JPH02181656A - 総コレステロール分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、血液中に含まれる総コレステロールを定量分
析するための乾式の一体型多層分析要素に関するもので
ある。

［従来技術とその欠点］ 血液中の総コレステロールは、結合型コレステロールと
遊離コレステロールから成る。遊離コレステロールは総
コレステロールの僅か２５％程度を占めるに過ぎず、結
合型コレステロールが総コレステロールの約７５％を占
める。結合型コレステロールはコレステロールエステル
と蛋白質（リボプロティン〉との錯体の形で存在する。

遊離コレステロールは、コレステロールオキシダーゼ等
を用いて酸化し、生成する過酸化水素またはコレステノ
ンを定量することにより定量できるが、結合型コレステ
ロールは分解して遊離コレステロールにしなければ分析
することができない。

コレステロールエステルと蛋白質の錯体（リボプロティ
ン）は、コレステロールエステルに対するコレステロー
ルエステラーゼの作用を阻害するので、エステラーゼを
作用させる前にこの錯体を分解させる必要がある。特開
昭５３−９６３７８号（米国特許４，２７５，１５１号
、同４，２７５，１５２号に対応）には、エチレングリ
コール単位が２０未溝のアルキルフェノキシポリエトキ
シエタノール（ポリエチレンオキシド−モノ−アルキル
フェニルエーテルの別名）を作用させることが提案され
ている。また米国特許３，９２５，１６４号でコレステ
ロールエステラーゼとともにポリエチレングリコールア
ルキルエーテルのような界面活性剤を用いることが知ら
れている。

一方、血液を試料とする臨床化学検査では、微量の液体
試料で精度の高い検査を行うことができることが望まし
い、従来溶液試薬を用いる湿式法が広く用いられている
が、迅速性に欠ける。乾式化学分析、すなわち実質的に
乾燥状態の分析要素、例えば試験片や多層分析要素中に
分析試薬系を導入した臨床分析法が、１９°７０年代か
ら知られている。乾式化学分析は湿式法による化学分析
（即ち溶液中の試薬を用いる方法）より、例えば使用上
の簡易性、経済上の節約及び分析の迅速さなどの点で優
れている。乾式多層分析要素は、微量の液体試料で精度
の高い検査を迅速に行うことができる分析手段として開
発され、例えば特公昭５３−２１６７７号、特開昭５５
−１６４３５８号、特開昭６０−２２２７６９号等で知
られている。乾式多層分析要素の一例を挙げれば、透明
支持体、試薬層、反射層、展開層から構成されている。

透明支持体（例えば下塗り処理を施した薄いプラスチッ
クフィルム）の上に塗布された試薬層には、液体試料中
に含まれる被検成分と反応し、その成分量に応じた光学
濃度に発色する試薬が含まれる０反射層は、試薬層に入
射した光が展開層に達するのを防ぎ、試薬層の光学測定
の際展開層に点着した液体試料の影響を受けないように
する役割を持つ、展開層は、点着された液体試料を均一
に、液の量にほぼ比例する面積に広げる。このような乾
式分析要素を用いて定量分析するには、液体試料、例え
ば全血を展開層の表面に一定量滴下する。展開層で展開
された血液は反射層を通って試薬層に達し、ここで試薬
と反応し、発色する。点着後、化学分析スライドを適当
な時間、一定温度に保って発色反応を充分に進行させた
後、透明支持体側から照明光を試薬層に照射し、特定波
長域で反射光量を測定して反射濃度を求め、予め求めて
おいた検量線に基づいて定量分析を行う。

従来、湿式法、乾式化学分析いずれにおいても、赤血球
を除去した血清または血漿を試料として分析が行なわれ
ることが多かった。しかし血液の他の成分から赤血球を
分離する操作には多くの労力と装置のコストを伴うので
、未希釈の全血で分析できることが望ましい。

全血を試料として乾式化学分析を行うには、分析要素中
で血清または血漿と血球成分とを分離しなければならな
い、このような要求を満足する、全血試料中の特定成分
の分析に有用な乾式分析要素が、特開昭６２−１３８７
５７号で提案された。この分析要素は、第１の非繊維質
多孔性層、第２の非繊維質多孔性層、繊維質多孔性層が
この順に一体に積層されており、前記３層の多孔性層が
それぞれ隣接する面の間で、液体の均一透過が実質的に
妨げられないような微少貫通部を形成するように部分的
に配置された接着剤により実質的に密着して接着されて
一体化されている、多層分析要素であり、発色等の光学
的変化を生ずる試薬組成物は前記３層の多孔性層のいず
れかに含まれ、被検出成分の存在下での発色等の光学的
変化は主として第１の非繊維質多孔性層で検出される。

この多層分析要素では、第２の非繊維質多孔性層と繊維
質多孔性層が協同的に働いて、血液から血球成分を分離
する。

この様に上部に血液から血球成分を分離するための血球
分離層を備えた多層分析要素では、しかし血球分離層内
での溶血が重大な問題となる。即ち、溶血により赤血球
内部から放出されるヘモグロビン等のために、特定波長
域での反射光量の測定が妨害される。また溶血は血清ま
たは血漿中の総コレステロールの濃度を変化させる。酵
素反応や試薬組成物の発色反応が阻害されることもある
。

こめように分析要素中のく特に血球分離層）で溶血が起
こることは、総コレステロール分析の測定精度を下げる
原因になる。

前述のポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフェニル
エーテル（アルキルフェノキシポリエトキシエタノール
）はコレステロールの加水分解を行うには有用であるが
、それ自身溶血性〈溶血させる性質）が大きい、しかも
比救的低分子であるために、組み込んだ層以外への拡散
性が大きい、それ故、血球分離層を備えた乾式分析要素
中にこの物質を組み込むと、分析要素中で溶血が起こっ
てしまい、その結果正確な総コレステロールの濃度分析
が行えないという欠点がある。

この問題を解決するためにポリエチレンオキシド−モノ
−アルキルフェニルエーテルのオキシエチレン単位を大
きくする（ｐＡえば４０以上に〉ことを試みた。しかし
このようなポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフェ
ニルエーテルを用いた場合、溶血性は低下するが、一方
で本来の役目である結合コレステロールの分解への効果
が減少してしまい、やはり正確な総コレステロールの濃
度分析は行えなかった。

分析要素中で溶血が起こらず、かつ結合コレステロール
が遊離コレステロールに充分分解されるような、優れた
総コレステロール定量分析用の乾式一体型多層分析要素
が望まれていた。

［本発明が解決しようとする技術的課題］本発明におい
て解決すべき技術的課題は、上述の技術的要求を満たす
分析要素を提供することである。即ち、分析要素中で溶
血が起こらず、かつ結合コレステロールが遊離コレステ
ロールに充分分解されるような、優れた総コレステロー
ル定量分析用の乾式一体型多層分析要素を提供すること
である。

［技術的課題を解決するための手段］ 前述の技術的課題は、多孔性液体展ｒｆＰＩ層を包含す
る少なくとも一つの水透過性層を有し、前記水透過性層
のうち少なくとも１層にコレステロールエステル加水分
解活性を有する酵素を含む乾式分析要素であって、前記
酵素を含む層またはそれ以外の水透過性層の少なくとも
１層にポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフェニル
エーテルとホルムアルデヒドの縮合物を含む分析要素に
よって解決された。

コレステロールエステル加水分解活性を有する酵素を含
む層と上記化合物を含む層とは、異なってもよいが、同
一の層であることが好ましい。

ポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフェニルエーテ
ルとホルムアルデヒドの縮合物は、ポリオキシエチレン
鎖のオキシエチレン単位の数が２０未満である、ポリエ
チレンオキシド−モノ−アルキルフェニルエーテル分子
２ないし４個の、ホルムアルデヒド縮合物であることが
好ましい、好ましい縮合物は、下記一般式［１１で表さ
れる。

［Ｉ］ 式中−は２から４までの整数、ｎは２０未満の整数、Ｒ
は炭素原子数４ないし１２のアルキル基を表す、Ｒは炭
素原子数８または９の直鎖または分岐アルキル基である
ことが好ましい。

本発明の上記課題はまた、光透過性支持体の上に少なく
とも１層の親水性ポリマーを含む層、多孔性試薬層、血
液から血球成分を分離するための層（血球分離層と称す
る）および血球分離層の一部を構成する多孔性血液展開
層が、この順に一体に積層されており、コレステロール
エステラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素、コレ
ステロールオキシダーゼ、及び過酸化水素の存在下に検
出し得る光学的変化を生ずる試薬組成物を含む総コレス
テロール定量分析用の乾式一体型多層分析要素であって
、前記多孔性試薬層にコレステロールエステラーゼ活性
を有する少なくとも１種の酵素、コレステロールオキシ
ダーゼ、および過酸化水素の存在下に検出し得る光学的
変化を生ずる試薬組成物の少なくとも一部のうちのいず
れか少なくとも１つを含み、前記親水性ポリマーを含む
層、多孔性試薬層、血液から血球成分を分離するための
層のうち少なくとも１つに、前記一般式で表される界面
活性化合物を含む分析要素によって、好ましく解決され
た。

［発明の具体的構成の詳細］ 本発明の分析要素は少なくとも一つの水透過性層を有し
、そのうち少なくとも１層は多孔性血液展開層である。

本発明の分析要素は、前記水透過性層のうち少なくとも
１層にコレステロールエステル加水分解活性を有する酵
素を含む０本発明の分析要素は、コレステロールエステ
ル加水分解活性を有する酵素を含む層またはそれ以外の
水浸透性層に、ポリエチレンオキシド−モノ−アルキル
フェニルエーテルとホルムアルデヒドの縮合物を含むこ
とを、特徴とする。

本発明の分析要素は光透過性支持体を有してもよい、光
透過性支持体は水浸透性であってもよいが、水不浸透性
であることが実用上好ましい。

本発明の分析要素は光透過性支持体の上に、それぞれ少
なくとも１層の、多孔性試薬層および血液から血球成分
を分離するための層（以下、血球分離層と称す）を有す
ることが好ましい、この構成において光透過性水不浸透
性支持体と多孔性試薬層の間には、少なくとも１層の親
水性ポリマーを含む層を有することが好ましい。

血球分離層のうち支持体と反対の表面に近い部分が、血
液展開層として作用する層であるか、血液展開作用をし
てもよく、それが好ましい。

本発明において、光透過性水不浸透性支持体の上に、親
水性ポリマーから成る層、多孔性試薬層、血球分離層が
この順に一体に積層されており、血球分離層の支持体と
反対の表面に近い部分が血液展開層としての作用をする
層である多層分析要素が、特に好ましい。

多孔性試薬層は血漿または血清の展開層としての作用を
してもよい、この場合の展開とは、血液展開層および／
まなは血球分離層での血液の展開領域よりも広い領域に
、血漿または血清をほぼ一様に展開することを言う。

本発明の分析要素は水浸透性層に、コレステロールエス
テラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素（以下ＣＨ
Ｅと略記する）、コレステロールオキシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ、及び過酸化水素の存在下に発色等の検出し
得る光学的変化を生ずる試薬組成物を含む、これら全て
を多孔性試薬層に含んでもよいし、その一部を多孔性試
薬層以外の水浸透性層に含んでもよい０例えば、Ｃ）（
Ｅとコレステロールオキシダーゼを多孔性試薬層に含み
、ペルオキシダーゼと過酸化水素検出試薬組成物を親水
性ポリマーから成る層に含んでもよい、上記諸成分の一
部、例えばＣＨＥを、血球分離層に含んでもよい。

コレステロールエステルからｉ！ｌ！Ｍコレステロール
を得るために用いるコレステロールエステラーゼ活性を
有する酵素としでは、例えば米国特許３９２５１６４号
、同４，２７５，１５１号等に製法が記載されたコレス
テロールエステラーゼをはじめ、市販のコレステロール
エステラーゼを選択して用いることができる。コレステ
ロールエステラーゼは動物臓器起源のものでも、微生物
起源のものでもよい。

特公昭５６−１９２４０号に記載されたように、コレス
テロールエステラーゼとともにリボプロティンリパーゼ
を併用してもよい。

遊離コレステロールの定量には、コレステロールオキシ
ダーゼを用いて酸化し、生成する過酸化水素を定量する
方法を用いることができる。コレステロールオキシダー
ゼとしては、例えば特開昭４９−４７５８２号２特公昭
５７−２８５５２号、同５７−４４３１８号等に製法が
記載されたものを、用いることができる。

過酸化水素を定量する方法は種々のものが良く知られて
おり、当業者はそれらの中から選択して採用することが
できる０例えば ｉ）ペルオキシダーゼと米国特許３，９８３，００５号
に記載された４−アミノアンチピリンとナフトール類の
組み合わせ、 ｉ）特開昭５７−１４２，５６２号に記載された、ペル
オキシダーゼ、水素供与体、Ｎ、Ｎ−ジ置換アニリンの
組み合わせ、 ｉｉｉ　）ロイコ色素の酸化により染料を生成する系、
例えば、ペルオキシダーゼと米国特許４，０８９，７４
７号、特開昭５９−１９３３５２号等に記載されたイミ
ダゾールロイコ色素との組み合わせ、 等が有用である。

コレステノンを検出するには、ヒドラジン類、例えばヒ
ドラジン、２．４−ジニトロヒドラジン等を試薬として
用いることができる。

遊離コレステロールの定量にはまた、ＮＡＤ（またはＮ
ＡＤＰ）依存コレステロールデヒドロゲナーゼを用いて
、生成するコレステノン又はＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰ
Ｈ）を定量する方法を用いることもできる。

多孔性試薬層としては、ろ紙、不織布のような繊維質多
孔性層を用いてもよいが、非繊維多孔性層を用いること
もできる。特公昭５３−２１６７７号、米国特許１．４
２１．３４１号等に記載されたセルロースエステル類、
例えば、セルロースアセテート、セルロースアセテート
／ブチレート、硝酸セルロースからなるプラッシュ・ポ
リマーの層が好ましい、６−ナイロン、６．６−ナイロ
ン等のポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン等の
微多孔性膜でもよい、特開昭６２−２７００６号に記載
されたポリスルホンから成る微孔性膜でもよい。

その他、特公昭５３−２１８７７号、特開昭５５−９０
８５９号等に記載された、ポリマー小粒子、ガラス粒子
、けい藻土等が親水性または非吸水性ポリマーで結合さ
れた連続空隙をもつ多孔性層、特開昭５７−１０１．７
８０号、同５７−１０１．７６１号に記載されたポリマ
ー粒子構造物も利用できる。

相分離法により作られたいわゆるプラッシュ・ポリマー
から成るメンブランフィルタ−では、厚さ方向の液体通
過経路は膜の製造の際の自由表面側〈即ち光沢面）で最
も狭くなっており、本発明の分析要素の試薬層にこの種
の膜を用いる場合には、層の支持体に近い側にメンブラ
ンフィルタ−の光沢面を向けることが好ましい。

親水性ポリマーを結合剤とし試薬組成物を含む均一層を
塗布した後、試薬組成物を含まない非繊維多孔性層を特
開昭５５−１６４３５６号のような方法で接着させるこ
とによって、試薬組成物を第１の非繊維多孔性層に実質
的に含有させることができる。

試薬組成物には必要に応じ、活性化剤、緩衝剤、硬膜剤
、界面活性剤等を含有させることができる０本発明の分
析要素の試薬層に含有させることができる緩衝剤の例と
しては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩やＢｉｏｃｈｅｓｉ
ｓｔｒｙ誌　第５巻　第２号、４６７ページより４７７
ページ（１９６６年）に記載されているグツド（Ｃｏｏ
ｄ　）の緩衝剤などを挙げることができる。これらの緩
衝剤はｒ蛋白質・酵素の基礎実験法Ｊ（堀尾武−ほか著
、南江堂、１９８１年）、前記Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ誌第５巻等を参考にして選択することができる。

遊離コレステロールとの反応により中間体を生成する組
成物を試薬層に、中間体と反応して染料等を生成し得る
組成物（指示薬）を試薬層と支持体との間にある第２の
試薬層に含んでもよい、この場合第２の試薬層は、多孔
質であってもよいが、親水性ポリマーを結合剤とする実
質的に均一な層であることが好ましい、親水性ポリマー
として例えばゼラチンおよびその誘導体く例えばフタル
化ゼラチン）、セルロース誘導体（例えばヒドロキシプ
ロピルセルロース）、アガロース、アクリルアミド重合
体、メタアクリルアミド重合体、アクリルアミドまたは
メタアクリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重合
体等が利用できる。第１の試薬層と第２の試薬層の間に
妨害物除去層（例えばＲｅ５ｅａｒｃｈＤｉｓｃｌｏｓ
ｕｒｅ、Ｎｏ、１２６２６（１９〕４）、ｐ、５１　ｔ
ｏ　５８に記載されたような）を設けてもよい。

血液展開層は、試料血液に対して液体計量作用を有する
層であることが好ましい、液体計量作用とは、その表面
に点着供給された液体試料を、その中に含有している成
分を実質的に偏在させることなく、面方向に単位面積当
りほぼ一定量の割合で広げる作用である。

展開層を構成する繊維質多孔性材料としては、Ｖ紙、不
織布、織物生地（例えば平織生地）、編物生地（例えば
トリコット編）、ガラス繊維ｒ紙等を用いることができ
る。これらのうち織物、編物が好ましい、織物等は特開
昭５７−８６３５９号に記載されたようなグロー放電処
理をしてもよい、展開層には、展開面積、展開速度等を
調節するため、特開昭６０−２２２７７０号、特願昭６
１−１２２８７５号、同６１−１２２８７６号、同６１
−１４３７５４号に記載したような親水性高分子あるい
は界面活性剤を含有してもよい、展開層はまた、特公昭
５３−２１６フフ号の記載のような非繊維展開層でもよ
い。

本発明で用いるポリエチレンオキシドーモノーアルキル
フ。

ニルエーテルのホルムアルデヒド縮合物は、公知の方法
で合成することができる０例えば米国特許２，５４１，
９９１号に記載された方法で合成できる。即ち、アルキ
ルフェノールとホルムアルデヒドとの縮合物を、アルキ
レンオキシドと反応させてオキシアルキル化することに
より、合成できる。また特公昭３８−２３，３４７号に
記載された方法を利用することもできる。

［実施例１コ １−１．ロ　コ　　　　　の− ユ不ユ魚１１液 下記組成Ａのロイコ色素溶液を調製した。

Ａ： ２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）
−４−（４−（ジメチルアミノ）フェニルツー５−フェ
ネチルイミダゾール　酢酸塩　　　　５．７ｇ２−（４
−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４−（
４−（ジメチルアミノ）フェニルツー５−フェネチルイ
ミダゾール　塩酸塩　　　　０．８９Ｎ、Ｎ−ジエチル
ラウリルアミド　　　　　　　　１０４ｇだうｊｚ」１
１ 下記組成りのゼラチン溶液を作成した。

Ｂ： アルカリ処理ゼラチン　　　　　　　　　３００　。

水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９
００　。

ビス〔（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミノコメタン　　　　　　　３．Ｏｆ１
化１０区１ Ｂ液をＴＫオートホモミキサー（特殊機械工業社製乳化
器）で約５７００回転／分でかくはんしながらＡ液を添
加し、約３０分間分散して、乳化物を調製した。

１−２．北負区墓ｍ奮 上記乳化物を、ゼラチン下塗りされている厚さ１８０μ
ｌの透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィル
ム（支持体）の上に１餉２当たり１５０ｇの割合で塗布
し、乾燥させ、発色試薬層とした。

１−３．［の 上記発色試薬層の表面を約２５℃の水で一様に湿らせ（
約３０ｇ／１１２の割合）、有効孔径１．２μ鴎、厚さ
１４０μｍ、空隙率約８０％のセルロースアセテートメ
ンブレンフィルター（富士写真フィルム（株）製ミクロ
フィルターＦＭ３００）を重ね合わせ、乾燥させて、発
色試薬層にメンブレンフィルターを接着させた。

次にこのメンブレンフィルターの上から、別に調製して
おいな下記組成物［１］を１ｍ２当たり１１０ｍ１の割
合で塗布し、乾燥させて、第１多孔質層とした。

［１］ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１２２３゜コレステロールエステラーゼ　　　　　　　
１．７ｇコレステロールオキシダーゼ　　　　　　　１
０．１８ｇリボプロティンリパーゼ　　　　　　　　　
　１．９４゜ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　
　８．８６゜フェロシアン化カリウム　　　　　　　　
　　５．６ｇ一般式［１］の化合物　　　　　　　　　
　４．６ｇ（ただしＲ＝ｐ−ノニル、ｎ＝１０゜ ｍ＝２およびｍ＝３の混合物） １−４．の 第２多孔質層とするための有効孔径３μ輪、厚さ１４０
μ転空隙率約８０％のセルロースアセテートメンブレン
フィルター（富士写真フィルム（株）製ミクロフィルタ
ーＦＭ３００）と、試料展開層とするための、５０デニ
ール相当のＰＥＴ紡績糸を３６ゲージ編みしたトリコッ
ト編物布地（厚さ約２５０μ酌を、それぞれ一般式［１
］の化合物（ただしＲで示される置換基がｐ−ノニル基
、ｎ；１０、ｍ＝２およびｍ＝３の混合物）の２重量％
水溶液に浸漬し、空隙に液を満たした後取り出して、乾
燥させた。

１−５．　２ 次に含浸処理済みのトリコット編物生地の温度８０℃に
予熱した表面に、温度１３０℃に加熱熔融したホットメ
ルト型接着剤を、グラビア印刷法を利用して、グラビア
ローラーからの転写により点状に付着させた。グラビア
ローラーのドツト中心間隔０．９ｍ転ドツト面積率は約
２０％、付着した固形成分量（単位面積当たり）は約３
ｇ／ｍ”であった。

高温の接着剤が付着した布地（展開層となる）の表面に
、直ちに含浸処理済みの前記メンブレンフィルター（第
２多孔質層となる）の非光沢面を向かい合わせ、両者を
ラミネートローラーの間を通してラミネート（接着一体
止）した。

この重層物（展開層および第２多孔質層）を上記と同じ
点状接着法により前記第１多孔質層の面上に接着し、一
体止させた。すなわち上記重層物のメンブレンフィルタ
ー面に、加熱したホットメルト型接着剤を、グラビア印
刷法を利用してグラビアローラーからの転写により点状
に付着させた後、直ちに前記第１多孔質層（支持体およ
び発色試薬層の上にある）の面と向かい合わせ、両者を
ラミネートローラーの間を通し、ラミネート（接着一体
止〉した。

こうして完成した総コレステロール活性測定用分析フィ
ルムは、支持体、発色試薬層、第１多孔質層、第２多孔
質贋、布展開層の順に一体に積層されている。布展開層
と第２多孔質層とは協同して、血球ろ重層として作用す
る。第１多孔質層は、コレステロールの存在下に第２鉄
イオンを生成する反応層として作用する０発色試薬層は
、コレステロールの存在下に第１多孔質層で生成した第
２鉄イオンにより色素を形成し、色素は透明支持体を通
して光学的に検出される。

■−６０分近メｊΔ」籏刀１飢 得られた総コレステロール定量分析用分析フィルムを一
辺１５■ｌの正方形チップに裁断し、特開昭５８−３２
３５０号に記載のスライド枠に収めて総コレステロール
定量用生化学分析スライドを完成した。

［比較例１］ 実施例１の一般式［Ｉ］の化合物の代わりに、ポリエチ
レンオキシド−モノ−ｐ−オクチルフェニルエーテル（
オキシエチレン単位線台数１０）を用いた他は、実施例
１と同様の手順で、総コレステロール定量用生化学分析
スライドを完成した。

［測定例１］ 分析スライドの全血中総コレステロールによる発色を、
下記のようにして評価した。

総コレステロール１６０ｉｙ／ｄｆを含むヒト血漿と、
同じ総コレステロール含有量でヘマトクリット値４０％
のヒト全血試料を用意し、各１０μｌを実施例１および
比較例１で作製した分析スライドの展開層上にそれぞれ
点着し、３７℃で３分および６分間インクベーション後
、中心波長６４０ｎｍの可視光でＰＥＴ支持体側から反
射測光により、分析スライドの発色光学濃度を測定した
。結果を第１表に示す。

表中の数値は、血漿で得られた反射光学濃度に対する全
血で得られた反射光学濃度の百分率である。

第１表 第２表 第１表から明らかなように、実施例１では血漿でも全血
でも同様の反射光学濃度が得られたが、比較例１では全
血での発色が、血漿でのそれに比し著しく低下した。

［参考例１］　　（溶血に間する試験）ヒト全血に第２
表に示す種類の界面活性剤を添加し十分に撹拌した後に
、遠心分離（５０ＧＯｒｐｍ、１０分）を行い、得られ
た上澄み液（血漿）の中心波長５フ５ｎ―の可視光に対
する透過率を測定し、吸光度を求めた。同じ全血を凍結
により完全に溶血させた後同じ操作で得た血漿の、同じ
方法で測定した吸光度を１００とした前記吸光度の相対
値を溶血度として、第２表に示した。

（ｎは分子中オキシエチレン単位の数）［参考例２］　
　（総コレステロールの分解）下記組成の総コレステロ
ール定量用試薬溶液を調製した。

水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００
　ｍｌコレステロールエステラーゼ　　　　　　４．Ｏ
ｕコレステロールオキシダーゼ　　　　　　４．Ｏｕペ
ルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　１０．Ｏｕ４−
アミノアンチピリン　　　　　　　　　２．ＯｍＭｌ、
７−シヒドロキシナフタレン　　　　　　４．０　ｓＮ
ポリエチレンオキシドーモノー ｍ−オクチルフェニルエーテル　　　　　２０゜（オキ
シエチレン単位数１０） リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ’６．８＞　　　　６７
　ｍＭこの試薬溶液３−に、総コレステロール濃度の異
なるコレステロール標準液２０μｌを加え、３７℃、１
０分間の反応の検量線を作成した。

上記組成のうちポリエチレンオキシド−モノ−ｐ−オク
チルフェニルエーテル（オキシエチレン単位数１０）の
代わりに、参考例１と同じ他の界面活性剤を用い、１６
０ｍｇ７ｄｌの総コレステロールを含むヒト血漿を試料
として同様の反応を行い、先に得られた検量線により総
コレステロール濃度を算出した。第３表に示す結果が得
られた。

（次ページに続く） 第３表 第３表から明らかなように、オキシエチレン単位の多い
ポリエチレンオキシド−モノ−ｐ−オクチルフェニルエ
ーテル（オキシエチレン単位数４０＞では結合コレステ
ロールの充分な分解が行なわれないが、本発明のポリエ
チレンオキシド−モノーアルキルフェニルエーテルホル
マリン縮合物はオキシエチレン単位１０のポリエチレン
オキシド−モノ−ｐ−オクチルフェニルエーテルと同等
の結合コレステロール分解能力を示している。即ち、リ
ボプロティンとの結合破壊に十分な効果を有すると推定
される。

なお、参考例１および２の結果を総合すると、オキシエ
チレン単位１０のポリエチレンオキシドーモノーアルキ
ルフ。

ニルエーテルは十分な結合コレステロール分解能力を有
するが全血試料の溶血を起こし、他方オキシエチレン単
位数の大きいポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフ
ェニルエーテルは溶血を起こさないが結合コレステロー
ル分解能力が低い、これに対し、本発明によるポリエチ
レンオキシド−モノーアルキルフェニルエーテルホルマ
リン縮合物は、十分な結合コレステロール分解能力を示
し、しかも溶血を起こさない。

手続補正書く自発） １、事件の表示　　特願昭６４−１０７０２、発明の名
称　　総コレステロール分析要素３、補正をする者 事件との関係 住　　　　所

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）多孔性液体展開層を包含する少なくとも一つの水透
   過性層を有し、前記水透過性層のうち少なくとも１層に
   コレステロールエステル加水分解活性を有する酵素を含
   む乾式分析要素であつて、前記酵素を含む層またはそれ
   以外の水透過性層の少なくとも１層にポリエチレンオキ
   シド−モノ−アルキルフェニルエーテルとホルムアルデ
   ヒドの縮合物を含む分析要素。 ２）ポリエチレンオキシド−モノ−アルキルフェニルエ
   ーテルとホルムアルデヒドの縮合物が、ポリオキシエチ
   レン鎖のオキシエチレン単位の数が２０未満である、ポ
   リエチレンオキシド−モノ−アルキルフェニルエーテル
   分子２ないし４個の、ホルムアルデヒド縮合物である特
   許請求の範囲１）の分析要素。 ３）縮合物が下記一般式で表される特許請求の範囲１）
   の分析要素。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ｍは２から４までの整数、ｎは２０未満の整数、
   Ｒは炭素原子数４ないし１２のアルキル基を表す。） ４）光透過性支持体の上に少なくとも１層の親水性ポリ
   マーを含む層、多孔性試薬層、血液から血球成分を分離
   するための層（血球分離層と称する）が、この順に一体
   に積層されており、血球分離層の一部は多孔性血液展開
   層であり、コレステロールエステラーゼ活性を有する少
   なくとも１種の酵素、コレステロールオキシダーゼ、及
   び過酸化水素の存在下に検出し得る光学的変化を生ずる
   試薬組成物を含む、総コレステロール定量分析用の乾式
   一体型多層分析要素であって、前記多孔性試薬層にコレ
   ステロールエステラーゼ活性を有する少なくとも１種の
   酵素、コレステロールオキシダーゼ、および過酸化水素
   の存在下に検出し得る光学的変化を生ずる試薬組成物の
   少なくとも一部のうちいずれか少なくとも１つを含み、
   前記親水性ポリマーを含む層、多孔性試薬層、血球分離
   層のうち少なくとも１つに、下記一般式で表される界面
   活性化合物を含む分析要素。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ｍは２から４までの整数、ｎは２０未満の整数、
   Ｒは炭素原子数４ないし１２のアルキル基を表す。） ５）血球分離層の支持体から遠い部分が多孔性血液展開
   層である特許請求の範囲４）の分析要素。 ６）多孔性試薬層と血球分離層のうち少なくとも１つに
   、前記一般式で表される界面活性化合物を含む特許請求
   の範囲４）の分析要素。