ES2308800T3 - Metodos para la produccion de proteinas. - Google Patents
Metodos para la produccion de proteinas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2308800T3 ES2308800T3 ES98903438T ES98903438T ES2308800T3 ES 2308800 T3 ES2308800 T3 ES 2308800T3 ES 98903438 T ES98903438 T ES 98903438T ES 98903438 T ES98903438 T ES 98903438T ES 2308800 T3 ES2308800 T3 ES 2308800T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- inclusion
- recombinant
- proteins
- thioredoxin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/24—Extraction; Separation; Purification by electrochemical means
- C07K1/26—Electrophoresis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
- C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/13—Labelling of peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Método de preparación de una composición de marcador del peso molecular, que comprende incubar proteínas recombinantes de diferente peso molecular con colorante de unión a proteínas, en el que se incuba una primera proteína recombinante con un primer colorante de tinción de proteínas y se incuba una pluralidad de proteínas recombinantes de pesos moleculares que difieren de dicha primera proteína recombinante y entre sí con un segundo colorante de tinción de proteínas de diferente color con respecto al primer colorante de tinción de proteínas, incubándose las proteínas con dichos colorantes en una disolución acuosa tamponada en condiciones de temperatura, tiempo y pH de la disolución controladas.
Description
Métodos para la producción de proteínas.
La presente invención está en los campos de la
biología molecular y de la ingeniería de proteínas. La invención se
refiere a métodos para la producción de proteínas recombinantes. Más
específicamente, la invención se refiere a métodos para la
producción de marcadores del peso molecular de proteínas y a
marcadores del peso molecular producidos mediante estos
métodos.
Con el advenimiento de la tecnología del ADN
recombinante, se ha convertido casi en rutina producir grandes
cantidades de proteínas en sistemas de expresión heterólogos, tales
como células huésped transformadas, para fines comerciales y de
investigación básica. Entre los sistemas huésped de expresión, E.
coli es el sistema más popular debido a la facilidad con la que
puede manipularse E. coli. Sin embargo, la expresión de
proteínas heterólogas en células huésped tiene algunas
limitaciones. Estas incluyen: la traducción ineficaz de ARNm debido
a la presencia de codones raramente usados (Kane, J., Current Opin.
Biotech 6:494-500 (1995)), la inestabilidad del
mRNA en E. coli (Bachmair, A et al., Science
234:179-186 (1986); Olins, P & Lee, S, Current
Opin. Biotech 6:501-506 (1993)), el efecto tóxico
de la proteína que está expresándose (Brosius, J., Gene
27:161-172 (1984); Studier, W & Mofatt, B., J.
Mol Biol. 189:113-130 (1986)) y la formación de
cuerpos de inclusión debido al plegamiento inapropiado de la
proteína (Schein, C., Bio/Technology 7.1141-1149
(1989); Mitraki, A & King, J, Bio/Technology
7:690-697 (1989)). Para resolver estos problemas, se
han desarrollado una variedad de técnicas.
La fusión génica es una de las estrategias más
populares para expresar proteínas de interés. Esta técnica
particular se usa para producir grandes cantidades de proteína
heteróloga fusionando la proteína de interés con el extremo
carboxilo terminal de una pareja de fusión (LaVallie, E., y McCoy,
J., Curr. Opin. Biotech 6:501-506). Como ejemplo de
este enfoque, se han desarrollado métodos para el aislamiento
selectivo de una proteína o polipéptido deseados construyendo un
vector recombinante que contiene una secuencia de ADN que codifica
para la proteína o polipéptido deseados que está operativamente
unida a una secuencia de ADN que codifica para la proteína A
(documento WO 84/03103). Entonces se aísla selectivamente la
proteína de fusión expresada mediante adsorción sobre un vehículo
de soporte de IgG, que se une a la proteína A, seguido por
desorción de la proteína de fusión. Entonces se escinde la proteína
de fusión en un único sitio de escisión con un agente de escisión,
que puede incluir proteasas, hidroxilamina, bromuro de cianógeno o
ácido fórmico, para dar la proteína purificada.
La mayoría de los sistemas usados para la
fabricación de polipéptidos recombinantes intenta minimizar la
producción del polipéptido en cuerpos de inclusión en las células
huésped de expresión. Una razón importante para estos intentos es
que la producción de polipéptidos en cuerpos de inclusión a menudo
produce un polipéptido bioquímicamente inactivo, desnaturalizado o
por lo demás funcional o estructuralmente comprometido tras su
liberación de los cuerpos de inclusión mediante técnicas de
solubilización convencionales. Aunque una variedad de métodos han
mostrado ser prometedores para minimizar la formación de cuerpos de
inclusión, se han utilizado técnicas de fusión génica en particular
para producir proteínas solubles que de otra forma se habrían
producido como cuerpos de inclusión.
Sin embargo, la formación de cuerpos de
inclusión dentro de células huésped también puede ser ventajosa. Por
ejemplo, los cuerpos de inclusión constituyen "paquetes"
sumamente densos y concentrados del polipéptido deseado, de los que
pueden eliminarse proteínas de la célula huésped contaminantes
mediante métodos tan sencillos como la centrifugación. Tras su
aislamiento, la transformación controlada de los cuerpos de
inclusión en una forma soluble podría proporcionar una fuente rica
del polipéptido deseado en su forma pura, biológicamente activa o
estructuralmente intacta. Sin embargo, la dificultad con un enfoque
de este tipo ha sido que habitualmente es casi imposible predecir
si un polipéptido recombinante formará o no cuerpos de inclusión
cuando se expresa en una célula huésped.
Las realizaciones de la invención se refieren a
un sistema en el que se usa la formación controlada de cuerpos de
inclusión para producir un polipéptido deseado. Mediante esta
formación controlada de cuerpos de inclusión, la purificación del
polipéptido deseado se hace más rápida y más completa, y la
solubilización controlada posterior de los cuerpos de inclusión
proporciona un alto rendimiento de polipéptido puro en su forma
activa.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un método de preparación de una composición de marcador del peso
molecular que comprende incubar proteínas recombinantes de diferente
peso molecular con colorante de unión a proteínas, en el que cada
proteína comprende una o más copias de un primer polipéptido
recombinante, y se incuba una primera proteína recombinante con un
primer colorante de tinción de proteínas y se incuba una pluralidad
de proteínas recombinantes de pesos moleculares que difieren de
dicha primera proteína recombinante y entre sí con un segundo
colorante de tinción de proteínas de diferente color con respecto al
primer colorante de tinción de proteínas, incubándose las proteínas
con dichos colorantes en una disolución acuosa tamponada en
condiciones de temperatura, tiempo y pH de la disolución
controladas.
En otro aspecto, la invención proporciona una
composición de marcador teñido del peso molecular de proteínas que
comprende proteínas recombinantes, en la que cada proteína tiene un
peso molecular diferente con respecto a todas las otras proteínas
en la composición, las proteínas comprenden una o más copias de un
primer polipéptido recombinante, y una de las proteínas
recombinantes está teñida con un colorante que está coloreado de
manera diferente del colorante que tiñe las otras proteínas
recombinantes.
Puede teñirse cualquier número de proteínas o
péptidos según la invención. Tales métodos de tinción pueden
realizarse sobre proteínas diferentes (de tamaño y/o tipo diferente)
al mismo tiempo o por separado. Si se desea, pueden mezclarse
proteínas teñidas por separado tras su tinción para proporcionar una
mezcla de proteínas teñidas que tienen tamaños diferentes para
producir un marcador del peso molecular de proteínas de la
invención. Preferiblemente, el marcador del peso molecular de la
invención comprende al menos dos y preferiblemente al menos tres
proteínas de tamaños diferentes. Más preferiblemente, los marcadores
del peso molecular de la invención comprenden 3-20,
todavía más preferiblemente 3-15 y todavía más
preferiblemente 3-10 proteínas de tamaños
diferentes.
La invención proporciona marcadores teñidos del
peso molecular producidos según los métodos de la invención y kits
que los contienen. Tales kits comprenden un medio de soporte, tal
como una caja, cartón o similar, que está compartimentalizado para
recibir en confinamiento estrecho en el mismo uno o más medios de
recipiente tales como tubos, viales, ampollas, frascos o similares,
en el que un primer medio de recipiente comprende uno o más
polipéptidos teñidos de la invención o uno o más marcadores teñidos
del peso molecular de la invención. Pueden proporcionarse varios
recipientes individuales en un kit, conteniendo cada recipiente un
polipéptido teñido de tamaño (y/o tipo) diferente, de modo que el
usuario final pueda preparar selectivamente diferentes marcadores
del peso molecular que tengan una combinación diferente de proteínas
de tamaño diferente. Por tanto, la descripción proporciona al
usuario final flexibilidad para preparar un marcador del pero
molecular apropiado dependiendo de las necesidades. Además, los
kits también pueden proporcionar recipientes separados que contienen
polipéptidos teñidos de manera diferente (por ejemplo, teñidos con
colorantes diferentes), proporcionando así al usuario final
flexibilidad no solo para variar el tamaño o patrón del marcador del
peso molecular, sino también el color o los colores atribuidos a
los péptidos o bandas individuales en el marcador del peso
molecular. Los kits pueden comprender además uno o más medios de
recipiente adicionales que contienen componentes que facilitan el
análisis del tamaño de las proteínas, tales como acrilamida, SDS,
reactivos y/o equipo de electroforesis en gel o capilar y
similares.
Otras realizaciones preferidas de la presente
invención resultarán evidentes para un experto habitual a la luz de
los siguientes dibujos y descripción de la invención, y de las
reivindicaciones.
La figura 1 (SEQ ID NO: 1) es una representación
del fragmento de AvaI (gen 32) de 264 pb derivado de
pPrL2107 usado para preparar multímeros en pPrL2001.
La figura 2 (SEQ ID NO: 2) es una representación
del fragmento de 261 pb con un único sitio AvaI usado para
preparar el plásmido ptcprl-monómero.
La figura 3 (SEQ ID NO: 5) es una representación
de la secuencia de tiorredoxina delta, plásmido pTrxfusprl10A,
usada para preparar la proteína de 10 kD.
La figura 4 (SEQ ID NO: 8) es una representación
de la secuencia de trxA-concat que tiene sitios NcoI
y NdeI usada para preparar concatámeros. Este plásmido,
denominado pTrxA-concat, sirvió como pareja de
inclusión.
La figura 5 (SEQ ID NO: 11) es una
representación de la secuencia de tiorredoxina delta usada para
preparar concatémeros de trxAtrxA.
La figura 6 (SEQ ID NO: 14) es una
representación del fragmento de pareja de fusión de
Dead-box de 138 pb usado para preparar el marcador
del peso molecular mediante fusión con
pTrxA-concat.
La figura 7 (SEQ ID NO: 17) es una
representación del fragmento de pareja de fusión de KpnI
metilasa de 15 kD usado para preparar el marcador del peso
molecular mediante fusión con pTrxA-concat.
La figura 8 es una fotografía en color de un gel
de gradiente de SDS-PAGE al 4-20% de
cuatro volúmenes de carga diferentes de los marcadores teñidos
previamente del peso molecular, que muestra la banda de referencia
de 50 kD teñida con isotiocianato de eosina (banda rosa) y las
bandas restantes en el marcador del peso molecular teñidas con RBBR
(bandas azules).
La figura 9 es una fotografía de un gel de
gradiente de SDS-PAGE al 4-20% de
proteínas de referencia de 50 kD (carriles 1-8) y
60 kD (carriles 9-13) teñidas previamente durante la
noche con isotiocianato de eosina a temperatura ambiente (carriles
1-4 y 9-12) o a 50ºC (carriles
5-8 y 13) a los pH indicados. M: marcadores
patrones del peso molecular (dos preparaciones diferentes).
La figura 10 es una fotografía de un gel de
gradiente de SDS-PAGE al 4-20% de
marcadores del peso molecular de 40 kD (carriles
1-12) y 50 kD (carriles 13, 14) teñidos previamente
durante la noche con isotiocianato de eosina a temperatura ambiente
(carriles 1-3, 7-9) o a 50ºC
(carriles 4-6, 10-14) a los pH
indicados. M: marcador patrón del peso molecular.
La figura 11 es una fotografía de un gel de
gradiente de SDS-PAGE al 4-20% de
marcadores del peso molecular de 50 kD teñidos previamente durante
la noche con isotiocianato de eosina a temperatura ambiente
(carriles 1-3, 7-9) o a 50ºC
(carriles 4-6, 10-14) a los pH
indicados. M: marcador patrón del peso molecular.
La figura 12 es una fotografía de un gel de
gradiente de SDS-PAGE al 4-20% de
marcadores del peso molecular de 30 kD (carriles 1, 5, 12), 40 kD
(carriles 2, 7, 10), 50 kD (carriles 3, 8, 11) y 60 kD (carriles 4,
6, 9) teñidos previamente con Procion rojo (carriles
1-4) o con isotiocianato de esosina (carriles
5-12) a los pH indicados. M: marcadores patrones
del peso molecular (dos preparaciones diferentes).
La figura 13 es una fotografía de un gel de
gradiente de SDS-PAGE al 4-20% de
marcadores del peso molecular de 30 kD (carriles
1-2), 40 kD (carriles 3-4), 50 kD
(carriles 5-6) y 60 kD (carriles
7-8) teñidos previamente con isotiocianato de verde
malaquita a los pH indicados. M: marcadores patrones del peso
molecular (dos preparaciones diferentes).
En la descripción que sigue, se utilizan
ampliamente varios términos usados convencionalmente en los campos
de la biología molecular y la ingeniería de proteínas. Con el fin de
proporcionar un entendimiento claro y sistemático de la memoria
descriptiva y las reivindicaciones, y del alcance que se le da a
tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones.
El término "polipéptido" se usa en el
presente documento para significar una secuencia de aminoácidos
contiguos, de cualquier longitud. Tal como se usa en el presente
documento, los términos "péptido" o "proteína" pueden
usarse de manera intercambiable con el término
"polipéptido".
La expresión "molécula de ácido nucleico"
tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia
de nucleótidos contiguos que pueden codificar para un polipéptido de
longitud completa o un fragmento de cualquier longitud del mismo, o
puede ser no codificante.
La expresión "proteína de pareja de
inclusión" se usa en el presente documento para significar
cualquier proteína o fragmento, parte, derivado o variante de los
mismos que forma cuerpos de inclusión tras su expresión en una
célula huésped; pueden fusionarse moléculas de ácido nucleico que
codifican para proteínas de pareja de inclusión con las que
codifican para polipéptidos de interés con el fin de provocar que el
polipéptido de interés se exprese conjuntamente en forma de cuerpos
de inclusión en una célula huésped.
La expresión "constructo de fusión génica"
tal como se usa en el presente documento significa una molécula de
ácido nucleico que es el producto de la fusión o el ligamiento
operativo de una molécula de ácido nucleico que codifica para un
polipéptido de interés con una molécula de ácido nucleico que
codifica para una proteína de pareja de inclusión. Un constructo de
fusión génica tal como se define en el presente documento puede
incluir secuencias de ácido nucleico adicionales que comprenden
señales de expresión (tales como promotores o potenciadores) que se
reconocen por una célula huésped y que dirigen la expresión del
constructo de fusión génica para producir el polipéptido de
interés.
Las frases "sustancialmente todos los
polipéptidos se complejan con un colorante" o "sustancialmente
todos los polipéptidos se tiñen con un colorante" o
"sustancialmente todos los polipéptidos se marcan con un
colorante" pueden usarse de manera intercambiable y tal como se
usan en el presente documento significan que sustancialmente todos
los polipéptidos o las proteínas en una muestra se han complejado,
teñido o marcado completamente o de manera sustancialmente completa
con uno o más colorantes. Puede determinarse tal finalización de la
tinción mediante cualquiera de varias técnicas analíticas, aunque
se prefiere el análisis de la movilidad y la intensidad de tinción
mediante electroforesis en gel (véanse los ejemplos más adelante).
Por ejemplo, la tinción incompleta o parcial de una muestra de
proteínas da como resultado una población heterogénea de proteínas,
cada una de las cuales puede tener una movilidad diferente durante
la electroforesis en gel. Sin embargo, tras la tinción completa o
sustancialmente completa, la movilidad permanecerá sustancialmente
sin cambios incluso tras la tinción adicional (es decir, incubación
adicional con colorante). Por tanto, puede medirse la tinción
completa o sustancialmente completa mediante tales cambios de
movilidad, o la carencia o carencia sustancial de los mismos.
Alternativamente o además de tales cambios de movilidad, puede
determinarse la finalización de la tinción mediante cambios en la
intensidad de tinción. Por tanto, tras la tinción completa o
sustancialmente completa según la invención, la intensidad de
tinción de una muestra de proteínas de interés, determinada por
ejemplo mediante electroforesis en gel, no cambiará sustancialmente
tras la tinción adicional (es decir, incubación adicional con
colorante).
La invención proporciona métodos para preparar
un marcador del peso molecular de proteínas, que está teñido
previamente, y un marcador del peso molecular de proteínas producido
mediante estos métodos.
La presente memoria descriptiva también da a
conocer un método para producir y aislar polipéptidos recombinantes
a partir de células huésped, en el que se producen los polipéptidos
recombinantes como cuerpos de inclusión en las células huésped. Por
conveniencia, este aspecto de la descripción se describe en primer
lugar a continuación, antes de la invención. Específicamente, el
método implica (a) obtener una célula huésped que comprende una
primera molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido
recombinante operativamente unida a una segunda molécula de ácido
nucleico que codifica para una proteína de pareja de inclusión,
formando de ese modo un constructo de fusión génica; y (b) cultivar
la célula huésped anterior en condiciones que favorecen la
producción del polipéptido como cuerpos de inclusión en la célula
huésped. La invención también proporciona el método anterior que
comprende además (c) aislar los cuerpos de inclusión a partir de la
célula huésped, lo más preferiblemente mediante centrifugación; y
(d) liberar el polipéptido de los cuerpos de inclusión. Según la
presente invención, puede obtenerse la primera molécula de ácido
nucleico que codifica para el polipéptido a partir de una célula
procariota, particularmente una célula bacteriana y lo más
particularmente una célula de Escherichia coli, o a partir
de una célula eucariota, particularmente una célula animal, una
célula vegetal o una célula de levaduras, más particularmente una
célula animal de mamífero y lo más particularmente una célula
humana, y la segunda molécula de ácido nucleico que codifica para la
proteína de pareja de inclusión puede obtenerse a partir de
cualquier célula, preferiblemente una célula bacteriana y lo más
preferiblemente una célula de Escherichia coli. La proteína
de pareja de inclusión puede ser cualquier proteína que forme un
cuerpo de inclusión tras su expresión en una célula huésped, y es
preferiblemente una proteína bacteriana, más preferiblemente una
tiorredoxina bacteriana o una tiorredoxina bacteriana modificada y
lo más preferiblemente una forma truncada en el extremo carboxilo
terminal de tiorredoxina de E. coli tal como se describe en
más detalle a continuación. Preferiblemente, se inserta el
constructo de fusión génica en un vector antes de introducirse en
la célula huésped. Según un aspecto de la descripción, el
polipéptido de interés puede liberarse de los cuerpos de inclusión,
formados por el constructo de fusión génica, mediante escisión con
un producto químico tal como bromuro de cianógeno, o más
preferiblemente con una enzima tal como trombina o enterocinasa.
Según otro aspecto, puede colocarse una secuencia de ácido nucleico
que codifica para un sitio de escisión específico de proteína entre
la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de
pareja de inclusión y el polipéptido recombinante en el constructo
de fusión génica; tras la expresión de la proteína de fusión como
cuerpos de inclusión en las células huésped, puede liberarse
entonces el polipéptido recombinante de los mismos mediante el
tratamiento de los cuerpos de inclusión con una enzima u otro
producto químico que reconoce y escinde específicamente en el sitio
de escisión específico de proteína. La descripción también
proporciona los métodos descritos anteriormente en los que el
constructo de fusión génica comprende el plásmido
pTreprl-monómero y proporciona el plásmido
pTrcprl-monómero. La descripción también se refiere
a los métodos descritos anteriormente en los que la célula huésped
es una célula bacteriana, lo más preferiblemente una célula de
Escherichia coli, y en los que el vector usado es un vector
de expresión, lo más preferiblemente los plásmidos pTrc99A o
pTrxfus. La descripción también proporciona estos vectores y células
huésped, particularmente células bacterianas y lo más
particularmente células de Escherichia coli, que comprenden
estos vectores. La descripción proporciona además polipéptidos
recombinantes preparados mediante los métodos anteriores, el
plásmido pTrcprl-monómero y el plásmido
pTrxA-concat.
Aunque la presente descripción se refiere
particularmente a métodos para la producción de un fragmento de la
proteína del gen 32 del bacteriófago T4, KpnI metilasa o
proteína Dead-Box, un experto habitual en la
técnica apreciará fácilmente que, usando los métodos de la
descripción, puede producirse cualquier polipéptido que comprenda
una secuencia de aminoácidos contiguos de cualquier longitud como
cuerpos de inclusión en una célula huésped y aislarse de la
misma.
Los métodos de la presente descripción utilizan
la técnica de fusión génica para producir un constructo de fusión
génica que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica para
un primer polipéptido operativamente unida a una segunda molécula
de ácido nucleico que codifica para una proteína de pareja de
inclusión. La molécula de ácido nucleico que codifica para el
primer polipéptido puede obtenerse a partir de una célula
bacteriana, particularmente una célula de E. coli; a partir
de una célula animal, preferiblemente una célula de mamífero y lo
más preferiblemente una célula humana; una célula vegetal; o una
célula de levaduras. Tal como se describe en más detalle a
continuación, la molécula de ácido nucleico que codifica para la
proteína de pareja de inclusión puede obtenerse a partir de
cualquier célula, preferiblemente a partir de una célula bacteriana
y lo más preferiblemente a partir de una célula de Escherichia
coli.
Se conocen bien en la técnica métodos para la
construcción de constructos de fusión génica que comprenden una
secuencia de ADN que codifica para un polipéptido deseado, fusionada
con una secuencia de ADN procariótico (véase, por ejemplo,
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2ª Ed., Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, págs. 17.2-17.9 (1989); Ausubel,
FM, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology,
Nueva York: John Wiley & Sons, Inc., pág.
16.4.1-16.8.14 (1994)) También pueden usarse de
manera equivalente en los métodos de la presente invención otros
métodos adecuados que son rutinarios para un experto habitual en la
técnica.
La presente descripción también se refiere a
vectores que comprenden las moléculas de ADN aisladas de la presente
invención, a células huésped que se modifican mediante ingeniería
genética con los vectores recombinantes y a métodos para la
producción de un polipéptido recombinante usando estos vectores y
células huésped.
El vector usado en la presente descripción puede
ser, por ejemplo, un fago o un plásmido, y es preferiblemente un
plásmido. Se prefieren vectores que comprenden regiones de control
que actúan en cis para el ácido nucleico que codifica para el
polipéptido de interés. Pueden suministrarse por el huésped factores
que actúan en trans apropiados, suministrarse por un vector de
complementación o suministrarse por el propio vector tras su
introducción en el huésped.
En ciertas realizaciones preferidas con respecto
a esto, los vectores proporcionan una expresión específica, que
puede ser inducible y/o específica del tipo celular. Se prefieren
particularmente entre tales vectores aquellos inducibles por
factores medioambientales que son fáciles de manipular, tales como
temperatura y aditivos nutritivos.
Los vectores de expresión útiles en la presente
descripción incluyen vectores derivados de cromosomas, episomas y
virus, por ejemplo vectores derivados de plásmidos bacterianos o
bacteriófagos, y vectores derivados de combinaciones de los mismos,
tales como cósmidos y fagémidos.
El inserto de ADN debe unirse operativamente a
un promotor adecuado, tal como el promotor PL del fago lambda, los
promotores lac, trp y lac de E. coli. El
experto conocerá otros promotores adecuados. Los constructos de
fusión génica contendrán además sitios para la iniciación de la
transcripción, terminación y, en la región transcrita, un sitio de
unión a ribosomas para la traducción. La parte codificante de los
transcritos maduros expresados por los constructos incluirá
preferiblemente un codón de iniciación de la traducción al comienzo
y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) colocado apropiadamente
al final del polinucleótido que va a traducirse.
Los vectores de expresión incluirán
preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Tales marcadores
incluyen genes de resistencia a tetraciclina o ampicilina para
cultivar en E. coli y otras bacterias.
Entre los vectores preferidos para su uso se
incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles de
Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript,
pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene; pcDNA3
disponible de Invitrogen; y pGEX, pTrxfus, pTrc99a,
pET-5, pET-9,
pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5
disponibles de Pharmacia. Otros vectores adecuados resultarán
fácilmente evidentes para el experto.
Los ejemplos representativos de células huésped
apropiadas incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas
tales como E. coli, Streptomyces spp, Erwinia
spp, Klebsiella spp. y Salmonella typhimurium. Se
prefiere como célula huésped E. coli y se prefieren
particularmente las cepas DH10B y Stbl2 de E. coli, que
están disponibles comercialmente (Life Technologies, Inc; Rockville,
Maryland).
Se ha descubierto inesperadamente que el uso de
una versión modificada del gen que codifica para la proteína de
pareja de inclusión inducirá a la célula huésped para producir la
proteína de fusión, que comprende el polipéptido de interés, como
cuerpos de inclusión intracelulares. Tal como se usa en el presente
documento, la expresión "versión modificada de un gen"
significa una versión de un gen que comprende una alteración de la
secuencia normal o más comúnmente encontrada del gen, que da como
resultado la expresión de la proteína codificada, en un estado
fusionado o no fusionado, en cuerpos de inclusión en una célula
huésped. Tales alteraciones pueden incluir, pero no se limitan a,
deleciones, sustituciones, inserciones, mutaciones puntuales y
similares.
Las proteínas de pareja de inclusión preferidas
para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan
a, versiones modificadas de la proteína de unión a maltosa de E.
coli (Betton y Hofnug, J. Biol. Chem.
271:8046-8052 (1996)), ARNasa II de E. coli
(Coburn y Mackie, J. Biol. Chem. 271:1048-1053
(1996)), fosfatasa alcalina de E. coli (Derman y Beckwith,
J. Bacteriol. 177:3764-3770 (1995); Georgiou et
al., Appl. Env. Microbiol. 52.1157-1161
(1986)), fosfolipasa A de E. coli (Dekker et al., Eur.
J. Biochem. 232.214-219 (1995)),
\beta-lactamasa de E. coli (Rinas y Bailey,
Appl. Env. Microbiol. 59: 561-566 (1993); Georgiou
et al., Appl. Env, Microbiol. 52.1157-1161
(1986)), proteína MalK de Salmonella typhimurium (Schneider
et al., Prot. Exp. Purif. 6:10-14 (1995)),
endoglucanasa D de Clostridium thermocellum (Tokatlidis
et al., FEBS Lett. 282:205-208 (1991)),
proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis subsp.
aizawai IPL7 (Oeda et al., J. Bacteriol.
171.3568-3571 (1989), procatepsina B humana (Kuhelj
et al., Eur. J Biochem. 229:533-539 (1995)),
interferón-\gamma porcino (Vandenbroeck et
al., Eur. J. Biochem. 215:481-486 (1993)), ADN
polimerasa de T5 (Chatterjee et al., Gene
97:13-19 (1991)) y tiorredoxina de E. coli
(Hoog et al., BioSci. Rep. 4:917-923 (1984)).
Más preferible para su uso en la presente invención es una
tiorredoxina de E. coli modificada, que tal como se usa en el
presente documento es una proteína tiorredoxina que tiene la
capacidad de formar cuerpos de inclusión (en constructos fusionados
o no fusionados) tras su expresión en una célula huésped. Se
prefiere particularmente un mutante por deleción de la tiorredoxina
de E. coli codificada por el gen trxA, y lo más
particularmente la forma truncada en el extremo carboxilo terminal
de trxA de E. coli que tiene una secuencia de
nucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO: 8, designada a
continuación en el presente documento pTrxA-concat.
La célula huésped recombinante que comprende
pTrxA-concat, DH10B de E. coli
(pTrxA-concat), se depositó el 6 de enero de 1997
en la Colección de Cultivos de Investigación Agrícola (Agricultural
Research Culture Collection) (NRRL), 1815 North University Street,
Peoria, Illinois 61604 EE.UU., como depósito número NRRL
B-21653.
Las versiones truncadas de trxA que
pueden usarse en la presente invención incluyen aquellas en las que
se delecionan 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,
3,3, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49
ó 50 aminoácidos del extremo carboxilo terminal de la tiorredoxina,
preferiblemente aquellas en las que se delecionan 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29, 30, 31, 32 ó 33 aminoácidos y lo más preferiblemente
aquellas en las que se delecionan 23 aminoácidos
(pTrxfusprl10A).
Un experto habitual en la técnica conoce bien
métodos para preparar y expresar constructos de fusión génica
modificados, tales como un constructo que codifica para una
tiorredoxina modificada o truncada, y se describen ampliamente en
la bibliografía (véase, por ejemplo Winnacker, From Genes to Clones,
Nueva York: VCH Publishers, págs. 451-481 (1987)),
y en detalle en los ejemplos a continuación. Para determinar si un
constructo de fusión génica modificado particular induce la
producción de cuerpos de inclusión en una célula huésped, puede
transferirse el constructo en una célula huésped y expresarse tal
como se describe a continuación. Entonces puede examinarse una
suspensión de células huésped para detectar la presencia de cuerpos
de inclusión por cualquier medio, tal como microscopía (por
ejemplo, microscopía de contraste de fases, de interferencia de
Nomarski, electrónica o de fluorescencia), adecuado para la
detección de la presencia de cuerpos de inclusión dentro de células
huésped individuales.
La secuencia de ácido nucleico de la pareja de
inclusión puede insertarse en el cromosoma de la célula huésped, o
en un vector que es preferiblemente un vector de expresión. Se
prefieren particularmente como vectores de expresión en la presente
invención vectores de expresión bien conocidos tales como pAR (para
lacZ), pATH (para trpE), pMAL (para malE),
pGEX (para GST) o pTrxfus (para trxA). Estos vectores y otros
que también pueden ser adecuados están disponibles comercialmente,
por ejemplo, de Pharmacia (Piscataway, Nueva Jersey).
Alternativamente, pueden usarse otros vectores bien caracterizados
conocidos en la técnica.
Tal como se describió anteriormente, los métodos
de la presente invención son adecuados para la producción de
cualquier polipéptido de cualquier longitud, y son particularmente
adecuados para producir polipéptidos cortos o aquellos que son
tóxicos para las células huésped, que de lo contrario no se
expresarían por las células huésped en cantidades significativas.
Se conocen bien en la técnica métodos para el aislamiento de
secuencias de ácido nucleico que codifican para un polipéptido de
interés a partir de una variedad de fuentes (véase, por ejemplo,
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2ª Ed., Cold Spring Harbor, Nueva York. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, (1989)). Una vez que se ha aislado la secuencia de
ácido nucleico que codifica para el polipéptido de interés, se
fusiona o une operativamente al ácido nucleico de la pareja de
inclusión modificada anterior, formando un vector, preferiblemente
un vector de expresión, que comprende el constructo de fusión
génica que va a usarse en la transformación de las células huésped.
Se prefiere particularmente como constructo de fusión génica el
plásmido ptcprl-monómero. Los métodos para la
fusión de la secuencia de ácido nucleico que codifica para un
polipéptido de interés con una secuencia de ácido nucleico de la
pareja de inclusión truncada y la inserción en un vector de
expresión son rutinarios para un experto habitual en la técnica
(véase, por ejemplo, Ausubel, F.M., et al., eds., Current
Protocols in Molecular Biology, Nueva York: John Wiley & Sons,
Inc., págs. 16.4 1-16 8 14 (1994)).
El constructo de fusión génica puede insertarse
en el cromosoma de la célula huésped, o en un vector que es
preferiblemente un vector de expresión. La introducción del
constructo de fusión génica en la célula huésped para producir una
célula huésped transformada puede efectuarse mediante transfección
con fosfato de calcio, transfección mediada por
DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos
catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros
métodos. Tales métodos se describen en muchos manuales de
laboratorio convencionales, tales como Davis et al., Basic
Methods In Molecular Biology (1986). Una vez que se han obtenido
células huésped transformadas, pueden cultivarse las células en
cualquier condición fisiológicamente compatible de pH y temperatura,
en cualquier medio nutritivo adecuado que contenga fuentes
asimilables de carbono, nitrógeno y minerales esenciales que ayuden
al crecimiento de la célula huésped. Las condiciones de cultivo que
producen proteínas recombinantes variarán según el tipo de vector
usado para transformar las células huésped. Por ejemplo, ciertos
vectores de expresión comprenden regiones reguladoras que requieren
crecimiento celular a ciertas temperaturas, o la adición de ciertos
productos químicos o agentes inductores al medio de crecimiento
celular para iniciar la expresión génica que da como resultado la
producción del polipéptido recombinante. Por tanto, la expresión
"condiciones que producen polipéptidos recombinantes", tal como
se usa en el presente documento, no pretende limitarse a ningún
conjunto de condiciones de cultivo. Se conocen bien en la técnica
condiciones y medios de cultivo apropiados para las células huésped
y vectores descritos anteriormente.
Se ha encontrado inesperadamente que el cultivo
de las células huésped transformadas con los constructos de fusión
génica proporcionados en el presente documento dará como resultado
la producción del polipéptido recombinante de interés como cuerpos
de inclusión. Por tanto, pueden considerarse así condiciones que
producen polipéptidos recombinantes de rutina para favorecer la
producción del polipéptido recombinante como cuerpos de inclusión
en la célula huésped, y pueden usarse para producir polipéptidos
recombinantes como cuerpos de inclusión según la presente
invención, no se requiere el uso de condiciones de cultivo inusuales
o experimentación excesiva.
Tal como conoce bien un experto habitual en la
técnica, se diseñan normalmente métodos para la producción de
polipéptidos mediante técnicas de ADN recombinante para minimizar la
producción de los polipéptidos en cuerpos de inclusión en las
células huésped, debido a las dificultades reales y percibidas para
aislar los polipéptidos a partir de los cuerpos de inclusión. Sin
embargo, según la presente descripción, puede usarse ventajosamente
la producción de un polipéptido recombinante en cuerpos de inclusión
para proporcionar un aislamiento y una purificación rápidos del
polipéptido.
Tras su producción como cuerpos de inclusión en
las células huésped, el producto de fusión génica que comprende el
polipéptido de interés puede aislarse mediante varias técnicas. Para
liberar los cuerpos de inclusión de las células huésped, las
células deben lisarse o romperse. Esta lisis puede realizarse
poniendo en contacto las células con una solución hipotónica,
mediante tratamiento con una enzima que rompe la pared celular tal
como lisozima, mediante sonicación, mediante tratamiento con alta
presión o mediante una combinación de los métodos anteriores.
También pueden usarse otros métodos de ruptura y lisis de células
bacterianas que se conocen por un experto habitual.
Preferiblemente, las células bacterianas se rompen mediante
tratamiento con lisozima seguido por sonicación, tal tratamiento
producirá
una mezcla de residuos celulares que comprende los cuerpos de inclusión, que no se rompen mediante este tratamiento.
una mezcla de residuos celulares que comprende los cuerpos de inclusión, que no se rompen mediante este tratamiento.
Tras la ruptura, se separan los cuerpos de
inclusión de los residuos celulares mediante cualquier técnica
adecuada para la separación de partículas en mezclas complejas. Las
técnicas preferidas de este tipo incluyen centrifugación o el uso
de un separador de partículas automatizado tal como los disponibles
comercialmente de, por ejemplo, Coulter Electronics (Hialeah,
Florida). Lo más preferido para aislar cuerpos de inclusión es la
centrifugación. Mediante la presente invención, pueden aislarse
cuerpos de inclusión centrifugando la mezcla de residuos celulares
anterior a aproximadamente 1-25.000 x g,
preferiblemente a aproximadamente 100-20.000 x g,
más preferiblemente a aproximadamente 5.000-15.000 x
g y lo más preferiblemente a aproximadamente 10.000 x g.
Preferiblemente, se realiza la centrifugación a aproximadamente
4º-10ºC durante aproximadamente 15-60 minutos, lo
más preferiblemente a aproximadamente 4ºC durante aproximadamente 30
minutos. Tras la centrifugación, se eliminan los residuos celulares
contenidos en el sobrenadante de los cuerpos de inclusión
sedimentados y se usa el sedimento para la purificación del
polipéptido recombinante de interés.
En la preparación para la purificación, se
solubiliza el producto de fusión génica contenido en los cuerpos de
inclusión, que comprende el polipéptido recombinante. La
solubilización se realiza preferiblemente mediante tratamiento con
un agente desnaturalizante, preferiblemente clorhidrato de
guanidinio o urea, y lo más preferiblemente urea aproximadamente 8
M.
Antes, durante o tras la solubilización de los
cuerpos de inclusión, el polipéptido recombinante de interés puede
escindirse opcionalmente de la proteína de pareja de inclusión
mediante técnicas que se describen bien en la técnica (véase, por
ejemplo, Ausubel, F M, et al., eds., Current Protocols in
Molecular Biology, Nueva York: John Wiley & Sons, Inc, págs.
16.4.5-16.4.17 (1994)). Sin embargo, un experto
habitual entenderá que la producción de polipéptidos recombinantes
mediante la presente invención no requiere necesariamente tal
escisión. Esta escisión puede realizarse mediante un método de
escisión química, por ejemplo poniendo en contacto los cuerpos de
inclusión con una cantidad que libera el polipéptido de un agente de
escisión química en condiciones que favorecen la liberación del
polipéptido de los cuerpos de inclusión. Los agentes de escisión
química preferidos incluyen bromuro de cianógeno, hidroxilamina o
disoluciones de pH bajo (hidrólisis ácida). Alternativamente, y más
preferiblemente, se realiza la escisión de la proteína de pareja de
inclusión mediante un método de escisión enzimática,
preferiblemente poniendo en contacto los cuerpos de inclusión con un
cantidad que libera el polipéptido de un agente de escisión
enzimática en condiciones que favorecen la liberación del
polipéptido de los cuerpos de inclusión. Los agentes de escisión
enzimática preferidos incluyen el factor Xa (para productos de
fusión génica que comprenden una pareja de inclusión de malE
o GST) o trombina (para productos de fusión génica que comprenden
una pareja de inclusión de GST), y se prefiere particularmente
enterocinasa (para productos de fusión génica que comprenden una
pareja de inclusión de trxA). Estos métodos de escisión
química y enzimática se llevan a cabo preferiblemente en condiciones
que favorecen la liberación del polipéptido de los cuerpos de
inclusión, que se conocen bien por un experto habitual en la técnica
(véase, por ejemplo, Ausubel, F.M., et al., eds., Current
Protocols in Molecular Biology, Nueva York. John Wiley & Sons,
Inc, págs. 16.4.5-16.4.17 (1994)). Tal liberación
puede dar como resultado la solubilización del péptido de interés y
por tanto puede ser innecesaria la solubilización adicional.
Alternativamente, puede facilitarse la escisión de la proteína de
pareja de inclusión del polipéptido durante la formación del
constructo de fusión génica. En un esquema de este tipo, puede
colocarse una secuencia de ácido nucleico que codifica para un sitio
de escisión específico de proteína entre la secuencia de ácido
nucleico que codifica para la proteína de pareja de inclusión (tal
como la tiorredoxina modificada) y el polipéptido recombinante en el
constructo de fusión génica; tras la expresión de la proteína de
fusión como cuerpos de inclusión en las células huésped, entonces
puede aislarse el polipéptido recombinante tratando los cuerpos de
inclusión con una enzima (tal como trombina o enterocinasa) o un
producto químico (tal como bromuro de cianógeno) que reconoce y
escinde específicamente en el sitio de escisión específico de
proteína. La escisión de la proteína de pareja de inclusión puede
realizarse alternativamente durante o tras cualquiera de las etapas
posteriores descritas a continuación.
Tras la solubilización, el producto de fusión
génica o el polipéptido recombinante escindido pueden replegarse
mediante diálisis para eliminar el agente desnaturalizante. La
diálisis se realiza preferiblemente durante aproximadamente
18-48 horas a aproximadamente 4ºC frente a una
solución salina tamponada isotónica.
Tras la solubilización y el replegamiento
opcional, el producto de fusión génica o el polipéptido recombinante
escindido pueden purificarse mediante cualquiera de una variedad de
técnicas de purificación de proteínas que conoce bien un experto
habitual en la técnica. Las técnicas adecuadas para la purificación
incluyen, pero no se limitan a, precipitación con sulfato de amonio
o etanol, extracción con ácido, electroforesis, inmunoadsorción,
cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en
fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba,
cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad,
cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía líquida (LC),
LC de alta resolución (HPLC), LC de rápida resolución (FPLC),
cromatografía sobre hidroxiapatito y cromatografía sobre lectinas.
Lo más preferiblemente, se emplean LC, HPLC o FPLC para la
purificación.
Tal como se describió anteriormente, puede
producirse cualquier polipéptido recombinante y aislarse de las
células huésped mediante los métodos de la presente invención. En
particular, es posible producir tiorredoxina recombinante mediante
estos métodos. En un esquema de este tipo, puede producirse
tiorredoxina, o un fragmento de la misma, mediante una serie de
etapas que comprenden (a) modificar el gen de tiorredoxina, (b)
transferir el gen de tiorredoxina modificado a una célula huésped y
(c) cultivar la célula huésped en condiciones que favorecen la
producción de tiorredoxina como cuerpos de inclusión en la célula
huésped. Estas etapas de modificación, transferencia y cultivo
pueden llevarse a cabo para la tiorredoxina tal como se describió
anteriormente para la producción de cualquier polipéptido y tal
como se describe en más detalle en los ejemplos a continuación.
Pueden usarse los métodos de la presente
invención para preparar un marcador del peso molecular de proteínas
que va a usarse como patrón del tamaño molecular o el peso molecular
en técnicas de análisis de proteínas tales como la electroforesis.
En esta realización, descrita en mayor detalle a continuación en los
ejemplos 3-9, puede prepararse una serie de
proteínas de fusión, en las que se une la proteína de pareja de
inclusión a uno o más polipéptidos recombinantes o fragmentos de
los mismos. Por ejemplo, puede insertarse una molécula de ácido
nucleico que codifica para una proteína de pareja de inclusión de
tiorredoxina modificada en un vector, preferiblemente un vector de
expresión, para formar un vector de fusión tal como el plásmido
pTrxA-concat (figura 4; SEQ ID NO: 8). Entonces
puede ligarse este vector a fragmentos únicos o múltiples de un
polipéptido recombinante tal como tiorredoxina (figura 5; SEQ ID
NO: 11), proteína Dead-Box de E. coli (figura
6, SEQ ID NO 14), KpnI metilasa (figura 7, SEQ ID NO: 17) o
proteína del gen 32 de T4 modificada de 264 pb (figura 1, SEQ ID
NO: 1), cada una de un tamaño elegido (por ejemplo, 5 kD o 10 kD).
Tras la inserción de la molécula de ácido nucleico o vector en la
célula huésped (es decir, la transformación de la célula huésped),
pueden producirse entonces los polipéptidos mediante expresión de
las moléculas de ácido nucleico en las células huésped. Resultará
obvio para un experto habitual en la técnica que son posibles varios
escenarios de expresión. Por ejemplo, pueden usarse los métodos de
la presente invención para producir una molécula de ácido nucleico
que codifica para una pluralidad de los polipéptidos que forman el
marcador del peso molecular, o para producir múltiples moléculas de
ácido nucleico cada una de las cuales codifica para un polipéptido
de peso molecular diferente del marcador del peso molecular.
Entonces pueden transformarse células huésped con un ácido nucleico
que codifica para una pluralidad de tales polipéptidos, o con
múltiples moléculas de ácido nucleico que codifican para un
polipéptido de peso molecular diferente. Alternativamente, pueden
transformarse múltiples células huésped, cada una con una única
molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido
diferente del marcador del peso molecular; en este escenario,
pueden mezclarse polipéptidos producidos por las células huésped
para formar el marcador del peso molecular. En cada uno de estos
escenarios, la expresión de estos constructos producirá
preferiblemente cuerpos de inclusión en las células huésped que
comprenden polipéptidos desde tan sólo 5-10 kD
hasta 250-330 kD. Además, los incrementos de peso
molecular del marcador del peso molecular producido mediante los
presentes métodos pueden definirse alterando simplemente la longitud
o el número de copias del gen del polipéptido recombinante unido al
constructo de fusión génica de la proteína de pareja de inclusión.
Por tanto, es posible, según la presente invención, producir un
marcador del peso molecular de proteínas que comprende una
colección de proteínas que oscilan, por ejemplo, desde
aproximadamente 5 kD hasta aproximadamente 300 kD, preferiblemente
desde aproximadamente 5 kD hasta aproximadamente 250 kD y más
preferiblemente desde aproximadamente 10 kD hasta aproximadamente
220 kD, en incrementos de, por ejemplo 5 kD, 10 kD, 20 kD, 25 kD,
50 kD, 100 kD o mayores. Por supuesto, un experto habitual en la
técnica entenderá que otros incrementos del tamaño o el peso
molecular pueden ser más adecuados para ciertas aplicaciones, y
pueden prepararse mediante sólo modificaciones menores de los
presentes métodos (tales como aumentando o disminuyendo la longitud
del gen que codifica para el polipéptido recombinante fusionado tal
como se describió anteriormente); tales métodos y composiciones
pueden proporcionarse por tanto sin apartarse del alcance de la
presente invención o cualquier realización de la misma.
En una realización preferida, los marcadores del
peso molecular de proteínas preparados tal como se describió
anteriormente pueden estar sin teñir o pueden teñirse previamente
con uno o más colorantes de unión a proteínas para facilitar el uso
de los marcadores del peso molecular en técnicas que requieren
marcadores teñidos previamente del peso molecular de proteínas
tales como inmunotransferencia de tipo Western. Según la invención,
puede usarse cualquiera de varios colorantes de unión a proteínas
para teñir proteínas o los marcadores del peso molecular de la
invención, para producir los marcadores teñidos previamente del peso
molecular de la invención. Puede usarse cualquier colorante que se
una covalentemente a una o más de las proteínas de marcadores del
peso molecular, incluyendo colorantes visibles (cromóforos),
colorantes fluorescentes (fluoróforos), colorantes fosforescentes
(fósforos) y similares. Los colorantes preferidos con respecto a
esto incluyen, pero no se limitan a, azul brillante de Remazol R
(RBBR), isotiocianato de esosina, isotiocianato de verde malaquita,
naranja reactivo (también conocido como Procion amarillo), Procion
rojo, isotiocianato de fluoresceína, isotiocianato de rodamina,
yodoacetamida de eosina, negro reactivo 5, violeta brillante de
Remasol 5R, naranja reactivo 14 y similares. Se prefieren
particularmente para su uso en los presentes métodos RBBR,
isotiocianato de eosina e isotiocianato de verde malaquita. Estos y
otros colorantes que pueden usarse en los presentes métodos están
disponibles comercialmente, por ejemplo de Sigma/Aldrich (St Louis,
MO) y Molecular Probes (Eugene, OR).
Según la invención, pueden producirse marcadores
teñidos previamente del peso molecular incubando una o más de las
proteínas de marcadores del peso molecular, que pueden producirse de
manera natural o producirse de manera recombinante tal como se
refirió anteriormente, con uno o más de los colorantes indicados
anteriormente en una disolución acuosa tamponada en condiciones de
temperatura, tiempo y pH de la disolución controladas.
Preferiblemente, las proteínas de marcadores del peso molecular se
suspenden en una disolución acuosa tamponada (tal como solución
salina tamponada con Tris, fosfato, carbonato o HEPES que comprende
NaCl a aproximadamente 10-300 mM, preferiblemente a
aproximadamente 50-200 mM) a una concentración de
aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 0,1 a
10, o de aproximadamente 0,5 a 10 unidades de A_{280}/ml, más
preferiblemente a una concentración de aproximadamente
1-10, aproximadamente 1-5 o
aproximadamente 1-4 unidades de A_{280}/ml. A la
disolución de proteína(s), pueden añadirse uno o más de los
colorantes anteriores a intervalos de concentración que son
específicos para cada colorante, normalmente en el intervalo de
aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 1000 mg/ml, de
aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml, de
aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, de
aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml, de
aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml o de
aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml. Por ejemplo,
puede añadirse RBBR a la disolución de proteína a una concentración
final de aproximadamente 0,3-50 mg/ml,
preferiblemente a aproximadamente 5-40 mg/ml y más
preferiblemente a aproximadamente 10-30 mg/ml. Puede
añadirse isotiocianato de eosina a la disolución de proteína a una
concentración final de aproximadamente 1-30 mg/ml y
más preferiblemente a aproximadamente 7-10 mg/ml.
Puede añadirse isotiocianato de verde malaquita a la disolución de
proteína a una concentración final de aproximadamente
5-30 mg/ml, más preferiblemente a aproximadamente
20-30 mg/ml. Un experto habitual puede determinar
las concentraciones óptimas para los otros colorantes que pueden
usarse para teñir las proteínas y los marcadores del peso molecular
según los presentes métodos sin experimentación excesiva, usando los
intervalos de concentración indicados anteriormente como
directriz.
La tinción de los marcadores del peso molecular
de proteínas también debe realizarse en condiciones de pH de la
disolución y/o temperatura controladas. Preferiblemente, la
disolución se tampona hasta un pH (medido a aproximadamente
temperatura ambiente (es decir, aproximadamente
24ºC-25ºC) antes de la adición de las proteínas,
marcadores del peso molecular y colorante(s)) de
aproximadamente 7-12, aproximadamente
7-11, aproximadamente 8-11, o
aproximadamente 8,5-10,5, de manera preferible
aproximadamente 7,2-9,7, de manera más preferible
aproximadamente 8,2-9,7 y de la manera más
preferible aproximadamente 9,2-9,7. Durante la
reacción de tinción, las disoluciones deben incubarse a una
temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 90ºC, de
aproximadamente 4ºC a aproximadamente 80ºC, preferiblemente de
aproximadamente temperatura ambiente (es decir, aproximadamente
20ºC-25ºC) a aproximadamente 80ºC, de
aproximadamente 35ºC a aproximadamente 80ºC, de aproximadamente 40ºC
a aproximadamente 75ºC, de aproximadamente 45ºC a aproximadamente
70ºC, de aproximadamente 45ºC a aproximadamente 70ºC, de
aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC, de aproximadamente
45ºC a aproximadamente 65ºC, más preferiblemente a una temperatura
de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 60ºC y lo más
preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 50ºC. Para la
producción de proteínas o marcadores del peso molecular teñidos,
deben incubarse las disoluciones de
proteína-colorante en las condiciones indicadas
anteriormente durante aproximadamente 4-48 horas, de
manera preferible aproximadamente 6-48 horas, de
manera más preferible aproximadamente 4-24 horas,
aproximadamente 6-24 horas, aproximadamente
8-24 horas, aproximadamente 10-24
horas, aproximadamente 12-24 horas y de la manera
más preferible aproximadamente 12-18 horas (es
decir, "durante la noche" tal como entenderá el término el
experto). Tras la incubación, pueden aislarse la/las
proteína(s) o marcadores del peso molecular teñidos del
colorante no conjugado y cualquier otra impureza mediante una
variedad de métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, diálisis,
cromatografía, difusión en gel, etc.) y pueden almacenarse en
disolución a de -70ºC a 4ºC, o pueden liofilizarse y almacenarse a
de -70ºC a temperatura ambiente (es decir, aproximadamente
20ºC-25ºC) hasta su uso.
En una realización particularmente preferida de
este tipo, el marcador teñido previamente del peso molecular de
proteínas puede comprender una colección de marcadores del peso
molecular de proteínas que están espaciados uniformemente en
SDS-PAGE y que comprenden además una banda de
proteína de referencia teñida con un color diferente de las otras
bandas, para permitir una fácil orientación de todas las bandas
sobre el gel. Por ejemplo, tal preparación de marcador teñido
previamente del peso molecular puede comprender una colección de
bandas en la que una banda (una banda de referencia) está teñida
con isotiocianato de eosina y las bandas restantes están teñidas
con RBBR. Tal enfoque se describe con detalle completo en el ejemplo
4 a continuación.
Resultará fácilmente evidente para un experto
habitual en las técnicas relevantes que otras modificaciones y
adaptaciones adecuadas a los métodos y las aplicaciones descritos en
el presente documento son obvios y pueden realizarse sin apartarse
del alcance de la invención o cualquier realización de la misma.
Habiendo descrito ahora la presente invención en detalle, se
entenderá más claramente la misma en referencia a los siguientes
ejemplos, que se incluyen con el presente documento para fines de
ilustración sólo y no pretenden ser limitativos de la
invención.
Los siguientes materiales y métodos se usaron
generalmente en los ejemplos, a menos que se especifique lo
contrario en un ejemplo particular.
Todas las enzimas incluyendo las enzimas de
restricción, ADN ligasa de T4, Taq ADN polimerasa y fosfatasa
alcalina termosensible se obtuvieron de Life Technologies, Inc.
(LTI; Rockville, Maryland) a menos que se indique lo contrario. El
vector de expresión de E. coli pTrc99A se obtuvo de Pharmacia
(Piscataway, Nueva Jersey); pTrxfus era de Genetics Institute
(Cambridge, Massachusetts) o Invitrogen (San Diego, California),
pRE1 se obtuvo del Dr. McKenney (Reddy et al., Nucl. Acids
Res. 17:10473-10488 (1989)). La resina
Toyo-Pearl AF chelate-650M se
adquirió de TosoHaas (Montgomeryville, Pensilvania). El huésped de
expresión de E. coli DH10B con o sin pRK248c1 (resistente a
tetraciclina) y Stbl2 eran de Life Technologies, Inc. (Rockville,
Maryland).
El azul brillante de Remasol R (RBBR) y verde
malaquita se obtuvieron de Aldrich y el isotiocianato de eosina se
obtuvo de Molecular Probes. La aprotinina bovina se obtuvo de Bayer.
Se purificaron las proteínas clonadas, tal como se describe de
manera completa a continuación, a partir de cepas de E. coli
que contenían plásmidos que codificaban para ocho proteínas con
tamaño que oscilaba desde 10 kDa hasta 160 kDa. Los componentes de
tampón eran todos de calidad de reactivo o superior. La unidad de
diafiltración era una Filtron Mini Ultrasette equipada con una
membrana de punto de corte de peso molecular Omega 3000. La resina
de medio G-25 se obtuvo de Pharmacia. Otros
reactivos y componentes se obtuvieron de fuentes comerciales de
suministro a laboratorios que serán familiares para el experto en
la técnica.
Se derivó un fragmento de AvaI de 264 pb
(SEQ ID NO: 1) de pPrL2107 (patente estadounidense nº 5.449.758).
Este fragmento es una parte de la proteína del gen 32 de T4 que se
ha modificado mucho. Este fragmento de AvaI se usó para
preparar multímeros (véase la patente estadounidense 5.449.758) en
pPrL2001. Se seleccionó un clon con 12 insertos y se designó como
pPrl 2738. Se volvió a clonar el fragmento clonado en pTrc99A tal
como sigue: se digirió el plásmido recombinante con EcoRI y
se hicieron romos los extremos con el fragmento Klenow en presencia
de dNTP; se digirió con NcoI y se purificó el fragmento
mediante GENE CLEAN^{TM} (Bio101). Se digirió el vector, pTrc99A,
con SalI, se hicieron romos los extremos con el fragmento
Klenow y se digirió con NcoI. Se ligó el vector purificado
en gel con el fragmento purificado en gel y se transformó en DH10B.
El clon se designó como pTrcprl.
Para preparar un monómero, se digirió
completamente pTrcprl con AvaI para eliminar multímeros y se
autoligó el vector. Este constructo contiene un fragmento de 261 pb
(SEQ ID NO: 2) con un único sitio AvaI y se esperaba que
produjera una proteína de 10 kD. El plásmido se designó como
pTrcprl-monómero.
Para generar clones para producir proteínas
individuales de desde 20 kD hasta 220 kD, se usó el fragmento de
AvaI de 264 pb de pPrL2107 para preparar multímeros en el
pTrcprl-monómero en el sitio AvaI. Puesto
que el fragmento de 264 pb (SEQ ID NO: 1) contiene un residuo
interno de metionina, se alteró a un residuo de lisina mediante
mutagénesis dirigida al sitio con el fin de detener cualquier
iniciación interna. Se llevó a cabo la ligación a temperatura
ambiente (22ºC) usando una razón 100:1 pmol de inserto y vector. Se
seleccionaron clones individuales con insertos correctos (dos,
tres, cuatro, etc.) por el tamaño del inserto tras la digestión con
NcoI y HindIII. Los plásmidos se designaron como
pTrcprl20, pTrcprl30, pTrcprl40, etcétera, para producir proteínas
de 20 kD, 30 kD, 40 kD, etc., respectivamente.
También se generó un clon que contenía una parte
de tiorredoxina de E. coli (truncada) bajo el control del
promotor pL de lambda para producir una proteína de 10 kD. Este
constructo contenía 86 de los 108 aminoácidos de tiorredoxina más
seis residuos de histidina en el extremo carboxilo, que
proporcionaban una etiqueta de His para facilitar la purificación
de la proteína expresada. En enfoques alternativos, se delecionaron
un máximo de 33 aminoácidos de la proteína tiorredoxina,
produciendo un constructo que comprendía 75 de los 108 aminoácidos
de tiorredoxina más la etiqueta de His. Los oligonucleótidos usados
para clonar el fragmento fueron T CTA AGG AAA TAC TTA CAT
ATC AGC G (SEQ ID NO: 3) y TA TTA CTG CAG TTA
GTG GTG GTG GTG GTG GTG TTC ACC GTT TTT GAA CAG CAG CAG (SEQ ID NO:
4). Se usaron los oligonucleótidos para PCR usando pTrxfus como
molde. Se digirió el producto de PCR con NdeI y PstI
(incorporados en los oligonucleótidos subrayados) y se clonó en
pTrxfus digerido con NdeI y PstI. El plásmido se
designó como pTrxfusprl10A (SEQ ID NO: 5).
Se usaron los oligonucleótidos TAA TAA
CCA TGG CAT ATG AGC GAT AAA ATT
ATT CAC (SEQ ID NO: 6) y ATT ATA CCC GAG TCC ACC ACG
GAT GCC ATA TTT CGG (SEQ ID NO: 7) con NcoI (en negrita,
subrayadas y en cursiva), NdeI (en negrita y en cursiva) y
AvaI (en negrita, subrayadas) para generar un vector
alternativo para preparar multímeros tal como sigue: se usaron los
oligonucleótidos para generar un producto de PCR usando pTrxfus
como molde. Se digirió el producto de PCR con NcoI y
AvaI y se clonó en pTrcprl-monómero para
sustituir el fragmento de NcoI-AvaI del gen del gen 32
de T4 modificado. Este plásmido se designó como
pTrxA-concat (SEQ ID NO: 8). Este constructo
contenía los aminoácidos 1-75 de tiorredoxina,
glicina como el aminoácido 76 y los aminoácidos
77-90 de pTrcprl-monómero incluyendo
los 6 residuos de histidina carboxilo terminales. Se preparó este
constructo para generar proteínas de fusión mediante ligación en
marco de un fragmento de AvaI o multímeros de fragmento de
AvaI tal como se trató anteriormente. Para preparar
multímeros, se han usado fragmentos de AvaI generados por
PCR a partir de varios genes de prueba tales como de tiorredoxina,
DEAD-box o KpnI metilasa. Los
oligonucleótidos usados para generar un fragmento AvaI a
partir del gen de tiorredoxina (Hoog et al., Bioscience
Reports 4:917-923 (1984)) fueron: TAA TAA CTC
GGG AGC GAT AAA ATT ATT CAC CTG (SEQ ID NO: 9) y ATA ATA
CCC GAG TTT GGT TGC CGC CAC TTC ACC (SEQ ID NO: 10).
Se digirió el producto de PCR (SEQ ID NO: 11) con AvaI y se
ligó a pTrxA-concat digerido con AvaI y
defosforilado usando 100 pmol de inserto y 1 pmol de vector. Los
clones con un único inserto o múltiples insertos se seleccionaron
estimando el tamaño del inserto tras la digestión con NcoI y
PstI. Finalmente, se clonaron los insertos deseados como
fragmento de NdeI-PstI en pTrxfus. Por tanto, estos
clones producirán proteínas de fusión de
tiorredoxina-(tiorredoxina)_{n} como de 20 kD, 30 kD, 40
kD, etc. Los oligonucleótidos usados para generar un fragmento de
AvaI a partir del gen de DEAD-box (Toone
et al., J. Bacteriol.
173(11):3291-3302 (1991)) fueron TAA TAA
CTC GGG AAG CTG ACT AAT CCG GAA GTA G (SEQ ID NO: 12)
y ATT ATT CCC GAG CAG TGC GCG GTA TTG ATC CAG (SEQ ID
NO: 13). El producto de PCR (SEQ ID NO: 14) se generó usando el
cromosoma de E. coli como molde. Se digirió el producto de
PCR con AvaI y se ligó con pTrxAconcat tal como
anteriormente. Se seleccionaron clones con varios insertos y
volvieron a clonarse en pTrxfus tal como anteriormente. Estos
clones se diseñaron para producir proteínas de fusión de
tiorredoxina-(DEAD-box)_{n} como de 15 kD,
20 kD, 25 kD, etc. Para preparar proteínas de fusión de
tiorredoxina-KpnI metilasa, los oligonucleótidos usados
fueron GA TTA CTC GGG GCA CAT AAA ATG CTA AAA GAT ACA
(SEQ ID NO: 15) y TC TAA CCC GAG TAA GAT CGT TTT TCT
TGA ACC ACC (SEQ ID NO: 16). El molde usado para PCR era un clon de
KpnI metilasa (Chatterjee et al., Nucleic Acids Res.
19:6505-6509 (1991)). Se digirió el producto de PCR
(SEQ ID NO: 17) con AvaI y se ligó a
pTrxA-concat y finalmente se subclonó un fragmento
de NdeI-PstI en el plásmido pTrxfus. Se generó este
plásmido para producir una proteína de fusión de
tiorredoxina-KpnI metilasa de 40 kD.
Se hicieron crecer Stb12 o DHIOB de E.
coli (LTI; Rockville, Maryland) que contenían constructos de
pTrcpr1 a 37ºC en medios ricos en tampón que contenían ampicilina a
100 \mug/ml. Se hicieron clones hasta una DO_{590} = 1,0 y se
indujeron durante 3 horas con IPTG hasta una concentración final de
1 mM. Se incubaron los clones a 37ºC durante 3 horas. Se hicieron
crecer constructos de pTrxfus a 30ºC en medios ricos en tampón que
contenían ampicilina a 100 \mug/ml y tetraciclina a 15 \mug/ml.
Se hicieron crecer clones hasta una DO_{590} = 1,0 y se indujeron
calentado hasta 42ºC durante 30 minutos seguido por un
sobrecrecimiento durante 3 horas a 37ºC. Se resuspendieron las
células en 1 ml de tampón de sonicación (Tris-HCl 10
mM 7,5, EDTA 1 mM y \beta-mercaptoetanol 10 mM)
seguido por sonicación durante 3 X 10 segundos. Se extrajeron 100
\mul para el extracto celular completo. Se extrajo una alícuota
para analizar proteínas como proteína total. La muestra sonicada se
centrifugó durante 10 minutos a 4ºC y se transfirió el sobrenadante
a un tubo eppendorf (soluble).
Se aplicaron las muestras (fracciones soluble y
total) a un gel de tris-glicina al
4-20% para examinar la proteína.
Se suspendieron las células en una razón de 1
g:2 ml de tampón Tris-HCl 20 mM, MgCl_{2} 2 mM, pH
8,0. Se añadió benzonasa, una endonucleasa recombinante de American
International Chemical, a una razón de 25 unidades por ml de
suspensión. Se rompieron las células con dos pases a través de un
homogeneizador de laboratorio de alta presión, modelo
MINI-LAB, tipo 7.30VH mm de APV Rannie, a 12.000
psi. Entonces se centrifugó la muestra a 10.000 x g durante 30
minutos en una centrífuga RC-5 para sedimentar los
cuerpos de inclusión dejando la mayor parte de los residuos
celulares en el líquido sobrenadante. Entonces se lavó el sedimento
de los cuerpos de inclusión dos veces a aproximadamente
20-25ºC con agua estéril usando un homogeneizador de
tejidos Ultra Torrax de Tekmar para suspender completamente el
sedimento. Entonces se hizo el sedimento soluble en tampón de urea
8 M, H_{2}NaPO_{4} 100 mM, imidazol 4 mM, pH 8,4 y se cargó en
una resina Toyopearl AF Chelate-650M de TosoHaas.
Antes de cargar la muestra, se cargó la resina con 3 volúmenes de
columna de una disolución de sulfato de níquel 1 M, se lavó con
tres volúmenes de columna de agua y entonces se equilibró con tres
volúmenes de columna de urea 8 M, H_{2}NaPO_{4} 100 mM,
imidazol 4 mM, pH 8,4 (tampón). Tras cargar la muestra, se lavó la
columna con 10 volúmenes de columna de tampón, y entonces se eluyó
la proteína en un único arrastre con urea 8 M, H_{2}NaPO_{4}
100 mM, pH 3,5, y se precipitó mediante diálisis frente a agua que
contenía EDTA 5 mM; se incluyó EDTA para quelar los iones de níquel
libres que degradaban las proteínas en un almacenamiento a largo
plazo. Se centrifugó el precipitado a 10.000 x g en una centrífuga
RC-5 y entonces se solubilizó en SDS al
1%/agua.
Se diluyeron las proteínas de 10, 15, 20, 25,
30, 40, 70, 100 y 160 kDa en SDS al 1% y H_{2}O hasta 8 unidades
de A_{280}/ml. Se combinó cada disolución de proteína con un
volumen igual del tampón de fosfato de sodio 280 mM, cloruro de
sodio 160 mM, SDS al 1% (p/v), pH 9,2 y se calentó hasta 50ºC
durante 15 minutos. Se prepararon disoluciones madre de RBBR (20
mg/ml y 60 mg/ml) en fosfato de sodio 140 mM, cloruro de sodio 80
mM, SDS al 1% (p/v), pH 9,2, se agitaron con vórtex y se incubaron
durante 15 minutos a 50ºC. Entonces se mezclaron individualmente
las disoluciones de proteínas de 10, 15, 20, 30, 70 y 160 kDa con un
volumen igual de la disolución madre de RBBR 60 mg/ml calentada, se
agitaron con vórtex y se incubaron durante 14-18
horas a 50ºC. Se mezclaron individualmente las disoluciones de
proteínas de 40 y 100 kDa con un volumen igual de la disolución
madre de RBBR 20 mg/ml calentada, se agitaron con vórtex y se
incubaron durante 14-18 horas a 50ºC. Tras la
incubación, se retiraron las disoluciones del baño de agua, se
permitió que se equilibraran hasta temperatura ambiente, se
filtraron a través de un filtro Cameo de 0,8 \mum para eliminar
cualquier compuesto particulado residual y se almacenaron a 4ºC
hasta su uso.
Para proporcionar un patrón de bajo peso
molecular, se preparó aprotinina a una concentración de 11 mg/ml en
fosfato de sodio 140 mM, cloruro de sodio 80 mM, SDS al 3% (p/v). Se
agitó con vórtex cuidadosamente la disolución y se calentó hasta
50ºC durante 15 minutos. Tras calentar, se añadieron 5,7 mg de
RBBR/ml a la disolución y entonces se mezcló la disolución y se
incubó durante 40 minutos a 70ºC. Entonces se añadió
\beta-mercaptoetanol (6,9 \mul/ml) y de nuevo
se mezcló la disolución y se incubó durante otros 10 minutos a 70ºC,
tras lo cual se añadieron 9,1 \mul/ml de acrilonitrilo. Se mezcló
la disolución, se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente
y entonces se filtró a través de un cartucho de filtro Cameo de 0,8
\mum y se almacenó a 4ºC.
Se combinó la disolución madre de 50 kDa de 8
A_{280}/ml en SDS al 1%/H_{2}O con un volumen igual de tampón
de fosfato de sodio 280 mM, cloruro de sodio 160 mM, SDS al 1%
(p/v), pH 9,7, se mezcló y se calentó durante 15 minutos a 50ºC. Se
preparó una disolución madre de 70 mg/ml de isotiocianato de eosina
(EITC) en dimetilformamida inmediatamente antes de su uso y se
añadió un volumen suficiente de esta disolución a la disolución de
proteína de 50 kDa para lograr una concentración final de EITC 7
mg/ml. Entonces se mezcló la disolución, se incubó a 50ºC durante
14-18 horas en la oscuridad, se equilibró hasta
temperatura ambiente, se filtró a través de un cartucho de filtro
Cameo de 0,8 \mum y se almacenó en la oscuridad a 4ºC.
Se evaluó la calidad del marcaje haciendo correr
cada disolución madre de proteína sobre SDS-PAGE
(Laemmli, E.K., Nature 227:680-685 (1970)),
preparando entonces una mezcla de todas las proteínas de modo que
las cantidades de las proteínas producen bandas que visualmente
parecen tener intensidades equivalentes. Entonces se diafiltró la
mezcla usando una unidad Miniultrasette de punto corte de peso
molecular de 3.000 con tampón de glicerol al 10%, TRIS 50 mM, EDTA
5 mM (para mejorar la estabilidad de la preparación en el
almacenamiento), pH 6,8. Se usó una columna Sephadex
G-25 para eliminar una pequeña cantidad de colorante
sin reaccionar que permanecía tras la diafiltración. Se equilibró
la columna Sephadex con Tris 50 mM, SDS al 1% (p/v), EDTA 5 mM, pH
6,8 y el tamaño de la columna era 15 veces el volumen de la
muestra. Se llevó a cabo SDS-PAGE sobre la mezcla
final para evaluar la calidad de la mezcla.
El objetivo inicial era preparar un patrón de
peso molecular de proteínas que oscila desde 10
kD-250 kD con incrementos de 10 kD. Por tanto, se
usó una parte modificada de la proteína del gen 32 de T4 que
contenía 87 aminoácidos (261 pb) que incluía 6 residuos de
histidina en el extremo carboxilo (figura 1; SEQ ID NO: 1) (véase
la patente estadounidense nº 5.449.758). Se clonó el fragmento y se
expresó para producir una proteína de 10 kD. El clon se designo
como plásmido pTrcprl-monómero. Este constructo
contiene un único sitio AvaI (CTCGGG) para generar
multímeros de cualquier fragmento de AvaI dado con la
secuencia CTCGGG. Cuando se digiere con AvaI, el clon genera
una proyección TCGG. Por tanto, cuando se liga un fragmento de ADN
que tiene una proyección TCGG en ambos extremos con
pTrcprl-monómero digerido con AvaI, el
fragmento se ligará sólo en una dirección (cabeza a cola). Usando
la condición apropiada de ligación, fue posible generar multímeros
de un fragmento deseado. Por ejemplo, si se liga un único fragmento
de AvaI (264 pb) al pTrcprl-monómero
producirá una proteína de 20 kD; si se ligan dos fragmentos,
producirá una proteína de 30 kD; etcétera.
Tal como se indicó anteriormente, se diseñó el
pTrcprl-monómero para producir una proteína de 10
kD. Sin embargo, los cultivos inducidos o no inducidos no
produjeron ninguna proteína de 10 kD. De manera interesante, los
clones mayores con múltiples insertos produjeron proteínas de
tamaños esperados. El nivel de expresión, sin embargo, variaba
entre los clones dependiendo del número de insertos. El nivel de
expresión de diversas proteínas (en kD) fue tal como sigue:
20<30 <40 <50 <60
<70\cong80\cong90\cong100\cong120 >160 >180
>200 >220 >250.
Para obtener una proteína de bajo peso molecular
para su uso en la producción de patrones de peso molecular, se
buscaron proteínas naturales próximas a 10 kD de tamaño que se
expresan bien en E. coli. Una proteína de este tipo es
tiorredoxina, que consiste en 108 aminoácidos y que tiene una masa
molecular de 12 kD (Lunn et al., J. Biol.Chem.
259:10469-10474 (1984); Hoog et al., BioSci
Rep. 4:917-923 (1984)). La tiorredoxina se
distribuye de manera ubicua y está presente en una concentración
excepcionalmente alta por célula (10.000-20.000
moléculas/célula). Además, se ha mostrado también que cuando se
sobreexpresa, representa casi el 40% de la proteína celular soluble
total (Lunn et al., idem). Por tanto, parece que la
tiorredoxina podría ser un candidato adecuado para la producción de
una proteína de 10 kD si se deleciona una parte de 2 kD de su
extremo carboxilo terminal. Un constructo de este tipo
(pTrxfuspr110A) que producía una proteína de 10 kD contenía: a) los
aminoácidos 1-85 de tiorredoxina; b) una sustitución
de ácido glutámico por valina en la posición de aminoácido número
86; y c) residuos de histidina en las posiciones
87-92. Este constructo de tiorredoxina truncada
producía aproximadamente el 20-30% de la proteína
celular total. Sin embargo, a diferencia de la tiorredoxina de
longitud completa, este constructo producía casi toda la proteína
inducida como cuerpos de inclusión. En otros experimentos, se
delecionaron 33 de los 108 aminoácidos del extremo carboxilo
terminal de la tiorredoxina; tales constructos también producían
casi toda la proteína inducida como cuerpos de inclusión tras su
expresión en las células huésped. También puede ser posible producir
polipéptidos mediante los presentes métodos usando tiorredoxina
truncada en la que se han delecionado 22 aminoácidos del extremo
carboxilo terminal, o en la que se han delecionado
33-50 aminoácidos, tal como se describió
anteriormente. Tras la expresión de la proteína en las células
huésped, se aislaron fácilmente los cuerpos de inclusión a partir de
las células huésped mediante centrifugación.
Con el fin de preparar la proteína de fusión con
tiorredoxina truncada, se desarrolló un vector que contenía un
único sitio AvaI, usado para preparar concatámeros; este
vector se designó pTrxA-concat (figura 4; SEQ ID
NO: 8). Usando este vector, se ha preparado una serie de proteínas
de fusión uniendo el vector a fragmentos únicos o múltiples de
tiorredoxina (figura 5; SEQ ID NO: 11) (fusión
tiorredoxina-tiorredoxina), proteína
DEAD-box de E. coli (figura 6; SEQ ID NO:
14), KpnI metilasa (figura 7; SEQ ID NO: 17), o proteína del
gen 32 de T4 modificada (figura 1; SEQ ID NO: 1) (véase la patente
estadounidense 5.449.758).
Específicamente, se prepararon las proteínas de
fusión de los pesos moleculares indicados ligando
pTrxA-concat a una o más copias de moléculas de
ácido nucleico que codifican para fragmentos de 10 kDa de
tiorredoxina truncada de E. coli (\DeltatrxA) o proteína
del gen 32 de T4, o fragmentos de 5 kD de proteína de
Dead-Box de E. coli o KpnI metilasa,
tal como se muestra en la tabla 1. En todos los casos, se expresó la
proteína de fusión como cuerpos de inclusión. Por tanto, usando los
métodos de la presente invención, se han producido de manera eficaz
polipéptidos de tamaño que oscila desde 10 kD hasta 220 kD, en
incrementos de 5-10 kD, como cuerpos de
inclusión.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Para demostrar su utilidad, se usó el presente
sistema para preparar marcadores no teñidos del peso molecular de
proteínas. Se mezclaron proteínas purificadas de diferentes tamaños,
preparadas tal como se describió en el ejemplo 2, y se separaron
mediante SDS-PAGE y se observaron los patrones de
bandas en diversas concentraciones de acrilamida.
Los resultados de estos experimentos mostraron
que la combinación de proteínas que permitía la mejor resolución a
lo largo de un intervalo de concentraciones de acrilamida era una
mezcla de proteínas de 10 kD, 15 kD, 20 kD, 25 kD, 30 kD, 40 kD, 50
kD, 60 kD, 70 kD, 80 kD, 90 kD, 100 kD, 120 kD, 160 kD y 220 kD.
Estos resultados demuestran que los métodos de la presente
invención son útiles para preparar proteínas de diversos intervalos
de tamaño y que pueden usarse para producir composiciones que
comprenden marcadores del peso molecular de proteínas.
Los marcadores teñidos previamente del peso
molecular de proteínas han estado disponibles comercialmente desde
hace más de 10 años en dos formas distintas. En una forma, todas las
proteínas están teñidas con un único colorante y en la segunda
forma cada proteína está teñida con colorantes diferentes (una
versión multicoloreada). Estas dos formas diferentes tienen varias
ventajas y desventajas. Los marcadores de un único color, por
ejemplo, se preparan normalmente de un modo que da como resultado
bandas relativamente nítidas en SDS-PAGE en
comparación con los marcadores multicoloreados, pero puede ser
difícil relacionar directamente cada banda con su peso molecular
correspondiente puesto que el único punto de referencia en los
marcadores teñidos previamente de un único color es la banda de
peso molecular mayor o menor. Si cualquiera de estas bandas de
referencia desaparece durante el almacenamiento, o no se resuelve
en el gel, la ausencia de un punto de referencia hace difícil la
identificación de las bandas restantes. De manera similar, la
determinación de la identidad de las bandas en marcadores
multicoloreados es fácil puesto que cada banda es de un color
distinto, pero algunas de las bandas son muy anchas en
SDS-PAGE y algunos de los colores son difíciles de
detectar visualmente.
En la presente invención, se ha desarrollado un
nuevo conjunto de marcadores teñidos previamente del peso molecular
de proteínas. Estos marcadores están uniformemente espaciados en
SDS-PAGE y comprenden una banda de referencia de un
color diferente de las otras bandas para permitir una fácil
orientación de todas las bandas del marcador. Se usó un único
colorante para teñir todas menos una proteína (la proteína de
referencia), que se tiñó con un segundo colorante. Se desarrollaron
protocolos de tinción para producir proteínas teñidas previamente
que dieron bandas nítidas en SDS-PAGE usando ambos
colorantes, al contrario de las amplias variaciones en la nitidez
de las bandas comunes en los marcadores multicoloreados. La proteína
teñida con el segundo colorante sirve como punto de referencia
dentro del marcador que facilita la identificación de las bandas del
marcador teñido previamente. Se sometieron a prueba varios
colorantes incluyendo el azul brillante de Remasol R (RBBR),
isotiocianato de eosina, Procion rojo, naranja reactivo (también
conocido como Procion amarillo), yodoacetamida de eosina, negro
reactivo 5, violeta brillante de Remasol 5R, naranja reactivo 14,
isotiocianato de rodamina e isotiocianato de verde malaquita. Se
optimizaron las condiciones de marcaje y almacenamiento de cada
componente de proteína en cuanto al pH de tampón y composición
iónica, concentración de colorante, concentración de proteína,
temperatura de marcaje y tiempo de incubación durante el marcaje,
tal como se describió en detalle anteriormente en la sección de
Materiales y métodos.
Se marcaron varias proteínas clonadas diferentes
con RBBR y entonces se hicieron correr en SDS-PAGE
para determinar la eficacia del procedimiento de marcaje y para
determinar los pesos moleculares aparentes de las proteínas
marcadas. Tal como se muestra en la figura 8, se consiguieron la
tinción más intensa y el espaciado más uniforme en
SDS-PAGE con la combinación de proteínas de 10, 15,
20, 30, 40, 50, 70, 100 y 160 kDa. Se marcó la proteína de 50 kDa
con isotiocianato de eosina de modo que pudo incorporarse una banda
de referencia o destacada en el marcador del peso molecular. Esta
banda rosa fuerte estaba situada como la cuarta banda a partir de la
parte superior y la sexta banda a partir de la parte inferior (no
incluyendo el patrón de aprotinina que no es parte de la
composición del marcador del peso molecular), lo que proporciona un
punto de referencia fácil para determinar el peso molecular de una
banda particular. Estos resultados demuestran que los presentes
métodos pueden usarse para producir conjuntos de marcadores del
peso molecular que se tiñen previamente de manera sencilla.
Sería útil tener marcadores del peso molecular
que no sólo puedan usarse para determinar el peso molecular tras la
tinción con azul coomassie en un gel, sino que también pudieran
usarse como marcadores del peso molecular tras las técnicas de
transferencia de membrana tales como las inmunotransferencias de
tipo Western. Los marcadores del peso molecular producidos mediante
los presentes métodos pueden usarse para ambas de estas
aplicaciones. Tal como se describió anteriormente, cada uno de los
componentes de proteína en la mezcla de marcadores no teñidos del
peso molecular contiene seis residuos de histidina en el extremo
carboxilo terminal. Puesto que estos seis residuos de histidina
interaccionan con Ni^{++} (Hochuli, E., y Piesecki, S., Methods: A
Companion to Methods in Enzymology 4:68-72 (1992),
puede usarse un conjugado de
Ni-NTA-fosfatasa alcalina junto con
cloruro de azul de nitrotetrazolio (NBT)/sal
p-toluidina de
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
(BCIP) para detectar e identificar los componentes de proteína en
una inmunotransferencia de tipo Western.
El presente sistema es particularmente útil para
expresar proteínas que son difíciles de expresar en E. coli,
ya sea debida esta dificultad a (1) el tamaño menor de la proteína
(en general, se expresan proteínas menores a niveles inferiores en
E. coli); (2) la toxicidad de la proteína heteróloga para el
huésped E. coli; (3) la traducción ineficaz en E.
coli; o (4) la inestabilidad del ARNm. Tal como se mostró en
los ejemplos anteriores, los métodos presentes permiten la
producción eficaz de proteínas heterólogas como cuerpos de
inclusión. Puesto que los cuerpos de inclusión son una forma aislada
de la proteína expresada, este sistema puede usarse para producir
proteínas tóxicas o péptidos pequeños que de otra manera no podrían
producirse en E. coli u otras células huésped bacterianas.
Usando este sistema, se han producido péptidos de 5kD y menores. El
sistema también puede usarse para producir polipéptidos de 250 kD de
tamaño o mayores.
En general, la conjugación o modificación
química de una proteína (por ejemplo, marcándola con un colorante)
implica la reacción de grupos funcionalmente reactivos en la
proteína con grupos funcionalmente reactivos correspondientes en el
marcador. Los grupos reactivos que pueden acoplarse con moléculas
que contienen amina, tales como proteínas que contienen residuos de
lisina, son con mucho los grupos funcionales más comunes presentes
en reactivos de reticulación tales como colorantes. Por tanto puede
usarse un procedimiento de acoplamiento de amina para conjugar casi
todas las proteínas o péptidos con otras moléculas.
En la presente invención, se ha usado una
variedad de colorantes, incluyendo azul brillante de Remazol R
(RBBR) e isotiocianato de eosina, como reactivos de acoplamiento
para el marcaje de proteínas de marcadores del peso molecular.
Estos colorantes reaccionan principalmente con grupos amina
nucleofílicos en las proteínas para dar complejos de
proteína-colorante estables. Los colorantes también
pueden reaccionar, en algún grado, con otros nucleófilos en las
proteínas diana, tales como grupos sulfhidrilos e iones fenolato de
cadenas laterales de tirosina.
Para producir los marcadores de proteínas
teñidos previamente más útiles (es decir, la intensidad del color y
nitidez de la banda más altas) y compatibles (es decir, la
variabilidad más baja en la movilidad de bandas entre lotes), es
esencial optimizar el protocolo de tinción. La intensidad de la
banda dependerá de la cantidad de grupos amina primarios presentes
en la proteína que está conjugándose con el colorante, mientras que
la nitidez de la banda dependerá de cuántas de las aminas primarias
disponibles en la proteína diana se han conjugado con el colorante.
Cada una de estas variables dependerá de las condiciones ambientales
a las que están sometidos la proteína y el colorante durante la
conjugación. Por tanto, el grado de conjugación de las proteínas de
marcadores diana con el colorante dependerá de varias condiciones
durante la tinción, incluyendo las concentraciones de la proteína y
del colorante en disolución, pH de la disolución, condiciones
iónicas, temperatura y duración de la incubación de la proteína con
el colorante.
Por tanto, un objeto de la presente invención es
desarrollar condiciones para teñir marcadores del peso molecular de
proteínas que proporcionarán marcadores del peso molecular con
bandas que se resuelven de manera tan intensa, tan homogénea y tan
compatible como sea posible. Para cumplir este objetivo, se
optimizaron las condiciones de marcaje en cuanto a las
concentraciones de la proteína y del colorante en disolución, pH de
la disolución (ajustado antes de la adición de proteína(s) y
colorante(s)) y temperatura y tiempo de incubación.
Para minimizar los volúmenes en los que se
llevan a cabo las reacciones, se examinaron concentraciones variadas
de proteínas. Se prepararon proteínas producidas tal como se
describió anteriormente en disoluciones a 1, 2 y 4 unidades de
A_{280}/ml y se marcaron con RBBR tal como se describió de manera
general anteriormente en la sección de Materiales y métodos, y
entonces se separaron en geles de gradiente de
SDS-PAGE al 4-20% tal como
anteriormente en el ejemplo 4. Entonces se determinó la intensidad
de tinción mediante densitometría y a simple vista. En general, las
concentraciones de proteínas de 1 y 2 unidades de A_{280}/ml
produjeron señales de intensidad similar, mientras que la
intensidad de marcaje era inferior a 4 unidades de A_{280}/ml.
En experimentos análogos, se determinó la
concentración óptima de RBBR mediante tinción de proteínas con RBBR
en un intervalo de concentraciones de desde 0,3 hasta 30 mg/ml. En
general, se encontró que RBBR 10 mg/ml proporcionaba la tinción de
la manera más intensa del producto homogéneo cuando se marcaron las
proteínas de 40 kD y 100 kD, mientras que las proteínas de 10 kD,
15 kD, 20 kD, 30 kD, 45 kD, 50 kD, 60 kD, 70 kD y 160 kD se
marcaron de manera óptima con 30 mg/ml de RBBR. Estos resultados
sugieren que un intervalo de aproximadamente 5-50
mg/ml o 10-30 mg/ml de RBBR puede ser óptimo para el
marcaje de marcadores del peso molecular de proteínas que consisten
en proteínas de pesos moleculares variables.
En experimentos preliminares diseñados para
determinar la temperatura y periodos de tiempo óptimos para el
marcaje, la incubación de las proteínas en disolución sin colorante
indicó que las proteínas tendían a degradarse cuando se incubaron a
70ºC durante 0,5-1 horas y cuando se incubaron a
60ºC durante aproximadamente 2-5 horas. Sin
embargo, cuando se incubaron durante la noche (12-24
horas) a aproximadamente 50ºC o inferior, parecía que las proteínas
eran estables (es decir, que resistían a la degradación en
disolución). Tras la tinción de las disoluciones de proteína con
RBBR a los intervalos de concentración indicados anteriormente, se
observaron las bandas más homogéneas e intensas (es decir, los
patrones de bandas más fuertes y más nítidos) en las preparaciones
de proteína teñidas con RBBR durante la noche a 50ºC. Periodos de
incubación más cortos (por ejemplo, de 4 a 8 horas) produjeron
patrones de bandas más heterogéneos (es decir, más difusos y menos
intensos), particularmente con proteínas de bajo peso molecular (de
10 kD a 60 kD). Las incubaciones durante la noche a temperatura
ambiente (de aproximadamente 20ºC a 25ºC) y a 37ºC no produjeron
resultados satisfactorios; las preparaciones de marcadores del peso
molecular teñidos con RBBR en estas condiciones dieron como
resultado marcadores del peso molecular que mostraron patrones de
bandas incluso más difusos y menos intensos. Estos resultados
indicaron que la tinción durante la noche de las proteínas a 50ºC
es óptima para producir marcadores del peso molecular de proteínas
teñidos previamente con RBBR.
Finalmente, para determinar el pH óptimo para la
tinción de las preparaciones de marcadores del peso molecular con
RBBR, se marcaron las proteínas con RBBR tal como anteriormente en
disoluciones tamponadas hasta pH que oscilan desde aproximadamente
7,2 hasta aproximadamente 9,7. Se observaron resultados ideales (es
decir, los patrones de banda menos difusos y tinción de la manera
más intensa) en disoluciones tamponadas hasta pH 9,2. Sin embargo,
ha de indicarse que el pH de la mezcla de tinción final era de
aproximadamente 8,3 (tras la adición de proteína y colorante),
mientras que el pH inicial óptimo del tampón al que se añadieron la
proteína y el colorante era de aproximadamente 9,2.
Tomados juntos, estos resultados sugieren que
las condiciones óptimas para producir marcadores del peso molecular
de proteínas teñidos previamente con RBBR incluyen una concentración
de proteína de aproximadamente 1 a 2 unidades de A_{280}/ml, una
concentración de colorante de aproximadamente 5 a aproximadamente 50
mg/ml, un pH de aproximadamente 9,0 a 9,5 y la incubación de la
proteína y el colorante durante aproximadamente
12-24 horas a una temperatura de aproximadamente
50ºC.
Tal como se indicó en el ejemplo 4 anterior, el
marcaje con eosina de una única banda de proteína en un marcador
complejo del peso molecular de proteínas, particularmente entre las
bandas de 40 kD y 70 kD marcadas con RBBR, proporciona una banda de
referencia valiosa que permite la identificación rápida y precisa de
todas las otras bandas de proteína en el marcador del peso
molecular. Por tanto, se determinaron las condiciones óptimas para
el marcaje de proteínas de 30 kD, 40 kD, 50 kD y 60 kD con
isotiocianato de eosina, para su uso en los marcadores del peso
molecular de la invención.
Se incubaron diversas preparaciones de proteínas
recombinantes de 30 kD, 40 kD, 50 kD y 60 kD, preparadas tal como
se describió anteriormente en los ejemplos 1 y 2, con isotiocianato
de eosina en las condiciones de concentración de proteína,
concentración de colorante, temperatura, tiempo y pH usadas para los
estudios con RBBR en el ejemplo 7. Tras el marcaje con
isotiocianato de eosina, se hicieron correr las preparaciones de
proteína en SDS-PAGE al 4-20%.
Tal como se muestra en las figuras
9-12, las condiciones de pH y temperatura usadas
durante el marcaje con eosina de proteínas de referencia de 30 kD,
40 kD, 50 kD y 60 kD afectaron drásticamente a la intensidad de
tinción y nitidez de la resolución de las bandas en
SDS-PAGE. Se obtuvieron resultados óptimos cuando se
incubaron aproximadamente 2 unidades de A_{280} de la proteína de
50 kD durante la noche (idealmente durante aproximadamente
4-16 horas) a 50ºC con una concentración final de
isotiocianato de eosina de aproximadamente 7 mg/ml a pH 9,2 (véase
la figura 9, carril 5; la figura 10, carril 13; la figura 11, carril
14; y la figura 12, carril 8) y cuando se marcó la proteína de 60
kD en las mismas condiciones, excepto a pH 9,2-9,7
(véase la figura 9, carril 13 y la figure 12, carril 6). Sin
embargo, en estas mismas condiciones la incubación de las proteínas
con el colorante Procion rojo comúnmente usado produjo poca o
ninguna tinción de las bandas del marcador del peso molecular
(véase la figura 12, carriles 1-4).
Para proporcionar bandas de referencia y
marcadores del peso molecular de proteínas teñidos con una variedad
de colores, sería ventajoso teñir los marcadores del peso molecular
de proteínas de la invención con un colorante, tal como verde
malaquita, de color diferente al de RBBR y eosina. Por tanto, se
determinaron las condiciones óptimas para el marcaje de proteínas
de 30 kD, 40 kD, 50 kD y 60 kD con isotiocianato de verde
malaquita.
\newpage
Se incubaron diversas preparaciones de proteínas
recombinantes de 30 kD, 40 kD, 50 kD y 60 kD, preparadas tal como
se describió anteriormente en los ejemplos 1 y 2, con isotiocianato
de verde malaquita en las condiciones de concentración de proteína,
concentración de colorante, temperatura, tiempo y pH usadas para los
estudios con RBBR en el ejemplo 7 y con isotiocianato de eosina en
el ejemplo 8. Tras el marcaje con isotiocianato de verde malaquita,
se hicieron correr las preparaciones de proteína en
SDS-PAGE al 4-20%.
Tal como se muestra en la figura 13, las
condiciones de pH usadas durante el marcaje con verde malaquita de
proteínas de referencia de 40 kD, 50 kD y 60 kD efecto drásticamente
a la intensidad de tinción y nitidez de resolución de las bandas en
SDS-PAGE. Se obtuvieron resultados óptimos cuando se
incubaron aproximadamente 1-2 unidades de A_{280}
de las proteínas durante la noche (idealmente durante
aproximadamente 16 horas) a temperatura ambiente con una
concentración final de isotiocianato de verde malaquita de
aproximadamente 20-30 mg/ml a pH 9,2 (véase la
figura 13, carriles 2, 4, 6 y 8).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Life Technologies, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 9800 Medical Center Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Rockville
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Maryland
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 20850
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Métodos para la producción de proteínas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 17
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: (por asignar)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 08-ENE-1998
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/034.658
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 08-ENE-1997
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 270 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 263 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGAAATACT TACATATGAG CG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATTACTGCA GTTAGTGGTG GTGGTGGTGG TGTTCACCGT TTTTGAACAG CAGCAG
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 280 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATAACCAT GGCATATGAG CGATAAAATT ATTCAC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTATACCCG AGTCCACCAC GGATGCCATA TTTCGG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 280 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATAACTCG GGAGCGATAA AATTATTCAC CTG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATAATACCCG AGTTTGGTTG CCGCCACTTC ACC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 282 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATAACTCG GGAAGCTGAC TAATCCGGAA GTAG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTATTCCCG AGCAGTGCGC GGTATTGATC CAG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 138 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATTACTCGG GGCACATAAA ATGCTAAAAG ATACA
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTAACCCGA GTAAGATCGT TTTTCTTGAA CCACC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 405 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
Claims (55)
1. Método de preparación de una composición de
marcador del peso molecular, que comprende incubar proteínas
recombinantes de diferente peso molecular con colorante de unión a
proteínas, en el que se incuba una primera proteína recombinante
con un primer colorante de tinción de proteínas y se incuba una
pluralidad de proteínas recombinantes de pesos moleculares que
difieren de dicha primera proteína recombinante y entre sí con un
segundo colorante de tinción de proteínas de diferente color con
respecto al primer colorante de tinción de proteínas, incubándose
las proteínas con dichos colorantes en una disolución acuosa
tamponada en condiciones de temperatura, tiempo y pH de la
disolución controladas.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho primer colorante de tinción de proteínas se selecciona del
grupo que consiste en Procion rojo, naranja reactivo, yodoacetamida
de eosina, negro reactivo 5, violeta brillante de Remasol 5R,
naranja reactivo 14, isotiocianato de rodamina, isotiocianato de
eosina e isotiocianato de verde malaquita.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
dicho primer colorante de tinción de proteínas se selecciona del
grupo que consiste en isotiocianato de eosina e isotiocianato de
verde malaquita.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el segundo colorante de unión a
proteínas es azul brillante de Remazol R.
5. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que las proteínas comprenden proteínas que tienen
incrementos de peso molecular de 5 kD, 10 kD, 20 kD, 25 kD, 50 kD
y/o 100 kD.
6. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que las proteínas recombinantes son proteínas de
fusión recombinantes.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que las proteínas recombinantes son
proteínas de fusión recombinantes unidas a una proteína de pareja
de inclusión.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
la proteína de pareja de inclusión es tiorredoxina o una pareja de
inclusión de tiorredoxina modificada que tiene la capacidad de
formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula huésped
bacteriana.
9. Método según la reivindicación 7, en el que
la proteína de pareja de inclusión se selecciona de proteína de
unión a maltosa de E. coli, ARNasa II de E. coli,
fosfatasa alcalina de E. coli, fosfolipasa A de E.
coli, \beta-lactamasa de E. coli,
proteína MalK de Salmonella typhimurium, endoglucanasa D de
Clostridium thermocellum, proteínas insecticidas de
Bacillus thuringiensis subsp. aizawai IPL7,
procatepsina B humana, interferón gamma porcino, ADN polimerasa de
T5, o versiones modificadas de las mismas que tienen la capacidad
de formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula
huésped bacteriana.
10. Método según la reivindicación 7, en el que
la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de
tiorredoxina de E. coli modificada que tiene la capacidad de
formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula huésped
bacteriana.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de
tiorredoxina truncada que tiene la capacidad de formar cuerpos de
inclusión tras su expresión en una célula huésped bacteriana.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de
tiorredoxina truncada en el extremo carboxilo terminal que tiene la
capacidad de formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una
célula huésped bacteriana.
13. Método según la reivindicación 12, en el que
la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de
tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 2 y 50 aminoácidos
carboxilo terminales.
14. Método según la reivindicación 12, en el que
la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de
tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 33 y 50 aminoácidos
carboxilo terminales.
15. Método según la reivindicación 12, en el que
la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de
tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 2 y 33 aminoácidos
carboxilo terminales.
16. Método según la reivindicación 12, en el que
la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de
tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 2 y 22 aminoácidos
carboxilo terminales.
17. Método según la reivindicación 12, en el que
la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de
tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 23 y 33 aminoácidos
carboxilo terminales.
18. Método según la reivindicación 17, en el que
la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de
tiorredoxina que tiene un truncamiento de 23 aminoácidos carboxilo
terminales.
19. Método según la reivindicación 10, en el que
la proteína de pareja de inclusión es una tiorredoxina que tiene un
peso molecular de 10 kD.
20. Método según la reivindicación 10, en el que
la proteína de pareja de inclusión es una forma truncada en el
extremo carboxilo terminal de la tiorredoxina de Escherichia
coli que está codificada por una molécula de ácido nucleico que
tiene una secuencia de nucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO:
8.
21. Método según cualquier reivindicación
anterior, en el que las proteínas recombinantes que proporcionan el
marcador del peso molecular tienen incrementos moleculares definidos
alterando la longitud o el número de copias de un polipéptido
recombinante comprendido en la proteína recombinante.
22. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que las proteínas recombinantes que
proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos
moleculares definidos alterando el número de copias de un
polipéptido recombinante comprendido en la proteína
recombinante.
23. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que las proteínas recombinantes que
proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos
moleculares definidos alterando la longitud o el número de copias
de un polipéptido recombinante comprendido en la proteína
recombinante, en el que dicha proteína recombinante está unida a
una proteína de pareja de inclusión.
24. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que las proteínas recombinantes que
proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos
moleculares definidos alterando el número de copias de un
polipéptido recombinante comprendido en la proteína recombinante, en
el que dicha proteína recombinante está unida a una proteína de
pareja de inclusión.
25. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que cada proteína de la serie de
proteínas recombinantes comprende un número de copias diferente de
una proteína de pareja de inclusión.
26. Método según la reivindicación 25, en el que
cada proteína de la serie de proteínas recombinantes comprende un
número de copias diferente de tiorredoxina.
27. Composición de marcador teñido del peso
molecular de proteínas preparada según el método según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.
28. Composición de marcador teñido del peso
molecular de proteínas, que comprende proteínas recombinantes, en
la que cada proteína tiene un peso molecular diferente con respecto
a todas las demás proteínas en la composición, las proteínas
comprenden una o más copias de un primer polipéptido recombinante y
una de las proteínas recombinantes está teñida con un colorante que
está coloreado de manera diferente del colorante que tiñe las otras
proteínas recombinantes.
29. Composición según la reivindicación 28, en
la que dicho primer colorante de tinción de proteínas se selecciona
del grupo que consiste en Procion rojo, naranja reactivo,
yodoacetamida de eosina, negro reactivo 5, violeta brillante de
Remasol 5R, naranja reactivo 14, isotiocianato de rodamina,
isotiocianato de eosina e isotiocianato de verde
malaquita.
malaquita.
30. Composición según la reivindicación 29, en
la que dicho primer colorante de tinción de proteínas se selecciona
del grupo que consiste en isotiocianato de eosina e isotiocianato de
verde malaquita.
31. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 30, en la que el segundo colorante de unión a
proteínas es azul brillante de Remazol R.
32. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 31, en la que las proteínas comprenden
proteínas que tienen incrementos del peso molecular de 5 kD, 10 kD,
20 kD, 25 kD, 50 kD y/o 100 kD.
33. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 32, en la que las proteínas recombinantes son
proteínas de fusión recombinantes.
34. Composición según la reivindicación 33, en
la que las proteínas recombinantes comprenden cada una una pareja
de cuerpo de inclusión.
35. Composición según la reivindicación 34, en
la que la pareja de cuerpo de inclusión es tiorredoxina.
36. Composición según la reivindicación 35, en
la que la tiorredoxina es una tiorredoxina modificada.
\newpage
37. Composición según la reivindicación 35 o la
reivindicación 36, en la que la proteína de pareja de inclusión es
tiorredoxina o una pareja de inclusión de tiorredoxina modificada
que tiene la capacidad de formar cuerpos de inclusión tras su
expresión en una célula huésped bacteriana.
38. Composición según la reivindicación 34, en
la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión
de tiorredoxina de E. coli modificada que tiene la capacidad
de formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula
huésped bacteriana.
39. Composición según la reivindicación 34, en
la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión
de tiorredoxina truncada que tiene la capacidad de formar cuerpos
de inclusión tras su expresión en una célula huésped
bacteriana.
40. Composición según la reivindicación 39, en
la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión
de tiorredoxina truncada en el extremo carboxilo terminal que tiene
la capacidad de formar cuerpos de inclusión tras su expresión en
una célula huésped bacteriana.
41. Composición según la reivindicación 40, en
la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión
de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 2 y 50
aminoácidos carboxilo terminales.
42. Composición según la reivindicación 40, en
la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión
de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 33 y 50
aminoácidos carboxilo terminales.
43. Composición según la reivindicación 40, en
la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión
de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 2 y 33
aminoácidos carboxilo terminales.
44. Composición según la reivindicación 40, en
la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión
de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 2 y 22
aminoácidos carboxilo terminales.
45. Composición según la reivindicación 40, en
la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión
de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 23 y 33
aminoácidos carboxilo terminales.
46. Composición según la reivindicación 45, en
la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión
de tiorredoxina que tiene un truncamiento de 23 aminoácidos
carboxilo terminales.
47. Composición según la reivindicación 37, en
la que la proteína de pareja de inclusión es una tiorredoxina que
tiene un peso molecular de 10 kD.
48. Composición según la reivindicación 40, en
la que la proteína de pareja de inclusión es una forma truncada en
el extremo carboxilo terminal de tiorredoxina de Escherichia
coli que está codificada por una molécula de ácido nucleico que
tiene una secuencia de nucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO:
8.
49. Composición según la reivindicación 33, en
la que la proteína de pareja de inclusión es proteína de unión a
maltosa, ARNasa II, fosfatasa alcalina, fosfolipasa A,
P-lactamasa, proteína MalK, endoglucanasa D,
proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis subsp.
aizawai IPL7, procatepsina B, interferón-gamma,
ADN polimerasa de T5 o versiones modificadas de las mismas que
tienen la capacidad de formar cuerpos de inclusión tras su
expresión en una célula huésped bacteriana.
50. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 49, en la que los polipéptidos recombinantes
que proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos
moleculares definidos alterando la longitud o el número de copias
de un polipéptido recombinante comprendido en el polipéptido
recombinante.
51. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 49, en la que los polipéptidos recombinantes
que proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos
moleculares definidos alterando el número de copias de un
polipéptido recombinante comprendido en el polipéptido
recombinante.
52. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 49, en la que los polipéptidos recombinantes
que proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos
moleculares definidos alterando la longitud o el número de copias
de un polipéptido recombinante comprendido en el polipéptido
recombinante, en la que dicho polipéptido recombinante está unido a
una proteína de pareja de inclusión.
53. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 49, en la que los polipéptidos recombinantes
que proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos
moleculares definidos alterando el número de copias de un
polipéptido recombinante comprendido en el polipéptido recombinante,
en la que dicho polipéptido recombinante está unido a una proteína
de pareja de inclusión.
54. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 28 a 49, en la que cada proteína de la serie de
proteínas recombinantes comprende un número de copias diferente de
una proteína de pareja de inclusión.
55. Composición según la reivindicación 54, en
la que cada proteína de la serie de proteínas recombinantes
comprende un número de copias diferente de tiorredoxina.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US3465897P | 1997-01-08 | 1997-01-08 | |
US34658 | 1997-01-08 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2308800T3 true ES2308800T3 (es) | 2008-12-01 |
Family
ID=21877792
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES98903438T Expired - Lifetime ES2308800T3 (es) | 1997-01-08 | 1998-01-08 | Metodos para la produccion de proteinas. |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (8) | US6703484B2 (es) |
EP (3) | EP0963435B1 (es) |
JP (2) | JP2001512306A (es) |
AT (1) | ATE397061T1 (es) |
AU (1) | AU6020998A (es) |
DE (1) | DE69839553D1 (es) |
ES (1) | ES2308800T3 (es) |
WO (1) | WO1998030684A1 (es) |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2308800T3 (es) | 1997-01-08 | 2008-12-01 | Invitrogen Corporation | Metodos para la produccion de proteinas. |
JP3432158B2 (ja) * | 1998-12-04 | 2003-08-04 | 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 | 電気泳動方法、電気泳動装置及びそれに用いるマーカー試料 |
EP1133565B1 (en) * | 1999-07-02 | 2010-09-22 | MorphoSys AG | Generation of specific binding partners binding to (poly)peptides encoded by genomic dna fragments or ests |
US20030157720A1 (en) * | 2002-02-06 | 2003-08-21 | Expression Technologies Inc. | Protein standard for estimating size and mass |
DE60331226D1 (de) | 2002-05-24 | 2010-03-25 | Medtronic Inc | Verfahren und dna-konstrukte zur produktion von polypeptiden mit hoher ausbeute |
EP1554302A4 (en) * | 2002-05-24 | 2006-05-03 | Restoragen Inc | DNA RECOMBINATION METHODS AND PRODUCTS FOR HIGH-YIELD PRODUCTION OF POLYPEPTIDES |
WO2003099854A2 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Nps Allelix Corp. | Method for enzymatic production of glp-2(1-33) and glp-2-(1-34) peptides |
DE10244502B4 (de) * | 2002-09-25 | 2006-06-01 | Universität Gesamthochschule Kassel | Molekulargewichtsmarker für Proteine und Verfahren zu dessen Herstellung |
US20040137526A1 (en) * | 2002-10-15 | 2004-07-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Multidimensional protein separation system |
WO2004072236A2 (en) * | 2003-02-06 | 2004-08-26 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Methods and compositions for 3-d sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide cube gel electrophoresis |
EP1668146B1 (en) | 2003-09-25 | 2014-11-12 | Life Technologies Corporation | Homogeneous populations of molecules |
ME01366B (me) * | 2003-11-21 | 2013-12-20 | Nps Allelix Corp | POSTUPAK ZA PROIZVODNJU PEPTIDA 2 NALIK NA GLUKAGON l NJIHOVIH ANALOGA |
WO2005054548A2 (en) * | 2003-11-28 | 2005-06-16 | Invitrogen Corporation | Methods, compositions, and kits for protein crystallization |
WO2005114220A2 (en) * | 2004-05-17 | 2005-12-01 | Invitrogen Corporation | Compositions, kits, and methods for calibration in mass spectrometry |
US8728759B2 (en) * | 2004-10-04 | 2014-05-20 | National Research Council Of Canada | Reverse cumate repressor mutant |
US7935788B2 (en) * | 2004-10-04 | 2011-05-03 | National Research Council Of Canada | Reverse cumate repressor mutant |
US7939331B2 (en) | 2005-03-07 | 2011-05-10 | Life Technologies Corporation | Isotopically-labeled proteome standards |
US20090087873A1 (en) * | 2006-07-21 | 2009-04-02 | Invitrogen Corporation | Sharply resolving labeled protein molecular weight standards |
US7951559B2 (en) | 2007-07-25 | 2011-05-31 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Recombinant peptide production using a cross-linkable solubility tag |
GB0718012D0 (en) * | 2007-09-14 | 2007-10-24 | Lab901 Ltd | Method for protein staining prior to electrophoresis |
KR101016766B1 (ko) | 2009-01-15 | 2011-02-25 | 한국과학기술연구원 | 티오레독신이 융합된 단백질 발현용 플라스미드 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산방법 |
WO2011151721A1 (en) * | 2010-06-04 | 2011-12-08 | Lupin Limited | Process for production of fusion proteins using truncated e. coli thioredoxin |
WO2012149180A2 (en) | 2011-04-26 | 2012-11-01 | Life Technologies Corporation | Fluorescent tracking dye |
US8975373B2 (en) | 2012-06-28 | 2015-03-10 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multi-protein quantitation standard |
CN105143860B (zh) | 2013-03-14 | 2019-03-08 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 蛋白质标准品 |
WO2016044619A1 (en) | 2014-09-19 | 2016-03-24 | Li-Cor, Inc. | Multifunctional protein molecular weight ladders |
EP3574001A1 (en) | 2017-01-27 | 2019-12-04 | Abera Bioscience AB | New compositions, methods and uses |
Family Cites Families (87)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3980540A (en) | 1975-03-28 | 1976-09-14 | Hoefer Scientific Instruments | Vertical gel slab electrophoresis apparatus and method |
JPS5292590A (en) * | 1976-01-30 | 1977-08-04 | Oriental Yeast Co Ltd | Isoelectric point marker for separation of isoelectric points of gel |
US4403036A (en) | 1980-12-02 | 1983-09-06 | University Of Iowa Research Foundation | Genetic reagents for generating plasmids containing multiple copies of DNA segments |
US4405720A (en) | 1981-03-04 | 1983-09-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Silver stains for protein in gels |
US4507233A (en) * | 1981-04-22 | 1985-03-26 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Colored molecular weight marker |
US4499782A (en) | 1981-10-05 | 1985-02-19 | National Research Development Corporation | Transmission units of the toroidal race rolling friction type |
US4468466A (en) | 1982-02-16 | 1984-08-28 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Silver stains for protein in gels--a modified procedure |
SE8300693L (sv) | 1983-02-09 | 1984-08-10 | Sven Lofdahl | Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta |
US4518584A (en) | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
GB8415998D0 (en) * | 1984-06-22 | 1984-07-25 | Janssen Pharmaceutica Nv | Staining method |
US5279792A (en) | 1984-06-22 | 1994-01-18 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Staining kit for proteins and nucleic acids |
US4575452A (en) | 1984-09-21 | 1986-03-11 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Kit for silver staining proteins and nucleic acids |
US4791069A (en) * | 1984-09-21 | 1988-12-13 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Methods for attaching ligands or anti-ligands to a solid phase |
US4569794A (en) | 1984-12-05 | 1986-02-11 | Eli Lilly And Company | Process for purifying proteins and compounds useful in such process |
SE459503B (sv) | 1985-05-03 | 1989-07-10 | Excorim Kommanditbolag | Hybrid-dna-molekyl innefattande dna-sekvens som kodar foer protein g samt foerfarande foer framstaellning av protein g |
US4766224A (en) * | 1985-08-19 | 1988-08-23 | International Minerals & Chemical Corp. | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies |
US4677196A (en) * | 1985-09-06 | 1987-06-30 | International Minerals & Chemical Corp. | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies |
US5082773A (en) * | 1986-02-14 | 1992-01-21 | Pharmacia Lkb Biotechnology Ab | Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G |
US4782027A (en) * | 1987-01-22 | 1988-11-01 | President And Fellows Of Harvard College | Protein detection by negative staining |
US5643758A (en) | 1987-03-10 | 1997-07-01 | New England Biolabs, Inc. | Production and purification of a protein fused to a binding protein |
AU601273B2 (en) | 1987-03-20 | 1990-09-06 | Creative Biomolecules, Inc. | Leader sequences for the production of recombinant proteins |
US5215896A (en) | 1987-03-20 | 1993-06-01 | Creative Biomolecules, Inc. | Leader sequences for the production of recombinant proteins |
US5986061A (en) * | 1988-10-28 | 1999-11-16 | Pbl Biomedical Laboratories | Phosphorylated fusion proteins |
EP0413440B1 (en) * | 1989-07-19 | 1995-08-09 | Tonen Corporation | Peptidyl prolyl-cis.trans-isomerase |
US5594115A (en) | 1990-04-09 | 1997-01-14 | Pharmacia & Upjohn Company | Process of purifying recombinant proteins and compounds useful in such process |
US5316908A (en) * | 1990-07-13 | 1994-05-31 | Life Technologies, Inc. | Size markers for electrophoretic analysis of DNA |
US5595887A (en) | 1990-07-16 | 1997-01-21 | Bionebraska, Inc. | Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment |
US5132439A (en) * | 1990-11-19 | 1992-07-21 | Promega Corporation | Protein staining compositions and methods |
US5273906A (en) | 1990-11-19 | 1993-12-28 | Promega Corporation | Protein staining compositions and methods |
US5714326A (en) | 1991-01-24 | 1998-02-03 | Dawson; Elliott P. | Method for the multiplexed preparation of nucleic acid molecular weight markers and resultant products |
US5270181A (en) | 1991-02-06 | 1993-12-14 | Genetics Institute, Inc. | Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules |
US5292646A (en) | 1991-02-06 | 1994-03-08 | Genetics Institute, Inc. | Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules |
JPH04271800A (ja) * | 1991-02-28 | 1992-09-28 | Hitachi Ltd | 電気泳動装置 |
US5139630A (en) * | 1991-05-31 | 1992-08-18 | Beckman Instruments, Inc. | Identification of sample constituents utilizing capillary electrophoresis |
US6060296A (en) | 1991-07-03 | 2000-05-09 | The Salk Institute For Biological Studies | Protein kinases |
WO1993002107A1 (en) * | 1991-07-25 | 1993-02-04 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Immunoglobulin-combining artificial protein |
KR100242093B1 (ko) * | 1991-09-20 | 2000-02-01 | 그레고리 아보트 | 신경교 유도 신경 영양성 인자 |
DE69233491T2 (de) * | 1991-11-14 | 2006-04-06 | The Brigham And Women's Hospital Inc., Boston | Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend S-Nitrosolipoproteine und deren Verwendung |
WO1993020098A1 (en) * | 1992-04-07 | 1993-10-14 | The Scripps Research Institute | Process for preparing modified proteins |
US5439812A (en) * | 1992-04-08 | 1995-08-08 | The Pennsylvania Research Corporation | Antibodies catalyzing deamidation of proteins |
US5705649A (en) | 1992-07-20 | 1998-01-06 | Promega Corporation | Protein staining compositions and methods |
PT655890E (pt) * | 1992-07-31 | 2005-05-31 | Ab Enzymes Gmbh | Celulas recombinantes, construcoes de adn, vectores e metodos para expressao de enzimas degradantes de fitato em proporcoes desejadas |
US5605691A (en) * | 1992-09-17 | 1997-02-25 | Ophidian Pharmaceuticals, Inc. | Immunologically active proteins from inclusion bodies |
US5834247A (en) | 1992-12-09 | 1998-11-10 | New England Biolabs, Inc. | Modified proteins comprising controllable intervening protein sequences or their elements methods of producing same and methods for purification of a target protein comprised by a modified protein |
KR100260632B1 (ko) | 1992-12-28 | 2000-07-01 | 성재갑 | 이식형 소마토트로핀 조성물 |
US5801005A (en) | 1993-03-17 | 1998-09-01 | University Of Washington | Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated |
US5480971A (en) * | 1993-06-17 | 1996-01-02 | Houghten Pharmaceuticals, Inc. | Peralkylated oligopeptide mixtures |
ES2118534T3 (es) * | 1993-10-28 | 1998-09-16 | Life Technologies Inc | Escalera de marcadores de acido nucleico para estimacion de la masa. |
US6680378B1 (en) * | 1993-10-28 | 2004-01-20 | Invitrogen Corporation | Nucleic acid marker ladder for estimating mass |
US5449758A (en) | 1993-12-02 | 1995-09-12 | Life Technologies, Inc. | Protein size marker ladder |
ATE529444T1 (de) | 1994-01-11 | 2011-11-15 | Dyax Corp | Inhibitoren des humanplasmins, die sich von den kunitz domänen ableiten |
US5578180A (en) | 1994-03-31 | 1996-11-26 | Novel Experimental Technology | System for PH-neutral longlife precast electrophoresis gel |
US5643722A (en) * | 1994-05-11 | 1997-07-01 | Trustees Of Boston University | Methods for the detection and isolation of proteins |
US5891993A (en) | 1994-08-11 | 1999-04-06 | The Scripps Research Institute | Template assembled synthetic protein |
US5541087A (en) | 1994-09-14 | 1996-07-30 | Fuji Immunopharmaceuticals Corporation | Expression and export technology of proteins as immunofusins |
WO1996017942A1 (en) | 1994-12-07 | 1996-06-13 | Bionebraska, Inc. | Production of peptides using recombinant fusion protein constructs |
EP0744614B1 (en) | 1995-03-31 | 1999-12-22 | Laboratory of Molecular Biophotonics | Use of Isoelectric point markers for isoelectric focusing with fluorescence detection |
US5698521A (en) * | 1995-04-04 | 1997-12-16 | Zymogenetics, Inc. | Native calcitonin mimetics |
US6379516B1 (en) | 1995-04-26 | 2002-04-30 | Ethrog Biotechnology Ltd. | Apparatus and method for electrophoresis |
US5582702A (en) | 1995-04-26 | 1996-12-10 | Ethrog Biotechnology Ltd. | Apparatus and method for electrophoresis |
WO1996034878A1 (en) | 1995-05-04 | 1996-11-07 | The Scripps Research Institute | Synthesis of proteins by native chemical ligation |
US6184344B1 (en) | 1995-05-04 | 2001-02-06 | The Scripps Research Institute | Synthesis of proteins by native chemical ligation |
US5616502A (en) | 1995-05-19 | 1997-04-01 | Molecular Probes, Inc. | Non-specific protein staining using merocyanine dyes |
US6143557A (en) | 1995-06-07 | 2000-11-07 | Life Technologies, Inc. | Recombination cloning using engineered recombination sites |
US5888732A (en) * | 1995-06-07 | 1999-03-30 | Life Technologies, Inc. | Recombinational cloning using engineered recombination sites |
US6274369B1 (en) | 1996-02-02 | 2001-08-14 | Invitrogen Corporation | Method capable of increasing competency of bacterial cell transformation |
US6307018B1 (en) | 1996-12-24 | 2001-10-23 | The Scripps Research Institute | General chemical ligation |
ES2308800T3 (es) | 1997-01-08 | 2008-12-01 | Invitrogen Corporation | Metodos para la produccion de proteinas. |
US5917012A (en) | 1997-04-03 | 1999-06-29 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Peptide derivatives |
DE19729248C1 (de) | 1997-07-09 | 1998-07-09 | Jochen Uhlenkueken | Standardprotein |
EP1001963B1 (en) | 1997-07-15 | 2011-01-05 | Life Technologies, Inc. | Nucleic acid ladders |
US6057106A (en) | 1998-01-23 | 2000-05-02 | Novex | Sample buffer and methods for high resolution gel electrophoresis of denatured nucleic acids |
US6013165A (en) * | 1998-05-22 | 2000-01-11 | Lynx Therapeutics, Inc. | Electrophoresis apparatus and method |
US6251651B1 (en) * | 1998-06-04 | 2001-06-26 | Amano Pharmaceutical Co., Ltd. | Protein-deamidating enzyme, gene encoding the same, production process therefor, and use thereof |
US6800287B2 (en) * | 1998-09-25 | 2004-10-05 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Copolymer 1 related polypeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use |
AU6608500A (en) | 1999-07-27 | 2001-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Automated landmarking for two-dimensional electrophoresis |
US6436703B1 (en) | 2000-03-31 | 2002-08-20 | Hyseq, Inc. | Nucleic acids and polypeptides |
JP2004506221A (ja) | 2000-08-11 | 2004-02-26 | インヴィトロジェン コーポレーション | 高度に均一な電気泳動用分子マーカー |
US6562213B1 (en) | 2000-08-30 | 2003-05-13 | Ethrog Biotechnology Ltd. | Electrophoresis apparatus for simultaneous loading of multiple samples |
US20020134680A1 (en) | 2001-03-08 | 2002-09-26 | Shmuel Cabilly | Apparatus and method for electrophoresis |
JP4236938B2 (ja) * | 2001-05-10 | 2009-03-11 | インビトロジェン コーポレイション | 予め注型された水和可能分離媒体を電気泳動するための方法および装置 |
US7183116B2 (en) | 2001-05-14 | 2007-02-27 | The Institute For Systems Biology | Methods for isolation and labeling of sample molecules |
WO2003074992A2 (en) | 2002-03-01 | 2003-09-12 | Mds Proteomics Inc. | Phosphorylated proteins and uses related thereto |
US7084929B2 (en) | 2002-07-29 | 2006-08-01 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Video data filtering arrangement and method |
EP1668146B1 (en) | 2003-09-25 | 2014-11-12 | Life Technologies Corporation | Homogeneous populations of molecules |
WO2006138366A2 (en) | 2005-06-16 | 2006-12-28 | New England Biolabs, Inc. | Protein markers |
US20090087873A1 (en) | 2006-07-21 | 2009-04-02 | Invitrogen Corporation | Sharply resolving labeled protein molecular weight standards |
-
1998
- 1998-01-08 ES ES98903438T patent/ES2308800T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-08 US US09/004,068 patent/US6703484B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-08 DE DE69839553T patent/DE69839553D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-08 JP JP53117798A patent/JP2001512306A/ja not_active Ceased
- 1998-01-08 AU AU60209/98A patent/AU6020998A/en not_active Abandoned
- 1998-01-08 WO PCT/US1998/000492 patent/WO1998030684A1/en active Application Filing
- 1998-01-08 EP EP98903438A patent/EP0963435B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-08 EP EP09180307A patent/EP2196536A1/en not_active Withdrawn
- 1998-01-08 AT AT98903438T patent/ATE397061T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-01-08 EP EP10174765A patent/EP2336313A1/en not_active Withdrawn
-
2003
- 2003-12-08 US US10/728,766 patent/US7223566B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-01-11 US US11/329,401 patent/US7259242B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-01-11 US US11/329,418 patent/US7265206B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-12-29 US US11/618,723 patent/US8012715B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-12-29 US US11/618,725 patent/US8389681B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-11-29 JP JP2007308538A patent/JP4791436B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-01-13 US US13/006,354 patent/US8519099B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-07-25 US US13/951,285 patent/US9409942B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US7265206B2 (en) | 2007-09-04 |
US20040204563A1 (en) | 2004-10-14 |
US20140097086A1 (en) | 2014-04-10 |
US8519099B2 (en) | 2013-08-27 |
US20070184527A1 (en) | 2007-08-09 |
JP4791436B2 (ja) | 2011-10-12 |
US20060286633A1 (en) | 2006-12-21 |
JP2008119000A (ja) | 2008-05-29 |
US20110108420A1 (en) | 2011-05-12 |
EP0963435A1 (en) | 1999-12-15 |
EP2336313A1 (en) | 2011-06-22 |
US20020065392A1 (en) | 2002-05-30 |
JP2001512306A (ja) | 2001-08-21 |
US20060269992A1 (en) | 2006-11-30 |
EP2196536A1 (en) | 2010-06-16 |
US20070190606A1 (en) | 2007-08-16 |
US8389681B2 (en) | 2013-03-05 |
EP0963435A4 (en) | 2004-09-22 |
AU6020998A (en) | 1998-08-03 |
US8012715B2 (en) | 2011-09-06 |
US7259242B2 (en) | 2007-08-21 |
US9409942B2 (en) | 2016-08-09 |
US7223566B2 (en) | 2007-05-29 |
EP0963435B1 (en) | 2008-05-28 |
US6703484B2 (en) | 2004-03-09 |
DE69839553D1 (de) | 2008-07-10 |
ATE397061T1 (de) | 2008-06-15 |
WO1998030684A1 (en) | 1998-07-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2308800T3 (es) | Metodos para la produccion de proteinas. | |
WO1998030684A9 (en) | Methods for production of proteins | |
ES2880336T3 (es) | Métodos y productos para la síntesis de proteínas de fusión | |
US6852834B2 (en) | Fusion peptides isolatable by phase transition | |
ES2399031T3 (es) | Producción de proteínas recombinantes mediante escisión autoproteolítica de una proteína de fusión | |
Clever et al. | Simian virus 40 Vp2/3 small structural proteins harbor their own nuclear transport signal | |
CN108884154A (zh) | 具有独特剪接活性的断裂内含肽 | |
ES2351275T3 (es) | Evolución in vitro continua. | |
JPH03502935A (ja) | 組換え的に調製された官能的な合成タンパク質ポリマー | |
Blaschke et al. | [29] Protein engineering by expressed protein ligation | |
KR101360375B1 (ko) | 수용성 bmp-2를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 수용성 bmp-2의 제조방법 | |
NZ507294A (en) | Methods of cancer diagnosis using a chimeric toxin comprising GnRH and PE | |
CN104812773B (zh) | 表位标记用抗体、杂交瘤细胞株以及其用途 | |
EP1911841B1 (en) | Methods for production of proteins | |
GB2357084A (en) | A hydrophobic carrier peptide | |
Diaz et al. | Expressed protein ligation: General experimental protocols | |
KR20210079235A (ko) | Whep 도메인 융합에 의한 목적 단백질의 수용성 증진 방법 | |
ES2948496T3 (es) | Nuevos aminoácidos que tienen un resto de norborneno | |
KR101678955B1 (ko) | 3h7 항체와의 친화성이 향상된 펩티드 태그 및 이의 용도 | |
KR101694965B1 (ko) | 2b8 항체와의 친화성이 향상된 펩티드 태그 및 이의 용도 | |
Rosenberg | Site selective labelling of proteins via native chemical ligation |