JPH07501931A - 7−adcaの生化学的新規製造法 - Google Patents
7−adcaの生化学的新規製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、市販のセファロスポリン系抗生物質を製造するための合成方法の分野
に関する。該抗生物質の数は現在、かなり多く、これらの治療物質は現在、第4
世代にある。市販のセファロスポリン系抗生物質には種々の多数の側鎖があり、
セファロスポリン系抗生物質の経済的重要性が大きいことから、種々のセファロ
スポリン系抗生物質の合成を容易にする重要中間体のより経済的で効率的な製造
方法の達成に対する重要性が高まついてる。
これらの重要中間体の一つは7−アミツデスアセトキシセフアロスボラン酸(7
−ADCA)であり、下記式:で表すことができる。現在、7−ADCAはペニ
シリンGから製造されるが、ペニシリン理系の5員環からセファロスポリン系の
特徴である6員環へ広げるには4または5個の化学工程を必要とする。全合成の
場合の常として、この方法には重大な欠点がある。とりわけ、複雑な多段工程を
必要とし、試薬が高価であり、かなりの量の創成物が生じるため排出液の処理が
問題になり、また、化学処理を施す前にかなり不純な出発物質の精製を要するこ
とが挙げられる。従って、環の拡張および側鎖の開裂を酵素的に行って、現在使
用されている化学的方法よりも経済的に7−ADCAを製造する微生物または醗
酵による方法に関する研究が進行している。
従って、本発明は特に、重要なセファロスポリン中間体である7−ADCAの製
造分野に関し、とりわけ、?−ADCAの生化学的製造方法の分野に関する。
今日まで、7−ADCAの生化学的取得を成功させるための研究は大部分が徒労
に終わっており、商業的規模での製造法に関しては特にそうである。例えば、直
接醗酵により、および/またはペニシリンGを酵素処理することにより、?−A
DCAを得るために必要な環の拡張を別にして、6−アミノペニシラン酸(6−
APA)を製造することは可能であるが、不幸なこまたはSlr*ploBtc
s属の酵素は、6−APAを基質として受け入れない。公知文献ではDAOC3
またはエクスパンダーゼ酵素と総称しているこれらの酵素を、ここ、ではペニシ
リン型分子に見られるペナム環構造をセファロスポリン類に見られるセフ−3−
エム環に拡張するのを触媒する酵素として定義する。以後、これらの酵素は「エ
クスパンダーゼ酵素」と称する。
エクスパンダーゼ酵素が作用する基質はペニシリンNであり、これは、環が拡張
されるとデアセトキシセファロスポリンC(DAOC)になる。この場合、7−
ADCAを得るためには、(D)−α−アミノアジポイル側鎖を開裂するだけで
よいが、この側鎖は、酵素開裂に対して頑強に抵抗して、許容されないほどの低
収量しか得られないことがわかっている。
本発明によれば、ペニシリン化合物(アジポイル側鎖を有する)を新規醗酵法に
より高力価で製造する効率的な生化学方法を達成することができる。そして、該
ペニシリン化合物は、ペニシリン化合物を産生ずる同一の微生物をエクスパンダ
ーゼ酵素系をも発現するよう形質転換すると、それによって1nsituで産生
されるエクスパンダーゼ酵素系の許容可能な基質である。エクスパンダーゼ酵素
は、ペニシリン化合物の環を拡張してセファロスポリン化合物が高収率で得られ
るように作用する。この第二の必須工程で重要なことは、ペニシリン化合物、こ
こではセファロスポリン化合物の側鎖が、別の酵素により驚くほど高収率で脱離
可能であることである。本発明の一部をなすこの独自の生化学方法は、予期しな
かったことに、7−ADCAが驚くほど高収率で製造されるという結果をもたら
す。
2、従来技術の簡単な説明
C■1v−elf el *1.、 1IIC@++ Ge++el +199
0) 17413−221は、ペニシリンVの環を拡張した後、得られたデアセ
トキシセファロスポリンVを酵素的に加水分解することにより7−ADCAを製
造する生化学方法を提案した。この提案は、S、clsマaligerls由来
のクローン化したペニシリンNエクスパンダーゼ遺伝子(三エユE)が入手可能
であることに基づいている(Koy*ccマ目el +1.、J、hcleri
ol、(1989) 171ニア54−760およびU、 S、 5. +17
0゜020)。しかし、そのエクスパンダーゼは、天然基質であるペニシリンN
には作用するものの、ペニシリンVには作用しないので、その提案は、ペニシリ
ンVの環拡張を行うことができるような修飾エクスパンダーゼ遺伝子が得られる
ような遺伝子処理を必要とする。必要な修飾は、Crnlwell cl *l
、では達成されておらず、S++eplos7cst cliw++l1He+
a+由来のcefE遺伝子により ?aicillium cbBiole■s
を形質転換し、DAOC3(エクスパンダーゼ)酵素を低レベルで発現すること
に成功したに過ぎない。
エクスパンダーゼ酵素は、その活性および遺伝子配列の両方に関して十分研究さ
れている。例えば、Il、S、 4.510.246および4、536.476
(以上、Woltr )では、サイクラーゼ、エピメラーゼおよび環拡張酵素
が、HreplolYcet cl*v++li!stwtを含む、原核生物の
β−ラクタム産生微生物の無細胞抽出物から別々に単離されて、安定な酵素試薬
が得られた。EP−A−0366354には、S、clIマ5lilerasか
ら単離・精製したエクスパンダーゼ酵素が記載されており、該酵素は末端残基お
よびアミノ酸組成物などで確認され、約34,600ダルトンの分子量を有する
と言われている。しかし、これは、U、 、5.4.536.476では同一酵
素であると思われるものの分子量が29.000になっており、対照的である。
EP−A−0233715は、S、 c1w++Ii(srwtから得らレルエ
クスパンダーゼ酵素の単離およびエンドヌクレアーゼ制限酵素による制限地図作
成、該酵素の宿主での形質転換および発現、ならびに該酵素を使用したペニシリ
ンN基質の環拡張の実例を開示している。υ、 S、 S、 070.1120
は、S、 cl*twli(erwsから得られルエクスパンダーゼ酵素をコー
ドするDNA配列を開示しており、また、F、 ebr7Iotsaw−菌株を
該DNA配列を含む発現ベクターにより形質転換してエクスパンダーゼ酵素を発
現させることを記載している。この酵素はペニシリンN以外の基質の拡張にも有
用とされているが、そのような拡張の実例はない。
上述した研究は、原核生物S、clIマtliI*rssから得られるエクスパ
ンダーゼ酵素に集中している。この同一の酵素または少なくとも見かけ上同じ環
拡張活性を有する酵素は、真核生物Cepk*IoBoriss scr!wo
niwm (^crtto++i*s tbrHo@tI−とも言う。)の菌株
によっても発現される。しかし、そのような菌株でのエクスパンダーゼ活性は二
機能性遺伝子(cefEF)によって発現され、その遺伝子は、その本来の機能
がエクスパンダーゼ酵素のデスアセトキシセファロスポラン酸(DAOC)産物
をデアセチルセファ0スポリンC(DAC)に変換することであるDAC3(ヒ
ドロキシラーゼ)活性も発現する。その結果、単一であるが二機能性のエクスパ
ンダーゼ/ヒドロキシラーゼ酵素が得られる。これら2個の遺伝子産物の活性を
分離する試みがなされているが、まだ誰も成功していない。例えば、El’−A
−0281391は、C,tcru+on日−^TCCIISSGから得られる
DAOC3/DAC8遺伝子の単離およびDNA配列の同定をその酵素の対応す
るアミノ酸配列とともに開示している。
Penicilliwmは形質転換され、その酵素を発現するが、ペニシリンG
およびVを対応するセファロスポリンに変換するという試みは少しも例示されて
いない。さらに、DAOC3をコードする遺伝子情報をDAC9から分離してそ
れらを別々に発現することは、遺伝子工学技術により容易に行うことができると
いう示唆にもかかわらず、そのような分離の実例は全く記載されヒドロキシラー
ゼ)酵素も、その活性および特徴ならびに遺伝子配列に関して十分に研究されて
いる。例えば、υ、 S、 4.171210 SU、 S、 4.24196
6およびo、s、 4.307.10 (以上、Ds++*i++)では、エピ
マー化して環を拡張することによりセファロスポリン抗生物質を生じるC、 易
cremoniasの無細胞抽出物によりペニシリン型の種々の出発物質を処理
している。υ、 S’、 4.753.1181(Wa−KisB Yeh)は
、C,seresoaiam酵素の等電点、分子量、アミノ酸残基、ヒドロキシ
ラーゼ活性とエクスパンダーゼ活性との比およびペプチド断片に関して記載して
いる。
上述した公知文献は、P、 chB+o(enws菌株を、エクスパンダーゼ酵
素を発現する遺伝子により形質転換してその酵素を発現させるという点のみで、
本発明に関連している。そこでは、発現した酵素を使用して、ペニシリンGおよ
びVではなく、ペニシリンNの環拡張を行っているだけである。その場合ですら
、ペニシリンNの7位には、本発明方法のように酵素的に開裂して7−ADCA
にすることができない側鎖がある。本発明は、アジポイル側鎖がP、’chrY
Io(ena■菌株により効率的に付加され、in 5itu発現したエクスパ
ンダーゼ酵素がその化合物を環拡張の基質として効率的に使用してアジポイル7
−ADCAにし、次いで、そのアジポイル側鎖が別の酵素により効率的に脱離さ
れて7−ADCAになるという驚くべき発見によるものである。本発明側々の断
片自体は公知文献に見出すことができるとしても、それらを結合すると本発明方
法のように予期しない結果が得られるということは示唆されていない。
例えば、6−アジポイルペニシラン酸は文献により公知である(Btllio、
^、 el sl、、 NatuIe (19601185,97−99参照)
。
in vitroでの6−アジポイルペニシラン酸の酵素的拡張も文献により公
知である(Bsllwin el tl、、 Tel目bed+on+1987
143. 3009−3014およびEP−^−026043参照)。そして、
アジポイル側鎖の酵素的開裂も文献により公知である(Mstsad−el 1
1.、 ]、 B暑c1. (19g7) 169. 5815−5820)
。
アジポイル側鎖は次の構造: C00H−(CH2) 4−C0−を有するが、
密接に関連した構造の側鎖として、構造:C00H−(CH2’) 3−Co−
を有するグルタリル側鎖がある。グルタリル側鎖の酵素的開裂は文献により公知
である(例えば、5hibu7* ej sl、、 Agric、 Biol、
Chew、(1981) 45. 1561−1567 、lJ*+swd*
u+d KomNsw、I、BIcl (1985) 163. 1222−
1228、 Mrlsid畠 !l *1.、 J、 BIcl、 (19B?
) 169. 51115−5820. 特開昭53−0860114 (萬有
製薬)および特開昭52−1211293 (萬有製薬)参照)。
また、EP−A−04530411は、P@tedomoass 5Y−77−
1によって産生されるグルタリルアシラーゼのアジポイル開裂活性を改善する方
法を記載している。α−サブユニット内に位置する種々のアミノ酸を置換するこ
とにより、(アジポイル−セリンからの)アジポイル開裂速度が3〜5倍高くな
った。なお、EP−^−0453[148は見かけ上、アジポイル側鎖に対する
活性が改善されたアンラーゼを実証しているが、アジポイル−セファ0スポリン
を主に生じさせる方法(化学的方法または本明細書に記載した方法と類似の生化
学的方法のいずれによっても)については何も記載していない。
(D)−α−アミノアジポイル側鎖が存在する場合、最初にアミノ基を酵素的に
除いて、その側鎖を(D)−アミノ酸オキシダーゼにより短くしてグルタリル(
、G 1.−7 )側鎖とし、これを別の酵素(グルタリルアシラーゼ)により
グルタリル側鎖を脱離することは文献により公知である。そのような二段開裂ハ
、11. S、 3.960、[2(Mtl+ods ) 、EP−人−027
59fi!、特開昭61−218057 (198g−KomN+3 旭化成工
業) 、W090./121111 (1990−Won(、Biopa+e
Camp、 )および1scHi etil、Bio/Tecbnolog7(
1991+ 9゜1811−191に開示されている。
係属の出願との関連
エクスパンダーゼ酵素の活性を、本明細書に記載した7−ADCAを得るための
生化学方法と同様の方法によりP、chB+oBnas形質転換細胞で発現させ
7−ACAを得るためのバイオ方法を開示した出願中の出願No、−−−−−−
−〜−−−(出願臼:−−−−−−−−−−−−−−−−’) (代理人事件N
o、 185721A)と関連する。しかし、この7−A CAバイオ方法では
、別個の最終産物を得るための全く異なる組換え代謝経路を達成するために、別
の酵素活性を発現するには別の形質転換が必要であるが、本明細書は、それに関
しては何も示唆していない。
本発明方法および上述した公知文献の開示をより十分に理解するのを助けるため
に、以下に、ペニシリンGおよびセファロスポリンCに導く代謝経路の種々の段
階、中間物質および関与rる形質転換を行う酵素を示す。
イソペニシリンN
CD) フェニルアセチルCoA
デスアセトキシセファロスポラン酸
(DAOC)
デアセチルセファ0スポラン酸
(DAC)
セファロスポリンC
発明の要旨
本発明は、7−アミツデスアセ!・午ンセファロスボランWR(7−ADCA)
を製造するための新規生化学方法に関している。本発明の方法は、下記工程:
1)イソペニシリンNを産生するPe+icilliwm cb+7to(e+
+mm菌株を、それが生育できる培養培地中で維持し、該培養培地にアジピン酸
または該PeniCilliam chB+ogcmmm菌株によって同化・利
用され得る1種以上のその塩およびエステルを含むアジペート原料を添加してア
ジポイル−6−アミツベニシラン酸(アジポイル−6−APA)を製造する工程
であって、該Peaicilliam cbBtogsnu+菌株は、アジポイ
ル−6−APAを基質とすることができるエクスパンダーゼ酵素の活性をコード
するDNAによって形質転換されており、その酵素の発現に伴い、該菌株によっ
て産生されたアジポイル−6−APAが1n8ituで環拡張されてアジポイル
−7−ADCAを生じる工程;および
2)該アジポイル−7−ADCAをアジポイルアシラーゼと接触させることによ
りアジポイル側鎖を脱離して7−八DCAを生成し、次いで該物質を単離する工
程を含む。
本明細書で使用する下記用語の意味を表示する。
「アジポイル−6−APAJは、(2S−(2α、5α、6β)]−3,3−ジ
メチル−7−オキソ−6−〔(ヘキサン−1,6−シオイル)アミノコ−4−チ
ア−1−アザビシクロ−(3,2,0)へブタン−2−カルボン酸を意味し、「
アジポイル−7−ADCAJは、7−〔(ヘキサン−1,6−シオイル)アミノ
コ−3−メチル−8−オキソ−5−チア−1−アザビシクロ−(4,2,0)オ
クト−2−エン−2−カルボン酸を意味する。
特に、本発明は、上記で詳述した7−アミツブアセトキシセファロスポラン酸(
7−ADCA)を製造するための新規生化学的方法において、アジペート源がア
ジピン酸二ナトリウムであり、エクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDNA
かに由来するエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDNAおよびエクスパン
ダーゼ活性をコードするDNAの発現を促進するプロモータを含む、後述するプ
ラスミドpPenFTsoから成る組換えDNA発現ベクターに関する。
本発明はさらに、Sl+cptom7ces elxvuliB+as ATC
C27064に由来するエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDNAおよび
エクスパンダーゼ活性をコードするDNAの発現を促進するプロモータ(Pen
icillins ch+y+ogtnnm IPNS遺伝子のプロモータなど
)を含む組換えDNA発現ベクターで形質転換されたPen1cillins
chB+olenum宿主細胞に関する。特に、本発明は、後述するプラスミド
pPenFTsoから成る組換えDNA発現ベクターで形質転換されたP!ni
Cilliom chB+o(snam宿主細胞に関する。
さらに、本発明は、遺伝子の発現に適した条件下で組換えPenlc口1i1s
chB+oBnam宿主細胞を培養する工程を含み、該組換え宿主細胞がSt
+eplom7ctIcl*yIlligs+a+ ATCC27064に由来
するエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDNAおよびニレスパンダーゼ活
性をコードするDNAの発現を促進するプロモータ(Penicillium
ch+y+ogCium IPNs遺伝子のプロモータなど)を含む組換えDN
A発現ベクターから成る方法に関する。特に、本発明は、遺伝子の発現に適した
条件下で組換えPcnicilliam chBsogenum宿主細胞を培養
する方法であって、該組換え宿主細胞が後述するプラスミドpPenFTsoな
どの組換えDNA発現ベクターから成る方法に関する。
発明の詳細な説明
本発明の第一は、下記構造式:
で表される、市販の合成セファロスポリンの重要な製造中間体である7−アミツ
デスアセトキシセフアロスボラン酸(7−ADCA)を製造するための新規生化
学的方法である。7−ADCAの特徴は、セファロスポリン核の他に、7−アミ
ノ基および3−メチル基である。7−アミノ基は多数の誘導側鎖に変換すること
ができ、従って、市販の種々のセファロスポリンを合成するためのベースとなる
。3−メチル基は、セファレキシンの場合のようにいつもではないが通常は、市
販のセファロスポリンを合成するためにい(つかの他の側鎖に変換されることと
なる。
本発明方法の7−ADCA物質は、下記構造式:で表される別の重要なセファロ
スポリン中間体であるセファロスポリンCと対比させることができる。この中間
体の場合、3−アセチルオキシメチル側鎖は市販のセファロスポリンに対して許
容されるかもしれないが、7− (D)−α−7ミノアジボイル側鎖は、合成に
よるこれ以上の誘導には適しないので、許容可能な7−アミノ基を得るために開
裂しなければならない。
不幸なことに、?−(D)−α−アミノアジポイル側鎖は、化学的または生化学
的ないずれの手段によっても、いつも脱離が困難である。
!鼻
本明細書、特に好ましい態様の説明の章で使用する下記の用語の意味を表示する
。
ツーADCA 7〜7ミノデスアセトキシセフアロスポラン酸6−APA 6−
7ミノペニシラン酸
DAOCデスアセトキシセファ0スボラン酸DAOC5DAOCシ:/ セ9−
セDACデアセチルセファロスポリンC
DAC3DACシンセターゼ
IPMS イソペニシリンNシンセターゼT+ロ トリス〔ヒドロキシメチルコ
アミノメタンED、TA エチレンジアミン四酢酸
DEPCジエチルピロカーボネート
TE Tr口/EDT^緩衝液
SSC塩(塩化ナトリウム)、クエン酸ナトリウム緩衝液SO3ドデシル硫酸ナ
トリウム
PEG ポリエチレングリコール
P*n1cjlli** chBto(ease培養本発明方法の第一工程は、
イソペニシリンNを産生ずるPs++1cilliss eh+7togeai
m菌株を、それが生育できる培養培地中で帷持し、該培養培地にアジピン酸また
はその塩およびエステルを含むアジペート源を添加する工程を含む。アジペート
源は、P、 chr7soge++amを接種した後、その培養培地に添加する
ことができるが、接種を行うときにすでに培養培地に存在しているのが好ましい
。アジピン酸またはその塩およびエステルは、−6−APAを生成することがで
きるものである。ここで、P、 chry+Ben1はエクスパンダーゼ酵素の
活性をコードするDNAによって形質転換されており、その酵素の発現の際、該
アジポイル−6−APAがin 5ituで環拡張されてアジポイル−7−AD
CAを生じる。
ペニシリウム属の cb+7sogennm種以外の種もイソペニシリンNを産
生ずる。しかし、歴史上、イソペニシリンNの産生量が最も高い菌株は全て、周
知の菌株改良技術によりchBtogen++―種から発育させている。このた
め本発明は、事実上、?nicilliim ct+ to cnum菌株に限
定したが、他の種にも適応できることは明らかである。PtniCilliam
ch+y+oBnw−の寄託菌株または該菌株の他の公的に入手可能な源は、
いずれも本発明方法を行うための適する出発点である。
イソペニシリンNを産生するPeoicilliIla chry+ogeou
+菌株の生育を維持することができる培養培地は、当業者が容易に慣れ親しむ型
のものである。例えば、培養は水中上通気醗酵法により行い、使用培地は多数の
使用可能な適する培地から選択される。典型的な培地は、ショ糖、グルコースお
よび澱粉などの炭素源;大豆の粉末および粕、綿実油、ピーナツ油ならびに種々
のアミノ酸、それらの混合物およびペプトンなどの窒素源を利用する。産生条件
は、収量および単離し易さに重点が置かれ、従って、そのような状況に好ましい
培地は、炭素源を糖蜜にして、窒素源を大豆粉末およびアミノ酸にすることがで
きる。
通常は栄養無機塩を培養培地に添加し、そのような塩としては、次のイオン成分
:ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸塩、硫酸塩、塩化
物、臭化物、硝酸塩、炭酸塩、第二鉄、第一鉄、マグネシウム、マンガンなどを
供給できる塩が挙げられる。微量元素も、通常は、Pe++icillias(
hrHogenumの生育、発育および代謝のために必須であり、他の培養培地
成分にもともと成分としてすでに与えられていないならば、培養培地に直接添加
することができる。
Penicilliam cbHsogen*m菌株は、ごく少量の7−ADC
Aの生産を所望する場合は、1!容振とラフラスコなどの容積の小さい装置中で
培養することができる。しかし、もつと大量のアジポイル−7−ADCAを所望
する場合は、水面下通気醗酵条件下で大規模な醗酵槽を使用する。
アジポイル−7−ADCAを大規模に製造する場合は、る。傾斜培地の胞子を使
用して、小さい体積の栄養培地に接種する。その栄養培地をインキュベートして
、その微生物の培養を大量かつ新鮮で活発に増殖するように行う。次いで、この
栄養培地を大規模醗酵培地の接種物として使用する。場合によっては、醗酵培地
の接種物としてさらに別の栄養培地を含めるのが好ましいかもしれない。そのよ
うな第二の栄養培地は、通常、醗酵培地の体積が第一栄養培地よりもかなり大き
い場合に使用する。このように、微生物の胞子が最初に体積の小さい栄養培地で
培養されて体積の大きい栄養培地用の接種物となる。次いで、体積の大きい栄養
培地から十分な濃度の微生物が得られたら、大規模醗酵槽での急速な醗酵が開始
される。栄養培地は、醗酵培地と同じ組成物を有するか、小規模での微生物の生
長および発育を高めるための他の成分を含むことができる。
本発明方法で使用する Pen1cilliaa chtltoHtaus菌株
は約20〜30℃の温度で最も効率的に培養されるが、最適な収率は、温度が約
22〜28℃、好ましくは約25℃のときに得られる。
アジポイル−7−ADCAは、Pen1cillins chrHoge+a1
1菌株を大規模槽中で、約10〜30日間、好ましくは15〜25日間、培養す
ると生産が最大になる。しかし、250mj容の振とうフラスコなどの小規模装
置で培養すると、微生物の生長はより急速になり、アジポイル−7−ADCAが
より短時間、例えば4〜15日、しばしば5〜7日間で生産される。
大規模醗酵槽の最終pHが8.0以上に達すると、アジポイル−7−A D C
Aの収率に悪影響を及ぼす可能性がある。そのような状況では、醗酵の間中、培
養培地のpHを監視するのが好ましい。アジポイル−7−ADCAの生産が最大
になる前にpHがそのようなレベルに達すると考えられる場合は、適切な酸また
は緩衝剤を醗酵培地に添加することによりpHを下方に調整すると好都合である
と考えられる。
アジポイル−7−ADCAを生産した後、醗酵培養液のサンプルをクロマトグラ
フィーによりテストすることができる。
はとんどの水面下通気醗酵と同じように、培養培地に滅菌空気を通すことにより
、Penicilliom ehBso!!nm−菌株の生長がより効率的に行
われ、アジポイル−7−ADCAの生産が高まる。培養培地に通す空気の体積は
通常、単位体積の培養培地につき、1分間に少な(とも約0.2体積である。し
かし、空気の通過速度を高めると、アジポイル−7−ADCAの生産に対して有
益な影響が得られることが多い。
Pen1cillios ch+y+ogenum菌株は、典型的には、アジポ
イル−7−ADCAの他に多くの創成物および代謝物を生産する。
これらのいくつかは酸に対して感受性であるため、アジポイル−7−ADCAを
醗酵培地から回収する際、醗酵培養液全体を短時間、酸性pHで処理することに
より、副成した不純物の一部を分解するのが望ましい。アジポイル−7−ADC
A醗酵産物は、こうして処理した醗酵培養液を濾過して回収し、所望により、イ
オン交換樹脂でのクロマトグラフィーにより醗酵培地の他の成分から分離し、さ
らに、必要であれば、続くアジポイル側鎖の酵素的開裂工程の前にクロマトグラ
フィーにより精製することができる。また、そのようなイオン交換クロマトグラ
フィーによる分離は、側鎖の開裂を行った後に行うこともできる。分離上の問題
がある主要な副成物の一つはアジポイル−6−APAであり、この副成物は、化
学的または酵素的に分解して分離をより容易にすることができる。最初に、濾過
した醗酵培養液を、n−ブタノールまたは酢酸アミルなどの水と混和しない有機
溶媒で最初に抽出するなどの予備精製にかけて不純物を除去する。次いで、抽出
した培養液は、さらに、活性炭でのクロマトグラフィーによる予備的方法で精製
することができる。
アジペート源の添加
上述のように好ましくは、Pe++icilliom chr7toBnu+に
対すの他の成分に添加する。所望により、接種後、例えば接種の1.2および/
または3日後にアジペート源を添加してもよい。アジペート源は、アジピン酸ま
たは培養されている?micilliwlchry+olenam菌株により同
化・利用されてアジポイル−6−APAを生産することができるアジピン酸の1
種以上の塩もしくはエステルとして定義される。アジピン酸、塩およびエステル
は単独または組み合わせて使用することができる。二ナトリウム塩が好ましいが
、カリウム塩およびナトリウムとの混合塩も適する。メチルエステルは使用でき
るが、エチルエステルは水に不溶である。アジピン酸塩またはエステルは、Ps
nieillins chr7toge+im菌株により同化・利用されてアジ
ポイル−6−APAを生産することができるものでなければならない。例えば、
アジピン酸自体は水に不溶であるにもかかわらず、同化可能な塩が適正なpH条
件下で生成されるために適する。
適するエクスパンダーゼ酵素
上述したように培養され、アジペートaが与えられてアジポイル−6−AI’A
を生産するP s o i c i I l 」CbrT−ソリ」1m m=菌
株はまた、エクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDNAによって形質転換さ
れており、その発現の際、該アジポイル−6−APAはin 5ituで環拡張
されてアジポイル−7−ADCAになる。
アジポイル−5−APAは、アジペート源を添加して培養したPcaicill
isn chry+ogtnnmにより細胞内で生産される。また、その細胞内
、すなわちin 5itu条件では、形質転換されたP!IlicilliI1
w cbry+o@ff11mがエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDN
Aを発現し、その際、その酵素が基質としてのアジポイル−5−APAに作用し
て環を拡張させ、アジポイル−7−ADCAを生成させる。
本発明の新規生化学的方法は、エクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDNA
による上述した型の Psnicilliamcb+Hogenam菌株の形質
転換をその範囲内に含み、その酵素の発現の際、アジポイル−6−APAがin
5ituで環拡張されてアジポイル−7−ADCAを生じる。すなわち、Pe
aiciiliis ehry+ogsecmを形質転換するDNAは、従来技
術において理解されているエクスパンダーゼ酵素の活性、すなわちイソペニシリ
ンNを環拡張してDAOCにする能力だけでなく、アジポイル−6−APAを環
拡張してアジポイル−7−ADCAにする能力も有する酵素を発現しなければな
らない。
しかし、側鎖の類似性から【5て、どのエクスパンダーゼ酵素も本発明の新規生
化学的方法において使用可能であると考えられる。
従来技術の章ですでに述べたように、St+!9jowyctIclsyili
ts+is ATCC2フ064由来のエクスパンダーゼ酵素は、その全塩基配
列が分析されているとともに、エンドヌクレアーゼ制限酵素による地図作製によ
り特徴付けられている。しかし、同一酵素であると思われるS、cl暑マυ1鬼
(emu暑If RII L 35 RS由来のものは、分子量が異なるとl報
告されているに止まり、塩基配列は分析されていない。
従来技術においてすでに同定されたこれらのエクスパンダーゼ酵素は、本発明の
新規生化学的方法において有用である。まだ同定されていないS、 clIvw
lige+*+の異なる菌株または別の属の微生物に由来する他のエクスパンダ
ーゼ酵素でさえも、本発明の新規生化学的方法を行うのに適すると考えられる。
有用な微生物の新しい菌株および属を同定し、エクス、(ンダーゼ酵素とされる
ものを単離し、それらが本発明方法での使用に適していることを検証するための
方法は簡単であり、当業者には周知である。有用な微生物の候補となる新しい菌
株および属の無細胞抽出物のスクリーニングは、該抽出物を、第一鉄(F e
”)イオン、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩およびアデノシン三リン
酸(ATP)などの公知のDAOC8補助因子の存在下でアジポイル−6−AP
Aに添加するという、信頼でき再現性のある方法で行うことができる。アジポイ
ル−5−APA基質は、下記に詳細に記載する方法と同様にしてアジペート源を
未形質転換Peaicillicm ch+!%oItniaに供給することに
より十分な量で製造することができる。所望のエクスパンダーゼ酵素は、アジポ
イル−7−ADCAが生成するならば存在し、その有無はクロマトグラフィーに
より検出することができる。
また、公知の組換え技術を使用すると、S、clsマuliitn+sおよびC
,*e+emoniomのエクスパンダーゼ配列に基づいてDNAプローブを作
り、本発明方法での使用に適するエクス/シンダーゼを生産しそうな候補微生物
のDNA部分をスクリーニングすることができる。
エクスパンダーゼ酵素の可能源
すでに述べたように、エクスパンダーゼ酵素は、ペナム環構造(ペニシリン型分
子に見られる)を拡張してセフ−3−エム環(セファロスポリンに見られる)に
するのを触媒する酵素である。従って、セフェム環を含む代謝産物を生産するど
の有機体もエクスパンダーゼをコードするDNAの可能源である。そのような有
機体の例を下記に挙げるが、このリストは例示に過ぎず、全てを網羅していると
考えるべきではない。
真菌:
Cephslotpoτ目m ac+emoniusCephtlospori
++s +p。
放線菌:
H+cplo@Hctt cl*wwli(e+r+S、l1lipin!ns
i+ czphts7cini他の細菌:
F11wobscle+in+ +p。
Alcsligcnc+ deail+i+iwntlJyeopltIl*
bollt口P+owide++cit +tl1ge+1LHobxcls+
Itcl1gzno+上記で挙げた生体のエクスlくンダーゼは、さら4こ研
究するための単なる候補に過ぎず、それらが全て本発明の新規方法番二適すると
は限らない。例えば、C,*c+e■on目■に由来する酵素などのエクスパン
ダーゼ活性およびヒドロキシラーゼ活性の両方を有する酵素を使用すると、ヒド
ロキシル化アジポイル−7−ADCA、すなわちアジポイル側鎖のついたDAC
が製造される可能性がある。
エクスパンダーゼ活性をコードするDNA断片の単離所望のエクスパンダーゼ酵
素の存在が上記方法により検出されると、エクスパンダーゼ酵素活性をコードす
るDNAの単離法も簡単で、当業者には周知である。エクスパンダーゼ酵素をコ
ードする遺伝子の公知配列および部分配列に基づ<DNAプローブは、所望の酵
素をコードする単離すべきDNAとハイブリッド形成するように構成される。そ
のようなプローブの構成は、エクスパンダーゼ酵素をコードするアミノ酸および
ヌクレオチド塩基配列ならびに関与する特定の微生物の優先コドンに関する知見
に基づく。Sl+epjos7ees el@vwligtr+++^TCC2
’1064のゲノムDNAに適用されるこの種の典型的方法の詳細な説明を以下
でさらに述べる。
エクスパンダーゼ酵素活性をコードするDNAの単離は、組換えDNA技術でよ
く知られた制限および連結方法により行われる。適正な制限断片を得て単離する
には、関与する微生物のゲノムのエンドヌクレアーゼによる制限酵素地図を知る
ことが必要である。S、 clsyaliger11+およびC,tc+eso
ni++++の制限酵素地図はすでに入手可能である。すなわち、前者の場合は
、制限酵素B a m HIおよび5allを使用すると、電気泳動により、所
望の1.8および2.2kbの断片が得られる。
PCnicilliom chr7sogenia菌株の形質転換エクスパンダ
ーゼ活性をコードするDNA断片が得られたら、それらを、プロモータ、翻訳活
性化配列、耐性マーカー、調節配列、ニスミドフォーマー、ならびに形質転換を
可能にし、または促進し、遺伝子産物の発現を行い、形質転換細胞の単離を容易
にする他のDNA塩基配列とともに、プラスミドまたは他の発現ベクターに挿入
(連結)することができる。こうして構成した発現ベクターを使用すると、Ps
nieilliam chrHogenam菌株の形質転換およびエクスパンダ
ーゼ酵素の活性の細胞内発現が達成される。形質転換および発現を達成するため
に使用される技術は文献により公知であり、そのような典型的な方法の詳細な説
明を以下でさらに述べる。
上記で既に詳述したように、形質転換され゛たPen1cilli*mcb+y
sogennm菌株は、エクスパンダーゼ酵素の活性を細胞内で発現し、in
5ituでアジポイル−6−APA基質に作用して環を拡張し、アジポイル−7
−ADCAにする。
新規な形質転換細胞
エクスパンダーゼ遺伝子の活性を発現する特定のPenieillium ch
r7sBena11形質転換細胞は、本発明の好ましい態様であり、Crn1v
ell el Il、(1990) C+u+!+l Ge+elic、17゜
213−221にあるような従来の構成と比べて新規である。いずれの構築でも
、in vitro突然変異誘発を使用してプロモータをエクスパンダーゼ遺伝
子に連結する。C5elvellの構築では、エクスパンダーゼ遺伝子のATG
にNde1部位を導入し、それを、Xbal/NdeIリンカ−によりI PN
Sプロモータの3′−末端にあるXba1部位に連結する。本発明の構築では、
エクスパンダーゼ遺伝子のATGにNco1部位を作り、r PNSリンカ−の
3゛ −末端にあるNcoI部位に連結する。
この結果、これらの構築におけるプロモーター遺伝子連結部の周りの塩基配列は
次のようになる。
xbll Ncal
IPNS プaそ一夕 S’TCTAGACACCA丁GG 3’ 配列番号
lC8+1vell構築では、CがTで置き換わっているが、本発明の構築では
、Cは保持されている。すなわち、ATG開始コドンのすぐ隣のI PNSプロ
モータの配列は、天然に存在するI PNS遺伝子に見られるものと正確に一致
する。この従来のプロモータは、ただ1個のヌクレオチド塩基が異なるだけだが
、翻訳効率が低下し、その結果エクスパンダーゼ遺伝子の発現レベルを下げる可
能性がある。
他の違いは、構築に含まれるプロモータまたは遺伝子の領域である。Crn1v
sll構築には、IPNSプロモータの5′B a m HTからXba13’
までの領域を含むが、本発明のベクターはそのプロモータの5’Ncolから
NcoE3’ までの領域を含む(Die!、el tl、、(19901,1
,Biol、 Ch!@、 265゜16358−16365 ) 、この結果
、Csn1vtll構築のI PNSプロモータには5′末端に約250塩基対
が付加される。しかし、この領域はI PNS遺伝子の上流にあるACVシンセ
ターゼ遺伝子の読み取り枠にある。
また、Csn1vtll構築は、5IrtploHce+遺伝子を、ATGから
その遺伝子の3′側のBamH1部位まで含むが、本発明のベクターは、ATG
からその遺伝子の3′側の5ai1部位まで含む(Kow*cewie cl
sl、、f19N)、J、Btcleriol、、171.754−7603
、この結果、Csn!well構築の3′末端には約1000bpsの塩基配列
が付加される。本発明の構築はさらに、エクスパンダーゼ遺伝子の上流域を、A
TGの5′側のBamH1部位まで含むが、エクスパンダーゼ遺伝子の読み取り
枠とはI PNSプロモータにより分離されている。
本発明の構築が公知文献に記載されたものとさらに異なる点は、使用する選択的
マーカーに関する。Penicilliam IPNsプロモータの使用二本発
明の構築におけるphlso*7ein遺伝子融合は、多重複製の組み込みまた
は高レベルの発現を可能にし、従ってエクスパンダーゼ遺伝子を高レベルで発現
する形質転換細胞を高い割合で産生ずる可能性がある位置での組み込みを選択す
るようになる。
上述した型の新規形質転換細胞は、PClooと命名したPenieilliu
m chB+ogenamである。その菌学上の特性としては、典型的には、広
範囲に広がる緑青色〜緑色で、滑らかなベルベット様で黄色の粒のついたコロニ
ーを生じ、寒天中に黄色が逆拡散し、分生子頭の分枝は全体に滑らかで、分生子
は長さが3〜4mmの楕円形〜球形であることが挙げられる。
P、 chr7sogenumに対する許容可能な培養条件は、11の蒸留水中
にラクトース−水和物1.5%(W/V) 、コーン浸出液0.5%(v/v)
、ペプトン0.5%(W/V)、NaC10,4%(w/v) 、Mg5O−7
H200−0596(W/ v ) 、K H2P O40、06%(W/ V
)、F e Cl ・6 H200、OO05%(w/v)、Cu5O一5H
200,0002%(W/V) 、寒天3.0%(W/ V )を含む固形培地
を使用し、pH4,8である。すぐ上に記載し、PClooと命名したP、 c
h+7sog!n■は、^−e+1ctn TypeCullu++ Co11
ection (ATCC) (12301PIT日tvn Driwe。
Roclvill+、 MtBl+nd 20852 )にへ丁CC74182
の受託番号(寄託日: 1992年8月21日に受理され、生存は1992年8
月27日に確認)で寄託されている。
アジポイル側鎖の開裂
本発明の新規生化学的方法の次の工程は、アジポイル−7−ADCAからアジポ
イル側鎖を開裂することであり、この工程では、前の工程の産物をアジポイルア
シラーゼ酵素系で処理する必要がある。上記ですでに述べたように、本発明の重
要な成果の一つは、アジポイル−7−ADCAの製造に導く全工程を単一の醗酵
培養で行うことができることである。これにより、その方法の工程ごとに中間物
質を単離し、部分的に精製する必要がない点で有効性が非常に改善される。しか
し、この最終工程にアジポイルアシラーゼ酵素系は存在しない、すなわち、最初
の醗酵培養においてin 5ituで生成されていない。
本発明の新規生化学的方法をバッチ式で行う場合は、最初の工程の産物を単離し
、部分的に精製する必要がある。このための予備的操作については上記ですでに
記載した。
にもかかわらず、本発明の方法は、アジポイル−7−ADCAが7−ADCAに
酵素的に変換できるようにアジポイルアシラーゼをアジポイル−7−ADCAに
効果的に接触させる方法であればどの方法でも行うことができる。これは、「接
触」の最も広い意味での定義である。原料として粗アジボイル−7−ADCAの
無細胞培養液を使用し、それを、粗アジポイルアシラーゼ培養液によりバッチ式
で処理することが可能である。この方法は、最初の反応物の実質的な精製を必要
としないので、ある程度の有効性が得られる。もちろん、改良は可能である。例
えば、反応物は、互いに接触させる前に所望する程度に精製してもよい。また、
バッチ法ではなく連続的方法でその工程を行うこともできる。反応物自体の接触
は、処理技術の向上に応じ、種々の方法で改良することができる。すなわち、固
定化酵素を、例えばアジポイルアシラーゼを含むカラムの形で使用し、アジポイ
ル−7−ADCAをそのカラムに通す。また、固定化酵素を懸濁物としてアジポ
イル−7−ADCAに添加してもよい。そのような固定化酵素系は、酵素の回収
が容易で、何度でも再使用できるという利点を有する。そのような処理技術の他
の例は、膜反応器に関するものである。反応物を接触させる好ましい方法は、固
定化酵素カラムによる方法である。
開裂工程に有用なアジポイルアシラーゼ酵素アジポイル側鎖に対して既知特異性
を有する酵素は多数存在する。市販のRAEY Cotp、製アジポイルアシラ
ーゼを使用して得られる結果は、下記の実施例でさらに詳述する。文献には、セ
ファロスポリン型分子からアジポイル側鎖を脱離する他の7種類の酵素が報告さ
れている。これら7種類の酵素のうち6個はPstmdo園on■種園内n1種
7番目はBacillus種に由来する。各々のPseudo■01111酵素
はいくつかの類似性があるが、全7種は、物理的/生物学的特性がある程度具な
る。それらの特性のいくつかを下記にまとめる。
酵素 文献 分子量近似値
(シU旦屯−可11及び (サブユニット)シにΩシ謹 菌株 )
E、 5Y−77−I 5hibuya、 椙ムー日1. 見かけ上ハ下ノ(T
oyo Jozo) (1981) G K 161:同eP、 GK16 M
atsuda、 Komatsu 16,000(Asahi ) (1985
) 54 、000E、5E83 (acyl) Matsuda、 し」u、
38.Zo。
(Asahi) (1987) 19,900E、5E83 (acyエエ)
Matsuda + 椙り盈L25 t 400、 (Asahi) (198
7) 58,200ム1−空践几瓜sp、−−−−−−−−−−−−−−−16
,000(RAEV Corp、) 54,000” Aramori tLa
l、、 (1991) 72: 232−243゜” Arwori et a
l、、ム」■山匡ηh(1991) 173: 7848−7855゜上記アジ
ポイルアシラーゼ酵素は全て、本発明の新規性化学的方法に有用である。本発明
方法に有用な他のアジポイルアシラーゼを、候補の酵素を、作用すべき実際の基
質であるアジポイル−7−ADCAに対してテストすることにより容易に発見で
きるかもしれない。よさそうな結果が得られたら、信頼できて再現性のある方法
により、候補の酵素が本発明方法に実際に有用であることを測定する。基質は、
S!swcxuk *nd Wellssn−Bednswsks in Cl
1n、 Chill、 Ac18(1978) 84. 19−26により報告
された方法を改良して無水アジピン酸と7−ADCAとの反応から直接調製でき
る。無水アジピン酸は、 1. MIcrosol、 Sci。
Chew、(199G) A27.397−412に記載されたAlberlt
oIl■dLandmarkの方法に従って調製できる。7−ADCAは、いく
つかの市販のもの(例えば、E、 R,5qaibb & 5ons、 Lid
、、 Nlおよび1nle+ebem Corp、、 Nl)を利用する。
高速比色法を使用して候補の酵素を粗選別する場合は、アジポイル−7−ADC
A基質の代わりにアジポイル−PABA(パラ−アミノ安息香酸)またはアジポ
イル−PNA (パラ−ニトロアニリン)などの呈色基質を使用してもよい。側
鎖の開裂により発色種が生じ、その種の有無および濃度が比色計により容易に測
定される。これらおよび他の適する比色法に関するさらに詳細な情報は、Mg+
elli、L、P、(1968)、1. Pht+m。
SCi、、 57:2+72−2173; S+*s!、 G、(19691,
Cl1n、 Chts、 15:I24−+36; St!vetsk、^、
cl sl、、 (1980) Al1. Biochem、 103+166
−169;およびRtle3 F、el *1.、(19g91 +、Ph暑r
mt、Ph*+wueol。
41+H6−N7を参照。
a c y IIの大きいサブユニットを持つRAEV酵素のN−末端アミノ酸
配列を、上記表に記載したGK16と比較した。比較結果を下記に示す(括弧内
は、決定的なものではなり道ことを示す。)。
RAEV 配列番号、5
SN (Sl (GI A V A p G K T A N G N A L
(L) L Q N (P)GK16 配列番号6
SNS I AYAPGKTANGNAL L LQN P暑e711配列番号
7
SNN W AYAPGRTATGRPI L AGD P示した配列から、こ
れら3個のペプチドは全て、明ら力A1こ関連している。しかし、上記で示した
配列と同様のN−末端配列ンGアシラーゼの場合のように、必ずしもアジポイル
アシラーゼ活性を有するとは限らない。他方、上記N−末端配列との相同性が小
さくとも本発明方法に有用なアジポイルアシラーゼがある。例えば、上記の表で
述べた^■bI酵素acylおよびFlloswt B、1rte+ospo+
as月アシラーゼは一応のアジポイル−7−ACAアンラーゼ活性を示すが、上
記に記載した他の酵二工程に有用なアジポイルアシラーゼに関する本発明の範囲
は、候補の酵素がアジポイル−7−ADCAからアジポイル側鎖を開裂すること
ができるかどうかで決定され、それは、上記で詳述したように容易かつ確実に決
定することができる。
他の方法により適するアジポイルアシラーゼを見出すことは可能である。例えば
、EP^−A−0453048は、PteadoIIonss 5Y−77−1
により生産されるグルタリルアシラーゼのアジポイル開裂活性の改善方法を記載
している。α−サブユニット内の特定位置の種々のアミノ酸を置き換えることに
より、(アジポイル−セリンからの)アジポイル開裂速度が3〜5倍高まるのが
認められた。そのような改善された酵素も本発明での使用に適する。
なお、EP−A−04530411は、確かにアジポイル側鎖に対する活性が改
善されたアシラーゼを例示しているが、アジポイル−セファロスポリンをまず生
成させる(化学的または本明細書に記載した方法と類似したI化学的方法による
)方法は全く記載してい工
以下に本発明の好ましい態様について詳細に記載するが、これらは説明のための
ものに過ぎず、本発明はこれらの態様によって限定されるものではない。
実施例l
Pen1cilliIls chry+ogenai培養条件これらの方法で使
用するPcnicilliam ch+y+ogenumは、11の蒸留水中に
ラクトース−水和物1.5%(w/v)、コーン浸出液0.5%(v/v)、ペ
プトン0.5%(W/ V )、NaCl 0.4%(w/v) 、MgSO4
−7H200,05%(vr / v ) 、K HP O40、06%(W/
V)、FeC1・6H00,0005%(W/v)、CuSO4・58200.
0002%(W/V) 、寒天3.0%(W/V)を含むLC3B培地(pH4
,8)を含む平板上に保持した。
25℃、相対湿度65%で12日間後、単集落を取り出し、ガラスピーズを含む
ねじ栓付き試験管中の蒸留水2mlに添加した。増殖培養物をかきまぜて解離し
た後、その懸濁物を使用してライスフラスコに接種した。ライスフラスコは、3
〜4倍体積の蒸留水で7分間洗浄し、30秒ごとに混合した後、米の水の吸収が
約25%になるまで排水した、天然長粒種の1lncleBen転換米を25g
/250mfフラスコで含んでいた。25℃、湿度65%で12日間後、50m
1の滅菌水で胞子をその米から洗い流した。その胞子懸濁物を使用して液体培地
に接種し、また、4℃で貯蔵するために培養液の親液性を付与した。
胞子を同体積の5%スキムミルクに添加し、滅菌アンプル中に凍結乾燥した。
ペニシリンの生産またはRNAもしくはDNA源としての菌糸体の生産のために
、菌株を振とうフラスコ中で2段階醗酵した。接種段階は、11の蒸留水にグル
コース3.0%(W/v ) 、ph&+mtmedi* l 、0%(W/V
) 、コーン浸出液3.0%(V/V) 、硫酸アンモニウム0.2%(W/V
)、Ca Co 30 、 5%(w/v) 、無水リン酸−カリウム0.05
%(W/V) 、ラクトース1.0%(W/V) 、−次乾燥酵母1.0%(W
/V)を含む培地50mj!1500mjフラスコに1×108胞子を添加する
ことにより開始した。インキュベーションは、直径70mmの円を描いて回転す
る(22Orpm)盤上、25℃、相対湿度65%で行った。
48時間インキュベーションした後、生産段階を、11の蒸留水にKH2PO4
0,05%(w/v)、K2So4o、5%(W/V)、(NH4’) 2So
41.0%(w/v)、ラクトース12.0%(w/v) 、pb*+1scd
目2.75%(W/ v ) 、Ca CO3(沈降)1.0%(W/V) 、
ラード油1.0%(v / v )の組成物を含む培地(pH6,6)35mj
1500mjフラスコに生長能力のある種子2mjを移すことにより開始した。
オートクレーブ後、しかし接種の前に、滅菌した25%アジピン酸ナトリウム(
pH6,6)を添加して最終のアジピン酸ナトリウム濃度を2.5%にした。次
いで、接種後、前段階と同じ条件下で5〜7日間インキュベーションを続けた。
形質転換のため、またはDNA源としてプロトプラストを生成させるために菌糸
体が必要な場合は、その菌株を、1!の蒸留水に50mj!の20 X C1a
flc+bick塩(120g(7)N a 2 N O3,10、4g ノK
Cl −10、4g (D M g S O4++7H20,30,4gのK
H2PO4) 、2.0mAのVo(el微量元素(0,3M(7)クエン酸、
0 、 2 M (’) Z n S O4,25mMのF e (NH) (
S O) ・6 H20110mMのCu5O3mMのMnSO4,8mMのホ
ウ酸、4 ゝ
2mMのNa2M0O4−2H20) 、5gのトリプトン、5gの酵母抽出物
、10gのグルコースを含む完全媒体(CM)50ml /250mlフラスコ
中で生長させた。インキュベーションは、220rpmの回転盤上、25℃で行
った。
上記したように調製した、48時間培養して生長させた植物菌糸体を寒冷紗によ
り濾取し、液体窒素中で凍結し、−夜凍結乾燥した。乾燥した菌糸体を乳鉢・す
りこぎで砂とともにすりつぶし、100mMのLiCj、50mMのEDTA、
10mMのTr i s (pH8,0) 、4%SDSの25r+1に再懸濁
した。その懸濁物を60℃の湯浴中で50〜55℃に加熱した後、その混合物を
、最初にIMのTris (pH8)飽和フェノール、次いでTris飽和フェ
ノール:クロロホルム(1:1、v/v)、次いでクロロホルムで抽出した。同
量の6M冷LIC1を添加し、次いでその混合物を一20℃で2〜3時間保持す
ると、RNAが水相から析出した。4℃、12000Xgで20分間遠心分離し
た後、上澄みを66%(V/V)エタノール溶液にして、−20℃で15分間冷
却すると、DNAが析出した。上述したように遠心分離した後、DNAペレット
を70%エタノールで洗浄し、脱水してTE緩衝液(10mMのTr i 5−
1(CI、pH7,5,1mMのEDTA)に再懸濁した。DNA濃度を、アガ
ロースゲル電気泳動において臭化エチジウムにより染色して、既知DNA基準と
比較することにより推定した。
上記実施例1で記載した?n1cilliIls ehBsogt++amの培
養を、25℃、22Orpmの回転盤上に載せた35m#の醗酵培地中(醗酵条
件は前述した通り)で96時間生長させた。菌糸体を、真空下、Wbslmtn
11フイルターにより濾取し、約50m1の水で洗浄した。直ちに菌糸体をそ
のフィルターからこすり取り、5mlの[破壊緩衝液J (50mMのTris
−HCI。
pH7,4,150mMのNaC1,5mMのEDTA、pH8,0,5%の5
DS)に再懸濁し、液体窒素で凍結し、凍結乾燥した。−夜凍結乾燥した後、0
.1%のDEPCを含む5mlの水および5mAのLM Tr i s (pH
8)飽和フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(50: 50 :
1)を添加し、その混合物を振とうしながら37℃で20分間溶がした。混合
物を4℃、12000Xgで10分間遠心分離し、水相を分離して、最初にIM
のTr i s (pH8)飽和フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコ
ール(50:50:1)、2番目にIMのトリス(p H8)飽和フェノール、
3番目にクロロホルムで再抽出した。同量の6MLiCJを最終的に得られた水
相゛と混合し、その溶液を一20℃で最低4時間放置した。全RNAを4℃、1
2000Xgで20分間ペレット化し、そのペレットを0.3mlのTE緩衝液
+〇、03r+1の3M酢酸ナトリウムに溶解し、2.5倍体積のエタノールを
添加してRNAを両析出させた。最終的に得られたペレットを0、 1mlのT
E緩衝液に溶解し、RNA濃度を、分光光度計による260nmでの吸光度によ
り測定した。
以下の操作で使用する Sl+eplom7ces cl*wulige+u+
菌株は、^TCC27064であった。その菌株を、11の蒸留水に酵母エキス
4g1麦芽工キス10g1グルコース4g、寒天20gを含む(pH7,2)平
板上で維持した。30℃で5日間生長させた後、2mlの滅菌水をその平板に添
加し、培養増殖したものを寒天表面からこすり採った。得られた懸濁物を、ガラ
スピーズを含む滅菌ねじ栓つき管に移した。培養増殖したものを、かきまぜて解
離させた後、その懸濁物を液体培地の接種に使用した。
また、その懸濁物は、最終体積が15%になるまでグリセロールを添加して、−
70℃での永久保存培地に使用した。
形質転換のため、またはDNA源としてプロトプラストを生成させるために菌糸
体が必要な場合は、その菌株を、IIの蒸留水に酵母エキス3g、ペプトン5g
、麦芽エキス3g1グルコース10g5シ*糖340g、MgC1−6H01,
02g、グリシン5g、寒天18gを含むYEME培地200m7/11フラス
コ中で生長させた。インキュベーションは、220rpmの回転盤上、28℃で
行った。
上述したように調製した培地で48時間培養して生長させた植物菌糸体を、22
100Xgで10分間遠心分離することにより集めた。その細胞を10mfのT
E緩衝液に再懸濁し、i Qmgのリゾチームを添加して、その混合物を30℃
で15分間インキュベートした。次いで、1mlの20%SDSを添加し、次い
ですぐに10m7のTE (pH8)飽和フェノールおよび1.5mlの5M−
NaCIを添加して、その混合物を20分間静かに上下動させた。12000X
gで10分間、相分離を行った後、水相を取り出して新しい管に移した。同量の
クロロホルムを添加し、その混合物を10分間静かに上下動させた。再び120
00Xgで1o分間遠心分離することにより相分離を行い、水相を取り出して新
しい管に移した。2倍体積のイソプロパツールを注意しながら添加し、析出した
DNAを取り、最少量のTE緩衝液に再溶解した。RNAアーゼAを添加して最
終濃度を2Qmg7mlとし、その溶液を50’Cで1時間インキュベートした
。次いで、100mMのNaCjおよび0.4%のSDSとともにプロテアーゼ
Kを添加して最終濃度を100mg/mjとし、その混合物を37℃で1時間イ
ンキュベートした。その溶液を同量のTE (pH8)飽和フェノールで再び抽
出し、さらにクロロホルムで抽出した。最後の抽出により得られたDNAを2倍
体積のイソプロパツールを添加した後に取り、その濃度を分光光度計による26
0nmでの吸光度により測定した。
実施例5
遺伝子ライブラリーの構築およびSI+eploBcc+ elswalige
ratDNAを制限酵素BamHIおよび5ailで消化した。消化されたDN
Aを0.8%アガロースゲル上で電気泳動にかけ、1.8〜2.2kbの大きさ
の断片を溶離し、予めBamHIおよび5ailで消化しであるpUci8DN
Aに連結した。
連結混合物を希釈し、電気穿孔法(GencPwl+er、Bio−Rtd。
Richmood、 CA)によりコンピテントJM109細胞に取り込んで形
質転換した。コンピテント細胞の作製および電気穿孔法の条件はともに、製造者
の指示に従った。形質転換混合物を100 m g / m lのアンピシリン
および75m1の2%X−Ga1を含むLB平板上で平板培養した。37℃で一
夜インキユベートした後、組換えコロニーを、プラスミドベクターβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子活性の不活化により無色になることから同定した。無色のコロニ
ーを選んで、100mg/mjのアンピシリンを含む新しいLB平板に移した。
37℃で一夜生長させた後、コロニーをニトロセルロースに移し、複製連鎖反応
により作製した、公開された5lreplosyc!s cl*ralilzr
isエクスパンダーゼ遺伝子配列の52〜918の塩基(Koマ*ceyic
etll、、(19B9) J、 B*ele+io1.171ニア54−76
0;およびU、 S、 5.070゜020〕に対応するプローブとハイブリッ
ド形成させた。複製連鎖反応産物の標識を、(32P)dCTPおよびオリゴ標
識キットを使用し、製造者(Ph*+m5cit、Pi+csl!+ny、 N
ew Ie口ey )の指示に従ってランダムプライマー伸長法により行った。
!−イブリッド形成反応は、1106CPの放射性同位体で標識したプローブ、
30%のホルムアミド、5XSSC(0,15MのNaCf、0.015Mのク
エン酸ナトリウム、pH7)、0.1%のS D S、5 XDeetl息+d
l (5gのフィコール、5gのポリビニルピロリドンおよび5gのBSA (
500mAの50Xストツク用))および100mg/mjの牛胸腺DNAの存
在下、37℃で一夜行った。いくつかの形質転換細胞がプローブと強くハイブリ
ッドを形成した。うち1個のコロニーについて、制限酵素分析によりエクスパン
ダーゼ遺伝子を有するベクターを含むことが確認され、このプラスミドをpFT
so−1と命名した。
実施例6
プラスミドDNAの単離
プラスミドを含むE、eoli培養液を500m1のLB培養液(20g/jの
り、B培養液ベース) (Gibco、 Ps口1ey。
5collsnd)中で、15mg/miのテトラサイクリンとともに、37℃
、22orpmの回転盤上で12〜16時間生長させた。
4℃、40ooxgで10分間遠心分離することにより細胞をベレット状にした
。その細胞ベレットを18m1のグルコース緩衝液(50mMのグルコース、2
5mMのTris(pH8,0) 、10mMのEDTA)に再懸濁し、40m
g/mAのりゾチーム(51gm5. St、Loai+、 MO) /グルコ
ース緩衝液を2ml添加して混合し、その混合物を室温で15分間インキュベー
トした。新しく調製した0、2NのNaOHおよび1%のSDSの溶液を40m
1添加し、その混合物を静かに攪拌して氷上に10分分間−た。次いで、5Mの
酢酸カリウム(pH4−8)30mJを添加して十分混合し、得られた混合物を
氷上にさらに10分分間−た。細胞片を、4℃、4000Xgで10分間遠心分
離することによりペレツト化し、得られた上澄みを寒冷紗フィルターにより濾過
した。プラスミドDNAを析出させるためにイソプロパツール(0,6倍体積)
を透明な上澄みに添加し、室温で20分間インキュベートしている間に析出物が
生成した。プラスミドDNAのベレット化を4℃、4000xgで20分間行い
、次いで、70%エタノールで洗浄して軽く乾燥した。そのベレットを9mlの
TE緩衝液に再懸濁した後、LogのCsC1およびLong/m#の臭化エチ
ジウム溶液0.387m1を添加した。この溶液を313.1100Xで24時
間遠心分離した。塩化セシウム勾配において得られたプラスミドのバンドを紫外
線により可視化して単離した後、臭化エチジウムを抽出用の飽和ブタノール水溶
液により除去した。次いで、プラスミドの作製に使用したC5Cj+をTE緩衝
液に対する透析により除去し、最後にDNAをPEG (MW8000)を使用
して濃縮した。DNAの濃度は分光光度計による260nmでの吸光度により測
定した。
Penicilliam形質転換ベクターは、優性選択マーカーとしての7レオ
マイシン耐性遺伝子を入れて構築した。これは、まず、フレオマイシン耐性遺伝
子(SI+eploslloleichatbindusltnai由来のフレ
オマイシン結合蛋白遺伝子)を含み、酵母シトクロムC1ターミネータに結合し
た66Qbp断片を、BamHI/Bglllで消化したプラスミドpUT71
3(CAYLA、TowlowsCCtdex、Fr5acs )からアガロー
スゲル上で電気泳動して溶離することにより単離して行った。単離した断片はベ
クターpsELEcT 1 (1’τomBSCDIIIO口Lion )のB
amHT部位に連結し、遺伝子の方向は制限酵素分析により決定した。次に、λ
付着末端部位を含む550bpのPstT断片を挿入して、適切な大きさの挿入
配列を含む場合はそのベクターを使用してニスミドが形成できるようにした。次
いで、?nicillium cbrYIoHt*atxイソペニシリンNシン
セターゼ(IPNS)遺伝子のプロモータ領域を含む1.5kbのNcor/B
amHr断片を、Near/BamHIで消化したI PNS遺伝子を含むゲノ
ムクローンから(アガロースゲル上で電気泳動して溶離することにより)単離し
た。単離したIPNS−プロモータ断片をBamHI/Ncolで消化したベク
ターに連結した。Nco1部位は、フレオマイシン耐性遺伝子のATG開始コド
ンにある。このベクターをpUTZ−2と命名する。
5lteplosyc!s cl*waliB+utエクスパンダーゼ遺伝子を
含む1.645kb断片をBamHIおよび5allで消化したpFTso−1
(前述のベクター)から、0.8%アガロースゲル上で電気泳動して溶離するこ
とにより精製した。単離した断片は、やはりBamHIおよび5altで消化し
たベクターp S E L E CT (P+omeHCorpo+5lion
)に連結した。このベクターは、pFTso−8と命名した。新規Nco1部
位を、^Hired 5ites +a を目ro突然変異誘発系(P+o*t
g畠Cotpor*目on )を使用したpFTso−8の部位特異的突然変異
誘発によりエクスパンダーゼ遺伝子のATG開始コドンに作った。突然変異誘発
は、製造者の指示に従って行った。オリゴヌクレオチドは、Hrzplo■7e
elエクスパンダーゼ遺伝子の公開された塩基配列(K++wscewic t
l if、、f19H) journal ofoleleriologF、1
71. p、3952−3958)由来のATG開始コドンにあるDNA領域の
コード配列と相補的であるように構築した。
オリゴヌクレオチドの合成は、シアノエチル ホスホラミディト化学(Pb轟n
+5ci1GsIIe^s+1bler 1nslro++enfr目on)に
より行い、オリゴ塩基配列は次の通りであった。
配列番号、8
S’ CGAGAGG^丁CAGTGAGAG丁CCATGGACACGACG
G 3’突然熱度誘発は、制限酵素分析により確認した。次に、Pc++ici
llism chBtoHs++wmイソペニシリンNシンセターゼ遺伝子のプ
ロモータ領域を含む1.2kbのNcoT断片を、I PNS遺伝子を含むNc
olで消化したゲノムクローンから(アガロースゲル上で電気泳動して溶離する
ことにより)単離した。I PNS−プロモータ領域は、エクスパンダーゼ遺伝
子のATG開始コドンに突然変異誘発により作ったpFTs。
−8ベクターの新規Neo T部位に連結した。プロモータのエクスパンダーゼ
遺伝子に対する方向は、制限酵素分析により確認した。次いで、IPMS−プロ
モータ:エクスパンダーゼ遺伝子カセットをBamHI/5ail断片として、
上述したPtn1cilliaa+形質転換ベクターpUTZ−2のBamHI
/5ail切断部位に移した。最終的な構成物をpPenFTsoと命名した。
実施例8
Penicillilβ−チューブリンプロモータのクローン化Pe++1ci
lli*sβ−チューブリン遺伝子を、ハイブリッド形成プローブとして^+p
tBil1w+ a目!rβ−チューブリン遺伝子を使用して、 Peeici
lliwm λゲノムライブラリーからクローン化した。このクローンの配列決
定および^5peBilli+ l1i(srのβ−デユープリン遺伝子の既知
アミノ酸配列との比較により、ATG開始コドンで始まる91%の相同率の領域
があることが確認された。機能性プロモータを含む配列が、開始コドンと1.4
kb上流のBamH1部位との間で単離された。
Ptn1cilliusβ−チューブリンプロモータを有する形質転換ベクター
の構築
Pen1cillinsβ−チューブリンプロモータを含む2.0kbのXba
I/Hf nd III断片を、やはりXbal/Hind111で消化した
ベクターp S E L E CT (Pro@@!s Corporatio
Ll)に連結した。新規Nco1部位を、AItered 5ites +n
witr。
突然変異誘発系(P+oweICo+po+l1ioa )を使用した部位特異
的突然変異誘発によりATG開始コドンに作った。突然変異誘発は、製造者の指
示に従って行った。オリゴヌクレオチドはATG開始部位領域に対して相補的に
構築したが、NcoT部位を作るため崖変更をいくつか挿入し、突然変異誘発の
ためにり
使用した。オリゴヌクレオチド合成は、シアノエチル ホスホラミディト化学(
Phttatc目Gc++s^++tabler i+++l+uaCntsl
io口)により行い、オリゴ塩基配列は次の通りであった。
配列番号、9
5′ ^TCTCTTT丁CT^^TACCTTCACCATGGGTGAGA
TTGTACGTGA丁CCC3’突然熱度誘発は、制限酵素分析により確認し
た。次に、Pc口icilliamβ−チューブリンプロモータを含む1.4k
bのB a m HT / N c o I断片を、BamHI/NcoTで消
化したベクターpFTso−8(前記実施例7に記載したベクター)においてs
’l +BIO1yctlエクスパンダーゼ遺伝子のATGに作ったNco1部
位に連結した。このベクターをbtFTso−8と命名した。β−チューブリン
プロモータを含む1.4kbのBamHT/NcoT断片はまた、B a m
HI / N c o Iで消化したベクターptJTZ−2(前記実施例7に
記載したベクター)にも連結した。この連結により、フレオマイシン耐性遺伝子
のすぐ前にβ−チューブリンプロモータが位置した。このベクターはpC[−6
と命名した。次に、β−チューブリンプロモータエクスパンダーゼ遺伝子カセッ
トを含む、ベクターbtFTSO−8由来の2.4kbのBamHI/Hind
III断片をBamHI/Hind IIIで消化したベクターpcI−6に
連結して、最終的なPen11111mm形質転換ベクターを得た。
このベクターにおいて、SlreplomytesエクスtZンダーゼ遺伝子お
よびフレオマイシン耐性マーカーをβ−チューブリンプロモータから発現させた
。このベクターをpTS−2と命名した。
実施例9
Penicillium (GAP)プロモータのクローン化Penicill
iumグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAP)遺伝子を、
^+peBillus nl(e+由来のGAP遺伝子をハイブリッド形成プロ
ーブとして使用することにより、Ptn1cilliu+eλゲノムライブラリ
ーからクローンイヒした。陽性の可能性がある4個のクローンについて、Cep
helo+po+iumGAP遺伝子(Kimuz、 Fl、 sl +1.、
(19911,1,Fe【n、 5adBiotB、、 Tl、 145−15
0)の5′領域のプライマーから生じたPCR産物によりさらに探索した。複製
連鎖反応(F’(1,R)のプライマーに使用したオリゴヌクレオチドは、シア
ノエチルホスホラミディト化学(Ph*+m畠eiIGene As+!mbl
e+Ill自r*5caNlion)により合成し、オリゴ配列は次の通りであ
る。
配列番号;10
S’ CGCGGA丁CCCGGCATCAACGGCTTCGGTCGTAT
3’配列番号11
5’ CGCG+、ATCCGGGCACGCGCATGGACATGCCAG
TG 3’4個の陽性と目されたクローンの1個が、PCR産物とクロスハイブ
リッド形成した。このゲノムクローンのBamHI断片(4k b)を、配列決
定目的でBamHIで消化したベクターp S E L E CT (Pron
egICo+po+5lion )に連結した。このベクターをpTs−c)と
命名した。この断片を配列決定すると、セファロスポリンGAP遺伝子の既知配
列との比較によりATG開始コドンが確認された。
Psnieilliwm (GAP)プロモータを有する形質転換ベクターi豊
!
Pen1cillins G A PプロモータにSl+eplom7cesエ
クスパンダーゼ遺伝子を入れるために、ベクターp”rs−oを使用したin
vitro部位特異的突然変異誘発により新規NcoT部位をPe口icill
iwm G A P遺伝子のATGに作った。突然変異誘発は、製造者の指示に
従って行った。オリゴヌクレオチドは、GAP遺伝子のATG開始コドンのDN
A領域をコードする配列に相補的であるように構築したが、Nco1部位を作る
ために塩基を変えて挿入した。オリゴヌクレオチドの合成はシアノエチルホスホ
ラミディト化学(Phsr++*ei* Gtlle AIIemb1eti!
1tlrt■e++j*liom )により行い、オリゴ配列は次の通りである
。
配列番号:12
5’ CAGTAA^CGCAACC^丁GGTTGTCCAG 3’突然熱度
誘発は、制限酵素分析により確認した。次に、GAPプロモータを含むpTs−
0のNcol/BamHr断片(1,9kb)をNcor/BamHIで消化し
たベクターpFTso−8(上記実施例7に記載のベクター)に連結し、Slr
+plom7e1エクスパンダーゼ遺伝子とともにGAPプロモータの位置付け
た。このベクターをpTs−o−tと命名した。
次に、GAPプロモータ:エクスパンダーゼカセットを含むp”rs−o−iの
BamHI/Hind III断片(3,0kb)をBamHr/Hind I
IIで消化したベクターpcI−6(上記実施例8に記載のベクター)に連結し
て、GAPプロモータからSltξ1lllll17ellエクスパンダーゼ遺
伝子が発現する最終的なPen1cillins形質転換ベクターpSD−1を
得た。
実施例10
?nicilliwm cbB+oltn*iの形質転換上記Pznieill
iam chBsogtnam菌株由来のプロトプラストを、25℃、220r
pmの回転盤上で67時間、50m1のCM培養液に1×107個の胞子を接種
することにより生成させた。
菌糸体を寒冷紗上に濾取し、500mj!容フラスコに移し、100mgのNo
yot7me 234fNovo BioLsbs、 Bsgst*e+d、D
en+u+k)を含む25m7のKMP (0,7MのKCl50.8Mのマン
ニトール、0 、 02 M (D K P O4、p H6、3) l: 再
懸11+1 シ、30℃、1100rpでインキュベートした。スフェロプラス
トを寒冷紗/グラスウールフィルターでの濾過により分離し、350Xgで10
分間遠心分離することによりペレット化した。
次いで、スフェロプラストを10mfのKMP緩衝液で3回洗浄し、KMPC(
50mMのCa C12を有するKMP)に再懸濁して5X107細胞/ m
lの濃度にし、室温で20分間放置した。Pen1cillins (D形質転
換のために、200rr+1のスフ二ロプラスト懸濁物を、50m/のPPC(
40%PEG。
MW3500.20mMのKPO4,pH6,3,596Ca C12は使用直
前に添加した)とともにDNA (5mg/mlヘパリンを含む5mgのベクタ
ーDNA/6.2mgのKMPC)に添加し、形質転換混合物を氷上で30分間
インキュベートした。新しく調製したPPC1mj!を添加し、その混合物を5
0mjの溶融した(50℃)再生寒天(CM+1.3Mのマンニトールおよび3
%寒天)に移した。次いで、形質転換混合物を5枚のペトリ皿に分配した。25
℃で24時間再生した後、プレートに、100mg150mg OL (1%ペ
プトン/1%寒天)゛のフレオマイシンを含むOLを上塗りした。上塗りの量は
再生寒天の量に等しい。プレートは、25℃で7〜14日間インキュベートし、
形質転換コロニーの発生を観察した。
高性能液体クロマトグラフィー(HP L C)を使用して、使アジポイル−7
−ADCAの生産の分析を行った。その分析は、625溶媒供給システム、22
0nmおよび254nmにセットした490E可変波長検出器、8251tls
データシステムおよび固定相としてのNovo−C−18カラムを有するWN!
++システムで行った。移動相(流量は1m1/分)は、2%メタノール/79
8%のO,OIOM−KH2PO4によるインクラティク溶離を5分間、2→4
0%直線勾配のメタノール10.010M−KH2PO4、pH7,0を15分
間とした。アジポイル−6−APAの定量は、220 n mでの標準ペニシリ
ンNの基準線を使用してめ、アジポイル−7〜ADCAの定量は254nmでの
標準デアセトキシセファ0スポリンの基準線を使用してめた。
アジポイル−6−APAおよびアジポイル−7−ADCAのペニンリナーゼ処理
に対する感受性の分析を、濾液に1単位/mlのベニシリナーゼIまたはペニシ
リナーゼI11を添加し、室温で10〜30分間インキュベートすることにより
行った。
これらのサンプルを、上記と同じHPLC条件下で分析した。
アジポイル−6−APAおよびアジポイル−7−ADCA物質のUVスペクトル
分析を510溶媒供給システム、99oフオトダイオードアレイ検出器、990
データシステム″および固定相としてのNovo−C−18カラムを有するWs
te目シスデシステムして行った。使用した移動相は上記と同じ条件であった。
全醗酵培養液からのアジポイル−7−ADCA物質の大規模な単離を、510溶
媒供給システム、9907オトダイオードアレイ検出器、990データシステム
および固定相としてのmBolIdxp*k C18予備カラムを使用した1l
llcrtシステムを使用し。
て行った。移動相(流量は5m17分)は、0.010M−KH2PO4,pH
7,0によるイソクラティク溶離が35分間であった。アジポイル−7−ADC
A物質の保持時間に対応する吸収ピークをフラクションコレクターにより集めた
。
寒天拡散バイオアッセイを使用して、HPLCにより単離したアジポイル−6−
APAおよびアジポイル−7−ADCA醗酵物質の抗生活性を測定した。2Qm
lの単離物質を、LB寒天平板培地(B&tillo+ 5ablilu+ A
TCC336?7またはE、coli超感受性感受性菌株of、 A+nold
L、 Demtin、 MITからの提供)を接種した3%寒天(Gibeo
、 Ps目1e2. 5col11nd)を有する20g/+ablilosを
アジポイル−6−APA物質を分析するための指ADCA物質を分析するための
指示菌株として使用した。37℃で15時間インキュベートした後、ディスク周
辺の指示細菌の生長が半分阻害されると、その物質が生理活性を有することを示
す。この実験におけるコントロールは、デアセトキシセファロスポリンC1セフ
ァロスポリンC1ペニシリンVおよびβ−ラクタム構造確認のためのコントロー
ルとしてのベニシリナーゼを含んだ、または含まない寒天であった。
全醗酵培養液から精製したアジポイル−7−ADCA物質を、RAEV酵素(R
AEV Carp、から市販されたもの)の比活性を測定するための基質として
使用した。0.16MのKH2PO4に10mMの基質、1mgのRAEV酵素
、5%のグリセロールを含む全体積50m1の反応混合物を37℃でインキュベ
ートした。0.1.3.5.10.20および30分後に5mlずつ取り、35
m1の0.OIOM−KH2PO4、ptT3.5で希釈して一70℃に冷凍し
た後、前記条件下でのHPLC分析を行った。
比色用のアジポイル−p−アミノ安息香酸基質に対するRAEV酵素の活性を、
0.065M(7)KH2PO4、pH7,0に5mMの基質、8.25mgの
RAEV酵素、10%のグリセロールを入れて全体積50m1とし、これを使用
して37℃で30分間分析した。反応は、96ウエルのマイクロタイターディツ
シュで行った。1/100に希釈したIMのN a N O2/ 0 、 25
M酢酸を50m1添加して反応を停止し、その反応物を室温で3分間放置した
。Long/mjの4−アミノ−5−ヒドロキシ−2,7−ナフタレン−ジスル
ホン酸−ナトリウム塩水和物/水を0.5MのN a HCO3で1/100に
希釈し、その100m7を添加して、EL312Bio−Kinelic+ P
IIle Re5der (BioTek In5trisenls)により5
15nmですぐに発色をモニターした。
アジポイル−7−ADCA基質を使用したR ’、 E V酵素(RAEV C
orp、から市販されたもの)分析を全てHPLCでモニターしたが、これは、
625溶媒供給システis 203nmおよび254nmにセットした490E
可変波長検出器、825i1sxissデータシステムおよび固定相としてのN
oマo−Cl3カラムを有するWelt目シスデシステムして行つた。移動相(
流量は1 mA /分) ハ、2%メタノール/98%+7)O,OIOM−K
HPO、pH3,5によるイソクラティク溶離を5分間、2→40%直線勾配の
メタノール10.OIOM−KH2PO4,pH3,5を15分間とした。反応
物質の保持時間をモニターするために標準7−ADCAを使用した。反応物質の
定量は、254nmでの標準7−ADCAの基準線を使用してめた。
’C−NMR(広幅プロトンデカップル)スペクトルを、フーリエ変換方式のI
BM−AF−350分光器ニより75.4MHz(7、IT)でめた。サンプル
は、0.5mlのD20(99,8%D 、 AIl+ieh )または0.5
mlのDMSO−d6 (99,O%D 、 Ald+ich )における醗酵
培養液から得た50mgのアジポイル−7−ADCA物質から成り、350″″
にで5mmの管に入れた。NMRデータにより、その物質がアジポイル−7−A
DCAであることが確認された。
実施例16
別のアジポイルアシラーゼ酵素の評価
RAEV酵素を使用した研究の他に、アジポイル−7−ADCA (および他の
アジポイル化合物)からのアジポイル側鎖の脱離を、種々の微生物源から得た酵
素により例証した。
最初の研究では、?emdog+oigs n If株SE−[13および5E
−495(日本国微工研に各々、FERM BP−H〕およびFEIIM BP
−1118の受託番号で寄託されている。)ならびにPsegdo■0■@菌株
5T−77−1(the No+lbe+a Re1ionsl R55est
ch L*bortloryにNNILB−11070の受託番号で寄託されて
いる。)を、2.0%(W/V)のH7Ci+e SF s O,5%(W/V
)のグルタミン酸−ナトリウム、0.5%(W/V)の酵母エキス、0.2%(
W/V)のコーンステイープ粉末、0.5%(W/V)の綿実油および0.1%
(W/V)のグルタル酸を含む培地で72時間生長させた。細胞を遠心分離によ
り集め、50mMのリン酸塩緩衝液、pH8,0で洗浄した後、緩衝液に再懸濁
し、少量のクロロホルムを添加することにより外膜を透過性にした。次いで、細
胞懸濁物の一部をアジポイル−p−ニトロアニリン(ad−PNA)と混合し、
30℃で2〜18時間インキュベートした。
インキュベージタン後、その混合物を10%(V/v)の酢酸を添加することに
より酸性にした。遊離したp−ニトロアニリンを次いで、γ−グルタミルートラ
ンスフェラーゼ(Sifs*製品番号545−A )の分析用の試薬(キット型
、Si(i8Cbemic81Co■pH製)を使用してジアゾ化合物に変換し
た後、比色法により検出した。3種類の菌株の相対的活性は、各々、5E−49
5,5E−83おヨヒ5T−77−11,m対し7100%、85.5%および
48%であった。上記RAEV酵素に対して記載したものと同様の方法を使用し
て、SF−83および5E−495酵素のアジポイル−7−ADCAに対する活
性も示された。5Y−77刊のアジポイル−7−ADCAl、jlするデアシル
化活性は、この菌株がβ−ラクタマーゼを生成するため、示すことができなかっ
た。
同様にして、2種類の真菌性菌株(AIlernsris sp、M^−133
、^TCCNo、20492およびAsperlilli+ +p、MA−H1
ATCCNo、20491 ;U、 S、 4.141.70 (明治製菓)参
照)およびIt、 S、 3.239.394(Lrek & Co、、Inc
、 )にセファoスポリンCアシラーゼ生産源として記載されている3種類の別
の細菌性菌株(B+*tib*cls+iwm、^TCCNo、14,649
; ^chro@obzelt+ins、^TCCNo、 14.648 ;お
よびN*tob*cltriom、^TCCNo、 14.650)についても
、アジポイル−アシラーゼ産生が示された。
配列番号:1
配列の長さ=14
配列の型:核酸
トポロジー;直鎖状
配列の種類: Ge++omic DNA配列
配列番号:2
配列の長さ=16
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類: Gt@omit DNA配列
GTGAGAGTTG ATGGAC
配列番号:3
配列の長さ:16
配列の型二核酸
鎖の数二二末鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類: Gtsomic DN^配列
τCTAGACACT ATCGAC
配列番号:4
配列の長さ=16
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類: G<aomic DN^配列
τCTAGACACCATGGAC
配列番号=5
配列の長さ=22
配列の型二アミノ酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
Leu Leu Leu Gin Asn Pr。
配列番号二6
配列の長さ、22
配列の型二アミノ酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー二直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号ニア
配列の長さ・22
配列の型二アミノ酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
配列番号:8
配列の長さ、34
配列の型:核酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類二Gs++omie [lNA配列
CGAGAGCATCAGTGAGAGTCCATGGACACG ACGG配
列番号:9
配列の長さ=47
配列の型:核酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類: Geeomic DN^配列
配列番号=IO
配列の長さ:33
配列の型:核酸
鎖の数ニー重鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類: Gceomic DN^配列
CGCGGAτCCCGGCATCAACG GCTTCGGTCG TAT配
列番号:11
配列の長さ:34
配列の!!:核酸
鎖の数ニー重鎮
トポロジー a鎖状
配列の種II : G@*o*ic DNA配列
配列番号:12
配列の長さ:26
配列の型:核酸
鎖の数ニー重鎮
トポロジー:直鎖状
配列の種類: G■osic DNA
配列
CAにTAAACにCAACCATGCTT GTCCAG補正書の写しく翻訳
文)提出書(特許法第184条の7第1項)
Claims (10)
- 1.7−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸(7−ADCA)を製造する ための新規生化学的方法において、下記工程: 1)イソペニシリンNを産生するPenicillium chrysogen um菌株を、それが生育できる培養培地中で維持し、該培養培地にアジピン酸ま たは該Penicillium chrysogenum菌株によって同化・利 用され得る1種以上のその塩およびエステルを含むアジペート源を添加してアジ ポイル−6−アミノペニシラン酸(アジポイル−6−APA)を製造する工程で あって、該Penicillium chrysogenum菌株は、アジポイ ル−6−APAを基質とすることができるエクスパンダーゼ酵素の活性をコード するDNAによって形質転換されており、その酵素の発現に際し、該菌株によっ て産生されたアジポイル−6−APAがinsituで環拡張されてアジポイル −7−ADCAを生じる工程;および 2)該アジポイル−7−ADCAをアジポイルアシラーゼと接触させることによ りアジポイル側鎖を脱離して7−ADCAを生成し、次いで該物質を単離する工 程を含むことを特徴とする生化学的方法。
- 2.アジペート源がアジピン酸二ナトリウムであることを特徴とする請求項1に 記載の生化学的方法。
- 3.エクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDNAがStreplomyce s clavuligerus ATCC27064に由来することを特徴とす る請求項1に記載の生化学的方法。
- 4.アジポイルアシラーゼがPsendmonas属に由来することを特徴とす る請求項1に記載の生化学的方法。
- 5.Streplomyces clavuligerus ATCC2706 4に由来するエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDNAおよび該エクスパ ンダーゼ酵素の活性をコードするDNAの発現を促進するPenicilliu m chrysogenum IPNS遺伝子のプロモータを含む組換えDNA 発現ベクター。
- 6.プラスミドpPenFTSOを含むことを特徴とする請求項5に記載の発現 ベクター。
- 7.Streplomyces clavuligerus ATCC2706 4に由来するエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDNAおよび該エクスパ ンダーゼ酵素の活性をコードするDNAの発現を促進するPenicilliu m chrysogenum IPNS遺伝子のプロモータを含む組換えDNA 発現ベクターで形質転換したPenicilliumchrysogenum宿 主細胞。
- 8.発現ベクターがプラスミドpPenFTSOを含み、PC100、ATCC ______であることを特徴とする請求項7に記載の形質転換宿主細胞。
- 9.遺伝子発現に適する条件下で組換えPenicilliumchrysog enum宿主細胞を培養する工程を含み、該組換え宿主細胞がStreplom yces clavuligerus ATCC27064に由来するエクスパ ンダーゼ酵素の活性をコードするDNAおよび該エクスパンダーゼ酵素の活性を コードするDNAの発現を促進するPenicillium chrysoge num IPNS遺伝子のプロモータを含む組換えDNA発現ベクターを含むこ とを特徴とする方法。
- 10.組換え宿主細胞がプラスミドpPenFTSOから成る組換えDNA発現 ベクターを含むことを特徴とする請求項9に記載の方法。
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