JPH02181656A - 総コレステロール分析要素 - Google Patents
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
析するための乾式の一体型多層分析要素に関するもので
ある。
遊離コレステロールから成る。遊離コレステロールは総
コレステロールの僅か25%程度を占めるに過ぎず、結
合型コレステロールが総コレステロールの約75%を占
める。結合型コレステロールはコレステロールエステル
と蛋白質(リボプロティン〉との錯体の形で存在する。
を用いて酸化し、生成する過酸化水素またはコレステノ
ンを定量することにより定量できるが、結合型コレステ
ロールは分解して遊離コレステロールにしなければ分析
することができない。
ン)は、コレステロールエステルに対するコレステロー
ルエステラーゼの作用を阻害するので、エステラーゼを
作用させる前にこの錯体を分解させる必要がある。特開
昭53−96378号(米国特許4,275,151号
、同4,275,152号に対応)には、エチレングリ
コール単位が20未溝のアルキルフェノキシポリエトキ
シエタノール(ポリエチレンオキシド−モノ−アルキル
フェニルエーテルの別名)を作用させることが提案され
ている。また米国特許3,925,164号でコレステ
ロールエステラーゼとともにポリエチレングリコールア
ルキルエーテルのような界面活性剤を用いることが知ら
れている。
試料で精度の高い検査を行うことができることが望まし
い、従来溶液試薬を用いる湿式法が広く用いられている
が、迅速性に欠ける。乾式化学分析、すなわち実質的に
乾燥状態の分析要素、例えば試験片や多層分析要素中に
分析試薬系を導入した臨床分析法が、19°70年代か
ら知られている。乾式化学分析は湿式法による化学分析
(即ち溶液中の試薬を用いる方法)より、例えば使用上
の簡易性、経済上の節約及び分析の迅速さなどの点で優
れている。乾式多層分析要素は、微量の液体試料で精度
の高い検査を迅速に行うことができる分析手段として開
発され、例えば特公昭53−21677号、特開昭55
−164358号、特開昭60−222769号等で知
られている。乾式多層分析要素の一例を挙げれば、透明
支持体、試薬層、反射層、展開層から構成されている。
クフィルム)の上に塗布された試薬層には、液体試料中
に含まれる被検成分と反応し、その成分量に応じた光学
濃度に発色する試薬が含まれる0反射層は、試薬層に入
射した光が展開層に達するのを防ぎ、試薬層の光学測定
の際展開層に点着した液体試料の影響を受けないように
する役割を持つ、展開層は、点着された液体試料を均一
に、液の量にほぼ比例する面積に広げる。このような乾
式分析要素を用いて定量分析するには、液体試料、例え
ば全血を展開層の表面に一定量滴下する。展開層で展開
された血液は反射層を通って試薬層に達し、ここで試薬
と反応し、発色する。点着後、化学分析スライドを適当
な時間、一定温度に保って発色反応を充分に進行させた
後、透明支持体側から照明光を試薬層に照射し、特定波
長域で反射光量を測定して反射濃度を求め、予め求めて
おいた検量線に基づいて定量分析を行う。
を除去した血清または血漿を試料として分析が行なわれ
ることが多かった。しかし血液の他の成分から赤血球を
分離する操作には多くの労力と装置のコストを伴うので
、未希釈の全血で分析できることが望ましい。
で血清または血漿と血球成分とを分離しなければならな
い、このような要求を満足する、全血試料中の特定成分
の分析に有用な乾式分析要素が、特開昭62−1387
57号で提案された。この分析要素は、第1の非繊維質
多孔性層、第2の非繊維質多孔性層、繊維質多孔性層が
この順に一体に積層されており、前記3層の多孔性層が
それぞれ隣接する面の間で、液体の均一透過が実質的に
妨げられないような微少貫通部を形成するように部分的
に配置された接着剤により実質的に密着して接着されて
一体化されている、多層分析要素であり、発色等の光学
的変化を生ずる試薬組成物は前記3層の多孔性層のいず
れかに含まれ、被検出成分の存在下での発色等の光学的
変化は主として第1の非繊維質多孔性層で検出される。
質多孔性層が協同的に働いて、血液から血球成分を分離
する。
分離層を備えた多層分析要素では、しかし血球分離層内
での溶血が重大な問題となる。即ち、溶血により赤血球
内部から放出されるヘモグロビン等のために、特定波長
域での反射光量の測定が妨害される。また溶血は血清ま
たは血漿中の総コレステロールの濃度を変化させる。酵
素反応や試薬組成物の発色反応が阻害されることもある
。
こることは、総コレステロール分析の測定精度を下げる
原因になる。
エーテル(アルキルフェノキシポリエトキシエタノール
)はコレステロールの加水分解を行うには有用であるが
、それ自身溶血性〈溶血させる性質)が大きい、しかも
比救的低分子であるために、組み込んだ層以外への拡散
性が大きい、それ故、血球分離層を備えた乾式分析要素
中にこの物質を組み込むと、分析要素中で溶血が起こっ
てしまい、その結果正確な総コレステロールの濃度分析
が行えないという欠点がある。
−アルキルフェニルエーテルのオキシエチレン単位を大
きくする(pAえば40以上に〉ことを試みた。しかし
このようなポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフェ
ニルエーテルを用いた場合、溶血性は低下するが、一方
で本来の役目である結合コレステロールの分解への効果
が減少してしまい、やはり正確な総コレステロールの濃
度分析は行えなかった。
が遊離コレステロールに充分分解されるような、優れた
総コレステロール定量分析用の乾式一体型多層分析要素
が望まれていた。
て解決すべき技術的課題は、上述の技術的要求を満たす
分析要素を提供することである。即ち、分析要素中で溶
血が起こらず、かつ結合コレステロールが遊離コレステ
ロールに充分分解されるような、優れた総コレステロー
ル定量分析用の乾式一体型多層分析要素を提供すること
である。
る少なくとも一つの水透過性層を有し、前記水透過性層
のうち少なくとも1層にコレステロールエステル加水分
解活性を有する酵素を含む乾式分析要素であって、前記
酵素を含む層またはそれ以外の水透過性層の少なくとも
1層にポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフェニル
エーテルとホルムアルデヒドの縮合物を含む分析要素に
よって解決された。
む層と上記化合物を含む層とは、異なってもよいが、同
一の層であることが好ましい。
ルとホルムアルデヒドの縮合物は、ポリオキシエチレン
鎖のオキシエチレン単位の数が20未満である、ポリエ
チレンオキシド−モノ−アルキルフェニルエーテル分子
2ないし4個の、ホルムアルデヒド縮合物であることが
好ましい、好ましい縮合物は、下記一般式[11で表さ
れる。
は炭素原子数4ないし12のアルキル基を表す、Rは炭
素原子数8または9の直鎖または分岐アルキル基である
ことが好ましい。
とも1層の親水性ポリマーを含む層、多孔性試薬層、血
液から血球成分を分離するための層(血球分離層と称す
る)および血球分離層の一部を構成する多孔性血液展開
層が、この順に一体に積層されており、コレステロール
エステラーゼ活性を有する少なくとも1種の酵素、コレ
ステロールオキシダーゼ、及び過酸化水素の存在下に検
出し得る光学的変化を生ずる試薬組成物を含む総コレス
テロール定量分析用の乾式一体型多層分析要素であって
、前記多孔性試薬層にコレステロールエステラーゼ活性
を有する少なくとも1種の酵素、コレステロールオキシ
ダーゼ、および過酸化水素の存在下に検出し得る光学的
変化を生ずる試薬組成物の少なくとも一部のうちのいず
れか少なくとも1つを含み、前記親水性ポリマーを含む
層、多孔性試薬層、血液から血球成分を分離するための
層のうち少なくとも1つに、前記一般式で表される界面
活性化合物を含む分析要素によって、好ましく解決され
た。
、そのうち少なくとも1層は多孔性血液展開層である。
1層にコレステロールエステル加水分解活性を有する酵
素を含む0本発明の分析要素は、コレステロールエステ
ル加水分解活性を有する酵素を含む層またはそれ以外の
水浸透性層に、ポリエチレンオキシド−モノ−アルキル
フェニルエーテルとホルムアルデヒドの縮合物を含むこ
とを、特徴とする。
透過性支持体は水浸透性であってもよいが、水不浸透性
であることが実用上好ましい。
なくとも1層の、多孔性試薬層および血液から血球成分
を分離するための層(以下、血球分離層と称す)を有す
ることが好ましい、この構成において光透過性水不浸透
性支持体と多孔性試薬層の間には、少なくとも1層の親
水性ポリマーを含む層を有することが好ましい。
液展開層として作用する層であるか、血液展開作用をし
てもよく、それが好ましい。
水性ポリマーから成る層、多孔性試薬層、血球分離層が
この順に一体に積層されており、血球分離層の支持体と
反対の表面に近い部分が血液展開層としての作用をする
層である多層分析要素が、特に好ましい。
してもよい、この場合の展開とは、血液展開層および/
まなは血球分離層での血液の展開領域よりも広い領域に
、血漿または血清をほぼ一様に展開することを言う。
テラーゼ活性を有する少なくとも1種の酵素(以下CH
Eと略記する)、コレステロールオキシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ、及び過酸化水素の存在下に発色等の検出し
得る光学的変化を生ずる試薬組成物を含む、これら全て
を多孔性試薬層に含んでもよいし、その一部を多孔性試
薬層以外の水浸透性層に含んでもよい0例えば、C)(
Eとコレステロールオキシダーゼを多孔性試薬層に含み
、ペルオキシダーゼと過酸化水素検出試薬組成物を親水
性ポリマーから成る層に含んでもよい、上記諸成分の一
部、例えばCHEを、血球分離層に含んでもよい。
を得るために用いるコレステロールエステラーゼ活性を
有する酵素としでは、例えば米国特許3925164号
、同4,275,151号等に製法が記載されたコレス
テロールエステラーゼをはじめ、市販のコレステロール
エステラーゼを選択して用いることができる。コレステ
ロールエステラーゼは動物臓器起源のものでも、微生物
起源のものでもよい。
テロールエステラーゼとともにリボプロティンリパーゼ
を併用してもよい。
ダーゼを用いて酸化し、生成する過酸化水素を定量する
方法を用いることができる。コレステロールオキシダー
ゼとしては、例えば特開昭49−47582号2特公昭
57−28552号、同57−44318号等に製法が
記載されたものを、用いることができる。
おり、当業者はそれらの中から選択して採用することが
できる0例えば i)ペルオキシダーゼと米国特許3,983,005号
に記載された4−アミノアンチピリンとナフトール類の
組み合わせ、 i)特開昭57−142,562号に記載された、ペル
オキシダーゼ、水素供与体、N、N−ジ置換アニリンの
組み合わせ、 iii )ロイコ色素の酸化により染料を生成する系、
例えば、ペルオキシダーゼと米国特許4,089,74
7号、特開昭59−193352号等に記載されたイミ
ダゾールロイコ色素との組み合わせ、 等が有用である。
ドラジン、2.4−ジニトロヒドラジン等を試薬として
用いることができる。
ADP)依存コレステロールデヒドロゲナーゼを用いて
、生成するコレステノン又はNADH(またはNADP
H)を定量する方法を用いることもできる。
孔性層を用いてもよいが、非繊維多孔性層を用いること
もできる。特公昭53−21677号、米国特許1.4
21.341号等に記載されたセルロースエステル類、
例えば、セルロースアセテート、セルロースアセテート
/ブチレート、硝酸セルロースからなるプラッシュ・ポ
リマーの層が好ましい、6−ナイロン、6.6−ナイロ
ン等のポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン等の
微多孔性膜でもよい、特開昭62−27006号に記載
されたポリスルホンから成る微孔性膜でもよい。
859号等に記載された、ポリマー小粒子、ガラス粒子
、けい藻土等が親水性または非吸水性ポリマーで結合さ
れた連続空隙をもつ多孔性層、特開昭57−101.7
80号、同57−101.761号に記載されたポリマ
ー粒子構造物も利用できる。
から成るメンブランフィルタ−では、厚さ方向の液体通
過経路は膜の製造の際の自由表面側〈即ち光沢面)で最
も狭くなっており、本発明の分析要素の試薬層にこの種
の膜を用いる場合には、層の支持体に近い側にメンブラ
ンフィルタ−の光沢面を向けることが好ましい。
塗布した後、試薬組成物を含まない非繊維多孔性層を特
開昭55−164356号のような方法で接着させるこ
とによって、試薬組成物を第1の非繊維多孔性層に実質
的に含有させることができる。
、界面活性剤等を含有させることができる0本発明の分
析要素の試薬層に含有させることができる緩衝剤の例と
しては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩やBiochesi
stry誌 第5巻 第2号、467ページより477
ページ(1966年)に記載されているグツド(Coo
d )の緩衝剤などを挙げることができる。これらの緩
衝剤はr蛋白質・酵素の基礎実験法J(堀尾武−ほか著
、南江堂、1981年)、前記Biochemistr
y誌第5巻等を参考にして選択することができる。
成物を試薬層に、中間体と反応して染料等を生成し得る
組成物(指示薬)を試薬層と支持体との間にある第2の
試薬層に含んでもよい、この場合第2の試薬層は、多孔
質であってもよいが、親水性ポリマーを結合剤とする実
質的に均一な層であることが好ましい、親水性ポリマー
として例えばゼラチンおよびその誘導体く例えばフタル
化ゼラチン)、セルロース誘導体(例えばヒドロキシプ
ロピルセルロース)、アガロース、アクリルアミド重合
体、メタアクリルアミド重合体、アクリルアミドまたは
メタアクリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重合
体等が利用できる。第1の試薬層と第2の試薬層の間に
妨害物除去層(例えばRe5earchDisclos
ure、No、12626(19〕4)、p、51 t
o 58に記載されたような)を設けてもよい。
層であることが好ましい、液体計量作用とは、その表面
に点着供給された液体試料を、その中に含有している成
分を実質的に偏在させることなく、面方向に単位面積当
りほぼ一定量の割合で広げる作用である。
織布、織物生地(例えば平織生地)、編物生地(例えば
トリコット編)、ガラス繊維r紙等を用いることができ
る。これらのうち織物、編物が好ましい、織物等は特開
昭57−86359号に記載されたようなグロー放電処
理をしてもよい、展開層には、展開面積、展開速度等を
調節するため、特開昭60−222770号、特願昭6
1−122875号、同61−122876号、同61
−143754号に記載したような親水性高分子あるい
は界面活性剤を含有してもよい、展開層はまた、特公昭
53−216フフ号の記載のような非繊維展開層でもよ
い。
フ。
で合成することができる0例えば米国特許2,541,
991号に記載された方法で合成できる。即ち、アルキ
ルフェノールとホルムアルデヒドとの縮合物を、アルキ
レンオキシドと反応させてオキシアルキル化することに
より、合成できる。また特公昭38−23,347号に
記載された方法を利用することもできる。
−4−(4−(ジメチルアミノ)フェニルツー5−フェ
ネチルイミダゾール 酢酸塩 5.7g2−(4
−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフェニル)−4−(
4−(ジメチルアミノ)フェニルツー5−フェネチルイ
ミダゾール 塩酸塩 0.89N、N−ジエチル
ラウリルアミド 104gだうjz」1
1 下記組成りのゼラチン溶液を作成した。
00 。
化10区1 B液をTKオートホモミキサー(特殊機械工業社製乳化
器)で約5700回転/分でかくはんしながらA液を添
加し、約30分間分散して、乳化物を調製した。
lの透明ポリエチレンテレフタレート(PET)フィル
ム(支持体)の上に1餉2当たり150gの割合で塗布
し、乾燥させ、発色試薬層とした。
約30g/112の割合)、有効孔径1.2μ鴎、厚さ
140μm、空隙率約80%のセルロースアセテートメ
ンブレンフィルター(富士写真フィルム(株)製ミクロ
フィルターFM300)を重ね合わせ、乾燥させて、発
色試薬層にメンブレンフィルターを接着させた。
おいな下記組成物[1]を1m2当たり110m1の割
合で塗布し、乾燥させて、第1多孔質層とした。
1223゜コレステロールエステラーゼ
1.7gコレステロールオキシダーゼ 1
0.18gリボプロティンリパーゼ
1.94゜ペルオキシダーゼ
8.86゜フェロシアン化カリウム
5.6g一般式[1]の化合物
4.6g(ただしR=p−ノニル、n=10゜ m=2およびm=3の混合物) 1−4.の 第2多孔質層とするための有効孔径3μ輪、厚さ140
μ転空隙率約80%のセルロースアセテートメンブレン
フィルター(富士写真フィルム(株)製ミクロフィルタ
ーFM300)と、試料展開層とするための、50デニ
ール相当のPET紡績糸を36ゲージ編みしたトリコッ
ト編物布地(厚さ約250μ酌を、それぞれ一般式[1
]の化合物(ただしRで示される置換基がp−ノニル基
、n;10、m=2およびm=3の混合物)の2重量%
水溶液に浸漬し、空隙に液を満たした後取り出して、乾
燥させた。
予熱した表面に、温度130℃に加熱熔融したホットメ
ルト型接着剤を、グラビア印刷法を利用して、グラビア
ローラーからの転写により点状に付着させた。グラビア
ローラーのドツト中心間隔0.9m転ドツト面積率は約
20%、付着した固形成分量(単位面積当たり)は約3
g/m”であった。
、直ちに含浸処理済みの前記メンブレンフィルター(第
2多孔質層となる)の非光沢面を向かい合わせ、両者を
ラミネートローラーの間を通してラミネート(接着一体
止)した。
点状接着法により前記第1多孔質層の面上に接着し、一
体止させた。すなわち上記重層物のメンブレンフィルタ
ー面に、加熱したホットメルト型接着剤を、グラビア印
刷法を利用してグラビアローラーからの転写により点状
に付着させた後、直ちに前記第1多孔質層(支持体およ
び発色試薬層の上にある)の面と向かい合わせ、両者を
ラミネートローラーの間を通し、ラミネート(接着一体
止〉した。
ルムは、支持体、発色試薬層、第1多孔質層、第2多孔
質贋、布展開層の順に一体に積層されている。布展開層
と第2多孔質層とは協同して、血球ろ重層として作用す
る。第1多孔質層は、コレステロールの存在下に第2鉄
イオンを生成する反応層として作用する0発色試薬層は
、コレステロールの存在下に第1多孔質層で生成した第
2鉄イオンにより色素を形成し、色素は透明支持体を通
して光学的に検出される。
辺15■lの正方形チップに裁断し、特開昭58−32
350号に記載のスライド枠に収めて総コレステロール
定量用生化学分析スライドを完成した。
レンオキシド−モノ−p−オクチルフェニルエーテル(
オキシエチレン単位線台数10)を用いた他は、実施例
1と同様の手順で、総コレステロール定量用生化学分析
スライドを完成した。
下記のようにして評価した。
同じ総コレステロール含有量でヘマトクリット値40%
のヒト全血試料を用意し、各10μlを実施例1および
比較例1で作製した分析スライドの展開層上にそれぞれ
点着し、37℃で3分および6分間インクベーション後
、中心波長640nmの可視光でPET支持体側から反
射測光により、分析スライドの発色光学濃度を測定した
。結果を第1表に示す。
血で得られた反射光学濃度の百分率である。
でも同様の反射光学濃度が得られたが、比較例1では全
血での発色が、血漿でのそれに比し著しく低下した。
表に示す種類の界面活性剤を添加し十分に撹拌した後に
、遠心分離(50GOrpm、10分)を行い、得られ
た上澄み液(血漿)の中心波長5フ5n―の可視光に対
する透過率を測定し、吸光度を求めた。同じ全血を凍結
により完全に溶血させた後同じ操作で得た血漿の、同じ
方法で測定した吸光度を100とした前記吸光度の相対
値を溶血度として、第2表に示した。
(総コレステロールの分解)下記組成の総コレステロ
ール定量用試薬溶液を調製した。
mlコレステロールエステラーゼ 4.O
uコレステロールオキシダーゼ 4.Ouペ
ルオキシダーゼ 10.Ou4−
アミノアンチピリン 2.OmMl、
7−シヒドロキシナフタレン 4.0 sN
ポリエチレンオキシドーモノー m−オクチルフェニルエーテル 20゜(オキ
シエチレン単位数10) リン酸ナトリウム緩衝液(pH’6.8> 67
mMこの試薬溶液3−に、総コレステロール濃度の異
なるコレステロール標準液20μlを加え、37℃、1
0分間の反応の検量線を作成した。
チルフェニルエーテル(オキシエチレン単位数10)の
代わりに、参考例1と同じ他の界面活性剤を用い、16
0mg7dlの総コレステロールを含むヒト血漿を試料
として同様の反応を行い、先に得られた検量線により総
コレステロール濃度を算出した。第3表に示す結果が得
られた。
ポリエチレンオキシド−モノ−p−オクチルフェニルエ
ーテル(オキシエチレン単位数40>では結合コレステ
ロールの充分な分解が行なわれないが、本発明のポリエ
チレンオキシド−モノーアルキルフェニルエーテルホル
マリン縮合物はオキシエチレン単位10のポリエチレン
オキシド−モノ−p−オクチルフェニルエーテルと同等
の結合コレステロール分解能力を示している。即ち、リ
ボプロティンとの結合破壊に十分な効果を有すると推定
される。
チレン単位10のポリエチレンオキシドーモノーアルキ
ルフ。
するが全血試料の溶血を起こし、他方オキシエチレン単
位数の大きいポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフ
ェニルエーテルは溶血を起こさないが結合コレステロー
ル分解能力が低い、これに対し、本発明によるポリエチ
レンオキシド−モノーアルキルフェニルエーテルホルマ
リン縮合物は、十分な結合コレステロール分解能力を示
し、しかも溶血を起こさない。
称 総コレステロール分析要素3、補正をする者 事件との関係 住 所
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)多孔性液体展開層を包含する少なくとも一つの水透
過性層を有し、前記水透過性層のうち少なくとも1層に
コレステロールエステル加水分解活性を有する酵素を含
む乾式分析要素であつて、前記酵素を含む層またはそれ
以外の水透過性層の少なくとも1層にポリエチレンオキ
シド−モノ−アルキルフェニルエーテルとホルムアルデ
ヒドの縮合物を含む分析要素。 2)ポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフェニルエ
ーテルとホルムアルデヒドの縮合物が、ポリオキシエチ
レン鎖のオキシエチレン単位の数が20未満である、ポ
リエチレンオキシド−モノ−アルキルフェニルエーテル
分子2ないし4個の、ホルムアルデヒド縮合物である特
許請求の範囲1)の分析要素。 3)縮合物が下記一般式で表される特許請求の範囲1)
の分析要素。 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中mは2から4までの整数、nは20未満の整数、
Rは炭素原子数4ないし12のアルキル基を表す。) 4)光透過性支持体の上に少なくとも1層の親水性ポリ
マーを含む層、多孔性試薬層、血液から血球成分を分離
するための層(血球分離層と称する)が、この順に一体
に積層されており、血球分離層の一部は多孔性血液展開
層であり、コレステロールエステラーゼ活性を有する少
なくとも1種の酵素、コレステロールオキシダーゼ、及
び過酸化水素の存在下に検出し得る光学的変化を生ずる
試薬組成物を含む、総コレステロール定量分析用の乾式
一体型多層分析要素であって、前記多孔性試薬層にコレ
ステロールエステラーゼ活性を有する少なくとも1種の
酵素、コレステロールオキシダーゼ、および過酸化水素
の存在下に検出し得る光学的変化を生ずる試薬組成物の
少なくとも一部のうちいずれか少なくとも1つを含み、
前記親水性ポリマーを含む層、多孔性試薬層、血球分離
層のうち少なくとも1つに、下記一般式で表される界面
活性化合物を含む分析要素。 ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中mは2から4までの整数、nは20未満の整数、
Rは炭素原子数4ないし12のアルキル基を表す。) 5)血球分離層の支持体から遠い部分が多孔性血液展開
層である特許請求の範囲4)の分析要素。 6)多孔性試薬層と血球分離層のうち少なくとも1つに
、前記一般式で表される界面活性化合物を含む特許請求
の範囲4)の分析要素。
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