JPH0357423B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はフローサイトメトリーを応用した血液
の光学的測定技術において使用するに好適な赤血
球特に網状赤血球、血小板などの血球測定用試薬
に関する。

従来の技術 従来の技術としては、例えば、1982年６月22日
発行の米国特許第4336029号明細書に示されてい
るように、アクリジンオレンジを蛍光染料として
用いて全血液試料を染色しレーザ光による散乱光
強度及び赤色蛍光強度信号をフローサイトメトリ
ー装置によつて検出処理し、赤血球と血小板を弁
別すると共に赤血球群から網状赤血球を弁別する
ものがある。

上記フローサイトメトリー装置では、第２図に
示すように、アクリジンオレンジ蛍光染料を含む
染色液で染色された全血液試料がシース状のフロ
ーチヤンネル３内を流れ、光学的刺激域を大体１
個ずつ通過する血球に対してレンズ２で集光した
レーザ光源１からの光を照射している。血球の通
過毎に発生する散乱光は光検出器Ａ５及び増幅器
１１を経て解析装置１２に入力される。また、血
球の通過毎に発生する赤色領域の蛍光はコンデン
サーレンズ４で集光されアパーチヤープレート
６、ダイクロイツクミラー７、フイルター８を経
て光検出器Ｂ９により検出され、増幅された後解
析装置１２に入力され、解析に必要な波長成分の
みの強度信号が測定されるのである。

測定された散乱光強度信号と赤色蛍光強度信号
とは第７図に示すような分布図にプロツトされ、
統計的処理により血小板群による信号を除去した
かたちで赤血球と網状赤血球とが弁別される。

発明が解決しようとする問題点 正常人の赤血球は中央部が陥凹した円盤状
（Discocyte）の形態をもち、このためフローサ
イトメトリー装置の光学的刺激域における進入ま
たは通過の角度によつて散乱光強度が変動するこ
とが避けられない。すなわち、散乱光強度信号の
スペクトラムを描いた第６図に示すように、赤血
球と血小板とは相互に明確に区別できない信号領
域を共有しており、散乱光強度のみの情報では両
者の弁別は不可能である。そこで、散乱光と蛍光
の２つのパラメータを用いて弁別するのである
が、蛍光強度信号についても先ず第３図に見るよ
うに、通常の赤血球群と血小板及び網状赤血球群
とは交差しており、各群の弁別は不可能である。
このことは、散乱光強度信号によつて統計的に血
小板群を除去した蛍光強度スペクトラムについて
も、第４図に示すごとく相互の交差は殆んど変ら
ないので、蛍光強度のみによつて赤血球と網状赤
血球とを正確に弁別することはできない。

網状赤血球は、赤血球そのものの産生能力や貧
血を判断するための指標となるもので、その正確
な測定は医学的に重要なフアクタを与えるもので
あるが、上述の如く従来のフローサイトメトリー
技術においては散乱光と蛍光の両パラメータを用
いても誤差が無視し難いものであつた。そこで、
血球の通過角度の変化によつて散乱光強度に変動
が生ずることを予め防止するため、ラウリル硫酸
ナトリウム塩などアニオン系界面活性剤を用いて
赤血球を球状化する試みがなされた。

しかしながら、フローサイトメトリー装置によ
つて網状赤血球群を測定する場合、通常の赤血球
群との蛍光強度差を観測するためにアクリジンオ
レンジ、ピロニンＧなどの塩基性蛍光色素を含む
染色液で血液細胞全体を染色する必要がある。塩
基性蛍光色素を含む染色液にアニオン系界面活性
剤を添加した場合、この活性剤は色素及び血球に
作用して、染色液中及び一旦は染色された血球中
での色素の析出をひき起こすだけでなく、血球そ
のものの染色を抑止する状態をひき起こし、この
ため従来の染色液によつては、染色された赤血球
群、網状赤血球群を明確に染色しそれぞれの正確
な測定を可能にすることができなかつた。

問題点を解決するための手段 本発明は、上記の問題点を解決し、全血液試料
中のすべての血球細胞すなわち、網状赤血球群、
赤血球群、白血球群、血小板群のそれぞれの細胞
容積と染色感度を正確に反映しかつ染色と光散乱
に寄与する細胞容積を維持しながらフローサイト
メトリー装置を用いてこれらすべての血液細胞群
についてその種類別の正確な測定を可能ならしめ
るものである。そのために本発明は、赤血球を球
状化するための球状化剤としてカチオン性または
非イオン性界面活性剤と、球状化した血球の形態
を保持させるための固定剤と、血球を染色するた
めの塩基性蛍光色素と、溶液全体を等張にするた
めの緩衝剤とを含有する水溶液から成る血球測定
用試薬を提供する。

上記球状化剤のうちカチオン性界面活性剤とし
ては一般式 で表わされるものが用いられる。ここに、R₁は
炭素数10〜16のアルキル基、R₂、R₃、R₄は−Ｈ、
−CH₃、−C₂H₅などの低級アルキル基、Ｘは塩
素、臭素などのハロゲンであつてよい。また、非
イオン性界面活性剤としては一般式 R₁〔−OCH₂CH₂〕−_oOH で表わされるもの（ここに、R₁は炭素数８〜18
のアルキル基、ｎは８〜18）または一般式 で表わされるもの（ここに、R₂は炭素数８〜12
のアルキル基、ｎは８〜18）が用いられる。

固定剤は、球状化剤による赤血球の最終的な溶
血を防止するものとしてグルタルアルデヒド、ホ
ルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどが用
いられ、その用量は上記球状化剤による血球の球
状化を阻害せず形状保持に適した量すなわち、試
薬１リツトル中に0.3〜３グラムが好適である。

網状赤血球を含む赤血球を蛍光染色するための
色素としてフラボホスフイン−Ｒ、コリホスフイ
ン−Ｏ、４（−4′ジエチルアミノスチリル）−Ｎ−メ
チルピリジニウムアイオダイド、アクリジンオレ
ンジ、ピロニンＧなどの塩基性蛍光色素を用い
る。

さらに、球状化した血球を安定化するために塩
化ナトリウム等のアルカリ金属塩を添加して染色
液試薬の浸透圧を等張とする。これと共にすべて
の血液細胞を効率よく染色するために緩衝剤とし
て水酸化ナトリウム等を添加し、溶液のPHを６〜
11に保たせる。

上述した組成分を含有する等張緩衝塩基性染料
溶液は抗凝固性全血液試料と混合するための血球
測定用試薬となる。

作 用 以上の構成による血球測定用試薬を抗凝固性全
血液試料に混合すると、その組成中のカチオン性
界面活性剤または非イオン性界面活性剤は赤血球
及び網状赤血球を効率よく球状化し、塩基性蛍光
色素の血球に対する染色作用を殆んど阻害するこ
とがない。

また、アルデヒドを中心とする固定剤は、血球
の球状化を阻害しない適量を用いれば、球状化剤
の血球に対する溶血作用を防いで、球状化した血
球の形態を長期間安定に保つはたらきをする。こ
うした球状化剤の使用により、赤血球は完全に球
状化し、フローサイトメトリー装置内の光学的刺
激域への進入角度または通過時の光束との対向面
の差に依存した散乱光の強度変化は解消する。す
なわち、光検出器で受光される個々の血球からの
散乱光強度は、個々の血球の大きさ（容積）を正
確に反映するものとなり、血小板と赤血球との散
乱光強度の分布は、両者のピークが比較的接近し
ているだけでなく赤血球のピークが不明瞭にしか
表われないため明確に分離し難かつた従来の場合
（第６図参照）に比し、第５図に見るごとく極め
て分離することができ、赤血球群と血小板群とは
本発明試薬により事実上散乱光強度のみによつて
弁別することも可能である。さらにまた、本発明
による試薬を使用した場合の赤血球群の弁別域
は、第１図に見るごとく、球状に縮小して網状赤
血球群の弁別域と通常の赤血球群との弁別域との
間も明確に区別しやすくなつている点で、従来の
第７図に示す全体的に散開し弁別がしにくい状況
と比べて、顕著な差異をなすことが理解される筈
である。

実施例 (1) ミリスチルトリメチルアンモニウムプロミド
５mgｒ、グルタルアルデヒド１ｇｒ、フラボホ
スフイン−R30mgｒ、リン酸１ｇｒを水１リツ
トルに溶解し水酸化ナトリウム溶液を添加して
PH8.0に調整しさらに塩化ナトリウムを添加し
浸透圧を280±10mOsm／Kgに調整して血球測
定用試薬を調製した。

上記試薬500に対し抗凝固性全血液試料１の
比率で混合して血球の球状化及び蛍光染色を完
全かつ短時間で行うことができた。

(2) ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロラ
イド7.5mgｒ、グルタルアルデヒド0.3ｇｒ、ア
クリジンオレンジ10mgｒ、リン酸１ｇｒを水１
リツトルに溶解し水酸化ナトリウムでPH7.0に
調整すると共に塩化ナトリウムで280±
10mOsm／Kgの浸透圧に調整して試薬とした。

(3) ミリスチルトリメチルアンモニウムプロミド
３mgｒ、ホルムアルデヒド２ｇｒ、４（−4′ジエ
チルアミノスチリル）−Ｎ−メチルピリジニウム
アイオダイド10mgｒ、リン酸１ｇｒを水１リツ
トルに溶解し水酸化ナトリウムでPH8.5に調整
すると共に塩化ナトリウムを添加し浸透圧を
280±10mOsm／Kgの試薬を調整した。

(4) ポリオキシエチレンノニルフエノールエーテ
ル（ノニオンNS−210、日本油脂製）30mgｒ、
ホルムアルデヒド３ｇｒ、４（−ジメチルアミノ
スチリル）−Ｎ−メチルピリジニウムアイオダイ
ド30mgｒ、リン酸１ｇｒを水１リツトルに溶解
し水酸化ナトリウムでPH10.0に調整すると共に
塩化ナトリウムを添加して浸透圧280±
10mOsm／Kgの試薬を調製した。

(5) （Triton−X100）30mgｒ、グルタルアルデ
ヒド0.3ｇｒ、フラボホスフイン−R40mgｒ、
リン酸１ｇｒを水１リツトルに溶解し水酸化ナ
トリウムを添加してPH8.5に調整すると共に塩
化ナトリウムを添加して浸透圧280±
10mOsm／Kgの試薬を調製した。

発明の効果 以上のような構成によれば、本発明試薬をフロ
ーサイトメトリー装置に流す血液サンプルに使用
すると、先ず赤血球群と血小板との弁別が散乱光
強度のみによつて極めて明確に実行できる（第５
図参照）ので、これらの個別計数が散乱光フアク
ターのみで可能となつた。また、カチオン性界面
活性剤、非イオン性界面活性剤が球状化剤として
用いられるため塩基性蛍光色素の血球に対する染
色が完全に効率よく行われ、こうした良好な染色
状態で網状赤血球も球状化する結果、通常の赤血
球との峻別も正確かつ簡略な解析を通じてなし得
ることとなり、血液検査による診断等の精度の格
段の向上を実現し得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明試薬を使用してフローサイトメ
トリー装置により測定した散乱光強度−蛍光強度
分布図、第２図はフローサイトメトリー装置の基
本構成図、第３図は染色された血球の蛍光強度分
布図で血小板を分離する前のもの、第４図は第３
図と同様の分布図であるが血小板を分離後のも
の、第５図は本発明試薬を使用して散乱光強度分
布を描いた図であつて赤血球群の示す散乱光強度
が鋭いピークをなすため血小板群との峻別が可能
となることを示し、第６図は従来の試薬による散
乱光強度分布図であつて第５図と比較すると両者
の差異が明らかなことを示し、第７図は従来の試
薬による散乱光強度−蛍光強度分布図を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ カチオン性または非イオン性界面活性剤から
   なる球状化剤と、固定剤と、塩基性蛍光色素とを
   含有する水溶液から成ることを特徴とする血球測
   定用試薬。 ２ 前記球状化剤が一般式 （ただし、R₁：炭素数10〜16のアルキル基、R₂、
   R₃、R₄：−Ｈあるいは−CH₃、−C₂H₅等の低級
   アルキル基、Ｘ：ハロゲン）で表わされるカチオ
   ン性界面活性剤であることを特徴とする特許請求
   の範囲１記載の血球測定用試薬。 ３ 前記球状化剤が一般式 R₁〔−OCH₂CH₂〕−_oOH （ただし、R₁：炭素数８〜18のアルキル基、ｎ
   ＝８〜18）で表わされる非イオン性界面活性剤で
   あることを特徴とする特許請求の範囲１記載の血
   球測定用試薬。 ４ 前記球状化剤が一般式 （ただし、R₂：炭素数８〜12のアルキル基、ｎ
   ＝８〜18）で表わされる非イオン性界面活性剤で
   あることを特徴とする特許請求の範囲１記載の血
   球測定用試薬。