ES2308800T3 - Metodos para la produccion de proteinas. - Google Patents

Abstract

Método de preparación de una composición de marcador del peso molecular, que comprende incubar proteínas recombinantes de diferente peso molecular con colorante de unión a proteínas, en el que se incuba una primera proteína recombinante con un primer colorante de tinción de proteínas y se incuba una pluralidad de proteínas recombinantes de pesos moleculares que difieren de dicha primera proteína recombinante y entre sí con un segundo colorante de tinción de proteínas de diferente color con respecto al primer colorante de tinción de proteínas, incubándose las proteínas con dichos colorantes en una disolución acuosa tamponada en condiciones de temperatura, tiempo y pH de la disolución controladas.

Description

Métodos para la producción de proteínas.

Campo de la invención

La presente invención está en los campos de la biología molecular y de la ingeniería de proteínas. La invención se refiere a métodos para la producción de proteínas recombinantes. Más específicamente, la invención se refiere a métodos para la producción de marcadores del peso molecular de proteínas y a marcadores del peso molecular producidos mediante estos métodos.

Técnica relacionada

Con el advenimiento de la tecnología del ADN recombinante, se ha convertido casi en rutina producir grandes cantidades de proteínas en sistemas de expresión heterólogos, tales como células huésped transformadas, para fines comerciales y de investigación básica. Entre los sistemas huésped de expresión, E. coli es el sistema más popular debido a la facilidad con la que puede manipularse E. coli. Sin embargo, la expresión de proteínas heterólogas en células huésped tiene algunas limitaciones. Estas incluyen: la traducción ineficaz de ARNm debido a la presencia de codones raramente usados (Kane, J., Current Opin. Biotech 6:494-500 (1995)), la inestabilidad del mRNA en E. coli (Bachmair, A et al., Science 234:179-186 (1986); Olins, P & Lee, S, Current Opin. Biotech 6:501-506 (1993)), el efecto tóxico de la proteína que está expresándose (Brosius, J., Gene 27:161-172 (1984); Studier, W & Mofatt, B., J. Mol Biol. 189:113-130 (1986)) y la formación de cuerpos de inclusión debido al plegamiento inapropiado de la proteína (Schein, C., Bio/Technology 7.1141-1149 (1989); Mitraki, A & King, J, Bio/Technology 7:690-697 (1989)). Para resolver estos problemas, se han desarrollado una variedad de técnicas.

La fusión génica es una de las estrategias más populares para expresar proteínas de interés. Esta técnica particular se usa para producir grandes cantidades de proteína heteróloga fusionando la proteína de interés con el extremo carboxilo terminal de una pareja de fusión (LaVallie, E., y McCoy, J., Curr. Opin. Biotech 6:501-506). Como ejemplo de este enfoque, se han desarrollado métodos para el aislamiento selectivo de una proteína o polipéptido deseados construyendo un vector recombinante que contiene una secuencia de ADN que codifica para la proteína o polipéptido deseados que está operativamente unida a una secuencia de ADN que codifica para la proteína A (documento WO 84/03103). Entonces se aísla selectivamente la proteína de fusión expresada mediante adsorción sobre un vehículo de soporte de IgG, que se une a la proteína A, seguido por desorción de la proteína de fusión. Entonces se escinde la proteína de fusión en un único sitio de escisión con un agente de escisión, que puede incluir proteasas, hidroxilamina, bromuro de cianógeno o ácido fórmico, para dar la proteína purificada.

La mayoría de los sistemas usados para la fabricación de polipéptidos recombinantes intenta minimizar la producción del polipéptido en cuerpos de inclusión en las células huésped de expresión. Una razón importante para estos intentos es que la producción de polipéptidos en cuerpos de inclusión a menudo produce un polipéptido bioquímicamente inactivo, desnaturalizado o por lo demás funcional o estructuralmente comprometido tras su liberación de los cuerpos de inclusión mediante técnicas de solubilización convencionales. Aunque una variedad de métodos han mostrado ser prometedores para minimizar la formación de cuerpos de inclusión, se han utilizado técnicas de fusión génica en particular para producir proteínas solubles que de otra forma se habrían producido como cuerpos de inclusión.

Sin embargo, la formación de cuerpos de inclusión dentro de células huésped también puede ser ventajosa. Por ejemplo, los cuerpos de inclusión constituyen "paquetes" sumamente densos y concentrados del polipéptido deseado, de los que pueden eliminarse proteínas de la célula huésped contaminantes mediante métodos tan sencillos como la centrifugación. Tras su aislamiento, la transformación controlada de los cuerpos de inclusión en una forma soluble podría proporcionar una fuente rica del polipéptido deseado en su forma pura, biológicamente activa o estructuralmente intacta. Sin embargo, la dificultad con un enfoque de este tipo ha sido que habitualmente es casi imposible predecir si un polipéptido recombinante formará o no cuerpos de inclusión cuando se expresa en una célula huésped.

Las realizaciones de la invención se refieren a un sistema en el que se usa la formación controlada de cuerpos de inclusión para producir un polipéptido deseado. Mediante esta formación controlada de cuerpos de inclusión, la purificación del polipéptido deseado se hace más rápida y más completa, y la solubilización controlada posterior de los cuerpos de inclusión proporciona un alto rendimiento de polipéptido puro en su forma activa.

Breve sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un método de preparación de una composición de marcador del peso molecular que comprende incubar proteínas recombinantes de diferente peso molecular con colorante de unión a proteínas, en el que cada proteína comprende una o más copias de un primer polipéptido recombinante, y se incuba una primera proteína recombinante con un primer colorante de tinción de proteínas y se incuba una pluralidad de proteínas recombinantes de pesos moleculares que difieren de dicha primera proteína recombinante y entre sí con un segundo colorante de tinción de proteínas de diferente color con respecto al primer colorante de tinción de proteínas, incubándose las proteínas con dichos colorantes en una disolución acuosa tamponada en condiciones de temperatura, tiempo y pH de la disolución controladas.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición de marcador teñido del peso molecular de proteínas que comprende proteínas recombinantes, en la que cada proteína tiene un peso molecular diferente con respecto a todas las otras proteínas en la composición, las proteínas comprenden una o más copias de un primer polipéptido recombinante, y una de las proteínas recombinantes está teñida con un colorante que está coloreado de manera diferente del colorante que tiñe las otras proteínas recombinantes.

Puede teñirse cualquier número de proteínas o péptidos según la invención. Tales métodos de tinción pueden realizarse sobre proteínas diferentes (de tamaño y/o tipo diferente) al mismo tiempo o por separado. Si se desea, pueden mezclarse proteínas teñidas por separado tras su tinción para proporcionar una mezcla de proteínas teñidas que tienen tamaños diferentes para producir un marcador del peso molecular de proteínas de la invención. Preferiblemente, el marcador del peso molecular de la invención comprende al menos dos y preferiblemente al menos tres proteínas de tamaños diferentes. Más preferiblemente, los marcadores del peso molecular de la invención comprenden 3-20, todavía más preferiblemente 3-15 y todavía más preferiblemente 3-10 proteínas de tamaños diferentes.

La invención proporciona marcadores teñidos del peso molecular producidos según los métodos de la invención y kits que los contienen. Tales kits comprenden un medio de soporte, tal como una caja, cartón o similar, que está compartimentalizado para recibir en confinamiento estrecho en el mismo uno o más medios de recipiente tales como tubos, viales, ampollas, frascos o similares, en el que un primer medio de recipiente comprende uno o más polipéptidos teñidos de la invención o uno o más marcadores teñidos del peso molecular de la invención. Pueden proporcionarse varios recipientes individuales en un kit, conteniendo cada recipiente un polipéptido teñido de tamaño (y/o tipo) diferente, de modo que el usuario final pueda preparar selectivamente diferentes marcadores del peso molecular que tengan una combinación diferente de proteínas de tamaño diferente. Por tanto, la descripción proporciona al usuario final flexibilidad para preparar un marcador del pero molecular apropiado dependiendo de las necesidades. Además, los kits también pueden proporcionar recipientes separados que contienen polipéptidos teñidos de manera diferente (por ejemplo, teñidos con colorantes diferentes), proporcionando así al usuario final flexibilidad no solo para variar el tamaño o patrón del marcador del peso molecular, sino también el color o los colores atribuidos a los péptidos o bandas individuales en el marcador del peso molecular. Los kits pueden comprender además uno o más medios de recipiente adicionales que contienen componentes que facilitan el análisis del tamaño de las proteínas, tales como acrilamida, SDS, reactivos y/o equipo de electroforesis en gel o capilar y similares.

Otras realizaciones preferidas de la presente invención resultarán evidentes para un experto habitual a la luz de los siguientes dibujos y descripción de la invención, y de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 (SEQ ID NO: 1) es una representación del fragmento de AvaI (gen 32) de 264 pb derivado de pPrL2107 usado para preparar multímeros en pPrL2001.

La figura 2 (SEQ ID NO: 2) es una representación del fragmento de 261 pb con un único sitio AvaI usado para preparar el plásmido ptcprl-monómero.

La figura 3 (SEQ ID NO: 5) es una representación de la secuencia de tiorredoxina delta, plásmido pTrxfusprl10A, usada para preparar la proteína de 10 kD.

La figura 4 (SEQ ID NO: 8) es una representación de la secuencia de trxA-concat que tiene sitios NcoI y NdeI usada para preparar concatámeros. Este plásmido, denominado pTrxA-concat, sirvió como pareja de inclusión.

La figura 5 (SEQ ID NO: 11) es una representación de la secuencia de tiorredoxina delta usada para preparar concatémeros de trxAtrxA.

La figura 6 (SEQ ID NO: 14) es una representación del fragmento de pareja de fusión de Dead-box de 138 pb usado para preparar el marcador del peso molecular mediante fusión con pTrxA-concat.

La figura 7 (SEQ ID NO: 17) es una representación del fragmento de pareja de fusión de KpnI metilasa de 15 kD usado para preparar el marcador del peso molecular mediante fusión con pTrxA-concat.

La figura 8 es una fotografía en color de un gel de gradiente de SDS-PAGE al 4-20% de cuatro volúmenes de carga diferentes de los marcadores teñidos previamente del peso molecular, que muestra la banda de referencia de 50 kD teñida con isotiocianato de eosina (banda rosa) y las bandas restantes en el marcador del peso molecular teñidas con RBBR (bandas azules).

La figura 9 es una fotografía de un gel de gradiente de SDS-PAGE al 4-20% de proteínas de referencia de 50 kD (carriles 1-8) y 60 kD (carriles 9-13) teñidas previamente durante la noche con isotiocianato de eosina a temperatura ambiente (carriles 1-4 y 9-12) o a 50ºC (carriles 5-8 y 13) a los pH indicados. M: marcadores patrones del peso molecular (dos preparaciones diferentes).

La figura 10 es una fotografía de un gel de gradiente de SDS-PAGE al 4-20% de marcadores del peso molecular de 40 kD (carriles 1-12) y 50 kD (carriles 13, 14) teñidos previamente durante la noche con isotiocianato de eosina a temperatura ambiente (carriles 1-3, 7-9) o a 50ºC (carriles 4-6, 10-14) a los pH indicados. M: marcador patrón del peso molecular.

La figura 11 es una fotografía de un gel de gradiente de SDS-PAGE al 4-20% de marcadores del peso molecular de 50 kD teñidos previamente durante la noche con isotiocianato de eosina a temperatura ambiente (carriles 1-3, 7-9) o a 50ºC (carriles 4-6, 10-14) a los pH indicados. M: marcador patrón del peso molecular.

La figura 12 es una fotografía de un gel de gradiente de SDS-PAGE al 4-20% de marcadores del peso molecular de 30 kD (carriles 1, 5, 12), 40 kD (carriles 2, 7, 10), 50 kD (carriles 3, 8, 11) y 60 kD (carriles 4, 6, 9) teñidos previamente con Procion rojo (carriles 1-4) o con isotiocianato de esosina (carriles 5-12) a los pH indicados. M: marcadores patrones del peso molecular (dos preparaciones diferentes).

La figura 13 es una fotografía de un gel de gradiente de SDS-PAGE al 4-20% de marcadores del peso molecular de 30 kD (carriles 1-2), 40 kD (carriles 3-4), 50 kD (carriles 5-6) y 60 kD (carriles 7-8) teñidos previamente con isotiocianato de verde malaquita a los pH indicados. M: marcadores patrones del peso molecular (dos preparaciones diferentes).

Descripción detallada de la invención Definiciones

En la descripción que sigue, se utilizan ampliamente varios términos usados convencionalmente en los campos de la biología molecular y la ingeniería de proteínas. Con el fin de proporcionar un entendimiento claro y sistemático de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, y del alcance que se le da a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones.

El término "polipéptido" se usa en el presente documento para significar una secuencia de aminoácidos contiguos, de cualquier longitud. Tal como se usa en el presente documento, los términos "péptido" o "proteína" pueden usarse de manera intercambiable con el término "polipéptido".

La expresión "molécula de ácido nucleico" tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de nucleótidos contiguos que pueden codificar para un polipéptido de longitud completa o un fragmento de cualquier longitud del mismo, o puede ser no codificante.

La expresión "proteína de pareja de inclusión" se usa en el presente documento para significar cualquier proteína o fragmento, parte, derivado o variante de los mismos que forma cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula huésped; pueden fusionarse moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas de pareja de inclusión con las que codifican para polipéptidos de interés con el fin de provocar que el polipéptido de interés se exprese conjuntamente en forma de cuerpos de inclusión en una célula huésped.

La expresión "constructo de fusión génica" tal como se usa en el presente documento significa una molécula de ácido nucleico que es el producto de la fusión o el ligamiento operativo de una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de interés con una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de pareja de inclusión. Un constructo de fusión génica tal como se define en el presente documento puede incluir secuencias de ácido nucleico adicionales que comprenden señales de expresión (tales como promotores o potenciadores) que se reconocen por una célula huésped y que dirigen la expresión del constructo de fusión génica para producir el polipéptido de interés.

Las frases "sustancialmente todos los polipéptidos se complejan con un colorante" o "sustancialmente todos los polipéptidos se tiñen con un colorante" o "sustancialmente todos los polipéptidos se marcan con un colorante" pueden usarse de manera intercambiable y tal como se usan en el presente documento significan que sustancialmente todos los polipéptidos o las proteínas en una muestra se han complejado, teñido o marcado completamente o de manera sustancialmente completa con uno o más colorantes. Puede determinarse tal finalización de la tinción mediante cualquiera de varias técnicas analíticas, aunque se prefiere el análisis de la movilidad y la intensidad de tinción mediante electroforesis en gel (véanse los ejemplos más adelante). Por ejemplo, la tinción incompleta o parcial de una muestra de proteínas da como resultado una población heterogénea de proteínas, cada una de las cuales puede tener una movilidad diferente durante la electroforesis en gel. Sin embargo, tras la tinción completa o sustancialmente completa, la movilidad permanecerá sustancialmente sin cambios incluso tras la tinción adicional (es decir, incubación adicional con colorante). Por tanto, puede medirse la tinción completa o sustancialmente completa mediante tales cambios de movilidad, o la carencia o carencia sustancial de los mismos. Alternativamente o además de tales cambios de movilidad, puede determinarse la finalización de la tinción mediante cambios en la intensidad de tinción. Por tanto, tras la tinción completa o sustancialmente completa según la invención, la intensidad de tinción de una muestra de proteínas de interés, determinada por ejemplo mediante electroforesis en gel, no cambiará sustancialmente tras la tinción adicional (es decir, incubación adicional con colorante).

Resumen

La invención proporciona métodos para preparar un marcador del peso molecular de proteínas, que está teñido previamente, y un marcador del peso molecular de proteínas producido mediante estos métodos.

La presente memoria descriptiva también da a conocer un método para producir y aislar polipéptidos recombinantes a partir de células huésped, en el que se producen los polipéptidos recombinantes como cuerpos de inclusión en las células huésped. Por conveniencia, este aspecto de la descripción se describe en primer lugar a continuación, antes de la invención. Específicamente, el método implica (a) obtener una célula huésped que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido recombinante operativamente unida a una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de pareja de inclusión, formando de ese modo un constructo de fusión génica; y (b) cultivar la célula huésped anterior en condiciones que favorecen la producción del polipéptido como cuerpos de inclusión en la célula huésped. La invención también proporciona el método anterior que comprende además (c) aislar los cuerpos de inclusión a partir de la célula huésped, lo más preferiblemente mediante centrifugación; y (d) liberar el polipéptido de los cuerpos de inclusión. Según la presente invención, puede obtenerse la primera molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido a partir de una célula procariota, particularmente una célula bacteriana y lo más particularmente una célula de Escherichia coli, o a partir de una célula eucariota, particularmente una célula animal, una célula vegetal o una célula de levaduras, más particularmente una célula animal de mamífero y lo más particularmente una célula humana, y la segunda molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína de pareja de inclusión puede obtenerse a partir de cualquier célula, preferiblemente una célula bacteriana y lo más preferiblemente una célula de Escherichia coli. La proteína de pareja de inclusión puede ser cualquier proteína que forme un cuerpo de inclusión tras su expresión en una célula huésped, y es preferiblemente una proteína bacteriana, más preferiblemente una tiorredoxina bacteriana o una tiorredoxina bacteriana modificada y lo más preferiblemente una forma truncada en el extremo carboxilo terminal de tiorredoxina de E. coli tal como se describe en más detalle a continuación. Preferiblemente, se inserta el constructo de fusión génica en un vector antes de introducirse en la célula huésped. Según un aspecto de la descripción, el polipéptido de interés puede liberarse de los cuerpos de inclusión, formados por el constructo de fusión génica, mediante escisión con un producto químico tal como bromuro de cianógeno, o más preferiblemente con una enzima tal como trombina o enterocinasa. Según otro aspecto, puede colocarse una secuencia de ácido nucleico que codifica para un sitio de escisión específico de proteína entre la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de pareja de inclusión y el polipéptido recombinante en el constructo de fusión génica; tras la expresión de la proteína de fusión como cuerpos de inclusión en las células huésped, puede liberarse entonces el polipéptido recombinante de los mismos mediante el tratamiento de los cuerpos de inclusión con una enzima u otro producto químico que reconoce y escinde específicamente en el sitio de escisión específico de proteína. La descripción también proporciona los métodos descritos anteriormente en los que el constructo de fusión génica comprende el plásmido pTreprl-monómero y proporciona el plásmido pTrcprl-monómero. La descripción también se refiere a los métodos descritos anteriormente en los que la célula huésped es una célula bacteriana, lo más preferiblemente una célula de Escherichia coli, y en los que el vector usado es un vector de expresión, lo más preferiblemente los plásmidos pTrc99A o pTrxfus. La descripción también proporciona estos vectores y células huésped, particularmente células bacterianas y lo más particularmente células de Escherichia coli, que comprenden estos vectores. La descripción proporciona además polipéptidos recombinantes preparados mediante los métodos anteriores, el plásmido pTrcprl-monómero y el plásmido pTrxA-concat.

Aunque la presente descripción se refiere particularmente a métodos para la producción de un fragmento de la proteína del gen 32 del bacteriófago T4, KpnI metilasa o proteína Dead-Box, un experto habitual en la técnica apreciará fácilmente que, usando los métodos de la descripción, puede producirse cualquier polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos contiguos de cualquier longitud como cuerpos de inclusión en una célula huésped y aislarse de la misma.

Fusión génica

Los métodos de la presente descripción utilizan la técnica de fusión génica para producir un constructo de fusión génica que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica para un primer polipéptido operativamente unida a una segunda molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de pareja de inclusión. La molécula de ácido nucleico que codifica para el primer polipéptido puede obtenerse a partir de una célula bacteriana, particularmente una célula de E. coli; a partir de una célula animal, preferiblemente una célula de mamífero y lo más preferiblemente una célula humana; una célula vegetal; o una célula de levaduras. Tal como se describe en más detalle a continuación, la molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína de pareja de inclusión puede obtenerse a partir de cualquier célula, preferiblemente a partir de una célula bacteriana y lo más preferiblemente a partir de una célula de Escherichia coli.

Se conocen bien en la técnica métodos para la construcción de constructos de fusión génica que comprenden una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido deseado, fusionada con una secuencia de ADN procariótico (véase, por ejemplo, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, págs. 17.2-17.9 (1989); Ausubel, FM, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Nueva York: John Wiley & Sons, Inc., pág. 16.4.1-16.8.14 (1994)) También pueden usarse de manera equivalente en los métodos de la presente invención otros métodos adecuados que son rutinarios para un experto habitual en la técnica.

Vectores y células huésped

La presente descripción también se refiere a vectores que comprenden las moléculas de ADN aisladas de la presente invención, a células huésped que se modifican mediante ingeniería genética con los vectores recombinantes y a métodos para la producción de un polipéptido recombinante usando estos vectores y células huésped.

El vector usado en la presente descripción puede ser, por ejemplo, un fago o un plásmido, y es preferiblemente un plásmido. Se prefieren vectores que comprenden regiones de control que actúan en cis para el ácido nucleico que codifica para el polipéptido de interés. Pueden suministrarse por el huésped factores que actúan en trans apropiados, suministrarse por un vector de complementación o suministrarse por el propio vector tras su introducción en el huésped.

En ciertas realizaciones preferidas con respecto a esto, los vectores proporcionan una expresión específica, que puede ser inducible y/o específica del tipo celular. Se prefieren particularmente entre tales vectores aquellos inducibles por factores medioambientales que son fáciles de manipular, tales como temperatura y aditivos nutritivos.

Los vectores de expresión útiles en la presente descripción incluyen vectores derivados de cromosomas, episomas y virus, por ejemplo vectores derivados de plásmidos bacterianos o bacteriófagos, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como cósmidos y fagémidos.

El inserto de ADN debe unirse operativamente a un promotor adecuado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp y lac de E. coli. El experto conocerá otros promotores adecuados. Los constructos de fusión génica contendrán además sitios para la iniciación de la transcripción, terminación y, en la región transcrita, un sitio de unión a ribosomas para la traducción. La parte codificante de los transcritos maduros expresados por los constructos incluirá preferiblemente un codón de iniciación de la traducción al comienzo y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) colocado apropiadamente al final del polinucleótido que va a traducirse.

Los vectores de expresión incluirán preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Tales marcadores incluyen genes de resistencia a tetraciclina o ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias.

Entre los vectores preferidos para su uso se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles de Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene; pcDNA3 disponible de Invitrogen; y pGEX, pTrxfus, pTrc99a, pET-5, pET-9, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia. Otros vectores adecuados resultarán fácilmente evidentes para el experto.

Los ejemplos representativos de células huésped apropiadas incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas tales como E. coli, Streptomyces spp, Erwinia spp, Klebsiella spp. y Salmonella typhimurium. Se prefiere como célula huésped E. coli y se prefieren particularmente las cepas DH10B y Stbl2 de E. coli, que están disponibles comercialmente (Life Technologies, Inc; Rockville, Maryland).

Parejas de inclusión

Se ha descubierto inesperadamente que el uso de una versión modificada del gen que codifica para la proteína de pareja de inclusión inducirá a la célula huésped para producir la proteína de fusión, que comprende el polipéptido de interés, como cuerpos de inclusión intracelulares. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "versión modificada de un gen" significa una versión de un gen que comprende una alteración de la secuencia normal o más comúnmente encontrada del gen, que da como resultado la expresión de la proteína codificada, en un estado fusionado o no fusionado, en cuerpos de inclusión en una célula huésped. Tales alteraciones pueden incluir, pero no se limitan a, deleciones, sustituciones, inserciones, mutaciones puntuales y similares.

Las proteínas de pareja de inclusión preferidas para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, versiones modificadas de la proteína de unión a maltosa de E. coli (Betton y Hofnug, J. Biol. Chem. 271:8046-8052 (1996)), ARNasa II de E. coli (Coburn y Mackie, J. Biol. Chem. 271:1048-1053 (1996)), fosfatasa alcalina de E. coli (Derman y Beckwith, J. Bacteriol. 177:3764-3770 (1995); Georgiou et al., Appl. Env. Microbiol. 52.1157-1161 (1986)), fosfolipasa A de E. coli (Dekker et al., Eur. J. Biochem. 232.214-219 (1995)), \beta-lactamasa de E. coli (Rinas y Bailey, Appl. Env. Microbiol. 59: 561-566 (1993); Georgiou et al., Appl. Env, Microbiol. 52.1157-1161 (1986)), proteína MalK de Salmonella typhimurium (Schneider et al., Prot. Exp. Purif. 6:10-14 (1995)), endoglucanasa D de Clostridium thermocellum (Tokatlidis et al., FEBS Lett. 282:205-208 (1991)), proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis subsp. aizawai IPL7 (Oeda et al., J. Bacteriol. 171.3568-3571 (1989), procatepsina B humana (Kuhelj et al., Eur. J Biochem. 229:533-539 (1995)), interferón-\gamma porcino (Vandenbroeck et al., Eur. J. Biochem. 215:481-486 (1993)), ADN polimerasa de T5 (Chatterjee et al., Gene 97:13-19 (1991)) y tiorredoxina de E. coli (Hoog et al., BioSci. Rep. 4:917-923 (1984)). Más preferible para su uso en la presente invención es una tiorredoxina de E. coli modificada, que tal como se usa en el presente documento es una proteína tiorredoxina que tiene la capacidad de formar cuerpos de inclusión (en constructos fusionados o no fusionados) tras su expresión en una célula huésped. Se prefiere particularmente un mutante por deleción de la tiorredoxina de E. coli codificada por el gen trxA, y lo más particularmente la forma truncada en el extremo carboxilo terminal de trxA de E. coli que tiene una secuencia de nucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO: 8, designada a continuación en el presente documento pTrxA-concat. La célula huésped recombinante que comprende pTrxA-concat, DH10B de E. coli (pTrxA-concat), se depositó el 6 de enero de 1997 en la Colección de Cultivos de Investigación Agrícola (Agricultural Research Culture Collection) (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EE.UU., como depósito número NRRL B-21653.

Las versiones truncadas de trxA que pueden usarse en la presente invención incluyen aquellas en las que se delecionan 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 3,3, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50 aminoácidos del extremo carboxilo terminal de la tiorredoxina, preferiblemente aquellas en las que se delecionan 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ó 33 aminoácidos y lo más preferiblemente aquellas en las que se delecionan 23 aminoácidos (pTrxfusprl10A).

Un experto habitual en la técnica conoce bien métodos para preparar y expresar constructos de fusión génica modificados, tales como un constructo que codifica para una tiorredoxina modificada o truncada, y se describen ampliamente en la bibliografía (véase, por ejemplo Winnacker, From Genes to Clones, Nueva York: VCH Publishers, págs. 451-481 (1987)), y en detalle en los ejemplos a continuación. Para determinar si un constructo de fusión génica modificado particular induce la producción de cuerpos de inclusión en una célula huésped, puede transferirse el constructo en una célula huésped y expresarse tal como se describe a continuación. Entonces puede examinarse una suspensión de células huésped para detectar la presencia de cuerpos de inclusión por cualquier medio, tal como microscopía (por ejemplo, microscopía de contraste de fases, de interferencia de Nomarski, electrónica o de fluorescencia), adecuado para la detección de la presencia de cuerpos de inclusión dentro de células huésped individuales.

La secuencia de ácido nucleico de la pareja de inclusión puede insertarse en el cromosoma de la célula huésped, o en un vector que es preferiblemente un vector de expresión. Se prefieren particularmente como vectores de expresión en la presente invención vectores de expresión bien conocidos tales como pAR (para lacZ), pATH (para trpE), pMAL (para malE), pGEX (para GST) o pTrxfus (para trxA). Estos vectores y otros que también pueden ser adecuados están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Pharmacia (Piscataway, Nueva Jersey). Alternativamente, pueden usarse otros vectores bien caracterizados conocidos en la técnica.

Tal como se describió anteriormente, los métodos de la presente invención son adecuados para la producción de cualquier polipéptido de cualquier longitud, y son particularmente adecuados para producir polipéptidos cortos o aquellos que son tóxicos para las células huésped, que de lo contrario no se expresarían por las células huésped en cantidades significativas. Se conocen bien en la técnica métodos para el aislamiento de secuencias de ácido nucleico que codifican para un polipéptido de interés a partir de una variedad de fuentes (véase, por ejemplo, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor, Nueva York. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). Una vez que se ha aislado la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de interés, se fusiona o une operativamente al ácido nucleico de la pareja de inclusión modificada anterior, formando un vector, preferiblemente un vector de expresión, que comprende el constructo de fusión génica que va a usarse en la transformación de las células huésped. Se prefiere particularmente como constructo de fusión génica el plásmido ptcprl-monómero. Los métodos para la fusión de la secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de interés con una secuencia de ácido nucleico de la pareja de inclusión truncada y la inserción en un vector de expresión son rutinarios para un experto habitual en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M., et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Nueva York: John Wiley & Sons, Inc., págs. 16.4 1-16 8 14 (1994)).

Expresión de proteína recombinante como cuerpos de inclusión

El constructo de fusión génica puede insertarse en el cromosoma de la célula huésped, o en un vector que es preferiblemente un vector de expresión. La introducción del constructo de fusión génica en la célula huésped para producir una célula huésped transformada puede efectuarse mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Tales métodos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986). Una vez que se han obtenido células huésped transformadas, pueden cultivarse las células en cualquier condición fisiológicamente compatible de pH y temperatura, en cualquier medio nutritivo adecuado que contenga fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y minerales esenciales que ayuden al crecimiento de la célula huésped. Las condiciones de cultivo que producen proteínas recombinantes variarán según el tipo de vector usado para transformar las células huésped. Por ejemplo, ciertos vectores de expresión comprenden regiones reguladoras que requieren crecimiento celular a ciertas temperaturas, o la adición de ciertos productos químicos o agentes inductores al medio de crecimiento celular para iniciar la expresión génica que da como resultado la producción del polipéptido recombinante. Por tanto, la expresión "condiciones que producen polipéptidos recombinantes", tal como se usa en el presente documento, no pretende limitarse a ningún conjunto de condiciones de cultivo. Se conocen bien en la técnica condiciones y medios de cultivo apropiados para las células huésped y vectores descritos anteriormente.

Se ha encontrado inesperadamente que el cultivo de las células huésped transformadas con los constructos de fusión génica proporcionados en el presente documento dará como resultado la producción del polipéptido recombinante de interés como cuerpos de inclusión. Por tanto, pueden considerarse así condiciones que producen polipéptidos recombinantes de rutina para favorecer la producción del polipéptido recombinante como cuerpos de inclusión en la célula huésped, y pueden usarse para producir polipéptidos recombinantes como cuerpos de inclusión según la presente invención, no se requiere el uso de condiciones de cultivo inusuales o experimentación excesiva.

Aislamiento y purificación de polipéptido recombinante

Tal como conoce bien un experto habitual en la técnica, se diseñan normalmente métodos para la producción de polipéptidos mediante técnicas de ADN recombinante para minimizar la producción de los polipéptidos en cuerpos de inclusión en las células huésped, debido a las dificultades reales y percibidas para aislar los polipéptidos a partir de los cuerpos de inclusión. Sin embargo, según la presente descripción, puede usarse ventajosamente la producción de un polipéptido recombinante en cuerpos de inclusión para proporcionar un aislamiento y una purificación rápidos del polipéptido.

Tras su producción como cuerpos de inclusión en las células huésped, el producto de fusión génica que comprende el polipéptido de interés puede aislarse mediante varias técnicas. Para liberar los cuerpos de inclusión de las células huésped, las células deben lisarse o romperse. Esta lisis puede realizarse poniendo en contacto las células con una solución hipotónica, mediante tratamiento con una enzima que rompe la pared celular tal como lisozima, mediante sonicación, mediante tratamiento con alta presión o mediante una combinación de los métodos anteriores. También pueden usarse otros métodos de ruptura y lisis de células bacterianas que se conocen por un experto habitual. Preferiblemente, las células bacterianas se rompen mediante tratamiento con lisozima seguido por sonicación, tal tratamiento producirá
una mezcla de residuos celulares que comprende los cuerpos de inclusión, que no se rompen mediante este tratamiento.

Tras la ruptura, se separan los cuerpos de inclusión de los residuos celulares mediante cualquier técnica adecuada para la separación de partículas en mezclas complejas. Las técnicas preferidas de este tipo incluyen centrifugación o el uso de un separador de partículas automatizado tal como los disponibles comercialmente de, por ejemplo, Coulter Electronics (Hialeah, Florida). Lo más preferido para aislar cuerpos de inclusión es la centrifugación. Mediante la presente invención, pueden aislarse cuerpos de inclusión centrifugando la mezcla de residuos celulares anterior a aproximadamente 1-25.000 x g, preferiblemente a aproximadamente 100-20.000 x g, más preferiblemente a aproximadamente 5.000-15.000 x g y lo más preferiblemente a aproximadamente 10.000 x g. Preferiblemente, se realiza la centrifugación a aproximadamente 4º-10ºC durante aproximadamente 15-60 minutos, lo más preferiblemente a aproximadamente 4ºC durante aproximadamente 30 minutos. Tras la centrifugación, se eliminan los residuos celulares contenidos en el sobrenadante de los cuerpos de inclusión sedimentados y se usa el sedimento para la purificación del polipéptido recombinante de interés.

En la preparación para la purificación, se solubiliza el producto de fusión génica contenido en los cuerpos de inclusión, que comprende el polipéptido recombinante. La solubilización se realiza preferiblemente mediante tratamiento con un agente desnaturalizante, preferiblemente clorhidrato de guanidinio o urea, y lo más preferiblemente urea aproximadamente 8 M.

Antes, durante o tras la solubilización de los cuerpos de inclusión, el polipéptido recombinante de interés puede escindirse opcionalmente de la proteína de pareja de inclusión mediante técnicas que se describen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F M, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Nueva York: John Wiley & Sons, Inc, págs. 16.4.5-16.4.17 (1994)). Sin embargo, un experto habitual entenderá que la producción de polipéptidos recombinantes mediante la presente invención no requiere necesariamente tal escisión. Esta escisión puede realizarse mediante un método de escisión química, por ejemplo poniendo en contacto los cuerpos de inclusión con una cantidad que libera el polipéptido de un agente de escisión química en condiciones que favorecen la liberación del polipéptido de los cuerpos de inclusión. Los agentes de escisión química preferidos incluyen bromuro de cianógeno, hidroxilamina o disoluciones de pH bajo (hidrólisis ácida). Alternativamente, y más preferiblemente, se realiza la escisión de la proteína de pareja de inclusión mediante un método de escisión enzimática, preferiblemente poniendo en contacto los cuerpos de inclusión con un cantidad que libera el polipéptido de un agente de escisión enzimática en condiciones que favorecen la liberación del polipéptido de los cuerpos de inclusión. Los agentes de escisión enzimática preferidos incluyen el factor Xa (para productos de fusión génica que comprenden una pareja de inclusión de malE o GST) o trombina (para productos de fusión génica que comprenden una pareja de inclusión de GST), y se prefiere particularmente enterocinasa (para productos de fusión génica que comprenden una pareja de inclusión de trxA). Estos métodos de escisión química y enzimática se llevan a cabo preferiblemente en condiciones que favorecen la liberación del polipéptido de los cuerpos de inclusión, que se conocen bien por un experto habitual en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M., et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Nueva York. John Wiley & Sons, Inc, págs. 16.4.5-16.4.17 (1994)). Tal liberación puede dar como resultado la solubilización del péptido de interés y por tanto puede ser innecesaria la solubilización adicional. Alternativamente, puede facilitarse la escisión de la proteína de pareja de inclusión del polipéptido durante la formación del constructo de fusión génica. En un esquema de este tipo, puede colocarse una secuencia de ácido nucleico que codifica para un sitio de escisión específico de proteína entre la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de pareja de inclusión (tal como la tiorredoxina modificada) y el polipéptido recombinante en el constructo de fusión génica; tras la expresión de la proteína de fusión como cuerpos de inclusión en las células huésped, entonces puede aislarse el polipéptido recombinante tratando los cuerpos de inclusión con una enzima (tal como trombina o enterocinasa) o un producto químico (tal como bromuro de cianógeno) que reconoce y escinde específicamente en el sitio de escisión específico de proteína. La escisión de la proteína de pareja de inclusión puede realizarse alternativamente durante o tras cualquiera de las etapas posteriores descritas a continuación.

Tras la solubilización, el producto de fusión génica o el polipéptido recombinante escindido pueden replegarse mediante diálisis para eliminar el agente desnaturalizante. La diálisis se realiza preferiblemente durante aproximadamente 18-48 horas a aproximadamente 4ºC frente a una solución salina tamponada isotónica.

Tras la solubilización y el replegamiento opcional, el producto de fusión génica o el polipéptido recombinante escindido pueden purificarse mediante cualquiera de una variedad de técnicas de purificación de proteínas que conoce bien un experto habitual en la técnica. Las técnicas adecuadas para la purificación incluyen, pero no se limitan a, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, electroforesis, inmunoadsorción, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía líquida (LC), LC de alta resolución (HPLC), LC de rápida resolución (FPLC), cromatografía sobre hidroxiapatito y cromatografía sobre lectinas. Lo más preferiblemente, se emplean LC, HPLC o FPLC para la purificación.

Tal como se describió anteriormente, puede producirse cualquier polipéptido recombinante y aislarse de las células huésped mediante los métodos de la presente invención. En particular, es posible producir tiorredoxina recombinante mediante estos métodos. En un esquema de este tipo, puede producirse tiorredoxina, o un fragmento de la misma, mediante una serie de etapas que comprenden (a) modificar el gen de tiorredoxina, (b) transferir el gen de tiorredoxina modificado a una célula huésped y (c) cultivar la célula huésped en condiciones que favorecen la producción de tiorredoxina como cuerpos de inclusión en la célula huésped. Estas etapas de modificación, transferencia y cultivo pueden llevarse a cabo para la tiorredoxina tal como se describió anteriormente para la producción de cualquier polipéptido y tal como se describe en más detalle en los ejemplos a continuación.

Producción de marcadores del peso molecular de proteínas

Pueden usarse los métodos de la presente invención para preparar un marcador del peso molecular de proteínas que va a usarse como patrón del tamaño molecular o el peso molecular en técnicas de análisis de proteínas tales como la electroforesis. En esta realización, descrita en mayor detalle a continuación en los ejemplos 3-9, puede prepararse una serie de proteínas de fusión, en las que se une la proteína de pareja de inclusión a uno o más polipéptidos recombinantes o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, puede insertarse una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de pareja de inclusión de tiorredoxina modificada en un vector, preferiblemente un vector de expresión, para formar un vector de fusión tal como el plásmido pTrxA-concat (figura 4; SEQ ID NO: 8). Entonces puede ligarse este vector a fragmentos únicos o múltiples de un polipéptido recombinante tal como tiorredoxina (figura 5; SEQ ID NO: 11), proteína Dead-Box de E. coli (figura 6, SEQ ID NO 14), KpnI metilasa (figura 7, SEQ ID NO: 17) o proteína del gen 32 de T4 modificada de 264 pb (figura 1, SEQ ID NO: 1), cada una de un tamaño elegido (por ejemplo, 5 kD o 10 kD). Tras la inserción de la molécula de ácido nucleico o vector en la célula huésped (es decir, la transformación de la célula huésped), pueden producirse entonces los polipéptidos mediante expresión de las moléculas de ácido nucleico en las células huésped. Resultará obvio para un experto habitual en la técnica que son posibles varios escenarios de expresión. Por ejemplo, pueden usarse los métodos de la presente invención para producir una molécula de ácido nucleico que codifica para una pluralidad de los polipéptidos que forman el marcador del peso molecular, o para producir múltiples moléculas de ácido nucleico cada una de las cuales codifica para un polipéptido de peso molecular diferente del marcador del peso molecular. Entonces pueden transformarse células huésped con un ácido nucleico que codifica para una pluralidad de tales polipéptidos, o con múltiples moléculas de ácido nucleico que codifican para un polipéptido de peso molecular diferente. Alternativamente, pueden transformarse múltiples células huésped, cada una con una única molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido diferente del marcador del peso molecular; en este escenario, pueden mezclarse polipéptidos producidos por las células huésped para formar el marcador del peso molecular. En cada uno de estos escenarios, la expresión de estos constructos producirá preferiblemente cuerpos de inclusión en las células huésped que comprenden polipéptidos desde tan sólo 5-10 kD hasta 250-330 kD. Además, los incrementos de peso molecular del marcador del peso molecular producido mediante los presentes métodos pueden definirse alterando simplemente la longitud o el número de copias del gen del polipéptido recombinante unido al constructo de fusión génica de la proteína de pareja de inclusión. Por tanto, es posible, según la presente invención, producir un marcador del peso molecular de proteínas que comprende una colección de proteínas que oscilan, por ejemplo, desde aproximadamente 5 kD hasta aproximadamente 300 kD, preferiblemente desde aproximadamente 5 kD hasta aproximadamente 250 kD y más preferiblemente desde aproximadamente 10 kD hasta aproximadamente 220 kD, en incrementos de, por ejemplo 5 kD, 10 kD, 20 kD, 25 kD, 50 kD, 100 kD o mayores. Por supuesto, un experto habitual en la técnica entenderá que otros incrementos del tamaño o el peso molecular pueden ser más adecuados para ciertas aplicaciones, y pueden prepararse mediante sólo modificaciones menores de los presentes métodos (tales como aumentando o disminuyendo la longitud del gen que codifica para el polipéptido recombinante fusionado tal como se describió anteriormente); tales métodos y composiciones pueden proporcionarse por tanto sin apartarse del alcance de la presente invención o cualquier realización de la misma.

En una realización preferida, los marcadores del peso molecular de proteínas preparados tal como se describió anteriormente pueden estar sin teñir o pueden teñirse previamente con uno o más colorantes de unión a proteínas para facilitar el uso de los marcadores del peso molecular en técnicas que requieren marcadores teñidos previamente del peso molecular de proteínas tales como inmunotransferencia de tipo Western. Según la invención, puede usarse cualquiera de varios colorantes de unión a proteínas para teñir proteínas o los marcadores del peso molecular de la invención, para producir los marcadores teñidos previamente del peso molecular de la invención. Puede usarse cualquier colorante que se una covalentemente a una o más de las proteínas de marcadores del peso molecular, incluyendo colorantes visibles (cromóforos), colorantes fluorescentes (fluoróforos), colorantes fosforescentes (fósforos) y similares. Los colorantes preferidos con respecto a esto incluyen, pero no se limitan a, azul brillante de Remazol R (RBBR), isotiocianato de esosina, isotiocianato de verde malaquita, naranja reactivo (también conocido como Procion amarillo), Procion rojo, isotiocianato de fluoresceína, isotiocianato de rodamina, yodoacetamida de eosina, negro reactivo 5, violeta brillante de Remasol 5R, naranja reactivo 14 y similares. Se prefieren particularmente para su uso en los presentes métodos RBBR, isotiocianato de eosina e isotiocianato de verde malaquita. Estos y otros colorantes que pueden usarse en los presentes métodos están disponibles comercialmente, por ejemplo de Sigma/Aldrich (St Louis, MO) y Molecular Probes (Eugene, OR).

Según la invención, pueden producirse marcadores teñidos previamente del peso molecular incubando una o más de las proteínas de marcadores del peso molecular, que pueden producirse de manera natural o producirse de manera recombinante tal como se refirió anteriormente, con uno o más de los colorantes indicados anteriormente en una disolución acuosa tamponada en condiciones de temperatura, tiempo y pH de la disolución controladas. Preferiblemente, las proteínas de marcadores del peso molecular se suspenden en una disolución acuosa tamponada (tal como solución salina tamponada con Tris, fosfato, carbonato o HEPES que comprende NaCl a aproximadamente 10-300 mM, preferiblemente a aproximadamente 50-200 mM) a una concentración de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 0,1 a 10, o de aproximadamente 0,5 a 10 unidades de A_{280}/ml, más preferiblemente a una concentración de aproximadamente 1-10, aproximadamente 1-5 o aproximadamente 1-4 unidades de A_{280}/ml. A la disolución de proteína(s), pueden añadirse uno o más de los colorantes anteriores a intervalos de concentración que son específicos para cada colorante, normalmente en el intervalo de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 1000 mg/ml, de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 500 mg/ml, de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml, de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml o de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml. Por ejemplo, puede añadirse RBBR a la disolución de proteína a una concentración final de aproximadamente 0,3-50 mg/ml, preferiblemente a aproximadamente 5-40 mg/ml y más preferiblemente a aproximadamente 10-30 mg/ml. Puede añadirse isotiocianato de eosina a la disolución de proteína a una concentración final de aproximadamente 1-30 mg/ml y más preferiblemente a aproximadamente 7-10 mg/ml. Puede añadirse isotiocianato de verde malaquita a la disolución de proteína a una concentración final de aproximadamente 5-30 mg/ml, más preferiblemente a aproximadamente 20-30 mg/ml. Un experto habitual puede determinar las concentraciones óptimas para los otros colorantes que pueden usarse para teñir las proteínas y los marcadores del peso molecular según los presentes métodos sin experimentación excesiva, usando los intervalos de concentración indicados anteriormente como directriz.

La tinción de los marcadores del peso molecular de proteínas también debe realizarse en condiciones de pH de la disolución y/o temperatura controladas. Preferiblemente, la disolución se tampona hasta un pH (medido a aproximadamente temperatura ambiente (es decir, aproximadamente 24ºC-25ºC) antes de la adición de las proteínas, marcadores del peso molecular y colorante(s)) de aproximadamente 7-12, aproximadamente 7-11, aproximadamente 8-11, o aproximadamente 8,5-10,5, de manera preferible aproximadamente 7,2-9,7, de manera más preferible aproximadamente 8,2-9,7 y de la manera más preferible aproximadamente 9,2-9,7. Durante la reacción de tinción, las disoluciones deben incubarse a una temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 90ºC, de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 80ºC, preferiblemente de aproximadamente temperatura ambiente (es decir, aproximadamente 20ºC-25ºC) a aproximadamente 80ºC, de aproximadamente 35ºC a aproximadamente 80ºC, de aproximadamente 40ºC a aproximadamente 75ºC, de aproximadamente 45ºC a aproximadamente 70ºC, de aproximadamente 45ºC a aproximadamente 70ºC, de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC, de aproximadamente 45ºC a aproximadamente 65ºC, más preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 60ºC y lo más preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 50ºC. Para la producción de proteínas o marcadores del peso molecular teñidos, deben incubarse las disoluciones de proteína-colorante en las condiciones indicadas anteriormente durante aproximadamente 4-48 horas, de manera preferible aproximadamente 6-48 horas, de manera más preferible aproximadamente 4-24 horas, aproximadamente 6-24 horas, aproximadamente 8-24 horas, aproximadamente 10-24 horas, aproximadamente 12-24 horas y de la manera más preferible aproximadamente 12-18 horas (es decir, "durante la noche" tal como entenderá el término el experto). Tras la incubación, pueden aislarse la/las proteína(s) o marcadores del peso molecular teñidos del colorante no conjugado y cualquier otra impureza mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, diálisis, cromatografía, difusión en gel, etc.) y pueden almacenarse en disolución a de -70ºC a 4ºC, o pueden liofilizarse y almacenarse a de -70ºC a temperatura ambiente (es decir, aproximadamente 20ºC-25ºC) hasta su uso.

En una realización particularmente preferida de este tipo, el marcador teñido previamente del peso molecular de proteínas puede comprender una colección de marcadores del peso molecular de proteínas que están espaciados uniformemente en SDS-PAGE y que comprenden además una banda de proteína de referencia teñida con un color diferente de las otras bandas, para permitir una fácil orientación de todas las bandas sobre el gel. Por ejemplo, tal preparación de marcador teñido previamente del peso molecular puede comprender una colección de bandas en la que una banda (una banda de referencia) está teñida con isotiocianato de eosina y las bandas restantes están teñidas con RBBR. Tal enfoque se describe con detalle completo en el ejemplo 4 a continuación.

Resultará fácilmente evidente para un experto habitual en las técnicas relevantes que otras modificaciones y adaptaciones adecuadas a los métodos y las aplicaciones descritos en el presente documento son obvios y pueden realizarse sin apartarse del alcance de la invención o cualquier realización de la misma. Habiendo descrito ahora la presente invención en detalle, se entenderá más claramente la misma en referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen con el presente documento para fines de ilustración sólo y no pretenden ser limitativos de la invención.

Ejemplos Materiales y métodos

Los siguientes materiales y métodos se usaron generalmente en los ejemplos, a menos que se especifique lo contrario en un ejemplo particular.

Materiales

Todas las enzimas incluyendo las enzimas de restricción, ADN ligasa de T4, Taq ADN polimerasa y fosfatasa alcalina termosensible se obtuvieron de Life Technologies, Inc. (LTI; Rockville, Maryland) a menos que se indique lo contrario. El vector de expresión de E. coli pTrc99A se obtuvo de Pharmacia (Piscataway, Nueva Jersey); pTrxfus era de Genetics Institute (Cambridge, Massachusetts) o Invitrogen (San Diego, California), pRE1 se obtuvo del Dr. McKenney (Reddy et al., Nucl. Acids Res. 17:10473-10488 (1989)). La resina Toyo-Pearl AF chelate-650M se adquirió de TosoHaas (Montgomeryville, Pensilvania). El huésped de expresión de E. coli DH10B con o sin pRK248c1 (resistente a tetraciclina) y Stbl2 eran de Life Technologies, Inc. (Rockville, Maryland).

El azul brillante de Remasol R (RBBR) y verde malaquita se obtuvieron de Aldrich y el isotiocianato de eosina se obtuvo de Molecular Probes. La aprotinina bovina se obtuvo de Bayer. Se purificaron las proteínas clonadas, tal como se describe de manera completa a continuación, a partir de cepas de E. coli que contenían plásmidos que codificaban para ocho proteínas con tamaño que oscilaba desde 10 kDa hasta 160 kDa. Los componentes de tampón eran todos de calidad de reactivo o superior. La unidad de diafiltración era una Filtron Mini Ultrasette equipada con una membrana de punto de corte de peso molecular Omega 3000. La resina de medio G-25 se obtuvo de Pharmacia. Otros reactivos y componentes se obtuvieron de fuentes comerciales de suministro a laboratorios que serán familiares para el experto en la técnica.

Construcción de ADN recombinante

Se derivó un fragmento de AvaI de 264 pb (SEQ ID NO: 1) de pPrL2107 (patente estadounidense nº 5.449.758). Este fragmento es una parte de la proteína del gen 32 de T4 que se ha modificado mucho. Este fragmento de AvaI se usó para preparar multímeros (véase la patente estadounidense 5.449.758) en pPrL2001. Se seleccionó un clon con 12 insertos y se designó como pPrl 2738. Se volvió a clonar el fragmento clonado en pTrc99A tal como sigue: se digirió el plásmido recombinante con EcoRI y se hicieron romos los extremos con el fragmento Klenow en presencia de dNTP; se digirió con NcoI y se purificó el fragmento mediante GENE CLEAN^{TM} (Bio101). Se digirió el vector, pTrc99A, con SalI, se hicieron romos los extremos con el fragmento Klenow y se digirió con NcoI. Se ligó el vector purificado en gel con el fragmento purificado en gel y se transformó en DH10B. El clon se designó como pTrcprl.

Para preparar un monómero, se digirió completamente pTrcprl con AvaI para eliminar multímeros y se autoligó el vector. Este constructo contiene un fragmento de 261 pb (SEQ ID NO: 2) con un único sitio AvaI y se esperaba que produjera una proteína de 10 kD. El plásmido se designó como pTrcprl-monómero.

Para generar clones para producir proteínas individuales de desde 20 kD hasta 220 kD, se usó el fragmento de AvaI de 264 pb de pPrL2107 para preparar multímeros en el pTrcprl-monómero en el sitio AvaI. Puesto que el fragmento de 264 pb (SEQ ID NO: 1) contiene un residuo interno de metionina, se alteró a un residuo de lisina mediante mutagénesis dirigida al sitio con el fin de detener cualquier iniciación interna. Se llevó a cabo la ligación a temperatura ambiente (22ºC) usando una razón 100:1 pmol de inserto y vector. Se seleccionaron clones individuales con insertos correctos (dos, tres, cuatro, etc.) por el tamaño del inserto tras la digestión con NcoI y HindIII. Los plásmidos se designaron como pTrcprl20, pTrcprl30, pTrcprl40, etcétera, para producir proteínas de 20 kD, 30 kD, 40 kD, etc., respectivamente.

También se generó un clon que contenía una parte de tiorredoxina de E. coli (truncada) bajo el control del promotor pL de lambda para producir una proteína de 10 kD. Este constructo contenía 86 de los 108 aminoácidos de tiorredoxina más seis residuos de histidina en el extremo carboxilo, que proporcionaban una etiqueta de His para facilitar la purificación de la proteína expresada. En enfoques alternativos, se delecionaron un máximo de 33 aminoácidos de la proteína tiorredoxina, produciendo un constructo que comprendía 75 de los 108 aminoácidos de tiorredoxina más la etiqueta de His. Los oligonucleótidos usados para clonar el fragmento fueron T CTA AGG AAA TAC TTA CAT ATC AGC G (SEQ ID NO: 3) y TA TTA CTG CAG TTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG TTC ACC GTT TTT GAA CAG CAG CAG (SEQ ID NO: 4). Se usaron los oligonucleótidos para PCR usando pTrxfus como molde. Se digirió el producto de PCR con NdeI y PstI (incorporados en los oligonucleótidos subrayados) y se clonó en pTrxfus digerido con NdeI y PstI. El plásmido se designó como pTrxfusprl10A (SEQ ID NO: 5).

Se usaron los oligonucleótidos TAA TAA CCA TGG CAT ATG AGC GAT AAA ATT ATT CAC (SEQ ID NO: 6) y ATT ATA CCC GAG TCC ACC ACG GAT GCC ATA TTT CGG (SEQ ID NO: 7) con NcoI (en negrita, subrayadas y en cursiva), NdeI (en negrita y en cursiva) y AvaI (en negrita, subrayadas) para generar un vector alternativo para preparar multímeros tal como sigue: se usaron los oligonucleótidos para generar un producto de PCR usando pTrxfus como molde. Se digirió el producto de PCR con NcoI y AvaI y se clonó en pTrcprl-monómero para sustituir el fragmento de NcoI-AvaI del gen del gen 32 de T4 modificado. Este plásmido se designó como pTrxA-concat (SEQ ID NO: 8). Este constructo contenía los aminoácidos 1-75 de tiorredoxina, glicina como el aminoácido 76 y los aminoácidos 77-90 de pTrcprl-monómero incluyendo los 6 residuos de histidina carboxilo terminales. Se preparó este constructo para generar proteínas de fusión mediante ligación en marco de un fragmento de AvaI o multímeros de fragmento de AvaI tal como se trató anteriormente. Para preparar multímeros, se han usado fragmentos de AvaI generados por PCR a partir de varios genes de prueba tales como de tiorredoxina, DEAD-box o KpnI metilasa. Los oligonucleótidos usados para generar un fragmento AvaI a partir del gen de tiorredoxina (Hoog et al., Bioscience Reports 4:917-923 (1984)) fueron: TAA TAA CTC GGG AGC GAT AAA ATT ATT CAC CTG (SEQ ID NO: 9) y ATA ATA CCC GAG TTT GGT TGC CGC CAC TTC ACC (SEQ ID NO: 10). Se digirió el producto de PCR (SEQ ID NO: 11) con AvaI y se ligó a pTrxA-concat digerido con AvaI y defosforilado usando 100 pmol de inserto y 1 pmol de vector. Los clones con un único inserto o múltiples insertos se seleccionaron estimando el tamaño del inserto tras la digestión con NcoI y PstI. Finalmente, se clonaron los insertos deseados como fragmento de NdeI-PstI en pTrxfus. Por tanto, estos clones producirán proteínas de fusión de tiorredoxina-(tiorredoxina)_{n} como de 20 kD, 30 kD, 40 kD, etc. Los oligonucleótidos usados para generar un fragmento de AvaI a partir del gen de DEAD-box (Toone et al., J. Bacteriol. 173(11):3291-3302 (1991)) fueron TAA TAA CTC GGG AAG CTG ACT AAT CCG GAA GTA G (SEQ ID NO: 12) y ATT ATT CCC GAG CAG TGC GCG GTA TTG ATC CAG (SEQ ID NO: 13). El producto de PCR (SEQ ID NO: 14) se generó usando el cromosoma de E. coli como molde. Se digirió el producto de PCR con AvaI y se ligó con pTrxAconcat tal como anteriormente. Se seleccionaron clones con varios insertos y volvieron a clonarse en pTrxfus tal como anteriormente. Estos clones se diseñaron para producir proteínas de fusión de tiorredoxina-(DEAD-box)_{n} como de 15 kD, 20 kD, 25 kD, etc. Para preparar proteínas de fusión de tiorredoxina-KpnI metilasa, los oligonucleótidos usados fueron GA TTA CTC GGG GCA CAT AAA ATG CTA AAA GAT ACA (SEQ ID NO: 15) y TC TAA CCC GAG TAA GAT CGT TTT TCT TGA ACC ACC (SEQ ID NO: 16). El molde usado para PCR era un clon de KpnI metilasa (Chatterjee et al., Nucleic Acids Res. 19:6505-6509 (1991)). Se digirió el producto de PCR (SEQ ID NO: 17) con AvaI y se ligó a pTrxA-concat y finalmente se subclonó un fragmento de NdeI-PstI en el plásmido pTrxfus. Se generó este plásmido para producir una proteína de fusión de tiorredoxina-KpnI metilasa de 40 kD.

Expresión de proteínas

Se hicieron crecer Stb12 o DHIOB de E. coli (LTI; Rockville, Maryland) que contenían constructos de pTrcpr1 a 37ºC en medios ricos en tampón que contenían ampicilina a 100 \mug/ml. Se hicieron clones hasta una DO_{590} = 1,0 y se indujeron durante 3 horas con IPTG hasta una concentración final de 1 mM. Se incubaron los clones a 37ºC durante 3 horas. Se hicieron crecer constructos de pTrxfus a 30ºC en medios ricos en tampón que contenían ampicilina a 100 \mug/ml y tetraciclina a 15 \mug/ml. Se hicieron crecer clones hasta una DO_{590} = 1,0 y se indujeron calentado hasta 42ºC durante 30 minutos seguido por un sobrecrecimiento durante 3 horas a 37ºC. Se resuspendieron las células en 1 ml de tampón de sonicación (Tris-HCl 10 mM 7,5, EDTA 1 mM y \beta-mercaptoetanol 10 mM) seguido por sonicación durante 3 X 10 segundos. Se extrajeron 100 \mul para el extracto celular completo. Se extrajo una alícuota para analizar proteínas como proteína total. La muestra sonicada se centrifugó durante 10 minutos a 4ºC y se transfirió el sobrenadante a un tubo eppendorf (soluble).

Se aplicaron las muestras (fracciones soluble y total) a un gel de tris-glicina al 4-20% para examinar la proteína.

Purificación de proteínas

Se suspendieron las células en una razón de 1 g:2 ml de tampón Tris-HCl 20 mM, MgCl_{2} 2 mM, pH 8,0. Se añadió benzonasa, una endonucleasa recombinante de American International Chemical, a una razón de 25 unidades por ml de suspensión. Se rompieron las células con dos pases a través de un homogeneizador de laboratorio de alta presión, modelo MINI-LAB, tipo 7.30VH mm de APV Rannie, a 12.000 psi. Entonces se centrifugó la muestra a 10.000 x g durante 30 minutos en una centrífuga RC-5 para sedimentar los cuerpos de inclusión dejando la mayor parte de los residuos celulares en el líquido sobrenadante. Entonces se lavó el sedimento de los cuerpos de inclusión dos veces a aproximadamente 20-25ºC con agua estéril usando un homogeneizador de tejidos Ultra Torrax de Tekmar para suspender completamente el sedimento. Entonces se hizo el sedimento soluble en tampón de urea 8 M, H_{2}NaPO_{4} 100 mM, imidazol 4 mM, pH 8,4 y se cargó en una resina Toyopearl AF Chelate-650M de TosoHaas. Antes de cargar la muestra, se cargó la resina con 3 volúmenes de columna de una disolución de sulfato de níquel 1 M, se lavó con tres volúmenes de columna de agua y entonces se equilibró con tres volúmenes de columna de urea 8 M, H_{2}NaPO_{4} 100 mM, imidazol 4 mM, pH 8,4 (tampón). Tras cargar la muestra, se lavó la columna con 10 volúmenes de columna de tampón, y entonces se eluyó la proteína en un único arrastre con urea 8 M, H_{2}NaPO_{4} 100 mM, pH 3,5, y se precipitó mediante diálisis frente a agua que contenía EDTA 5 mM; se incluyó EDTA para quelar los iones de níquel libres que degradaban las proteínas en un almacenamiento a largo plazo. Se centrifugó el precipitado a 10.000 x g en una centrífuga RC-5 y entonces se solubilizó en SDS al 1%/agua.

Marcaje con azul brillante de Remasol R

Se diluyeron las proteínas de 10, 15, 20, 25, 30, 40, 70, 100 y 160 kDa en SDS al 1% y H_{2}O hasta 8 unidades de A_{280}/ml. Se combinó cada disolución de proteína con un volumen igual del tampón de fosfato de sodio 280 mM, cloruro de sodio 160 mM, SDS al 1% (p/v), pH 9,2 y se calentó hasta 50ºC durante 15 minutos. Se prepararon disoluciones madre de RBBR (20 mg/ml y 60 mg/ml) en fosfato de sodio 140 mM, cloruro de sodio 80 mM, SDS al 1% (p/v), pH 9,2, se agitaron con vórtex y se incubaron durante 15 minutos a 50ºC. Entonces se mezclaron individualmente las disoluciones de proteínas de 10, 15, 20, 30, 70 y 160 kDa con un volumen igual de la disolución madre de RBBR 60 mg/ml calentada, se agitaron con vórtex y se incubaron durante 14-18 horas a 50ºC. Se mezclaron individualmente las disoluciones de proteínas de 40 y 100 kDa con un volumen igual de la disolución madre de RBBR 20 mg/ml calentada, se agitaron con vórtex y se incubaron durante 14-18 horas a 50ºC. Tras la incubación, se retiraron las disoluciones del baño de agua, se permitió que se equilibraran hasta temperatura ambiente, se filtraron a través de un filtro Cameo de 0,8 \mum para eliminar cualquier compuesto particulado residual y se almacenaron a 4ºC hasta su uso.

Para proporcionar un patrón de bajo peso molecular, se preparó aprotinina a una concentración de 11 mg/ml en fosfato de sodio 140 mM, cloruro de sodio 80 mM, SDS al 3% (p/v). Se agitó con vórtex cuidadosamente la disolución y se calentó hasta 50ºC durante 15 minutos. Tras calentar, se añadieron 5,7 mg de RBBR/ml a la disolución y entonces se mezcló la disolución y se incubó durante 40 minutos a 70ºC. Entonces se añadió \beta-mercaptoetanol (6,9 \mul/ml) y de nuevo se mezcló la disolución y se incubó durante otros 10 minutos a 70ºC, tras lo cual se añadieron 9,1 \mul/ml de acrilonitrilo. Se mezcló la disolución, se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente y entonces se filtró a través de un cartucho de filtro Cameo de 0,8 \mum y se almacenó a 4ºC.

Marcaje con isotiocianato de eosina de la proteína de 50 kDa

Se combinó la disolución madre de 50 kDa de 8 A_{280}/ml en SDS al 1%/H_{2}O con un volumen igual de tampón de fosfato de sodio 280 mM, cloruro de sodio 160 mM, SDS al 1% (p/v), pH 9,7, se mezcló y se calentó durante 15 minutos a 50ºC. Se preparó una disolución madre de 70 mg/ml de isotiocianato de eosina (EITC) en dimetilformamida inmediatamente antes de su uso y se añadió un volumen suficiente de esta disolución a la disolución de proteína de 50 kDa para lograr una concentración final de EITC 7 mg/ml. Entonces se mezcló la disolución, se incubó a 50ºC durante 14-18 horas en la oscuridad, se equilibró hasta temperatura ambiente, se filtró a través de un cartucho de filtro Cameo de 0,8 \mum y se almacenó en la oscuridad a 4ºC.

Preparación de la mezcla final

Se evaluó la calidad del marcaje haciendo correr cada disolución madre de proteína sobre SDS-PAGE (Laemmli, E.K., Nature 227:680-685 (1970)), preparando entonces una mezcla de todas las proteínas de modo que las cantidades de las proteínas producen bandas que visualmente parecen tener intensidades equivalentes. Entonces se diafiltró la mezcla usando una unidad Miniultrasette de punto corte de peso molecular de 3.000 con tampón de glicerol al 10%, TRIS 50 mM, EDTA 5 mM (para mejorar la estabilidad de la preparación en el almacenamiento), pH 6,8. Se usó una columna Sephadex G-25 para eliminar una pequeña cantidad de colorante sin reaccionar que permanecía tras la diafiltración. Se equilibró la columna Sephadex con Tris 50 mM, SDS al 1% (p/v), EDTA 5 mM, pH 6,8 y el tamaño de la columna era 15 veces el volumen de la muestra. Se llevó a cabo SDS-PAGE sobre la mezcla final para evaluar la calidad de la mezcla.

Ejemplo 1 Clonación y expresión de una proteína de 10 kD

El objetivo inicial era preparar un patrón de peso molecular de proteínas que oscila desde 10 kD-250 kD con incrementos de 10 kD. Por tanto, se usó una parte modificada de la proteína del gen 32 de T4 que contenía 87 aminoácidos (261 pb) que incluía 6 residuos de histidina en el extremo carboxilo (figura 1; SEQ ID NO: 1) (véase la patente estadounidense nº 5.449.758). Se clonó el fragmento y se expresó para producir una proteína de 10 kD. El clon se designo como plásmido pTrcprl-monómero. Este constructo contiene un único sitio AvaI (CTCGGG) para generar multímeros de cualquier fragmento de AvaI dado con la secuencia CTCGGG. Cuando se digiere con AvaI, el clon genera una proyección TCGG. Por tanto, cuando se liga un fragmento de ADN que tiene una proyección TCGG en ambos extremos con pTrcprl-monómero digerido con AvaI, el fragmento se ligará sólo en una dirección (cabeza a cola). Usando la condición apropiada de ligación, fue posible generar multímeros de un fragmento deseado. Por ejemplo, si se liga un único fragmento de AvaI (264 pb) al pTrcprl-monómero producirá una proteína de 20 kD; si se ligan dos fragmentos, producirá una proteína de 30 kD; etcétera.

Tal como se indicó anteriormente, se diseñó el pTrcprl-monómero para producir una proteína de 10 kD. Sin embargo, los cultivos inducidos o no inducidos no produjeron ninguna proteína de 10 kD. De manera interesante, los clones mayores con múltiples insertos produjeron proteínas de tamaños esperados. El nivel de expresión, sin embargo, variaba entre los clones dependiendo del número de insertos. El nivel de expresión de diversas proteínas (en kD) fue tal como sigue: 20<30 <40 <50 <60 <70\cong80\cong90\cong100\cong120 >160 >180 >200 >220 >250.

Para obtener una proteína de bajo peso molecular para su uso en la producción de patrones de peso molecular, se buscaron proteínas naturales próximas a 10 kD de tamaño que se expresan bien en E. coli. Una proteína de este tipo es tiorredoxina, que consiste en 108 aminoácidos y que tiene una masa molecular de 12 kD (Lunn et al., J. Biol.Chem. 259:10469-10474 (1984); Hoog et al., BioSci Rep. 4:917-923 (1984)). La tiorredoxina se distribuye de manera ubicua y está presente en una concentración excepcionalmente alta por célula (10.000-20.000 moléculas/célula). Además, se ha mostrado también que cuando se sobreexpresa, representa casi el 40% de la proteína celular soluble total (Lunn et al., idem). Por tanto, parece que la tiorredoxina podría ser un candidato adecuado para la producción de una proteína de 10 kD si se deleciona una parte de 2 kD de su extremo carboxilo terminal. Un constructo de este tipo (pTrxfuspr110A) que producía una proteína de 10 kD contenía: a) los aminoácidos 1-85 de tiorredoxina; b) una sustitución de ácido glutámico por valina en la posición de aminoácido número 86; y c) residuos de histidina en las posiciones 87-92. Este constructo de tiorredoxina truncada producía aproximadamente el 20-30% de la proteína celular total. Sin embargo, a diferencia de la tiorredoxina de longitud completa, este constructo producía casi toda la proteína inducida como cuerpos de inclusión. En otros experimentos, se delecionaron 33 de los 108 aminoácidos del extremo carboxilo terminal de la tiorredoxina; tales constructos también producían casi toda la proteína inducida como cuerpos de inclusión tras su expresión en las células huésped. También puede ser posible producir polipéptidos mediante los presentes métodos usando tiorredoxina truncada en la que se han delecionado 22 aminoácidos del extremo carboxilo terminal, o en la que se han delecionado 33-50 aminoácidos, tal como se describió anteriormente. Tras la expresión de la proteína en las células huésped, se aislaron fácilmente los cuerpos de inclusión a partir de las células huésped mediante centrifugación.

Ejemplo 2 Clonación de proteínas de fusión mayores de 10 kD

Con el fin de preparar la proteína de fusión con tiorredoxina truncada, se desarrolló un vector que contenía un único sitio AvaI, usado para preparar concatámeros; este vector se designó pTrxA-concat (figura 4; SEQ ID NO: 8). Usando este vector, se ha preparado una serie de proteínas de fusión uniendo el vector a fragmentos únicos o múltiples de tiorredoxina (figura 5; SEQ ID NO: 11) (fusión tiorredoxina-tiorredoxina), proteína DEAD-box de E. coli (figura 6; SEQ ID NO: 14), KpnI metilasa (figura 7; SEQ ID NO: 17), o proteína del gen 32 de T4 modificada (figura 1; SEQ ID NO: 1) (véase la patente estadounidense 5.449.758).

Específicamente, se prepararon las proteínas de fusión de los pesos moleculares indicados ligando pTrxA-concat a una o más copias de moléculas de ácido nucleico que codifican para fragmentos de 10 kDa de tiorredoxina truncada de E. coli (\DeltatrxA) o proteína del gen 32 de T4, o fragmentos de 5 kD de proteína de Dead-Box de E. coli o KpnI metilasa, tal como se muestra en la tabla 1. En todos los casos, se expresó la proteína de fusión como cuerpos de inclusión. Por tanto, usando los métodos de la presente invención, se han producido de manera eficaz polipéptidos de tamaño que oscila desde 10 kD hasta 220 kD, en incrementos de 5-10 kD, como cuerpos de inclusión.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Esquema para la producción de proteínas de fusión a lo largo de un intervalo de pesos moleculares

1

\newpage

Ejemplo 3 Producción de marcadores no teñidos del peso molecular de proteínas

Para demostrar su utilidad, se usó el presente sistema para preparar marcadores no teñidos del peso molecular de proteínas. Se mezclaron proteínas purificadas de diferentes tamaños, preparadas tal como se describió en el ejemplo 2, y se separaron mediante SDS-PAGE y se observaron los patrones de bandas en diversas concentraciones de acrilamida.

Los resultados de estos experimentos mostraron que la combinación de proteínas que permitía la mejor resolución a lo largo de un intervalo de concentraciones de acrilamida era una mezcla de proteínas de 10 kD, 15 kD, 20 kD, 25 kD, 30 kD, 40 kD, 50 kD, 60 kD, 70 kD, 80 kD, 90 kD, 100 kD, 120 kD, 160 kD y 220 kD. Estos resultados demuestran que los métodos de la presente invención son útiles para preparar proteínas de diversos intervalos de tamaño y que pueden usarse para producir composiciones que comprenden marcadores del peso molecular de proteínas.

Ejemplo 4 Producción de marcadores teñidos previamente del peso molecular de proteínas

Los marcadores teñidos previamente del peso molecular de proteínas han estado disponibles comercialmente desde hace más de 10 años en dos formas distintas. En una forma, todas las proteínas están teñidas con un único colorante y en la segunda forma cada proteína está teñida con colorantes diferentes (una versión multicoloreada). Estas dos formas diferentes tienen varias ventajas y desventajas. Los marcadores de un único color, por ejemplo, se preparan normalmente de un modo que da como resultado bandas relativamente nítidas en SDS-PAGE en comparación con los marcadores multicoloreados, pero puede ser difícil relacionar directamente cada banda con su peso molecular correspondiente puesto que el único punto de referencia en los marcadores teñidos previamente de un único color es la banda de peso molecular mayor o menor. Si cualquiera de estas bandas de referencia desaparece durante el almacenamiento, o no se resuelve en el gel, la ausencia de un punto de referencia hace difícil la identificación de las bandas restantes. De manera similar, la determinación de la identidad de las bandas en marcadores multicoloreados es fácil puesto que cada banda es de un color distinto, pero algunas de las bandas son muy anchas en SDS-PAGE y algunos de los colores son difíciles de detectar visualmente.

En la presente invención, se ha desarrollado un nuevo conjunto de marcadores teñidos previamente del peso molecular de proteínas. Estos marcadores están uniformemente espaciados en SDS-PAGE y comprenden una banda de referencia de un color diferente de las otras bandas para permitir una fácil orientación de todas las bandas del marcador. Se usó un único colorante para teñir todas menos una proteína (la proteína de referencia), que se tiñó con un segundo colorante. Se desarrollaron protocolos de tinción para producir proteínas teñidas previamente que dieron bandas nítidas en SDS-PAGE usando ambos colorantes, al contrario de las amplias variaciones en la nitidez de las bandas comunes en los marcadores multicoloreados. La proteína teñida con el segundo colorante sirve como punto de referencia dentro del marcador que facilita la identificación de las bandas del marcador teñido previamente. Se sometieron a prueba varios colorantes incluyendo el azul brillante de Remasol R (RBBR), isotiocianato de eosina, Procion rojo, naranja reactivo (también conocido como Procion amarillo), yodoacetamida de eosina, negro reactivo 5, violeta brillante de Remasol 5R, naranja reactivo 14, isotiocianato de rodamina e isotiocianato de verde malaquita. Se optimizaron las condiciones de marcaje y almacenamiento de cada componente de proteína en cuanto al pH de tampón y composición iónica, concentración de colorante, concentración de proteína, temperatura de marcaje y tiempo de incubación durante el marcaje, tal como se describió en detalle anteriormente en la sección de Materiales y métodos.

Se marcaron varias proteínas clonadas diferentes con RBBR y entonces se hicieron correr en SDS-PAGE para determinar la eficacia del procedimiento de marcaje y para determinar los pesos moleculares aparentes de las proteínas marcadas. Tal como se muestra en la figura 8, se consiguieron la tinción más intensa y el espaciado más uniforme en SDS-PAGE con la combinación de proteínas de 10, 15, 20, 30, 40, 50, 70, 100 y 160 kDa. Se marcó la proteína de 50 kDa con isotiocianato de eosina de modo que pudo incorporarse una banda de referencia o destacada en el marcador del peso molecular. Esta banda rosa fuerte estaba situada como la cuarta banda a partir de la parte superior y la sexta banda a partir de la parte inferior (no incluyendo el patrón de aprotinina que no es parte de la composición del marcador del peso molecular), lo que proporciona un punto de referencia fácil para determinar el peso molecular de una banda particular. Estos resultados demuestran que los presentes métodos pueden usarse para producir conjuntos de marcadores del peso molecular que se tiñen previamente de manera sencilla.

Ejemplo 5 Producción de marcadores del peso molecular para su uso en inmunotransferencias

Sería útil tener marcadores del peso molecular que no sólo puedan usarse para determinar el peso molecular tras la tinción con azul coomassie en un gel, sino que también pudieran usarse como marcadores del peso molecular tras las técnicas de transferencia de membrana tales como las inmunotransferencias de tipo Western. Los marcadores del peso molecular producidos mediante los presentes métodos pueden usarse para ambas de estas aplicaciones. Tal como se describió anteriormente, cada uno de los componentes de proteína en la mezcla de marcadores no teñidos del peso molecular contiene seis residuos de histidina en el extremo carboxilo terminal. Puesto que estos seis residuos de histidina interaccionan con Ni^{++} (Hochuli, E., y Piesecki, S., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4:68-72 (1992), puede usarse un conjugado de Ni-NTA-fosfatasa alcalina junto con cloruro de azul de nitrotetrazolio (NBT)/sal p-toluidina de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP) para detectar e identificar los componentes de proteína en una inmunotransferencia de tipo Western.

Ejemplo 6 Producción de proteínas pequeñas o tóxicas

El presente sistema es particularmente útil para expresar proteínas que son difíciles de expresar en E. coli, ya sea debida esta dificultad a (1) el tamaño menor de la proteína (en general, se expresan proteínas menores a niveles inferiores en E. coli); (2) la toxicidad de la proteína heteróloga para el huésped E. coli; (3) la traducción ineficaz en E. coli; o (4) la inestabilidad del ARNm. Tal como se mostró en los ejemplos anteriores, los métodos presentes permiten la producción eficaz de proteínas heterólogas como cuerpos de inclusión. Puesto que los cuerpos de inclusión son una forma aislada de la proteína expresada, este sistema puede usarse para producir proteínas tóxicas o péptidos pequeños que de otra manera no podrían producirse en E. coli u otras células huésped bacterianas. Usando este sistema, se han producido péptidos de 5kD y menores. El sistema también puede usarse para producir polipéptidos de 250 kD de tamaño o mayores.

Ejemplo 7 Optimización de las condiciones para el marcaje de marcadores del peso molecular de proteínas con azul brillante de Remasol R (RBBR)

En general, la conjugación o modificación química de una proteína (por ejemplo, marcándola con un colorante) implica la reacción de grupos funcionalmente reactivos en la proteína con grupos funcionalmente reactivos correspondientes en el marcador. Los grupos reactivos que pueden acoplarse con moléculas que contienen amina, tales como proteínas que contienen residuos de lisina, son con mucho los grupos funcionales más comunes presentes en reactivos de reticulación tales como colorantes. Por tanto puede usarse un procedimiento de acoplamiento de amina para conjugar casi todas las proteínas o péptidos con otras moléculas.

En la presente invención, se ha usado una variedad de colorantes, incluyendo azul brillante de Remazol R (RBBR) e isotiocianato de eosina, como reactivos de acoplamiento para el marcaje de proteínas de marcadores del peso molecular. Estos colorantes reaccionan principalmente con grupos amina nucleofílicos en las proteínas para dar complejos de proteína-colorante estables. Los colorantes también pueden reaccionar, en algún grado, con otros nucleófilos en las proteínas diana, tales como grupos sulfhidrilos e iones fenolato de cadenas laterales de tirosina.

Para producir los marcadores de proteínas teñidos previamente más útiles (es decir, la intensidad del color y nitidez de la banda más altas) y compatibles (es decir, la variabilidad más baja en la movilidad de bandas entre lotes), es esencial optimizar el protocolo de tinción. La intensidad de la banda dependerá de la cantidad de grupos amina primarios presentes en la proteína que está conjugándose con el colorante, mientras que la nitidez de la banda dependerá de cuántas de las aminas primarias disponibles en la proteína diana se han conjugado con el colorante. Cada una de estas variables dependerá de las condiciones ambientales a las que están sometidos la proteína y el colorante durante la conjugación. Por tanto, el grado de conjugación de las proteínas de marcadores diana con el colorante dependerá de varias condiciones durante la tinción, incluyendo las concentraciones de la proteína y del colorante en disolución, pH de la disolución, condiciones iónicas, temperatura y duración de la incubación de la proteína con el colorante.

Por tanto, un objeto de la presente invención es desarrollar condiciones para teñir marcadores del peso molecular de proteínas que proporcionarán marcadores del peso molecular con bandas que se resuelven de manera tan intensa, tan homogénea y tan compatible como sea posible. Para cumplir este objetivo, se optimizaron las condiciones de marcaje en cuanto a las concentraciones de la proteína y del colorante en disolución, pH de la disolución (ajustado antes de la adición de proteína(s) y colorante(s)) y temperatura y tiempo de incubación.

Para minimizar los volúmenes en los que se llevan a cabo las reacciones, se examinaron concentraciones variadas de proteínas. Se prepararon proteínas producidas tal como se describió anteriormente en disoluciones a 1, 2 y 4 unidades de A_{280}/ml y se marcaron con RBBR tal como se describió de manera general anteriormente en la sección de Materiales y métodos, y entonces se separaron en geles de gradiente de SDS-PAGE al 4-20% tal como anteriormente en el ejemplo 4. Entonces se determinó la intensidad de tinción mediante densitometría y a simple vista. En general, las concentraciones de proteínas de 1 y 2 unidades de A_{280}/ml produjeron señales de intensidad similar, mientras que la intensidad de marcaje era inferior a 4 unidades de A_{280}/ml.

En experimentos análogos, se determinó la concentración óptima de RBBR mediante tinción de proteínas con RBBR en un intervalo de concentraciones de desde 0,3 hasta 30 mg/ml. En general, se encontró que RBBR 10 mg/ml proporcionaba la tinción de la manera más intensa del producto homogéneo cuando se marcaron las proteínas de 40 kD y 100 kD, mientras que las proteínas de 10 kD, 15 kD, 20 kD, 30 kD, 45 kD, 50 kD, 60 kD, 70 kD y 160 kD se marcaron de manera óptima con 30 mg/ml de RBBR. Estos resultados sugieren que un intervalo de aproximadamente 5-50 mg/ml o 10-30 mg/ml de RBBR puede ser óptimo para el marcaje de marcadores del peso molecular de proteínas que consisten en proteínas de pesos moleculares variables.

En experimentos preliminares diseñados para determinar la temperatura y periodos de tiempo óptimos para el marcaje, la incubación de las proteínas en disolución sin colorante indicó que las proteínas tendían a degradarse cuando se incubaron a 70ºC durante 0,5-1 horas y cuando se incubaron a 60ºC durante aproximadamente 2-5 horas. Sin embargo, cuando se incubaron durante la noche (12-24 horas) a aproximadamente 50ºC o inferior, parecía que las proteínas eran estables (es decir, que resistían a la degradación en disolución). Tras la tinción de las disoluciones de proteína con RBBR a los intervalos de concentración indicados anteriormente, se observaron las bandas más homogéneas e intensas (es decir, los patrones de bandas más fuertes y más nítidos) en las preparaciones de proteína teñidas con RBBR durante la noche a 50ºC. Periodos de incubación más cortos (por ejemplo, de 4 a 8 horas) produjeron patrones de bandas más heterogéneos (es decir, más difusos y menos intensos), particularmente con proteínas de bajo peso molecular (de 10 kD a 60 kD). Las incubaciones durante la noche a temperatura ambiente (de aproximadamente 20ºC a 25ºC) y a 37ºC no produjeron resultados satisfactorios; las preparaciones de marcadores del peso molecular teñidos con RBBR en estas condiciones dieron como resultado marcadores del peso molecular que mostraron patrones de bandas incluso más difusos y menos intensos. Estos resultados indicaron que la tinción durante la noche de las proteínas a 50ºC es óptima para producir marcadores del peso molecular de proteínas teñidos previamente con RBBR.

Finalmente, para determinar el pH óptimo para la tinción de las preparaciones de marcadores del peso molecular con RBBR, se marcaron las proteínas con RBBR tal como anteriormente en disoluciones tamponadas hasta pH que oscilan desde aproximadamente 7,2 hasta aproximadamente 9,7. Se observaron resultados ideales (es decir, los patrones de banda menos difusos y tinción de la manera más intensa) en disoluciones tamponadas hasta pH 9,2. Sin embargo, ha de indicarse que el pH de la mezcla de tinción final era de aproximadamente 8,3 (tras la adición de proteína y colorante), mientras que el pH inicial óptimo del tampón al que se añadieron la proteína y el colorante era de aproximadamente 9,2.

Tomados juntos, estos resultados sugieren que las condiciones óptimas para producir marcadores del peso molecular de proteínas teñidos previamente con RBBR incluyen una concentración de proteína de aproximadamente 1 a 2 unidades de A_{280}/ml, una concentración de colorante de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/ml, un pH de aproximadamente 9,0 a 9,5 y la incubación de la proteína y el colorante durante aproximadamente 12-24 horas a una temperatura de aproximadamente 50ºC.

Ejemplo 8 Optimización de las condiciones para el marcaje de marcadores del peso molecular de proteínas con isotiocianato de eosina

Tal como se indicó en el ejemplo 4 anterior, el marcaje con eosina de una única banda de proteína en un marcador complejo del peso molecular de proteínas, particularmente entre las bandas de 40 kD y 70 kD marcadas con RBBR, proporciona una banda de referencia valiosa que permite la identificación rápida y precisa de todas las otras bandas de proteína en el marcador del peso molecular. Por tanto, se determinaron las condiciones óptimas para el marcaje de proteínas de 30 kD, 40 kD, 50 kD y 60 kD con isotiocianato de eosina, para su uso en los marcadores del peso molecular de la invención.

Se incubaron diversas preparaciones de proteínas recombinantes de 30 kD, 40 kD, 50 kD y 60 kD, preparadas tal como se describió anteriormente en los ejemplos 1 y 2, con isotiocianato de eosina en las condiciones de concentración de proteína, concentración de colorante, temperatura, tiempo y pH usadas para los estudios con RBBR en el ejemplo 7. Tras el marcaje con isotiocianato de eosina, se hicieron correr las preparaciones de proteína en SDS-PAGE al 4-20%.

Tal como se muestra en las figuras 9-12, las condiciones de pH y temperatura usadas durante el marcaje con eosina de proteínas de referencia de 30 kD, 40 kD, 50 kD y 60 kD afectaron drásticamente a la intensidad de tinción y nitidez de la resolución de las bandas en SDS-PAGE. Se obtuvieron resultados óptimos cuando se incubaron aproximadamente 2 unidades de A_{280} de la proteína de 50 kD durante la noche (idealmente durante aproximadamente 4-16 horas) a 50ºC con una concentración final de isotiocianato de eosina de aproximadamente 7 mg/ml a pH 9,2 (véase la figura 9, carril 5; la figura 10, carril 13; la figura 11, carril 14; y la figura 12, carril 8) y cuando se marcó la proteína de 60 kD en las mismas condiciones, excepto a pH 9,2-9,7 (véase la figura 9, carril 13 y la figure 12, carril 6). Sin embargo, en estas mismas condiciones la incubación de las proteínas con el colorante Procion rojo comúnmente usado produjo poca o ninguna tinción de las bandas del marcador del peso molecular (véase la figura 12, carriles 1-4).

Ejemplo 9 Optimización de las condiciones para el marcaje de marcadores del peso molecular de proteínas con isotiocianato de verde malaquita

Para proporcionar bandas de referencia y marcadores del peso molecular de proteínas teñidos con una variedad de colores, sería ventajoso teñir los marcadores del peso molecular de proteínas de la invención con un colorante, tal como verde malaquita, de color diferente al de RBBR y eosina. Por tanto, se determinaron las condiciones óptimas para el marcaje de proteínas de 30 kD, 40 kD, 50 kD y 60 kD con isotiocianato de verde malaquita.

\newpage

Se incubaron diversas preparaciones de proteínas recombinantes de 30 kD, 40 kD, 50 kD y 60 kD, preparadas tal como se describió anteriormente en los ejemplos 1 y 2, con isotiocianato de verde malaquita en las condiciones de concentración de proteína, concentración de colorante, temperatura, tiempo y pH usadas para los estudios con RBBR en el ejemplo 7 y con isotiocianato de eosina en el ejemplo 8. Tras el marcaje con isotiocianato de verde malaquita, se hicieron correr las preparaciones de proteína en SDS-PAGE al 4-20%.

Tal como se muestra en la figura 13, las condiciones de pH usadas durante el marcaje con verde malaquita de proteínas de referencia de 40 kD, 50 kD y 60 kD efecto drásticamente a la intensidad de tinción y nitidez de resolución de las bandas en SDS-PAGE. Se obtuvieron resultados óptimos cuando se incubaron aproximadamente 1-2 unidades de A_{280} de las proteínas durante la noche (idealmente durante aproximadamente 16 horas) a temperatura ambiente con una concentración final de isotiocianato de verde malaquita de aproximadamente 20-30 mg/ml a pH 9,2 (véase la figura 13, carriles 2, 4, 6 y 8).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Life Technologies, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 9800 Medical Center Drive

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rockville

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Maryland

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 20850

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Métodos para la producción de proteínas

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: (por asignar)

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 08-ENE-1998

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/034.658

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 08-ENE-1997

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 270 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 263 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGAAATACT TACATATGAG CG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 56 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATTACTGCA GTTAGTGGTG GTGGTGGTGG TGTTCACCGT TTTTGAACAG CAGCAG

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 280 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATAACCAT GGCATATGAG CGATAAAATT ATTCAC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTATACCCG AGTCCACCAC GGATGCCATA TTTCGG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 280 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATAACTCG GGAGCGATAA AATTATTCAC CTG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATAATACCCG AGTTTGGTTG CCGCCACTTC ACC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 282 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATAACTCG GGAAGCTGAC TAATCCGGAA GTAG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTATTCCCG AGCAGTGCGC GGTATTGATC CAG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 138 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTACTCGG GGCACATAAA ATGCTAAAAG ATACA

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTAACCCGA GTAAGATCGT TTTTCTTGAA CCACC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 405 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: ambos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

9

Claims (55)

1. Método de preparación de una composición de marcador del peso molecular, que comprende incubar proteínas recombinantes de diferente peso molecular con colorante de unión a proteínas, en el que se incuba una primera proteína recombinante con un primer colorante de tinción de proteínas y se incuba una pluralidad de proteínas recombinantes de pesos moleculares que difieren de dicha primera proteína recombinante y entre sí con un segundo colorante de tinción de proteínas de diferente color con respecto al primer colorante de tinción de proteínas, incubándose las proteínas con dichos colorantes en una disolución acuosa tamponada en condiciones de temperatura, tiempo y pH de la disolución controladas.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho primer colorante de tinción de proteínas se selecciona del grupo que consiste en Procion rojo, naranja reactivo, yodoacetamida de eosina, negro reactivo 5, violeta brillante de Remasol 5R, naranja reactivo 14, isotiocianato de rodamina, isotiocianato de eosina e isotiocianato de verde malaquita.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicho primer colorante de tinción de proteínas se selecciona del grupo que consiste en isotiocianato de eosina e isotiocianato de verde malaquita.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el segundo colorante de unión a proteínas es azul brillante de Remazol R.

5. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que las proteínas comprenden proteínas que tienen incrementos de peso molecular de 5 kD, 10 kD, 20 kD, 25 kD, 50 kD y/o 100 kD.

6. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que las proteínas recombinantes son proteínas de fusión recombinantes.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las proteínas recombinantes son proteínas de fusión recombinantes unidas a una proteína de pareja de inclusión.

8. Método según la reivindicación 7, en el que la proteína de pareja de inclusión es tiorredoxina o una pareja de inclusión de tiorredoxina modificada que tiene la capacidad de formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula huésped bacteriana.

9. Método según la reivindicación 7, en el que la proteína de pareja de inclusión se selecciona de proteína de unión a maltosa de E. coli, ARNasa II de E. coli, fosfatasa alcalina de E. coli, fosfolipasa A de E. coli, \beta-lactamasa de E. coli, proteína MalK de Salmonella typhimurium, endoglucanasa D de Clostridium thermocellum, proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis subsp. aizawai IPL7, procatepsina B humana, interferón gamma porcino, ADN polimerasa de T5, o versiones modificadas de las mismas que tienen la capacidad de formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula huésped bacteriana.

10. Método según la reivindicación 7, en el que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina de E. coli modificada que tiene la capacidad de formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula huésped bacteriana.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina truncada que tiene la capacidad de formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula huésped bacteriana.

12. Método según la reivindicación 11, en el que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina truncada en el extremo carboxilo terminal que tiene la capacidad de formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula huésped bacteriana.

13. Método según la reivindicación 12, en el que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 2 y 50 aminoácidos carboxilo terminales.

14. Método según la reivindicación 12, en el que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 33 y 50 aminoácidos carboxilo terminales.

15. Método según la reivindicación 12, en el que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 2 y 33 aminoácidos carboxilo terminales.

16. Método según la reivindicación 12, en el que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 2 y 22 aminoácidos carboxilo terminales.

17. Método según la reivindicación 12, en el que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 23 y 33 aminoácidos carboxilo terminales.

18. Método según la reivindicación 17, en el que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina que tiene un truncamiento de 23 aminoácidos carboxilo terminales.

19. Método según la reivindicación 10, en el que la proteína de pareja de inclusión es una tiorredoxina que tiene un peso molecular de 10 kD.

20. Método según la reivindicación 10, en el que la proteína de pareja de inclusión es una forma truncada en el extremo carboxilo terminal de la tiorredoxina de Escherichia coli que está codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO: 8.

21. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que las proteínas recombinantes que proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos moleculares definidos alterando la longitud o el número de copias de un polipéptido recombinante comprendido en la proteína recombinante.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que las proteínas recombinantes que proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos moleculares definidos alterando el número de copias de un polipéptido recombinante comprendido en la proteína recombinante.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que las proteínas recombinantes que proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos moleculares definidos alterando la longitud o el número de copias de un polipéptido recombinante comprendido en la proteína recombinante, en el que dicha proteína recombinante está unida a una proteína de pareja de inclusión.

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que las proteínas recombinantes que proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos moleculares definidos alterando el número de copias de un polipéptido recombinante comprendido en la proteína recombinante, en el que dicha proteína recombinante está unida a una proteína de pareja de inclusión.

25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que cada proteína de la serie de proteínas recombinantes comprende un número de copias diferente de una proteína de pareja de inclusión.

26. Método según la reivindicación 25, en el que cada proteína de la serie de proteínas recombinantes comprende un número de copias diferente de tiorredoxina.

27. Composición de marcador teñido del peso molecular de proteínas preparada según el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

28. Composición de marcador teñido del peso molecular de proteínas, que comprende proteínas recombinantes, en la que cada proteína tiene un peso molecular diferente con respecto a todas las demás proteínas en la composición, las proteínas comprenden una o más copias de un primer polipéptido recombinante y una de las proteínas recombinantes está teñida con un colorante que está coloreado de manera diferente del colorante que tiñe las otras proteínas recombinantes.

29. Composición según la reivindicación 28, en la que dicho primer colorante de tinción de proteínas se selecciona del grupo que consiste en Procion rojo, naranja reactivo, yodoacetamida de eosina, negro reactivo 5, violeta brillante de Remasol 5R, naranja reactivo 14, isotiocianato de rodamina, isotiocianato de eosina e isotiocianato de verde
malaquita.

30. Composición según la reivindicación 29, en la que dicho primer colorante de tinción de proteínas se selecciona del grupo que consiste en isotiocianato de eosina e isotiocianato de verde malaquita.

31. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en la que el segundo colorante de unión a proteínas es azul brillante de Remazol R.

32. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, en la que las proteínas comprenden proteínas que tienen incrementos del peso molecular de 5 kD, 10 kD, 20 kD, 25 kD, 50 kD y/o 100 kD.

33. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, en la que las proteínas recombinantes son proteínas de fusión recombinantes.

34. Composición según la reivindicación 33, en la que las proteínas recombinantes comprenden cada una una pareja de cuerpo de inclusión.

35. Composición según la reivindicación 34, en la que la pareja de cuerpo de inclusión es tiorredoxina.

36. Composición según la reivindicación 35, en la que la tiorredoxina es una tiorredoxina modificada.

\newpage

37. Composición según la reivindicación 35 o la reivindicación 36, en la que la proteína de pareja de inclusión es tiorredoxina o una pareja de inclusión de tiorredoxina modificada que tiene la capacidad de formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula huésped bacteriana.

38. Composición según la reivindicación 34, en la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina de E. coli modificada que tiene la capacidad de formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula huésped bacteriana.

39. Composición según la reivindicación 34, en la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina truncada que tiene la capacidad de formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula huésped bacteriana.

40. Composición según la reivindicación 39, en la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina truncada en el extremo carboxilo terminal que tiene la capacidad de formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula huésped bacteriana.

41. Composición según la reivindicación 40, en la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 2 y 50 aminoácidos carboxilo terminales.

42. Composición según la reivindicación 40, en la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 33 y 50 aminoácidos carboxilo terminales.

43. Composición según la reivindicación 40, en la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 2 y 33 aminoácidos carboxilo terminales.

44. Composición según la reivindicación 40, en la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 2 y 22 aminoácidos carboxilo terminales.

45. Composición según la reivindicación 40, en la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina que tiene un truncamiento de entre 23 y 33 aminoácidos carboxilo terminales.

46. Composición según la reivindicación 45, en la que la proteína de pareja de inclusión es una pareja de inclusión de tiorredoxina que tiene un truncamiento de 23 aminoácidos carboxilo terminales.

47. Composición según la reivindicación 37, en la que la proteína de pareja de inclusión es una tiorredoxina que tiene un peso molecular de 10 kD.

48. Composición según la reivindicación 40, en la que la proteína de pareja de inclusión es una forma truncada en el extremo carboxilo terminal de tiorredoxina de Escherichia coli que está codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO: 8.

49. Composición según la reivindicación 33, en la que la proteína de pareja de inclusión es proteína de unión a maltosa, ARNasa II, fosfatasa alcalina, fosfolipasa A, P-lactamasa, proteína MalK, endoglucanasa D, proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis subsp. aizawai IPL7, procatepsina B, interferón-gamma, ADN polimerasa de T5 o versiones modificadas de las mismas que tienen la capacidad de formar cuerpos de inclusión tras su expresión en una célula huésped bacteriana.

50. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 49, en la que los polipéptidos recombinantes que proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos moleculares definidos alterando la longitud o el número de copias de un polipéptido recombinante comprendido en el polipéptido recombinante.

51. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 49, en la que los polipéptidos recombinantes que proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos moleculares definidos alterando el número de copias de un polipéptido recombinante comprendido en el polipéptido recombinante.

52. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 49, en la que los polipéptidos recombinantes que proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos moleculares definidos alterando la longitud o el número de copias de un polipéptido recombinante comprendido en el polipéptido recombinante, en la que dicho polipéptido recombinante está unido a una proteína de pareja de inclusión.

53. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 49, en la que los polipéptidos recombinantes que proporcionan el marcador del peso molecular tienen incrementos moleculares definidos alterando el número de copias de un polipéptido recombinante comprendido en el polipéptido recombinante, en la que dicho polipéptido recombinante está unido a una proteína de pareja de inclusión.

54. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 49, en la que cada proteína de la serie de proteínas recombinantes comprende un número de copias diferente de una proteína de pareja de inclusión.

55. Composición según la reivindicación 54, en la que cada proteína de la serie de proteínas recombinantes comprende un número de copias diferente de tiorredoxina.