TW401422B - Glial cell line-derived neurotrophic factor - Google Patents

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TW401422B TW081108487A TW81108487A TW401422B TW 401422 B TW401422 B TW 401422B TW 081108487 A TW081108487 A TW 081108487A TW 81108487 A TW81108487 A TW 81108487A TW 401422 B TW401422 B TW 401422B
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Description

經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 401422 ___ 取月s修正 -丨 Μ 補光—-- 五、發明説明（1 ) 一^ 相關申請案之互相參考 本申請案爲美國專利案第07/855，413號（公 告於1992年3月19日），美國專利案第 07/788，42.3號（公告於1991年1 1月6曰 )，美國專利案第07/774，1〇9號（公告於 1 9 9 1年1 0月8日）及美國專利案第 07/764，685號（公告於1991年9月20曰 )之部份續篇，其各自的標題爲、神經膠質衍生之神經營 養因子#。 發明範園 本發明是有關神經營養因子，特別是神經膠質細胞系 衍生之神經營養因子（G D N F ) ·也包括在本發明的是 自天然來源純化GDNF之過程，及選殖編碼GDNF之 大鼠及人類基因之過程，以及編碼GDNF之大鼠及人類 基因之核酸序列。G DN F基因已繼代選殖至表現載體中 ，且載體用以表現生物活性之GDNF。此外，本發明包 括使用G D N F用以避免及治療神經傷害及神經相關疾病 ，如巴金森氏病。 本發明也揭示GDNF之抗體，以及鑑定神經營養因 子GDNF族中成員之方法•且最後描述，經由將分泌 G D N F之細胞移植至病人中而避免或治療神經傷害之方 法》 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -3 - 1 (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) •訂 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 401422 ___ 取月s修正 -丨 Μ 補光—-- 五、發明説明（1 ) 一^ 相關申請案之互相參考 本申請案爲美國專利案第07/855，413號（公 告於1992年3月19日），美國專利案第 07/788，42.3號（公告於1991年1 1月6曰 )，美國專利案第07/774，1〇9號（公告於 1 9 9 1年1 0月8日）及美國專利案第 07/764，685號（公告於1991年9月20曰 )之部份續篇，其各自的標題爲、神經膠質衍生之神經營 養因子#。 發明範園 本發明是有關神經營養因子，特別是神經膠質細胞系 衍生之神經營養因子（G D N F ) ·也包括在本發明的是 自天然來源純化GDNF之過程，及選殖編碼GDNF之 大鼠及人類基因之過程，以及編碼GDNF之大鼠及人類 基因之核酸序列。G DN F基因已繼代選殖至表現載體中 ，且載體用以表現生物活性之GDNF。此外，本發明包 括使用G D N F用以避免及治療神經傷害及神經相關疾病 ，如巴金森氏病。 本發明也揭示GDNF之抗體，以及鑑定神經營養因 子GDNF族中成員之方法•且最後描述，經由將分泌 G D N F之細胞移植至病人中而避免或治療神經傷害之方 法》 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -3 - 1 (請先閲讀背面之注$項再填寫本頁) •訂
__86..1 9 6補充 B7_ 五、發明説明（7 ) (Williams et al. 1 986 Proc.Nat 1. Acad.Sci. USA 83： 9231)。於本發明中提出決定G D N F可有效治療的其他 神經傷害型式之方法。
Patrick Aebischer及其同事已描述可半滲透，可植 入之膜裝置之用法，其在某些狀況下列充作遞送藥物或醫 藥品之工具。如，其已提出對分泌神經遞質因子之細胞包 膠之，並將此種裝置植入巴金森氏病患者之腦中。具美國 專利第 4，8 9 2，5 3 8 ( Aebischer et al.);美 國專利案第 5，0 1 1 · 4 7 2 (Aebischer et al.) :美國專利第 5，1 0 6，6 2 7 (Aebischer et al. );PCT 案 W〇91/10425;PC 案 W091/ 1 0 4 7 OWinn et al.1991 Erper. Neurol,113：322-329;Aebischer et al , 1991 Erper. Neurol 111:269- 275;及 Tresco et al 1992 ASAIO 38:17-23。 發明要點 本發明是有關及由請專利範圍的是實質上純化的神經 膠質細胞系衍生之神經營養因子（GDNF)。於本發明 一個具體實例中，得到比活性較B 4 9調適培養基高出至 少約24，000倍之實質上純化的GDNF。實質上純 化的GDNF具有至少約12，000TU/微克之比活 性。 本發明實質上純化的GDNF，具有在非還原SPS — PAG E上約31 — 4 2 kD之視分子量，及在還原 SDS — PAGE上約20 — 23kD之視分子量。實質 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印策 -9 - 401422 A6 B6 鱖濟部中央#準屬員工消#舍祚榦*-« 五、發明説明（2 ) 發明背醫 神經營餐因子是天然的蛋白質，見於神經条統或由神 經条统剌激活動之非神經糸統·其功能傺促進神經及/或 神經P質細胞之存活及維持其表型之分化（Varon and Barge 1979 Ann. Rev. Neuroscience 1 ί 3 2 7 ϊ Thoenen and Edgar 1985 . Science 229:238) 〇 由於此 生理角色，神經營養因子可用於治療發生於各種神經變性 疾病之神經細胞的變性及分化功能之喪失。 為了使持殊的神經營養因子可用於治療神經傷害，受 損的神經細胞必須對因子可感受。不同的神經營養因子通 常影馨不同類型的神經細胞。因此，較好是擁有各種不同 的神經營養因子以治療可能發生的不同型式之疾病或傷害 中的毎一種受損神經元。 神經營養因子可保護感受神經元拮抗各種不相翻之傷 害。如，神經營養因子神經生長因子（NGF)可救援潁 螫部份之感覺神經元，使其不致於因為切斷軸索突而死亡 ,(Rich et al· 1987) J. Neurocytol 16：261； Otte et al·, 1987 J. Neurosci 83:150),於胚胎發展中免於 値體發生之死亡（Hamburger et al. 1984 J. Neurosci 4:767)及因投予红豆杉酵或順氡居鉑所放之傷害（ Apfel et al.1991 Ann Neurol，29:87)。此顯而易見之 保護通則導致一種槪念，即若神經營養因子保護感受神經 元拮抗實驗性傷害，則其將可用於治療病人神經元受損所 涉及之疾病，即使病因是未知的。 a 先 Η 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 訂 本紙張尺度適用中困國家樣準（〇~5)甲4规格（2〗0乂 297么、釐）-4 81.9.25,000 4S1 娜
A7 B7 列 序 酸 基 胺 ： 歹 歹 下序 括端 包末 上基 質胺 實之 段一 1 有： I具ο ， Ν F )N D 8 D I (G 训之Q 胸化Ε 矽純S 五 (Ser)-pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala-Leu-Pro-Arg-Arg-Glu-(Arg)-Asn-( )-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-(Ser)-Pro-(Asp)-(Asn).' 大鼠GDNF之成熟及'^前原'型式之胺基酸序列示於圖 13 及 14(SEQ ID N0:3 及 SEQ I D N 0:4)。成熟人類GDNF之胺基酸序列示於圓19劃 線部份（SEQ ID N0:5) ·人類GDNF之前 原型式之胺基酸序列示於圖9 (SEQ ID N 0 ： 5 )及 22(SEQ ID N0:8)。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 k-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本發明的一方面是取得純化GDNF之方法，包括： 1 )製備B 4 9神經膠質母細胞瘤細胞之無血清生長調適 培養基；2)濃縮調適培養基；3)在經濃縮之調適培養 基上進行肝素Sepharose層析；4 )自該肝素Sepharose 層析所得流份上進行快速蛋白質液相層析；及5)在得自 快速蛋白質液相層析流份上進行逆相高性能液相層析。於 一個具體實例中，獲得純化GDNF的方法進一步包括： 6 )將由逆相高性能液相層析所得之流份接受製備式S D S-PAGE ;及7)在由製備式SDS-P A G E所得之流份上進行逆相髙性能液相層析· 本發明也描述自由B 4 9細胞株製備之c DNA庫中 選殖大鼠GDNF塞因·編碼成熟的及前原型大鼠 GDNF之核酸序列示於圖13(SEQ ID NO: 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -10 - A6 B6 «濟部中央樣準«霣工消♦含作杜*-« 五、發明説明（3 ) 一待定的神經營餐因子，加上具有正確的神經元特異 性，必須有足夠應用的量才可充作藥學治療用。由於組嫌 中神經營養因子存在之量極少（如Hofer and Barde 1988 Nature 331:261 ； Lin et a 1· 1989 Science 246： 1023) ·因此自動物组織中車接製備藥學用置之神經營養 因子將是不合宜的。抑或，希望定位出神經營養因子之基 因位置，且以該基因為基礎建立一傾重组體表現条，以可 能地産生無限置之蛋白質。 本發明者描述一種在生物樣品中篩選神經營養活性之 方法，偽在於巴金森氏病中會變性之黑質多巴胺能神經元 之胚胎前軀賭上進行。此鑑定神經營養因子之生物檢定法 可用於治療巴金森氏病，此傣依據先前所述之分析為基礎 的（Friedman et a 1. 1987 Neuro · Sci.Lett.79: 65-72,待列為本案參考）且加以修飾應用於本發明中。 此分析法可用於篩選和多巴胺能神經元有開之神經營 養活性之各種可能來源。本發明描述一種新神經營養因子 之特性，其純化自此種來源之一，即神經膠質母細胞瘤细 胞株，B49之調適培養基（Schubert et al· 1974 Nature 249:22^-27·持列為本案參考）。得自此細胞之諝 適培養基，已報告含有多巴胺能神經營養活性（Bohn et al. 1989 Soc. Neurosci Abs.l5:277)。於此先前報告中 ，神經營餐活性之來源並未被純化，化學地記述，或示出 1 是諝適培餐基中單一作用物之结果。 神經傷害是由危害一種以上神經細胞存活及/或正確 <請先《讀背由之注意事項再瑱寫本||^ -·装. 訂. •槔 本纸張尺度適用中a國家«準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）-5 - 81.9.25.000 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 --- 附件二(A):第81108487號專利申諝案 年月曰修^]中文說明書修正頁民國89年4月呈 651 4 t,補本·__ * . 五、發明說明（10 ) 包括避色或治療神經傷害之方法，此方法包括將分泌神經 膠質細胞系衍生之營養因子之細胞植入有所需之患者體內 。最後，本發明包括經由植入病體以避免或治療神經傷害 之裝置，其包括一個可半滲透之膜，及包膠在該膜內可分 泌GDNF之細胞，且該膜對GDNF是可滲透的而對得 自病體有害於細胞之因子則是不可滲透的。 圖式簡單說明 圖1示出經濃縮之B 4 9神經膠質母細胞瘤細胞，無 血清生長調適培養基溶液之肝素Sepharose層析結果。結 果示出溶離液O.D.290( ——)，導電性（一 △一） ，及按TU計之GDNF活性。匯集標以橫線 之流份以進一步純化。 圖2示出得自圖1匯集流份示HP L C Superose層 析結果。結果示出〇 _ D . 28。（— 一），及按TU計之 GDNF 活性（一 〇 —)。 圖3示出圖2第1 4號流份之RP — HPL C結果》 結果示出0 . D · 214，按TU計之GDNF活性示於下 〇 圖4示出上圖3中3—10流份之SDS—PAGE 銀染色分析結果。第S列含有分子量標準。 圖5示出圖4中5及6流份之製備式S D S — PAG E結果。凝膠片測試按TU計之G DN F活性。凝 膠片也利用分子量標記校正分子量（Anershain) ° 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) v--------訂---------線 -12 - 經濟却中央樣準局霣工消#合作杜<f« A6 _.__B6 五、發明説明（4 ) 功能之狀況所造成的。此種神經傷害可能由各種不同原因 所致，其中某些列於下文。 神經傷害可經由身體傷害而發生，其迪成近傷寄位置 之軸索突及/或神經細胞髖之受性。神經傷害也可能因為 血流至部份神經条之暫時或持久的中斷而發生，如中風中 。神經傷害也可因為故意或意外地曝於神經毒素下而發生 ，如癌症及A IDS化學治療剤，分別為順氛氨鉑及二去 氣胞苷（ddC)。神經傷害也可由慢性代謝疾病所致， 如糖尿病或瞀功能障礙。神經傷害也可因神經變性疾病所 致，如巴金森氏病、阿滋海黙爾氏病、及肌萎縮性倒索硬 化（ALS),其由於待異的神經元族群受性所致。 本案描述一種新穎的神經營餐因子。神經營餐因子為 天然的蛋白質，其可促進特異神經細胞之正常功能及/或 保護相同的細胞拮抗各種不同型式之傷寄。因為道些持性 ，使GDNF被建議可用於治療各種型式之神經傷害，包 括上示的各種型式。 巴金森氏病由獨待的症狀而鑑知，包括僵硬、蓮動徐 缓、皮脂溢、急促步式、鼙曲姿勢、多涎、及"小球滾動 "式震顱。此病在全世界所有人種均會發生，且平均發病 年齡為β 0歲。 於衝突理論及爭論年後，巴金森氏病之生化基礎浮現 為主因。（見Bergman，1990 Drug Store News» 12: ID19)。了解巴金森氏病的一値重點是稱之為黑質的基底 神經節區域，且待別是纹狀體。黑質，中腦色素灰質之二 (請先Μ讀背Φ之注意事項再填寫本t ί裝· 訂. •線.}----- 本紙張尺度適用中B团家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公#)-6- 81.9.25,000
A7 B7 401似 五、發明説明（11 ) 圇6示出圖5中1 6-23流份之RP — HPLC結 果。A層析圖是樣品，且B層析圖是對照組（來自空白列 相當膠片之匯集膠萃取物）。 圖7示出圖6A第3峰（1列）及分子量對照組（S 列），銀染色SDS - PAGE之分析結果。 圖8(SEQ ID N0:1)示出得自純化GD N F之胺基末端胺基酸序列。空白括號顯示該位之胺基酸 無法利用是序技術予以決定。若殘基示於括號內，表示該 殘基確.認有某些不確定。完全正確的胺基末端胺基酸序列 示於下圖19(SEQ ID N0:5)中。 圖9示出胰蛋白酶水解之純GDNF之RP— HP L C結果•層析A圖含有樣品，且層析B圖是對照組 (只含胰蛋白酶）。 圖1 0示出圖9第3 7號峰之RP — HPLC結果， 係先經溴化氰處理》 圖11示出圖10第1號峰還原產物之RP-HPLC結果。 圖12(SEQ ID NO:2)描述純GDNF之內部胺基酸序列。 圖13(SEQ ID NO:3)示出衍自B49細胞庫cDNA純系 λ ZapI 176. 1之大鼠GDNF核酸序列。也示出指導合成GDNF 之胺基酸序列。指導合成成熟GDNF之核酸序列底下劃線。 GDNF大部份較佳的前原型胺基末端序列則標以*號。 、圖14(8£〇 ID N0:4)示出所指之成熟GDNF之胺基酸序 列· 圖1 5示出純化之B 4 9細胞GDNF及人類重組體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -V、1T.\---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央梂準局負工消費合作社印製 -13 - m. 濟 部 中 央 樣 竿 霣 X 消 费 合 作 杜 % A6 B6 五、發明説明（5 ) 側成對層，涉及於多巴胺之傳送，而正常的基底神經節作 用你涉及一糸列交互作用及迴餓条统，其與黑質有蘭且部 份由多巴胺，乙醒腔驗及其他物霣所調控。 於巴金森氏病中，有因神經元變性所致之黑質多巴胺 能能活性之官能障礙。此造成多巴胺缺失之狀況及活性平 衡移向瞻齡能控制。因此，雖然乙醛膽鹼濃度沒有增加， 由此膽驗能調介物在中樞神經糸之剌激性作用可壓倒已耗 竭多巴胺之抑制作用。 迄今對巴金森氏病最有效之治f是口服左旋多巴。左 旋多巴可穿透中樞神經条統，且在基底神經節中酵素性轉 化成多巴胺。咸倍，左旋多巴之有益作用偽在於增加多巴 胺於腦中之濃度。不幸地，不論是左旋多巴或任何較少利 用之諝介物均無法確實地抵抗因為多巴胺能神經元變性作 用所造成的疾病之進行。 其他的研究者已報告在各種生物來源中存在有多巴胺 能活性。於Springer等人的PCT案W09 1/ 01739中，於衍生自週邊神經条細胞之萃取物中鑑定 出一種多巴胺能神經罃養活性。所鑑知之活性並未純化 ，但歸於分子量在10, 000道耳呑以下的因子。因子 自大鼠坐骨神經中分離，但顯然非CNTF,其他見於神 經（Lin et al . 1989 Science 246:1023)。 於Appel等人的美國專利案第5, 017，7 3 5號 中，於尾殼组織萃取取物中鑑知多巴胺能活性。再次，並 未純化出引起活性之因子，且含活性之流份表現分子置十 本紙張尺度適用中國囲家揉準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）-7 81.9.25.000 (請先Μ讀背由之注意事項再填寫本 .装· 訂·
8& 3. 2d # B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（12 ) C N T F促進雞胚睫狀神經節的得之副交感神經元存活之 結果》Y軸光密度之增加長示神經元的得存活增加。X軸 代表各神經因子漸減之澳度。標以對照組之曲線，係和用 來產生標以GDNF曲線之含GDNF流份相鄰之等體積 無法性流份。 圖1 7示出CO S細胞調適培養基，對於經由培養中 中腦多巴胺能神經元增加多巴胺能攝入能力之生物檢測法 。Y軸代表所吸收之經放射標記之多巴胺含量，相對於X 軸之漸增量之澳縮C 0 S細胞培養基。標以B - 1之曲線 代表來自C 0 S細胞之無血清調適培養基，此細胞爲 GDN F基因以表現GDN F之正確方位所轉感。標以 C 一 1之曲線代表來自C 0 S細胞之無血清調適培養基， 以GDNF基因以避免GDNF表現之相反方位轉感之。 圖1 8示出COS細胞調適培養基，對於增加來自雞 胚交感鏈之交感神經元培養存活能力之生物檢測法·Y軸 代表爲培養減少的MTT染料量，且和神經元之存活呈比 率。X軸代表濃縮的C 0 S細胞培養基增加之稀釋倍滅。 標以GDNF之曲線代表COS細胞無血清調適培養基， 其以GD N F基因在GDNF可表現之適當方位轉感•標 以對照組之曲線代表C 0 S細胞之無血清調適培養基，其 爲G D N F基因在避免表現之相反方位轉感之。 圖19(SEQ ID NO :5)示出如下實例2 C所述’所得之人類GDNF之部份核酸序列，包括指導 合成成熟人類G D N F之全部基因部份。也示出所指之成 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） I ,^I I I— IH n 11 n n I (請先H讀背面之注意事項再填寫本頁) -14 - 4〇ί4-2 Α6 Β6 纒濟部中央«準屬Ai消费含作杜_« 五、發明説明（6 ) 分小。也見 Niiji 麗 er et al.1990 Brain Res. 528:151-154(成鼠腦之化學去向心的纹狀體）；Lo et al, 1990 Soc. Neurosci Abstr· 16:809 (纹狀觼衍生之神經營餐 因子）。此外，也示出其他已知的神經營養因子具有多巴 胺能活性，如腦衍生之神經營養因子（BDNF),及酸 性及鹺性織維母細胞生長因子。 本發明的GNDF係依據其在由大鼠胚胎中腦所分離 之多巴胺能神經細胞培養中促進功能活性及存活之能力而 分離的。這些多巴胺能神經細胞為成鼠黑質中多巴胺能神 經細胞之胚胞胎,前軀體，而其傜於巴金森氏病中變性的。 因此，GDNF可用來減少由巴金森氏病症狀所引起的神 經元的變性。 再者，GDNF可用於治療病人多巴胺能神經細胞體 其他所損害型式或不正確的功能。此種傷害或官能障礙可 發生於精神***及其他型式之精神病。對此種狀況目前之 治療常霈在多巴胺受體具活性之蕖物，推想由這些搞有受 髖之神經元族群刺激活動之多巴胺能神經元之不適當功能 可能涉及於疾病過程中。 依據先前以其他神經營養因子所進行之實驗為基礎， 可現出可以GDNF治療的新型式神經傷害，因為由可感 受此神經營餐因子之各種型式之神經細胞中可學到更多。 如，神經生長因子（NGF)當近來發現其對於阿滋海黙 爾氏病中變性之基底前腦膽鹸能神經元可作用如神經營餐 因子時，可顯現出其對阿滋海黙爾氏病潛在的有用治療性 (請先W讀背面之注意事項再填寫本Γ -·裝· 訂. 線 一---·_--- 象纸張尺度適用中困团家«準（CNS)甲4规格（210 X 297«釐）_ 8 - 81.9.25,000
經濟部中央樣準局員工消費合作社印裝 i、發明説明（13 ) 熟人類GDNF胺基酸序列。成熟人類GDN F之胺基酸 序列底下劃線。 圖2 0示出GDNF於多巴胺能神經元中刺激多巴胺 攝入及酪胺酸羥化酶（TH)免疫染色之能力。如實例1 B般建立細胞培養。GDNF於塗佈日加入，並於9天後 於試管內再加以補充。1 5天後試管內偵翊3H — DA之 攝入A) * 16天後以4%仲甲醛試管內固定培養物，充 份洗滌，以0 · 2%三通X— 1 0 0使通透，並於TH多 株抗體染色（E u g i n e T e c h I n t e r n a t i ο n a 1，A 1 1 e n d a 1 e ,NJ)。利用Vectastain ABC，套組示像化初步抗體之結 合（Vector Labs, Burlingame,CA)。 圖2 1示出GDNF對多巴胺能神經元之特異性。培 養物如實例1B般建立·GDNF於塗佈日加入。於7天 後試管內偵測3H-DA之攝入。8天後試管內偵測 14C 一 GABA攝入。細胞培育並如3H — DA攝入般處 理，除了攝入緩衝溶液包括：克氏-林格氏磷酸塩緩衝溶 液，PH7 . 4，含有5 . 6mM葡萄糖，1 . 3mM EDTA，10/zM胺基一氧醋酸（以避免GABA瓦解 )，2mM；8 —丙胺酸（以抑制GABA之神經膠攝入） 及0 · ΙμΜ 14C — GABA (150毫居里/毫莫耳 ，New England Nuclear，Boston, ΜΑ)·於 1 mM二胺基丁 酸（DABA)存在下，14C_GABA強力抑制劑攝入 GABA神經元，14C_攝入減少1 0%。自實驗值中減 去DABA存在時之對照數值· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
n 1111 n ^ I I n I! I n SI n I _ 15 _
__86..1 9 6補充 B7_ 五、發明説明（7 ) (Williams et al. 1 986 Proc.Nat 1. Acad.Sci. USA 83： 9231)。於本發明中提出決定G D N F可有效治療的其他 神經傷害型式之方法。
Patrick Aebischer及其同事已描述可半滲透，可植 入之膜裝置之用法，其在某些狀況下列充作遞送藥物或醫 藥品之工具。如，其已提出對分泌神經遞質因子之細胞包 膠之，並將此種裝置植入巴金森氏病患者之腦中。具美國 專利第 4，8 9 2，5 3 8 ( Aebischer et al.);美 國專利案第 5，0 1 1 · 4 7 2 (Aebischer et al.) :美國專利第 5，1 0 6，6 2 7 (Aebischer et al. );PCT 案 W〇91/10425;PC 案 W091/ 1 0 4 7 OWinn et al.1991 Erper. Neurol,113：322-329;Aebischer et al , 1991 Erper. Neurol 111:269- 275;及 Tresco et al 1992 ASAIO 38:17-23。 發明要點 本發明是有關及由請專利範圍的是實質上純化的神經 膠質細胞系衍生之神經營養因子（GDNF)。於本發明 一個具體實例中，得到比活性較B 4 9調適培養基高出至 少約24，000倍之實質上純化的GDNF。實質上純 化的GDNF具有至少約12，000TU/微克之比活 性。 本發明實質上純化的GDNF，具有在非還原SPS — PAG E上約31 — 4 2 kD之視分子量，及在還原 SDS — PAGE上約20 — 23kD之視分子量。實質 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局貝工消費合作社印策 -9 -
經濟部中央橾準局員工消费合作社印製 GD NF 1 _ 5 0胺基酸之編碼予列•也示出人類前原 GDNF前5 0個胺基酸所指之胺基酸序列。此資料加上圖 19所給之編碼序列資料，可提出人類前原GDNF之全部 編碼序列，及所指的人類前原GDNF蛋白質胺基酸序列。 圖2 3示出如實例2D所述，p B S S Κ — λ3Α1 u Γ質體內之Sa c I I及P s t I位置7輿圖 〇 圖2 4示出GDN F對多巴胺能神經元之特異性。如 實例1B所述地製備培養· GDNF於塗佈日加入，並於6 天後試管內偵測攝入情況· A示出多巴胺之攝入，及爲5 羥色胺之攝入。 圖2 5示出由考馬斯藍所染的SDS- PAGE，爲 S-Sepharose管柱上含有未再折叠GDNF之細菌萃取物 ，於再折叠前層析所得之流份於還原條件下所進行的（見 實例6C) 。2—8列代表來自管柱溶離液之連續流份。 流份3_5富含GDNF予以匯集以供再折叠。1列爲分 子量標準品（SDS-70L，Sigma)。 圖2 6示出GDNF溶液之考馬斯藍染色的SDS — PAGE ;再折叠前（6&13列），再折叠後（2列） 及再折叠及其後以1 5 0mM2_巯基乙醇反向還原後（ 5列）·再折叠前及之後再反向還原之物質，以約16 kPa之單體型式進行。經成功再折叠之GDNF(無還 •適用中國國家標準（0奶）八4規格（210/297公釐） iw訂 ....— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -16 - 4S1 娜
A7 B7 列 序 酸 基 胺 ： 歹 歹 下序 括端 包末 上基 質胺 實之 段一 1 有： I具ο ， Ν F )N D 8 D I (G 训之Q 胸化Ε 矽純S 五 (Ser)-pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala-Leu-Pro-Arg-Arg-Glu-(Arg)-Asn-( )-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-(Ser)-Pro-(Asp)-(Asn).' 大鼠GDNF之成熟及'^前原'型式之胺基酸序列示於圖 13 及 14(SEQ ID N0:3 及 SEQ I D N 0:4)。成熟人類GDNF之胺基酸序列示於圓19劃 線部份（SEQ ID N0:5) ·人類GDNF之前 原型式之胺基酸序列示於圖9 (SEQ ID N 0 ： 5 )及 22(SEQ ID N0:8)。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 k-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本發明的一方面是取得純化GDNF之方法，包括： 1 )製備B 4 9神經膠質母細胞瘤細胞之無血清生長調適 培養基；2)濃縮調適培養基；3)在經濃縮之調適培養 基上進行肝素Sepharose層析；4 )自該肝素Sepharose 層析所得流份上進行快速蛋白質液相層析；及5)在得自 快速蛋白質液相層析流份上進行逆相高性能液相層析。於 一個具體實例中，獲得純化GDNF的方法進一步包括： 6 )將由逆相高性能液相層析所得之流份接受製備式S D S-PAGE ;及7)在由製備式SDS-P A G E所得之流份上進行逆相髙性能液相層析· 本發明也描述自由B 4 9細胞株製備之c DNA庫中 選殖大鼠GDNF塞因·編碼成熟的及前原型大鼠 GDNF之核酸序列示於圖13(SEQ ID NO: 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -10 - 修正 年月曰广86. 3. 26^甫充 A7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印掣 五、發明説明（15 ) 原作用）則呈約3 OkP a之二聚體型式進行* 1 5列爲 分子量標準品（SDS-70L，Signa)。 圖2 7示出利用再折叠的GDNF生物檢測之結果； 偵測促進培養中雞胚交感神經元存活之能力。生物檢測步 驟如實例4 A所述地進行。以Y -軸之光密度（和存活神 經元之數目成比率）對X軸之GDNF濃度作圖（以考馬 斯藍染色之SDS—PAGE凝膠之激光-密度計決定） *對雞胚交感神經元存活所估計之再折疊G D N F E D 5。值爲約3毫微克/毫升。 圖2 8示出利用再折疊的GDNF生物檢測的結果； 偵測大鼠胚胎中腦培養中其增加多巴胺能爲黑質多巴胺能 神經元攝入之能力。生物檢測之步驟如實例1 B所示》以 Y軸上多巴胺之攝入對X軸之GDNF濃度作圖。於這些 培養中，再折叠GDNF增加多巴胺攝入所估計之ED5。 爲約3微微克/毫升。 較佳真髏眘例^詳沭 現在對本發明較佳具體實例詳述參考資料，其加上以 下實例用以解釋本發明之原則。 於本發明前，GDNF並未被鑑知爲一種分離的生物 活性物質，且並未以實質上純型式存在。如此中所述的， 提出GDN F之詳細說明，配合其物理、化學及生物特性 ;利用性；如何製作，含彼之有用的組成物：指導合成彼 之核酸序列；含此核酸序列之載體；爲此種載體所轉形之 請 先 閲 之 注 2 旁 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -17 - 纒濟舞中兴標竿局R工消t合作杜,« A6 __Έ6_ 五、發明説明（9 ) 3)。也掲示得到指導合成GDNF之人類基因之方法。 编碼成熟的人類GDNF之核酸序列示於圖19 (SEQ ID NO:5)。编碼人類GDNF前原型片段前50 但胺基酸之核酸序列，示於圖22 (SEQ ID NO ·· 8 ) 〇 本發明也包括藥學組成物，在_學上適合的載體中含 有有效劑量之純化GDNF。也描述避免或治療神經傷害 的方法，其包括對有所需之患者投予治療有效劑躉之 GDNF。於一較佳具體實例中，神經傷害是也巴金森氏 病或受損或失常功能之多巴胺能神經細胞。 於本發明一値較佳具體實例中，GDNF以重组體 DNA方法産製，利用上述之指導合成GDNF之基因。 本發明包括一種可用於産製生物活性GDNF之載體，含 有操作性鍵結至指導合成成熟或原前型GDNF之核酸序 列之表面鼯控要件，及為此種載體轉形之宿主。也包括用 於産製GDNF之重组DNA方法，包括：將指導合成G DNF之DNA序列繼代選殖至含有表現DNA序列所需 之調控要件之表現載饈中；以該表現載饉轉形宿主細胞； 在擴大載體之條件下培養宿主細胞並表現GDNF;回收 G D N F 〇 描述産製GDNF之重組體DNA方法，此方法包括 :在擴大載醱之條件下培餐本發明之宿主細胞並表現GD N F ;並回收彈簧。 本發明包括可確認GDNF之實質上純化的抗體。也 本紙張尺廑適用中國B家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）-11- 81.9.25,000 ----------------- 1----裝------訂------線 (請先Μ讀背面之注意事項*填寫本f 401422 年“1K 86. 3. 26 销 Α7 Β7 Λ、發明説明（16 ) 宿主細胞；產製彼所採用之重組技術；及本發明其他方面 之描述。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) GDNF是一種蛋白質，其可鑑之或得自神經膠質細 胞及可呈現神經營養活性之細胞。更特異地，GDNF是 一種蛋白質，其特徵部份在可在黑質多巴胺能神經元之胚 胎前軀體上增加多巴胺攝入之能力，進一步則是促進副交 感及交感神經細胞存活之能力。可以數種方式進一步鑑定 實質純化之GDNF: 1 ·具有至少約12，OOOTU/微克之比活性。 2 ·在還原的SDS-PAGE上有約2 0 — 3 0 k D之分子量· 3 ·在非還原的SDS — PAGE上有約31 — 42 k D之分子量。 4 ·比活性至少較B 4 9 -調適培養基的高 2 4，0 0 0 倍。 5·具有在中腦培養中正向調控酪胺酸羥化酶免疫活 性之能力。 經濟部中央揉準局負工消費合作.杜印褽
6 ·其胺基末端胺基酸序列示於圖8中（SEQ ID N 0 : 1 )。
7 ·其內部胺基酸序列示於圖12中（SEQ ID N 0 ： 2 )。 下文更詳細描述本發明的GDNF·要了解，本發明 此方面涵蓋具胺基末端胺基酸序列和圖8所示（S E Q ID NO : 1 )的相同或實質上同質之任何多巴胺能神 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4说格（210X297公釐） -18 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 --- 附件二(A):第81108487號專利申諝案 年月曰修^]中文說明書修正頁民國89年4月呈 651 4 t,補本·__ * . 五、發明說明（10 ) 包括避色或治療神經傷害之方法，此方法包括將分泌神經 膠質細胞系衍生之營養因子之細胞植入有所需之患者體內 。最後，本發明包括經由植入病體以避免或治療神經傷害 之裝置，其包括一個可半滲透之膜，及包膠在該膜內可分 泌GDNF之細胞，且該膜對GDNF是可滲透的而對得 自病體有害於細胞之因子則是不可滲透的。 圖式簡單說明 圖1示出經濃縮之B 4 9神經膠質母細胞瘤細胞，無 血清生長調適培養基溶液之肝素Sepharose層析結果。結 果示出溶離液O.D.290( ——)，導電性（一 △一） ，及按TU計之GDNF活性。匯集標以橫線 之流份以進一步純化。 圖2示出得自圖1匯集流份示HP L C Superose層 析結果。結果示出〇 _ D . 28。（— 一），及按TU計之 GDNF 活性（一 〇 —)。 圖3示出圖2第1 4號流份之RP — HPL C結果》 結果示出0 . D · 214，按TU計之GDNF活性示於下 〇 圖4示出上圖3中3—10流份之SDS—PAGE 銀染色分析結果。第S列含有分子量標準。 圖5示出圖4中5及6流份之製備式S D S — PAG E結果。凝膠片測試按TU計之G DN F活性。凝 膠片也利用分子量標記校正分子量（Anershain) ° 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) v--------訂---------線 -12 -
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 經營養蛋白質。本發明也包括其內部胺基酸序列和圖1 2 所示（SEQ ID NO:2)的相同或實質上同質之 任何多巴胺能神經營養蛋白質。 本發明包括一種新穎的多巴胺能神經營養蛋白質，其 在此定義爲神經膠質細胞系衍生之神經營養因子（ GDNF) «GDNF已呈實質上純型式鑑知及分離自B 4 9神經膠質母細胞瘤細胞之無血清生長調適培養基。 已純化及鑑定出GDNF，且得到純化物質之部份胺 基酸序列·依據所得之部份胺基酸序列，設計D NA探針 以得到可用於GDN F重組產製之大鼠c DNA純系。此 種純系之核酸序列及大鼠G D N F所指之胺基酸序列示於 圖 13(SEQ ID N0:3)及14(SEQ ID Ν0:4)β 已決定出GDNF之胺基末端胺基酸序列，且示於圖 8中（SEQ ID NO :1)。也己決定GDNF.部 份的內部胺基酸序列，且示於圖12 (SEQ ID NO : 2)。經純化的GDNF在未還原條件之SDS-PAGE上具有約3 1 — 4 2之視分子量，在還原條件之 SDS — PAGE上具有約2 0 — 2 3 kD之視分子量。 雖未爲此種理論所限，推測此資料與其在自然生成狀況下 爲糖基化、二硫化物鍵結的二聚體符合。 如下實例6 C中所詳述的，於細菌表現系中人類 G D N F基因之表現可導致重組體人類G D N F或 r h G D N F之產製。於表現後所分離的物質基本上是不 具生物活性的，且以單體出現·於再折叠後，GDNF呈 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -19 -
A7 B7 401似 五、發明説明（11 ) 圇6示出圖5中1 6-23流份之RP — HPLC結 果。A層析圖是樣品，且B層析圖是對照組（來自空白列 相當膠片之匯集膠萃取物）。 圖7示出圖6A第3峰（1列）及分子量對照組（S 列），銀染色SDS - PAGE之分析結果。 圖8(SEQ ID N0:1)示出得自純化GD N F之胺基末端胺基酸序列。空白括號顯示該位之胺基酸 無法利用是序技術予以決定。若殘基示於括號內，表示該 殘基確.認有某些不確定。完全正確的胺基末端胺基酸序列 示於下圖19(SEQ ID N0:5)中。 圖9示出胰蛋白酶水解之純GDNF之RP— HP L C結果•層析A圖含有樣品，且層析B圖是對照組 (只含胰蛋白酶）。 圖1 0示出圖9第3 7號峰之RP — HPLC結果， 係先經溴化氰處理》 圖11示出圖10第1號峰還原產物之RP-HPLC結果。 圖12(SEQ ID NO:2)描述純GDNF之內部胺基酸序列。 圖13(SEQ ID NO:3)示出衍自B49細胞庫cDNA純系 λ ZapI 176. 1之大鼠GDNF核酸序列。也示出指導合成GDNF 之胺基酸序列。指導合成成熟GDNF之核酸序列底下劃線。 GDNF大部份較佳的前原型胺基末端序列則標以*號。 、圖14(8£〇 ID N0:4)示出所指之成熟GDNF之胺基酸序 列· 圖1 5示出純化之B 4 9細胞GDNF及人類重組體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -V、1T.\---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央梂準局負工消費合作社印製 -13 - Α7 Β7 年“ίί 86. 3, 2β 補充 五、發明説明（29 ) 子（SEQ ID NO:5)可以依據熟知及標準步驟 ，將更易於大腸桿菌中表現之密碼子替代之。此種經修飾 的核酸序列也包括在本發明範圍內。 特殊的核酸序列可由精藝者修飾之•因此，本發明也 包括可指導合成如圖14 (SEQ ID N0:4)及 19 (SEQ ID NO: 5)所示成熟的大鼠及成熟 的人類GDNF，如圖13所示前原型大鼠GDNF ( SEQ ID NO:3)及如圖19(SEQ ID N0:5)及圖22(SEQ ID NO:8)所示前 原型人類G D N F之胺基酸序列的所有核酸序列*本發明 也包括可與所有此種核酸序列，或適當的核酸序列互捕物 可雜交，且可指導合成具多巴胺能活性之多肽之核酸序列 。本發明也包括可指導合成具多巴胺能活性之多肽，且可 爲結合至GD N F之抗體所確認之核酸序列。 本發明也包括載體，含有表現控制要件且操作性鏈結 至本發明範圍內任一核酸序列上。本發明也包括已爲載體 所轉形的各種宿主細胞，此載體即含有可操作性鏈結至本 發明範圍內任一核酸序列之表現控制要件者。 G D N F於C 0 S細胞中之表現描述於實例5中。·示 於圖1 3中編碼GDNF之基因，繼代選殖至質體載體 P S G 5中，此載體經設計用以瞬時表現如CO S細胞一 類之經選殖基因之細胞》選出含有正確及不正確G D N F 基因方向之質體，並將DNA轉感至COS_7細胞•經 培養後可回收經轉形的細胞。以多巴胺能分析及交感神經 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） . — (请先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央樣準局負工消費合作社印製 -31 -
8& 3. 2d # B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（12 ) C N T F促進雞胚睫狀神經節的得之副交感神經元存活之 結果》Y軸光密度之增加長示神經元的得存活增加。X軸 代表各神經因子漸減之澳度。標以對照組之曲線，係和用 來產生標以GDNF曲線之含GDNF流份相鄰之等體積 無法性流份。 圖1 7示出CO S細胞調適培養基，對於經由培養中 中腦多巴胺能神經元增加多巴胺能攝入能力之生物檢測法 。Y軸代表所吸收之經放射標記之多巴胺含量，相對於X 軸之漸增量之澳縮C 0 S細胞培養基。標以B - 1之曲線 代表來自C 0 S細胞之無血清調適培養基，此細胞爲 GDN F基因以表現GDN F之正確方位所轉感。標以 C 一 1之曲線代表來自C 0 S細胞之無血清調適培養基， 以GDNF基因以避免GDNF表現之相反方位轉感之。 圖1 8示出COS細胞調適培養基，對於增加來自雞 胚交感鏈之交感神經元培養存活能力之生物檢測法·Y軸 代表爲培養減少的MTT染料量，且和神經元之存活呈比 率。X軸代表濃縮的C 0 S細胞培養基增加之稀釋倍滅。 標以GDNF之曲線代表COS細胞無血清調適培養基， 其以GD N F基因在GDNF可表現之適當方位轉感•標 以對照組之曲線代表C 0 S細胞之無血清調適培養基，其 爲G D N F基因在避免表現之相反方位轉感之。 圖19(SEQ ID NO :5)示出如下實例2 C所述’所得之人類GDNF之部份核酸序列，包括指導 合成成熟人類G D N F之全部基因部份。也示出所指之成 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） I ,^I I I— IH n 11 n n I (請先H讀背面之注意事項再填寫本頁) -14 -
R N A。 A7 B7 五、發明説明（35 ) 5)聚合酶鏈反應（PCR)之產物，其以GDNF 上之序列所設計之寡核苷酸爲引子，及D至1 ) 至4)中所述之任一核酸來源爲模板· 經証明在某些經驗所決定之雜交條件下可與以G DN F爲底之探針雜交之任何核酸序列，均可以精藝者熟知之 各種技術選殖及定序，且可直接決定序列同質性程度，以 鑑定GDNF基因族成員。藉著以NGF序列爲底之探針 之篩選*此種雜交途徑可用來選殖NT-3，（Kaisho et al. 1 9 9 0 FEBS Letters 26 6 : 287- 1 9 1 ) β 鑑定GDNF族成員的另一方法，係利用聚合酶鏈反 應（P CR)擴大GDNF族成員之序列，之後選殖並分 析經擴大之序列。P CR所用之簡併（或未簡併）寡核替 酸引子，可依據GDNF序列而合成。已知半胱胺酸位置 具保存性，且半胱胺酸殘基緊鄰胺基酸序列具保留性，此 乃NGF族中可觀察到的，則在成熟GDNF半胱胺酸周 圍之區域代表引子合成明顯的候選者，但也可自蛋白質的 成熟及前原部份中選擇其他各種引子。P c R反應可在減 低的回冷溫度條件下進行，其不僅可擴大G D N F序列也 可擴大任何G D N F族成員之序列。見，Innis et al. 1990 PCR Protocols * A Guide to Methods and App1i cations,Academic Press。此.種P CR反應之產物可以凝 膠電泳選擇大小，選殖至適當的載體中，且定序所選殖之 DNA以鑑定GDNF族成員。此外，純系可由與 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I t— I.^. n n n I ^ I n n n n I ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央棣準局貝工消費合作社印製 -37 -
經濟部中央樣準局員工消費合作社印裝 i、發明説明（13 ) 熟人類GDNF胺基酸序列。成熟人類GDN F之胺基酸 序列底下劃線。 圖2 0示出GDNF於多巴胺能神經元中刺激多巴胺 攝入及酪胺酸羥化酶（TH)免疫染色之能力。如實例1 B般建立細胞培養。GDNF於塗佈日加入，並於9天後 於試管內再加以補充。1 5天後試管內偵翊3H — DA之 攝入A) * 16天後以4%仲甲醛試管內固定培養物，充 份洗滌，以0 · 2%三通X— 1 0 0使通透，並於TH多 株抗體染色（E u g i n e T e c h I n t e r n a t i ο n a 1，A 1 1 e n d a 1 e ,NJ)。利用Vectastain ABC，套組示像化初步抗體之結 合（Vector Labs, Burlingame,CA)。 圖2 1示出GDNF對多巴胺能神經元之特異性。培 養物如實例1B般建立·GDNF於塗佈日加入。於7天 後試管內偵測3H-DA之攝入。8天後試管內偵測 14C 一 GABA攝入。細胞培育並如3H — DA攝入般處 理，除了攝入緩衝溶液包括：克氏-林格氏磷酸塩緩衝溶 液，PH7 . 4，含有5 . 6mM葡萄糖，1 . 3mM EDTA，10/zM胺基一氧醋酸（以避免GABA瓦解 )，2mM；8 —丙胺酸（以抑制GABA之神經膠攝入） 及0 · ΙμΜ 14C — GABA (150毫居里/毫莫耳 ，New England Nuclear，Boston, ΜΑ)·於 1 mM二胺基丁 酸（DABA)存在下，14C_GABA強力抑制劑攝入 GABA神經元，14C_攝入減少1 0%。自實驗值中減 去DABA存在時之對照數值· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
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經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 五、發明説明（es ) 程度（大鼠及人類CNTF間胺基酸同質性爲8 3% ; McDonald et al，B+BA(1991)(付印中）。大與及人類 NGF間之胺基酸序列同質性爲9 5% , BDNF是 1 0 0% ，且NT-3是 1 0 0%;Hailbook et al，1991 Neuron 6 : 8 4.5 — 8 5 5 )。 爲得完全的人類前原型GDNF序列，可依據已得之 人類GDNF序列製成經放射標記之雜交探針，且該探針 可用以篩選人類c DNA庫•由於c DNA是經修飾 mRN A之套數，故無不表現子且可得完全編碼序列。此 外，目前已知相當於編碼序列之不表現子位置，且大鼠 c D N A純系中可製得與不表現子上游序列特異之雜交探 針，且以此來篩選含有5 /表現子純系之基因庫。 P·編碼人類前原型.GDNF前1 5 0個胺某酸之核益醅 序列 如圖2 C的詳述的*有一個不表現子可分割相當於人 類前原—GDNF第5 1胺基酸之核苷酸序列•爲了得到 此分子部份之序列，以衍自大鼠前原GDNF胺基末端編 碼序列之探針來篩選人類基因體庫，且一個雜交純系被定 序且示出含有人類前原GDNF 1至5 0個胺基酸之編碼 序列，如圖22所示（SEQ ID NO ： 8 ) » 爲了篩選基因庫，如實例2 C所述地合成一個P C R 探針•所應用之寡核苷酸引子爲： 本紙張尺度適用+國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ----------裝------訂-------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 70
經濟部中央橾準局員工消费合作社印製 GD NF 1 _ 5 0胺基酸之編碼予列•也示出人類前原 GDNF前5 0個胺基酸所指之胺基酸序列。此資料加上圖 19所給之編碼序列資料，可提出人類前原GDNF之全部 編碼序列，及所指的人類前原GDNF蛋白質胺基酸序列。 圖2 3示出如實例2D所述，p B S S Κ — λ3Α1 u Γ質體內之Sa c I I及P s t I位置7輿圖 〇 圖2 4示出GDN F對多巴胺能神經元之特異性。如 實例1B所述地製備培養· GDNF於塗佈日加入，並於6 天後試管內偵測攝入情況· A示出多巴胺之攝入，及爲5 羥色胺之攝入。 圖2 5示出由考馬斯藍所染的SDS- PAGE，爲 S-Sepharose管柱上含有未再折叠GDNF之細菌萃取物 ，於再折叠前層析所得之流份於還原條件下所進行的（見 實例6C) 。2—8列代表來自管柱溶離液之連續流份。 流份3_5富含GDNF予以匯集以供再折叠。1列爲分 子量標準品（SDS-70L，Sigma)。 圖2 6示出GDNF溶液之考馬斯藍染色的SDS — PAGE ;再折叠前（6&13列），再折叠後（2列） 及再折叠及其後以1 5 0mM2_巯基乙醇反向還原後（ 5列）·再折叠前及之後再反向還原之物質，以約16 kPa之單體型式進行。經成功再折叠之GDNF(無還 •適用中國國家標準（0奶）八4規格（210/297公釐） iw訂 ....— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -16 - 修正 年月曰广86. 3. 26^甫充 A7 B7 經濟部中央標準局負工消費合作社印掣 五、發明説明（15 ) 原作用）則呈約3 OkP a之二聚體型式進行* 1 5列爲 分子量標準品（SDS-70L，Signa)。 圖2 7示出利用再折叠的GDNF生物檢測之結果； 偵測促進培養中雞胚交感神經元存活之能力。生物檢測步 驟如實例4 A所述地進行。以Y -軸之光密度（和存活神 經元之數目成比率）對X軸之GDNF濃度作圖（以考馬 斯藍染色之SDS—PAGE凝膠之激光-密度計決定） *對雞胚交感神經元存活所估計之再折疊G D N F E D 5。值爲約3毫微克/毫升。 圖2 8示出利用再折疊的GDNF生物檢測的結果； 偵測大鼠胚胎中腦培養中其增加多巴胺能爲黑質多巴胺能 神經元攝入之能力。生物檢測之步驟如實例1 B所示》以 Y軸上多巴胺之攝入對X軸之GDNF濃度作圖。於這些 培養中，再折叠GDNF增加多巴胺攝入所估計之ED5。 爲約3微微克/毫升。 較佳真髏眘例^詳沭 現在對本發明較佳具體實例詳述參考資料，其加上以 下實例用以解釋本發明之原則。 於本發明前，GDNF並未被鑑知爲一種分離的生物 活性物質，且並未以實質上純型式存在。如此中所述的， 提出GDN F之詳細說明，配合其物理、化學及生物特性 ;利用性；如何製作，含彼之有用的組成物：指導合成彼 之核酸序列；含此核酸序列之載體；爲此種載體所轉形之 請 先 閲 之 注 2 旁 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） -17 - 401422 年“1K 86. 3. 26 销 Α7 Β7 Λ、發明説明（16 ) 宿主細胞；產製彼所採用之重組技術；及本發明其他方面 之描述。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) GDNF是一種蛋白質，其可鑑之或得自神經膠質細 胞及可呈現神經營養活性之細胞。更特異地，GDNF是 一種蛋白質，其特徵部份在可在黑質多巴胺能神經元之胚 胎前軀體上增加多巴胺攝入之能力，進一步則是促進副交 感及交感神經細胞存活之能力。可以數種方式進一步鑑定 實質純化之GDNF: 1 ·具有至少約12，OOOTU/微克之比活性。 2 ·在還原的SDS-PAGE上有約2 0 — 3 0 k D之分子量· 3 ·在非還原的SDS — PAGE上有約31 — 42 k D之分子量。 4 ·比活性至少較B 4 9 -調適培養基的高 2 4，0 0 0 倍。 5·具有在中腦培養中正向調控酪胺酸羥化酶免疫活 性之能力。 經濟部中央揉準局負工消費合作.杜印褽
6 ·其胺基末端胺基酸序列示於圖8中（SEQ ID N 0 : 1 )。
7 ·其內部胺基酸序列示於圖12中（SEQ ID N 0 ： 2 )。 下文更詳細描述本發明的GDNF·要了解，本發明 此方面涵蓋具胺基末端胺基酸序列和圖8所示（S E Q ID NO : 1 )的相同或實質上同質之任何多巴胺能神 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4说格（210X297公釐） -18 -
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 經營養蛋白質。本發明也包括其內部胺基酸序列和圖1 2 所示（SEQ ID NO:2)的相同或實質上同質之 任何多巴胺能神經營養蛋白質。 本發明包括一種新穎的多巴胺能神經營養蛋白質，其 在此定義爲神經膠質細胞系衍生之神經營養因子（ GDNF) «GDNF已呈實質上純型式鑑知及分離自B 4 9神經膠質母細胞瘤細胞之無血清生長調適培養基。 已純化及鑑定出GDNF，且得到純化物質之部份胺 基酸序列·依據所得之部份胺基酸序列，設計D NA探針 以得到可用於GDN F重組產製之大鼠c DNA純系。此 種純系之核酸序列及大鼠G D N F所指之胺基酸序列示於 圖 13(SEQ ID N0:3)及14(SEQ ID Ν0:4)β 已決定出GDNF之胺基末端胺基酸序列，且示於圖 8中（SEQ ID NO :1)。也己決定GDNF.部 份的內部胺基酸序列，且示於圖12 (SEQ ID NO : 2)。經純化的GDNF在未還原條件之SDS-PAGE上具有約3 1 — 4 2之視分子量，在還原條件之 SDS — PAGE上具有約2 0 — 2 3 kD之視分子量。 雖未爲此種理論所限，推測此資料與其在自然生成狀況下 爲糖基化、二硫化物鍵結的二聚體符合。 如下實例6 C中所詳述的，於細菌表現系中人類 G D N F基因之表現可導致重組體人類G D N F或 r h G D N F之產製。於表現後所分離的物質基本上是不 具生物活性的，且以單體出現·於再折叠後，GDNF呈 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -19 - 401422 A6 B6 鱷濟部中央襻準局霣X滴费含锥社··« 五、發明説明（18 ) 具生物活性之二硫化物一鍵结的二體。因此，GDNF在 其天然的生物活性型式上傺一種二硫化物鍵.結之二體。然 而，本發明包括呈單體及二體之GDNF,及生物不活性 及生物活性型式。 依據大竄GDNF之核酸序列來製備探針，以選殖指 導合成人類GDNF之基因醱DNA基因。编碼成熟 GDNF之人類基因，及人類成熟GDNF之胺塞酸序列 示於圏 19(SEQ ID Ν Ο ： 5 ) 〇 GDNF之特徽也在於其可在黑質多巴胺能神經元之 胚胎前軀體上增加多巴胺攝入之能力，如下文實例1中所 述。GDNF進一步的特擞在於其可促進副交感及交感神 經細胞之存活，如下實例4所述。 GDNF進一步又可顯現特徵於在中腦培養中正向諝 控酪胺酸羥化酶免疫反應性之能力。此待性的一個實例述 於實例1 E及圖20中。此外，GDNF對多巴胺能神經 元有相對於通稱之神經元更多之特異性。如，此可在含 GABA之神經元上對7 —胺基丁酸（GABA)攝入之 有限作用而明示。此點也述於實例1 E及圖2 1中。已示 出GDNF在5羥色胺能神經元之5—羥色胺攝入上少有 作用。點述於實例1已及圔24中。 於本發明窨前後文中，所指的任何神經膠質衍生之神 經營養因子均應視為任何來源之神經營養因子，其與此處 所鑑定及描述之之GDNF實質上是同質的，或生物上相 當的。大鼠及人類蛋白質間同質性程度為約93%,且所 t尺度適用中國固家«準（CNS>甲4规格（210 X 297公釐Γ 20 ~ 81.9.25,000
1 〆 V. (請先Μ讀背由之注意事項再填窝本P 裝· 訂· .嶁 A6 B6 纒濟部中央襟準爲霣工消费合作社，« 五、發明説明（19 ) 有哺乳動物之GDNF均具有類似的高度同質性。此種 GDNF在其生物活性型式上呈二體存在。 本發明包括GDNF之糖基化及未糖基化型式，以及 自然生成及重组體GDNF之截斷型式，如此中所述。於 一值進一步具髏實例中，GDNF以一値以上之聚乙二酵 (PEG)或其他重覆的聚合部份粘附西修飾之。本發明 也包括含有胺基一末端甲硫胺醯殘基之於細菌表現条中重 组産製之GDNF。 在本說明軎及申請專利範圍中所用的"生物上相當的 〃一詞表示，本發明的組成物可以相似方式明示某些或所 有相同的神經營養特性，但未必和自B49調適培養基中 所分離的GDNF為相同程度。而於本說明蓄及申請專利 範圍中所用的> 實質上同質的〃一詞表示，與分離自B4 9諝適培餐基之GDNF同質之程度較先前報告的任何G DNF所呈現的還多。較好，同質程度超過70%,更好 超過80%,甚至最好超過90%、95%或99%。此 處所述之同霣性百分率傜以見於二序列中較少者中之胺基 酸殘基百分率來估計，此二序列以序列中相同的胺基酸殘 基排列比較，且4個長100胺基酸之間隔可孔入以助其 排列，如Dayhoff於 Atlas οί Protein Segtuence and Structure . Vol.5. P124(1972). National Biochemical Research Foundation， Washington·D·C·» 所示，後文已列為本案參參。也包括的其他實質同質者可 與經由此處所述GDNF的抗體交互一反應而分離的任何
(請先聞讀背兩之注意事項再碘寫本P 装· 订. .線 本紙張尺度適用中國Η家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）_ 21 - 81.9.25,000 A6 _ _B6 _ 五、發明説明（20 ) GDNF,或其基因可經由此處理所述GDNF之基因或 基因片段之雜交而分離者。 本發明較佳的GDNF己分離自B49調適培養基， 且已呈實質上純型式被分離，又一較佳的GDNF是以重 组DNA技術製備的，以生成實質上純型式之GDNF。 基於本發明目的，"純型式"或> 實質上純型式'當使用 時傜指此中所掲示之GDNF,應表示其實質上無其他非 GDNF蛋白質之製劑。較好，本發明的GDNF有至少 50%之純度，較好75炻，且更好80%、 95%或 99%純度。於本發明一傾具體實例中，GDNF蛋白質 製剤為如此實質上的純型式，故便一般精藉者可決定至少 部份胺基酸序列，而無先進行進一步的純化步驟。 於本發明一値較佳具髓實例中，GDNF如下文實例 1所述的純化自B49諝適培養基。當然，給予此中所示 之賫料，精藝者將可明白也可鑑知其他的GDNF來源， 且依據此中所示之純化方法，大體上可完成GDNF自此 種來溉中之純化。 鳗濟部中央律準爲Κ工谪费合作社,髮 (請先W讀背雨之注意事項再填寫本Ρ GDNF之多巴胺能活性可助於純化過程。闢於多巴 胺能神經營餐活性之生物檢定法，述於下文實例1B中。 簡言之，製成分離的中腦細胞培餐物，在富含血清或無血 淸環境下。欲進行多巴胺能活性試驗之樣品，予以脱埴化 且連绩加至細胞培餐中，且並於含6. 5%0〇2之37 t：潮灞大氣下培育6天。培餐物於受試物質存在下，與氚 化的多巴胺（3Η — DA)在3 7C下培育。停止多巴胺 本纸張尺度逋用中团國家樣準（CNS)-甲4规格（210 X 297公釐广22 81.9.25.000 A6 B6 經濟部中夹#準局霣工消费含作杜<p« 五、發明説明（21 ) 之攝入，洗滌細胞，且以留於培養基中氚之閃燦計數來分 析多巴胺之攝入。 GDNF之純化詳述於下實例1C中。純化過程詳述 於表I。自B49神經膠質母細胞瘤细胞中製備調適培餐 基起始物，係當收集及補充調適培餐基時，將細胞置於無 血清培餐基中2天。重覆此循琛，以自各批B49細胞中 生成3獲的調適培養基。調適培養基離心並濃缩約1〇倍 ，再進一步純化。 此中所定義之B49神經膠質母細胞廇無血淸生長諝 適培養基之此粗製混合物的第一步製法，像將諏適培餐基 引入肝素Sepharose管柱中，其以含0 · 5 N NaCi 之50mM NaPi缓衝溶液，pH8.0平衡。由含 1 . 5 N NaC)^50mM NaPi, pH8. 0 所製成之梯度缓衝溶液，於溶離穩定後引入。得自此層析 之流份進行G DNF活性之偵測，且匯集合GDNF活性 之流份以進一步純化。 所匯集之流份接受Superose管柱之快速蛋白質液相層 析（FPLC),採用含 0.5N NaCi^2 50inM NaPi缓衝溶液，pH7.4。再次決定所得流份之 GDNF活性。之後得自此步驟之單一流份再酸化並填料 至C 一 8逆相高性能液相層析（HP LC)管柱上。被鑑 知含GDNF活性之流份混合以進一步純化並進行蛋白質 之定序。如下表I所示，於此點所得之GDNF具有較諝 適培餐基高約24, 000倍之比活性。於此點所得蛋白 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 訂 緣 象纸張尺度適用中國B家*準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）-23 - 81.9.25,000 A6 __B6___ 五、發明説明（22 ) 質之胺基末端定序所得之胺基酸序列示於圖8中（SEQ ID Ν Ο ： 1 ) 〇 得自HPLC之GDNF,其進一步純化可由含 GDNF活性之流份進行製備式SDS—PAGE而完成 。加至含蛋白質流份中的是含甘油及SDS之缓衝物質， 且溶液於未邇原的15%SDS—PAGE上流過，電泳 於10*C, 40mA /凝睡中進行2小時。相當於約30 _42kD分子董之凝膠部份，以生物檢定法已發現含有 GDNF活性。分離自SDS — PAGE物質之第二次 HPLC靥析可得到單一峰之GDNF,如圖6所示。
(請先W讀背*之注意事項再填寫本P -丨装· 订. •填 纒濟部中喪#準爲霣工消#合作杜t-襞 81.9.25,000 本紙張尺度逋用中國國家櫺準（CNS>甲4规格（210 X念97公货厂24 - A6 B6
五、發明説明（23 ) 表1自B49細胞CM中純化GDNF
步輥 CM 1·肝素 Sepha r〇 s 2. FPLC Supe ro s e 3. RP-HPLC 4·製備式 SDS-PAGE 5.RP-HPLC (MG) 200 3.1 0.3e 0.001fc n · d · 0.0003 牛物活袢hh活件 (TUX ΙΟ·3) (TU/撤克）（!〇· 94 0.5 (1) (100) b 37 31 12 7 5 12 24 39 103 206 33 12,000 24,000 13 d • d 7 17,000 34.000 5 請 η 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 窝 本 r 裝 订 » 以OD2e。為依據 b 依蛋白質定序之回收（按撤微莫耳計）及對GDNF 36kD之假設的分子量（得自非還原303 — PAGE) n · d ·=未決定 HPLC所得物質於製備式SDS—PAGE前及後 ，決定GDNF之胺基末端序列。由來得到純化GDNF 胺基酸序列之步驟示於實例ID中。以氣相蛋白質定序儀 可得胺基酸序列。自由HPLC所分離之物質中可得内部 序列，其未以製備式SDS—PAGE進一步純化。純化 ^紙張尺度適用中困8家壎準（CNS)中4规格（210 X 297公釐厂25 一 線 經濟部中央#竿爲员工消#合作杜,* 81.9.25,000 經濟部中央樣準馮貝工消费合作社_褽
A6 ___B6_ 五、發明説明（24) 的GDNF與胰蛋白酶共培育可得内部胺基酸序列。所得 的胰蛋白酶Η段以HPLC分離。發現一片段含有未處理 蛋白霣胺基酸末端序列的前13值胺基酸殘基。第二Η段 以CNBr處理，以HPLC純化，遵原，並再次於 HPLC上純化。所得的胺基酸序列示於圖12中（ S E Q ID N〇:2)。示於括號内的這些序列，經 決定為具少程度信賴度者。 本發明包括選殖GDNF基因之方法，及被鑑知可编 碼GDNF之基因。選殖大鼠及人類GDNF基因之詳細 步驟示於下實例2中。再次，精越者應了解，基於此中所 掲示的其他選殖此種基因之方法應十分明顯。待別地，基 於此中所掲示的步驟，自其他编碼GDNF之種類中選殖 基因應十分明顯。 大鼠GDNF基因，如此中所述偽由B49細胞所分 離之p〇U A+ RNA所構築之cDNA庫中得到的，其 以由純GDNF所得之胺基酸序列為基礎之簡併的寡核苷 酸探針予以篩選而得。依據揉準步驟所得之cDNA,經 處理以含有經EcoRI水解之連接子，並嵌入 AZap I I選殖載體。所使用的雜交探針以32P檫記， 且其由下列簡併寡核苷酸組成（S E Q ID N 0 ： 7)、 5· > CCIGATAAACAAGCIGCIGC > 31 C G G (請先W讀背面之注意事項再填寫本 -丨裝- 訂· .線 本紙張尺度適用中团國家#準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐Γ 26 — 81-9.25,000 A6 B6 it濟#中央«準屬聚工消#合作杜_髮 五、發明説明（25 ) 可得許多陽性純条·且其中一純条因编碼一部份GDNF 故以DNA定序鑑定為陽性，将之用於設計簡併的探針。 獲得含於AZapII26.1中cDNA純糸之核 苷酸序列之方法，示於下實例2B中。決定出cDNA純 糸5 —端前877驗基對之核眘酸序列，且示於圖1 3中 (S E Q ID N0 : 2)。於圖1 3中，已示出純条 中含有227値胺基酸之開放讀譯架構，其中包括純 GDNF的胺基末端，而且與GDNF解離所得之内部肽 之序列符合。 示於圃14中所指之胺基酸序列（SEQ ID NO : 4)顯示出★成熟GDNF 〃之胺基酸序列。所諝 $胺基酸序列〃意指得自B49細胞調適培養基之純 GDNF之序列。當然，純GDNF可呈二體或其他多聚 體型式#在，且可糖基或於其他方式中化學修飾。成熟的 GDNF可在羧基末端截斷，特別是距羧基末端6及5殘 基之Ly s —Ar g之蛋白水解處理修雔作用。晒1 3所 示，AZapI176.1大鼠純条之核苷酸序列檢査 (S E Q ID N0 : 2)推測，G DN F最先轉譯成 前原型GDNF多狀，且訊號序列及此分子”原〃部份之 蛋白水解處理修飾，可造成具有如b49調適培餐基中所 得相同的成熟序列之純GDNF。已主張，前原GDNF 多肽始於第一侮ATG—編碼甲硫胺酸一傜位於純糸5/ 端之密碼子（圆13中第50位）。因此，本發明包括可 自圓13所示基因中轉譯的任何及金部的前原GDNF多 請 先 Μ 讀 背 由 之 注 意 事 項 再 填 窵 本 裝 訂 線 本紙張尺度適用中國囲家*準（CNS)甲4规格（210X 297公釐Γ 27 __ 81.9.25,000 «濟部f央樣準屬員工消»合作社_« 81.9.25,000 A6 __B6_ 五、發明説明（26 ) 肽，以及可自更完金純条中轉譯的任何及所有的前原 GDNF多肽，此可由精藉者利用標準的實驗室步驟及及 此中所述之純条容易地獲得。 圖13所示之大鼠核酸序列之總覧（SEQ ID NO:2)顯示，所預測位於518及538位置間之胺 基酸序列為 Asp — Lys — I 1 e. — Leu — Lys — Asn_Leu,此和下實例1内部序列所述之方法中衍 生自純且成熟GDNF之肽之胺基酸序列符合。位於 706位置之TGA停止密碼子終止ORF。所預测的純 GDNF之長度因此為134胺基酸殘基，且預測此多肽 之分子量為14. 931。二値可能的N—鐽结之糖基化 位置在425及533位置上。在任一或二位置上之耱基 化作用將會增加分子之分子量。 位第28 1.位置處之絲胺酸，其相當於純成熟 G D N F序列之起點，其前方接有序列Lys — Arg, 其提供一但槽在之蛋白水解位置，以處理GDNF假想的 軀膿型式産生純化自B49細胞之分子型式。潛在的轉譯 起始密碼子（ATG)位於第50位置，像在序列中且其 後緊接潛在的分泌訊號序列。鄰接此ATG之序列顯示對 Kozak—致序列有充份的類似性（Kozak 1987 Nucleic Aad$ Res. 15:125-48),潁示此ATG可被利用作為轉 譯起始位置。再者，此ATG是cDNA純条序列中最5 /端之ATG,這些事實暗示，其可充作GDNF前艇暖 型式轉譯之涫在起始位置。 本紙張尺度適用中國S家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐广28 - ---7--------------.1 Γ----裝------#------線 r (請先《讀背*之注意事項再填寫本 A6 A6 纔濟_十央揉準屬霣工消费合作杜,« 五、發明説明（27 > 由上述大鼠c DNA純条核苔酸序列之待色推知一傾 可能性，邸GDNF先轉譯成前原型GDNF多肽，且此 分子的"原#部份可造成纯化自B49細胞調適培養基之 GDNF型之産製。然而，其他GDNF型式之發生也符 合序列數據。如，可在681 bp的ORF内發生另二 値潛在的ATG轉譯起黏：一鶴在206位及另一在 242位置。言些ATG位於純GDNF胺基酸序列起端 之上游。雖然，在真核細胞中轉譯作用通常始自mRNA 之最5 >端A T G ( Kozak,上文），但此中有例子是部 份的轉譯起黏發生於下游的六10處。因此，經由在這些 ATG密碼子處之轉譯起始作用，可想像生成不同的 GDNF前軀體型式。這些多肽之蛋白水解修飾，可造成 和在B49細胞諝適培養基中所見之純GDNF型式相同 者。再者，開放讀譯架構經由cDNA純条序列之5^端 伸展。因此有可能轉譯作用之始發生在ATG上游，而非 存在於c DNA純条中。於此偶發性中，GDNF可轉譯 成甚至更大的前軀觼，含有此中所述之胺基酸序列及額外 的上游序列。此種假想前軀髏型式之修飾，也可生成此中 所報告的纯型式之GDNF。藉著經由逆轉錄海引子伸展 作用定序含在GDNF基因之mRNA5 >端，可偵測潛 在的上游ATG起點（Maniatis et al.上文）。此外，其 他的cDNA純条可得自B49庫，且ϋ些純条之5#端 可被定序。第一値ATG上游的5 / mRNA長度，可以 ★ S 1定輿圖〃（ManUtis et al,上文）及/或單純的 <請先Μ讀背£之注意事項再填窵本 装. 订. 線 拿紙張尺度適用中®Β家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐Γ 29 一 81,9.25,000 «濟♦中央镖準《員工消费合作杜<pc A6 B6_ 五、發明説明（28) 定出逆轉錄酶反應引子伸展産物長度，約略地定出來。同 時可推想出含有编碼純GDNF序列的初步轉譯産物的各 種假想型式。此處所示出，播於重組體噬薗體 AZapII76·1中cDNA鈍条fe部份DNA序列 ，明確地界定出構成分離自B49細胞諝適培養基純GD NF多肽之编碼序列。 於下文實例2C中，描述编碼GDNF之人類基因之 選殖。以實例2 B中所述，衍生大鼠cDNA純条之探針 篩遘人類基因庫。鑑定出人類GDNF基因之基因鳢 DNA純条指導合成成熟人類GDNF基因之序列，示於 圖 19 中（SEQ ID N0:5)。 由圖19所示人類GDNF基因之序列，無法得到G DNF前原部份之完整编碼序列。得到人類前原GDNF 前5 0但睽基酸纗碼序列之方法，示於實例2 D中。所得 的序列示於圖2 2 ( S E Q ID Η 0 : 8)。用來得 到序列的質醱ΡΒ55Κ—λ3ΑluI之與臞示於藺 2 3中。 本發明.包括编碼GDNF之核酸序列。在此示出指導 合成大鼠（圖13) ( S E Q ID N03):及人類 (圖 19) ( S E Q ID N0:5) GDNF 之相當 高度同質性之序列。在本發明範圍内也包括，指導合成相 同或离度同質性胺基酸序列之實質上相似的核酸序列。如 ,當於如大腸桿菌之細菌表現条中製成卻表現成熟 GDNF之構體時，圖19中所示的核酸序列中某些密碼 請 先 閱 讀 背 A 之 注 意 事 項 再 填 窵 本 t 装 订 線 拿紙張尺度適用中囲困家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐Γ 3〇 - 81.9.25,000 Α7 Β7 年“ίί 86. 3, 2β 補充 五、發明説明（29 ) 子（SEQ ID NO:5)可以依據熟知及標準步驟 ，將更易於大腸桿菌中表現之密碼子替代之。此種經修飾 的核酸序列也包括在本發明範圍內。 特殊的核酸序列可由精藝者修飾之•因此，本發明也 包括可指導合成如圖14 (SEQ ID N0:4)及 19 (SEQ ID NO: 5)所示成熟的大鼠及成熟 的人類GDNF，如圖13所示前原型大鼠GDNF ( SEQ ID NO:3)及如圖19(SEQ ID N0:5)及圖22(SEQ ID NO:8)所示前 原型人類G D N F之胺基酸序列的所有核酸序列*本發明 也包括可與所有此種核酸序列，或適當的核酸序列互捕物 可雜交，且可指導合成具多巴胺能活性之多肽之核酸序列 。本發明也包括可指導合成具多巴胺能活性之多肽，且可 爲結合至GD N F之抗體所確認之核酸序列。 本發明也包括載體，含有表現控制要件且操作性鏈結 至本發明範圍內任一核酸序列上。本發明也包括已爲載體 所轉形的各種宿主細胞，此載體即含有可操作性鏈結至本 發明範圍內任一核酸序列之表現控制要件者。 G D N F於C 0 S細胞中之表現描述於實例5中。·示 於圖1 3中編碼GDNF之基因，繼代選殖至質體載體 P S G 5中，此載體經設計用以瞬時表現如CO S細胞一 類之經選殖基因之細胞》選出含有正確及不正確G D N F 基因方向之質體，並將DNA轉感至COS_7細胞•經 培養後可回收經轉形的細胞。以多巴胺能分析及交感神經 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） . — (请先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央樣準局負工消費合作社印製 -31 - 40142¾ A6 _Ββ __ 五、發明説明（30 ) 經節神經元分析，測試C0S-7細胞諝適培養基。發現 細胞中含GDNF基因在正確方向之諏適培養基，於二種 分析法中均具生物活性，顯示經由重组《DNA過程可将 具生物活性之GDNF成功地産生。 於本發明一個較佳具鼸實例中，以重組醴DNA技術 在細菌表現条中製備人類成熟的GDNF。 人麴GDNF於大腸捍菌中之表現述於下實钶6中。 可指導合成成熟人類GDNF之部份人類GDNF基因， 示於圖19中，以此來製備一櫥人類GDNF構體。此種 構體連接至質體載饈上，再轉形至大腸桿菌JM107中 。經培餐轉形的宿主細胞後，可回收GDNF。可得具成 熟人類GDNF預期分子置之蛋白質（約1 5, 000道 耳呑），胺基末端定序証實所得的蛋白霣為成熟的人類 G D N F 〇 纒濟部中央樣準局霣工洧费合作社<ffi 人類GDNF之折疊及於大腸捍菌中表現之本質，描 述於下實例6C中。於本發明所述之具醱寘例中，所得到 的含經表現蛋白質之荦取物，於再折叠前先於S-Sepharo-se Fast Flow樹脂上以離子交換層析部份純化之。欲完 成再折疊則加入：先是二硫是赤絲藻醇，之後穀脱甘肽二 銷埴，之後加再折疊缓衝溶液至含GDNF之萃取物中。 經再折璺的rhGDNF實質上完全具生物活性，且在其 生物活性型上僳呈二硫化物鍵结之二聚腰型式。於折疊前 及再折疊物質還原後之GDNF係呈單饈狀態，且實質上 是生物上非活性型。 81,9.25,000 (請先《讀背®之注意事項再填窵本 紙張尺度適用中团Η家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公嫠Γ 32 - 鱖濟部中央櫺竿局MKX消#合作杜t-輦 A6 B6 五、發明説明（31 ) 於其他表現条中表現也可産生GDNF。如，以圖 19所示可指導合成成熟人類GDNF之核酸序列，精蓊 者可於其他表現糸统中産生GDNF。含有指導合成 GDNF之核酸序列，且其操作性鏈结至表現調控要件之 載體，可轉形至其他的撖生物宿主細胞中，包括芽孢桿菌 、假單胞菌及酵母。也可應用標狀病毒表現糸統。 如上所示，本發明是有關於神經傷害患者中治療神經 傷害之方法。此方法包括，投予治療有效劑置的人類蛋白 質神經謬質一衍生之神經營養因子（GDNF)至神經受 損之患者。 疾病或螯學徽候被視為神經傷害，偽當若神經细胞之 存活或功能及/或其軸突行進受損而言。於一較佳具鳢實 例中，此種神經傷害是下列狀況之一结果所致：1)身體 的傷害，其造成軸突之行進及/或接近受傷處神經細胞體 之變性；2)绝血，如中風；3)曝於神經毒素下，如癌 症及A IDS之化學治療劑，分別如順氯氨鉑及二去氣胞 苷（ddC) ; 4)慢性代謝性疾病，如糖尿病或腎功能 障礙。及4)神經變性疾病，如巴金森氏病、阿滋海黙爾 氏病，及肌㈣縮性測索硬化（A L S ),其造成特異化神 經元族群之變性。未排除之狀況包括神經傷害，如巴金森 氏病、阿滋海黙爾氏病、肌萎缩性測索硬化、中風、糖尿 病多神經病、由癌症化學治療劑（红豆杉醇或順氣氨鉑或 長春新齡）所致之毒性神經病、由A IDS化學治療劑（ d d I或d dC)所致之毒性神經病，及身體傷害到神經 :尺度遶Λ中囲Η家樣準（CNS)甲4规格（210X297么、釐Γ 33 - 81.9.25,000 ---Τ--------------- r----裝------訂------線； (請先《讀背*之注意事項再填寫本 A6 B6 五、發明説明（32 ) 条统，如由腦或脊饉身體傷害或臂及手之壓碎或切斷傷害 所致的。 在此也掲示産製GDNF之方法。一傾掲示的方法包 括自各種來葱中分離GDNF,如神經驥質細胞株之諏適 培養基。第二種方法涉及分離出負資编碼GDNF之基因 ，於適當的載讎及细胞型式中遘殖基因，表現基因以産生 GDNF。後一方法大臞上是重组DNA方法之例子，為 本發明之較佳法。以重组DNA方法為較佳，部份是因為 其可逢到在較髙純度下相雪大蓋的蛋白質。重组體人類 GDNF對製備治療性组成物及用於治療神經傷害而言， 為最佳的蛋白質。 本發明包括鑑定及選殖基因之方法，此基因編碼的蛋 白質具有與GDNF同質之胺基酸序列，以及所有此種經 鑑知之蛋白質。 己描述含有三種神經營餐因子之晡乳動動基因族（ 經濟部中央«毕屬HCX消t舍作杜<f«
Le i brock et a 1 . 1989 Nature 341^149-152. Ma i sonpi-erre et al· 1990 Science 247:1446-1451)。此族中所 含的三種蛋白質之成熟型式〔神經生長因子（NG F )、 腦衍生之神經營養因子（BDNF)及神經營養因子一 3 〔NF — 3)〕互相具有約50%之胺基酸同一性。於逭 些蛋白質各傾中之6傾半胱胺酸殘基位置均精確地保存。 雖然结構上相似，但逭三種蛋白質呈現不同的組織分佈（ Ernfors et a 1·1990 Neuron 5j511~526 Maisonpierve et a 1·1990 Neuron 5：501-509,及Philips et a 1· 81.9.25,000 :尺度適用中B國家«準（CNS)甲4规格（210 X 297公* r 34 - A6 B6 嫌濟部f央揉準屬興工消费含作杜1-« 五、發明説明（34 ) 交實驗。 此種雜交條件，常稱為a減少的迫切性"在文獻中有 充份描述（Betz et al.上文，SaBbrook.et al. 1989 Molecular Cloning , 2nd edition· Cold Spring Harb-or Press)且更常是涉及於水性溶液中進行時雜交反應溫 度之減低及/或減少雜交条中甲醯胺之濃度，通常應用含 50%甲醯胺之溶液。其他減少迫切性的方法也已有述， 且也可應用（SaBbr〇〇k et al,上文）。於這些雜交實驗 中所使用的核酸標的可包括： 1) 基因體DNA庫，含有人類、大鼠、或任何哺乳 動物種類，或任何其他種類的DNA選殖至任何 合宜的載饅中，包括噬菌體、質饅、粘接質臞、 酵母人工染色體，或其他任何型式之載體； 2) cDNA庫，其産生出處之RNA來自上述任何 有機體之任何組雜型式，或來自上述任何有機體 中任何型式初级細胞之培養，或目前存在於或可 産製自任何初级细胞培養之任何型式之穩定細胞 髖； 3) 於上文1)中所述之基因體DNA以限制酶水解 並進行南方吸漬分析之準備，即凝膠電泳並轉移 至固相載髏； 4) 上2)中所述之RNA,接受電並轉移至固相載 體以進行此方吸漬分析。此種RNA可含全部的 細胞RNA或經分级分離之P〇ly A* (請先閲讀背面之注意事項再填寫本Ik i裝. 訂· •線 本紙張尺度適用中國Η家樣準（CNS)甲4規格（210 X 297公梦r 36 - 81.9,25,000
R N A。 A7 B7 五、發明説明（35 ) 5)聚合酶鏈反應（PCR)之產物，其以GDNF 上之序列所設計之寡核苷酸爲引子，及D至1 ) 至4)中所述之任一核酸來源爲模板· 經証明在某些經驗所決定之雜交條件下可與以G DN F爲底之探針雜交之任何核酸序列，均可以精藝者熟知之 各種技術選殖及定序，且可直接決定序列同質性程度，以 鑑定GDNF基因族成員。藉著以NGF序列爲底之探針 之篩選*此種雜交途徑可用來選殖NT-3，（Kaisho et al. 1 9 9 0 FEBS Letters 26 6 : 287- 1 9 1 ) β 鑑定GDNF族成員的另一方法，係利用聚合酶鏈反 應（P CR)擴大GDNF族成員之序列，之後選殖並分 析經擴大之序列。P CR所用之簡併（或未簡併）寡核替 酸引子，可依據GDNF序列而合成。已知半胱胺酸位置 具保存性，且半胱胺酸殘基緊鄰胺基酸序列具保留性，此 乃NGF族中可觀察到的，則在成熟GDNF半胱胺酸周 圍之區域代表引子合成明顯的候選者，但也可自蛋白質的 成熟及前原部份中選擇其他各種引子。P c R反應可在減 低的回冷溫度條件下進行，其不僅可擴大G D N F序列也 可擴大任何G D N F族成員之序列。見，Innis et al. 1990 PCR Protocols * A Guide to Methods and App1i cations,Academic Press。此.種P CR反應之產物可以凝 膠電泳選擇大小，選殖至適當的載體中，且定序所選殖之 DNA以鑑定GDNF族成員。此外，純系可由與 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I t— I.^. n n n I ^ I n n n n I ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央棣準局貝工消費合作社印製 -37 - 4014S2 Αβ Β6 鳜濟部中央螵準爲貝工滴费♦作社，髮 五、發明説明（36 ) GDNF具特異性之探針，在离迫切度條件下雜交而第一 次筛選，以鑑定GDNF純条。無法在高迫切度下與 GDNF雜交之任何純条可再定序，或者此種純条可在減 低迫切度之條件下與GfaNF探針雜交，之後於這些條件 下確可與GDNF探針雜交的任何鈍条可再定序。 第二種利用PCR選殖GDNF族成貝之途徑你標記 上述PCR反應之産物，且使用造些産物充作探針以在高 及/或低迫切度條件下，與上文列舉之核酸檫的篩選。雜 交純条或核酸片段可如上般詳细分析，以鑑定GDNF纯 条及核成員。在一途徑已用來在NGF及BDNF序列為 底下S^INT — 3 之用。（Naisopierre et al. 1990 Science 247:1446-1451)0 於本發明一値較佳具體實例中，將有效劑置之治療或 _學組成物（含GDNF)投予至神經損害患者。於本發 明一値較隹具鳢實例中，GDNF治療性地用於巴金森氏 病患者。精毎者均熟悉可甩來顯示何者神經元對G D N F 之處理有反映之各種分析法，且在無不當經驗下進行其他 對GDNF有感受性神經元之決定。精轻者可容易地決定 ，饈内何處可表現GDNF之信息，且在道些區域中各別 GDNF蛋白質之水平為何。精藝者也可決定神經糸中與 GDNF结合之位置。此資料使精藝者可決定出似乎對 GDNF具感受性之神經元型式，此依序可推論此蛋白質 適當的睡床指示。之後進行適當的細胞培養及動物實驗， 以決定GDNF可用於治療此種徴候之可能性。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本t i裝. 訂· •線 本紙張尺度適用中团B家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）-38_ 81.9,25,000 A6 B6 «濟部t央標準局霣工洧费合作杜4-製 五、發明説明) 也已示出，分離自B49諏適培養基之純化的 GDNF,可促進培餐中副交感及交感神經細胞之存活。 逭些结果詳述於實例4。 由於可能GDNF之神經營餐功能你由一傾以上不連 绩及可分離部份的給予的，因此也檢視藉著投予其活性组 份由可控制GDNF神經營餐功能之部份所組成之治療组 成物，是否可實行本發明方法。 本發明之治療或藥學組成物，較好採注射經腸外投藥 ，或經由植入泵連缠輸注而直接注入腦脊结液中（CSF )。同時也可檢視其他有效的投藥型式，如腸外缓釋諝和 物，吸入性蓀劑、口服活性諝和物，或栓劑。同時也檢視 配合一種以上可促進GDNF穿透血腦障壁之作用物之投 蕖。一値較佳的溶媒是生理食埴水溶液，但希望也可使用 其他蕖學上可接受之載體，如人造CSF。於一較佳具體 實例中，想像由載體及GDNF構成的生理上可相容之缓 釋諝和物。於此載體中主要的溶劑可本質上為水性或非水 性者。此外，載鳢可含有其他藥學上可接受之賦形劑，以 變化或雜持調和杨之pH、等滲性、拈度、澄明度、色澤 、無菌度、穩定性、溶解速率或氣味。類似地，載髏中仍 可含有其他蕖理上可接受之賦形劑，以變化或雒持穩定性 、溶解速率、釋出、或吸收或GDNF穿透血腦障壁之能 力。此種賦形劑為經常及傳統上用來躕和劑量之物質，用 於腸外投藥可呈單位劑量型式或多劑量型式，或用於以連 鑲或定期自一植入泵中輸注而直接输注至C S F中。 先 η 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 % 本 裝 訂 線 本纸張尺廋適用中Η B家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐户39 - 81.9.25,000 A6 B6 缓濟部f央樣準局霣工消费合作杜_製 五、發明説明（38 ) 一旦調和成治療组成物，其可貯於無菌瓶中，呈溶掖 爾、懸液劑、凝謬、乳剤、固體或脱水或冷凍乾燥之散薄 。此種諝和物之貯存可呈即可用型式，或於投藥前才重組 而成者。此種調和物較佳之貯存溫度為至少低至4 且 較好在一 70*0下。 較好，腸外投予含GDNF之調和物之方式可經由皮 下、肌内、椎管内或腦内路徑。為逹到欲求的GDNF劑 量可進行毎天重覆或較少頻率之皮下或肌内注射，或者 GDNF可自植入泵中連鑲或定期地輸注。给藥頻率依諏 和物中GDNF之藥物動力學變數，及所使用之投藥路徑 而定。 為逹到GDNF至多巴胺能及其他受損神經細胞（其 细胞體在腦及脊隨内）之欲求劑置，希望GDNF可投予 至腦或脊發蜘蛛膜下或腦室内。投藥可探連缅或定期方式 ，且可經由固定或擬定流速之可植入泵或採定定期注射方 式。投藥中也可配合令GDNF穿透皿腦障壁之作用物。 也希望某些含GDNF之諏和物也可口服。較好，以 此方式投予之GDNF傺經過包膠的，可諝和包廖之GD NF,加或不加有组合固體劑型習知使用之載髖。較好， 設計醪囊，便諝和物之活性部份可布贾腸道中釋出，此中 生物利用旁可逹最大且条统前降解作用減至最小。可包括 有額外的賦形劑，以促進GDNF之吸收。也可應用稀釋 劑、芳香劑、低熔黏蟠、植物油、潤滑劑、助懸劑、錠劑 崩散剤、及粘合劑。 <請先閱讀背面之注意事項再填窝本 -—装_ 訂· .縷 本紙張尺度適用中國理家揉準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）-40 - 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明（39 ) 不論投藥方式，依據病人大約醱重或體表面積估計待 異劑董。治療所需適當劑量的進一步估算，此中涉及上述 每一阑和物要由精藉者例常地製成，且是其在無不當經驗 下例行試驗之範团之内，尤其是以此中所掲示之爾量資料 及分析法為準。這些劑置經由被利用來決定剤置之已確立 分析法，配合適當的劑量一反應數據可予以確定。 於本發明一值具體實例中，GDNF可治療性投予， 偽於病人身體中植入可合成及分泌GDNF生物活性型之 細胞。此種産製GDNF之細胞可為GDNF天然産製者 之細胞（類似B49細胞）或細胞産製GDNF之能力經 由GDNF基因（呈適合促進其表現及分泌之型式）之轉 形而被增加之細胞。為了將病人由於投予外來物之 GDNF所引起可能的免疫反應減至最小，較好天然 GDNF産製細胞是源自人類，且可産生Λ類GDNF。 另外，可利用指導合成人類GDNF之表現構髓轉形於細 胞以表現人類GDNF,方法類似下文實例5及6中所述 Ο 經濟部中央樣毕局Λ工滴♦含作杜印製 可利用以下工具鑑定可自然分泌人類GDNF之細胞 :(1)可利用代表部份人類GDNF傅訊RNA之寡核 苷酸，或互補於人類GDNF傅訊RNA之寡核普酸，以 利用此方吸潰分析、RNase保護，原位雜交、聚合酶 鏈反應、或其他相關方法、來發現可産製人類GDNF傅 訊RNA之細胞株，或者（2)可利用確認人類GDNF 之多株或單株抗匾，以利用西方吸潰分析、E L I S A分 81.9*25,000 (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本t t紙張尺度適用中Η國家《準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐了 41 五、發明説明) 析、放射免疫分析，或其他相翻方法來發現其萃取物或諝 適培餐基含有GDNF蛋白質之細胞株。較佳的策略是利 用上（2)中人類GDNF抗、篩S—糸列源自人類細胞 之調適培餐基，以發現可將GDNF分泌至其培養基中之 抗《。所産生GDNF之証實，則可純化之並分析胺基酸 序列，如同B49細胞可産生GDNF並分泌至其培餐基 中。下實例7描述人類重組髖GDNF抗體之産製及分雄 Ο 可利用可自然分泌或經轉形可分泌人類GDNF之細 胞來治療病人。人類或非人類動物細胞，可在半可穿透之 聚合包裝中再植入病人饈内，以令GDNF釋出但不致為 病人的免疫条統所破壊。另外，病人本身的細胞，經轉形 可於活體外産製GDNF,可在無此種包膠下直接植入病 饅中。 經濟部中央*準屬員工消费合作杜印轚
(請先《讀背面之注意事項再填寫本P 活細胞以膜包膠之方法對精藉者而言是熟悉的，且其 可在無不富經驗下製備包膠細胞及植入病體。見，美國專 利第4, 892，538 ; 5, 011，472及 5,106, 627,其各自待異地纳為本案參考。包驂 活細胞之条统述於Aebischer等人的PCT案W09 1/ 10425,待列為本案參考。也見，PCT案W091 / 1 0 4 7 0 (Aebischer 等人）；Winn et al 1991 Exper> Neurol· 113：322-329;Aebischer et al«1991 Exper· Neuro1·111J269-275 *Tresco et al· 1992 ASAIO 38:17-23,各自持異地列為本案參考。 尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297«釐y U " 81.9.25,000 A6 B6 鳗濟部中央樣準局Λ工消#合作杜印製 五、發明説明（41 ) 特別地，分泌GDNF之細胞可植入巴金森氏病患之 纹狀體中，以對黑霣的多巴胺能神經之终界提供GDNF ，及植入黑質中以對多巴胺能細胞鐮提供GDNF。此種 局部應用可經由多巴胺能终靖促進紋狀醴之芽出及神經支 配，且可避色或減缓多巴胺能神經细胞進一步的變性。 因此，本發明經由植細胞至有所需患者病醱中以避免 或治療神經傷寄；此種細胞之選擇基於其産生GDNF之 天然能力或經逋傳工程分泌GDNF之能力。較好，當患 者是人類時，所分池的GDNF為人類成熟的GDNF。 應注意到，此中所述的GDNF調和物可用於獸類以 及應用至人體，且因此'"病人"一詞不應有所限制。於獸 類應用時，劑量範圍應如上所示。 要了解，基於此中所教示的，針對待異問題或環境應 用本發明教示，將是精薛者能力範園内的。本發明代表性 用法之實例示於以下實例中。 奮例 審例1 :GDNFク紳>fh及宙庠 本實例描述GDNF分析及純化之方法。也描述製備 純化起始物之B49细胞株諝適培養基之方法。也描述獲 得純GDNF胺基酸序列及純蛋白質部份胺基酸序列之方 法。 A ·材料 請 Η 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 装 訂 % t紙張尺度適用t國國家揉準（CNS)甲4規格（210X297«釐） 81.9.25,000 --43- 401422 A6 B6 五、發明説明（42 ) 迪當時期懷孕的大E得自Zivie Miller lab A1 缓濟_^-央樣準房興工消费合作社印製 son Park,PA。除非另有所示，所有試劑均來自SU»a Chemical Co·， St· Louis.M0〇 B.多R胺能神铒璺着活袢之生物分析 培養條件：如前所述（Fer i ed*an and My t i 1 i neor 1987 Neurosci. Lett. 79:65-72)略加修飾製備分離的 中腦细胞培餐。簡言之，懷孕1 6天的Sprague-Dawley大 鼠胚胎，在無菌條之顯撤鏡下自腦中切出頭侧中腦脚蓋· 收集於無Ca“及Mg “之Dulbecco、磷酸埴缓衝食埴水 (Gibco，Gaithersburg，MD),並以缓和提碎機械地分離 。細胞塗佈在每孔洞100榭升之16毫米直徑组雄培餐 孔洞中（Falcon · Lincoln Park，NJ. 2 4 孔洞盤）其中 含400撤升培餐基以生成毎孔洞2. 5_3· 5X 10β細胞之密度。培養孔洞先前已曝於0. 1毫克/毫 升聚1一鳥替酸於1〇11114硼酸納，？士8.4之溶液中 ，37Ό下3小時，於milli-Q H2〇中洗3次，及 Earl’s平衡塩溶液（Gibco)中洗一次。供餐培餐基（ 10/10)含有最低營養要求培養基（MEM, G i bco )並添加蕕萄糖（33mM) ·碩酸氫納（24. 5mM ),毅胺酸（2mM)、HEPES (15mM)、青徽 素G (5U/毫升）、鐽徽素（5微克/¾升）、10% 熱減活之胚牛血清（Gibco)及10%熱滅活之馬血淸（ Gi bco)。培餐物在含6. 5 % C0 2水飽和大氣中（以 請 先 蹋 讀 背 * 之 注 意 事 項 再 填 寫 装 訂 ；·纸張尺度適用中國Β家橒準（CNS)甲4规格（210 X 297«釐） 81.9.25,000 A6 B6 缓濟部t夹標準属Λ工消*合作杜<p« 五、發明説明（43 ) 371C維持。3小時後，酋大部份細胞已粘附在孔洞底部 時，培餐基更換以500微升新鮮培餐基。此時，將欲做 GDNF活性分析的連缠稀釋樣品以雙份加至各孔洞，且 培餐盤培育於37C培育箱中。一週後，培養物以氣去氣 尿嘧啶核替（13榭克/毫升）及尿嘧啶核苷（3 3微克 /¾升）處理24小時，以避免過多的神經膠質增殖及接 下來添加無胚牛血清之上述培養基。供養培餐基每週更新 Ο 另外，使用化學上明確的無血淸培養基，其中血淸以 蛋白質、激素及埴類的混合物取代。明確的培餐基（DM )含有MEM及F12營餐物混合物（約為Gibco; 1 : 1 , v/v)加上葡萄糖（3 3mM)、毅胺酸（2mM ),NaHW3(24. 5mM) ^ HEPES (15 mM),及鐵傅遞蛋白（100微克/毫升），胰岛素（ 25撤克1毫升）、腐胺（60wM)、黄體酮（20 nM),硒酸鈉（30mM)、育徽素G (5U/€升） 及鍵徽素（5微克/毫升）。DM之滲透度以Milli-Q水 加入調至325 (1 10 - 125毫升H3〇/升），以 外形或神經傷害纖雒酸性蛋白質（GFAP)染色可見出 一些非神經元細胞，其係星狀细胞一待異的細胞骨架蛋白 質。GDNF在含血淸及明確培養基中，均可有效剌激多 巴胺之攝入。以下實例中所有的分析法均於含血清之培養 中進行。 在逭些培養物中可分析多巴胺能神經元之功能狀況， 請 先 Η 讀 背 之 注 意 事 項 再 壜 寫 本 装 訂 t紙張尺度適用中國國家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -ts- 81.9.25,000 A6 B6 401422 五、發明説明（44 ) 像偵測多巴胺經由多巴胺能神經元中持異的$淸除者#蓮 送而攝入，並且利用免疫組鐵化學法計數對多巴胺合成酶 一酪胺酸羥化酶呈陽性之神經元數目。培養物為正腎上腺 素能神經元摻雜之可能性（此神經元也會蓮送多巴胺且也 含有酪胺酸羥化海）可由小心切開而排除，且明示出多巴 胺蓮送者具有多巴胺能之藥現槪要待性，而非正醫上腺素 能神經元之特性。在造些培養中多巴胺之攝入可為GBR ,12909所抑制，此為多巴胺能神經元單胺蓮送者之 抑制劑，具20ιτιΜ之£〇3。值。相反的，為抑制多巴胺 在培餐中之攝入所需之去管敏（desipranine)至少 300倍之多，其為正腎上腺素能神經元上單胺蓮送者之 抑制劑。這些數值為多巴胺能神經元上針對單胺蓮送者所 報告之數值。 樣品製備：在於中腦細胞培餐中分析多巴胺能神經營 餐活性之前，所有由第1至第3純化步驟（下C段）中産 生之樣品均如下去脱之。100撖升的培餐基10/10 (充作載醮）加至Ceutricon -10 (Amicon)中，並令其 置1 〇分鐘。各份欲分析樣品加至Centr icon中，之後加 1毫升Dulbecco’s高葡萄耱之經修飾的伊亞格培餐基，不 加重磺酸塢但含10mM HEPES,pH7.2(A 溶液），以5, 0 00xg離心70分。滞留物（約 〇· 1毫升）加新鮮A溶液使速1. 1毫升，再重襄缩二 次。樣品經由0· 11微米U1 et raf ree-MC無菌Durapore 單位（Millipore , Bedford ΜΑ)遇濾，再加至培餐孔洞 衣紙張尺度速用中國國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 請 先 Μ * 背 之 注 意 事 項 再 磷 窵 本 装 訂 嫌濟部中夹標準房霣工消费合作杜印製 81.9.25,000 401422 A6 B6 觎濟鏵t央«準屬員工消费合侏杜印製 五、發明説明鉍5 ) 中。 1 r Λ 3Η —劣円胺夕檯入：如先前所述（F$ie<Uan and Mytil，ineou (1987) Neurosci.Lett. 79:65-72)略加修 飾，在第6或7天時於培養中進行經m化多巴胺（3H_ DA)之攝入，且所有溶液均保持在37t：下。簡言之， 移去培養基，以0. 25毫升攝入缓衝溶液潤漉二次•此 缓衝溶液由克勃氏一林格氏磷酸塩缓衝溶液，PH7·4 所组成1含有5 . 6 m Μ葡萄耱、1 · 3 m M EDTA ,0. ImM抗壊血酸及0. 5mM巴吉林（單胺氣化酶 之抑制劑）。培養物與〇· 25毫升的5〇111^31·!-D A (New England Nuclear，Boston，MA.fcb 活性 3 6 _ 37居里/毫莫耳）在37*0下共置15分。移去培養混 合物，之後細胞以0. 5毫升攝入缓衝溶液洗二次以停止 — DA),培餐物與0· 5毫升95%乙酵在37*0 下培育30分，再加至10毫升EcoLite (ICN , Irvin , CA),並於閃爍計數器上計數。加0 . 5mM GBR — 12909 (RBI)至攝入缓衝溶液中可得空白數值 ，其是多巴胺能神經元高親和力攝入泵之特異抑制劑（ Heikkila et al. 1984 Euro. J. Pharnacol· 103： 241-48)，且在未處理之對照培養中通常3H _ D A之攝入 低於5%。將GDNF活性營養單位（TU)定義為：造 成培養物3H — DA攝入最大剌瀲作15 0 %時, 數之倒數。將TU值除以樣品中所存在之蛋白質含量，可 得比活性。 (請先》讀背.由之注意事項脣填窵本f •装. 訂. 本紙張尺度逍用中國國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐Γ
81.9.25.0C A6 B6 五、發明説明邮） C · Π Π N F之紳化 祀始材料：得自 D · Schuber t，Sa 1 k Ins t i t u t e，La Jolla，CA之B49神經傷寄箱母細胞之細胞，在培餐瓶‘ 中（2 2 5 公分 2) » Costar，Cambridge, MA)以含 10 %胚牛血清、4mM毅胺酸、5 0單位/毫升青徽素一 G 及5 0微克/毫升鏈徽素之DMEM培養基培養至呈匯合 狀。製備無血清之生長諝適培養基（CM),傺以10毫 升無血清培養基洗培養物一次，再將細胞以毎瓶50毫升 置無血淸培養基中2天。收集CM,细胞以毎2天，無血 淸之新鮮培養基更新，直到第6天。得自各批次細胞之獲 之混合CM,在4t!下離心5, OOOxg, 20分以除 去细胞及殘届。上淸液以A· icon濃缩器（Υ Μ 1 0膜）濃 縮約10倍，再於4t：下以40, 000 xg離心20分 。上淸液經 0 · 2 撤米之 Micro Culture Capsule (
Gel^an Sciences) 過濾，且可貯於下長達1 fi月。
1步皤.阡隶SeDhar〇se靥析：上述之製劑(200 毫克蛋白質）缜料至肝素Seph arose CL-63 (Pharmacia， ?13〇&1?^7，^)管柱上（1><2 5公分），其已用5 0 m M NaPi缓衝溶液，ρΗ,8.0,含有 0 . 1 5 N NaCJ2 (Α缓衝溶液）先行平衡。管柱再 以相同缓衝溶液洗滌，直到流出物在280毫撤米下之光 密度（0 Dm。）轉為基準值，再以1 0 〇毫升由A缓衝 液至50mM NaPi,pH8.0,含1.5N 請 先 Η 讀 背 由 之 注 意 事 項 再 填 窝 裝 訂 嫌濟部中夹霉準廣霣工消费合作杜印轚 ^紙張尺度遥用中BIB家揉準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明（4：i)
NaC{ (B缓衡液）之線性梯度溶離。收集2毫升流份 。流份分析導電度及GDNF活性。圓1示出此一靥析法 。溶離出之蛋白質槪圓，對0D〃C值作圓。重叠有於各 流份中所測得之導《度及GDNF活性之繪鼸。以横線顯 示其中具高峰GDNF活性之流份（約0. 6—0. 8 NaCJ?處）予以匯集以進一步分析。 2步屋.HPLC Superose靥析：上述匯集物經由
Am i con 濃縮，器（Amicon，Beverly，MA YMl 〇 膜）濃结 成0.4¾升，再於50mM NaPi缓衝液，ρΗ 7· 4含0. 5Ν NaCi?下於悚速蛋白質液態層析（ FDPLC) Superose 12 管柱上（Pharmacia )層析， 流速為0.5毫升/分。經14分鐘溶離後，0. 5毫升流份 收集至聚矽氧化之撖離心管中，其内已有5撤升的0.4 % Tween 2 0。來自各流份的各份，進行G D N F活 性分析。圓2示出此在OD2*〇下有蛋白質概圓之層析， 且重β上GDNF活性型式。填料至管柱中有85%的G DNF活性可在12—15號流份中回收。 3步« :RP-HPLC:來自上述的第14號流份，以10 撤升25%三氟醋酸（TFA)酸化。一半的經酸化物質 滇至窄孔Aquapore RP - 300c — 8逆相HPLC管
柱中（Brownlee 管柱.Applied B i osysterns » San Jose ， CA), 2. 1X220 毫米，並以 Ha/0. 1% T F A :80%乙臃/0.085% TFA梯度溶離。手動式 將含蛋白質之流份收集至經聚矽氧化之撖董離心管中，此 本纸張尺度逋用中团团家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公*) ~ 49 ~ 81.9.25.000 請 先 Η 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 t 装 訂 鐮濟部中夹*準為貝工消费合作社<p« 401422 Αβ Β6 缓濟部中央標準局員工消费合作杜印褽 五、發明説明辟） 依214毫撖米下之UV吸光度來進行。來自各流份的各 份，進行G D N F活性分析。圖3示出此一在0 D 2:4下 有蛋白質槪醺之層析，且活性型式示於較下圖中。5及6 流份中含有約90¾回收且RP—HPLC之活性，而7 流份負資剩下10%·活性。圖4示出在圖3中接近 GDNF活性峰各流份之SDS—PAGE凝膠銀染圖。 4步嫌.魃備式SDS—PAGE：匯集含有离峰 GDNF活性之第5及6流份，並在10撖升0.4% Tween2 0存在下，於高速真空上濃緯。在樣品中加入1 微升 1M T ris驗及 5 微升 0 . 2 M Tris- HCi , pH6. 8，其中含有40%甘油及5%SDS,並於非 邇原的15%SDS-PAGE上進行霣泳（Laeul i 1 9 7 0 Nuture 277 ： 68 0 - 684)(板為 0. 075X14X11. 5公分，20孔的梳子， 0. 075X0.4X2. 8公分/樣品孔）。電泳於 1 0 TC下以4 0毫安培/凝謬進行2小時。凝鏐Η切成 1 . 1 4毫米薄片。各薄片切成2値更小片，並以連绩3 次的25微升5mM NaPi,pH6.7,含 0. 0 1%Tween2 0之更換而溶離，在4t!下連鑛2 0小 時不斷的搖動進行。混合3份溶離物質，分析其GDNF 活性（困5),再匯集具最高活性之溶離物（凝騵薄片 16 — 23號，相當於30 — 42kD, H5)。空白凝 暖片（在其上只填以SDS — PAGE缓衝溶液再行電泳 )則類似地處理以為對照組。 -—-—--5Θ-- 請 Η 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 装 訂 Λ 本紙張尺度適用中团國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 A6 B6 經濟部中央*率為A工消费合作杜«P製 五、發明説明矽〉 5步雄一RP—HPLC:匯集的凝驂溶離物，於高 速真空下濃縮至約150微升，以25%TFA20微升 酸化•並如3步驟所述地於RP — HPLC上進行。手動 式收集含蛋白霣流份至聚矽氣化之撖量離心管中，依據其 OD2h值及GDNF活性而言。圖6示出此一靥析之結 果。至於對照組，自類似大小之空白凝謬薄Η中得之溶雄 物，也RP — HPLC上進行。樣品中較對照圃有顯著 峰者僅有第3峰（圃6, Α圖對照Β圖），其中 含70%熵料至HPLC管柱之GDNF活性。圄7示出 第3峰於SDS—PAGE凝膠上之銀染圏。唯一可視之 染色是可於30 — 42kD間棰寬的帶，符合於製備式 SDS — PAGE中所見之GDNF活性概圓（圖5)。 典型純化之綜合示於表I。 D紳GDNF之胺某酴庠刻 按基末端序列：鼷6中的第3峰以氣相蛋白質定序儀 (Applied Biosyste·)定序。所得的序列示於圏8。具 GDNF活性流份經第3步驟純化後定序（圖3中第5及 6流份）也顯示一値箪一序列，和以純樣品所得者（困8 )相同。在這些不同流份中共同擁有的唯一物質是在30 一42kPa間呈模糊之物質。因此，在30—42 kP a區外見於第5及6 (圖4)流份銀染凝膠中之污染 帶將a)由於量太少（<1微撖其耳）以致無法以目前的 技術予以定序；b)和序列中的30—42kD棋糊箝有 請 先 Η 讀 背 之 注 意 事 項 * 填 寫 本 装 訂 η ί·紙張尺度適用中B國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐>
St 81.9.25,000 401422 A6 B6 五、發明説明¢0 ) 蘭；或C)具有經阻斷之胺基末端。 aiLESL： GDNF製製劑經3步驟之純化後，充作 起始材料以得内部序列。圖3中第5及6流份匯集至聚矽 氣化之微董離心管中，其内含有9撖升的0. 4%
Tween,並在高真空下濃缩成40撖升。在樣品中加入 160撤升1% NH<HC〇3,其中含有2.5M胍埴 酸塩及1微克胰蛋白酶，並在371C下培育一夜。混合物 以25%TFA20撤升酸化，於高真空下濃缩至約 15〇撤升，且肽在窄孔的八<11^0(^6 R P — 3 0 0 C-8逆相HPLC管柱上（Browhlee管柱，2 . 1 X 220 毫米）分離，以 H2O/O. 1%TFA:80% 乙臃/0· 085%TFA梯度溶離。手動式收集含肽之 流份至矽氣化微離心管中，此依214毫撤下之吸光度為 準。圏9示出此層析之结果。圖9中第10峰之序列，經 決定知和圖8所示未處理蛋白質胺基末端序列的前13傾 胺基酸相同。（SEQ IDN0:1)。圖9中的第 37峰以CNBr進一步處理。樣品在高真空下濃縮至 20撖升。加70撤升的90%甲酸及5毫克CNBr至 樣品中，且樣品在室溫下置暗處一夜。此混合物於高真空 下濃縮成20微升，以100微升0.1%TFA稀釋， 再於如上述之逆相HPLC上分離。圖10示出此層析之 结果。圔1 0第1峰於5撤升0. 4 %Tween2 0存在下 ，於高真空下濃缩成20微升。樣品中加入100撤升的 l^NH/COa及5撤升5 0mM二硫異赤弱藻酵，且樣 本紙張尺度速用中國國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 請 it 聞 讀 背 由 之 注 意 事 項 再 填 寫 ΙΛ 装 訂 *濟部中央標準场貝工消t合作杜印《 A6 B6 «濟部中喪«準局貝工消费合作杜卹t 五、發碘説明¢1 ) 品在室溫下培育1小時。混合物以10微升25%TFA 酸化，於高真空中濃縮成100撤升，並在逆相HPLC 上分離，如上述。圖1 1示出此種層析之结果。圔1 1上 之第33及34峰有相同的序列（圃12) ( S E Q ID Ν Ο : 2 ) 〇 E . G D N F ：> 梓任· 於SDS—PAGE之移動性：在無任何熱處理及於 非邇原條件下，GDNF在SDS — PAGE上以介於 3 1 — 42kD之模糊帶出現。當樣品在還原劑（4炻/3 一頚基乙酵）存在下於100TC中加熱3分鐘，則 GDNF在20—23kD間呈分離的多重帶出現。由於 填至凝膠上之生物活性約有5 0%可於前一條件下（非邇 原）而非後一條件（運原）回收，HPLC可能是一傾二 硫化物鍵结之二體，且只有在呈二體時才具活性。雖然由 單一的胺基末端可推想GDNF製劑在核心一鈒結構上像 同質的，但由模糊或多重帶型式則推測其傜一饀異質的糖 基化蛋白質。 bb活性：經純化的GDNF有約1 7營養單位/毫微 克之經估計比活性，其顯示多巴胺攝入之最大刺激作用一 半值發生在約60微微克/毫升之相當低濃度下。對纯 GDNF所測之比活性多少低估了，因為於純化過程中 GDNF曝於RP — HPLC所用之酸性有機溶劑下，及 於SDS—PAGE中曝於變性條件，使GDNF部份被 •59·-
請 先 Μ 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 窵 本 1 V 訂 ί纸張尺度適用中國B家標单（CNS) T4规格（210 X 297·»釐） 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明¢2 > 滅活之故。 GDNF之待異性：GDNF因其可於多巴胺神經元 上加強多巴胺攝入之能力而純化（圓20A)。為了決定 GDNF是否也正向諝控多巴胺神經元存活及/或成熟的 另一指數，因此也偵測於中腦培養中之酪胺酸羥化酶（ TH)免疫活性。TH是培養物中與多巴胺神經元具特異 性之樺記。免疫活性為GDNF之正向調控可歸因於多巴 胺神經之增加之存活及/或增加毎多巴胺神經元中TH之 産製。於塗佈日加入純化的GDNF,且第8天後檢査培 養物可知造成較無GDNF之對照组高出10倍之TH* 神經元數目。若於第9天加入第二劑量之GDNF,並於 7天後檢査培餐物（試管内第16天）侧仍可觀察到离出 對照组之類似的剤量一依賴性增加（圃20B)。因此， GDNF可支持多巴胺能神經元之存活及/或增加TH基 因於中腦多巴胺能神經元中之表現。 為明示出GDNF在多巴胺神經元之成熟及/或存活 上可呈現待異的刺激作用，而非在所有神經元上的一般作 用，於是分析含有7 —胺基丁酸（G A B A )(其也存在 於中腦培餐中）之神經元中對GDNF之反應性。在中腦 細胞之姐妹培餐物中偵測H3 -多巴胺能（3H_DA)及 i4C — GABA之攝入，其則已先和各種濃度之GDNF 分別生長15及16天。如上所述，GDNF可加強中臞 多巴胺神經元之3H—DA攝人能力，較無GDNF之對 照组強過〜150% (圔21A)。然而，GDNF對於 本紙張尺度適用中团团家«準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 請 先 Η 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 Γ 装 訂 *濟部t兴樣準屬Α'工消t合作杜印製 81.9.25.000 A6 B6 五、發明説明（5¾ GABA神經元攝入〃C一GABA之能力則無潁著作用 ，因為在GDNF存在下 叫：一 GABA之攝入僅高出 對照組20% (圔2 1B)。此也可由3H — DA/〃C 一 GABA摄入比率經估計增加來説明（圃2 1C)。這 些數據顯示，多巴胺及GABA中腦神經元對GDNF之 存在有不同的反應，且GDNF對於中腦培餐中3H_ DA攝入之剌激作用傈對多巴胺特異的，和GABA神經 元相反。 這些觀察進一步説明，為何GDNF可用來治療巴金 森氏病或其化涉及多巴胺能神經元之失諝症。造些结果明 ,GDNF可正向諝控多巴胺能神經元至少二種重要的待 性：多巴胺之攝入及TH酵素水平。结果也説明， GDNF的作用對多巴胺能神S元而言至少具部份特異性 ，因為GABA神經元並未被類似地影響。 除了多巴胺能及HABA能神經元之外，尚有另一神 經族群一 5羥色胺能神經元，於大鼠胚胎中腦培養中。某 些因子，如上皮生長因子（EGF)可經由中腦培養中之 多巴胺能神經元增加多巴胺之攝入，也可經由5羥色胺能 神經元增加5羥色胺之攝入，及經由GABA能神經元增 加GABA 之 II 入。見》Casper et al. 1991，J· Neurosci. 30:372。此點顯不這些因子並非對多巴按能神 經元特異的。 相反的，GDNF無法經由5羥色胺神經元來增加5 羥色胺之攝入。以實例IB 3H — DA摄入之相同方式 本纸張尺度遗《中Η國家«準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -55 - 請 先. Η 讀 背 * 之 注 意 事 項 存 填 寫 裝 訂 缓濟部t央«準屬員工消费合作杜<ρ製 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明¢4 ) 偵測3H — 5羥色胺之攝入，除了攝入緩衝溶液中以50 η Μ 3Η_5羥色胺（1 1居里/莫耳， A^ersha· » Arlington Hcients，1C)代替 3H — DA。於 10/uM 喜它潘（c i t a 1 pra·)(得自 Dr . C · My t i 1 i neou，Mount Sinai School of Medicine)(一種5羥色胺神經元中已 知之5羥色胺攝入強力抑制剤）存在下，3H — 5羥色胺 之攝入減少至1 5%。於喜它潘存在下之對照组數值自實 驗值中減去，示於圔2 4 〇 和EGF等非待異性因子相反的，GDNF在多巴胺 攝入可顯著增加之條件下，無法增加GABA之攝入（困 2 1)及5羥色胺之攝入（圖24)。這些及上述结果顯 示，在中腦培養中，當與所存在之GABA能及5羥色按 能神經元比較下，GDNF對多巴胺能神經元具有特異性 。此種特異性可加強GDNF用於治療巴金森氏病之有用 性，此疾被視為對中腦（黑質）多巴胺能神經元待異性的 奮例2. GDNF某因乏箱箝 a.蓰ytmastBGDNF之大鼠某因〇〇以六耷教 為了選殖编碼GDNF之基因，以分離自B49細胞 之P〇 1 S A*RNA構築一值cDNA庫，且此庫利 用以純化GDNF所得之胺基酸序列為底之簡併的寡核苷 酸序列探針予以篩選。決定出可與探針雜交之cDNA純 条，利用DNA定序，其含有簡併寡核苷酸探針中所用序 ^纸張尺度適用中國团家樣準（CNS) T 4规格（210X 297公釐） 請 先 聞 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 窵 本 裝 订 鳗濟部中兴樣準>«貝工消#合作杜<!·« S6r 81.9.25,000 A6 B6 401422 五、發明説明¢5 ) 列而言3'端之DNA序列，其编碼存在於GDNF中之 肢基酸序列，及位胺基酸序列羧基末端之序列，而此乃篩 遘寡核苷酸探針所憑據處。 Β49细胞株之培餐條件，於上實例1中已詳述。於 裂備RNA時，細胞在含血淸之培餐中生長至幾近匯合程 度，於無血淸之培養基中洗一次（DMEM),並於 DMΕΜ中生長4天，其中毎2天更換培養基。之後回收 细胞，以 ChoBQzynski 及 Sacchi 1981，Analytionl Biochemistry 162:156-159之方法宰取全部的RNA。聚 腺苷化RNA自此结RNA中之製備像經過alUodT纖維 素親和力管柱，如Maniatis et al. 1989 Molecular Cloning 2nd Edition，.CSH Press所述。 依據製造商之策略，利用M — M L V RNase Η ·逆 轉錄酶（BRL，Gcaithersburg，MD)進行 cDNA之合 + 成。第一股反應以oligo dT15引字（Pharmecia )開始，且 也包括每5撖克P〇lgA< RNA8單位的RNasin (Promega，Madison，WI)。第二股合成則由大腸桿菌 DNA聚合酶I,大腸捍菌RNaseH,及大腸捍菌 DNA連接酶（均得自BRL)依製造商指示開始。為有 助於選殖，cDNA以T4DNA聚合酶（BRL)處理 使産生很多端，並以EcoRI甲基化酶（BRL)甲基 化之。道些步驟之進行依據酵素廠商之指示進行。 cDNA再以一倍髖積之1:1酚及氣仿株混合物萃取二 次，且水相以1/2體積之7. 5M NH^Ac及3倍 t纸張尺度適用中國國家揉準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）
請 先 Η 讀 背 m 之 注 意 事 項 再 填 % 本 1C 装 訂 龌濟部中央樣準房ΛΧ消费合作杜<p製 81.9.25,000 5^· 401422 A6 B6 經濟部中夹樣準爲霣工消t合作杜印製 五、發明説明怀） . «稹之乙酵在室溫下沈澱。沈澱物之回收利用室溫下 16, 00Oxg離心15分，以70%乙醇洗，真空乾 燥，再 «浮於 5Ό 撖升、50mM Tris-HCi? (pH 7 . 6 ) , 1 6 m M MgCJ?2、lmM ATP、 1 m M DTT、5%PEG 8000 中，含有500 撤撖莫耳磯醯化之連接子（CCCGAATTCGGG, Pharmacia) ( S E Q ID N0:9)及 3 單位的 T , DNA連接酶（BRL)。連接子之連接於16t! 下進行一夜（約1 6小時）。反應混合物以酚/氛仿萃取 ，再如上述般沈澱。洗過之團塊乾燥，並再懸浮於5◦微 升EcoRI水解缓衝溶液中（1 〇 〇 m M Tris—HCi ( ρ Η 7 . 5 ) , 5 m M MgC^a, 50mM NaCi? ，及0. 025%之通X—100),此中己加入400 單位的 E C O R I (New England Biolabs，Beverly， MA)。反應在37t!下培育2小時。沈澱後（如上）圃塊 再懸浮於E c o R I水解缓衝溶液中，並如上述進行第二 循琛的EcoRI水解。這些反應沈澱，並再懸浮於4 0 微升 1 0 m M Tris-HCi ( 8 · 0 ) ，1 m M EDTA ,1 0 0 m Μ N a C又中。此c D N A目前已含有經 E c 〇 R I水解之連接子，以離心經由Sephacryl- S-300 (Pharmacia)自旋管柱，在約1 l〇〇g下5分鐘進行大 小之分级分離。收集流過夜，如上述乙酵沈澱之，並再懸 浮於 10mM Tris-HCJMpH8. 0) , lmM EDTA中，使濃度為約〇.1微克/微升。 請 λ 聞 讀 背 焉 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 訂 η 本紙張尺度適用中國团家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,00 A6 B6 五、發明説明$7 ) 於 λ Z a p I I (Stratagene，La Jolla，CA)遘残 載髏中構築cDNA庫β通常，1撖克經EcoRI水解 且磷酸酶化之載匾臂（購自Stratagene)與0. 1撖克接 有EcoRI連接子之cDNA,於5微升建接作用中連 接，利用約3Weiss單位的T4DNA連接酶（NEB) •於 50mM, Tris-HC 芡（7. 6) , 7mM M g C ^ 3 , 1 m M DTT, 5%PEG8000及 1 m M ATP中。連接反應在161C下進行一夜。連接反 應包裝在Gipapack II Gold包裝萃取物中（購_Stratag-ene ),依廠商之策略進行。基因庫塗佈以定效價，並於 由81^1&“1^所提供之乂乙1一藍宿主中篩選之。 由此連接及包裝下，在共12値，150¾米直徑之 培餐皿中約可塗佈出270, 000値嗟薗斑形成單位。 依據Maniatis等人之步驟，自逭些培養盤中可製備二份硝 化纗維濾膜掀片。濾膜與下列經33P標記之簡併寡核砮酸 (S E Q ID N 0 : 7)雜交（I =肌胺酸）：
>CC I GATAAACAAGC I GC I GC>3 ^ C G G 此序列偽依據上實例1所得之純GDNF胺基末端（SE Q ID NO: 10)四週之序列而來：
Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala 本纸張尺度適用中Η國家揉準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐> 請 Μ 讀 背 之 注 意 事 項 再 寫 本 Γ 装 訂 鱷濟部中央樣準爲貝工消#合作杜<p« 81.9.25,000 401422 A6 B6 缓濟部中央檩準渴員工消费合作杜印* 五、發明説明种） 寡核甘酸樣以衍自 32P — ATP (A^ersha· , Arlighto-fi Heights , IL)之 32P , 利用 T 4聚核苷酸激酶 （ phar 重-acia或United States Biochemical, Cleveland， 0H)o 雜交反應於6XSSPE, 0. 1% SDS, 0· 1亮 克/¾ 升 t RNA(S I GNA, 31几〇1^3,1!«0)及2乂登 哈氏試劑（各0· 4毫克/毫升的ficoll,聚乙烯吡咯啶 ，BSA V部份）中，以50t：進行一夜（約16小時 )。雜交溶液中每毫升含2_3x 1 0tfc pm之經檫記 的寡物。雜交後，濾膜於室溫下，以2XSSPE, 0 · 1 % S D S洗二次，及相同溶液但預熱至5 0 TC洗二 次。令濂膜風乾，並在一70C下利用加強板曝光底片7 天。 檢査已展開之底H,以鑑定可與篩選寡核μ酸雜交之 噬菌斑。於此初步篩選中，可鑑定出24推想的雙重隈性 者。切出相當於陽性訊號之基因庫塗佈區，再懸浮並再塗 佈，以經由上述之雜交步驟進行第二回的篩選。於此第二 次篩選中，原先24掴中有8傾再測試呈隈性，16傾則 呈陰性结果。這8傾陽性，經1或2次額外的雜交予以噬 醏斑純化，此中6値接下來以DNΑ定序來分析，以決定 其是否含有可纗碼GDNF之DNA序列。 AZap I I噬菌體之噬菌質饈部份，其含有經蓮殖 之嵌入子，稱為pBluescript SK-。自毎僑λ Z a p I I 重組細胞中切出pBluescript SK-噬菌質體，其傈可與寡 請 先 Η 讀 背 由 之 注 意 事 項 再 填 窵 本 Ι^Ν 裝 訂 ：纸張尺廋適用中國國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 -60- A6 B6 五、發明説明印） 核苷酸探針雜交者。自λ/Za pi I載體中活體内切出重 组细胞pBluescript SK-質髖之步思，詳述於廠商指示中 。簡言之，AZapI I及M13·輔助·噬菌髖之共感 染，可造成重组SpBluescript 2單股DNA套數在感染 性Ml 3病毒粒子内之包裝。當此一病赛粒子感染敏感性 细胞，則單股DNA句轉化成雙股DNA,且如質體般垂 直增殖。對此事件之選擇，可由PB1 uescr i pt SK- 上所编 碼的氛苄青徽素抗性基因提供。因此，含有★救援的〃重 組饅pBluescript SK-質饅（來自8傾陽性AZapII 純条）之大腸捍菌KL1 - Blue衍生物，依據 St ra ta^en-e所述之策略，可容易地得到8®陽性的AZap I I纯 条，並且應用與AZa p I I載體一起提供之_輔助〃 噬菌體。 於DNA定序時，自逭些重组質體中6镝製備雙股質 髏 D N A，依據 Birnboiu 及 D〇ilyl979 NAR 7 :1 5 1 3 - 1 5 2 3之'^撖量製備〃步驟，利用二去氧 鰱終结反應所進行之DNA定序反應，以其為模板及筛選 寡物為引子。定序用之試劑得自United States Biochemical ， 呈套组 （ Sequenase Vers ion 2 · 0 )，.且依廠 商提供之策略進行定序步驟。其中一純糸衍自纯条 λΖ&ρΙΙ76· 1 命名為 pBiuescript SK-7 6 · 1 •有以下的序列（SEQ ID N 0 ： 1 1 ): 5* > GAG AGG AAC CGG CAA GCT GCA GCT GCC AGC GCA > 3'
T AA ΤΑ T A T 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）
請 先 Η 讀 背 藥 之 注 意 事 項 * % 本 1C 裝 訂 缓濟郜中喪樣箏爲霣工消费舍作杜卹褽 81.9.25,000 401422 A6 B6 五、發明説明¢0 ) 此序列可轉譯成以下胺基酸序列（SEQ ID NO: 1 2 )
Glu-Arg-Asn-Arg-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-Ser-Pro 此符合GDNF胺基末端區之胺基酸序列，始於距用來産 生篩選寡物/定序引子之胺基酸序列末基末端第5值胺基 酸殘基。此結果明示出，含於AZap I 176. 1中之 c DNA純条一定编碼純化自B49细胞諝適培養基之部 份或全部的GDNF蛋白質。 請 先· « 讀 背 夤 之 注 意 事 項 再 瑱 寫 本 裝 龌濟部中夹*準屬霣工滴#合作杜印« B . cDNA 紳奂 λ7. ai)II76. 1 句.袄有 GDNF 结磘序列之厲城内的核g酴庠列 決定cDNA純条5〜端前877驗基對之核苷酸序 列。孽呈此孱含有一但7値胺基酸之跟放讀譯架播( OR F),其包括得自純GDNF胺基末端的咳_基麝存到 ,以及符合由純GDNF麻離衍生之内部肽之序列。預測 此ORF所具有的羧基末端傾胺基酸，含有純的成熟 GDNF蛋白質所預測之胺基酸序列。前頭93俚胺基酸 包括一涫在的起始ATG密碼子，之後是想像的分泌訊 號序列，及含有潛在的蛋白水解處理修飾位置，以供前軀 體或蛋白質之*前原#型解雄，以産生如上文實例1所述 之成熟且純化型式之GDNF^ 定序反應中之棋板D N A包括質藤pBluescript SK- 訂 Η 本紙張尺度遗用中國酹家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐〉 MC» 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明¢1 ) 76. 1DNA之單股及雙股販本。雙股DNA製備自 XL1— Blue 培餐物（pBluescriptSK-76· 1)利用 •煮沸製備 #步想遽成（Anel, Bioche· · 114:193-97) 且於Cs c 1密度梯度上成帑。單股模板之産生，傜以廠 商（Stratapane )所供應之”輔助"Ml 3噬鯖體感 染於 XL1— Blue 中而産生（pBluescriptSK-7 6. 1 ),利用與噬菌體一起之相開策略進行cMAppliedBio-syste· ( Foster City »CA)DNA 合成儀（3 8 0 A 機型）上合成長15至23個核苷酸之單股寡核苷酸引子 ，且通常勿需純化。利用二去氧鐽反應進行序列之決定。 所使用之試劑包括在Sequenase Version 2 . .0套组中（ United States Biochemical)，且依廠商指示進行。 cDNA純糸 XZapII76. 1 5'端前 877但核苷酸之序列，其中含有純且成熟GDNF蛋白 質之編碼序列，示於圖13中（SEQ ID N 0 ： 3 )並配合所指的6 8 1鹸基對開放謓譯架構之胺基酸序列 ，其你見於此序列中。相會於純且成熟GDNF之序列始 於第2 8 1位置之弱胺酸殘基，且示於圖14中（SEQ ID NO : 4)。於區所得之DNA序列可預_一段 胺基酸序列，其完金符合於純GDNF胺基末端所見胺基 酸序列的前23悃殘基（見實例1)。 依據圓13基因之分析，似乎GDNF先轉譯成前原 型GDNF多肽，且訊號肽及此分子*原〃部份之蛋白水 解條株造成纯化自B49細胞諝適培養基之GDNF型式 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 請 先 閱 * 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 訂 齷濟部中喪*竿廣貝工消费合作杜<|»轚 81.9.25,00 mMS2 A6 B6 繞濟部中央襟準场Λ工消费含作杜印製 五、發明説明62 ) 的産生。對此前原型而言，最可能的轉譯起點在ATG密 碼子，其位於圖1 3序列的第50位置上（SEQ ID Ν Ο ： 3 ) 〇 C.釐殖绾磘額甚闵 許多神經營養因子之胺基酸序列，在各種晡乳動物種 類間具高度保留性（Hallbook，et al. 1991 Nearon 6: 845-858; McDonald，et al , 1991 BBA (SEP 中）） 。由於胺基酸序列之保留性，因此對编碼這些蛋白質之基 因而言，其核苷酸序列也有相當的保留性。因此，於一晡 乳動物種類中编碼神經營養因子之基因，可輿在另一哺乳 動物種類中编碼該因子之基因，在適當的回冷條件下交叉 雜交（即形成穩定的雙股DNA雜交釀），此常是真的。 此待性可用來鑑定，所滢殖之人類DNAM段中包括有 G D N F之基因。 構築在載醱AF I X I I中之人類基因體庫可購自 Stratagene (批號林946203),且利用實例2B所 述，衍生 G D N F 大鼠 c D Ν A 純条（pBluescript SK-76. 1)之經32P—檫記之探針來篩選。探針含有來自 成熟GDNF之約250bp之編碼序列，傈利用聚合酶 鏈反應之梅異擴大作用（Saiki et al. 1985，Science 230: 1350),且其産製如下。進行50微升或100撤 升之PCR反應，利用1毫撤克以下之AZapI I 76. 1DNA為模板，且二但寡核苷酸引子各10 — 請 it. BQ 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 訂 Η 紙張尺度遑用中团Β家揉準（CNS>甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 A6 B6 五、發明說明¢3 )
20微撤某耳，其傜由大鼠GDNF之序列為底。一寡物 為上實例2A中所述之*篩S寡物"（也稱為DHD_ 21)，而第二寡物（DHD — 26) ( S E Q ID Μ Ο : 1 3)具以下序列： 51 > AAATTTTTIAAIATTTTATC > 3·
GG C G C G 其你以GDNF解離之内部肽産物（見實例1)所得之胺 基酸序列（Asp — Lys — I le - Leu — Lys — Asn — Leu) ( S E Q ID NO:14)底的。 反應於 lOmM Tris-HCJ? ( pH 8 . 3,25¾) 5〇mM K C i? , 1 . 5 m M 10 撖克 / 毫升 B S A ( Promega R3961)各 0 . 2 m M dNTPs (Pharmacia)中進行，利用 2. 5-5 單位 之聚合酶（USB) D反應包括30傾循環的：95t：, 1分鐘；4 4*0, 1/2分鐘；及72t：l又1/2分鐘 。此反應産物以瓊脂糖凝鰺電泳觀察約為2 5 0 b P ,此 和匯1 3中所示c DNA序列的二傾引子位置符合。此未 經標記之片段自凝膠中溶離，像依廠商指示，以ultrafr-ee — MC遇濾單位雄心而得，且充作接績PC R檫記反應 中之棋板，其中應用相同的二傾寡物引子。造些反應在相 同條件下進行，除了冷dcTP濃度減少至12. 5//M ，且加入2. 5wM3000—5000居里/毫某耳的 α — 32PdcTP ( Aajersha·)。檩記反應之産物通過 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS>甲4规格（210 X 297公釐） 請 Η 讀 背 由 之 注 意 事 項 再 填 % 本 r 裝 訂 缓濟_中央樣準爲興工消费合作杜_袋 81.9.25,000 65* 401432 A6 B6 *濟部中央镖準屬霣工消费合作杜印装 五、發明説明¢4 ) Biospin6 自旋管柱（BioRad，Rich^ond.CA)。經此管柱 之流出液充作探針，以篩選人類基因龌库。 基因庫利用31；^1&86116提供之大腸桿菌？1^仄17予 以塗佈。製備24镝150毫米培養盤，其中含大約 50, ◦00値噬薗斑。自各皿中依上文Maniatis等人所 述之步驟，製成二份硝化纖濾膜掀片。此48值濾膜以上 述250xl0·6cpm之PCR探針探測（以0.5N NaOH處理以變性），於250毫升的6XSSPE, 0.1%SDS, 2X登哈氏試剤，0·1¾克/毫升 tRNA及30%甲醛胺（USB),以42TC作用一夜 (約16小時）。濾膜再於室溫下以250¾升2χ SSPE, 0· 1%SDS 洗二次，在 50TC 下以 1. 6 升0. 1XSSPE, 0. 1%SDS洗二次。令濾膜置 下乾燥，並置底片下，在加強片存在下於一 7 0 t：中曝光 6天。底片展門並計分。可觀察到6値強的二次陽性株。 基因庫塗佈之區域相當於所切出之陽性訊號，將之再懸浮 ，且再經由詳細雜交步驟，再塗佈以第二回的篩選。6值 再搜(試仍呈陽性，且經塗佈及雜交之額外循琛可以採噬菌 純化法得到。 對精藹者而言，繼代選殖並定出可與探針雜交區 DNA片段序列是例常的操作工作，因此可決定人類GD NF基因的全部或部份序列。若在逭些純条中若無法代表 完整的人類GDNF基因，則常是沿著基因髖> 行走"並 遘殖此區周圔重疊的DNAH段，以獲得並定序出基因任 請 先 « 讀 背 由 之 注 意 事 項 * 省 寫 本 i t i r Μ *纸張尺度適用中困國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）
VU 81.9.25,000 A6 B6 轚濟部中喪標準爲貝工消t合作杜印轚 五、發明説明（6马 何剩餘部份。 可應用上述步驟及精藉者淺而易見之各種其他步篇來 篩遘其他的人類基因庫。如利用上述的探針及雑交之策略 ，可旆遘人類cDNA庫，其你由人類被殼中所萃取之 A* RNA所構築的。此含於選殖載體AgtlO中之 基因庠，購自 Clontech (Palo Alto，C A )(貨號 L1092a,批號#1561)。此基因庫塗佈在（約 2 5 0, 0 0 0 噬菌斑）大腸桿餺 LE 3 9 2 (Maniatis et al ,上文），密度為毎盤約20, 000镝噬菌斑， 且在上述條件下雜交篩選。雜交後，濾膜在室溫下以〇. 2xSSPE, 0. 1%SDS 中洗2次，及0. lxS SPE, 0· 1%SDS,預熱至50t!下洗二次。濾膜 於室溫下風乾，並曝於底Η下。經加強膜在7 Ot：下曝光 3天後，展開底片並鑑定出8個重覆陽性者。 以大鼠GDNF探針雜交鑑定出人類基因髏庫中6值 IF IX I I純糸，並以噬菌斑純化方式便呈均質（見上 )。以Sambrook等人之方法（Moleonlar Cloning:A Labooatory Manual ; 1 9 8 9 )製備各噬餹玀之溶菌産 物。以下列步驟自谊些純糸中製備DNA : DNa s e I (Pharmacia)及 RNase A (Sigma)加至 5 毫升各培 餐物中，使終濃度為1微克/毫升。溶液在37C下培育 1小時。之後加入5毫升2 0%聚乙二酵（Sig^a) , 2 M NaCi,且溶液在0*0下培吉1小時。λ噬菌讎以 12， OOOxs離心10分鐘使呈囫塊。睡菌髖國塊再 請 先 Μ 讀 背 由 之 注 意 事 項 再 填 窵 本 Γ 装 訂 Λ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -67 - 81.9.25,000 401422 A6 B6 經濟部中央*準爲貝工消费合作杜印製 五、發明説明（ 想浮於2 5 0撇升T F ( 1 0 mM TRIS, pH 7. 4, lmMEDTA),之後依序以等量的下列溶液 萃取：a_氦仿；b—酚；c一1:1的氰仿及酚混合钧 及d—氰仿。加入醋酸銨使終濃度為Ο. 25M,且加2 倍醯積乙醇以沈澱DNA,再以1 0, 000g離心。D NA圍塊懋浮於TE中。 得自六傾λ分離物中之各DNA以各種限制酶水解， 且片段經璜脂耱凝膠電泳（Sambrook et al)分離。 DNA片段轉移至二值相同的耐鑰膜上（ Schleicher an-d Schuell)並與來自大鼠GDNF之經放射標記的探 針雜交。於大鼠GDNF中在356,及357核眘酸間 有一値EcoRI位置（依循鼸13中之纗《)。此可解 離成熟GDNF之鏞碼序列。為了決定人類基因臁 GDNF純条是苔在同質位置上有解離位，則以 E c o R I充作限制酶之一以水解人類純条。針對大鼠 GDNF中EcoRI上游（1號探針）或下游（2號探 針）之基因區製成持異放射檫記之探針。1號探針針長 268bp,且含有4bp的大鼠GDNF5Z未轉嫌序 列，及254bp的编碼序列（胺基酸1至8 5)。其裂 備傈利用聚合酶餺反應擴大AZapII76· 1DNA ,及採用寡核苷酸引子PD1 (GACGGGACTCT AAGATG) ( S E Q ID N0:15)及 DHD 23 (GCIGCIGC (C/T) TG (T/C) TT (A / G ) T C I G G ) ( S E Q ID NO： 16) {請先n讀背*之注意事項再填寫本一 t
T % 本紙張尺度適用中困Η家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） -68 _ 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明（6乃 。裂備探針之反應條件如上述，除了反應包括30値循琢 的下列：95*C, 1分艟，50t!l又1/2分及7 2Ό 1又1/2分。2號探針長195bp,且含有17«核 苷酸的大鼠GDNF3/未轉譯序列，及178bp之纗 碼序列（胺基酸153至2 1 1)。其製備利用聚合酶鍵 反應，及寡核眘酸引子LF2 (CGAGACAATGT ACGACA) ( S E Q ID N0:17)&PD2 (CTCTGGAGCCAGGGTCA) ( S E Q ID 1^0:18),而且以人乙珏？1176.1充作 DNA棋板。反應條件和1號探針的相同。 6傭λ純条中有5個可得相同的雑交型式。1號探針 與約7 0 O b ρ之E c 〇 R I Μ段雜交，且2號探針輿約 2. 8kb的Ec oR I 片段雑交。由二探針輿二籲不 同的EcoRI DNAH段雜交之事實可強烈推測，人 類GDNF基因含有一櫥均質的EcoRI位置。700 bp及1. 8bp的EcoRlH段分別瀵代遘殖至 Bluescript SK- (Straiegene)中。如實例 2 B 中所述地 決定此二片段的核苷酸序列。這些DNA片段之序列示於 BI19中（SEQ ID N0:5)。由序列可淸楚.， 在前原GDNF第52位肢基酸前有一傾不表現子。在指 導合成成熟人類GDNF之基因部份中並無不表現子。所 預澜的成熟人類GDNF胺基酸序列，與成熟的大霣 GDNF有93%的同質性。此和大S及人類蛋白質於其 他神經營餐因子間所見之胺基酸序列同質性大約有相同的 請 先 BQ 讀 背 * 之 注 意 事 項 再 填 % 本 裝 訂 緩濟«中央樣準為貝工消费合作社印« 本紙張尺度適用中Η团家櫺準（CNS>甲4规格（210 X 297公釐） -69 - 81.9.25,000 40142?
經濟部中央標準局員工消費合作社印聚 五、發明説明（es ) 程度（大鼠及人類CNTF間胺基酸同質性爲8 3% ; McDonald et al，B+BA(1991)(付印中）。大與及人類 NGF間之胺基酸序列同質性爲9 5% , BDNF是 1 0 0% ，且NT-3是 1 0 0%;Hailbook et al，1991 Neuron 6 : 8 4.5 — 8 5 5 )。 爲得完全的人類前原型GDNF序列，可依據已得之 人類GDNF序列製成經放射標記之雜交探針，且該探針 可用以篩選人類c DNA庫•由於c DNA是經修飾 mRN A之套數，故無不表現子且可得完全編碼序列。此 外，目前已知相當於編碼序列之不表現子位置，且大鼠 c D N A純系中可製得與不表現子上游序列特異之雜交探 針，且以此來篩選含有5 /表現子純系之基因庫。 P·編碼人類前原型.GDNF前1 5 0個胺某酸之核益醅 序列 如圖2 C的詳述的*有一個不表現子可分割相當於人 類前原—GDNF第5 1胺基酸之核苷酸序列•爲了得到 此分子部份之序列，以衍自大鼠前原GDNF胺基末端編 碼序列之探針來篩選人類基因體庫，且一個雜交純系被定 序且示出含有人類前原GDNF 1至5 0個胺基酸之編碼 序列，如圖22所示（SEQ ID NO ： 8 ) » 爲了篩選基因庫，如實例2 C所述地合成一個P C R 探針•所應用之寡核苷酸引子爲： 本紙張尺度適用+國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ----------裝------訂-------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 70 A6 B6 五、發明説明矽） PD1 = 5* > CCCGAATTCGACGGGACTCTAAGATG > 37 (SEQ ID NO:19) LFA = 5/ > CGGTGGCCGAGGGAGTGGTCTTC > 3· (SEQ ID NO:20) PCR之反應條件（無放射性及32P —榡記者）如實例2 B所述，除了反應包括25或30值下列循琛：95*01 分鏡，50t!, 1又1/2分，及72*C, 1分鐘。此反 應産物含有大鼠前原一 GDNF编碼序列前1 22 bp, 及推想的起始子ATG5<端144bp (見圖13及 S E Q ID NO:3)。以此探針筛選人類基因摩之 條件如實例2C所述。用來鐽定攜有成熟人類GDNF序 列之純你之相同濾膜掀H,以加熱至沸騰之去離子蒸皤水 洗15分，2次，探測一夜，再依實例2C之策略洗鲦。 濾膜曝光於底片上，一 7 ου及加溫膜下歴3天。於展開 時，可觀察到不同強度的許多一重覆陽性者。挑出12俚 相當強陽性者，其中10值以相繼的篩選條件之雜交循環 而予以噬菌斑純化之。 造些重组噬菌體的經選殖DNA,以南方吸漬雜交分 析之。可發現一傾約1 000b ρ之A 1 u I Η段可與篩 S探針雜，交且繼代遘殖至經SmaI—水解之 pBluescript SK-中，以産生 p B S S K — λ 3A 1 u I 〇 此經選殖的A 1 u I Η段進一步繼代選殖以促進相鼸 D Ν Α片段之定序。經純化的 pBSSK-A3AluIDNA以一糸列只解離載醱一 次之限制酶水解（於聚連接子區内），且水解産物以理脂 請 先· Η * 背 西 之 注 意 事 項 再 瑱 寫 本 裝 訂 «濟部中兴樣準局員工消费合作杜印製 表紙張尺度適用中团思家樣準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 A6 B6 經濟部中央標準屬霣工消#合作杜<p製 五、發明説明（70 ) 糖凝膠霣泳分析。因此可鑑定出在所選殖DNA内只解離 一次的二値限制酶（Pst I及Sac I I)。圔22示 出San I I及Ps t I位置之輿圏。南方吸漬顯示，可 與篩選探針雜化之經選殖匾將位在所選殖之A 1 u I片段 的Sac I I及Pst I位置之間。因此於定時，構築 PBSSK—λ3Α1uI二傾黼除作用衍生物。於一例 中，小的（約300bp) Pst I片段蜊除如下：（質 體以Ps t I水解，且水解物連接再轉形至大賜桿菌中。 篩選轉形細胞，是否缺乏小的P s t I Μ段。為對比而言 ,300bpSaclH 段自 pBSSK — λ3Α1ιιΙ 中類似地刪除，以産生一侮第二刪除作用衍生物。以此二 値刪除質體充作棋板應用於定序反應中。如實例2Β所述 地進行定序。 圖22(SEQ ID NO:8)示出如此獲得的 233b p序列。此序列含有1 5 1 b p區域，其與大鼠 前原一 GDNF的前15 1 b p之编碼序列大極高度同質 性；胺基酸水平有8 8 %同一性，DNA水平為95%。 因此，可結論道，此區傜部份的表現子，其攜有人類前原 一GDNF胺基末端50値殘基之编碼序列，及第51位 密碼子的第一嫡核苷酸。鄰接此1 5 1 b p序列3 *端之 序列，與哺乳動不表現子5 /端之一致序列同質〔Shapi-jro and Senapathy 1987 , Nucl. Acids Res. 15:7155-7174〕。鄰接假想的起始子A T G 5 /螨之序列與2 8 bp之大鼠序列有強烈同質性；28佃殘基中有27傾相 請 先- 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 訂 Η ^紙張尺度適用中國团家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） ft 81.9*25,000 401422 A6 B6 五、發明説明pi ) 同。於此點，上游序列鮮明地分出。在分岐點四遇之序列 舆哺乳動物不表現子3/端之一致序列有相當多的同質性 (Shapiro and Senapathy·上文）。因此，此似乎是一 值分剌位置，雖然對此並無直接旣據。含有人類前原一 GDNF之開放謓譯架構，伸展至起始子AT G上游至少 27b p。於上較佳具體實例詳細説明之討論中，其他型 式的前縻一GDNF也可能産生，其中可含有額外的上游 胺基酸。這些型式也可能轾過修飾，以産生已被純化及定 序之成熟的GDNF分子（見實例1)。 此處及實例2C所示之核苷酸序列，含有人類前原型 —GDNF完全的编碼序列，其與大鼠前原一GDNF有 極高同質性，而後者已可成功地於哺乳動物細胞中表現（ 見實例5)以産生具活性之大鼠GDNF。 奮例.3 : GDNF避免實驗性巴金森氏病徴候群之用法 此實例描述由神經毒素MPTP (1—甲基一4一苯 基一1, 2, 3, 6—四氩一吡啶，適當投予至動物，以 造成猴子實驗性巴金森氏病徴候群之方法。也描述投予 GDNF至動物中（已曝於MPTP下），而舒缓巴金森 氏徴候群於動物中發展之方法。 A.宑铒MPTP處理诰成奮驗袢R金淼庄榭候群^梅芊 中k予G D N F。将一值不锈銷導管植入右測心室，並連 至皮下植入之等滲小泵中（Alzet 2002)。小泵中含有各 先. 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 % 本 裝 訂 嫌濟部中央樣準爲貝工消费含作杜«P髮 本纸張尺度適用中國國家«準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） ~Ύττ 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明界） 種濃度的GDNF,或充作陰性對照组的其稀稼爾。泵可 毎小時遞送0. 5撤升，共歴14天。植入導管一泵2天 後•猴子（Cebus apella)接受0· 6毫克/公斤的MP TP注射至右頸動脈。距最初植入後6週，動物灌流以食 埴水，且快速移去腦子。腦於冰上分割，且組織束自尾核 及被殼中移去。黑質置於固定液中。尾核一被殼组雄以Η PLC—EC紛析多巴胺，處理黑質以進行酪胺酸羥化酶 (T Η)免疫活性分析。 B . G D N F之效力。黑霣多巴胺能神經細胞及其軸 索突出至尾核/被殼之變性，可在此猴子模式中迪成實驗 性巴金森氏徴候群。此中有許多實驗性，卽GDNF可避 免或減低此神經元變性之嚴重性。如，GDNF可避免黑 質中TU隈性神經細胞睡之喪失。此顯示，GDNF可免 去黑質多巴胺能神經細胞髖ΜΡΤΡ之毒性作用。 GDNF也可免去避免尾核/被殼中TU陽性雄維之喪失 此顯示GDNF可免去黑質多巴胺能神經元之軸索突出受 ΜΡΤΡ之毒性作用。GDNF也可避免尾核/被殼中多 巴胺含量之喪失。此顯示GDNF可免去自黑質多巴胺能 神經元至尾核/被殼之軸索及其多巴胺含董受ΜPTP之 毒性作用。 奮例4:GDNF之生物沃袢及港ff的瞄庄谪鼴症 在加豐的及明確含量培餐基中，純化的GDNF經由 胚胎中腦神經細胞培餐中之多巴胺能神經元可增加多巴胺 本紙張尺度適用中团团家«準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 請 先 PQ 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 装 訂 嫌濟部中夹標芈爲員工消#含作杜印* 81.9.25,000 401422 A6 B6 嫌濟部中央樣準屌霣工消费合作社印製 五、發明説明㈧） 之攝入，如實例1中所示。此顯示，GDNF是這些多巴 胺能神經細胞《之神經營養因子。如此可証知GDNF可 用於治療發生於巴金森氏病中這些神經元之變性。此外， 也証知GDNF可用於治療其他腦多巴胺能神經元之不適 切功能。此種不適切之功能可發生在精神***症及其他需 以安鎮痛蕖治療之失調症。 A.紳化的GDNFWT促淮惊蕃中副夺應及交感神猓细朐 ：>存活 1.神铒；存活乏分析： 材料 3 —〔4·, 5 — 二甲基睡唑 _2 — 基）一 2, 5 —二 苯基四化溴（MTT)得自 Sigma Chemical Co· , St .Lo-uis»Missouri。胚牛血清購自 Hyclone Laboratories , Logan，Utah。培餐基及堪溶液得自 Iruine Scientific， Santa Ana，California。培餐皿得自 Coatar，Cambridg-e，Massachusetts。實用级之無熱原，有繁殖力之雞胚卵 得自Spafas， Roanoke, Illinois。 分析 如前所述（Collins 1978 Develop. Biol. 65:50; Manthorpe et a 1· 1986 Develop ， Brain Res·25：191) 製備初生雞胚睫狀神經節及交感神經鏈神經節之培養。簡 言之，自能育之無熱原雞蛋中移出睫狀或交感神經，其已 书——— 請 先· 繭 讀 背 m 之 注 意 事 項 再 填 寫 本1^ 装 訂 t紙張尺度適用中和國家揉準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 4014Z2 A6 B6 畿濟#中夹*準爲霣工消费合作杜印装 五、發明説明（7今 先分別在38t!之潮湄大氣下培育8及1 0天。神經節化 學分離，你先曝於漠克氏平衡埴溶液，無二價隈離子，含 有10mM HEPES緩衝溶液，ρΗ7·2中，37 t：, 10分鐘，之後曝於0. 125%細鏞胰蛋白酶1: 2 5 0於漢克氏平衡埴溶液之溶液中（如上述修飾）， 37t!下1 2分鐘。加胚牛血淸至1 0%終濃度以停止胰 蛋白化作用。 經遇此處理後，神經節轉移至由Dulbecco's高葡萄糖 經修飾伊耳格氏培養基组成之溶液中，其中無硪酸氫埴， 但含1 0 %胚牛血淸及1 0mM HEPES, pH 7. 2,並以玻逋巴斯德吸量管搗碎約10次以機制地分 離，此管之两口己用火磨光，並限制至某一直經便充熵吸 量管須費2秒鐘。 經分離之神經節再塗佈於100毫米直徑组雄培餐血 2中之培餐基内（DulbeCC〇’s經修飾伊耳格培養基，添加 10 %胚牛血淸，4mM毅胺酸，6 0毫克/升青徽素一 G , 2 5 m M HEPES, pH7. 2)(毎镛培餐皿 有40傾分離的神經節）歷3小時。進行此預塗佈以分出 非神經元細胞（其可粘附至皿中）及神經細胞（其不會粘附） 。3小時後，未粘附之神經细胞以離心收集，再懸浮於组 雄培餐基中，並塗佈至96孔洞徵滴定组織培養盤一半匾 域，其中毎孔洞50微升，且塗佈之密度為毎孔洞 1500镲神經細胞。撖滴定孔洞先前已曝於1毫克/毫 升聚馬胺酸於1 OmM硼酸納，pH8.4之溶液， 請 « 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本16 裝 訂 本纸張尺度適用中國國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297««〉 81.9.25,000 401422 A6 B6 鱷濟部中央«準屬員工消费合作杜印製 五、發明説明？5 ) 4*C下一夜，以蒸皤水洗滌再風乾。 欲進行神經營養活性分析之樣品，經連绩稀釋後取 10撤升加至各孔洞中，且皿在含有7. 5%C0 2之潮 湄大氣中，以37*0培育20小時。經過睫狀神經節（8 小時，交感神經節40小時後，於毎孔洞加入15撖升的 1. 5毫克/毫升四銼染料MTT於1)11〗1^〇<?〇、高葡萄糖 經修飾之伊耳格培養基（無碩酸氫塢有1 OmM HEPES, pH7. 2)之溶液，且培餐物置37t：之 培育箱中4小時。之後，加入7 5微升，6 . 7毫升的 1 2 M HCi/升異丙酵之溶液，且各孔洞之内容物搗 碎30次以打破細胞並懸浮染料。利用自動化撤滴定盤計 讀器（Dynatech，Chantilly，Virginia)決定各孔洞相 對於6 9 0毫米參考值之5 7 0毫微米吸出度。未接受任 何神經營餐因子劑孔洞之吸光度（陰性對照组）自含有樣 品孔洞的吸光度中減去。所得之吸光度和各孔洞之活细胞 數呈比例，明確表示神經細胞可減低染料。將神經營養活 性之營餐單位定義為可生成神經細胞最大存活50%所需 之稀釋倍數之倒數。營餐單位除以樣品中蛋白質含置可決 定出比活性。 如圓15中所説明的，纯的GDNF可促進雞胚睫狀 神經節中劑交感神經細胞培餐之存活。如圃16所説明的 ,純化的GDNF也可促進雞胚交感神經鏈神經中交感神 卜紙張尺度適用中团Β家樣準（CNS)甲4规格（210X 297公釐） 开 81.9.25,000 請 先 Μ 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 装 訂 A6 B6 五、發明説明(76 ) 經细胞培養之存活。 造些结果顯示，GDNF作用如副交感及交感神垤元 之存活因子。如此，其可用於治療各種可自主（邸副交感 及交感）神經条统有危害之神經傷害型式。此種傷害可由 代謝狀況所致，如糖尿病或腎官能失調。此種傷害也可來 自各種化學治療劑對病人之治療，如癌症化學治療劑如顒 氡氨鉑及長春新鹺，或AIDS化學治療劑，dd I及 ddC。此種傷害也可因遣傅疾病所致，如自主功能障礙 。此種傷害也可來自外傷。 窗例FS :里细艚Π Π N F於動物细朐中：> 砉琨 A.嫌链重细暫艚以為COS細朐衷現 含有完整GDNF编碼序列的約1. 5kb pBluescinpt SK-76.1之Sma I片段，繼代選殖至質髏載 賭 p S G 5 中（Green et al· 1988 Mucl· Acids. Res. 1 6 : 369),其經過設計可在表現SV40T抗原之 細胞中（如COS細胞）暫時表現所選殖之基因。 由 GDNF cDNA 之 DNA 序列（圖 13)( S E Q ID NO: 3)及限制酶輿圖，可鑑定出一段 S*a IH段，可由位於載匾聚連接子上的一錮Saa I位置 (距cDNA純条端18bp)及位於cDNA純条 中的一 I位置（〜1 500bp距離），距成熟 GDNF编碼序列端約800bp。此SBa I片段如 下段選殖至PSG5中，純化的pSG5質饈DNA ( 本紙張尺度遥用中困國家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 請 先 K 讀 背 之 注 意 事 項 脣 填 寫 本 裝 訂 嫌濟部中央樑準馬貝工消费合作杜蛘髮 81.9.25,000 A6 B6 4014X1 五、發明説明P )
Stratagene)以EcoRI水解，再以牛滕驗性磷酸酶（ C I A P ) ) ( Pr〇«een)處理，依廠商指示進行。接下 去載儒霣泳再自瓊脂凝膠中溶離。純化的pBlue sc i npt SK -76.1質黼DNA以EcoRI甲基酶甲基化，以Sa· I水解， 再與實例2A中所述之EcoRI連接子分子連接。於EcoRI水 解及瓊脂糖凝膠霣泳後，溶離出含人感興趣之約1. 5 kbSaa IH段（今已EcoRI甲基化及連接之），並與經 EcoRI水解及確酸酶化之PSG5載體連接。連接産物用 來轉形於勝任的大腸桿薗XL 1 — B 1 u e ,利用 C a C又；?步驟進行（Maniatis, et al.上文）。選出氨 窄青徽素抗性轉形細胞，以限制酶水解及瑱脂糖凝謬轚泳 分析重组質鳢。以EcoRI水解顯示，大部份的轉形細胞含 有攜有欲求嵌入子之質體。以Ban Hie水解、可鑑定出相 對於載《中SV40啓動基因之經選殖的GDNF基因之 方位（注意到，Ban HI位於圖1 3序列中第1 5位置）。 二種方位均可得到〇 選擇二值轉形細胞以進一步分析，一者含有稱之為 PSG5 ·· rGDNF — 7之質醱，播有位於正確方向之 GDNF基因，其中始於SV40啓動基因之RNS轉錄 子可表現；而第二者含有稱之為PSG5:rGDNF— 4之質醍，攜有相反方向之GDNF基因，其中始於SV 40啓動基因之RNA轉錄子並不表現GDNF。逭些質 龌的纯化製劑均利用CsCi?密度梯度離心法製備，以用 於C 0 S細胞表現實驗中。 束纸張尺度適用中國B家揉準（CNS)甲4规格<210 X 297公釐） 請 k. · 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 瑱 寫 本 裝 訂 缓濟#中夹標準屬員工消#合作杜<p« 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明（7¾ B. GDNF於COS—7細敝中之壶現1 以鐮溶解及後的CsC)^密度離心（Maui at is, et al,上文）方法製備得自造些構髗之質髏DNA。DNA 此以 Sompayrac 及 Danna 的方法（1 9 8 1 , Proc.Natl. Acad. Sci . USA 78: 7575-7578)之方法轉感至 C 0 S - 7 細胞。至於對照组，同樣的COS細胞培餐以含相反方向 之GDNF嵌入子的質髖載《DNA所轉感，其無法表現 出GDNF蛋白質。毎掴100毫米之培餐皿，使用30 撖克之脂感素（lipofectin)及〇· 3 — 1微克的質體 D N A 〇 經轉感24小時後，吸出培養基，更換以OpTiMEM I 士 3%FCS。培餐物培育48小時，並如下述地回收： ει)吸抽出培餐基（調適培餐基或CM)並貯於 -8 0 *0 下； b)加5毫升PBS±2.5mM EDTA至细胞 叢，並保持於2 5 XI下3分鎗，之後細胞吸量出 來，並以lOOOxg離心5分鐘。移出上淸液 ，細胞園塊貯於一 8 0 *0下。 C Μ於Centricoul 〇濃缩器中濃縮3 0倍，再行生 物活性分析。細胞園塊於500撖升1OmM EDTA ，PH70,加有 ImM 苄甲胖，lOOjt/M pMSF ,1 in Μ E —胺基一 N —己酸中超音波®通。溶液産物 以14, OOOxg離心5分鐘，上淸液再進行生物活性 本紙張尺度適用中國國家《準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐> -80 - 81.9.25.000 請 a Μ 讀 背 由 之 注 意 事 項 再 窵 ΙΛ 裝 訂 *濟部中央*準爲貝X消费合作杜印製 401422 A6 B6 五、發明説明四） 分析。 C.所弃頊クΠΠNFク生物分析 以可表現GDNF及對照组質《 (其中GDNF编碼 序列位不正確方向）轉感之COS細胞，其溶胞産物及培 養基均進行於中腦神經元培養中增加多巴胺能«入之能力 分析，及增加交感神經節神經元存活之能力分析（見實例 1及4 )。C Q S细胞培養基（圔1 7 )及溶胞産物（未 示出數據）如對GDNF所預期般的，可增加多巴胺之攝 入。如圔18所示，COS細胞培養及溶胞産生可如對 GDNF所預期的，增加交感神經鏈神經元之存活。 适些結果淸楚地顯示，動物細胞中GDNF基因之表 現可造成蛋白質之産製，其所具的生物活性已明示出如純 化的G D N F 〇 奮例6:人額GDNF於大脹捍窗中之表現 A.饞链可指湛会成人類GDNF之霣體 利用人類GDNF基因之序列資料（實例2C),製 成合成的寡核替酸PD3及PD4,可充成人類GDNF 基因擴大作用中之引子，其可自大賜捍菌中之質腥表現条 中表現。PD31(SEQ ID N0:21)及 P D 4 ( S E Q ID N0:22)寡核苷酸之序列為 PD3 . 5 * CGCGGATCCAATAAGGAGGAAAAAAAATGTCACCAGATAAACAAAT 3' PD4： 5* CGCGGTACCCAGTCTCTGGAGCCGGA 3/ 本纸張尺度逋用中國國家《準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 請 先 η « t * 之 注 意 事 項 再 碘 窵 ΙΛ 裝 訂 鳜濟部中夹*準局霣工消#合作杜印轚 81.9.25,000 A6 B6 經濟♦中央*準爲Λ工消费合作社印黧 五 '發明説明¢0 ) 寡核笞酸PD3長46值核苷酸。於3 z嫌的1 7核 苷酸，對於在指導合成成熟蛋白質N—末端區域中之人類 GDNF基因偽完美配合的。此17值核奋酸前方為轉譯 起始密碼子，ATG,如此成熟的人類GDNF,其合成 始於大賭桿圈中正確胺基酸。其他的核Μ酸經設計以提供 於大腸捍菌中良好表現所需之其他訊號，以及構築 GDNF表現質體所需之Bam HI限制酶位置。 寡核苔酸PD4長26値核苷酸。位於3 <端的1 7 侮核苷酸和人類GDNF基因停止密碼子3/的17侮核 苷酸完全符合，此寡核苷酸可提供於GDNF表現質《構 築所需之Κ ρ η I限制酶位置。 擴大人類GDNF之反應條件如下：全部反應龌積為 100微升，且含1€撤克含人類GDNF基因之 ADNA純条，各20微撖其耳的PD3及PD4, 20 mM Tris-HCJ? pH8. 8, 10mM K C ί , 6 m Μ , (NH<)2S〇4, 1. 5mM MgC^ 及 0. 1%三通X-100。反應混合物加熱至9 5 t：歴5 分鐘，冷卻至44C,加入2單位的Pf u DNA聚合 海（Stratapene)。反應包括3 ◦値循琛的下列：7 2 t： · 1又1/2分鐘，95*C, 1分嫌，及44t：, 1又 1/2分鐘。於反應末了2加入至终濃度10 mM。加入5單位的DNA聚合海I大Ulen〇w)片段（ Pronega)且反應在37*0下培育1 〇分鎗。之後加入 10撖升3M NaAc及220撖升 EtOH,且溶 -82-- 請 Μ 曾 之 注 意 事 項 再 填 寫ΙΛ 裝 訂 本纸張尺度遗用中Β國家揉準（CNS)甲4规格（210 X 297欠釐） 81·9·25·000 401422 A6 B6 嫌濟部中央樣準房霣工消t合作杜卹製 五、發明説明吞1 ) 液在1 2, OOOxg下離心1 5分以沈澱DNA。沈澱 之DN A再懸浮於1 0 0撤升5 OmM Tris-HC^ ( p Η 8 ) , 5 Ο m Μ NaC^, 10mM MgCJ^， 20單位Ban HI及20單位Κρη I中，並於37*0下培育 1小時。經瓊脂糖凝腰«泳後可鑑知正確大小之DNAH 段，以Ultrafree-MC遇濾單位（Millipore )纯化。此片 段連接至大腸捍菌表現載體PT3XI — 2 (下述）。連 接條件如下：全部的反應髏稹為5撤升，且含10毫撤克 經ΚρηI及BamHI線化之PT3XI—2 DNA ,5毫撤克人類GDNF D NAΜ段（如上述），5 0 m M Tris-HCi2 (pH7. 6) , lOmM M g C ί 1 m M A T P , 1 m M DTT, 5% 聚 乙二酵，及1單位T<DNA連接酶（BRL),反應在 1 4 t：下培育2小時。 載饈P T3X I — 2以下列方式構築。於此構築中所 用之起始質體是質體PKK 2 2 3 — 3 (Brosiusand Η ο 1 y，19 8 4 )購自 P h a r m a c i a。質腰 pKK223 — 3 撕有 Ν 部份的四琛徽素抗生基因。此無功能基因以攥於質體 PBR322上的完全四環徽素抗性基因取代。質體 ΡΚΚ223 — 3以Sph I完金水解，及Ba· HI部份水 解。凝膠純化出4.4kb片段，並與合成的承接子混合 (S E Q ID NO ： 2 3) 5， GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT 3, ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 5, Bglll Clal 、' 請 先. m * t « 之 注 意 事 項 脣 磷 窵 本 i t i r 本紙張尺度逍用中國B家*準（CNS)甲4规格（210X 297公釐〉 81.9.25,000 五、發明説明杉2 > A6 B6 以及539b p來自p BR322四環徽素抗生基因 C 1 a I , S p h I 水解物之片段（PL Biocheaicals， 27 — 4891 — 01)。生成的質鼸命名為pCJI。 接下來，購自New England Biolabs的Xh〇 I連接 子，嵌入質腥PCJ1的PvulI位置中以形成質體 P C J X - 1。此嵌入作用可瓦解控制質體套數之iv 〇 p 基因。接下來，含有1 ac I基因之EcoRlH段純化自質 «PMC9 ( Cal osetal., 1983),之後以 X h ο I至EcoRI承接子嵌入X h ο I位置。於質體 PKK 2 2 3 - 3中之聚連接子區，再以EcoRI及 Pst I切割以替換以含額外位置之聚連接子（SEQ ID N 0 ： 2 4 ) 5, AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA37 < · 3' GGGCCC ATGGTCTAGA CTCGAGTGAT CAG 5r 請 先 讀 背 * 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 訂 經濟部中央«準房霣工消费合作杜<p« 所得之質體載體命名為pCJX—1。 最後，四琛徽素抗性基因以類似的基因取代，其中 Hind III· Ban HI及Sal I限制酶位置已用亞硫酸氫埴突 變作用予以破壞。以下步驟用突變PBR322之四琛徽 素抗性基因。質體PBR322以Hind III切割，再以亞 硫酸鈉突變（Shortle and Botstein, 1 9 8 3 )。突變 m- t紙張尺度遍用中國团家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明（ 的DNA連接以形成璨狀DNA,之後以Hind III切割以 線化任何逃脱突變之質饑。大腸桿菌JM101( Yanisch-Perron et al，1985)。分離出抗四琢徽索之質儀[ ，並於四瑭徽素抗性基因中撿査Hind III位置之喪失。成 功突變之質酸命名為PT1。依循類似步《以突變PTI 中之Bam HI位置，生成質齷pT2。質鼸PT2依序突變 以除去Sa1I位置，形成質醱ρΤ3。 ΡΤ3攜有突變 的四環徽素抗性基因之C 1 a I _S 1 y I Μ段分離出來 ，再取代PCJXI—1之同質片段以形成ρΤ3Χ—2 。經突變的四環徽素性基因仍可指導合成一«具有功能的 蛋白質。tac啓動基因區下游引入一儀聚連接子，其在 其他位置外含有Ban HI及ΚρηΙ限制位置，可用於選殖 基因以於大腸捍鯖中之表現。 載鐮舆人類成熟GDNF構鐮經2小時連接後，2微 升反應混合物依廠商操作指示轉形至Epicurian Coli 3仙£^超勝任大腰桿菌细胞（3丨以《1衫116)。如實例2 6 中所述地決定重组質*之一的DNA序列。由序列証例， 此質鼸含有指導合成成熟人類GDNF之人類GDNF基 因完全的编碼序列。 B.人類GDNF在大藤捍饈中之裹現 含有纗碼人類GDNF DNA序列之重组質體，轉 形至大腸桿菌JM107奋rMCB0005中，此供 JM1 07 之 T 1 抗性變種（Yan i sch Per ron et a 1 » 請 先- K * 背 爾 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 装 訂 缓濟部中喪樣準屬興X消#合作杜<p« 本纸張尺度遑用中团B家«準（CNS)甲4現格（210 X 297公 -85 - 81.9.25.000 401422 Αβ Β6 «濟部中央樣準為貝工消费合作杜印製 五、發明説明β4 ) 1985)),利用 Sambrook et al 所述之 CaCiZa 方 法進行（1 989)。一個重组细胞生長於力1 100徹 克〆毫升苞苄靑徽素（SU»e)之50毫升LB培餐基中 (Sanbrook et al),於37t：下震盪一夜。第二天培餐 物以1:70稀釋於加有1〇〇微克/毫升氛苄育徽素之 LB培養基中，並以37υ下震盪5小時生長之。以 8, OOOxg離心10分鐘以回收20¾升細胞。團塊 懸浮於4毫升1 OmM EDTA, pH7. 4中。細胞 利用 French Press Pressure Cell (SLM Instruments) 在18, OOOpsi下瓦解。溶胞産物以12, 000 x g在4t：之離心1 5分。園塊再懸浮於1 OmM EDTA中。若醱酵在42t!下而非371C或30t：下進 行則可發現可累積相當多的GDNF。 目前為於大腸捍菌中得到高GDNF表現水平之較佳 方法，像利用實例6A中所述之重组質體（其中人類成熟 GDNF之编碼序列選殖於表現載髏p T 3X I — 2中） 其方法如下。於10升醱酵中，500毫升接種物生長於 含15撤克/毫升四琛徽素之LB培餐基中（pH 7), 於3 7 t：的2升高節震盪槽中培養至介於2及3間之光密 度（Am。）。此培育物接種於10升培餐基中，其中含 12克/升胰蛋白陳，24克/升酵母浸膏、25克/升 甘油，1. 3克/升Κ2ΗΡΟ<, 0. 4克/升 ΚΗ»ΟΡ〇 〇· 1 毫升 / 升 4: 1 的 Maco 119 :GE60混合物，及1 5毫克/升四琛徽素HCJ2。培 請 先. Η 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 窵 本 Γ 装 訂 拿紙張尺度適用中Η Η家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -Θ&- 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明$5 > 養物在42t!下生長至約12 — 18小時，至光密度約 12至20 (Αββ。）。醱酵之pH值維持在7. 0,且 溶《維持3 0 %飽和度。醱酵後，培養物在4t!下冷卻， 細胞以離心回收。 自上述此質體中産製人類GDNF,對此大腸桿菌而 言並非待異的，但可於任何適合的菌株中産生。質驩已轉 形至二傾其他的大腸桿菌中，JM108 (Yonish Perron et al·，1985)及 SURE®cstratagene)。於此二 株中，經聚丙烯醯胺凝醪電泳後之考馬斯藍染色，可彻出 正確分子置之新蛋白質帶。 各份再懸浮物質經由聚丙烯醛胺凝謬電泳。凝睡以考 馬斯藍染色。只於含有重组體人類GDNF質體之培養 存在有GDNF預基分子置（1 5, 000道耳呑）之蛋 白質，只含載«ΡΤ3Χ 1—2之培餐物則否。已回收的 蛋白質接受檫準的胺基末端定序步思，且此蛋白質前22 儀胺基酸和國1 9所示之人類G D N F胺基酸序列相同， 証實人類GDNF被正確地表現於大腸桿菌中。 C.産自細_：>重紺饍人額GDNF之苒析鬈及牛物法袢 再折叠材料之製備。大賜捍菌轉形細胞JM107 ( PT3X12 : huGDNF)於以酵母浸膏（ #0127 — 01 Difco Laboratries. Detroit» MI)及 陕蛋白陳（.林 0 1_2 3 — 0 5 Difco Laboratories Detroit，MI)為底之褀雜培餐基中（24克/升酵母浸膏 本纸張尺廋遥用中困藤家«準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 請 先- « 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 訂 Λ 缓濟部f夹樣準屬員工滴费合作杜«P* 81.9.25,000 401422 A6 B6 缓濟部中夹標準屬貝工消费合作杜*:* 五、發明説明拆） ,12克/升胰蛋白陳· 5克/升甘油，1. 3克/升 K 2 Η P 0 4 , 〇 · 4 克 / 升 Κ Η 2 Ρ Ο < , 0 . 1 毫升 / L Macol 19/0£60(4:1),15毫克/升 四琛徽素），無I P T G誘導下之3 7 t：中生長至穩態期 。细胞於JA10旋轉子中以4*C· 1 600xg離心 20分鐘，且细胞团塊再貯於一201下。 細胞如下述地處理：5毫克细胞糊以40毫升10 m M EDTA，pH7. 0之冰上，以0 C I公司之勻 漿機勻漿化之。淤漿在20, OOOps i下French加法 3次，之後在JA20轉子中以4¾. 30, OOOxg 心10分鐘。丢棄上淸液，团塊勻漿化再如上述地雄心。 於一値具體實例中，得自再萃取之团塊以40毫升的25 m M Tris , ρΗ7. 4勻漿化，如上述地離心，且上 清液丢棄。園塊以20毫升50mM Tris, ρ Η 8 . 0 ，含8Μ尿素加或不加30mM2—魏基乙酵勻漿化，如 上述離心並保留上淸液。上淸液稱為TU萃取物。於一較 佳具體實例中，醒塊以4 0毫升的1 0 m M Tris , ΡΗ8.0,含有 lmM Ε D Τ A , 1 96 Ν Ρ - 4 0 勻漿化，且上淸液丢棄。圃塊以磺睡化作用溶解，方式如 下：圍塊於25毫升20mM磷酸銪，ρΗ7· 4,含8 mM尿素，100mM亞硫酸氫銷，及10mM連四硫酸 納勻漿化。令雄醛化作用在4t：及攪拌下進行一夜，再於 4Ό下以16, OOOxg離心10分鐘，以澄明化溶液 請 先· Η 讀 背 由 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 訂 本·纸張尺度適用+國國家揉準（CNS)甲4 Λ格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 A6 B6 嫌濟部中夹*準局興工消*合作杜印製 五、發明説明矽） 再析罄前對T U辁取物之部份紳仆.^ T U萃取物於S —Sepharose快流速樹脂中（Pharaicia)以離子交換層析 部份姹化。管柱平衡，再於室下，以25mM Tris, pH7. 4,含8M尿素及30mM2 —薙基乙酵（A缓 衝溶掖）平衡。樣品媾料後，以A缓衝液洗至基線光密度 ,管柱在10%管柱積每分鐘下，以各5倍管柱釀稹的A 缓衝溶液及lOOmM Tris, pH9. 0,含8M尿素 ,500mM NaCJe 及 30mM2 —黷基乙酵（B 缓 衝溶掖）溶離。管柱流份於280毫撖米下追踪，並於S DS — PAGE分析。GDNF在60 — 70%梯度處呈 主要蛋白質峰被溶離。匯集富含GDNF之流份以再折疊 。（晒 2 5 ) 〇 猶蘑化芨取物再析疊前之部份純业。碘睡化举取物， 在Q — Sepharose快流速樹脂上（PharnaWia)以離子交換 層析部份纯化。管柱平衡，並在41C之10mM Tris, PH8. 0含4M尿素（A缓衝液）中進行。樣品熇料後 ，以Α缓衝液洗至基底光密度，管柱於5%管柱體積每分 鐘下，以各5倍管柱讎積之A缓衝溶液及lOmM Tris , pH8. 0,含 4M 尿素及 500mM NaCi (B缓衝溶液）溶離。管柱流份於280毫撖米 下追踪，並以SDS-PAGE分析。GDNF在50% 梯度下主蛋白質峰處溶離。匯集富含GDNF之流份以供 折疊。 部份鈍化T II銓取物之再析纒》GDNF如上述部份 請 先 Η 讀 背 兩 之 注 意 寧 項 再 碘 寫 本 装 訂 η k紙張尺度適用中國國家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297«釐） 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明科） 纯化再如下述地再折叠：對4毫升含約1毫克/毫升 GDNF之經匯集的管柱溶離物，加入5mΜ二硫異舆弱 藻酵。管加蓋以排阻空氣，並在25*C下保持1 5分。此 溶液再以14倍鳢稹之再折疊缓衝溶液（l〇〇mM Na2HP0<, 10mM 乙酵胺 pH8. 3,含 4M 尿素 ,5%聚乙二酵及2mM半胱胺酸）稀釋，並在5*C之氬 大氣下保持3天。 部份紳化：> 磋醅化芨取物^洱析纒》如上述部份純化 的GDNF,如下再折叠：含有約3毫克/毫升GDNF 之匯集的管柱溶離液，以1 9倍體積之再折疊缓衝溶液（ lOOmM Na^HPCU，Tris pH8. 3,含 4M 尿素；5%聚乙二酵300;及3mM半胱胺酸）稀釋， 並保持在5 t：氬大氣下3天。 再析曇Γ, DNF以SDS — PAGE分析β萃取自细 菌之GDNF (先前未曝於還原劑下），呈單髖在SDS _ P A G Ε上移動，和標準蛋白質分子置之移動比較下， 其視分子量約16kP a。在二體位置處無可澍及之G D NF。GDNF若曝於還原劑下（30 — 150mM2 — K基乙酵）只要在再折叠，不論於萃取中或SDS— PAGE前，，則移動的位置舆未運原的细菌蛋白質幾乎 無法分辨，視分子量約16kPa (圖26, 6&13列 )。此顯示，GDNF製備自细菌細胞，於再折叠前並未 二聚艚化。
經如上再折叠後，大部份産自細菌之重組體GDNF 本紙張尺度遥用中國B家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 請 先 和 讀 背 由 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 訂 缓濟♦中喪樣準層興X消*合作杜印製 81.9.25,000 A6 B6 鳗濟部中央*準屬興工消费合作杜印製 五、發明説明锣） ,是以约30kPa之表現的二腥型式在非邏原SDS-PAGE 上移動（圔2 6，2列）。SDS-PAGE 前 以150mM2 —殲基乙酵還原再折II的GDNF,使其 可再次移動至約16kPa之單《位置（園23, 5列） 。這些结果顯示，GDNF之再折疊使蛋白質變成二硫化 物鍵結的二《。再折叠GDNF之SDS—PAGE在無 邇原下進行，且凝膠沿長度切條，並於交感神經節神經元 存活分析中（如下）分析其生物活性。唯一可測及之生物 活性像在二醱位置處，顯示二體像生物上具活性的。 於谱相HPI.C：(RP_HPLC)上分析再析蘑的 G D N F » 以 S -Sepharose或 Q — Sepgarose層析部份純 化之GDNF,但此傜在再折璺前，則其在RP— HPLC中之移動（如下述地進行）具约21分之滯留時 間。GDNF再折叠後於相同條件下移動，具約15分之 滯萤時間。滯留時間之移動預期是GDNF成功再折叠之 故〇 R P — Η P L C上滯留時間上之移動常可於蛋白®再 折疊後觀察到。 道些樣品之RP—HPLC,如下進行，流速1毫升 /分：一但〇.46X25公分的C一4管柱（ VyDac U 2 1 4 TP54)如下述地展開：A溶 爾·· 0 . 1 %三氟醋酸（T F A ) / Η 2 Ο ; B溶劑= 0.1%TFA/乙腈；由〇. 5-1. 5分，乃由5策 增加至25%;1. 5至31. 5分，乃由25%增至 5 5^〇 -91- 請 先. Η 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 訂 t纸張尺度邊用中國國家«準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐〉 81.9.25,000 A6 B6 431422 五、發明説明种） 苒析以生物分析法分析》再折疊的 GDNF,於雞胚（Ε 10)交感神經節神經元存活生物 分析（實例4Α)及大鼠胚胎（Ε16)中腦培餐之多巴 胺攝入生物分析（實例1Β)中分析。再折叠前， GDNF曝於30mM2—癍基乙醇下，並如下述以S_ Sepharose層析純化，在中腦培餐之多巴胺攝入分析中並 無可測及之生物活性，而於交感神經元存活生物分析中測 是生物活性大大地減少。經S-Sepharose層析物質在交感 神經元存活生物分析中之表現的ED〃為約1微克/毫升 ，其較再折》的rhGDNF低约333倍（見下文）至 於Q-Sepharose靥析物質，於交感神經元存活生物分析中 之表現的ED5。為約3毫撤克/毫升，其較再折疊 rhGDNF低約100倍（見下文）。於再折疊後， GDNF在有無曝於2—癍基乙酵下，於二種分析法中在 表現上均具完全的活性（圖27 — 28)。此结果顯示， GDNF因再折叠可獲得顯著的生物活性，同時於再折叠 前生物活性之減少或不存在並非由於曝於2 —镟基乙酵之 故。 在逭些生物分析中，再折疊的重组體人類GDNF ( rh_GDNF)之ED3。，和先前見於B49細胞諝逋 培餐基之鈍大EGDNF類似。於交感神經之存活生物分 析中，rhGDNF之ED5。為約3毫撖克/毫升（圈 27),且大鼠GDNF之ED5。為約5毫微克/毫升。 於中腦培餐中多巴胺能攝入分析中，rhGDNF的 本纸張尺度遗用中國Η家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） (請先《讀背由之注意事項再填寫本Θ •裝· 訂· 觎濟郜中夹樣準屬興工洧t合作杜印製 81.9.25,00 A6 B6 缓濟部中央#準局霣工消费合作社印褽 五、發明説明) ED«。為约30撤撤克/¾升（國28)，於大鼠 GDNF中為約50微撖克/毫升。造些结果顯示，相當 大比率之r hGDNF可成功地再折叠並具完全的生物活 性。 奮期17 : GDNF抗鱅夕庠餺》分離 以下列步班産生rhGDNF之抗體。所見之此步驟 中包括佐劑、免疫接種策略，及動物種類，但並不限於此 。同時，生成GDNF抗醴可利用如下示步驟4中之再折 疊，天然蛋白質或經變性之滅活蛋白質，或利用來自人類 或其他動物種類GDNF序列之連鑛肽。 單株抗可以許多標準方法之一産生（見Antibodies, a Laboratory manua1；Co 1d Spring Harbor Laboratory 1988) ISBN087 9 69-314 -2,Ed HarLocs及Dacid Lane编輯）。簡言之，産生單株抗篇此 一步班通常涉及：免疫適當的動物，追踪接受免疫接種動 物之抗臁反應，分離可産生抗鱧之細胞，如一種以上反應 動物之淋巴器官，逭些细胞與適笛细胞株播合，如胬_細 胞瘤细胞》以産生融合裔，其傈分泌不死细胞之抗鼸，並 筛選以p漸分雄融合瘤直到得到可産製欲求單株抗體之單 一細胞純条為止。 於兔子中生成多株抗腰之方法如下：含有0. 005 -0· 25¾克rhGDNF之.2毫升無菌食埴水，注入 RIBI佐剤一MDL — TDM — CWS乳劑小瓶中（ 請 先· η 讀 背 * 之 注 意 事 項 再 窵 本 裝 訂 η 衣纸張尺度適用中Β國家櫺準（CNS〉甲4规格（210 X 297公釐）
81.9.25.0C A6 B6 嫌濟部中央籌準爲貝工消费合作杜印製 五、發明説明$2 > R I B I Iaaunoche· Research，Inc·)並辑旋以形成乳 劑，依操作指示進行。經麻醉之雌性New Zealand白兔依 R I B I建議的兔疫接種策略注射。如下投予1毫升佐劑 抗原乳劑： 0. 30毫升的皮内注射（6位置各0· 05毫升） 0. 40毫升的肌内注射（各後腿0· 20«升） 0 · 1 0毫升的皮下（頸匾） 0.20毫升的腹膜内 動物於毎4 一 6週，以相同策略再次注射（迫加）。 於第1次注射前及10—14天之各追加後採血，以利用 中和作用分析或三明治式EC I SA測試抗體之産製。 如下進行中和作用分析，利甩大鼠E16中腦培餐分 析進行。兔子受試血淸稀釋至Du 1 becco、最低營養要求培 養基，並以25mM HEPES缓衝至PH7.4,並 含5毫克/毫升牛血淸白蛋白（稱之為BSA5)。此再 加至分析孔洞中（25微升之經稀釋受試血淸至5 0 0撇 升组雄培餐溶液中），並含其在371C下培育30分鐘。 接下來加入rhGDNF,其以6. 32毫撖克/毫升於 BSAS之經稀釋貯液型式加入25撖升，使分析中之最 終r hGDNF濃度為0. 3 1 6毫撤克/¾升。在培餐 8天後，以上述方法偵测多巴胺之攝入。以第二次追加所 得之抗血淸進行中和分析，其结果如下（下表2)。 請 先- Η 讀 背 * 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 訂 本紙張尺瘦適用中國國家*準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） -9Φ- 81.9.25.000 五、發明説明93 ) 轰_Z. A6 B6 兔子组號抗鹿 中和作用ec5« + E1 i s &ECs 〇 1604 再折疊的|*1160肝 20X 103 2.5X 103 2257 再折疊的rhGDNF 12X 103 7X 103 2506 再折疊的rh<JDNF 2X 103 3X 103 9380 變性的rhGDNF 2X 103 2X 103 +GDNF剌激之多巴胺攝入，於50%中和時之抗血淸 稀釋倍數 + E L I S A中産生最大 (高原期）訊號50%時之抗血 請 先· Η 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 裝 經濟部中央標率屬貝工消费合作杜«Ρ製
淸稀釋倍數 抗血淸也於下列步班中，以檫準ELISA定出 GDNF抗體之效價： 微滴定盤（9 6孔洞，Nunc aaxi so rp)毎孔洞塗覆以 100微升，1· 0微克/毫升rhGDNF於50mΜ 碩酸氫銷，ΡΗ9. 6塗佈缓衝溶液，4t：下歴一夜。以 洗滌缓衝溶液（PWB);磷酸埴缓衝上生理食埴水， PH7. 2,含有0. 5%吐溫20)洗四次，再於25 *0下以每孔洞2 0 0撤升2 %牛血清白蛋白於磷酸埴缓衝 之生理食埴水，PH7. 2之溶液阻斷2小時。培餐皿再 次以PWB洗雔，並加欲定效價之血淸樣品至孔洞中（ 100微升稀釋於20%正常山羊血淸及PWB中）。培 "9S 訂 η Ε*纸張尺度適用中國β家*準（CNS)甲4规格（210 X 297«釐） 81.9.25,000 4〇1432 A6 _____ B6 五、發明説明$4 ) 餐皿在35t!下培育1 . 5小時，並以PWB再次洗滌。 加入1:250◦稀釋於pWB之_性磷酸酶一共轭之山 羊抗一兔子 I 8 G ( J a c k s ο η I u η 〇 c h e b i c a 1 s)至各孔 洞（100撖升），並於35«C下培育1. 5小時。培餐 皿如前述地洗雔。接下去加P — NPP受質（對位一硝基 苯基磷酸二納；Sig«a Cat.No. MP 3 8 9 )至各孔洞（ 1 0 0微升，1 · 〇毫克/毫升D — Ν Ρ ί>於1 0涔二乙 酵胺，ΡΗ9.8)且培餐皿於25t!下培育。呈色後於 4 0 5 — 4 9 0毫微升下以計讀器（Molecul ar Devices Enax)謓取數值。 抗血淸於西方墨點中用來偵測及定量GDNF,如下 ••由 U.K.Laeul i (Nature 227 : 680-685 (1970) II 先描述 之基本方法進行硫酸十二酯納聚丙烯醯胺凝膠霣泳（ SDS—PAGE)，利用12又1/2%丙烯酵胺解析 凝膠及4又1/2%丙烯醯胺堆積凝暖。凝睡（16X 14X0. 15公分）以40毫安培固定電流電泳3小時 。至於遘原/變性，樣品在含1%SDS及150mM2 一镰基乙酵之樣品缓衝溶液中加熱至100t：,歷10分 鐘。 於西方墨黏方面，凝膠再轉漬至I«〇bil〇n-P膜（ Millipore Cat.No. IPVH 151 50),以 8 0 毫安培固定霣 流在 25mM Tris篇，1 9 2 m Μ 甘胺酸，0 . 1 % SDS,及20%甲酵中進行16小時，並如下處理： 1)膜在25*0缓和搖動下，於阻斷缓衝溶液中（ *紙張尺度適用_國B家櫺準（CNS)甲4规格（210 X 297«釐） 請 Η 讀 背 m 之 注 意 事 項 再 瑱 % 本 裝 訂 嫌濟舞中央*準為霣工消费合作杜印髮 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明05 ) 1 0 m M Tris· ρΗ7. 4» 含 150mM NaC$;Ο. 05%吐粗20;4%脱脂牛奶 ••及Ο . Ο 2 %疊氟化銷）粗斷1小時。 2) 膜再於25Ό缓和搖動下，舆含經稀釋之 GDNF第一抗血淸之阻斷播衝溶液中培育2小 時。 3) 以阻斷缓衝溶液洗滌膜（4 一 5分）。 4 )膜再於2 5 *0缓和搖動下，與含經稀釋之第二抗 釀（鱷性磷酸酶共轭之經親和力純化的山羊抗兔 子 I g G ,· Cappel Cat No. 59299)於阻斷缓衝 溶液中培育2小時。 5) 膜再以排除脱脂牛奶之阻斷缓衝溶液洗滌（4一 5分）。 6) 膜在25*0及缓和搖動下，於50毫升含165 微升 NBT 及 83 微升 BC I P (Pro^eea Kit· Cat NO.P3771)的展開缓衝溶液溶液中（1 0 0 m M Tr i s , ρΗ9· 5 含 lOOmM NaHCJe 及 5mM 展開，直到 欲求的染色逢到為止。 奮例8 :靱嫌WT分泌GDNF^曄句.暖细胞.#棺入病應 可分泌GDNF之细胞可包_至半滲透膜中，以植入 神經受損患者之《内。於一但較佳具鼸實例中，巴金森氏 病患者於紋狀鼸中植入可分泌GDNF之包繆細胞•以將 諸 先 讀 背 爾 之 注 意 寧 項 再 填 寫 本ΐ 装 訂 «濟部t夹«.準屬霣工消费合作杜_« 象纸張尺度適用中國函家標準（CNS) V4规格（210 X 297«釐y 81.9.25,000 玉、發明説明¢7 > (A)介質型式：Diskette· 5.25英寸，3 6 0 k b貯量 (B )霣腦·· I B Μ可相容 (C )操作条统：M S DOS (D)軟體 ：WordPerfect 5.1 (v i )同前應用數據：無 (V i i )先前申請資料 (A)申請號：07/7881423, 07/ 774,109,07/ 7 6 4,6 8 5 (B)立楢日期·· 06 —1 1-1991, 08 -10 — 1991, 2 0 - 9 - 請 先 Η 讀 臂 之 注 意 事 項 再 填 寫 本
(v i i i )法律/事物資料 (A)名稱：Barry J. Swanson (B ) 註册號 ：3 3 » 2 1 5 (C ) 參考/備忘數字 • • S Y N E 一 2 2 5 鱷 (i X )申請資料 濟 部 中 (A) 電話： (3 0 3 ) 8 5 0 — 9 9 0 0 央 檁 (B ) 電報： (3 0 3 ) 8 5 0 - 9 4 0 1 準 局 霣 (2 ) S E Q ID NO » • 1 資料 ^ ( i )序列待性 合 作 社 印 製 (A)長度 (B )型式 2 5傾胺基酸， 胺基酸 本紙張尺度適用中國团家«準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 81.9.25,000 A6 B6 五、發明説明併） (C )拓撲學：線型 (V ) Η段型式：N —末端片段 (i)序列描述：SEQ ID N 0 ： 1
Ser Pro Asp Lys Gin Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Xaa 5 10 15
Gin Ala Ala Ala Ala Ser Pro Asp Asn 20 25 請 η 讀 背 由 之 注 意 事 項 再 填 寫
(3 ) S E Q ID N0:2資料 (i )序列待性(A) 長度：13個胺基酸，(B) 型式：胺基酸 (C )拓撲學：線型(v ) Η段型式：内部片段(i X)特色：Xaa 是Lys 或G 1 η (X i )序列描述：S E Q I D NO 2 装 訂 Λ IE濟部中央樣率爲貝工消t合作杜<p«
Asp Xaa lie Leu Lys Asn Lei^ Gly Arg Val Arg Arg Leu (4 ) S E Q ID (i )序列待性(A )長度 (B )型式 (C )股性 N 0 : 3資料 8 9 0 b p核酸單股 (D)拓撲學：線型 81.9.25,000 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） A6B6 五、發明説明的i X )特色
X
(A)名稱/索引 序列描述：S E Q 大鼠GDNF之核酸 ID N 0 : 3 缓濟部中央樣準爲员工洧费合作杜印« CCCCCGGGCT GCAGGAATTC GGGG GTC TAC GGA GAC CGG ATC CGA GGT GCC GCC 54 Val Tyr Gly Asp Arg lie Arg Gly Ala Ala -90 -85 GCC GGA CGG GAC TCT AAG ATG AAG TTA TGG GAT GTC GTG GOT GTC TGC 92 Ala Gly Arg Asp Ser Lys Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys -80 -75 -70 CTG GTG TTG CTG CAC ACC GCG TCT GCC TTC CCG CTG CCC GCC GGT AAG 140 Leu Val Leu Leu His Thr Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys 一65 —60 —55 AGG CTT CTC GAA GCG CCC GCC GAA GAC CAC TCC CTC GGC CAC CGC CGC 188 Arg Leu Leu Glu Ala Pro Ala Glu Asp His Ser Leu Gly His Arg Arg —50 —45 —40 GTG CCC TTC GCG CTG ACC AGT GAC TCC AAT ATG CCC GAA GAT TAT CCT 236 Val Pro Phe Ala Leu Thr Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro -35 -3〇 -25 -20 X- GAC CAG TTT GAT GAC GTC ATG GAT TTT ATT CAA GCC ACC ATC AAA AGA 284 Asp Gin Phe Asp Asp Val Met Asp Phe lie Gin Ala Thr lie Lys Arg -15 -10 -5 CTG AAA AGG TCA CCA GAT AAA CAA GCG GCG GCA CTT CCT CGA AGA GAG 332 Leu Lys Arg Ser Pro Asp Lys Gin Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu 1 5 l〇 AGG AAC CGG CAA GCT GCA GCT GCC AGC CCA GAG AAT TCC AGA GGG AAA 380 Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys 15 20 25 GGT CGC AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAT CGG GGG TGC GTC TTA ACT GCA 428 Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala 30 35 40 45 ATA CAC TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT TTG GGC TAC GAA ACC AAG GAG 476 lie His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leii Gly Tyr Glu* Thr Lys Glu 50 55 60 GAA CTG ATC TTT CGA TAT TGT AGC GGT TCC TGT GAA GCG CCC GAG ACA 524 Glu Leu lie Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Glu Ala Ala Glu Thr — 65 70 75 ATG TAC GAC AAA ATACTA AAA AAT CTG TCT CGA AGT AGA AGG CTA ACA 572 Met Tyr Asp Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr 80 85 90 AGT GAC AAG GTA GGC CAG GCA TGT TGC AGG CCG GTC GCC TTC GAC GAC 620 Ser Asp Lys Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro Val Ala Phe Asp Asp 95 100 i〇5 請 先 两 讀 t * 之 注 意 事 項 再 碘 寫 本 訂 本纸張尺度適用中國國家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公梦 81.9.25,000 5 6 2 b ρ 核酸 單股
X A6 B6 五、發明説明（im>
Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Glu Ala Ala Glu Thr Met Tyr Asp 65 70 75 80
Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr Ser Asp Lys 85 90 95
Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro Val Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser 100 105 110
Phe Leu Asp Asp Ser Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys His Ser Ala 115 120 125
Lys Arg Cys Qly Cys lie 130 ， (6 ) S E Q ID NO:5SI 料 (i )序列特性 (A)長度 (B )型式 (C )股性 (D)拓撲學：線型 (i x )特色 (A)名稱/索引：人類GDNF之核酸序列 序列説明：SECl ID N 0 ： 5 ATTTTCTCTT TTCTTTTTGA ACAGCA AAT ATG CCA GAG GAT TAT CCT GAT CAG 53
Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gin 請 先 Η 讀 背 面 之 注 意 事 項 蜃 衊 窵 本 霾濟部中夹糲準局霣工请#会祚社¥« TTT ATT CAA Phe lie Gin TTC GAT GAT GTC ATG GAT TTT ATT CAA GCC ACC ATT AAA AGA CTG AAA 101 Ala Thr lie Lys Arg Leu Lys
Phe Asp Asp Val Met Asp AGG TCA CCA GAT AAA CAA ATG GCA GTG CTT CCT AGA AGA GAG CGG AAT Arg Ser Pro Asp Lys Gin Met: Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn 1 5 10 15 149 CGG CAG GOT GCA GCT GCC AAC CCA GAG AAT TCC AGA GGA AAA GGT CGG 197 Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg 20 25 30 81.9.25,000 本纸張尺度適用中國國家樣準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐103 _ 五 發明説明（1〇2) Α6 Β6 AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAC CGG GGT TGT GTC TTA ACT GCA ΑΤΑ CAT Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala lie His 35 40 45 245 TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT CTG GGC TAT GAA ACC AAG GAG GAA Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu 50 55 60 CTG Leu 293 ATT TTT AGG TAC TGC AGC GGC TCT TGC GAT GCA GCT GAG ACA ACG TAC lie Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr 65 70 75 GAC AAA ATA TTG AAA AAC ΊΤΑ TCC AGA AAT AGA AGG CTG GTG ACT GAC 389 Asp Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp 80 85 90 95 AAA GTA GGG CAG GCA TGT TGC AGA CCC ATC GCC TTT GAT GAT GAC CTG 437 Lys Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro lie Ala Phe Asp Asp Asp Leu 100 105 110 TCG TTT TTA GAT GAT AAC CTG GTT TAC CAT ATT CTA AGA AAG CAT TCC 485 Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys His Ser 115 120 125 GCT AAA AGG TGT GGA TGT ATC TGA CTCCGGCTCC AGAGACTGCT GTGTATTGCA 539 Ala Lys Arg Cys Gly Cys lie 130 341 請 聞 讀 背 m 之 注 意寧 項 再寫 本
TTCCTGCTAC AGTGCAAAGA AAG 562 Λ 濟 央 樣 準 屬λ X 消 t 合 作 社 η製 (7 ) S E Q ID NO:6資料 (i )序列特性(A>長度：1 3 4值胺基酸殘基，(B)型式：胺基酸 (C )拓撲學··線型 (i X )待色(A)名稱/索引：成熟人類GDNF之胺基酸
(X i )序列描述·· S E Q
序列 ID Ν Ο ·· 6
Ser Pro Asp Lys Gin Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg 5 10 15 本纸張尺度適用中BH家*荜（CNS)甲4规格（210 X 297«釐r 1〇4 81.9.25,000 A6 B6 «濟部中*樣準屬Λ工消费舍祚社卹轚 五、發明説明（103) Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg 20 25 30 Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala lie His Leu 35 40 45 Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu lie 50 55 60 Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp 65 70 75 80 、 Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys 85 90 95 Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro lie Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser 100 105 no Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys His Ser Ala 爻15 120 125 Lys Arg Cys Gly Cys lie· 130(8 ) S E Q ID N0:7資料 (i )序列特性 (A )長度：2 0 b p(B) 型式：核酸(C) 股性：單股(D) 拓撲學：線型 (i )特色(A)名稱/索引••寡核苷酸引子(D)其他資料：N在3. 15及18位置上是肌胺酸(ii)序列描述：SEQ ID Ν Ο ： 7 CCNGAYAARC ARGCNGCNGC(9 ) S E Q ID NO:8 資料 (i )序列特性 請先《讀背由之注意寧項再填寫本一·^ .裝. 訂‘ 線〕 I：紙張尺度逋用中BH家樣準（CNS)肀4规格（210 X 297公釐T _ 81.9.25,000 A6B6 鱺濟部中央«準局X工消费合作社帑髮 五、發明説明（1〇4) (A) 長度：223bp (B) 型式：核酸 (C) 股性：單股 (D) 拓撲學：線型 (i X )待色 (A)名稱/索引：人類GDNF之核酸序列 (ii)序列描述：SEQ ID Ν Ο ： 8 "ttctctcccc cacctcccgc ctgcccgcgc a ggt gcc gcc gcc gga cgg GAC TTT 55 Gly Ala Ala Ala Gly Arg Asp Phe 、 -5 AAG ATG AAG TTA TGG GAT GTC GTG GCT GTC TGC CTG GTG CTG CTC CAC Lys Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His 1 5 10 15 ACC GCG TGC GCC TTC CCG CTG CCC GCC GGT AAG AGG CCT CCC GAG GCG Thr Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala 20 25 30 CCC GCC GAA GAC CGC TCC CTC GGC CGC CGC CGC GCG CCC TTC GCG CTG Pro Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu 35 40 45 AGO AGT GAC TGTAAGAACC GTTCC Ser Ser Asp 50 (10)SEQ ID N0:9 資料 (i )序列特性(A) 長度：1 2 b p (B) 型式：核酸 (C )股性：單股 (D)拓捵學：線型(i x )特色 (A)名稱/索引：線型 103 151 199 223 *先矚讀背西之注意事項再磷寫本頁f -丨裝· 訂. ’線 本纸張尺度適用中88家«筚（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） 106 - 81.9.25,000 A6 B6 纒濟部中央镡準局霣工消费合作社，製 五、發明説明（1〇5> (ii)序列描述：SEQ ID N 0 ： 9 CCCGAATTCG GG I (11) SEQ ID N0:10資料 (i )序列特性 (A) 長度：7値胺基酸殘基 (B) 型式：胺基酸 (D )拓撲學：線型 (xi)序列描述：SEQ ID N 0 ： 1 0 Pro Asp Lys Gin Ala Ala Ala (12) S E Q ID N0:11 資料 (i )序列特性 (A)長度：3 3 b p ΓΒ )型式：核酸 (C )股性：單股 (D)拓撲學：線型 (i x )待色 (A)名稱 / 索引：pBluescript SK-75.1 核 酸序列 (xi)序列描述：SEQ ID N 0 ： 1 1 gag agg aac cgg caa gct gcw gmw gym wgm ccw 33 (13) S E Q ID N O ·· 1 2 資料 尺度適用中國囲家#準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐r 107 - 81.9.25,000 (請先《讀背β之注意事項再填寫本一 i装· 訂. 線 A6 B6 五、發明説明（106) (i )序列待性 (A)長度：1 Γβ胺基酸殘基 (Β)型式：胺基酸 (C) 股性·•箪股 (D) 拓撲學：線型 (xi)序列描述：SEQ ID NO: 12
Glu Arg Asn.Arg Gin Ala AlaAla Ala Ser Pro (1 4) S E Q ID NO:13資料 (i )序列特性 (A) 長度：2 0 b p (B) 型式：核酸 (C) 股性·•單股 (D) 拓撲學：線型 (i x )特色 嫌濟#中夫樣準屬貝工谪♦合舴杜*« (A)名稱/索引：寡核苷酸，DHD — 26 (D)其他資料：N在9及1 2位置為肌按酸 (ii)序列描述：SEQ ID NO：13 ARRTTYTTNA RNATYTTRTC .20 (15) S E Q ID N〇：14資料 < (i )序列特性 (A)長度：7钽胺基酸殘基 (Β)型式：胺基酸 81·9·25,000 (請先《«背面之注意事項再填窝本 农紙張尺度適用中囲國家*準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐t 1〇8 A6 B6 五、發明説明（ΐσ7) (C )股性：單股 (D)拓撲學：線型 (xi)序列説明：SEQ ID N 0 ： 1 4
Asp Lys He Leu Lys Asn Leu (16) SEQ ID N0:15資料 (i )序列待性 (A) 長度：1 7 b p (B) 型式：核酸 (C )股性：單股 (D)拓撲學：線型 (i x )待色 (A) 名稱/索引：寡核替酸引乎PD 1 (i)序列説明：SEQ ID N Ο ： 1 5
GACGGGACTC TAAGATG 經濟部中央«準爲霣工消费合作杜印« (17) SEQ ID NO :16資料 (i )序列特性 (A )長度：2 0 b p (B) 型式：核酸 (C) 股性：單股 (D) 拓撲學：線型 (i x )特色 81.9.25,000 (請先《讀背*之注意事項再填寫本頁€ 本紙張尺度適用中囲困家檁準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐h 109 一 經濟部中央樣準局Λ工消费合件枝_髮 A6 B6 五、發明説明（108)
(A)名稱/索引：寡核苷酸引子DHD23 (D)其他資料：在3. 6及18位置上之N 肌胺酸 (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 1 6
GCNGCNGCYT GYTTRTCNGG (1 8 ) S E Q ID N0:17資料 (i )序列待性 (A)長度：1 7 b p (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D)拓撲學：線型 (i X)待色 (A)名稱/索引：寡核苷酸引子LF2 (xi)序列說明：SEQ ID NO: 17
CGAGACAATG TACGACA (19) SEQ ID NO:18*料 (i )序列待性 (A) 長度：1 7 b p (B) 型式：核酸 (C) 股性：單股 (D )拓撲學··線型 (i X )特色 本紙張尺度遍Λ中困囲家«準（CNS)甲4规格（210 X 297公嫠110 - 81.9.25,000 :請先《讀曹*之注意事項番«窵本買^^ ί A6 __-B6_ 五、發明説明（1()9) (A)名稱/索引：寡核苷酸引子PD2 (i)序列説明：SEQ ID NO:18 *
CTCTGGAGCC AGGGTCA (20) SEQ ID N0:19 資料 (i )序列待性 (A)長度：2 6 b p (B )型式：核酸 (C )股性：單股 (D)拓撲學：線型 (i x )待色 (A)名稱/索引：寡核苷酸引子PD1 (xi)序列說明：SEQ ID Ν Ο ： 1 9 CCCGAATTCG ACGGGACTCT AAGATG 26 (21) SEQ ID N0:20 資料 (i )序列特性 «濟部中央標準局霣工消费舍作杜_髮 (A) 長度：2 4 b p (B) 型式：核酸 (C )股性：單股 (D)拓撲學：線型 (i x )特色 (A)名稱/索引：寡核苷酸引子LFA (xi)序列說明：SEQ ID NO：20 81*9*25,000 (請先Μ讀背西之注意事項再磷寫本xf 本纸張尺度適用中國团家«準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐）~ 111 _ A6 B6 五、發明説明（11〇) CGGTGGCCAG AGGGAGTGGT CTTC 24 (22) S E Q ID N0:21 資料 (i )序列待性 (A) 長度：46bp (B) 型式：核酸 (C )股性·•單股 (D)拓撲學：線型 (i X )待色 (A)名稱/索引：寡核苷酸引子PD3 (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 2 1 CGCGGATCCA ATAAGGAGGA AAAAAAATGT CACCAGATAA ACAAAT 46 (23) S E Q ID N0:22 資料 (i )序列特性 經濟_肀央縹準屬員工消费合作社，« (A) 長度：2 6 b p (B) 型式：核酸 (C) 股性：單股 (D) 拓撲學：線型 (i X )待色 (A)名稱/索引：寡核苷酸引子PD4 (xi)序列説明：SEQ ID N 0 ： 2 2 81.9.25,000 {請先《讀背*之注意事項*«寫本頁f 本紙張尺度適用中团B家揉準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐Γ 112 — Α6 Β6 鱷濟舞中央樣準屬貝工消♦含作社*-«
五、發明説明（111) •Ί CGCGGTACCC AGTCTCTGGA GCCGGA 26 (24) S E Q ID N0:23 資料 (i )序列待性 (A) 長度：3 3 b P (B) 型式：核酸 (C )股性：雙股 (D)拓撲學：線型 (i X)待色 (A)名稱/索引：質醴pCJ1之承接子片段 (xi)序列説明：SEQ ID N 0 ： 2 3 GATCTAGAAT TGTCATGTTT GACAGCTTAT CAT (25) S E Q ID N0:24 資料 (i )序列待性 (A) 長度：3 7 b p (B) 型式：核酸 (C )股性：雙股 (D)拓撲學：線型 (i x)特色 (A)名稱/索引：質嫌pCJXI — 1之聚連 接子序列 (xi)序列說明：SEQ ID N 0 ： 2 4 AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA (請先讀背面之注意寧項再填寫本頁f I*— · .丨裝· 訂· •蟓 .k· 本紙張尺度適用中囲Η家«準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐Γ 113 _ 81.9.25,000

Claims (1)

  1. 六、申請專利範S年月曰 附件（A ): Λ8 B8 C8 D8
    第81108487號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國89年5月修正 1 . 一種神經膠質細胞系衍生之神經營養因子蛋白質， GDNF)，其特徵在於：如下（SEQ ID N0: 4)所示編碼鼠GDNF且視分 子量爲3 0 k D a之胺基酸序列： Ser Pro Asp Gin Ala Ala Gly Gin Arg Asn Val Thr Phe Arg Tyr Lys lie Leu Val Gly Gin Phe Leu Asp Lys Arg Cys Lys Gin Ala Ala Gly Lys Asp Leu Cys Ser Lys Asn Ala Cys Asp Ser Gly Cys Ala Ala Ala Set Pro Giu Asn Arg Gly Gly Leu Gly Gly Ser Cys Leu Ser Arg Cys Arg Pro Leu Val- Tyr' lie; Leu Pro Asn Ser Cys Val Tyr Glu Glu Ala Ser Arg Val Ala His lie Arg Arg Arg Gly Leu Thr Thr Lys Ala Glu Arg Leu Phe Asp Leu Arg Glu Arg Lys Gly Ala lie Glu Glu Thr Met Thr Ser Asp Asp Lys His Asn Arg Arg Arg His Leu Leu lie Tyr Asp Asp Lys Leu Ser Ser Ala — — — — — — ill — — —— -------線‘(請先閱讀臂面之注意事項再填寫本頁) t ψϊ.!才 t 7 或如下（SEQ ID NO: 6)所示編碼人類GDNF且 視分子量爲3 0 k D a之胺基酸序列： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐）-1 - 六、申請專利範S年月曰 附件（A ): Λ8 B8 C8 D8
    第81108487號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國89年5月修正 1 . 一種神經膠質細胞系衍生之神經營養因子蛋白質， GDNF)，其特徵在於：如下（SEQ ID N0: 4)所示編碼鼠GDNF且視分 子量爲3 0 k D a之胺基酸序列： Ser Pro Asp Gin Ala Ala Gly Gin Arg Asn Val Thr Phe Arg Tyr Lys lie Leu Val Gly Gin Phe Leu Asp Lys Arg Cys Lys Gin Ala Ala Gly Lys Asp Leu Cys Ser Lys Asn Ala Cys Asp Ser Gly Cys Ala Ala Ala Set Pro Giu Asn Arg Gly Gly Leu Gly Gly Ser Cys Leu Ser Arg Cys Arg Pro Leu Val- Tyr' lie; Leu Pro Asn Ser Cys Val Tyr Glu Glu Ala Ser Arg Val Ala His lie Arg Arg Arg Gly Leu Thr Thr Lys Ala Glu Arg Leu Phe Asp Leu Arg Glu Arg Lys Gly Ala lie Glu Glu Thr Met Thr Ser Asp Asp Lys His Asn Arg Arg Arg His Leu Leu lie Tyr Asp Asp Lys Leu Ser Ser Ala — — — — — — ill — — —— -------線‘(請先閱讀臂面之注意事項再填寫本頁) t ψϊ.!才 t 7 或如下（SEQ ID NO: 6)所示編碼人類GDNF且 視分子量爲3 0 k D a之胺基酸序列： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐）-1 - A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 Ser Pro Asp Lys Gin *Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Aan Pro Glu Aan Ser Arg Gly Lya Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala He His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu lie Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp . · Lys lie Leu Lys Asn Leu .Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro .lie Ala Phe Asp Asp Aap Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys lie; 其中該GDNF具有促進多巴胺神經元吸收多巴胺之能力。 2. 如申請專利範圍第1項之神經營養因子蛋白質， 其係爲雙硫鍵鍵結二聚體之型式。 3. 如申請專利範圍第1項之神經營養因子蛋白質， 其係爲糖基化。 4. 如申請專利範圍第1項之神經營養因子蛋白質， 其係爲非糖基化β 5. 如申請專利範圍第1項之神經營養因子蛋白質， 其中該胺基酸序列之胺基終端爲甲硫胺酸殘基。 6 .如申請專利範圍第1至5項中任一項之神經營養 因子蛋白質，其係由重組DN Α技術所產製。 7. —種用於預防或治療神經損傷之藥學組成物，其 係包含有效含量之如申請專利範圍第1項之蛋白質及一種 藥學上適當之載體。 8. 如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中該神 經營養因子蛋白質係由重組DN A技術所產製。 9. 如申請專利範圍第8項之藥學組成物，其中該蛋 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐）-2 - • r I —— — — I -—III — —— » — — — — — — — — — — — — — — — I. (請先閱讀嘴面之注意事項再填寫本頁) A8 B8 C8 D8 _ 六、申請專利範圍 白質之胺基終端爲甲硫胺酸殘基。 1 〇.—種編碼神經膠質細胞系衍生之神經營養因子 蛋白質（GDNF)的核酸序列，其係具有： (a )如下所示SEQ ID N0:3編碼鼠GDNF之核替 酸序列 I TCA CCA G&T AAA CAA GCG GCG GCA CTT CCT CGA AlGA GAG AGG AAC CGG CXA GCT GCA GCT GCC AGC CCA GAG A AT TCC AGA f^GG AAA GGT CCC AGA GGC CAG AGG GGC AAT CGG GGG TGr GTC ΤΓλ >1CT GCA ΑΤΑ CAC .TTA AAT GTC ACT GAC TTR GGT TTG GGC TAC GAA ACC. AAG GAG - ! GftA CTG ATC TTT CGA TAT TGT AGC GCT TCC TGT ΟΑΔ GCG GCC dAG.ACA ATG XAC GAC AAA JVTJ^CTA AAA AAT CTG TCT CGi. AGT ACA AGG 〇ΪΑ...Α〇Α >GT G^C AAG GTA CAG GC\ TGT X.QG AGG CCG GTC GCC TTC GAC GAC GA>C CTG ：TC& TTT T〇3 GAC GAC AGC CITG. G.TT TAP CATJTC· CTA-flGA AAG I CAT TCC GCT AAA CGG XGT GGA ΤβΤ hTC 或如下所示SEQ ID N 0: 5編碼人類GDNF 之核苷酸序列 TCA CCA GAT AAA CAA .ATG GCA QTG C.TT CCT AGA AGA .GAG· tfiG AAT ! CGG CAG GCT GCA GCT GCC AAC CCA GAG AAT TCC AGA GGA ..AAA ：Q.GT. C.GQ AGA ncc CXG AGG GGC AAC CGG GGT TGT .GTC ΤΤΛ ^CT GCA -iVTA. CAT I TTA RAT QTC A>CT GAC. TTG GGT： CTG GGC TAT. QAA ACC AAG GAG !GAA CTG i ATT ΈΤΤ AGG TAC T.GC AGC GGC TCT .TGC GAT GCA GCT GAG ACA iACG TAC. G^C AAA ATA TTG ΑΛΓ TTf.-JCC AGA AAT AGA AGG CTG. GTJa.!^CT CAC AAA GTA GGG CAG OTA TGT TGC AGA CCC ATC GCC TTT QAT GAT iGAC CTG I TPG TTT TTA GAT GAT A^C CTG GTT TAC CAT.ATT CT^ AGA AAG ΐXT TCC ! ： GCT AAA AGG TGT GGA TGT ATC 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐）-3 - ---------------I---I ---I----^ , (請先閱讀嘴面之注意事項再填寫本頁) A8B8C8D8 六、申清專利範圍 或其簡併序列：或 (b )編碼如SEQ ID N0:4或6所示之胺基酸序列的 核苷酸序列； 其中’該神經營養因子蛋白質具有促進多巴胺神經元 吸收多巴胺之能力。 1 1.如申請專利範圍第1 0項之核酸序列’其中該 核Μ酸序列係爲： TCA CCA GAT AAA CAA GCG GCG GCA CTT CCT CGA AGA GAG Ser Pro Asp Lys Gin Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu 1 5 10 AGG AAC CGG CAA GOT GCA GCT GCC AGC CCA GAG AAT TCC AGA GGG AAA Axg Aan Arg Gin Ala Ala Ala Ala Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys 15 20 25 GGT CGC AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAT CGG GGG TGC GTC TTA ACT GCA Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala 3〇 35 40 45 ATA CAC TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT TTG GGC TAC GAA ACC AAG GAG lie His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly .Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu SO 55 60 GAA CTG ATC TTT CGA TAT TGT AGC GGT TCC TGT GAA GCG GCC GAG ACA Glu Leu lie Phe Aig Tyr Cys Ser Gly. Ser Cys Glu Ala Ala Glu Thr 65 70 75 ATG TAC GAC AAA ATACTA- AAA AAT CTG XCT CGA AGT AGA AGG CTA ACA Met Tyr Asp Lya lie Leu Lys Aan Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr 80 85 90 AGT GAC AAG GTA GGC CAG GCA TGT TGC AGG CCG GTC GCC TTC GAC GAC Ser Asp Lys Val Gly Gin Ala Cys Cya Arg Pro Val Ala Phe Asp Asp 95 100 105 GAC CTG TCG TTT TTA (3AC GAC AGC CTG GTT TAC CAT ATC CTA AGA AAG Aap Leu Ser Phe Leu Asp Asp Ser Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys 110 115 120 125 CAT TCC GCT AAA CGG TGT GGA TGT ATC His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys lie 130 1 2.如申請專利範圍第1 〇項之核酸序列’其中該 核苷酸序列係爲： 本紙張尺度適用巾關家標準(CNS)A4規格（210 X 297公髮）-4 _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) '裝 訂---------線 經濟部智慧財產苟員!-消費合泎f£.;fM Α 、申請專利範圍 Α8 Β8 C8 D8 TCA CCA GAT AAA CAA ATG GCA GTG CTT CCT AGA AGA GAG CGG AAT Ser Pro Asp Lys Gin Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn 1 5 10 15 CGG CAG GCT GCA GCT GCC AAC CCA GAG AAT TCC AGA GGA AAA GGT CGG Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg 20 25 30 AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAC CGG GGT TGT GTC TTA ACT GCA ATA CAT Arg Gly Gin Arg Gly Lys Aan Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala lie His 35 40 45 TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT CTG GGC TAT GAA ACC AAG GAG GAA CTG Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu 50 55 60 ATT TTT AGG TAC TGC AGC GGC TCT TGC GAT GCA GCT GAG ACA ACG TAC He Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr. Thr Tyr 65 70 75 GAC AAA ATA TTG AAA AAC TTA TCC AGA AAT AGA AGG CTG GTG ACT GAC Asp Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp 60 85 90 95 AAA GTA GGG CAG GCA TGT TGC AGA CCC ATC GCC TTT GAT GAT GAC CTG Lys Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro lie Ala Phe Asp Asp Asp Leu 100 105 110 TCG TTT TTA GAT GAT AAC CTG GTT TAC CAT ATT CTA AGA AAG CAT TCC Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys His Ser 115 120 125 GCT AAA AGG TGT GGA TGT ATC Ala Lys Arg Cys Gly Cys lie 130 (請先閱讀嘴面之注意事項再填寫本頁) Ά--------^-------— 經濟部智慧財產局員工消費合作：ώ印製 1 3.—種核酸序列，其係編碼神經膠質細胞系衍生 之神經營養因子蛋白質，該神經營養因子蛋白質具有如下 所示SEQ ID N0: 6之胺基酸序列 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐）-5 - 401^^2 B8 C8 _______ D8 六、申請專利範圍 Ser Pro Asp Lya Gift Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Aan Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Aan Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala He His Leu (請先閱讀嘴面之注意事項再填寫本頁) Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu lie Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro lie Ala Fhe Asp Aap Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Aan Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys lie • . 其中，該蛋白質之胺基終端爲甲硫胺酸殘基。 1 4.一種產製神經膠質細胞系衍生之神經營養因子 之方法’其係包含培養一經轉形或轉移感染之C0S或大腸 桿菌宿主細胞，該宿主細胞含有用於表現申請專利範圍第 1至5項中任一項之神經膠質細胞系衍生之神經營養因子 蛋白質的表現載體，其培養條件係適於該宿主細胞表現該 蛋白質。 1 5.—種產製神經膠質細胞系衍生之神經營養因子 之方法，其係包含培養一經轉形或轉移感染之C0S或大腸 桿菌宿主細胞’該宿主細胞含有用於表現如申請專利範圍 第1 0項之核酸序列的表現載體，其培養條件係適於該宿 主細胞表現該神經膠質細胞系衍生之神經營養因子蛋白質 〇 1 6.如申請專利範圍第1 4或1 5項之方法，其係 進一步包含分離由該宿主細胞所表現之神眉膠質細胞系衍 生之神經營養因子的步驟。 本紙張尺度適用中國國家@(CNS)A4規格（21〇 X 297公Μ ) - 6 - A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 1 7·如申請專利範圍第1 4或1 5項之方法，其係 進一步包含再摺疊該神經膠質細胞系衍生之神經營養因子 的步驟。 1 8.如申請專利範圍第1 6項之方法，其係進一步 包含再摺疊該神經膠質細胞系衍生之神經營養因子的步驟 〇 1 9.—種抗體，其生成係拮抗且鍵結至具有如SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6所示之胺基酸序列的神經營養性 蛋白質。 2 0.如申請專利範圍第i 9項之抗體，該抗體係爲 單株抗體》 2 1.如申請專利範圍第1 9項之抗體，該抗體係爲 多株抗體。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210^ 297公釐）-7 - (請先閱讀臂面之注意事項再填寫本頁) '裝！ 訂!-線*
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