El método de preparación de una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 ó 5, en el cual la proteína tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un residuo metionina en la terminal amino.

7. El método de preparación de una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6 cuya proteína es obtenible por tecnología recombinante.

8. El método de preparación de una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha proteína es modificada por unión de una o más porciones poliméricas.

9. El método de preparación de una proteína de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual la porción polimérica es polietilenglicol.

10. Un método para preparar una secuencia de ácidos nucleicos en donde el método comprende la preparación de un ácido nucleico que codifica una proteína factor neurotrófico según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. Un método para preparar una secuencia de ácidos nucleicos purificada y aislada en donde el método comprende la preparación de un ácido nucleico que codifica a una proteína factor neurotrófico, en donde dicha secuencia de ácidos nucleicos:

(a) comprende a los nucleótidos 304 al 705 de SEC ID NO: 3 o los nucleótidos 105 al 506 de SEC ID NO: 5; o

(b) codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6; o

(c) codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos con un grado de homología en exceso de 70% con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6; o

(d) hibrida a una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a una sonda de oligonucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6;

y en donde dicha proteína tiene la capacidad de promover la captación de dopamina en neuronas dopaminérgicas.

12. Un método para preparar un vector en donde el método comprende la preparación de un vector que comprende elementos reguladores de la expresión ligados operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11.

13. Un método para preparar una célula huésped transformada o transfectada aislada de su ambiente natural en donde el método comprende transformar o transfectar una célula huésped con un vector obtenible de acuerdo con la reivindicación 12.

14. El método para preparar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la célula huésped se selecciona entre el grupo que consiste en células de mamífero y microorganismos.

15. El método para preparar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 14 en donde la célula huésped es una célula COS-7 o una célula de E. coli.

16. El método para preparar una célula huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde dicha célula es adecuada para implantación humana y en donde dicha célula expresa y secreta un factor neurotrófico.

17. El método para preparar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicha célula es transformada o transfectada ex vivo.

18. El método para preparar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, en donde dicha célula es encerrada en una membrana semipermeable adecuada para implantación humana.

19. Un método para la producción de factor neurotrófico que comprende los pasos de:

(a) cultivar una célula huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 bajo condiciones adecuadas para la expresión de factor neurotrófico por dicha célula huésped; y

(b) opcionalmente, aislar el factor neurotrófico expresado por dicha célula huésped.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, el cual comprende además el paso de replegar el factor neurotrófico aislado.

21. Un método para preparar un factor neurotrófico purificado, en donde dicho factor es obtenible de acuerdo con el método de las reivindicaciones 19 ó 20.

22. Un método para preparar una composición farmacéutica en donde el método comprende la preparación de una proteína neurotrófica de acuerdo con un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 21, o de acuerdo con un método de la reivindicación 19 ó 20.

23. Un método para preparar una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 22 para utilizar en la prevención o tratamiento del daño o enfermedad de las células nerviosas o células nerviosas que funcionan en forma incorrecta.

24. Un método para preparar una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 23 para utilización en la prevención o tratamiento del mal de Parkinson.

25. Un método para preparar una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 23 para utilización en la prevención o tratamiento del mal de Alzheimer.

26. Un método para preparar una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 23 para utilización en la prevención o tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica.

27. Un método para preparar una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 23 para utilización en la prevención o tratamiento del daño o enfermedad de células nerviosas debido a lesión física, isquemia, exposición a neurotoxinas, enfermedades metabólicas crónicas o enfermedades neurodegenerativas.

28. Un método para preparar una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 27 para utilización en el tratamiento del daño a las células nerviosas debido a accidente cerebrovascular, polineuropatía diabética, o neuropatía tóxica causada por un agente terapéutico.

29. Un método para preparar un anticuerpo, en el cual el método comprende inmunizar a un animal con una proteína factor neurotrófico que comprende una secuencia de aminoácidos según lo expuesto en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6.

30. El método de preparación de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 29, en el cual dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

31. El método de preparación de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 29, en el cual dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

32. Un método para preparar un dispositivo para tratar el daño a los nervios, en donde el dispositivo es preparado utilizando:

(a) una membrana adecuada para implantación; y

(b) células recombinantemente modificadas obtenibles de acuerdo con la reivindicación 13 las cuales expresan y secretan la proteína factor neurotrófico encapsulada dentro de dicha membrana;

para encapsular las células en la membrana y en donde dicha membrana es permeable a la proteína factor neurotrófico e impermeable a materiales perjudiciales para dichas células.

33. El método de preparación de un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 32, en donde dicho factor neurotrófico comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6.

34. Un método de preparación de un hibridoma que comprende pasos, en donde las células productoras de anticuerpos son fusionadas con una línea celular apropiada, produciendo dicho hibridoma un anticuerpo monoclonal que se une a un factor neurotrófico que comprende una secuencia de aminoácidos según lo expuesto en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6.

35. Un proceso para aislar factor neurotrófico poniendo en contacto dicho factor con un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6.

36. Un método para la producción de factor neurotrófico que comprende los pasos de:

(a) cultivar una célula huésped transformada o transfectada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína factor neurotrófico bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína,

en donde dicha secuencia de ácidos nucleicos está ligada operativamente a un promotor no natural; y en donde dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6; y

(b) aislar dicha proteína expresada en una forma sustancialmente purificada de dicho cultivo de células huéspedes,

en donde dicha proteína tiene la capacidad de promover la captación de dopamina en neuronas dopaminérgicas.

37. El método de acuerdo con la reivindicación 36, que comprende además replegar la proteína factor neurotrófico expresada para formar un dímero unido a disulfuro.