JPH07501931A - ７−ａｄｃａの生化学的新規製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、市販のセファロスポリン系抗生物質を製造するための合成方法の分野 に関する。該抗生物質の数は現在、かなり多く、これらの治療物質は現在、第４ 世代にある。市販のセファロスポリン系抗生物質には種々の多数の側鎖があり、 セファロスポリン系抗生物質の経済的重要性が大きいことから、種々のセファロ スポリン系抗生物質の合成を容易にする重要中間体のより経済的で効率的な製造 方法の達成に対する重要性が高まついてる。

これらの重要中間体の一つは７−アミツデスアセトキシセフアロスボラン酸（７ −ＡＤＣＡ）であり、下記式：で表すことができる。現在、７−ＡＤＣＡはペニ シリンＧから製造されるが、ペニシリン理系の５員環からセファロスポリン系の 特徴である６員環へ広げるには４または５個の化学工程を必要とする。全合成の 場合の常として、この方法には重大な欠点がある。とりわけ、複雑な多段工程を 必要とし、試薬が高価であり、かなりの量の創成物が生じるため排出液の処理が 問題になり、また、化学処理を施す前にかなり不純な出発物質の精製を要するこ とが挙げられる。従って、環の拡張および側鎖の開裂を酵素的に行って、現在使 用されている化学的方法よりも経済的に７−ＡＤＣＡを製造する微生物または醗 酵による方法に関する研究が進行している。

従って、本発明は特に、重要なセファロスポリン中間体である７−ＡＤＣＡの製 造分野に関し、とりわけ、？−ＡＤＣＡの生化学的製造方法の分野に関する。

今日まで、７−ＡＤＣＡの生化学的取得を成功させるための研究は大部分が徒労 に終わっており、商業的規模での製造法に関しては特にそうである。例えば、直 接醗酵により、および／またはペニシリンＧを酵素処理することにより、？−Ａ ＤＣＡを得るために必要な環の拡張を別にして、６−アミノペニシラン酸（６− ＡＰＡ）を製造することは可能であるが、不幸なこまたはＳｌｒ＊ｐｌｏＢｔｃ ｓ属の酵素は、６−ＡＰＡを基質として受け入れない。公知文献ではＤＡＯＣ３ またはエクスパンダーゼ酵素と総称しているこれらの酵素を、ここ、ではペニシ リン型分子に見られるペナム環構造をセファロスポリン類に見られるセフ−３− エム環に拡張するのを触媒する酵素として定義する。以後、これらの酵素は「エ クスパンダーゼ酵素」と称する。

エクスパンダーゼ酵素が作用する基質はペニシリンＮであり、これは、環が拡張 されるとデアセトキシセファロスポリンＣ（ＤＡＯＣ）になる。この場合、７− ＡＤＣＡを得るためには、（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖を開裂するだけで よいが、この側鎖は、酵素開裂に対して頑強に抵抗して、許容されないほどの低 収量しか得られないことがわかっている。

本発明によれば、ペニシリン化合物（アジポイル側鎖を有する）を新規醗酵法に より高力価で製造する効率的な生化学方法を達成することができる。そして、該 ペニシリン化合物は、ペニシリン化合物を産生ずる同一の微生物をエクスパンダ ーゼ酵素系をも発現するよう形質転換すると、それによって１ｎｓｉｔｕで産生 されるエクスパンダーゼ酵素系の許容可能な基質である。エクスパンダーゼ酵素 は、ペニシリン化合物の環を拡張してセファロスポリン化合物が高収率で得られ るように作用する。この第二の必須工程で重要なことは、ペニシリン化合物、こ こではセファロスポリン化合物の側鎖が、別の酵素により驚くほど高収率で脱離 可能であることである。本発明の一部をなすこの独自の生化学方法は、予期しな かったことに、７−ＡＤＣＡが驚くほど高収率で製造されるという結果をもたら す。

２、従来技術の簡単な説明 Ｃ■１ｖ−ｅｌｆ　ｅｌ　＊１．、　１ＩＩＣ＠＋＋　Ｇｅ＋＋ｅｌ　＋１９９ ０）　１７４１３−２２１は、ペニシリンＶの環を拡張した後、得られたデアセ トキシセファロスポリンＶを酵素的に加水分解することにより７−ＡＤＣＡを製 造する生化学方法を提案した。この提案は、Ｓ、ｃｌｓマａｌｉｇｅｒｌｓ由来 のクローン化したペニシリンＮエクスパンダーゼ遺伝子（三エユＥ）が入手可能 であることに基づいている（Ｋｏｙ＊ｃｃマ目ｅｌ　＋１．、Ｊ、ｈｃｌｅｒｉ ｏｌ、（１９８９）　１７１ニア５４−７６０およびＵ、　Ｓ、　５．　＋１７ ０゜０２０）。しかし、そのエクスパンダーゼは、天然基質であるペニシリンＮ には作用するものの、ペニシリンＶには作用しないので、その提案は、ペニシリ ンＶの環拡張を行うことができるような修飾エクスパンダーゼ遺伝子が得られる ような遺伝子処理を必要とする。必要な修飾は、Ｃｒｎｌｗｅｌｌ　ｃｌ　＊ｌ 、では達成されておらず、Ｓ＋＋ｅｐｌｏｓ７ｃｓｔ　ｃｌｉｗ＋＋ｌ１Ｈｅ＋ ａ＋由来のｃｅｆＥ遺伝子により　？ａｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｂＢｉｏｌｅ■ｓ を形質転換し、ＤＡＯＣ３（エクスパンダーゼ）酵素を低レベルで発現すること に成功したに過ぎない。

エクスパンダーゼ酵素は、その活性および遺伝子配列の両方に関して十分研究さ れている。例えば、Ｉｌ、Ｓ、　４．５１０．２４６および４、５３６．４７６ 　（以上、Ｗｏｌｔｒ　）では、サイクラーゼ、エピメラーゼおよび環拡張酵素 が、ＨｒｅｐｌｏｌＹｃｅｔ　ｃｌ＊ｖ＋＋ｌｉ！ｓｔｗｔを含む、原核生物の β−ラクタム産生微生物の無細胞抽出物から別々に単離されて、安定な酵素試薬 が得られた。ＥＰ−Ａ−０３６６３５４には、Ｓ、ｃｌＩマ５ｌｉｌｅｒａｓか ら単離・精製したエクスパンダーゼ酵素が記載されており、該酵素は末端残基お よびアミノ酸組成物などで確認され、約３４，６００ダルトンの分子量を有する と言われている。しかし、これは、Ｕ、　、５．４．５３６．４７６では同一酵 素であると思われるものの分子量が２９．０００になっており、対照的である。

ＥＰ−Ａ−０２３３７１５は、Ｓ、　ｃ１ｗ＋＋Ｉｉ（ｓｒｗｔから得らレルエ クスパンダーゼ酵素の単離およびエンドヌクレアーゼ制限酵素による制限地図作 成、該酵素の宿主での形質転換および発現、ならびに該酵素を使用したペニシリ ンＮ基質の環拡張の実例を開示している。υ、　Ｓ、　Ｓ、　０７０．１１２０ は、Ｓ、　ｃｌ＊ｔｗｌｉ（ｅｒｗｓから得られルエクスパンダーゼ酵素をコー ドするＤＮＡ配列を開示しており、また、Ｆ、　ｅｂｒ７Ｉｏｔｓａｗ−菌株を 該ＤＮＡ配列を含む発現ベクターにより形質転換してエクスパンダーゼ酵素を発 現させることを記載している。この酵素はペニシリンＮ以外の基質の拡張にも有 用とされているが、そのような拡張の実例はない。

上述した研究は、原核生物Ｓ、ｃｌＩマｔｌｉＩ＊ｒｓｓから得られるエクスパ ンダーゼ酵素に集中している。この同一の酵素または少なくとも見かけ上同じ環 拡張活性を有する酵素は、真核生物Ｃｅｐｋ＊ＩｏＢｏｒｉｓｓ　ｓｃｒ！ｗｏ ｎｉｗｍ　（＾ｃｒｔｔｏ＋＋ｉ＊ｓ　ｔｂｒＨｏ＠ｔＩ−とも言う。）の菌株 によっても発現される。しかし、そのような菌株でのエクスパンダーゼ活性は二 機能性遺伝子（ｃｅｆＥＦ）によって発現され、その遺伝子は、その本来の機能 がエクスパンダーゼ酵素のデスアセトキシセファロスポラン酸（ＤＡＯＣ）産物 をデアセチルセファ０スポリンＣ（ＤＡＣ）に変換することであるＤＡＣ３（ヒ ドロキシラーゼ）活性も発現する。その結果、単一であるが二機能性のエクスパ ンダーゼ／ヒドロキシラーゼ酵素が得られる。これら２個の遺伝子産物の活性を 分離する試みがなされているが、まだ誰も成功していない。例えば、Ｅｌ’−Ａ −０２８１３９１は、Ｃ，ｔｃｒｕ＋ｏｎ日−＾ＴＣＣＩＩＳＳＧから得られる ＤＡＯＣ３／ＤＡＣ８遺伝子の単離およびＤＮＡ配列の同定をその酵素の対応す るアミノ酸配列とともに開示している。

Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｗｍは形質転換され、その酵素を発現するが、ペニシリンＧ およびＶを対応するセファロスポリンに変換するという試みは少しも例示されて いない。さらに、ＤＡＯＣ３をコードする遺伝子情報をＤＡＣ９から分離してそ れらを別々に発現することは、遺伝子工学技術により容易に行うことができると いう示唆にもかかわらず、そのような分離の実例は全く記載されヒドロキシラー ゼ）酵素も、その活性および特徴ならびに遺伝子配列に関して十分に研究されて いる。例えば、υ、　Ｓ、　４．１７１２１０　ＳＵ、　Ｓ、　４．２４１９６ ６およびｏ、ｓ、　４．３０７．１０　（以上、Ｄｓ＋＋＊ｉ＋＋）では、エピ マー化して環を拡張することによりセファロスポリン抗生物質を生じるＣ、　易 ｃｒｅｍｏｎｉａｓの無細胞抽出物によりペニシリン型の種々の出発物質を処理 している。υ、　Ｓ’、　４．７５３．１１８１（Ｗａ−ＫｉｓＢ　Ｙｅｈ）は 、Ｃ，ｓｅｒｅｓｏａｉａｍ酵素の等電点、分子量、アミノ酸残基、ヒドロキシ ラーゼ活性とエクスパンダーゼ活性との比およびペプチド断片に関して記載して いる。

上述した公知文献は、Ｐ、　ｃｈＢ＋ｏ（ｅｎｗｓ菌株を、エクスパンダーゼ酵 素を発現する遺伝子により形質転換してその酵素を発現させるという点のみで、 本発明に関連している。そこでは、発現した酵素を使用して、ペニシリンＧおよ びＶではなく、ペニシリンＮの環拡張を行っているだけである。その場合ですら 、ペニシリンＮの７位には、本発明方法のように酵素的に開裂して７−ＡＤＣＡ にすることができない側鎖がある。本発明は、アジポイル側鎖がＰ、’ｃｈｒＹ Ｉｏ（ｅｎａ■菌株により効率的に付加され、ｉｎ　５ｉｔｕ発現したエクスパ ンダーゼ酵素がその化合物を環拡張の基質として効率的に使用してアジポイル７ −ＡＤＣＡにし、次いで、そのアジポイル側鎖が別の酵素により効率的に脱離さ れて７−ＡＤＣＡになるという驚くべき発見によるものである。本発明側々の断 片自体は公知文献に見出すことができるとしても、それらを結合すると本発明方 法のように予期しない結果が得られるということは示唆されていない。

例えば、６−アジポイルペニシラン酸は文献により公知である（Ｂｔｌｌｉｏ、 ＾、　ｅｌ　ｓｌ、、　ＮａｔｕＩｅ　（１９６０１１８５，９７−９９参照） 。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの６−アジポイルペニシラン酸の酵素的拡張も文献により公 知である（Ｂｓｌｌｗｉｎ　ｅｌ　ｔｌ、、　Ｔｅｌ目ｂｅｄ＋ｏｎ＋１９８７ １４３．　３００９−３０１４およびＥＰ−＾−０２６０４３参照）。そして、 アジポイル側鎖の酵素的開裂も文献により公知である（Ｍｓｔｓａｄ−ｅｌ　１ １．、　］、　Ｂ暑ｃ１．　（１９ｇ７）　１６９．　５８１５−５８２０）　 。

アジポイル側鎖は次の構造：　Ｃ００Ｈ−（ＣＨ２）　４−Ｃ０−を有するが、 密接に関連した構造の側鎖として、構造：Ｃ００Ｈ−（ＣＨ２’）　３−Ｃｏ− を有するグルタリル側鎖がある。グルタリル側鎖の酵素的開裂は文献により公知 である（例えば、５ｈｉｂｕ７＊　ｅｊ　ｓｌ、、　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｗ、（１９８１）　４５．　１５６１−１５６７　、ｌＪ＊＋ｓｗｄ＊ 　ｕ＋ｄ　ＫｏｍＮｓｗ、Ｉ、ＢＩｃｌ　（１９８５）　１６３．　１２２２− １２２８、　Ｍｒｌｓｉｄ畠　！ｌ　＊１．、　Ｊ、　ＢＩｃｌ、　（１９Ｂ？ ）　１６９．　５１１１５−５８２０．　特開昭５３−０８６０１１４　（萬有 製薬）および特開昭５２−１２１１２９３　（萬有製薬）参照）。

また、ＥＰ−Ａ−０４５３０４１１は、Ｐ＠ｔｅｄｏｍｏａｓｓ　５Ｙ−７７− １によって産生されるグルタリルアシラーゼのアジポイル開裂活性を改善する方 法を記載している。α−サブユニット内に位置する種々のアミノ酸を置換するこ とにより、（アジポイル−セリンからの）アジポイル開裂速度が３〜５倍高くな った。なお、ＥＰ−＾−０４５３［１４８は見かけ上、アジポイル側鎖に対する 活性が改善されたアンラーゼを実証しているが、アジポイル−セファ０スポリン を主に生じさせる方法（化学的方法または本明細書に記載した方法と類似の生化 学的方法のいずれによっても）については何も記載していない。

（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖が存在する場合、最初にアミノ基を酵素的に 除いて、その側鎖を（Ｄ）−アミノ酸オキシダーゼにより短くしてグルタリル（ 、Ｇ　１．−７　）側鎖とし、これを別の酵素（グルタリルアシラーゼ）により グルタリル側鎖を脱離することは文献により公知である。そのような二段開裂ハ 、１１．　Ｓ、　３．９６０、［２（Ｍｔｌ＋ｏｄｓ　）　、ＥＰ−人−０２７ ５９ｆｉ！、特開昭６１−２１８０５７　（１９８ｇ−ＫｏｍＮ＋３　旭化成工 業）　、Ｗ０９０．／１２１１１１　（１９９０−Ｗｏｎ（、Ｂｉｏｐａ＋ｅ　 Ｃａｍｐ、　）および１ｓｃＨｉ　ｅｔｉｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｂｎｏｌｏｇ７（ １９９１＋　９゜１８１１−１９１に開示されている。

係属の出願との関連 エクスパンダーゼ酵素の活性を、本明細書に記載した７−ＡＤＣＡを得るための 生化学方法と同様の方法によりＰ、ｃｈＢ＋ｏＢｎａｓ形質転換細胞で発現させ ７−ＡＣＡを得るためのバイオ方法を開示した出願中の出願Ｎｏ、−−−−−− −〜−−−（出願臼：−−−−−−−−−−−−−−−−’）　（代理人事件Ｎ ｏ、　１８５７２１Ａ）と関連する。しかし、この７−Ａ　ＣＡバイオ方法では 、別個の最終産物を得るための全く異なる組換え代謝経路を達成するために、別 の酵素活性を発現するには別の形質転換が必要であるが、本明細書は、それに関 しては何も示唆していない。

本発明方法および上述した公知文献の開示をより十分に理解するのを助けるため に、以下に、ペニシリンＧおよびセファロスポリンＣに導く代謝経路の種々の段 階、中間物質および関与ｒる形質転換を行う酵素を示す。

イソペニシリンＮ ＣＤ）　フェニルアセチルＣｏＡ デスアセトキシセファロスポラン酸 （ＤＡＯＣ） デアセチルセファ０スポラン酸 （ＤＡＣ） セファロスポリンＣ 発明の要旨 本発明は、７−アミツデスアセ！・午ンセファロスボランＷＲ（７−ＡＤＣＡ） を製造するための新規生化学方法に関している。本発明の方法は、下記工程： １）イソペニシリンＮを産生するＰｅ＋ｉｃｉｌｌｉｗｍ　ｃｂ＋７ｔｏ（ｅ＋ ＋ｍｍ菌株を、それが生育できる培養培地中で維持し、該培養培地にアジピン酸 または該ＰｅｎｉＣｉｌｌｉａｍ　ｃｈＢ＋ｏｇｃｍｍｍ菌株によって同化・利 用され得る１種以上のその塩およびエステルを含むアジペート原料を添加してア ジポイル−６−アミツベニシラン酸（アジポイル−６−ＡＰＡ）を製造する工程 であって、該Ｐｅａｉｃｉｌｌｉａｍ　ｃｂＢｔｏｇｓｎｕ＋菌株は、アジポイ ル−６−ＡＰＡを基質とすることができるエクスパンダーゼ酵素の活性をコード するＤＮＡによって形質転換されており、その酵素の発現に伴い、該菌株によっ て産生されたアジポイル−６−ＡＰＡが１ｎ８ｉｔｕで環拡張されてアジポイル −７−ＡＤＣＡを生じる工程；および ２）該アジポイル−７−ＡＤＣＡをアジポイルアシラーゼと接触させることによ りアジポイル側鎖を脱離して７−八ＤＣＡを生成し、次いで該物質を単離する工 程を含む。

本明細書で使用する下記用語の意味を表示する。

「アジポイル−６−ＡＰＡＪは、（２Ｓ−（２α、５α、６β）］−３，３−ジ メチル−７−オキソ−６−〔（ヘキサン−１，６−シオイル）アミノコ−４−チ ア−１−アザビシクロ−（３，２，０）へブタン−２−カルボン酸を意味し、「 アジポイル−７−ＡＤＣＡＪは、７−〔（ヘキサン−１，６−シオイル）アミノ コ−３−メチル−８−オキソ−５−チア−１−アザビシクロ−（４，２，０）オ クト−２−エン−２−カルボン酸を意味する。

特に、本発明は、上記で詳述した７−アミツブアセトキシセファロスポラン酸（ ７−ＡＤＣＡ）を製造するための新規生化学的方法において、アジペート源がア ジピン酸二ナトリウムであり、エクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡ かに由来するエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡおよびエクスパン ダーゼ活性をコードするＤＮＡの発現を促進するプロモータを含む、後述するプ ラスミドｐＰｅｎＦＴｓｏから成る組換えＤＮＡ発現ベクターに関する。

本発明はさらに、Ｓｌ＋ｃｐｔｏｍ７ｃｅｓ　ｅｌｘｖｕｌｉＢ＋ａｓ　ＡＴＣ Ｃ２７０６４に由来するエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡおよび エクスパンダーゼ活性をコードするＤＮＡの発現を促進するプロモータ（Ｐｅｎ ｉｃｉｌｌｉｎｓ　ｃｈ＋ｙ＋ｏｇｔｎｎｍ　ＩＰＮＳ遺伝子のプロモータなど ）を含む組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたＰｅｎ１ｃｉｌｌｉｎｓ　 ｃｈＢ＋ｏｌｅｎｕｍ宿主細胞に関する。特に、本発明は、後述するプラスミド ｐＰｅｎＦＴｓｏから成る組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたＰ！ｎｉ Ｃｉｌｌｉｏｍ　ｃｈＢ＋ｏ（ｓｎａｍ宿主細胞に関する。

さらに、本発明は、遺伝子の発現に適した条件下で組換えＰｅｎｌｃ口１ｉ１ｓ 　ｃｈＢ＋ｏＢｎａｍ宿主細胞を培養する工程を含み、該組換え宿主細胞がＳｔ ＋ｅｐｌｏｍ７ｃｔＩｃｌ＊ｙＩｌｌｉｇｓ＋ａ＋　ＡＴＣＣ２７０６４に由来 するエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡおよびニレスパンダーゼ活 性をコードするＤＮＡの発現を促進するプロモータ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　 ｃｈ＋ｙ＋ｏｇＣｉｕｍ　ＩＰＮｓ遺伝子のプロモータなど）を含む組換えＤＮ Ａ発現ベクターから成る方法に関する。特に、本発明は、遺伝子の発現に適した 条件下で組換えＰｃｎｉｃｉｌｌｉａｍ　ｃｈＢｓｏｇｅｎｕｍ宿主細胞を培養 する方法であって、該組換え宿主細胞が後述するプラスミドｐＰｅｎＦＴｓｏな どの組換えＤＮＡ発現ベクターから成る方法に関する。

発明の詳細な説明 本発明の第一は、下記構造式： で表される、市販の合成セファロスポリンの重要な製造中間体である７−アミツ デスアセトキシセフアロスボラン酸（７−ＡＤＣＡ）を製造するための新規生化 学的方法である。７−ＡＤＣＡの特徴は、セファロスポリン核の他に、７−アミ ノ基および３−メチル基である。７−アミノ基は多数の誘導側鎖に変換すること ができ、従って、市販の種々のセファロスポリンを合成するためのベースとなる 。３−メチル基は、セファレキシンの場合のようにいつもではないが通常は、市 販のセファロスポリンを合成するためにい（つかの他の側鎖に変換されることと なる。

本発明方法の７−ＡＤＣＡ物質は、下記構造式：で表される別の重要なセファロ スポリン中間体であるセファロスポリンＣと対比させることができる。この中間 体の場合、３−アセチルオキシメチル側鎖は市販のセファロスポリンに対して許 容されるかもしれないが、７−　（Ｄ）−α−７ミノアジボイル側鎖は、合成に よるこれ以上の誘導には適しないので、許容可能な７−アミノ基を得るために開 裂しなければならない。

不幸なことに、？−（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖は、化学的または生化学 的ないずれの手段によっても、いつも脱離が困難である。

！鼻 本明細書、特に好ましい態様の説明の章で使用する下記の用語の意味を表示する 。

ツーＡＤＣＡ　７〜７ミノデスアセトキシセフアロスポラン酸６−ＡＰＡ　６− ７ミノペニシラン酸 ＤＡＯＣデスアセトキシセファ０スボラン酸ＤＡＯＣ５ＤＡＯＣシ：／　セ９− 　セＤＡＣデアセチルセファロスポリンＣ ＤＡＣ３ＤＡＣシンセターゼ ＩＰＭＳ　イソペニシリンＮシンセターゼＴ＋ロ　トリス〔ヒドロキシメチルコ アミノメタンＥＤ、ＴＡ　エチレンジアミン四酢酸 ＤＥＰＣジエチルピロカーボネート ＴＥ　Ｔｒ口／ＥＤＴ＾緩衝液 ＳＳＣ塩（塩化ナトリウム）、クエン酸ナトリウム緩衝液ＳＯ３ドデシル硫酸ナ トリウム ＰＥＧ　ポリエチレングリコール Ｐ＊ｎ１ｃｊｌｌｉ＊＊　ｃｈＢｔｏ（ｅａｓｅ培養本発明方法の第一工程は、 イソペニシリンＮを産生ずるＰｓ＋＋１ｃｉｌｌｉｓｓ　ｅｈ＋７ｔｏｇｅａｉ ｍ菌株を、それが生育できる培養培地中で帷持し、該培養培地にアジピン酸また はその塩およびエステルを含むアジペート源を添加する工程を含む。アジペート 源は、Ｐ、　ｃｈｒ７ｓｏｇｅ＋＋ａｍを接種した後、その培養培地に添加する ことができるが、接種を行うときにすでに培養培地に存在しているのが好ましい 。アジピン酸またはその塩およびエステルは、−６−ＡＰＡを生成することがで きるものである。ここで、Ｐ、　ｃｈｒｙ＋Ｂｅｎ１はエクスパンダーゼ酵素の 活性をコードするＤＮＡによって形質転換されており、その酵素の発現の際、該 アジポイル−６−ＡＰＡがｉｎ　５ｉｔｕで環拡張されてアジポイル−７−ＡＤ ＣＡを生じる。

ペニシリウム属の　ｃｂ＋７ｓｏｇｅｎｎｍ種以外の種もイソペニシリンＮを産 生ずる。しかし、歴史上、イソペニシリンＮの産生量が最も高い菌株は全て、周 知の菌株改良技術によりｃｈＢｔｏｇｅｎ＋＋―種から発育させている。このた め本発明は、事実上、？ｎｉｃｉｌｌｉｉｍ　ｃｔ＋　ｔｏ　ｃｎｕｍ菌株に限 定したが、他の種にも適応できることは明らかである。ＰｔｎｉＣｉｌｌｉａｍ 　ｃｈ＋ｙ＋ｏＢｎｗ−の寄託菌株または該菌株の他の公的に入手可能な源は、 いずれも本発明方法を行うための適する出発点である。

イソペニシリンＮを産生するＰｅｏｉｃｉｌｌｉＩｌａ　ｃｈｒｙ＋ｏｇｅｏｕ ＋菌株の生育を維持することができる培養培地は、当業者が容易に慣れ親しむ型 のものである。例えば、培養は水中上通気醗酵法により行い、使用培地は多数の 使用可能な適する培地から選択される。典型的な培地は、ショ糖、グルコースお よび澱粉などの炭素源；大豆の粉末および粕、綿実油、ピーナツ油ならびに種々 のアミノ酸、それらの混合物およびペプトンなどの窒素源を利用する。産生条件 は、収量および単離し易さに重点が置かれ、従って、そのような状況に好ましい 培地は、炭素源を糖蜜にして、窒素源を大豆粉末およびアミノ酸にすることがで きる。

通常は栄養無機塩を培養培地に添加し、そのような塩としては、次のイオン成分 ：ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸塩、硫酸塩、塩化 物、臭化物、硝酸塩、炭酸塩、第二鉄、第一鉄、マグネシウム、マンガンなどを 供給できる塩が挙げられる。微量元素も、通常は、Ｐｅ＋＋ｉｃｉｌｌｉａｓ（ ｈｒＨｏｇｅｎｕｍの生育、発育および代謝のために必須であり、他の培養培地 成分にもともと成分としてすでに与えられていないならば、培養培地に直接添加 することができる。

Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉａｍ　ｃｂＨｓｏｇｅｎ＊ｍ菌株は、ごく少量の７−ＡＤＣ Ａの生産を所望する場合は、１！容振とラフラスコなどの容積の小さい装置中で 培養することができる。しかし、もつと大量のアジポイル−７−ＡＤＣＡを所望 する場合は、水面下通気醗酵条件下で大規模な醗酵槽を使用する。

アジポイル−７−ＡＤＣＡを大規模に製造する場合は、る。傾斜培地の胞子を使 用して、小さい体積の栄養培地に接種する。その栄養培地をインキュベートして 、その微生物の培養を大量かつ新鮮で活発に増殖するように行う。次いで、この 栄養培地を大規模醗酵培地の接種物として使用する。場合によっては、醗酵培地 の接種物としてさらに別の栄養培地を含めるのが好ましいかもしれない。そのよ うな第二の栄養培地は、通常、醗酵培地の体積が第一栄養培地よりもかなり大き い場合に使用する。このように、微生物の胞子が最初に体積の小さい栄養培地で 培養されて体積の大きい栄養培地用の接種物となる。次いで、体積の大きい栄養 培地から十分な濃度の微生物が得られたら、大規模醗酵槽での急速な醗酵が開始 される。栄養培地は、醗酵培地と同じ組成物を有するか、小規模での微生物の生 長および発育を高めるための他の成分を含むことができる。

本発明方法で使用する　Ｐｅｎ１ｃｉｌｌｉａａ　ｃｈｔｌｔｏＨｔａｕｓ菌株 は約２０〜３０℃の温度で最も効率的に培養されるが、最適な収率は、温度が約 ２２〜２８℃、好ましくは約２５℃のときに得られる。

アジポイル−７−ＡＤＣＡは、Ｐｅｎ１ｃｉｌｌｉｎｓ　ｃｈｒＨｏｇｅ＋ａ１ １菌株を大規模槽中で、約１０〜３０日間、好ましくは１５〜２５日間、培養す ると生産が最大になる。しかし、２５０ｍｊ容の振とうフラスコなどの小規模装 置で培養すると、微生物の生長はより急速になり、アジポイル−７−ＡＤＣＡが より短時間、例えば４〜１５日、しばしば５〜７日間で生産される。

大規模醗酵槽の最終ｐＨが８．０以上に達すると、アジポイル−７−Ａ　Ｄ　Ｃ Ａの収率に悪影響を及ぼす可能性がある。そのような状況では、醗酵の間中、培 養培地のｐＨを監視するのが好ましい。アジポイル−７−ＡＤＣＡの生産が最大 になる前にｐＨがそのようなレベルに達すると考えられる場合は、適切な酸また は緩衝剤を醗酵培地に添加することによりｐＨを下方に調整すると好都合である と考えられる。

アジポイル−７−ＡＤＣＡを生産した後、醗酵培養液のサンプルをクロマトグラ フィーによりテストすることができる。

はとんどの水面下通気醗酵と同じように、培養培地に滅菌空気を通すことにより 、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｏｍ　ｅｈＢｓｏ！！ｎｍ−菌株の生長がより効率的に行 われ、アジポイル−７−ＡＤＣＡの生産が高まる。培養培地に通す空気の体積は 通常、単位体積の培養培地につき、１分間に少な（とも約０．２体積である。し かし、空気の通過速度を高めると、アジポイル−７−ＡＤＣＡの生産に対して有 益な影響が得られることが多い。

Ｐｅｎ１ｃｉｌｌｉｏｓ　ｃｈ＋ｙ＋ｏｇｅｎｕｍ菌株は、典型的には、アジポ イル−７−ＡＤＣＡの他に多くの創成物および代謝物を生産する。

これらのいくつかは酸に対して感受性であるため、アジポイル−７−ＡＤＣＡを 醗酵培地から回収する際、醗酵培養液全体を短時間、酸性ｐＨで処理することに より、副成した不純物の一部を分解するのが望ましい。アジポイル−７−ＡＤＣ Ａ醗酵産物は、こうして処理した醗酵培養液を濾過して回収し、所望により、イ オン交換樹脂でのクロマトグラフィーにより醗酵培地の他の成分から分離し、さ らに、必要であれば、続くアジポイル側鎖の酵素的開裂工程の前にクロマトグラ フィーにより精製することができる。また、そのようなイオン交換クロマトグラ フィーによる分離は、側鎖の開裂を行った後に行うこともできる。分離上の問題 がある主要な副成物の一つはアジポイル−６−ＡＰＡであり、この副成物は、化 学的または酵素的に分解して分離をより容易にすることができる。最初に、濾過 した醗酵培養液を、ｎ−ブタノールまたは酢酸アミルなどの水と混和しない有機 溶媒で最初に抽出するなどの予備精製にかけて不純物を除去する。次いで、抽出 した培養液は、さらに、活性炭でのクロマトグラフィーによる予備的方法で精製 することができる。

アジペート源の添加 上述のように好ましくは、Ｐｅ＋＋ｉｃｉｌｌｉｏｍ　ｃｈｒ７ｔｏＢｎｕ＋に 対すの他の成分に添加する。所望により、接種後、例えば接種の１．２および／ または３日後にアジペート源を添加してもよい。アジペート源は、アジピン酸ま たは培養されている？ｍｉｃｉｌｌｉｗｌｃｈｒｙ＋ｏｌｅｎａｍ菌株により同 化・利用されてアジポイル−６−ＡＰＡを生産することができるアジピン酸の１ 種以上の塩もしくはエステルとして定義される。アジピン酸、塩およびエステル は単独または組み合わせて使用することができる。二ナトリウム塩が好ましいが 、カリウム塩およびナトリウムとの混合塩も適する。メチルエステルは使用でき るが、エチルエステルは水に不溶である。アジピン酸塩またはエステルは、Ｐｓ ｎｉｅｉｌｌｉｎｓ　ｃｈｒ７ｔｏｇｅ＋ｉｍ菌株により同化・利用されてアジ ポイル−６−ＡＰＡを生産することができるものでなければならない。例えば、 アジピン酸自体は水に不溶であるにもかかわらず、同化可能な塩が適正なｐＨ条 件下で生成されるために適する。

適するエクスパンダーゼ酵素 上述したように培養され、アジペートａが与えられてアジポイル−６−ＡＩ’Ａ を生産するＰ　ｓ　ｏ　ｉ　ｃ　ｉ　Ｉ　ｌ　」ＣｂｒＴ−ソリ」１ｍ　ｍ＝菌 株はまた、エクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡによって形質転換さ れており、その発現の際、該アジポイル−６−ＡＰＡはｉｎ　５ｉｔｕで環拡張 されてアジポイル−７−ＡＤＣＡになる。

アジポイル−５−ＡＰＡは、アジペート源を添加して培養したＰｃａｉｃｉｌｌ ｉｓｎ　ｃｈｒｙ＋ｏｇｔｎｎｍにより細胞内で生産される。また、その細胞内 、すなわちｉｎ　５ｉｔｕ条件では、形質転換されたＰ！ＩｌｉｃｉｌｌｉＩ１ ｗ　ｃｂｒｙ＋ｏ＠ｆｆ１１ｍがエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮ Ａを発現し、その際、その酵素が基質としてのアジポイル−５−ＡＰＡに作用し て環を拡張させ、アジポイル−７−ＡＤＣＡを生成させる。

本発明の新規生化学的方法は、エクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡ による上述した型の　Ｐｓｎｉｃｉｌｌｉａｍｃｂ＋Ｈｏｇｅｎａｍ菌株の形質 転換をその範囲内に含み、その酵素の発現の際、アジポイル−６−ＡＰＡがｉｎ 　５ｉｔｕで環拡張されてアジポイル−７−ＡＤＣＡを生じる。すなわち、Ｐｅ ａｉｃｉｉｌｉｉｓ　ｅｈｒｙ＋ｏｇｓｅｃｍを形質転換するＤＮＡは、従来技 術において理解されているエクスパンダーゼ酵素の活性、すなわちイソペニシリ ンＮを環拡張してＤＡＯＣにする能力だけでなく、アジポイル−６−ＡＰＡを環 拡張してアジポイル−７−ＡＤＣＡにする能力も有する酵素を発現しなければな らない。

しかし、側鎖の類似性から【５て、どのエクスパンダーゼ酵素も本発明の新規生 化学的方法において使用可能であると考えられる。

従来技術の章ですでに述べたように、Ｓｔ＋！９ｊｏｗｙｃｔＩｃｌｓｙｉｌｉ ｔｓ＋ｉｓ　ＡＴＣＣ２フ０６４由来のエクスパンダーゼ酵素は、その全塩基配 列が分析されているとともに、エンドヌクレアーゼ制限酵素による地図作製によ り特徴付けられている。しかし、同一酵素であると思われるＳ、ｃｌ暑マυ１鬼 （ｅｍｕ暑Ｉｆ　ＲＩＩ　Ｌ　３５　ＲＳ由来のものは、分子量が異なるとｌ報 告されているに止まり、塩基配列は分析されていない。

従来技術においてすでに同定されたこれらのエクスパンダーゼ酵素は、本発明の 新規生化学的方法において有用である。まだ同定されていないＳ、　ｃｌＩｖｗ ｌｉｇｅ＋＊＋の異なる菌株または別の属の微生物に由来する他のエクスパンダ ーゼ酵素でさえも、本発明の新規生化学的方法を行うのに適すると考えられる。

有用な微生物の新しい菌株および属を同定し、エクス、（ンダーゼ酵素とされる ものを単離し、それらが本発明方法での使用に適していることを検証するための 方法は簡単であり、当業者には周知である。有用な微生物の候補となる新しい菌 株および属の無細胞抽出物のスクリーニングは、該抽出物を、第一鉄（Ｆ　ｅ　 ”）イオン、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩およびアデノシン三リン 酸（ＡＴＰ）などの公知のＤＡＯＣ８補助因子の存在下でアジポイル−６−ＡＰ Ａに添加するという、信頼でき再現性のある方法で行うことができる。アジポイ ル−５−ＡＰＡ基質は、下記に詳細に記載する方法と同様にしてアジペート源を 未形質転換Ｐｅａｉｃｉｌｌｉｃｍ　ｃｈ＋！％ｏＩｔｎｉａに供給することに より十分な量で製造することができる。所望のエクスパンダーゼ酵素は、アジポ イル−７−ＡＤＣＡが生成するならば存在し、その有無はクロマトグラフィーに より検出することができる。

また、公知の組換え技術を使用すると、Ｓ、ｃｌｓマｕｌｉｉｔｎ＋ｓおよびＣ ，＊ｅ＋ｅｍｏｎｉｏｍのエクスパンダーゼ配列に基づいてＤＮＡプローブを作 り、本発明方法での使用に適するエクス／シンダーゼを生産しそうな候補微生物 のＤＮＡ部分をスクリーニングすることができる。

エクスパンダーゼ酵素の可能源 すでに述べたように、エクスパンダーゼ酵素は、ペナム環構造（ペニシリン型分 子に見られる）を拡張してセフ−３−エム環（セファロスポリンに見られる）に するのを触媒する酵素である。従って、セフェム環を含む代謝産物を生産するど の有機体もエクスパンダーゼをコードするＤＮＡの可能源である。そのような有 機体の例を下記に挙げるが、このリストは例示に過ぎず、全てを網羅していると 考えるべきではない。

真菌： Ｃｅｐｈｓｌｏｔｐｏτ目ｍ　ａｃ＋ｅｍｏｎｉｕｓＣｅｐｈｔｌｏｓｐｏｒｉ ＋＋ｓ　＋ｐ。

放線菌： Ｈ＋ｃｐｌｏ＠Ｈｃｔｔ　ｃｌ＊ｗｗｌｉ（ｅ＋ｒ＋Ｓ、ｌ１ｌｉｐｉｎ！ｎｓ ｉ＋　ｃｚｐｈｔｓ７ｃｉｎｉ他の細菌： Ｆ１１ｗｏｂｓｃｌｅ＋ｉｎ＋　＋ｐ。

Ａｌｃｓｌｉｇｃｎｃ＋　ｄｅａｉｌ＋ｉ＋ｉｗｎｔｌＪｙｅｏｐｌｔＩｌ＊　 ｂｏｌｌｔ口Ｐ＋ｏｗｉｄｅ＋＋ｃｉｔ　＋ｔｌ１ｇｅ＋１ＬＨｏｂｘｃｌｓ＋ 　Ｉｔｃｌ１ｇｚｎｏ＋上記で挙げた生体のエクスｌくンダーゼは、さら４こ研 究するための単なる候補に過ぎず、それらが全て本発明の新規方法番二適すると は限らない。例えば、Ｃ，＊ｃ＋ｅ■ｏｎ目■に由来する酵素などのエクスパン ダーゼ活性およびヒドロキシラーゼ活性の両方を有する酵素を使用すると、ヒド ロキシル化アジポイル−７−ＡＤＣＡ、すなわちアジポイル側鎖のついたＤＡＣ が製造される可能性がある。

エクスパンダーゼ活性をコードするＤＮＡ断片の単離所望のエクスパンダーゼ酵 素の存在が上記方法により検出されると、エクスパンダーゼ酵素活性をコードす るＤＮＡの単離法も簡単で、当業者には周知である。エクスパンダーゼ酵素をコ ードする遺伝子の公知配列および部分配列に基づ＜ＤＮＡプローブは、所望の酵 素をコードする単離すべきＤＮＡとハイブリッド形成するように構成される。そ のようなプローブの構成は、エクスパンダーゼ酵素をコードするアミノ酸および ヌクレオチド塩基配列ならびに関与する特定の微生物の優先コドンに関する知見 に基づく。Ｓｌ＋ｅｐｊｏｓ７ｅｅｓ　ｅｌ＠ｖｗｌｉｇｔｒ＋＋＋＾ＴＣＣ２ ’１０６４のゲノムＤＮＡに適用されるこの種の典型的方法の詳細な説明を以下 でさらに述べる。

エクスパンダーゼ酵素活性をコードするＤＮＡの単離は、組換えＤＮＡ技術でよ く知られた制限および連結方法により行われる。適正な制限断片を得て単離する には、関与する微生物のゲノムのエンドヌクレアーゼによる制限酵素地図を知る ことが必要である。Ｓ、　ｃｌｓｙａｌｉｇｅｒ１１＋およびＣ，ｔｃ＋ｅｓｏ ｎｉ＋＋＋＋の制限酵素地図はすでに入手可能である。すなわち、前者の場合は 、制限酵素Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩおよび５ａｌｌを使用すると、電気泳動により、所 望の１．８および２．２ｋｂの断片が得られる。

ＰＣｎｉｃｉｌｌｉｏｍ　ｃｈｒ７ｓｏｇｅｎｉａ菌株の形質転換エクスパンダ ーゼ活性をコードするＤＮＡ断片が得られたら、それらを、プロモータ、翻訳活 性化配列、耐性マーカー、調節配列、ニスミドフォーマー、ならびに形質転換を 可能にし、または促進し、遺伝子産物の発現を行い、形質転換細胞の単離を容易 にする他のＤＮＡ塩基配列とともに、プラスミドまたは他の発現ベクターに挿入 （連結）することができる。こうして構成した発現ベクターを使用すると、Ｐｓ ｎｉｅｉｌｌｉａｍ　ｃｈｒＨｏｇｅｎａｍ菌株の形質転換およびエクスパンダ ーゼ酵素の活性の細胞内発現が達成される。形質転換および発現を達成するため に使用される技術は文献により公知であり、そのような典型的な方法の詳細な説 明を以下でさらに述べる。

上記で既に詳述したように、形質転換され゛たＰｅｎ１ｃｉｌｌｉ＊ｍｃｂ＋ｙ ｓｏｇｅｎｎｍ菌株は、エクスパンダーゼ酵素の活性を細胞内で発現し、ｉｎ　 ５ｉｔｕでアジポイル−６−ＡＰＡ基質に作用して環を拡張し、アジポイル−７ −ＡＤＣＡにする。

新規な形質転換細胞 エクスパンダーゼ遺伝子の活性を発現する特定のＰｅｎｉｅｉｌｌｉｕｍ　ｃｈ ｒ７ｓＢｅｎａ１１形質転換細胞は、本発明の好ましい態様であり、Ｃｒｎ１ｖ ｅｌｌ　ｅｌ　Ｉｌ、（１９９０）　Ｃ＋ｕ＋！＋ｌ　Ｇｅ＋ｅｌｉｃ、１７゜ ２１３−２２１にあるような従来の構成と比べて新規である。いずれの構築でも 、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を使用してプロモータをエクスパンダーゼ遺伝 子に連結する。Ｃ５ｅｌｖｅｌｌの構築では、エクスパンダーゼ遺伝子のＡＴＧ にＮｄｅ１部位を導入し、それを、Ｘｂａｌ／ＮｄｅＩリンカ−によりＩ　ＰＮ Ｓプロモータの３′−末端にあるＸｂａ１部位に連結する。本発明の構築では、 エクスパンダーゼ遺伝子のＡＴＧにＮｃｏ１部位を作り、ｒ　ＰＮＳリンカ−の ３゛　−末端にあるＮｃｏＩ部位に連結する。

この結果、これらの構築におけるプロモーター遺伝子連結部の周りの塩基配列は 次のようになる。

ｘｂｌｌ　Ｎｃａｌ ＩＰＮＳ　プａそ一夕　Ｓ’ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡ丁ＧＧ　３’　配列番号　 ｌＣ８＋１ｖｅｌｌ構築では、ＣがＴで置き換わっているが、本発明の構築では 、Ｃは保持されている。すなわち、ＡＴＧ開始コドンのすぐ隣のＩ　ＰＮＳプロ モータの配列は、天然に存在するＩ　ＰＮＳ遺伝子に見られるものと正確に一致 する。この従来のプロモータは、ただ１個のヌクレオチド塩基が異なるだけだが 、翻訳効率が低下し、その結果エクスパンダーゼ遺伝子の発現レベルを下げる可 能性がある。

他の違いは、構築に含まれるプロモータまたは遺伝子の領域である。Ｃｒｎ１ｖ ｓｌｌ構築には、ＩＰＮＳプロモータの５′Ｂ　ａ　ｍ　ＨＴからＸｂａ１３’ 　までの領域を含むが、本発明のベクターはそのプロモータの５’Ｎｃｏｌから ＮｃｏＥ３’　までの領域を含む（Ｄｉｅ！、ｅｌ　ｔｌ、、（１９９０１，１ ，Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ！＠、　２６５゜１６３５８−１６３６５　）　、この結果 、Ｃｓｎ１ｖｔｌｌ構築のＩ　ＰＮＳプロモータには５′末端に約２５０塩基対 が付加される。しかし、この領域はＩ　ＰＮＳ遺伝子の上流にあるＡＣＶシンセ ターゼ遺伝子の読み取り枠にある。

また、Ｃｓｎ１ｖｔｌｌ構築は、５ＩｒｔｐｌｏＨｃｅ＋遺伝子を、ＡＴＧから その遺伝子の３′側のＢａｍＨ１部位まで含むが、本発明のベクターは、ＡＴＧ からその遺伝子の３′側の５ａｉ１部位まで含む（Ｋｏｗ＊ｃｅｗｉｅ　ｃｌ　 ｓｌ、、ｆ１９Ｎ）、Ｊ、Ｂｔｃｌｅｒｉｏｌ、、１７１．７５４−７６０３　 、この結果、Ｃｓｎ！ｗｅｌｌ構築の３′末端には約１０００ｂｐｓの塩基配列 が付加される。本発明の構築はさらに、エクスパンダーゼ遺伝子の上流域を、Ａ ＴＧの５′側のＢａｍＨ１部位まで含むが、エクスパンダーゼ遺伝子の読み取り 枠とはＩ　ＰＮＳプロモータにより分離されている。

本発明の構築が公知文献に記載されたものとさらに異なる点は、使用する選択的 マーカーに関する。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉａｍ　ＩＰＮｓプロモータの使用二本発 明の構築におけるｐｈｌｓｏ＊７ｅｉｎ遺伝子融合は、多重複製の組み込みまた は高レベルの発現を可能にし、従ってエクスパンダーゼ遺伝子を高レベルで発現 する形質転換細胞を高い割合で産生ずる可能性がある位置での組み込みを選択す るようになる。

上述した型の新規形質転換細胞は、ＰＣｌｏｏと命名したＰｅｎｉｅｉｌｌｉｕ ｍ　ｃｈＢ＋ｏｇｅｎａｍである。その菌学上の特性としては、典型的には、広 範囲に広がる緑青色〜緑色で、滑らかなベルベット様で黄色の粒のついたコロニ ーを生じ、寒天中に黄色が逆拡散し、分生子頭の分枝は全体に滑らかで、分生子 は長さが３〜４ｍｍの楕円形〜球形であることが挙げられる。

Ｐ、　ｃｈｒ７ｓｏｇｅｎｕｍに対する許容可能な培養条件は、１１の蒸留水中 にラクトース−水和物１．５％（Ｗ／Ｖ）　、コーン浸出液０．５％（ｖ／ｖ） 、ペプトン０．５％（Ｗ／Ｖ）、ＮａＣ１０，４％（ｗ／ｖ）　、Ｍｇ５Ｏ−７ Ｈ２００−０５９６（Ｗ／　ｖ　）　、Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４０、０６％（Ｗ／　Ｖ 　）、Ｆ　ｅ　Ｃｌ　・６　Ｈ２００、ＯＯ０５％（ｗ／ｖ）、Ｃｕ５Ｏ一５Ｈ ２００，０００２％（Ｗ／Ｖ）　、寒天３．０％（Ｗ／　Ｖ　）を含む固形培地 を使用し、ｐＨ４，８である。すぐ上に記載し、ＰＣｌｏｏと命名したＰ、　ｃ ｈ＋７ｓｏｇ！ｎ■は、＾−ｅ＋１ｃｔｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｌｕ＋＋　Ｃｏ１１ ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）　（１２３０１ＰＩＴ日ｔｖｎ　Ｄｒｉｗｅ。

Ｒｏｃｌｖｉｌｌ＋、　ＭｔＢｌ＋ｎｄ　２０８５２　）にへ丁ＣＣ７４１８２ の受託番号（寄託日：　１９９２年８月２１日に受理され、生存は１９９２年８ 月２７日に確認）で寄託されている。

アジポイル側鎖の開裂 本発明の新規生化学的方法の次の工程は、アジポイル−７−ＡＤＣＡからアジポ イル側鎖を開裂することであり、この工程では、前の工程の産物をアジポイルア シラーゼ酵素系で処理する必要がある。上記ですでに述べたように、本発明の重 要な成果の一つは、アジポイル−７−ＡＤＣＡの製造に導く全工程を単一の醗酵 培養で行うことができることである。これにより、その方法の工程ごとに中間物 質を単離し、部分的に精製する必要がない点で有効性が非常に改善される。しか し、この最終工程にアジポイルアシラーゼ酵素系は存在しない、すなわち、最初 の醗酵培養においてｉｎ　５ｉｔｕで生成されていない。

本発明の新規生化学的方法をバッチ式で行う場合は、最初の工程の産物を単離し 、部分的に精製する必要がある。このための予備的操作については上記ですでに 記載した。

にもかかわらず、本発明の方法は、アジポイル−７−ＡＤＣＡが７−ＡＤＣＡに 酵素的に変換できるようにアジポイルアシラーゼをアジポイル−７−ＡＤＣＡに 効果的に接触させる方法であればどの方法でも行うことができる。これは、「接 触」の最も広い意味での定義である。原料として粗アジボイル−７−ＡＤＣＡの 無細胞培養液を使用し、それを、粗アジポイルアシラーゼ培養液によりバッチ式 で処理することが可能である。この方法は、最初の反応物の実質的な精製を必要 としないので、ある程度の有効性が得られる。もちろん、改良は可能である。例 えば、反応物は、互いに接触させる前に所望する程度に精製してもよい。また、 バッチ法ではなく連続的方法でその工程を行うこともできる。反応物自体の接触 は、処理技術の向上に応じ、種々の方法で改良することができる。すなわち、固 定化酵素を、例えばアジポイルアシラーゼを含むカラムの形で使用し、アジポイ ル−７−ＡＤＣＡをそのカラムに通す。また、固定化酵素を懸濁物としてアジポ イル−７−ＡＤＣＡに添加してもよい。そのような固定化酵素系は、酵素の回収 が容易で、何度でも再使用できるという利点を有する。そのような処理技術の他 の例は、膜反応器に関するものである。反応物を接触させる好ましい方法は、固 定化酵素カラムによる方法である。

開裂工程に有用なアジポイルアシラーゼ酵素アジポイル側鎖に対して既知特異性 を有する酵素は多数存在する。市販のＲＡＥＹ　Ｃｏｔｐ、製アジポイルアシラ ーゼを使用して得られる結果は、下記の実施例でさらに詳述する。文献には、セ ファロスポリン型分子からアジポイル側鎖を脱離する他の７種類の酵素が報告さ れている。これら７種類の酵素のうち６個はＰｓｔｍｄｏ園ｏｎ■種園内ｎ１種 ７番目はＢａｃｉｌｌｕｓ種に由来する。各々のＰｓｅｕｄｏ■０１１１１酵素 はいくつかの類似性があるが、全７種は、物理的／生物学的特性がある程度具な る。それらの特性のいくつかを下記にまとめる。

酵素　文献　分子量近似値 （シＵ旦屯−可１１及び　（サブユニット）シにΩシ謹　菌株　） Ｅ、　５Ｙ−７７−Ｉ　５ｈｉｂｕｙａ、　椙ムー日１．　見かけ上ハ下ノ（Ｔ ｏｙｏ　Ｊｏｚｏ）　（１９８１）　Ｇ　Ｋ　１６１：同ｅＰ、　ＧＫ１６　Ｍ ａｔｓｕｄａ、　Ｋｏｍａｔｓｕ　１６，０００（Ａｓａｈｉ　）　（１９８５ ）　５４　、０００Ｅ、５Ｅ８３　（ａｃｙｌ）　Ｍａｔｓｕｄａ、　し」ｕ、 　３８．Ｚｏ。

（Ａｓａｈｉ）　（１９８７）　１９，９００Ｅ、５Ｅ８３　（ａｃｙエエ）　 Ｍａｔｓｕｄａ　＋　椙り盈Ｌ２５　ｔ　４００、　（Ａｓａｈｉ）　（１９８ ７）　５８，２００ム１−空践几瓜ｓｐ、−−−−−−−−−−−−−−−１６ ，０００（ＲＡＥＶ　Ｃｏｒｐ、）　５４，０００”　Ａｒａｍｏｒｉ　ｔＬａ ｌ、、　（１９９１）　７２：　２３２−２４３゜”　Ａｒｗｏｒｉ　ｅｔ　ａ ｌ、、ム」■山匡ηｈ（１９９１）　１７３：　７８４８−７８５５゜上記アジ ポイルアシラーゼ酵素は全て、本発明の新規性化学的方法に有用である。本発明 方法に有用な他のアジポイルアシラーゼを、候補の酵素を、作用すべき実際の基 質であるアジポイル−７−ＡＤＣＡに対してテストすることにより容易に発見で きるかもしれない。よさそうな結果が得られたら、信頼できて再現性のある方法 により、候補の酵素が本発明方法に実際に有用であることを測定する。基質は、 Ｓ！ｓｗｃｘｕｋ　＊ｎｄ　Ｗｅｌｌｓｓｎ−Ｂｅｄｎｓｗｓｋｓ　ｉｎ　Ｃｌ １ｎ、　Ｃｈｉｌｌ、　Ａｃ１８（１９７８）　８４．　１９−２６により報告 された方法を改良して無水アジピン酸と７−ＡＤＣＡとの反応から直接調製でき る。無水アジピン酸は、　１．　ＭＩｃｒｏｓｏｌ、　Ｓｃｉ。

Ｃｈｅｗ、（１９９Ｇ）　Ａ２７．３９７−４１２に記載されたＡｌｂｅｒｌｔ ｏＩｌ■ｄＬａｎｄｍａｒｋの方法に従って調製できる。７−ＡＤＣＡは、いく つかの市販のもの（例えば、Ｅ、　Ｒ，５ｑａｉｂｂ　＆　５ｏｎｓ、　Ｌｉｄ 、、　Ｎｌおよび１ｎｌｅ＋ｅｂｅｍ　Ｃｏｒｐ、、　Ｎｌ）を利用する。

高速比色法を使用して候補の酵素を粗選別する場合は、アジポイル−７−ＡＤＣ Ａ基質の代わりにアジポイル−ＰＡＢＡ（パラ−アミノ安息香酸）またはアジポ イル−ＰＮＡ　（パラ−ニトロアニリン）などの呈色基質を使用してもよい。側 鎖の開裂により発色種が生じ、その種の有無および濃度が比色計により容易に測 定される。これらおよび他の適する比色法に関するさらに詳細な情報は、Ｍｇ＋ ｅｌｌｉ、Ｌ、Ｐ、（１９６８）、１．　Ｐｈｔ＋ｍ。

ＳＣｉ、、　５７：２＋７２−２１７３；　Ｓ＋＊ｓ！、　Ｇ、（１９６９１， Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｔｓ、　１５：Ｉ２４−＋３６；　Ｓｔ！ｖｅｔｓｋ、＾、　 ｃｌ　ｓｌ、、　（１９８０）　Ａｌ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０３＋１６６ −１６９；およびＲｔｌｅ３　Ｆ、ｅｌ　＊１．、（１９ｇ９１　＋、Ｐｈ暑ｒ ｍｔ、Ｐｈ＊＋ｗｕｅｏｌ。

４１＋Ｈ６−Ｎ７を参照。

ａ　ｃ　ｙ　ＩＩの大きいサブユニットを持つＲＡＥＶ酵素のＮ−末端アミノ酸 配列を、上記表に記載したＧＫ１６と比較した。比較結果を下記に示す（括弧内 は、決定的なものではなり道ことを示す。）。

ＲＡＥＶ　配列番号、５ ＳＮ　（Ｓｌ　（ＧＩ　Ａ　Ｖ　Ａ　ｐ　Ｇ　Ｋ　Ｔ　Ａ　Ｎ　Ｇ　Ｎ　Ａ　Ｌ 　（Ｌ）　Ｌ　Ｑ　Ｎ　（Ｐ）ＧＫ１６　配列番号６ ＳＮＳ　Ｉ　ＡＹＡＰＧＫＴＡＮＧＮＡＬ　Ｌ　ＬＱＮ　Ｐ暑ｅ７１１配列番号 ７ ＳＮＮ　Ｗ　ＡＹＡＰＧＲＴＡＴＧＲＰＩ　Ｌ　ＡＧＤ　Ｐ示した配列から、こ れら３個のペプチドは全て、明ら力Ａ１こ関連している。しかし、上記で示した 配列と同様のＮ−末端配列ンＧアシラーゼの場合のように、必ずしもアジポイル アシラーゼ活性を有するとは限らない。他方、上記Ｎ−末端配列との相同性が小 さくとも本発明方法に有用なアジポイルアシラーゼがある。例えば、上記の表で 述べた＾■ｂＩ酵素ａｃｙｌおよびＦｌｌｏｓｗｔ　Ｂ、１ｒｔｅ＋ｏｓｐｏ＋ ａｓ月アシラーゼは一応のアジポイル−７−ＡＣＡアンラーゼ活性を示すが、上 記に記載した他の酵二工程に有用なアジポイルアシラーゼに関する本発明の範囲 は、候補の酵素がアジポイル−７−ＡＤＣＡからアジポイル側鎖を開裂すること ができるかどうかで決定され、それは、上記で詳述したように容易かつ確実に決 定することができる。

他の方法により適するアジポイルアシラーゼを見出すことは可能である。例えば 、ＥＰ＾−Ａ−０４５３０４８は、ＰｔｅａｄｏＩＩｏｎｓｓ　５Ｙ−７７−１ により生産されるグルタリルアシラーゼのアジポイル開裂活性の改善方法を記載 している。α−サブユニット内の特定位置の種々のアミノ酸を置き換えることに より、（アジポイル−セリンからの）アジポイル開裂速度が３〜５倍高まるのが 認められた。そのような改善された酵素も本発明での使用に適する。

なお、ＥＰ−Ａ−０４５３０４１１は、確かにアジポイル側鎖に対する活性が改 善されたアシラーゼを例示しているが、アジポイル−セファロスポリンをまず生 成させる（化学的または本明細書に記載した方法と類似したＩ化学的方法による ）方法は全く記載してい工 以下に本発明の好ましい態様について詳細に記載するが、これらは説明のための ものに過ぎず、本発明はこれらの態様によって限定されるものではない。

実施例ｌ Ｐｅｎ１ｃｉｌｌｉＩｌｓ　ｃｈｒｙ＋ｏｇｅｎａｉ培養条件これらの方法で使 用するＰｃｎｉｃｉｌｌｉａｍ　ｃｈ＋ｙ＋ｏｇｅｎｕｍは、１１の蒸留水中に ラクトース−水和物１．５％（ｗ／ｖ）、コーン浸出液０．５％（ｖ／ｖ）、ペ プトン０．５％（Ｗ／　Ｖ　）、ＮａＣｌ　０．４％（ｗ／ｖ）　、ＭｇＳＯ４ −７Ｈ２００，０５％（ｖｒ　／　ｖ　）　、Ｋ　ＨＰ　Ｏ４０、０６％（Ｗ／ Ｖ）、ＦｅＣ１・６Ｈ００，０００５％（Ｗ／ｖ）、ＣｕＳＯ４・５８２００． ０００２％（Ｗ／Ｖ）　、寒天３．０％（Ｗ／Ｖ）を含むＬＣ３Ｂ培地（ｐＨ４ ，８）を含む平板上に保持した。

２５℃、相対湿度６５％で１２日間後、単集落を取り出し、ガラスピーズを含む ねじ栓付き試験管中の蒸留水２ｍｌに添加した。増殖培養物をかきまぜて解離し た後、その懸濁物を使用してライスフラスコに接種した。ライスフラスコは、３ 〜４倍体積の蒸留水で７分間洗浄し、３０秒ごとに混合した後、米の水の吸収が 約２５％になるまで排水した、天然長粒種の１ｌｎｃｌｅＢｅｎ転換米を２５ｇ ／２５０ｍｆフラスコで含んでいた。２５℃、湿度６５％で１２日間後、５０ｍ １の滅菌水で胞子をその米から洗い流した。その胞子懸濁物を使用して液体培地 に接種し、また、４℃で貯蔵するために培養液の親液性を付与した。

胞子を同体積の５％スキムミルクに添加し、滅菌アンプル中に凍結乾燥した。

ペニシリンの生産またはＲＮＡもしくはＤＮＡ源としての菌糸体の生産のために 、菌株を振とうフラスコ中で２段階醗酵した。接種段階は、１１の蒸留水にグル コース３．０％（Ｗ／ｖ　）　、ｐｈ＆＋ｍｔｍｅｄｉ＊　ｌ　、０％（Ｗ／Ｖ ）　、コーン浸出液３．０％（Ｖ／Ｖ）　、硫酸アンモニウム０．２％（Ｗ／Ｖ ）、Ｃａ　Ｃｏ　３０　、　５％（ｗ／ｖ）　、無水リン酸−カリウム０．０５ ％（Ｗ／Ｖ）　、ラクトース１．０％（Ｗ／Ｖ）　、−次乾燥酵母１．０％（Ｗ ／Ｖ）を含む培地５０ｍｊ！１５００ｍｊフラスコに１×１０８胞子を添加する ことにより開始した。インキュベーションは、直径７０ｍｍの円を描いて回転す る（２２Ｏｒｐｍ）盤上、２５℃、相対湿度６５％で行った。

４８時間インキュベーションした後、生産段階を、１１の蒸留水にＫＨ２ＰＯ４ ０，０５％（ｗ／ｖ）、Ｋ２Ｓｏ４ｏ、５％（Ｗ／Ｖ）、（ＮＨ４’）　２Ｓｏ ４１．０％（ｗ／ｖ）、ラクトース１２．０％（ｗ／ｖ）　、ｐｂ＊＋１ｓｃｄ 目２．７５％（Ｗ／　ｖ　）　、Ｃａ　ＣＯ３（沈降）１．０％（Ｗ／Ｖ）　、 ラード油１．０％（ｖ　／　ｖ　）の組成物を含む培地（ｐＨ６，６）３５ｍｊ １５００ｍｊフラスコに生長能力のある種子２ｍｊを移すことにより開始した。

オートクレーブ後、しかし接種の前に、滅菌した２５％アジピン酸ナトリウム（ ｐＨ６，６）を添加して最終のアジピン酸ナトリウム濃度を２．５％にした。次 いで、接種後、前段階と同じ条件下で５〜７日間インキュベーションを続けた。

形質転換のため、またはＤＮＡ源としてプロトプラストを生成させるために菌糸 体が必要な場合は、その菌株を、１！の蒸留水に５０ｍｊ！の２０　Ｘ　Ｃ１ａ ｆｌｃ＋ｂｉｃｋ塩（１２０ｇ（７）Ｎ　ａ　２　Ｎ　Ｏ３，１０、４ｇ　ノＫ 　Ｃｌ　−１０、４ｇ　（Ｄ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４＋＋７Ｈ２０，３０，４ｇのＫ Ｈ２ＰＯ４）　、２．０ｍＡのＶｏ（ｅｌ微量元素（０，３Ｍ（７）クエン酸、 ０　、　２　Ｍ　（’）　Ｚ　ｎ　Ｓ　Ｏ４，２５ｍＭのＦ　ｅ　（ＮＨ）　（ Ｓ　Ｏ）　・６　Ｈ２０１１０ｍＭのＣｕ５Ｏ３ｍＭのＭｎＳＯ４，８ｍＭのホ ウ酸、４　ゝ ２ｍＭのＮａ２Ｍ０Ｏ４−２Ｈ２０）　、５ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物 、１０ｇのグルコースを含む完全媒体（ＣＭ）５０ｍｌ　／２５０ｍｌフラスコ 中で生長させた。インキュベーションは、２２０ｒｐｍの回転盤上、２５℃で行 った。

上記したように調製した、４８時間培養して生長させた植物菌糸体を寒冷紗によ り濾取し、液体窒素中で凍結し、−夜凍結乾燥した。乾燥した菌糸体を乳鉢・す りこぎで砂とともにすりつぶし、１００ｍＭのＬｉＣｊ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、 １０ｍＭのＴｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ８，０）　、４％ＳＤＳの２５ｒ＋１に再懸濁 した。その懸濁物を６０℃の湯浴中で５０〜５５℃に加熱した後、その混合物を 、最初にＩＭのＴｒｉｓ　（ｐＨ８）飽和フェノール、次いでＴｒｉｓ飽和フェ ノール：クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）、次いでクロロホルムで抽出した。同 量の６Ｍ冷ＬＩＣ１を添加し、次いでその混合物を一２０℃で２〜３時間保持す ると、ＲＮＡが水相から析出した。４℃、１２０００Ｘｇで２０分間遠心分離し た後、上澄みを６６％（Ｖ／Ｖ）エタノール溶液にして、−２０℃で１５分間冷 却すると、ＤＮＡが析出した。上述したように遠心分離した後、ＤＮＡペレット を７０％エタノールで洗浄し、脱水してＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒ　ｉ　５− １（ＣＩ、ｐＨ７，５，１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。ＤＮＡ濃度を、アガ ロースゲル電気泳動において臭化エチジウムにより染色して、既知ＤＮＡ基準と 比較することにより推定した。

上記実施例１で記載した？ｎ１ｃｉｌｌｉＩｌｓ　ｅｈＢｓｏｇｔ＋＋ａｍの培 養を、２５℃、２２Ｏｒｐｍの回転盤上に載せた３５ｍ＃の醗酵培地中（醗酵条 件は前述した通り）で９６時間生長させた。菌糸体を、真空下、Ｗｂｓｌｍｔｎ 　１１フイルターにより濾取し、約５０ｍ１の水で洗浄した。直ちに菌糸体をそ のフィルターからこすり取り、５ｍｌの［破壊緩衝液Ｊ　（５０ｍＭのＴｒｉｓ −ＨＣＩ。

ｐＨ７，４，１５０ｍＭのＮａＣ１，５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８，０，５％の５ ＤＳ）に再懸濁し、液体窒素で凍結し、凍結乾燥した。−夜凍結乾燥した後、０ ．１％のＤＥＰＣを含む５ｍｌの水および５ｍＡのＬＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ ８）飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（５０：　５０　： 　１）を添加し、その混合物を振とうしながら３７℃で２０分間溶がした。混合 物を４℃、１２０００Ｘｇで１０分間遠心分離し、水相を分離して、最初にＩＭ のＴｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ８）飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコ ール（５０：５０：１）、２番目にＩＭのトリス（ｐ　Ｈ８）飽和フェノール、 ３番目にクロロホルムで再抽出した。同量の６ＭＬｉＣＪを最終的に得られた水 相゛と混合し、その溶液を一２０℃で最低４時間放置した。全ＲＮＡを４℃、１ ２０００Ｘｇで２０分間ペレット化し、そのペレットを０．３ｍｌのＴＥ緩衝液 ＋〇、０３ｒ＋１の３Ｍ酢酸ナトリウムに溶解し、２．５倍体積のエタノールを 添加してＲＮＡを両析出させた。最終的に得られたペレットを０、　１ｍｌのＴ Ｅ緩衝液に溶解し、ＲＮＡ濃度を、分光光度計による２６０ｎｍでの吸光度によ り測定した。

以下の操作で使用する　Ｓｌ＋ｅｐｌｏｍ７ｃｅｓ　ｃｌ＊ｗｕｌｉｇｅ＋ｕ＋ 菌株は、＾ＴＣＣ２７０６４であった。その菌株を、１１の蒸留水に酵母エキス ４ｇ１麦芽工キス１０ｇ１グルコース４ｇ、寒天２０ｇを含む（ｐＨ７，２）平 板上で維持した。３０℃で５日間生長させた後、２ｍｌの滅菌水をその平板に添 加し、培養増殖したものを寒天表面からこすり採った。得られた懸濁物を、ガラ スピーズを含む滅菌ねじ栓つき管に移した。培養増殖したものを、かきまぜて解 離させた後、その懸濁物を液体培地の接種に使用した。

また、その懸濁物は、最終体積が１５％になるまでグリセロールを添加して、− ７０℃での永久保存培地に使用した。

形質転換のため、またはＤＮＡ源としてプロトプラストを生成させるために菌糸 体が必要な場合は、その菌株を、ＩＩの蒸留水に酵母エキス３ｇ、ペプトン５ｇ 、麦芽エキス３ｇ１グルコース１０ｇ５シ＊糖３４０ｇ、ＭｇＣ１−６Ｈ０１， ０２ｇ、グリシン５ｇ、寒天１８ｇを含むＹＥＭＥ培地２００ｍ７／１１フラス コ中で生長させた。インキュベーションは、２２０ｒｐｍの回転盤上、２８℃で 行った。

上述したように調製した培地で４８時間培養して生長させた植物菌糸体を、２２ １００Ｘｇで１０分間遠心分離することにより集めた。その細胞を１０ｍｆのＴ Ｅ緩衝液に再懸濁し、ｉ　Ｑｍｇのリゾチームを添加して、その混合物を３０℃ で１５分間インキュベートした。次いで、１ｍｌの２０％ＳＤＳを添加し、次い ですぐに１０ｍ７のＴＥ　（ｐＨ８）飽和フェノールおよび１．５ｍｌの５Ｍ− ＮａＣＩを添加して、その混合物を２０分間静かに上下動させた。１２０００Ｘ ｇで１０分間、相分離を行った後、水相を取り出して新しい管に移した。同量の クロロホルムを添加し、その混合物を１０分間静かに上下動させた。再び１２０ ００Ｘｇで１ｏ分間遠心分離することにより相分離を行い、水相を取り出して新 しい管に移した。２倍体積のイソプロパツールを注意しながら添加し、析出した ＤＮＡを取り、最少量のＴＥ緩衝液に再溶解した。ＲＮＡアーゼＡを添加して最 終濃度を２Ｑｍｇ７ｍｌとし、その溶液を５０’Ｃで１時間インキュベートした 。次いで、１００ｍＭのＮａＣｊおよび０．４％のＳＤＳとともにプロテアーゼ Ｋを添加して最終濃度を１００ｍｇ／ｍｊとし、その混合物を３７℃で１時間イ ンキュベートした。その溶液を同量のＴＥ　（ｐＨ８）飽和フェノールで再び抽 出し、さらにクロロホルムで抽出した。最後の抽出により得られたＤＮＡを２倍 体積のイソプロパツールを添加した後に取り、その濃度を分光光度計による２６ ０ｎｍでの吸光度により測定した。

実施例５ 遺伝子ライブラリーの構築およびＳＩ＋ｅｐｌｏＢｃｃ＋　ｅｌｓｗａｌｉｇｅ ｒａｔＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよび５ａｉｌで消化した。消化されたＤＮ Ａを０．８％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、１．８〜２．２ｋｂの大きさ の断片を溶離し、予めＢａｍＨＩおよび５ａｉｌで消化しであるｐＵｃｉ８ＤＮ Ａに連結した。

連結混合物を希釈し、電気穿孔法（ＧｅｎｃＰｗｌ＋ｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒｔｄ。

Ｒｉｃｈｍｏｏｄ、　ＣＡ）によりコンピテントＪＭ１０９細胞に取り込んで形 質転換した。コンピテント細胞の作製および電気穿孔法の条件はともに、製造者 の指示に従った。形質転換混合物を１００　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリン および７５ｍ１の２％Ｘ−Ｇａ１を含むＬＢ平板上で平板培養した。３７℃で一 夜インキユベートした後、組換えコロニーを、プラスミドベクターβ−ガラクト シダーゼ遺伝子活性の不活化により無色になることから同定した。無色のコロニ ーを選んで、１００ｍｇ／ｍｊのアンピシリンを含む新しいＬＢ平板に移した。

３７℃で一夜生長させた後、コロニーをニトロセルロースに移し、複製連鎖反応 により作製した、公開された５ｌｒｅｐｌｏｓｙｃ！ｓ　ｃｌ＊ｒａｌｉｌｚｒ ｉｓエクスパンダーゼ遺伝子配列の５２〜９１８の塩基（Ｋｏマ＊ｃｅｙｉｃ　 ｅｔｌｌ、、（１９Ｂ９）　Ｊ、　Ｂ＊ｅｌｅ＋ｉｏ１．１７１ニア５４−７６ ０；およびＵ、　Ｓ、　５．０７０゜０２０〕に対応するプローブとハイブリッ ド形成させた。複製連鎖反応産物の標識を、（３２Ｐ）ｄＣＴＰおよびオリゴ標 識キットを使用し、製造者（Ｐｈ＊＋ｍ５ｃｉｔ、Ｐｉ＋ｃｓｌ！＋ｎｙ、　Ｎ ｅｗ　Ｉｅ口ｅｙ　）の指示に従ってランダムプライマー伸長法により行った。

！−イブリッド形成反応は、１１０６ＣＰの放射性同位体で標識したプローブ、 ３０％のホルムアミド、５ＸＳＳＣ（０，１５ＭのＮａＣｆ、０．０１５Ｍのク エン酸ナトリウム、ｐＨ７）、０．１％のＳ　Ｄ　Ｓ、５　ＸＤｅｅｔｌ息＋ｄ ｌ　（５ｇのフィコール、５ｇのポリビニルピロリドンおよび５ｇのＢＳＡ　（ ５００ｍＡの５０Ｘストツク用））および１００ｍｇ／ｍｊの牛胸腺ＤＮＡの存 在下、３７℃で一夜行った。いくつかの形質転換細胞がプローブと強くハイブリ ッドを形成した。うち１個のコロニーについて、制限酵素分析によりエクスパン ダーゼ遺伝子を有するベクターを含むことが確認され、このプラスミドをｐＦＴ ｓｏ−１と命名した。

実施例６ プラスミドＤＮＡの単離 プラスミドを含むＥ、ｅｏｌｉ培養液を５００ｍ１のＬＢ培養液（２０ｇ／ｊの り、Ｂ培養液ベース）　（Ｇｉｂｃｏ、　Ｐｓ口１ｅｙ。

５ｃｏｌｌｓｎｄ）中で、１５ｍｇ／ｍｉのテトラサイクリンとともに、３７℃ 、２２ｏｒｐｍの回転盤上で１２〜１６時間生長させた。

４℃、４０ｏｏｘｇで１０分間遠心分離することにより細胞をベレット状にした 。その細胞ベレットを１８ｍ１のグルコース緩衝液（５０ｍＭのグルコース、２ ５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８，０）　、１０ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、４０ｍ ｇ／ｍＡのりゾチーム（５１ｇｍ５．　Ｓｔ、Ｌｏａｉ＋、　ＭＯ）　／グルコ ース緩衝液を２ｍｌ添加して混合し、その混合物を室温で１５分間インキュベー トした。新しく調製した０、２ＮのＮａＯＨおよび１％のＳＤＳの溶液を４０ｍ １添加し、その混合物を静かに攪拌して氷上に１０分分間−た。次いで、５Ｍの 酢酸カリウム（ｐＨ４−８）３０ｍＪを添加して十分混合し、得られた混合物を 氷上にさらに１０分分間−た。細胞片を、４℃、４０００Ｘｇで１０分間遠心分 離することによりペレツト化し、得られた上澄みを寒冷紗フィルターにより濾過 した。プラスミドＤＮＡを析出させるためにイソプロパツール（０，６倍体積） を透明な上澄みに添加し、室温で２０分間インキュベートしている間に析出物が 生成した。プラスミドＤＮＡのベレット化を４℃、４０００ｘｇで２０分間行い 、次いで、７０％エタノールで洗浄して軽く乾燥した。そのベレットを９ｍｌの ＴＥ緩衝液に再懸濁した後、ＬｏｇのＣｓＣ１およびＬｏｎｇ／ｍ＃の臭化エチ ジウム溶液０．３８７ｍ１を添加した。この溶液を３１３．１１００Ｘで２４時 間遠心分離した。塩化セシウム勾配において得られたプラスミドのバンドを紫外 線により可視化して単離した後、臭化エチジウムを抽出用の飽和ブタノール水溶 液により除去した。次いで、プラスミドの作製に使用したＣ５Ｃｊ＋をＴＥ緩衝 液に対する透析により除去し、最後にＤＮＡをＰＥＧ　（ＭＷ８０００）を使用 して濃縮した。ＤＮＡの濃度は分光光度計による２６０ｎｍでの吸光度により測 定した。

Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉａｍ形質転換ベクターは、優性選択マーカーとしての７レオ マイシン耐性遺伝子を入れて構築した。これは、まず、フレオマイシン耐性遺伝 子（ＳＩ＋ｅｐｌｏｓｌｌｏｌｅｉｃｈａｔｂｉｎｄｕｓｌｔｎａｉ由来のフレ オマイシン結合蛋白遺伝子）を含み、酵母シトクロムＣ１ターミネータに結合し た６６Ｑｂｐ断片を、ＢａｍＨＩ／Ｂｇｌｌｌで消化したプラスミドｐＵＴ７１ ３（ＣＡＹＬＡ、ＴｏｗｌｏｗｓＣＣｔｄｅｘ、Ｆｒ５ａｃｓ　）からアガロー スゲル上で電気泳動して溶離することにより単離して行った。単離した断片はベ クターｐｓＥＬＥｃＴ　１　（１’τｏｍＢＳＣＤＩＩＩＯ口Ｌｉｏｎ　）のＢ ａｍＨＴ部位に連結し、遺伝子の方向は制限酵素分析により決定した。次に、λ 付着末端部位を含む５５０ｂｐのＰｓｔＴ断片を挿入して、適切な大きさの挿入 配列を含む場合はそのベクターを使用してニスミドが形成できるようにした。次 いで、？ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｂｒＹＩｏＨｔ＊ａｔｘイソペニシリンＮシン セターゼ（ＩＰＮＳ）遺伝子のプロモータ領域を含む１．５ｋｂのＮｃｏｒ／Ｂ ａｍＨｒ断片を、Ｎｅａｒ／ＢａｍＨＩで消化したＩ　ＰＮＳ遺伝子を含むゲノ ムクローンから（アガロースゲル上で電気泳動して溶離することにより）単離し た。単離したＩＰＮＳ−プロモータ断片をＢａｍＨＩ／Ｎｃｏｌで消化したベク ターに連結した。Ｎｃｏ１部位は、フレオマイシン耐性遺伝子のＡＴＧ開始コド ンにある。このベクターをｐＵＴＺ−２と命名する。

５ｌｔｅｐｌｏｓｙｃ！ｓ　ｃｌ＊ｗａｌｉＢ＋ｕｔエクスパンダーゼ遺伝子を 含む１．６４５ｋｂ断片をＢａｍＨＩおよび５ａｌｌで消化したｐＦＴｓｏ−１ （前述のベクター）から、０．８％アガロースゲル上で電気泳動して溶離するこ とにより精製した。単離した断片は、やはりＢａｍＨＩおよび５ａｌｔで消化し たベクターｐ　Ｓ　Ｅ　Ｌ　Ｅ　ＣＴ　（Ｐ＋ｏｍｅＨＣｏｒｐｏ＋５ｌｉｏｎ 　）に連結した。このベクターは、ｐＦＴｓｏ−８と命名した。新規Ｎｃｏ１部 位を、＾Ｈｉｒｅｄ　５ｉｔｅｓ　＋ａ　を目ｒｏ突然変異誘発系（Ｐ＋ｏ＊ｔ ｇ畠Ｃｏｔｐｏｒ＊目ｏｎ　）を使用したｐＦＴｓｏ−８の部位特異的突然変異 誘発によりエクスパンダーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドンに作った。突然変異誘発 は、製造者の指示に従って行った。オリゴヌクレオチドは、Ｈｒｚｐｌｏ■７ｅ ｅｌエクスパンダーゼ遺伝子の公開された塩基配列（Ｋ＋＋ｗｓｃｅｗｉｃ　ｔ ｌ　ｉｆ、、ｆ１９Ｈ）　ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆｏｌｅｌｅｒｉｏｌｏｇＦ、１ ７１．　ｐ、３９５２−３９５８）由来のＡＴＧ開始コドンにあるＤＮＡ領域の コード配列と相補的であるように構築した。

オリゴヌクレオチドの合成は、シアノエチル　ホスホラミディト化学（Ｐｂ轟ｎ ＋５ｃｉ１ＧｓＩＩｅ＾ｓ＋１ｂｌｅｒ　１ｎｓｌｒｏ＋＋ｅｎｆｒ目ｏｎ）に より行い、オリゴ塩基配列は次の通りであった。

配列番号、８ Ｓ’　ＣＧＡＧＡＧＧ＾丁ＣＡＧＴＧＡＧＡＧ丁ＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＧＡＣＧ Ｇ　３’突然熱度誘発は、制限酵素分析により確認した。次に、Ｐｃ＋＋ｉｃｉ ｌｌｉｓｍ　ｃｈＢｔｏＨｓ＋＋ｗｍイソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子のプ ロモータ領域を含む１．２ｋｂのＮｃｏＴ断片を、Ｉ　ＰＮＳ遺伝子を含むＮｃ ｏｌで消化したゲノムクローンから（アガロースゲル上で電気泳動して溶離する ことにより）単離した。Ｉ　ＰＮＳ−プロモータ領域は、エクスパンダーゼ遺伝 子のＡＴＧ開始コドンに突然変異誘発により作ったｐＦＴｓ。

−８ベクターの新規Ｎｅｏ　Ｔ部位に連結した。プロモータのエクスパンダーゼ 遺伝子に対する方向は、制限酵素分析により確認した。次いで、ＩＰＭＳ−プロ モータ：エクスパンダーゼ遺伝子カセットをＢａｍＨＩ／５ａｉｌ断片として、 上述したＰｔｎ１ｃｉｌｌｉａａ＋形質転換ベクターｐＵＴＺ−２のＢａｍＨＩ ／５ａｉｌ切断部位に移した。最終的な構成物をｐＰｅｎＦＴｓｏと命名した。

実施例８ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｌβ−チューブリンプロモータのクローン化Ｐｅ＋＋１ｃｉ ｌｌｉ＊ｓβ−チューブリン遺伝子を、ハイブリッド形成プローブとして＾＋ｐ ｔＢｉｌ１ｗ＋　ａ目！ｒβ−チューブリン遺伝子を使用して、　Ｐｅｅｉｃｉ ｌｌｉｗｍ　λゲノムライブラリーからクローン化した。このクローンの配列決 定および＾５ｐｅＢｉｌｌｉ＋　ｌ１ｉ（ｓｒのβ−デユープリン遺伝子の既知 アミノ酸配列との比較により、ＡＴＧ開始コドンで始まる９１％の相同率の領域 があることが確認された。機能性プロモータを含む配列が、開始コドンと１．４ ｋｂ上流のＢａｍＨ１部位との間で単離された。

Ｐｔｎ１ｃｉｌｌｉｕｓβ−チューブリンプロモータを有する形質転換ベクター の構築 Ｐｅｎ１ｃｉｌｌｉｎｓβ−チューブリンプロモータを含む２．０ｋｂのＸｂａ 　Ｉ／Ｈｆ　ｎｄ　ＩＩＩ断片を、やはりＸｂａｌ／Ｈｉｎｄ１１１で消化した ベクターｐ　Ｓ　Ｅ　Ｌ　Ｅ　ＣＴ　（Ｐｒｏ＠＠！ｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ Ｌｌ）に連結した。新規Ｎｃｏ１部位を、ＡＩｔｅｒｅｄ　５ｉｔｅｓ　＋ｎ　 ｗｉｔｒ。

突然変異誘発系（Ｐ＋ｏｗｅＩＣｏ＋ｐｏ＋ｌ１ｉｏａ　）を使用した部位特異 的突然変異誘発によりＡＴＧ開始コドンに作った。突然変異誘発は、製造者の指 示に従って行った。オリゴヌクレオチドはＡＴＧ開始部位領域に対して相補的に 構築したが、ＮｃｏＴ部位を作るため崖変更をいくつか挿入し、突然変異誘発の ためにり 使用した。オリゴヌクレオチド合成は、シアノエチル　ホスホラミディト化学（ Ｐｈｔｔａｔｃ目Ｇｃ＋＋ｓ＾＋＋ｔａｂｌｅｒ　ｉ＋＋＋ｌ＋ｕａＣｎｔｓｌ ｉｏ口）により行い、オリゴ塩基配列は次の通りであった。

配列番号、９ ５′　＾ＴＣＴＣＴＴＴ丁ＣＴ＾＾ＴＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧＡＧＡ ＴＴＧＴＡＣＧＴＧＡ丁ＣＣＣ３’突然熱度誘発は、制限酵素分析により確認し た。次に、Ｐｃ口ｉｃｉｌｌｉａｍβ−チューブリンプロモータを含む１．４ｋ ｂのＢ　ａ　ｍ　ＨＴ　／　Ｎ　ｃ　ｏ　Ｉ断片を、ＢａｍＨＩ／ＮｃｏＴで消 化したベクターｐＦＴｓｏ−８（前記実施例７に記載したベクター）においてｓ ’ｌ　＋ＢＩＯ１ｙｃｔｌエクスパンダーゼ遺伝子のＡＴＧに作ったＮｃｏ１部 位に連結した。このベクターをｂｔＦＴｓｏ−８と命名した。β−チューブリン プロモータを含む１．４ｋｂのＢａｍＨＴ／ＮｃｏＴ断片はまた、Ｂ　ａ　ｍ　 ＨＩ　／　Ｎ　ｃ　ｏ　Ｉで消化したベクターｐｔＪＴＺ−２（前記実施例７に 記載したベクター）にも連結した。この連結により、フレオマイシン耐性遺伝子 のすぐ前にβ−チューブリンプロモータが位置した。このベクターはｐＣ［−６ と命名した。次に、β−チューブリンプロモータエクスパンダーゼ遺伝子カセッ トを含む、ベクターｂｔＦＴＳＯ−８由来の２．４ｋｂのＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ 　ＩＩＩ断片をＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで消化したベクターｐｃＩ−６に 連結して、最終的なＰｅｎ１１１１１ｍｍ形質転換ベクターを得た。

このベクターにおいて、ＳｌｒｅｐｌｏｍｙｔｅｓエクスｔＺンダーゼ遺伝子お よびフレオマイシン耐性マーカーをβ−チューブリンプロモータから発現させた 。このベクターをｐＴＳ−２と命名した。

実施例９ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　（ＧＡＰ）プロモータのクローン化Ｐｅｎｉｃｉｌｌ ｉｕｍグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子を、 ＾＋ｐｅＢｉｌｌｕｓ　ｎｌ（ｅ＋由来のＧＡＰ遺伝子をハイブリッド形成プロ ーブとして使用することにより、Ｐｔｎ１ｃｉｌｌｉｕ＋ｅλゲノムライブラリ ーからクローンイヒした。陽性の可能性がある４個のクローンについて、Ｃｅｐ ｈｅｌｏ＋ｐｏ＋ｉｕｍＧＡＰ遺伝子（Ｋｉｍｕｚ、　Ｆｌ、　ｓｌ　＋１．、 （１９９１１，１，Ｆｅ【ｎ、　５ａｄＢｉｏｔＢ、、　Ｔｌ、　１４５−１５ ０）の５′領域のプライマーから生じたＰＣＲ産物によりさらに探索した。複製 連鎖反応（Ｆ’（１，Ｒ）のプライマーに使用したオリゴヌクレオチドは、シア ノエチルホスホラミディト化学（Ｐｈ＊＋ｍ畠ｅｉＩＧｅｎｅ　Ａｓ＋！ｍｂｌ ｅ＋Ｉｌｌ自ｒ＊５ｃａＮｌｉｏｎ）により合成し、オリゴ配列は次の通りであ る。

配列番号；１０ Ｓ’　ＣＧＣＧＧＡ丁ＣＣＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴ 　３’配列番号１１ ５’　ＣＧＣＧ＋、ＡＴＣＣＧＧＧＣＡＣＧＣＧＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＣＣＡＧ ＴＧ　３’４個の陽性と目されたクローンの１個が、ＰＣＲ産物とクロスハイブ リッド形成した。このゲノムクローンのＢａｍＨＩ断片（４ｋ　ｂ）を、配列決 定目的でＢａｍＨＩで消化したベクターｐ　Ｓ　Ｅ　Ｌ　Ｅ　ＣＴ　（Ｐｒｏｎ ｅｇＩＣｏ＋ｐｏ＋５ｌｉｏｎ　）に連結した。このベクターをｐＴｓ−ｃ）と 命名した。この断片を配列決定すると、セファロスポリンＧＡＰ遺伝子の既知配 列との比較によりＡＴＧ開始コドンが確認された。

Ｐｓｎｉｅｉｌｌｉｗｍ　（ＧＡＰ）プロモータを有する形質転換ベクターｉ豊 ！ Ｐｅｎ１ｃｉｌｌｉｎｓ　Ｇ　Ａ　ＰプロモータにＳｌ＋ｅｐｌｏｍ７ｃｅｓエ クスパンダーゼ遺伝子を入れるために、ベクターｐ”ｒｓ−ｏを使用したｉｎ　 ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発により新規ＮｃｏＴ部位をＰｅ口ｉｃｉｌｌ ｉｗｍ　Ｇ　Ａ　Ｐ遺伝子のＡＴＧに作った。突然変異誘発は、製造者の指示に 従って行った。オリゴヌクレオチドは、ＧＡＰ遺伝子のＡＴＧ開始コドンのＤＮ Ａ領域をコードする配列に相補的であるように構築したが、Ｎｃｏ１部位を作る ために塩基を変えて挿入した。オリゴヌクレオチドの合成はシアノエチルホスホ ラミディト化学（Ｐｈｓｒ＋＋＊ｅｉ＊　Ｇｔｌｌｅ　ＡＩＩｅｍｂ１ｅｔｉ！ １ｔｌｒｔ■ｅ＋＋ｊ＊ｌｉｏｍ　）により行い、オリゴ配列は次の通りである 。

配列番号：１２ ５’　ＣＡＧＴＡＡ＾ＣＧＣＡＡＣＣ＾丁ＧＧＴＴＧＴＣＣＡＧ　３’突然熱度 誘発は、制限酵素分析により確認した。次に、ＧＡＰプロモータを含むｐＴｓ− ０のＮｃｏｌ／ＢａｍＨｒ断片（１，９ｋｂ）をＮｃｏｒ／ＢａｍＨＩで消化し たベクターｐＦＴｓｏ−８（上記実施例７に記載のベクター）に連結し、Ｓｌｒ ＋ｐｌｏｍ７ｅ１エクスパンダーゼ遺伝子とともにＧＡＰプロモータの位置付け た。このベクターをｐＴｓ−ｏ−ｔと命名した。

次に、ＧＡＰプロモータ：エクスパンダーゼカセットを含むｐ”ｒｓ−ｏ−ｉの ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片（３，０ｋｂ）をＢａｍＨｒ／Ｈｉｎｄ　Ｉ ＩＩで消化したベクターｐｃＩ−６（上記実施例８に記載のベクター）に連結し て、ＧＡＰプロモータからＳｌｔξ１ｌｌｌｌｌ１７ｅｌｌエクスパンダーゼ遺 伝子が発現する最終的なＰｅｎ１ｃｉｌｌｉｎｓ形質転換ベクターｐＳＤ−１を 得た。

実施例１０ ？ｎｉｃｉｌｌｉｗｍ　ｃｂＢ＋ｏｌｔｎ＊ｉの形質転換上記Ｐｚｎｉｅｉｌｌ ｉａｍ　ｃｈＢｓｏｇｔｎａｍ菌株由来のプロトプラストを、２５℃、２２０ｒ ｐｍの回転盤上で６７時間、５０ｍ１のＣＭ培養液に１×１０７個の胞子を接種 することにより生成させた。

菌糸体を寒冷紗上に濾取し、５００ｍｊ！容フラスコに移し、１００ｍｇのＮｏ ｙｏｔ７ｍｅ　２３４ｆＮｏｖｏ　ＢｉｏＬｓｂｓ、　Ｂｓｇｓｔ＊ｅ＋ｄ、Ｄ ｅｎ＋ｕ＋ｋ）を含む２５ｍ７のＫＭＰ　（０，７ＭのＫＣｌ５０．８Ｍのマン ニトール、０　、　０２　Ｍ　（Ｄ　Ｋ　Ｐ　Ｏ４、ｐ　Ｈ６、３）　ｌ：　再 懸１１＋１　シ、３０℃、１１００ｒｐでインキュベートした。スフェロプラス トを寒冷紗／グラスウールフィルターでの濾過により分離し、３５０Ｘｇで１０ 分間遠心分離することによりペレット化した。

次いで、スフェロプラストを１０ｍｆのＫＭＰ緩衝液で３回洗浄し、ＫＭＰＣ（ ５０ｍＭのＣａ　Ｃ１２を有するＫＭＰ）に再懸濁して５Ｘ１０７細胞／　ｍ　 ｌの濃度にし、室温で２０分間放置した。Ｐｅｎ１ｃｉｌｌｉｎｓ　（Ｄ形質転 換のために、２００ｒｒ＋１のスフ二ロプラスト懸濁物を、５０ｍ／のＰＰＣ（ ４０％ＰＥＧ。

ＭＷ３５００．２０ｍＭのＫＰＯ４，ｐＨ６，３，５９６Ｃａ　Ｃ１２は使用直 前に添加した）とともにＤＮＡ　（５ｍｇ／ｍｌヘパリンを含む５ｍｇのベクタ ーＤＮＡ／６．２ｍｇのＫＭＰＣ）に添加し、形質転換混合物を氷上で３０分間 インキュベートした。新しく調製したＰＰＣ１ｍｊ！を添加し、その混合物を５ ０ｍｊの溶融した（５０℃）再生寒天（ＣＭ＋１．３Ｍのマンニトールおよび３ ％寒天）に移した。次いで、形質転換混合物を５枚のペトリ皿に分配した。２５ ℃で２４時間再生した後、プレートに、１００ｍｇ１５０ｍｇ　ＯＬ　（１％ペ プトン／１％寒天）゛のフレオマイシンを含むＯＬを上塗りした。上塗りの量は 再生寒天の量に等しい。プレートは、２５℃で７〜１４日間インキュベートし、 形質転換コロニーの発生を観察した。

高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）を使用して、使アジポイル−７ −ＡＤＣＡの生産の分析を行った。その分析は、６２５溶媒供給システム、２２ ０ｎｍおよび２５４ｎｍにセットした４９０Ｅ可変波長検出器、８２５１ｔｌｓ データシステムおよび固定相としてのＮｏｖｏ−Ｃ−１８カラムを有するＷＮ！ ＋＋システムで行った。移動相（流量は１ｍ１／分）は、２％メタノール／７９ ８％のＯ，ＯＩＯＭ−ＫＨ２ＰＯ４によるインクラティク溶離を５分間、２→４ ０％直線勾配のメタノール１０．０１０Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７，０を１５分 間とした。アジポイル−６−ＡＰＡの定量は、２２０　ｎ　ｍでの標準ペニシリ ンＮの基準線を使用してめ、アジポイル−７〜ＡＤＣＡの定量は２５４ｎｍでの 標準デアセトキシセファ０スポリンの基準線を使用してめた。

アジポイル−６−ＡＰＡおよびアジポイル−７−ＡＤＣＡのペニンリナーゼ処理 に対する感受性の分析を、濾液に１単位／ｍｌのベニシリナーゼＩまたはペニシ リナーゼＩ１１を添加し、室温で１０〜３０分間インキュベートすることにより 行った。

これらのサンプルを、上記と同じＨＰＬＣ条件下で分析した。

アジポイル−６−ＡＰＡおよびアジポイル−７−ＡＤＣＡ物質のＵＶスペクトル 分析を５１０溶媒供給システム、９９ｏフオトダイオードアレイ検出器、９９０ データシステム″および固定相としてのＮｏｖｏ−Ｃ−１８カラムを有するＷｓ ｔｅ目シスデシステムして行った。使用した移動相は上記と同じ条件であった。

全醗酵培養液からのアジポイル−７−ＡＤＣＡ物質の大規模な単離を、５１０溶 媒供給システム、９９０７オトダイオードアレイ検出器、９９０データシステム および固定相としてのｍＢｏｌＩｄｘｐ＊ｋ　Ｃ１８予備カラムを使用した１ｌ ｌｌｃｒｔシステムを使用し。

て行った。移動相（流量は５ｍ１７分）は、０．０１０Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ ７，０によるイソクラティク溶離が３５分間であった。アジポイル−７−ＡＤＣ Ａ物質の保持時間に対応する吸収ピークをフラクションコレクターにより集めた 。

寒天拡散バイオアッセイを使用して、ＨＰＬＣにより単離したアジポイル−６− ＡＰＡおよびアジポイル−７−ＡＤＣＡ醗酵物質の抗生活性を測定した。２Ｑｍ ｌの単離物質を、ＬＢ寒天平板培地（Ｂ＆ｔｉｌｌｏ＋　５ａｂｌｉｌｕ＋　Ａ ＴＣＣ３３６？７またはＥ、ｃｏｌｉ超感受性感受性菌株ｏｆ、　Ａ＋ｎｏｌｄ 　Ｌ、　Ｄｅｍｔｉｎ、　ＭＩＴからの提供）を接種した３％寒天（Ｇｉｂｅｏ 、　Ｐｓ目１ｅ２．　５ｃｏｌ１１ｎｄ）を有する２０ｇ／＋ａｂｌｉｌｏｓを アジポイル−６−ＡＰＡ物質を分析するための指ＡＤＣＡ物質を分析するための 指示菌株として使用した。３７℃で１５時間インキュベートした後、ディスク周 辺の指示細菌の生長が半分阻害されると、その物質が生理活性を有することを示 す。この実験におけるコントロールは、デアセトキシセファロスポリンＣ１セフ ァロスポリンＣ１ペニシリンＶおよびβ−ラクタム構造確認のためのコントロー ルとしてのベニシリナーゼを含んだ、または含まない寒天であった。

全醗酵培養液から精製したアジポイル−７−ＡＤＣＡ物質を、ＲＡＥＶ酵素（Ｒ ＡＥＶ　Ｃａｒｐ、から市販されたもの）の比活性を測定するための基質として 使用した。０．１６ＭのＫＨ２ＰＯ４に１０ｍＭの基質、１ｍｇのＲＡＥＶ酵素 、５％のグリセロールを含む全体積５０ｍ１の反応混合物を３７℃でインキュベ ートした。０．１．３．５．１０．２０および３０分後に５ｍｌずつ取り、３５ ｍ１の０．ＯＩＯＭ−ＫＨ２ＰＯ４、ｐｔＴ３．５で希釈して一７０℃に冷凍し た後、前記条件下でのＨＰＬＣ分析を行った。

比色用のアジポイル−ｐ−アミノ安息香酸基質に対するＲＡＥＶ酵素の活性を、 ０．０６５Ｍ（７）ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７，０に５ｍＭの基質、８．２５ｍｇの ＲＡＥＶ酵素、１０％のグリセロールを入れて全体積５０ｍ１とし、これを使用 して３７℃で３０分間分析した。反応は、９６ウエルのマイクロタイターディツ シュで行った。１／１００に希釈したＩＭのＮ　ａ　Ｎ　Ｏ２／　０　、　２５ 　Ｍ酢酸を５０ｍ１添加して反応を停止し、その反応物を室温で３分間放置した 。Ｌｏｎｇ／ｍｊの４−アミノ−５−ヒドロキシ−２，７−ナフタレン−ジスル ホン酸−ナトリウム塩水和物／水を０．５ＭのＮ　ａ　ＨＣＯ３で１／１００に 希釈し、その１００ｍ７を添加して、ＥＬ３１２Ｂｉｏ−Ｋｉｎｅｌｉｃ＋　Ｐ ＩＩｌｅ　Ｒｅ５ｄｅｒ　（ＢｉｏＴｅｋ　Ｉｎ５ｔｒｉｓｅｎｌｓ）により５ １５ｎｍですぐに発色をモニターした。

アジポイル−７−ＡＤＣＡ基質を使用したＲ　’、　Ｅ　Ｖ酵素（ＲＡＥＶ　Ｃ ｏｒｐ、から市販されたもの）分析を全てＨＰＬＣでモニターしたが、これは、 ６２５溶媒供給システｉｓ　２０３ｎｍおよび２５４ｎｍにセットした４９０Ｅ 可変波長検出器、８２５ｉ１ｓｘｉｓｓデータシステムおよび固定相としてのＮ ｏマｏ−Ｃｌ３カラムを有するＷｅｌｔ目シスデシステムして行つた。移動相（ 流量は１　ｍＡ　／分）　ハ、２％メタノール／９８％＋７）Ｏ，ＯＩＯＭ−Ｋ ＨＰＯ、ｐＨ３，５によるイソクラティク溶離を５分間、２→４０％直線勾配の メタノール１０．ＯＩＯＭ−ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ３，５を１５分間とした。反応 物質の保持時間をモニターするために標準７−ＡＤＣＡを使用した。反応物質の 定量は、２５４ｎｍでの標準７−ＡＤＣＡの基準線を使用してめた。

’Ｃ−ＮＭＲ（広幅プロトンデカップル）スペクトルを、フーリエ変換方式のＩ ＢＭ−ＡＦ−３５０分光器ニより７５．４ＭＨｚ（７、ＩＴ）でめた。サンプル は、０．５ｍｌのＤ２０（９９，８％Ｄ　、　ＡＩｌ＋ｉｅｈ　）または０．５ ｍｌのＤＭＳＯ−ｄ６　（９９，Ｏ％Ｄ　、　Ａｌｄ＋ｉｃｈ　）における醗酵 培養液から得た５０ｍｇのアジポイル−７−ＡＤＣＡ物質から成り、３５０″″ にで５ｍｍの管に入れた。ＮＭＲデータにより、その物質がアジポイル−７−Ａ ＤＣＡであることが確認された。

実施例１６ 別のアジポイルアシラーゼ酵素の評価 ＲＡＥＶ酵素を使用した研究の他に、アジポイル−７−ＡＤＣＡ　（および他の アジポイル化合物）からのアジポイル側鎖の脱離を、種々の微生物源から得た酵 素により例証した。

最初の研究では、？ｅｍｄｏｇ＋ｏｉｇｓ　ｎ　Ｉｆ株ＳＥ−［１３および５Ｅ −４９５（日本国微工研に各々、ＦＥＲＭ　ＢＰ−Ｈ〕およびＦＥＩＩＭ　ＢＰ −１１１８の受託番号で寄託されている。）ならびにＰｓｅｇｄｏ■０■＠菌株 ５Ｔ−７７−１（ｔｈｅ　Ｎｏ＋ｌｂｅ＋ａ　Ｒｅ１ｉｏｎｓｌ　Ｒ５５ｅｓｔ ｃｈ　Ｌ＊ｂｏｒｔｌｏｒｙにＮＮＩＬＢ−１１０７０の受託番号で寄託されて いる。）を、２．０％（Ｗ／Ｖ）のＨ７Ｃｉ＋ｅ　ＳＦ　ｓ　Ｏ，５％（Ｗ／Ｖ ）のグルタミン酸−ナトリウム、０．５％（Ｗ／Ｖ）の酵母エキス、０．２％（ Ｗ／Ｖ）のコーンステイープ粉末、０．５％（Ｗ／Ｖ）の綿実油および０．１％ （Ｗ／Ｖ）のグルタル酸を含む培地で７２時間生長させた。細胞を遠心分離によ り集め、５０ｍＭのリン酸塩緩衝液、ｐＨ８，０で洗浄した後、緩衝液に再懸濁 し、少量のクロロホルムを添加することにより外膜を透過性にした。次いで、細 胞懸濁物の一部をアジポイル−ｐ−ニトロアニリン（ａｄ−ＰＮＡ）と混合し、 ３０℃で２〜１８時間インキュベートした。

インキュベージタン後、その混合物を１０％（Ｖ／ｖ）の酢酸を添加することに より酸性にした。遊離したｐ−ニトロアニリンを次いで、γ−グルタミルートラ ンスフェラーゼ（Ｓｉｆｓ＊製品番号５４５−Ａ　）の分析用の試薬（キット型 、Ｓｉ（ｉ８Ｃｂｅｍｉｃ８１Ｃｏ■ｐＨ製）を使用してジアゾ化合物に変換し た後、比色法により検出した。３種類の菌株の相対的活性は、各々、５Ｅ−４９ ５，５Ｅ−８３おヨヒ５Ｔ−７７−１１，ｍ対し７１００％、８５．５％および ４８％であった。上記ＲＡＥＶ酵素に対して記載したものと同様の方法を使用し て、ＳＦ−８３および５Ｅ−４９５酵素のアジポイル−７−ＡＤＣＡに対する活 性も示された。５Ｙ−７７刊のアジポイル−７−ＡＤＣＡｌ、ｊｌするデアシル 化活性は、この菌株がβ−ラクタマーゼを生成するため、示すことができなかっ た。

同様にして、２種類の真菌性菌株（ＡＩｌｅｒｎｓｒｉｓ　ｓｐ、Ｍ＾−１３３ 、＾ＴＣＣＮｏ、２０４９２およびＡｓｐｅｒｌｉｌｌｉ＋　＋ｐ、ＭＡ−Ｈ１ ＡＴＣＣＮｏ、２０４９１　；Ｕ、　Ｓ、　４．１４１．７０　（明治製菓）参 照）およびＩｔ、　Ｓ、　３．２３９．３９４（Ｌｒｅｋ　＆　Ｃｏ、、Ｉｎｃ 、　）にセファｏスポリンＣアシラーゼ生産源として記載されている３種類の別 の細菌性菌株（Ｂ＋＊ｔｉｂ＊ｃｌｓ＋ｉｗｍ、＾ＴＣＣＮｏ、１４，６４９　 ；　＾ｃｈｒｏ＠ｏｂｚｅｌｔ＋ｉｎｓ、＾ＴＣＣＮｏ、　１４．６４８　；お よびＮ＊ｔｏｂ＊ｃｌｔｒｉｏｍ、＾ＴＣＣＮｏ、　１４．６５０）についても 、アジポイル−アシラーゼ産生が示された。

〔配列表〕

配列番号：１ 配列の長さ＝１４ 配列の型：核酸 トポロジー；直鎖状 配列の種類：　Ｇｅ＋＋ｏｍｉｃ　ＤＮＡ配列 配列番号：２ 配列の長さ＝１６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：　Ｇｔ＠ｏｍｉｔ　ＤＮＡ配列 ＧＴＧＡＧＡＧＴＴＧ　ＡＴＧＧＡＣ 配列番号：３ 配列の長さ：１６ 配列の型二核酸 鎖の数二二末鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：　Ｇｔｓｏｍｉｃ　ＤＮ＾配列 τＣＴＡＧＡＣＡＣＴ　ＡＴＣＧＡＣ 配列番号：４ 配列の長さ＝１６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：　Ｇ＜ａｏｍｉｃ　ＤＮ＾配列 τＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣ 配列番号＝５ 配列の長さ＝２２ 配列の型二アミノ酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

配列番号二６ 配列の長さ、２２ 配列の型二アミノ酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー二直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号ニア 配列の長さ・２２ 配列の型二アミノ酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号：８ 配列の長さ、３４ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類二Ｇｓ＋＋ｏｍｉｅ　［ｌＮＡ配列 ＣＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＧ　ＡＣＧＧ配 列番号：９ 配列の長さ＝４７ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：　Ｇｅｅｏｍｉｃ　ＤＮ＾配列 配列番号＝ＩＯ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：　Ｇｃｅｏｍｉｃ　ＤＮ＾配列 ＣＧＣＧＧＡτＣＣＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＧ　ＧＣＴＴＣＧＧＴＣＧ　ＴＡＴ配 列番号：１１ 配列の長さ：３４ 配列の！！：核酸 鎖の数ニー重鎮 トポロジー　ａ鎖状 配列の種ＩＩ　：　Ｇ＠＊ｏ＊ｉｃ　ＤＮＡ配列 配列番号：１２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎮 トポロジー：直鎖状 配列の種類：　Ｇ■ｏｓｉｃ　ＤＮＡ 配列 ＣＡにＴＡＡＡＣにＣＡＡＣＣＡＴＧＣＴＴ　ＧＴＣＣＡＧ補正書の写しく翻訳 文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．７−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）を製造する ための新規生化学的方法において、下記工程： １）イソペニシリンＮを産生するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ ｕｍ菌株を、それが生育できる培養培地中で維持し、該培養培地にアジピン酸ま たは該Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株によって同化・利 用され得る１種以上のその塩およびエステルを含むアジペート源を添加してアジ ポイル−６−アミノペニシラン酸（アジポイル−６−ＡＰＡ）を製造する工程で あって、該Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株は、アジポイ ル−６−ＡＰＡを基質とすることができるエクスパンダーゼ酵素の活性をコード するＤＮＡによって形質転換されており、その酵素の発現に際し、該菌株によっ て産生されたアジポイル−６−ＡＰＡがｉｎｓｉｔｕで環拡張されてアジポイル −７−ＡＤＣＡを生じる工程；および ２）該アジポイル−７−ＡＤＣＡをアジポイルアシラーゼと接触させることによ りアジポイル側鎖を脱離して７−ＡＤＣＡを生成し、次いで該物質を単離する工 程を含むことを特徴とする生化学的方法。
2. ２．アジペート源がアジピン酸二ナトリウムであることを特徴とする請求項１に 記載の生化学的方法。
3. ３．エクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡがＳｔｒｅｐｌｏｍｙｃｅ ｓ　ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ　ＡＴＣＣ２７０６４に由来することを特徴とす る請求項１に記載の生化学的方法。
4. ４．アジポイルアシラーゼがＰｓｅｎｄｍｏｎａｓ属に由来することを特徴とす る請求項１に記載の生化学的方法。
5. ５．Ｓｔｒｅｐｌｏｍｙｃｅｓ　ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ　ＡＴＣＣ２７０６ ４に由来するエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡおよび該エクスパ ンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡの発現を促進するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕ ｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　ＩＰＮＳ遺伝子のプロモータを含む組換えＤＮＡ 発現ベクター。
6. ６．プラスミドｐＰｅｎＦＴＳＯを含むことを特徴とする請求項５に記載の発現 ベクター。
7. ７．Ｓｔｒｅｐｌｏｍｙｃｅｓ　ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ　ＡＴＣＣ２７０６ ４に由来するエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡおよび該エクスパ ンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡの発現を促進するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕ ｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　ＩＰＮＳ遺伝子のプロモータを含む組換えＤＮＡ 発現ベクターで形質転換したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿 主細胞。
8. ８．発現ベクターがプラスミドｐＰｅｎＦＴＳＯを含み、ＰＣ１００、ＡＴＣＣ ＿＿＿＿＿＿であることを特徴とする請求項７に記載の形質転換宿主細胞。
9. ９．遺伝子発現に適する条件下で組換えＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇ ｅｎｕｍ宿主細胞を培養する工程を含み、該組換え宿主細胞がＳｔｒｅｐｌｏｍ ｙｃｅｓ　ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ　ＡＴＣＣ２７０６４に由来するエクスパ ンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡおよび該エクスパンダーゼ酵素の活性を コードするＤＮＡの発現を促進するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅ ｎｕｍ　ＩＰＮＳ遺伝子のプロモータを含む組換えＤＮＡ発現ベクターを含むこ とを特徴とする方法。
10. １０．組換え宿主細胞がプラスミドｐＰｅｎＦＴＳＯから成る組換えＤＮＡ発現 ベクターを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。