JPH06180314A - 試薬組成物及びその全血中の網状赤血球の同定と特性表示のための使用 - Google Patents
試薬組成物及びその全血中の網状赤血球の同定と特性表示のための使用Info
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Abstract
との方法を提供する。 【構成】 血液試料中の網赤血球を染色するための有機
カチオン染料と、約6〜9のpHを維持するための緩衝
溶液とを含む試薬組成物を使用する。その染料は青色吸
収染料オキサジン750またはニューメチレンブルーで
あってもよい。双性イオン界面活性剤が網赤血球と赤血
球との等積的球形化のため試薬組成物中に含まれ、その
試薬組成物と全血試料との混合物を流通式細胞測定器の
センシング領域を通過させると、各細胞により散乱およ
び吸収された光が測定され、赤血球は網赤血球と区別さ
れ、各網赤血球または赤血球の体積とヘモグロビン濃度
とヘモグロビン含有量並に網赤血球または赤血球の平均
細胞体積と平均小体ヘモグロビン濃度と平均細胞ヘモグ
ロビンとが、測定された細胞1つずつの体積とヘモグロ
ビン濃度とから計算される。1つの方法はまた擬似吸収
に関して、測定した吸収信号を調節することを含んでい
る。
Description
の細胞の同定(identifying)および特性表
示(characterizing)へのその使用、更
に特別には試薬組成物並に光散乱および吸収流通式細胞
測定(flow cytometry)技術による、全
血試料中の(i)網状赤血球の同定および(ii)多数
の個別の網状赤血球と赤血球との体積とヘモグロビン濃
度とヘモグロビン含有量との同時測定へのその使用に関
する。
種な小体、即ち赤色血液細胞(赤血球と白色血液細胞
(白血球)と血小板とを懸濁する水性流体部分(血漿)
より成る。血漿は大約水90%と蛋白質9%と塩0.9
%と他の材料例えば糖、尿素、尿酸等を含む組成物であ
る。
ち小体は2つの主な群即ちその第1目的が酸素の輸送で
ある赤血球と、その第1機能が免疫システムと体に異質
の材料の破壊とである白血球とに分かれる。この2つの
主要な群のほかに、血液はまた、止血において重要な所
謂血小板を含有している。
れた後、これらの細胞が末梢血液中を循環しながら起
る。これらの若い赤色細胞即ち“網状赤血球”(以下、
網赤血球とも言う)はその核を失い、それ故***する、
あるいはリボ核酸(RNA)を合成する能力を失う。こ
れらの機能は停止するが、赤血球は代謝的にはまだ活性
で、しばらくは蛋白質を合成し、ヘム合成のため鉄を取
り込み、そしてエネルギーに豊んだ状態を維持するのに
要求される必要な代謝反応を行うことができる。これら
の細胞は普通、それを網赤血球中の陰イオン性RNAと
反応し、網赤血球中の、網赤血球にその名を与えてい
る。細いあるいは粗い染色した“細網”中に沈澱するカ
チオン染料の溶液にさらすことにより、成熟赤血球と非
常に容易に区別される。
0.5〜2%含まれるが、この百分率は異常状態では劇
的に変化し得る。例えば血液疾患研究における診断補助
として、出血後の赤色血液細胞再生の指針として、並
に、或る種の悪性疾患の化学療法における初期毒性の監
視のため、網赤血球数は長年用いられて来た。
チオン染料ででも染色することができるポリアニオンで
ある。網赤血球中のRNAはほんの僅かなカチオン染料
〔ブリリアントクレジルブルー(BCG)とニューメチ
レンブルー(NMB)とオーラミンO(AuO)とアク
リジンオレンジ(AO)とチアゾールオレンジ(TO)
とピロニンY(PY)とを含む〕で染色できる。これら
の染料のうち、僅か一つの部分集合のみが速に細胞を浸
透(従って染色)できる。この部分集合にはNMBとA
Oとが含まれる。網赤血球の染色の速さと度合とは染料
の細胞外濃度と染料の網赤血球膜を通しての浸透速度
と、カチオン染料と網赤血球RNAとの間の比結合恒数
の大きさとに左右される。後2者の性質は各染料で異っ
ていて容易に予見することはできず、それ故有用な網赤
血球染料を発見するには試行錯誤が必要である。凡ての
カチオン物質が元のままの赤色細胞(および網赤血球)
膜を浸透できるわけでなく、必然的にカチオンを伴うア
ニオンの本性が、そのカチオン物質が速に、遅くまたは
全く浸透するか、しないかに影響し得る。疎水性分子は
一般には親水性分子より速に赤色細胞膜を浸透し、小さ
い分子は一般に大きい分子より速に膜を浸透する。網赤
血球を染色できるカチオン染料と混合された塩または緩
衝剤の部分集合のみが速かな染色を可能にする。即ち
“誤った”緩衝剤とでは“正しい”染料でも網赤血球を
染色するのに“永久の”時間がかかる。さらに、網赤血
球染色混合物の有用な処方を発見するためには試行錯誤
が必要である。かくて、手引きとして使用できる種種な
“ルール”にも拘らず、どんな特別なカチオン染料が、
どんな条件の下で速に浸透し、網赤血球を染色するかを
直感的に予見することは未だ不可能である。
は特定のセンシング領域を通して1度に1つの細胞を通
過させることである。典型的には、水力学的集束により
単一細胞を、集束された光源と散乱、吸収または蛍光光
線測定のための検出システムとより成るセンシング域を
通過させる。粒子が持つ、それがさえぎった光への影響
は多くの方法で検出できる。一般に、粒子はそれが懸濁
されている媒質の屈折率とは違う屈折率を持っている。
それ故、それは照明されている光を、ある角度範囲を通
じて、屈折率差と粒子寸法と形と屈折率の内部変動と構
造並に照明光の波長とに左右される種種な強度で散乱す
る。(均一球体に関してはMieの散乱理論が散乱光の
分布と強度とに関し完全な記述を与えている。)また粒
子は入射光の幾らかを吸収してもよい。後者の場合、吸
収光の一部分は、典型的には吸収光の波長より長い波長
で蛍光として再放射されいもよい。
散乱光と非散乱光と蛍光とを測定するために設備した光
検出器を用いて測定できる。
μmより小さい場合、高速度での通過(典型的には1秒
当り広く間隔をあけた細胞数100乃至数1000)に
より影響され、そして特に懸濁流の照明された部分に落
ちる毎秒当りの光子の数に比較した〔そして吸収検出器
(そして蛍光検出器)のバックグラウンド照明に比較し
た〕照明ビーム中の光子数は非常に小であり得る。それ
故、粒子間の小さい特別な差異の検出感度の限界は決定
的に光子流束(少くとも光源の固有の“輝度”に左右さ
れる)とその光子流束の、粒子間の他の大小の差異によ
り起される攝動がどの位大きいかに左右される。
における妨害の主要な源は各信号により全く異り得る。
1次近似として、染色されたまたは未染色の細胞からの
蛍光信号の大きさはその信号を引起す細胞の形または方
向により殆んど影響されないが、散乱および吸収信号は
形と方向により非常に強く影響される。極端な例として
人赤血球の本来の両凹形はそれが生じさせる吸収および
散乱信号に対し、深刻な影響を持ち、典型的な、伝統的
に染色された網赤血球の小さな吸収信号より大きい影響
を持つ(図8Aおよび8Bを見よ)。これが本発明の前
には吸収流通式細胞測定法が網赤血球の計数または一般
に、細胞中の低濃度の吸収分子の測定に関して有用でな
かった理由である。他方、細胞中または(例えば結合さ
れていない蛍光染料)それらを囲む媒質中の弱い蛍光材
料は吸収または散乱信号に対し実質的に影響しない。
計数に用いることができる幾つかの半自働化されている
方法が利用できる。現在の各方法では、有機カチオン染
料例えばAO、AuOまたはTOを含有する希釈剤が網
赤血球内のRNAを染色するのに用いられる。染料細胞
膜を浸透し、RNAと結合し、そして通常各網赤血球中
の“細網”を沈澱させる。染色されたRNAからの信号
量は大雑把にはRNA含量に比例する。適当な染色の
後、適当な励起光源を設備した蛍光流通式細胞測定器
(典型的には488nmで放射するアルゴンイオンレー
ザーと発光検出器)が流出液中の網赤血球の百分率決定
に使用できる。
血中の網赤血球を弁別する実例とする方法は特許文献に
公開されている。
との米国特許第3,684,377号は、人血に関する
正常な生理学的範囲内のpH因子と浸透性とをもつアク
リジンオレンジの水性溶液を含む、示差血液分析分析用
染料組成物を公開している。その染料組成物は赤血球散
乱信号をもつ蛍光信号の有無を測定することによる、網
赤血球の計数に用いることができる。
7号は、濃度10-6〜10-5g/mlのアクリジンオレ
ンジを含む染料組成物を用いる、AdamsとKame
ntskyとの特許と同じ方法を公開している。
29号は、pH約7.4、等浸透性で、染料AOとクエ
ン酸イオンとパラホルムアルデヒドとの水性溶液を包含
する試薬組成物を公開している。種種な成分の濃度は網
赤血球と血小板との染料取込みを最大にするよう選択さ
れ、染料取込みが血液試料と試薬組成物との混合2〜5
分の中に達成されるよう与えられる。Natale試薬
を利用する、血小板と網赤血球との自働化検出法はGe
rshman等の米国特許第4,325,706号に公
開されている。
7,451号に公開されている試薬においては、網赤血
球はチオフラビンTまたはクリスアニリンで染色され
る。生理学的食塩水中の染料(0.2mg/ml)の2
5μlアリコートを抗凝固性にされた血液10μlと混
合し、その混合物を約7分間培養して効果的に染色され
ることが見出された。
号はRNAまたはDNA染色用の染料組成物を公開して
いる。その染色組成物は好ましい染料化合物としてTO
を含んでいる。網赤血球は最小時間30分内に染色され
る。
試薬はKurodaの米国特許第4,971,917号
に記載されていて、それは染料例えばAuOによる成熟
赤血球の非特異染色を減少し、蛍光流通式細胞測定法に
より分析される場合、成熟赤血球が間違って網赤血球と
して計数されることを防ぐため炭酸塩を含有している。
溶液、即ち染料AuOを非水性溶剤に溶解した染色用の
原溶液と、最適の染色条件を満足させる緩衝溶液とを包
含する、網赤血球計数用試薬を記載している。
の他の網赤血球染色試薬がKuroda等の米国特許第
4,985,176号に公開されている。この文献は3
0秒と20分との間のどこでもよい、試薬と試料との培
養時間を教えている。
分集合のみが網赤血球を選択的に染色し、これらの更に
小さい部分集合のみが速に網赤血球に浸透する。この発
明のカチオン染料は網赤血球を5分以下の中に染色し、
それ故血液試料と試薬組成物とを互に混合後すぐ流通式
細胞測定法により網赤血球分析を行い得て、それ故本発
明は自働化された方法に容易に受入れられる。
が、ここに文献に加えられている、“化合物および試薬
組成物と全血中の網赤血球の定量へのその使用”と題す
る、FanとFischerとの、1989年1月12
日出願の同時係属米国特許出願番号第07/444,2
55号に記載されている。Fan等の試薬はパラフオル
ムアルデヒドと蓚酸カリウムとを含む緩衝溶液中にAO
誘導体10-6g/mlを含有する。この試薬組成物は網
赤血球を染色し、血液試料中の網赤血球の定量的蛍光流
通式細胞測定分析を可能にする。この試薬もまた前記の
試薬の何れも以下に論ずるような方向雑音問題を防止す
るための球形化剤を含有してはいなくて、細胞1つずつ
に基いて他の診断学的に重要なパラメーター例えば網赤
血球と赤血球との体積およびヘモグロビン濃度の同時測
定ができない。
ow Cytometry ofDNA Conten
t Using Oxazine750 or Rel
ated Laser Dyes With633nm
Excitation,Cytometry,第1
巻、107−110頁(1986)において、流通式細
胞測定法によるDNA含有量の測定のためのオキサジン
750の使用を公開している。細胞はオキサジン750
10〜30μMで染色され、DNA測定のためエタノ
ール添加により固定される。ShapiroとStev
ensとはオキサジン750はRNAを染色するように
は見えないと主張している。更にその上オキサジン75
0を用いる実験案は網赤血球計数あるいは他の診断学的
に重要な赤色細胞パラメーター例えば体積とヘモグロビ
ン濃度との細胞1つづつに基く同時測定を可能にしてい
ない。
測定器を利用する網赤血球計数の不利な点は方向雑音と
網赤血球信号との間の弁別が出来ないことである。人お
よび多くの他の哺乳動物の赤色血液細胞は両凹ディスク
の形を持っている。そのような非対称赤色血液細胞によ
り散乱される光の量は細胞の方向に従って変る。従って
同一の赤色血液細胞がセンシング域を通過する時、その
方向がその域で同一でない限り非常に違った散乱光と吸
収信号とを生ずる。その結果正常な赤色細胞に関する散
乱および吸収信号の分布は非常に広く、2つのモードが
あることになる(図14および15を参照)。少量の染
色された細網が1つは存在するけれども同一である2つ
の赤色血液細胞は違った方向の故に、一般に散乱光およ
び吸収検出器に対し大きい信号差を生ずる。これが起る
と、染色された細網が生ずるであろう非常に小さい差異
は方向雑音中に埋没してしまう。
4,575,490と4,412,004号とは流通式
細胞測定器での赤色血液細胞体積測定における方向雑音
の除去法を教えている。彼等の方法は、細胞体積のより
一層精密で正確な測定を可能にする細胞間の如何なる差
異も除去するために、未染色の赤色血液細胞の等積球形
化を包含している。各血色血液細胞は界面活性剤球形化
剤により両凹形から完全な球形に変換される。赤血球の
溶血を防止するため、“緩衝”蛋白質および(または)
アルデヒド固定剤とを球形化剤と共に用いる。Kimと
Ornsteinとによって記載されているアニオン界
面活性剤は、細網を染色し、沈澱するのに用いられるカ
チオン染料と速に反応し、沈澱することが判っている故
に、網赤血球染料と共には使用できない。
4号はTECHNICON H’1システム、即ち抗凝
固性にされている全血試料中の個別および平均赤血球体
積(MCV)並に赤血球の個別および平均小体ヘモグロ
ビン濃度(MCHC)の測定のための完全自働化法およ
び手段を与えている流通式細胞測定器の赤色血液細胞チ
ャネルを公開している。この方法においては、全血試料
の2μmアリコート中の赤色血液細胞を始めに希釈し、
それから、今記載したKimとOrnsteinとの方
法を用いて等積的に球形化する。20秒培養後、これら
の細胞を、本質的に1度に1個、分析器の赤色細胞チャ
ネル内の照明されている測定域を通過させる。2つの個
別の角度間隔中に、これらの細胞により散乱される光の
量を測定する。光源と検出角との選択がこの適用におい
ては決定的に重要である。633nmの光を放射するヘ
リウムネオンレーザーが光源である場合、2つの散乱光
集光角度間隔は2−3°および5−15°である。ある
細胞について、1度各間隔中の散乱光の水準が知られる
と、その細胞に関する体積およびヘモグロビン濃度はM
ieの散乱原理の予測する値と比較して決定される。各
細胞に関する体積(V)とヘモグロビン濃度(HC)と
はメモリーに記憶され、Tyckoで議論した如く、こ
の技術で知られている技術により、試料測定サイクルの
終了時にMCVとMCHCとが計算される。これらの計
算を用い、VとHCとの分布サイトグラム(cytog
ram)およびVとHCとのヒストグラムができる。
との間を区別しないし、前記し、実施されている方法
は、網赤血球と赤血球との診断学的に重要なパラメータ
ー例えば細胞1つづつに基いた体積およびヘモグロビン
濃度を個別に決定するのには用いることができない。
の監視における他の困難さは網赤血球検出信号と成熟赤
色血液細胞信号とシステム雑音との間の弁別の困難さに
ある。RNAの染色された系状体は若い網赤血球に多
く、流通式細胞測定器により検出する場合比較的大きい
量の信号を生む。しかし一層成熟した細胞は染色された
RNAの含有が少く、流通式細胞測定器システムの雑音
におおわれてしまうかもしれないより小さい信号を生
む。
技術により、全血試料中の網赤血球を同定し、同時に、
網赤血球と赤血球との体積とヘモグロビン濃度とヘモグ
ロビン含有量とを個別に測定するのに有用な方法と試薬
との要求が存在している。
る技術の変形でカチオン染料を使用したと云う前提で出
発した。また蛍光および(または)吸収を網赤血球検出
するために利用できる流通式細胞測定法の開発に関心が
あった。更にその上吸収の場合、方向雑音除去のため赤
色細胞の球形化を用いることを望んだ(図16及び図1
7を参照)。(若し元の細胞体積を同時に回復させ、精
密に測定することに関心がなければ、多くの方向雑音除
去のために、等容積的または完全な球形化の必要はない
ことに注意。)我我はまた等容積的球形化とTycko
の前記の方法とを用いることにより、蛍光および吸収法
に関して、選択的に網赤血球を染色する試薬を用いて、
細胞1つずつに基き網赤血球と成熟赤色細胞との体積と
ヘモグロビンとを同時に測定できるであろうことを希望
した。若し球形化が完全で、等容積的でないが等張性に
関する或る既知の係数Xであるならば、体積に関しては
1/Xによる補正と蛋白質例えばヘモグロビン濃度に関
してはXによる補正を行うTycko法を用いて元の値
を計算できることに注意。)
ロビンが非常に透明な領域の単色光を放射する光源が要
求される。即ち、赤色ヘリウムネオン(HeNe)レー
ザーまたは均一なより長波長のレーザーのような光源が
要求される。このことは、その波長が吸収測定のために
用いられるはずならば、染料は赤色光の強い吸収をもつ
青色染料でなければならない。
してKimとOrnsteinとの教えにより示唆され
ているような赤色細胞球形化剤として非イオン、カチオ
ンおよび双性イオン界面活性剤を探究した。Kim並に
Ornstein法におけるごとく、我我は赤色細胞溶
血を遅くするため、界面活性剤濃度を“緩衝”するのに
蛋白質(典型的には牛血清アルブミン)を用いた。多く
のそのような界面活性剤(例えばTriton×100
およびラウラミドプロピルアミドベタイン)が満足に働
いた。それで我我はラウラミドプロピルアミドベタイン
および他の幾つかの双性イオン界面活性剤(例えばDA
PSとTDAPS)とが赤色細胞溶血を遅延するために
緩衝する蛋白質を必要とせず、KimとOrnstei
nとの方法について、凡ての種類の血液細胞に対する理
想的な代りの球形化剤であることを見出した。それらは
蛋白質緩衝を必要としない故に、製造するのに安定で、
より簡単な試薬を可能にした。(KimとOrnste
inとの固定段階は最早絶対的なものではなく、蛋白質
含有試薬中での細胞増殖の問題も避られる。)この発明
は、別の特許出願の主題となっている。
収流通式細胞測定法による、血液試料中における網赤血
球を他の細胞から弁別する方法を提供するのが本発明の
主要な目的である。
による全血試料中の網赤血球を教える、前記のような試
薬と方法とを提供することである。
赤血球とを同時に球形化し、網赤血球を染色するため
の、前記のような試薬と方法とを提供することである。
乱光流通式細胞測定法による、全血試料中の網赤血球と
赤血球との体積とヘモグロビン濃度とヘモグロビン含有
量とを同時に測定する、前記のような試薬組成物と方法
とを提供することである。
の赤色血液細胞と網赤血球とを区別し、それぞれを計数
し、細胞1つに基いての測定から決定した各細胞型の体
積とヘモグロビン含有量とヘモグロビン濃度と平均赤血
球体積と平均小体ヘモグロビン濃度とを測定するため
の、前記の如き試薬組成物と方法とを提供するにある。
は網赤血球染色のための有機カチオン染料と約6〜約9
のpHを維持するための緩衝溶液とを含む。その染料は
構造式
n,Inc.of Dayton,Ohioから入手可
能)、あるいは構造式
い。
物のpHを約6〜9に維持するため、適当な緩衝剤を含
んでいる。その溶液はKClまたはNaClを用いて約
250m Osmから約330m Osmに調節された
最終浸透性をもっていて、次の成分の1つまたはそれ以
上を記載の濃度で含んでいてもよい。成分 濃度(mM) K/NaHCO3 5−50 MgCl2 0−88 KCl 4−104 Na3PO4 0−1.5 CaCl2 0−0.6
〜8に維持するために溶液を処方し、それは次の成分を
与えられている濃度で1つまたはそれ以上を含んでいて
もよく、約280〜300m Osmの浸透性を維持す
る。成分 濃度(mM) Tris/TEA 0−150 K2Ox/EDTA 0−121 KCl/NaCl 0−155
透過を助長するために、あるアニオンとカチオンとを含
有すべきことが発見された。そのようなアニオンは重炭
酸イオン、塩素イオン、硼酸イオン、バルビタール、蓚
酸イオンあるいはエチレンジアミンテトラ酢酸(EDT
A)を含んでいてもよい。しかし凡てのアニオンが細胞
膜を横切る染料の透過を促進するのに効果的であるわけ
ではなかった。例えば、次のアニオン、即ちリンゴ酸イ
オン、酒石酸イオン、リン酸イオンが唯一つの主要なア
ニオンとして試薬組成物中に含まれている場合、若しあ
っても、網赤血球と赤血球との間の区別は殆んど出来な
い。可能なカチオンにはカリウムイオン、ナトリウムイ
オン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tri
s)またはトリエタノールアミン(TEA)が含まれ
る。
測定法技術を用いて、全血試料中の網赤血球を同定する
のに用いてもよい。最も広い適用におけるその方法には
全血のアリコートを前記試薬組成物の1つと混合するこ
とが含まれる。適当な培養期間の後、その試料/試薬混
合物を、1度に1細胞ずつ、流通式細胞測定器の特定な
センシング領域を通過させる。水力学的集束により、単
一細胞がそのセンシング域を通過し、そこで適当な照明
波長をもつ集束された光源で照明される。細胞1つずつ
に基き、その細胞に関して少くとも1つの散乱光信号と
少くとも1つの吸収信号とが測定される。これらの測定
値から網赤血球が赤血球から区別され得る。
組成物は更に、赤色血液細胞と網赤血球とを等積的に球
形化するため、双性イオン界面活性剤を含む。その双性
イオン球形化剤は好ましくはアルキルアミドベタインま
たはアルキルベタイン例えばラウラミドプロピルベタイ
ン(LAB)とココアミドプロピルベタン(CAPB)
とココアミドスルホベタイン(CASB)とである。他
の好ましい球形化剤はN−テトラデシル−N,N−ジメ
チル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホナート(T
DAPS)とN−ドデシル−N,N−ジメチル−3−ア
ンモニオ−1−プロパンスルホナート(DDAPS)と
である。TDAPSとDDAPSとは、最も安定した試
料調製物を与える故に最も好ましい球形化剤である。
効果的な等積的球形化のためには、試薬組成物中の球形
化剤濃度は約3.9〜148μg/mlである。球形化
剤は好ましくはLABは約12〜87.5μg/ml量
で、TDAPSは約3.9〜11.8μg/ml量で、
DDAPSは約49.3〜148μg/ml量で、CA
PSは約8.8〜17.5μg/ml量で、あるいはC
ASBは約12.5〜15μg/ml量で存在する。
RNA染色に要する試薬組成物中のニューメチレンブル
ーの濃度は約10〜100μg/mlの範囲であること
を見出した。
の下で、RNA染色に要する試薬組成物中のオキサジン
濃度は低く、即ち、約2〜15μg/mlの範囲であ
り、緩衝剤で増大された透過の結果、網赤血球中RNA
の染料染色は5分以内になることを見出した。そのよう
な低濃度の染料は成熟赤血球の非網赤血球染色を最小に
し、それは雑音バックグラウンドからの信号の良好な分
離となる。その様な速やかな染色はこの試薬組成物を自
働化された方法に非常に適合させている。
測定器のセンシング領域を通過する時各細胞により散乱
および吸収された光を測定し、赤血球が網赤血球と区別
でき、各網赤血球または赤血球の体積およびヘモグロビ
ン濃度が決定できる。網赤血球と赤血球との数および網
赤血球または赤血球のヘモグロビン含有量と平均細胞体
積と平均小体ヘモグロビン濃度と平均細胞ヘモグロビン
は測定された細胞1つづの体積とヘモグロビン濃度から
計算される。
とを包含し、本発明の範囲は請求項において示される。
発明の原理を実施するのに利用されてもよい流通式細胞
測定装置の部分の様式化した機能的、構造的描写を示し
ている。その装置は、出願人により販売されている、商
標、TECHNICON H’1の下に市場で入手でき
るシステムの変形である特別なシステムを描いている。
定法の原理を具体化していて、特定の型の照明に対する
細胞の光散乱および光吸収の応答を知覚する能力を含ん
でいる。本発明に関して主要な関心のある構成要素のみ
が示されている。従って図面は、この装置のいろいろな
構成要素を動かしそして制御するのに要する機械的およ
び電気的構成要素即ちモーター、ソレノイド、ポンプ、
弁、センサーの凡てを説明してはいない。これら構成要
素の凡てはどんな既知の在来の形をもっていてもよく、
それらは、意図されている方法で試料を処理するため
の、本発明に従う流通式細胞測定装置における種種な構
成要素の操作の望ましい様式に関して以下与えられる情
報に関する知識を持っている技術に塾達した正常な人に
より容易に実現できるものである。
通セル(sheath−stream flow ce
ll)とこれを支持する水力学手段とにより、調製され
た細胞を測定点に送る。その細胞は、流通セルの正方形
断面流通チャネルに対し中心にある円筒状体積に局限さ
れている。流通セル構造はTECHNICON H’1
システム中に用いられているものと同一である。水力学
的システムは非常に簡単で、唯2つの蠕動ポンプとそれ
に連結されている配管である。シースポンプ(shea
th pump)と管とはシース(さや)を1.6×1
0-7m3/secの速さで送り、試料は3.5×10-10
m3/secの速さで送られ、流通セル中における流通
チャネルは250μm×250μmである。被覆流れ中
軸方向に流れている、得られた円筒状の試料流は直径7
μm、速さ2.5m/sをもっている。
システムにより提供されている2つの赤色細胞散乱チャ
ネルに加えて、吸収測定を演ずる光学的システムを提供
することにある。散乱/吸収流通式細胞測定器の光学シ
ステムは一般に2つの二次システム(a)照明光学系
(図1)と(b)検出光学系(図2)とに分けることが
できる。
は一般的に整理番号10で示されていて、633nmの
光の2mWビームを放射するヘリウム−ネオンレーザー
12を組入れている。そのビームはレーザービームの位
置の調節をする2つの反射鏡14と16とにより折りま
げられる。その調節でビーム軸を照明光学系の物理的光
学軸と一致させることができる。それからそのビームを
1対の円柱レンズ18と20とにより192×77μm
楕円形ビーム(1/e2において)に形づくられる。1
92μmの寸法は焦点距離150mm円柱レンズ18で
形成され、それはA−1孔口22の長軸(それは図1の
頁の面と並行である)を照明する。77μmの寸法は焦
点距離60mm円柱レンズ20により形成され、A−1
孔口の短軸を照明する。孔口A−1は653×89μm
である。照明二重レンズ23は流通セル24に37.4
×12.6μmの楕円形ガウス強度分布を生じさせる。
その楕円の短軸は垂直である流れの方向に並行、即ち矢
印26の方向にある。
乱し、吸収する。散乱および吸収された光は図2で図示
して説明されている検出光学系中に捕捉され、測定され
る。散乱されない光と19.5°までに散乱された光は
高開口数(Hi−NA)レンズ28により集光され、平
行にされる。そのビームは30/70(30%反射、7
0%透過)ビームスプリッター30により2つの部分に
分割される。そのビーム32はフォトダイオードに反射
され、吸収測定に用いられ、一方透過ビーム34は更に
20/80(20%反射、80%透過)ビームスプリッ
ター36により分割され、2つの散乱チャネルを作る。
反射された散乱チャネル38は5−15°絞り(dar
kstop)40を持ち、一方透過チャネル42は2−
3°絞り44を持っている。これらの絞り40、44の
それぞれを透過する光はそれぞれレンズ46と48とを
通りフォトダイオード50および52に集光される。濃
度フィルター54と54と56とは各フォトダイオード
における光水準を標準検出器と前置増幅器とに適当であ
る水準に低下させるのに用いられる。
前置増幅器60に集光される。前置増幅器出力はそのシ
ステムを透過する光出力に比例する。それは散乱されな
い光と約19.5°までの角度中に散乱される光とを集
める。この角度間隔内で、球形化された赤血球と網赤血
球とによる散乱光の約98%が集められる。
H’1機器の吸収チャネルは細胞吸収測定には最適にさ
れていない。吸収信号は吸収前置増幅器での雑音と同じ
水準である。吸収検出法の数学モデルが開発された。こ
のモデルは、流通セル中におけるレーザーによる照射領
域の減少で、信号は劇的に改善するであろうと予見し
た。スリットの寸法を公称150×20μm(TECH
NICON H’1システムにおいて)から公称40×
20μmに減少してSN比を係数3.75も増加させ
た。
は20〜50mVである。これは処理電子工学系が要求
する信号より非常に小さい。約25の利得のある吸収前
置増幅器に第2の利得段階を加えた。これは約1Vまで
のパルス高さをもたらした。
利得および濃度フィルターの光学密度を、Techni
con(TCN)Optical Test Mate
rial(OTM,TCH T03−1704)を検定
した場合に、各チャネルの出力で約2Vの平均パルス信
号水準を生じるように選択した。この材料は出願人から
市場で入手でき、TECHNICON H’1システム
への使用に適合している。このことは、後置検出信号処
理ハードウエア(Post detection si
gnal processing hardware)
中に可変利得増幅器を用いて、各チャネル中の総括利得
の微細な調節を可能にしている。
図を図3に示めす。このシステムは前置増幅器62と可
変利得増幅器64とパルス高さ分析器66とアナログ−
デジタル変換器68とデータ利得ハードウエア(コンピ
ューター)70とソフトウエアとから成る。
分Howard Shapiro,M.D.,P.
C.,Cambridge,MA,から入手できる4C
yteシステム(4Cyte Model FE Fr
ont Endと4Cyte Model I Int
erface Card)より成る。パルス高さ分析器
とアナログ−デイジタル変換器とデータ利得ソフトウエ
アと、この4Cyteシステムの凡て構成要素である。
これらの構成要素は4つまでの入力信号についてのパル
ス高さを表わす保持パルスを作り出し、“妥当な”パル
ス高さしきい水準を作ることを可能にする。4Cyte
テンターフェイスカードは、4つまでの入力信号のアナ
ログ−デイジタル変換のための4Cyteソフトウエア
と、主コンピューターのRAM記憶装置へのこれらの値
の捕獲と共に用いる。このデイジタル化した信号はリス
トモード中に記憶される。各細胞に関する情報と測定さ
れた4つのパラメーターのおのおのの情報とフラギング
(flagging)に関する情報との5つの8ビット
バイトがある。これらの実験の主コンピューターはカラ
ーモニターとマッチ副処理器(match co−pr
ocessor)とを備えたIBM PC/XTクロー
ンであった。データ整理はどんなIBM両立コンピュー
ターでも実行できる。
定と網赤血球と赤色血液細胞との特性表示のための、吸
収流通式細胞測定技術を用い、同じ試薬組成物を組込ん
だ方法とを説明する。可能性がある場合はいつでも、標
準の市場で入手出来る試薬級材料を用いた。次の処方と
方法とは唯説明の目的のためにのみ提供されているこ
と、及び他の成分と割合と方法とがこの発明の開示に従
って採用できることは理解されよう。
液試料中の網赤血球と赤血球との区別のための散乱およ
び吸収測定 オキサジン750染料を1mg/mlN,N−ジメチル
ホルムアミド原液中に貯蔵する。作業試薬はその原液
を、次の成分を記載の濃度で含有する緩衝溶液に加える
ことにより作る。 オキサジン750 6μg/ml 塩化カルシウム 0.3mM 塩化カリウム 4.0mM 塩化マグネシウム 88.0mM リン酸ナトリウム(三塩基) 0.5mM 重炭酸ナトリウム 20.0mM
にpHはそれぞれ272m mol/kgおよび8.1
であった。
1システム赤色細胞試料処理案を模した方法で手で混合
した。ガラス試験管に作業試薬5mlを満した。それか
ら血液試料5μlを、試薬を渦式混合機上撹拌し乍ら、
その作業試薬にピペットで加えた。それからその血液
1:1000希釈物を流通式細胞測定装置の試料ライン
に供給する。約2分間でその試料は流通セルを通過し、
赤色細胞と網赤血球との分析のためのヘリウム−ネオン
レーザー光源にさらされる。若し試料体積が許されるな
らば各試料は2回測定される。顕微鏡試験ではこの混合
物中の大部分の赤色細胞と網赤血球とは球形化されてい
ること示した。
収サイトグラムの形、図4で表示される。明確な細胞個
体群がその特別な散乱並に吸収信号に基き、明らかに観
察される。赤血球個体群は縦軸と縦線Xとの間の領域A
に来る。これらの細胞は高い散乱信号と低い細胞吸収信
号を示す。網赤血球の主要部分はXの右の領域、領域B
に来る。これらの細胞はそのオキサジン750染色RN
Aからのより高い吸収信号により、成熟赤血球から区別
される。血小体個体群は線Yの下の領域C内に落ち、合
致領域は線Zの上の領域Dにある。血小体は網赤血球に
比較すると、比較的低い散乱信号を持っている。
基き、患者試料の網赤血球数を、網赤血球と赤血球とを
同定する、散乱光と吸収との領域を限定する電子工学的
“窓”を創ることによって決定してもよい。各“窓”に
落ちる網赤血球並に成熟赤血球の数が測定され、従って
全細胞個体群中の網赤血球と赤血球との百分率が計算さ
れる。図4の(1)において網赤血球“窓”は領域Bで
測定され、成熟赤血球“窓”は領域Aで測定される。図
4の(2)および凡ての次の散乱/散乱サイトグラムに
おいて、非線形のグリッド重複はTyckoの前記の方
法に従う、完全球形に就いての一定体積と一定屈折率の
場所を示していることに注意。
ional Committeefor Clinic
al Laboratory Standards(N
CCLS)により勧告されている手動顕微鏡手順を用い
て測定される。この手順においては、少量の試料を調製
し、その試料中の網赤血球の百分率を顕微鏡の助けをか
りて数える。その顕微鏡は100×の油浸対物レンズと
10×接眼レンズとを備えている。各試料について最低
1000個の細胞を数える。顕微鏡の接眼レンズ中にM
illerデイスクを挿入して計数精度を改善した。染
色後青色の材料の2つまたはそれ以上の粒子を含有する
どの赤色細胞も網赤血球と分類した。
定技術により2.3%と測定された。同じ血液試料をN
CCLS法でも分析した。その結果は網赤血球数1.7
%であった。
ーで染色され、散乱/吸収流通式細胞測定器により測定
された場合網赤血球と赤血球との個体群間を区別するの
に実施された。緩衝剤処方はオキサジン750を含有す
る試薬組成物についてのそれと同じである。オキサジン
750を置きかえた、作業試薬中のニューメチレンブル
ーの濃度は60μg/mlである。前記のような試料調
製と分析案とに従った。しかし、顕微鏡的検査は、赤色
細胞並に網赤血球はオキサジン750混合物におけるよ
り球形化されていないことを明らかにした。分析からの
粗データは赤色散乱対赤色吸収サイトグラムの形で(図
5の(1))表示される。図4の(1)と比較すると、
吸収と散乱信号は、多分方向雑音のため、より拡がって
いることに注意すること。赤血球と網赤血球との間の吸
収分離に基くと、患者試料の網赤血球数は2.2%と測
定された。NCCLS法により分析された場合、網赤血
球数1.7%が得られた。
1の試薬組成物を用いる、血液試料中の網赤血球と赤血
球とを識別するための散乱並に吸収さ測定 実施例1の試薬組成物を利用したが、赤色血液細胞と網
赤血球とを等積的に球形化するために、更に双性イオン
界面活性剤を含めて、第2の実験セットを実施した。
に界面活性剤、ラウラミドプロピルベタインを、試薬中
の界面活性剤最終濃度が63μg/mlであるように加
えて創った。
従った。
中の成熟赤色細胞と網赤血球とは完全に球形化され、網
赤血球は染色されていることが判った。球形化の完全さ
の増大と共に、方向雑音の減少が増していることを示す
図14、図15、図4〜図7の差異に注目せよ。
染料と前記の界面活性剤とを含有する試薬組成物で染色
した場合、網赤血球個体群と赤色球個体群との間のより
高い弁別度を示している。図16において未染色対照、
領域Bには細胞がないことに注目すること。
%と測定された。同じ血液試料がNCCLS法によって
も分析された。その結果は網赤血球数9.1%である。
ルー染料と前記の界面活性剤とを含有する試薬組成物で
染色した場合の、網赤血球個体群と赤血球個体群との弁
別度を示している。
5.0%と測定された。同じ血液試料がNCCLS法に
よっても分析された。その結果は網赤血球数9.1%で
あった。
用いる、本発明の試薬組成物と方法並にNCCLS参照
方法とに就いての相関研究 検出光学サブシステムが、流通セル中のレーザービーム
を通過する細胞からの、散乱光および非散乱光を集め
る。細胞は凡ての方法に光を散乱する。前記の光学シス
テム中の比較的Hi−NAレンズは、19.5°までの
半角を持つ光学軸に中心を置く円錐中に散乱される光を
受ける。19.5°より大きい角度に散乱される光は失
はれる。その結果、細胞の吸収を測定しょうとする場
合、完全に非吸収の細胞は入射光の数パーセントまでを
吸収(擬似吸収)する“ようである。”測定される吸収
は次の如く表わすことができる。
には染色された網赤血球からの実際の吸収信号と同じ大
きさである。このことは染色された網赤血球の未染色赤
色血液細胞からの、吸収サイトグラムでの分離度を減少
する。吸収チャネルのS/N比は、擬似吸収およびヘモ
グロビン吸収成分を各赤色細胞と網赤血球との吸収信号
から除去するためにその信号を補正することにより改善
できる。擬似吸収とヘモグロビン吸収との量は前記のT
ycko特許中に記載の、よく知られているMie光散
乱原理を用いることにより、どんな与えられた細胞につ
いても計算できる。角度間隔19.5〜180°につい
ての散乱断面、その上にヘモグロビン吸収成分δ3を加
えたものは次の如く計算できる。
り、λは励起(または照明)光波長であり、ηsは試料
流およびシース(sheath)の屈折率であり、Qe
xtは細胞の励起効率であり、擬似吸収の場合、θ3=
0°およびΔθ3=19.5°である。δ3値はVおよび
HCの凡ての期待値に関し、表にされている。
とは先ず、Tyckoに記載のような散乱−散乱サイト
グラムの細胞からの2つの散乱信号から決定する。それ
からδ3を、測定されたVとHCとに関してのルックア
ップ表記載項目中に見出し、吸収チャネルで測定された
値から引き去る。その結果が細胞の染色による実際の吸
収である。測定された吸収信号は次の関係式により各細
胞に関する染料吸収のみを残すように調節できる。
とフラギングとに先立ち、この調節された値が粗データ
パラメータに替る。赤色散乱パラメーターがV−HC図
中に現れない対象はいずれもデータ分析計画では無限さ
れている。それで、このデータは図10と図11とに示
されている補正された値を反映する赤色散乱対吸収サイ
トグラムで再表示してある。
吸収流通式細胞測定器中で試薬組成物の中に用いた場合
のオキサジン750の性能を比較するため行った。血液
試料はその試薬組成物で染色した。血液試料の同じセッ
ト中の網赤血球もNCCLS法を用いて計数した。
吸収補正を除いては、実施例2について記載したものと
同じものである。
の成熟赤色細胞と網赤血球とが完全に球形化され、網赤
血球は染色されていることが判った。
血球数は図12中で比較されている。試薬組成物中オキ
サジン750濃度2μg/mlで、試薬組成物と図1〜
図3の流通式細胞測定装置とを用いた測定値と、NCC
LS参照法により得た測定値との間に密接な相関がある
ことを示している。直交回帰分析により得られた測定値
の相関係数は0.92であった。
を用いた、吸収流通式細胞測定器とTECHNICON
H’1参照法とに就いての相関研究 擬似吸収補正と適当なゲーティングの後、赤血球と網赤
血球との指数MCVとMCHCとが別別に測定され、散
乱/吸収流通式細胞測定器中に本発明の試薬組成物を用
いて得られた値とTECHNICON H’1測定値と
を比較した。図8と図9とはそれぞれ、全体の赤色血液
細胞のMCVとMCHCとに関する相関データを示す。
印された網赤血球を示す。
の有利さには、全血試料の中の網赤血球の同定に関す
る、そして吸収流通式細胞測定技術による、網赤血球と
赤血球との体積とヘモグロビン含有量とヘモグロビン濃
度との同時定量に関する試薬組成物と方法とを含んでい
る。
達成され、他の有利な結果が得られることが判るであろ
う。
の構造と方法とにおいていろいろな変更がなされ得るの
で、前記の記載中に含まれるかあるいは添付図面で示さ
れた凡ての事項は説明としてで、限定の意味ではないと
解釈されるべきものであるとする。例えば血液の画分試
料は同様な方法で処置し得る。
通式細胞測定器の照明光学系の説明図である。
通式細胞測定器の検出光学系の説明図である。
通式細胞測定器の検出信号処理システムの説明図であ
る。
された、部分的に球形化されている赤色血液細胞と網赤
血球とを含有する全血試料についてのサイトグラムであ
る。(1)は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであ
り、(2)は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサ
イトグラムである。
染色された、部分的に球形化されている赤色血液細胞と
網赤血球とを含有する全血試料についてのサイトグラム
である。(1)は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラム
であり、(2)は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱
のサイトグラムである。
された、完全に球形化された赤色血液細胞と網赤血球と
を含有する全血試料についてのサイトグラムである。
(1)は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであり、
(2)は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサイト
グラムである。
染色された、完全に球形化された赤色血液細胞と網赤血
球とを含有する全血試料についてのサイトグラムであ
る。(1)は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであ
り、(2)は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサ
イトグラムである。
染色されている網赤血球に関する、MCVの相関を示
す。
染色されている網赤血球に関する、MCHCの相関を示
す。
サジン750で染色された、完全に球形化された赤色血
液細胞と網赤血球とを含有する全血試料に関するサイト
グラムである。(1)は赤色光散乱対赤色吸収のサイト
グラムであり、(2)は赤色光低角度散乱対赤色光高角
度散乱のサイトグラムである。
ーメチレンブルーで染色された完全に球形化された赤色
血液細胞と網赤血球とを含有する全血試料に関するサイ
トグラムである。(1)は赤色光散乱対赤色吸収のサイ
トグラムであり、(2)は赤色光低角度散乱対赤色光高
角度散乱のサイトグラムである。
サジン750とNCCLS参照方法とを用いた、全血試
料中に検出された網赤血球百分率の比較である。
方形で示す)とに関する、HC対Vのサイトグラムであ
る。
関する、赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムである。
関する、赤色光高角度散乱対赤色光低角度散乱のサイト
グラムである。
する、赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであり、擬
似吸収に対して補正してある。
する、赤色光高角度散乱対赤色光低角度散乱のサイトグ
ラムである。
Claims (31)
- 【請求項1】 次の各工程 (a)血液試料のアリコートを、球形化剤を含有する溶
液から成る水性試薬組成物と混合して懸濁液を形成する
工程、(b)工程(a)の前記懸濁液を、集束した光学
的照明領域に、1度に実質的に1つの細胞ずつ、通す工
程、(c)各細胞により散乱された光および吸収された
光を検出及び測定する工程、及び(d)前記の散乱およ
び吸収された光の強さに少とも部分的に基いて、関心あ
る亜綱の細胞を識別する工程、を含んで成る流通式細胞
測定法による、血液試料中の関心ある細胞の亜綱の同定
方法。 - 【請求項2】 工程(a)が、関心ある亜綱を選択的に
染色する染料化合物を添加することを含む、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項3】 工程(d)が、集光光学系の孔口の外に
散乱する光による擬似吸収成分除去のため、吸収信号の
量を修正することを含む、請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 次の各工程 (a)関心のある亜綱の細胞のリボ核酸を染色する染料
化合物と、約6〜約9のpHを維持するための緩衝剤と
球形化剤とを包含する水性試薬組成物と血液試料のアリ
コートを混合して懸濁液を形成する工程、(b)工程
(a)の懸濁液を、集束した光学的照明領域に、1度に
実質的に1つの細胞ずつ、通す工程、(c)各細胞によ
り散乱および吸収された光を検出及び測定する工程、及
び(d)前記の散乱および吸収された光の強さに少くと
も部分的に基いて、関心ある亜綱の細胞を識別する工
程、を含んで成る流通式細胞測定法による、血液試料中
の関心ある細胞の亜綱の同定方法。 - 【請求項5】 細胞の亜綱が網状赤血球である請求項4
に記載の方法。 - 【請求項6】 工程(b)における光学的照明がスペク
トルの赤色領域における励起波長をもつ、請求項4に記
載の方法。 - 【請求項7】 球形化剤が双性イオン界面活性剤であ
り、全緩衝剤濃度が血液試料中の細胞を等容積的に球形
にするよう等張である、請求項4に記載の方法。 - 【請求項8】 染料化合物が構造式 【化1】 を持つオキサジン750あるいは染料化合物が構造式 【化2】 を持つニューメチレンブルーである、請求項4に記載の
方法。 - 【請求項9】 界面活性剤がラウラミドプロピルベタイ
ンとN−テトラデシル−N,N−ジメチル−3−アンモ
ニオ−1−プロパンスルホナートとN−ドデシル−N,
N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホナ
ートとココアミドプロピルベタインとココアミドスルホ
ベタインとから成る群から選択される、請求項7に記載
の方法。 - 【請求項10】 次の各工程 (a)有機のカチオン染料化合物と球形化剤と緩衝剤溶
液とを包含する試薬組成物を、血液試料のアリコートと
混合して懸濁液を形成させ、その染料化合物が網状赤血
球のリボ核酸を染色し、(b)工程(a)の懸濁液を、
集束した光学的照明領域に、1度に実質的に1つの細胞
ずつ、通す工程、(c)各細胞により散乱および吸収さ
れた光を検出及び測定する工程、(d)前記の散乱並に
吸収された光の強さに基き染色された細胞と染色されて
いない細胞とを同定する工程、及び(e)前記の散乱お
よび吸収された光の強さに基き網状赤血球または赤血球
の数と体積とヘモグロビン濃度とRNA濃度とを決定す
る工程、を含んで成る流通式細胞測定法による、全血試
料中の網状赤血球と赤血球との同定方法。 - 【請求項11】 染料化合物が濃度範囲約2μg/ml
〜約15μg/mlのオキサジン750である、請求項
10に記載の方法。 - 【請求項12】 試薬組成物のpHが約6〜約9であ
る、請求項10に記載の方法。 - 【請求項13】 緩衝溶液が、濃度約5〜50mMのK
/NaHCO3と、濃度約0〜88mMのMgCl2と濃
度約4〜104mMのKClと濃度約0〜1.5mMの
Na3PO4と濃度約0〜0.6mMのCaCl2との1
つまたはそれ以上を包含し、試薬組成物の最終浸透性が
約250〜330m Osmである、請求項10に記載
の方法。 - 【請求項14】 緩衝溶液が濃度約0〜150mMのT
ris/TEA、濃度約0〜121mMのK2Ox/E
DTA、または濃度約0〜155mMのKCl/NaC
lの1つまたはそれ以上を包含し、試薬組成物の最終浸
透性が約280〜300m Osmである、請求項10
に記載の方法。 - 【請求項15】 界面活性剤がアルキルベタインまたは
アルキルアミドベタインである、請求項10に記載の方
法。 - 【請求項16】 界面活性剤がラウラミドプロピルベタ
インとN−テトラデシル−N,N−ジメチル−3−アン
モニオ−1−プロパンスルホナートとN−デシル−N,
N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホナ
ートとココアミドプロピルベタインとココアミドスルホ
ベタインとより成る群から選択される、請求項10に記
載の方法。 - 【請求項17】 界面活性剤が約3.9〜148μg/
mlの量で存在する、請求項10に記載の方法。 - 【請求項18】 染料化合物が濃度約10〜100μg
/mlのニューメチレンブルーである、請求項10に記
載の方法。 - 【請求項19】 染料化合物が構造式 【化3】 を持つオキサジン750または染料化合物が構造式 【化4】 を持つニューメチレンブルーである細胞のリボ核酸を染
色する染料化合物と、pHを約6〜8.1に維持するた
めの緩衝剤とを包含する、流通式細胞測定法による、全
血試料中の関心ある細胞の亜綱の同定のための試薬組成
物。 - 【請求項20】 緩衝溶液が、濃度約5〜50mMのK
/NaHCO3と濃度約0〜88mMのMgCl2と濃度
約4〜104mMのKClと濃度約0〜1.5mMのN
a3PO4と濃度約0〜0.6mMのCaCl2との1つ
またはそれ以上を包含し、試薬組成物の最終浸透性が約
250〜330m Osmである、請求項19に記載の
試薬組成物。 - 【請求項21】 緩衝溶液が、濃度約0〜150mMの
Tris/TEA、濃度約0〜121mMのK2Ox/
EDTA、あるいは濃度約0〜155mMのKCl/N
aClの1つまたはそれ以上を包含し、試薬組成物の最
終浸透性が約280〜300m Osmである、請求項
19に記載の試薬組成物。 - 【請求項22】 染料オキサジン750を濃度約2〜1
5μg/mlで含有する、請求項19に記載の試薬組成
物。 - 【請求項23】 染料ニューメチレンブルーを濃度約1
0〜100μg/mlで含有する、請求項19に記載の
試薬組成物。 - 【請求項24】 染料化合物が構造式 【化5】 を持つオキサジン750か、または構造式 【化6】 を持つニューメチレンブルーである、網状赤血球中のリ
ボ核酸染色のための染料化合物の有効量と、網状赤血球
および赤血球の等容積的球形化を行う量の双性イオン界
面活性剤と約6〜9のpHを維持するための緩衝溶液と
を包含する、流通式細胞測定法による全血試料中の網状
赤血球同定のための試薬組成物。 - 【請求項25】 緩衝溶液が濃度約5〜50mMのK/
NaHCO3と、濃度約0〜88mMのMgCl2と濃度
4〜104mMのKClと濃度約0〜1.5mMのNa
3PO4と濃度0〜0.6mMのCaCl2との1つまた
はそれ以上を包含し、試薬組成物の最終浸透性が約25
0〜330m Osmである、請求項24に記載の試薬
組成物。 - 【請求項26】 緩衝溶液が濃度約0〜150mMのT
ris/TEA、濃度約0〜121mMのK2Ox/E
DTA、または濃度0〜155mMのKCl/NaCl
の1つまたはそれ以上を包含し、試薬組成物の最終浸透
性が約280〜300m Osmである、請求項24に
記載の試薬組成物。 - 【請求項27】 濃度約2〜15μg/mlの染料オキ
サジン750を含有する、請求項24に記載の試薬組成
物。 - 【請求項28】 濃度約10〜100μg/mlの染料
ニューメチレンブルーを含有する、請求項24に記載の
試薬組成物。 - 【請求項29】 界面活性剤を約3.9〜148μg/
ml含有する、請求項24に記載の試薬組成物。 - 【請求項30】 界面活性剤がアルキルベタインまたは
アルキルアミドベタインである請求項24に記載の試薬
組成物。 - 【請求項31】 界面活性剤がラウラミドプロピルベタ
インとN−テトラデシル−N,N−ジメチル−3−アン
モニオ−1−プロパンスルホナートとN−ドデシル−
N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1プロパンスルホ
ナートとココアミドプロピルベタインとココアミドスル
ホベタインとから成る群から選択される、請求項24に
記載の試薬組成物。
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