SK282387B6 - Bioproces na prípravu 7-ADCA - Google Patents

Abstract

Je opísaný bioproces prípravy medziproduktu na prípravu cefalosporínových antibiotík, kyselina 7-aminodeacetoxycefalosporánová /7-ADCA/, v ktorom sa kmeň Penicillium chrysogenum kultivuje za prítomnosti adipátového prípravku tak, že produkuje adipoyl-6-APA /kyselinu 6-aminopenicilánovú/ a pri expresii génu expandázy in situ, t. j. odvodenej zo Streptomyces clavuligerus, ktorým bol kmeň Penicillium chrysogenum transformovaný, konvertuje adipoyl-6-APA rozšírením kruhu na dipoyl-7-ADCA. Konečný produkt 7-ADCA je potom pripravený odštiepením bočného adipoylového reťazca za využitia adipoylacylázy.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka syntetických metód na prípravu komerčných cefalosporínových antibiotík, ktorých je teraz už veľké množstvo a ich vývoj sa nachádza v štvrtej generácii. Veľká rozmanitosť bočných reťazcov pri komerčných cefalosporínoch a značná ekonomická dôležitosť cefalosporínov, viedla k záujmu vytvoriť ekonomickejšie a tiež účinnejšie metódy prípravy kľúčových medziproduktov, ktoré umožňujú priamu syntézu rôznych cefalosporínov.

Jedným z týchto kľúčových medziproduktov je 7-aminodeacetoxycefalosporánová kyselina /7-ADCA/ so vzorcom:

7-ADCA sa teraz vyrába z penicilínu G a vyžaduje päť alebo šesť chemických stupňov na rozšírenie kruhového systému penicilínu z päťčlánkového na šesťčlánkový kruh, ktorý je pre cefalosporíny charakteristický. Pre totálnu chemickú syntézu je typické, že tento proces vykazuje závažné nedostatky. Medzi tieto nedostatky patrí viacstupňový a komplexný proces, drahé reagencie, značné množstvo vedľajších produktov, s čím súvisia problémy úpravy tekutých odpadov a tiež vyčistenie vysoko nečistého východiskového materiálu, pred započatím chemického postupu. Vzhľadom na tieto skutočnosti sa uskutočňoval dlhý čas výskum, zameraný na vytvorenie mikrobiologického alebo, fermentačného procesu, ktorý by viedol k enzymatickému rozšíreniu kruhu a k odštiepeniu bočných reťazcov a príprave 7-ADCA na ďaleko ekonomickejšej báze než je to pri chemickom procese, ktorý sa používa teraz.

Vynález teda spadá najmä do oblasti prípravy kľúčového medziproduktu cefalosporínu 7-ADCA a zvlášť sa týka bioprocesu na prípravu 7-ADCA.

Až doteraz sa výskum vhodného bioprocesu na prípravu 7-ADCA nestretol s úspechom, a to s ohľadom na komerčné hľadisko prípravy. Bolo síce možné pripraviť E-aminopenicilánovú kyselinu /6-APA/ priamou fermentáciou a/alebo enzymatickou transformáciou penicilínu G, pričom bolo potrebné len rozšíriť kruh na získanie 7-ADCA, bolo však bohužiaľ zistené, že enzýmy mikroorganizmov Cephalosporium alebo Streptomyces, ktoré uskutočňujú rozšírenie kruhu svojou normálnou metabolickou dráhou, nemôžu využiť 6-APA ako substrát. Tieto enzýmy, ktoré sa v literatúre nazývajú expandázy, sú definované ako enzýmy, ktoré katalyzujú rozšírenie cyklických štruktúr, ktoré sa nachádzajú v molekulách typu penicilínu na šesťčlánkové cykly, nachádzajúce sa v cafalosporínoch. V ďalšom texte budú nazývané „expandáza“.

Substrát, na ktorý expandáza pôsobí, je penicilín N, ktorý po rozšírení cyklu dáva deacetoxycefalosporín C /DAOC/. Je len nutné odštiepiť /D/-a-aminoadipoylový bočný reťazec k vzniku 7-ATCA, ale ukázalo sa, že tento bočný reťazec je takmer úplne rezistentný voči enzymatickému odštiepeniu a výsledkom sú neprijateľne nízke výťažky.

Podľa vynálezu bolo možné dosiahnuť účinný bioproces, pri ktorom sa penicilínová zlúčenina /s adipoylovým bočným reťazcom/ vyrobí novým fermentačným procesom a táto zlúčenina je potom vhodným substrátom pre systém expandázy, ktorý je produkovaný in situ rovnakým mikroorganizmom, ktorý produkuje penicilínovú zlúčeninu a ktorý bol transformovaný na expresiu uvedeného systému ex pandázy. Expandáza potom pôsobí na rozšírenie kruhu penicilínovej zlúčeniny a vytvára tak cefalosporínová zlúčeninu s vysokým výťažkom. Dôležité je, že v druhom kritickom stupni je možné bočný reťazec penicilínovej zlúčeniny, teraz cefalosporínovej zlúčeniny, odlúčiť pomocou ďalšieho enzýmového systému počas dosiahnutia vysokých výťažkov. Neočakávaný výsledok tohto unikátneho bioprocesu, podľa vynálezu, vedie k prekvapujúco vysokým výťažkom 7-ADCA.

Doterajší stav techniky

Cantwell a kol. v Curr Genet /1990/ 17: 213 - 221, navrhol bioproces na prípravu 7-ADCA rozšírením kruhu penicilínu V a následnou enzymatickou hydrolýzou, výsledného deacetoxycefalosporínu V s cieľom prípravy 7-ADCA: Tento návrh je založený na dostupnosti klonovaného génu penicilín N expandázy /ceflE/ z mikroorganizmu Streptomyces clavuligerus, Kovacevic a kol., J. Bacteriol. /1989/ 171: 754 - 760 a U.S. 5,070,020. Expandáza však pôsobí na penicilín N, ktorý je jej prirodzeným substrátom, nie však na penicilín V a navrhnutý proces vyžaduje aplikáciu metód genetického inžinierstva, s cieľom modifikácie génu expandázy, ktorá pôsobí na rozšírenie kruhu penicilínu V. Požadovaná modifikácia nebola Cantwellom a kol. dosiahnutá a podarilo sa im len uspieť pri transformácii Penicillium chrysogenum s cef E génom zo Streptomyces clavuligerus a docieliť nízky stupeň expresie DAOCS expandázy.

Expandáza bola skúmaná ako s ohľadom na jej aktivitu, tak aj na genetickú sekvenciu. napr., vo Wolfeho US patentoch 4, 510,246 a 4,536,476 sa opisuje izolácia cyklázy, epimerázy oddelene z bezbunkového extraktu prokaryotických organizmov, produkujúcich β-laktámy vrátane Streptomyces clavuligerus, takže vznikli stabilné enzýmové preparáty. V EP-A-0 366 354 sa opisuje izolovaná a vyčistená expandáza zo Streptomyces clavuligerus vrátane koncového rezídua a aminokyselinového zloženia a uvádza sa, že má molekulovú hmotnosť cca 34 600 daltonov. V US patente 4,536,476 sa na rozdiel od toho uvádza, že ide o molekulovú hmotnosť 29 000 daltonov pri, pravdepodobne, tom istom enzýme. V EP-A-0 233 715 sa opisuje izolácia a charakteristika expandázy pomocou reštrikčnej endonukleázy, získanej zo Streptomyces clavuligerus, transformácia a expresia v hostiteľovi enzýmu a demoštrácia rozšírenia kruhu na substráte penicilínu N za využitia rovnakého enzýmu. US patent 5,070,020 opisuje kódovanie štruktúry expandázy zo sekvencie DNA, získanej zo Streptomyces clavuligerus. ako aj transformáciu kmeňa Penicillium chrysogenum s vektorom expresie, obsahujúcim DNA sekvenciu, čím sa dosiahne expresia expandázy. Predpokladá sa, že tento enzým je užitočný pre rozšírenie iných substrátov než je penicilín N, ale také rozšírenie nebolo dokázané.

Práce, už uvedené, sa sústredili na expandázu, odvodenú z prokaryotického mikroorganizmu Streptomyces clavuligerus. K expresii toho istého enzýmu alebo aspoň enzýmu s rovnakou expandázovou aktivitou dochádza tiež pri kmeni eukaryotického mikroorganizmu Cephalosoorium acremonium /tiež opisovaného ako Acremonium chrysogenum/. Tu však dochádza k expresii DACS /hydroxylázová aktivita/, ktorej prirodzenou funkciou je konvertovať deacetoxycefalosporánovú kyselinu /DAOC/ na deacetylcefalosporin C /DAC/. Výsledkom je jediný, ale bifunkčný enzým expandáza/hydroláza. Boli uskutočňované pokusy separovať tieto aktivity dvoch génových produktov, neboli však úspešné. Napr. EP-A-0 281 391 opisuje izoláciu a identifi káciu DNA sekvencie DAOCS/DACS génu, získaného z Cephalosporium acremonium ATCC 11550 spolu s príslušnými aminokyselinovými sekvenciami enzýmov. Penicillium sa transformuje a dochádza k expresii enzýmov, ale žiaduca konverzia penicilínov G a V na zodpovedajúce cefalosporíny sa nikdy nedokázala. Predpoklad, že techniky génového inžinierstva zaistia prostriedky, ktoré umožnia separovať genetickú informáciu pre DAOC od informácie pre DACS a uskutočniť potom ich oddelenú expresiu, sa nikdy neoveril.

Enzým DAOCS/DACS /expandáza/hydroláza/ z Cephalosporium acremonium bol taktiež skúmaný, a to ako s ohľadom na jeho aktivitu, tak charakteristiku a genetickú sekvenciu. Napr. v patentoch Demain US 4,178,210, 4,248,966 a 4,307,192 boli rôzne východiskové materiály penicilínového typu podrobené pôsobeniu bezbunkového extraktu z Cephalosporium acremonium, ktorý epimerizuje a rozširuje kruh, za vzniku cefalosporínového antibiotického produktu. We-Kuang Yeh opisuje v US patente 4,753,881 charakteristiky Cephalosporium acremonium enzýmu a to jeho izoelektrický bod, molekulovú hmotnosť, aminokyselinové rezíduá, pomer aktivity hydrolázy k aktivite expandázy a peptidové fragmenty.

Uvádzaný stav techniky skúmal len jeden aspekt nášho vynálezu, t. j. transformáciu kmeňa Penicillium chrysogenum génom, spôsobujúcim expresiu expandázy a dosiahnutie expresie pri tomto enzýme. Exprimovaný enzým sa však využíval len na rozšírenie kruhu pri penicilíne N, nie však pri penicilíne G a V. Aj v tomto prípade penicilín N má v 7. polohe bočný reťazec, ktorý sa nedá enzymaticky odštiepiť za vzniku 7-ADCA ako pri metóde podľa nášho vynálezu. Predmetný vynález je založený na prekvapujúcom objave, že adipoylový bočný reťazec môže byť účinne adovaný kmeňom Penicillium chrysogenum, takže exprimovaná expandáza môže in situ účinne využiť túto zlúčeninu ako substrát, na rozšírenie kruhu na adipoyl-7-ADCA a tento adipoylový bočný reťazec, môže byť účinne odstránený ešte ďalším enzýmom a vznikne 7-ADCA. Rôzne izolované časti tohto vynálezu môžeme nájsť v predchádzajúcom stave techniky, nedošlo však nikdy k ich kombinácii takým spôsobom, že sa metódou podľa vynálezu docielili prekvapujúce výsledky.

Napr. je známa výroba penicilánovej kyseliny; pozri Ballio A. a kol., Náture /160/ 185, 97 - 99. Enzymatické rozšírenie 6-adipoylpcnicilánovcj kyseliny na báze in vitro je takisto známe. Pozri Baldwin akol., Tetrahedron /1987/ 43, 3009 - 3014; a EP-A-0 268 343. Enzymatické odštiepenie adipoylového bočného reťazca je tiež známe; pozri Matsuda a kol., J. Bact. /1937/169,58; 15 - 5820.

Adipoylový bočný reťazec má túto štruktúru: COOH/CH₂/₄-CO-, zatiaľ čo bočné reťazce podobnej štruktúry ako glutaryl majú tento vzorec: COOH-/CH₂/₃-CO-. Enzymatické odštiepenie glutarylového bočného reťazca je taktiež známe. Pozri napr. Shibuya a kol., Agric. Biol. Chem. /181/ 45, 1561 - 1567; Matsuda a Komatsu, J. Bact. /185/ 163, 1222 - 1228; Matsuda a kol., J. Bact. /1987/ 169, 5815-5820; Jap. 53-086084 /1978-Banyu Pharmaceutical Co., Ltd./; a Jap. 52-128293 /1977 - Banyu Pharmaceutical Co., Ltd./.

Tiež EPA-A-0 453 048 opisuje metódu zdokonalenia odštepnej aktivity, pôsobením glutarylacylázy, produkovanej Pseudomonas SY-77-1. Substitúciou rôznych aminokyselín na určitých pozíciách vnútri alfa-podjeďnotky sa dosiahne troj- až päťnásobné zrýchlenie tejto štiepnej reakcie /z adipoylserínu/. Je potrebné poznamenať, že aj kel sa v EP-A-0 453 048 opisuje acyláza so zdokonalenou aktivitou pri adipoylových bočných reťazcov, neopisuje sa tu žiadny spôsob /či chemický alebo bioproces v niečom analogický postupu, ktorý je tu opisovaný/, podľa ktorého by bolo možné produkovať priamo adipoyl-cefalosporín.

Keď je prítomný /D/-a-aminoadipoylový bočný reťazec, je známe, že sa najprv enzymaticky odstráni aminoskupina a skráti sa bočný reťazec pomocou /D/-aminoacyoxydázy, ponechá sa glutaralový bočný reťazec /GL7/, ktoiý sa potom odstráni ďalším enzýmom /glutarylacyláza/. Takéto dvojstupňové odštiepenie je opísané v US patente Matsudu 3,960,662; EP-A-0 275 901; Jap. 61-218057 /1988 - Komatsu, Asaha Chemical Industry Co.,/; WO 90/12110/1990 Wong - Biopure Coip.J; a Isogai a kol., Bio/technology [1991], 188 -191.

Odkaz na súčasne podávanú prihlášku

Odkazuje sa na súčasne podávanú prihlášku, sériové číslo, podanú /zástupca Docket č. 18572IA/, ktorá opisuje bioproces vedúci k vzniku 7-ADCA ktorý sa zakladá na expresii aktivity expandázy v Penicillium chrysogenum transformovanej rovnakým spôsobom ako pri bioprocese na prípravu 7-ADCA, tu opisovaného. V bioprocese 7-ADCA sa však vyžadujú ďalšie transformácie pre expresiu ďalších enzymatických aktivít tak, aby sa dosiahli úplne odlišné rekombinantné metabolické dráhy pri určitom finálnom produkte, z čoho nič nie je uvedené v tomto opise.

Pre lepšie pochopenie metódy podľa vynálezu sú v ďalšom texte znázornené rôzne stupne metabolickej dráhy vedúcej k penicilínu G a cefalosporínu C, medziprodukty a enzýmy, ktoré transformáciu uskutočňujú.

L - alfa-aminoadipová kyselina +

L - cysteín + L-valín (L)

ACV syntetáza •'

izopenicilín-N-syntetáza (IPNS)

C L)

HOOC.

>· y’^-' ^S h₂n

.iZopenicilin N (IPN)

IPN--amidolya2a

SK 282387 Β6 acyl CoA :-6-APA acyltransferáza fenylacetyl CoA

penicilín Q

HOOC

H₂N

izopenicilín N (IPN)

CH₃ ch₃

COOH

SK 282387 Β6 izopenicilín N (IPN)

IPN-epimerá.sa

penicilín N penicilin-N -expandáz a

C D)

deacetoxycefalosporánová kyselina (DAOC)

DAOC 3'- hydroxyláza (D)

deacetoxycefalosporánová kyselina (DAC)

DAC - acetyltransferáza

cefalosporin C

Podstata vynálezu

Vynález sa týka nového bioprocesu na prípravu 7-aminodeacetoxy-cefalosporánovej kyseliny /7-ADCA/, ktorý sa skladá z dvoch stupňov:

1/ kultivácia kmeňa Penicillium chrysogenum, ktorý produkuje izopenicilín N v kultivačnom médiu, schopnom podporovať jeho vzrast s pridávaním adipátového prípravku do tohto média, pričom tento adipátový prípravok obsahuje kyselinu adipovú alebo jednu alebo aj viacero jej solí a esterov, ktoré môžu byť asimilované a využité uvedeným kmeňom Penicillium chrysogenum tak, aby produkoval adipoyl-6-aminopenicilánová kyselinu /adipoyl-6-APA/; uvedený kmeň Penicillium chrysogenum sa transformuje DNA so zakódovanou aktivitou expandázy, schopnej využil uvedenú adipoyl-6-ΑΡΑ ako substrát, pričom výsledkom expresie je rozšírenie kruhu uvedenej adipoyl-6-ΑΡΑ, produkovanej zmieneným kmeňom in situ na adipoyl-7-ADCA; a

2/ uvedenie spomenutej adipoyl-7-ADCA do kontaktu s adipoylacylázou, pričom sa adipoylový bočný reťazec odstráni a vytvorí sa 7-ADCA; tento produkt sa potom izolujeĎalej uvedené termíny majú tieto významy: „adipoyl-6-ΑΡΑ“ znamená [2S-/2a,5a,6p/]-3,3-dimetyl7.oxo-6-|7hexán-1,6-dioyl/amino]-4-tia-1 -azabicyklo-[3.2.0]heptán-2-karboxylová kyselina; a „adipoyl-7-ADCA“ znamená 7-[/hexán-l,6-dinyl/amino-3-metyl-8-oxo-5-tia-l-azabicyklo-[4.2.0]-oct-2-ene-2-karboxylová kyselina.

Vynález sa týka najmä nového bioprocesu na prípravu 7-aminodeacetoxycefalosporánovej kyseliny /7-AĎCA/, kde sa ako adipátový prípravok používa adipät disodný a kde je DNA kódujúca protetín, s aktivitou expandázy odvodená z mikroorganizmu Streptomyces clavuligerus ATCC 27C64 a adipoylacyláza je odvodená z Pseudomonas species.

Vynález sa ďalej týka vektora expresie rekombinantnej DNA, obsahujúceho DNA kódujúcu proteín s aktivitou expandázy odvodenej z mikroorganizmu Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 promótor, ktorý riadi expresiu tejto DNA kódujúcej expandázy a plazmid pPenFTSO, ako je opisované ďalej.

Ďalej vynález hovorí o hostiteľskej bunke Penicillium chrysogenum, transformovanej vektorom expresie rekombinantnej DNA, obsahujúcim DNA, kódujúcu expandázu, odvodenou zo Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, a promótor génu IPSN Penicillium chrysogenum riadiaci expresiu tejto expandázy. Vynález sa týka najmä hostiteľskej bunky mikroorganizmu Penicillium chrysogenum, transformovanej expresným vektorom rekombinantnej DNA, obsahujúcej plazmid pPenFTSO, ako je ďalej opísané.

Ďalej sa vynález týka metódy kultivácie hostiteľskej bunky rekombinantného mikroorganizmu Penicillium chrysogenum za podmienok, vhodných na expresiu génu, pričom uvedená hostiteľská rekombinantná bunka obsahuje expresný vektor, obsahujúci rekombinantnú DNA kódujúcu expandázu, odvodenú zo Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, a promótor génu Penicillium chrysogenum IPNS, ktorý riadi expresiu uvedenej expandázy. Vynález sa potom týka najmä metódy kultivácie hostiteľskej bunky rekombinantného mikroorganizmu Penicillium chrysogenum za podmienok, vhodných na expresiu génu, pričom uvedená hostiteľská rekombinantná bunka obsahuje expresný vektor rekombinantnej DNA, obsahujúci plazmid pPenFTSO, ako sa ďalej opisuje.

Ako primárny znak vynálezu sa dá uviesť vytvorenie nového bioprocesu na prípravu 7-aminodeactoxycefalosporánovej kyseliny /7-ADCA/, čo je kľúčový medziprodukt na prípravu syntetických komerčných cefalosporínov, ktorú možno znázorniť týmto štruktúrnym vzorcom:

COOH

Navyše k cefalosporínovému jadru sú rozlišujúcim znakom 7-ADCA 7-aminoskupina a 3-metylskpina. Ί-aminoskupina je skupina, ktorú možno konvertovať na akýkoľvek počet derivátov bočných reťazcov a tvorí tak bázu pre syntézu rôznych komerčných cefalosporínov. 3-metyl-skupina sa obvykle, nie však vždy, musí konvertovať na iný bočný reťazec pre syntézu komerčného cefalosporinu.

Produkt 7-ADCA, vyrobený metódou podľa vynálezu, tvorí kontrast s cefalosporínom C, ďalším kľúčovým cefalosporínovým medziproduktom, ktorý možno charakterizovať týmto štruktúrnym vzorcom:

o

H,H- II _H00>\/V^c

COOH

Pri tomto cefalosporíne by bol prijateľný bočný reťazec 3-acetyloxymetyl pre komerčné cefalosporíny. 7-/D/-a-aminoadipoyl bočný reťazec nie je prijateľný pre Ďalšiu syntetickú deriváciu a musí byť odštiepený tak, aby vznikla vhodná 7-aminoskupina. Bohužiaľ 7-/D/a-aminoadipoyl bočný reťazec možno len ťažko odstrániť, či už chemickou, alebo biochemickou cestou.

Definície

V tomto opise a najmä v oddiele nazvanom „opis výhodných usporiadaní“ majú ďalej uvádzané termíny tieto významy: 7-ADCA 7-aminodeacetoxycefalosporánová kyselina 6-APA 6-aminopenicilánová kyselina

DAOC deacetoxycefalosporänová kyselina DAOCS DAOCS-syntetáza

DAC deacetylcefalosporín C

DACS DAC -syntetáza

IPNS izopenicilín-N-syntetáza

Tris tris/hydroxymetyl/aminometán

EDTA etyléndiamintetraoctová kyselina

DEPC dietylpyrouhličitan

TE T ris/EDTA pufer

SSC soľ, /chlorid sodný/, citrát sodný, pufer

SDS dodecylsulfát sodný

PEG polyetylénglykol

Kultúra mikroorganizmu Penicillium chrysogenum

Prvý stupeň metódy, podľa vynálezu, zahŕňa stupeň kultivácie kmeňa Penicillium chrysogenum, ktorý produkuje izopenicilín N, v kultivačnom médiu, ktoré je schopné podporovať jeho vzrast s pridávaním adipátového prípravku do tohto kultivačného média, pričom tento adipátový prípravok obsahuje kyselinu adipovú alebo jednu alebo aj viacero jej soli a esterov. Adipátový prípravok môže byť pridávaný do kultivačného média po naočkovaní mikroor ganizmom Penicillium chrysogenum, dáva sa však prednosť tomu, aby bol adipátový prípravok už prítomný v kultivačnom médiu už v čase, keď sa vykonáva naočkovanie. Kyselina adipová alebo jej soli a estery môžu byť ako také asimilované a využívané kmeňom Penicillium chrysogenum s cieľom produkcie adipoyl-6-ΑΡΑ; uvedený kmeň Penicillium chrysogenum sa transformuje DNA so zakódovanou aktivitou expandázy, pričom výsledkom expresie je rozšírenie kruhu in situ uvedenej adipoyl-6-ΑΡΑ za vzniku adipoyl-7-ADCA.

Ďalšie druhy rodu Penicillium okrem Penicillium chrysogenum druhu produkujú taktiež izopenicilín N. Najviac produkčné kmene, produkujúce izopenicilín N, však boli v minulosti vyvinuté dobre známymi technikami zdokonalením kmeňa z druhu chrysogenum. Z praktických dôvodov sa teda vynález obmedzil na kmene Penicillium chrysogenum, aj keď sa dá isto uplatniť aj pri ďalších species. Akýkoľvek deponovaný kmeň Penicillium chrysogenum alebo aj ďalší, verejne prístupný prameň tohto kmeňa je vhodným východiskovým bodom na vykonávanie metódy podľa vynálezu.

Kultivačné médium, ktoré môže podporovať rast kmeňa Penicillium chrysogenum, ktorý produkuje izopenicilín N, môže pripraviť ľahko odborník v tomto obore. Napr. môže byť kultivácia uskutočňovaná submerznou aeróbnou fermentačnou metódou a použité médium môže byť zvolené z radu vhodných dostupných médií. Typické médiá používajú zdroje uhlíka ako sacharózu, glukózu a škrob; zdroje dusíka sú sójové mäso a granulát, olej zo semien bavlníka, búrske oriešky a rôzne aminokyseliny, ich zmesi a peptóny. Pri výrobe sa kladie dôraz na výťažok a izoláciu, a tak býva z toho dôvodu dávaná prednosť melase, ako zdroju uhlíka, a sójovým produktom a aminokyselinám, ako zdroju dusíka.

Do kultivačného média sa ďalej obvykle pridávajú anorganické soli a najmä soli schopné dodať potrebné iónové zložky:

soli draslíka, sodíka, amónia, vápnika, ďalej sírany, fosforečnany, chloridy, bromidy, dusičnany, uhličitany, železnaté a železité soli, soli horčíka, mangánu atď. Stopové prvky, dôležité pre vzrast, vývoj a metabolizmus Penicillium chrysogenum, môžu byť priamo pridávané do kultivačného média, pokiaľ sa nedostávajú do média ako zložky iného kultivačného média.

Kmene Penicillium chrysogenum možno pestovať v zariadení s malým objemom, ako je trepačka s objemom 1 1, ak hodláme vyprodukovať len malé množstvá 7-ADCA. Ak máme v úmysle pripraviť väčšie množstvo adipoyl-7-ADCA, potom je nutné použiť veľké fermentačné nádrže pre submerznú aeróbnu fermentáciu.

Pri príprave adipoyl-7-ADCA vo väčšom meradle sa spóry Penicillium chrysogenum pestujú na šikmom agare. Spóry z agaru sa potom používajú na naočkovanie vegetatívneho média s malým objemom. Vegetatívne médium po inkubácii produkuje čerstvú, aktívnu kultúru mikroorganizmov s bohatým rastom. Tento vegetatívny vzrast sa potom používa ako očkovacia látka pre fermentačné médiá v širokom meradle. V niektorých prípadoch by mohlo byť žiaduce, zaradiť ešte ďalšie vegetatívne médium pre naočkovanie fermentačného média. Toto druhé štádium vegetatívneho média sa obvykle používa vtedy, keď je objem fermentačného média väčší než prvé vegetatívne médium. Tak sa spóry mikroorganizmov kultivujú, najprv v malom objeme vegetatívneho média s cieľom vytvorenia očkovacej látky pre vegetatívne médium s väčším objemom. Väčší objem vegetatívneho média potom poskytne dostačujúcu koncentráciu mikroorganizmov, ktoré sú potrebné na rýchlu iniciáciu fermentácie, vykonávanej vo väčšom meradle vo fermentačnom tanku. Vegetatívne médium môže mať rovnaké zloženie ako fermentačné médium alebo môže obsahovať ďalšie ingredienty na podporu rastu a vývoja mikroorganizmov v malom meradle.

Kmene Penicillium chrysogenum používané v metóde podľa vynálezu sú účinne kultivované pri teplotách medzi 20 a 30 °C, optimálne výťažky však možno dosiahnuť pri teplotách medzi 22 až 28 °C, výhodne potom pri 25 °C.

Maximálna produkcia adipoyl-7-ADCA sa dosiahne vtedy, keď sa kmeň Penicillium chrysogenum kultivuje vo veľkých nádržiach 10 až 30 dní, výhodne 15-25 dní. Keď sa však kultúra pestuje v nádobe s malým objemom, ako je 250 ml trepačka, rast mikroorganizmov je oveľa rýchlejší a produkcia adipoyl-7-ADCA prebehne rýchlejšie, napr. od 4 do 15 dní, obvykle potom do 5 až 7 dní.

Ak konečné pH vo veľkých fermentačných nádržiach dosiahne 8,0 alebo je i vyššie, výražok adipoyl-7-ADCA môže byť negatívne ovplyvnený. Počas týchto situácií je žiaduce monitorovať pH kultivačného média, počas procesu fermentácie. Ak dochádza k tomu, že pH dosiahne tieto hodnoty skôr, než dôjde k maximálnej produkcii adipoyl-7-ADCA, pH môže byť vhodne upravené pridaním vhodnej kyseliny alebo pufra do fermentačného média.

Produkciu adipoyl-7-ADCA možno sledovať testovaním vzoriek z fermentačného média pomocou chromatografie.

Ako to býva pri veľkom počte submerzných aeróbnych fermentačných postupov, kultivačným médiom prebubláva sterilný vzduch, s cieľom dosiahnutia väčšieho rastu kmeňa Penicillium chrysogenum a zvýšenej produkcie adipoyl-7ADCA. Objem vzduchu preháňaného kultivačným médiom je obvykle najmenej cca 0,2 objemu vzduchu za minútu na objem kultivačného média. Zvýšené množstvo prietoku vzduchu môže mať často priaznivý účinok na produkciu adipoyl-7-ADCA.

Kmeň Penicillium chrysogenum produkuje okrem adipoyl-7-ADCA mnoho vedľajších produktov a metabolitov. Pretože niektoré z nich sú labilné, je žiaduce pri získavaní adipoyl-7-ADCA z fermentačnéro média, pôsobiť na celé fermentačné médium krátky čas kyselinou s cieľom úpravy pH, čo povedie k odstráneniu niektorých nečistôt, ktoré sa v priebehu procesu vytvorili. Fermentačný produkt adipoyl7-ADCA sa potom odlúči z takto upraveného fermentačného média, separuje sa od iných zložiek iónovou chromatografiou a môže sa aj ďalej chromatograficky vyčistiť - ak je to potrebné - predtým, než dôjde k enzymatickému odštiepeniu adipoylového bočného reťazca. Je tiež možné uplatniť iónovú chromatografiu po separácii bočného adipoylového reťazca. Jedným z hlavných vedľajších produktov je adipoyl-6-ΑΡΑ a je možné tento produkt chemicky alebo enzymaticky degradovať tak, aby separácia bola jednoduchšia. Najprv sa sfiltrované fermentačné médium podrobí predbežnému vyčisteniu, ktoré môže zahŕňať počiatočnú extrakciu organickým rozpúšťadlom nemiešateľným s vodou, ako je n-butanol alebo amylacetát, aby sa odstránili nečistoty. Extrahované médium sa potom ďalej čistí chromatografiou s aktívnym uhlím.

Pridávanie adipátového prípravku

V čase, keď sa pripravuje fermentačná kultúra pre Penicillium chrysogenum, ako je opísané, teda pred naočkovaním, pridáva sa adipátový prípravok k ďalším ingredientom fermentačného kultivačného média. Výhodne sa pridáva adipátový prípravok nejaký čas po naočkovaní, napr. 1, 2 a/alebo 3 dni po naočkovaní. Definovali sme adipátový prípravok ako a dipátovú kyselinu alebo niektorú z jej solí alebo esterov, ktoré môžu byť asimilované a využité kmeňom Penicillium chrysogenum na produkciu adipoyl-6APA. Adipová kyselina, jej soli a estery môžu byť používané oddelene alebo aj v kombinácii. Dáva sa prednosť disodnej soli, aj keď draselná soľ aj zmes solí so sodíkom by bola taktiež výhodná. Je možné použiť metylester, etylester je nerozpustný vo vode. Soľ alebo ester kyseliny adipovej musia vyhovovať podmienkam tak, aby mohli byť asimilované a využité kmeňom Penicillium chrysogenum, na produkciu adipoyl-6-ΑΡΑ. Napríklad by bola vhodná samotná kyselina adipová, aj keď je vo vode nerozpustná, ak sa za vhodných podmienok pH vytvorí asimilovateľná soľ.

Vhodné expandázy

Kmeň Penicillium chrysogenum v kultivačnom médiu, do ktorého sa pridá adipátový prípravok, ako je uvedené, za účelom produkcie adipoyl-6-ΑΡΑ, je kmeňom, ktorý bol transformovaný DNA kódujúcou expandázou, pričom výsledok tejto expresie, uvádzaná adipoyl-S-APA rozšíri in situ svoj kruh a expanduje na adipoyl-7-ADCA.

Adipoyl-6-APA je produkovaná intraceluláme v dôsledku pridania adipátového prípravku do kultúry Penicillium chrysogenum. V tomto intracelulámom prostredí t. j. in situ, transformovaný Penicillium chrysogenum vykonáva expresiu DNA kódujúcej cxpandázu, zatiaľ čo enzým pôsobí na adipoyl-6-ΑΡΑ ako substrát a rozširuje kruh za vzniku adipoyl-7-ADCA.

Nový bioproces podľa vynálezu zahŕňa teda tiež transformáciu kmeňa Penicillium chrysogenum opísaného typu s DNA, kódujúcou aktivitu expandázy, a výsledkom jeho expresie je adipoyl-6-ΑΡΑ, ktorý in situ rozširuje kruh za vzniku adipoyl-7-ADCA. Teda DNA, s ktorou je transforovaný kmeň Penicillium chrysogenum musí uskutočniť expresiu enzýmu, ktorý nevykazuje len aktivitu expandázy, ako sa obvykle chápe, t. j. schopnosti rozšíriť kruh izopenicilínu N na DAOC, ale tiež schopnosť rozšíriť kruh adipoyl-6-ΑΡΑ na adipoyl-7-ADCA. Vzhľadom na podobnosť vedľajších reťazcov je možné, že by takto bolo možné použiť akýkoľvek enzým expandázy v tomto novom bioprocese.

Už sme uviedli v časti o doterajšom stave techniky, že expandáza, odvodená zo Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 bola úplne sekvenovaná a charakterizovaná mapovaním reštrikčnou endonukleázou. Aj keď pravdepodobne ide o rovnaký enzým, odvodený zo Streptomyces clavuligerus NRRL 3585, bolo v literatúre uvedené, že má odlišnú molekulovú hmotnosť, nie je však sekvenovaný.

Expandázy, identifikované v predchádzajúcom stave techniky, sú užitočné v novom bioprocese podľa vynálezu. Ďalšie, doteraz neidentifikované expandázy, odvodené z ráznych kmeňov Streptomyces clavuligerus alebo aj z mikroorganizmov iných rodov, môžu byť tiež vhodné na uskutočňovanie nového bioprocesu podľa vynálezu. Procedúry identifikácie týchto nových kmeňov a rodov užitočných mikroorganizmov, ako aj izolácia predpokladaných expandáz a stanovení, či sú vhodné na použitie pri metóde podľa vynálezu, sú známe a odborníkmi používané. Screening bezbunkových extraktov nových kmeňov a rodov užitočných mikroorganizmov je možné uskutočňovať spoľahlivým a reprodukovateľným spôsobom tak, že sa uvedené extrakty pridajú k substrátu adipoyl-6-ΑΡΑ za prítomnosti známych DAOCS koafaktorov, ktoré zahŕňajú železnaté ióny, askorbáf alfa-ketoglutarát a adenozíntrifosfát /ATP/. Substrát adipoyl-6-ΑΡΑ možno pripraviť v dostatočných množstvách pridaním adipátového prípravku k netransformovanému Penicillium chrysogenum analogickým spôsobom, ako je opísané. Žiaduca expandáza je prítomná, ak sa vytvorí adipoyl-7-ADCA; jej prítomnosť sa zistí chromatograflcky. Rovnako je možné za využitia dobre známych rekombinačných techník vytvoriť vzorky DNA, založené na sekvencii expandázy Streptomaces clavuligerus a Cephalosporium acremonium, s cieľom vykonania screeningu DNA mikroorganizmu, o ktorom sa predpokladá, že by mohol produkovať expandázu, vhodnú na použitie s metódou podľa vynálezu.

Potenciálne zdroje expandáz

Ako sme už uviedli, expandázy sú enzýmy, ktoré katalyzujú rozšírenie päťčlánkového kruhu /penicilínový typ molekúl/ na šesťčlánkový kruh /cefalosporínový typ molekúl/. Akýkoľvek organizmus, produkujúci látky cefalosporínového typu, je teda potenciálnym zdrojom DNA kódujúcej. Príklady takýchto organizmov sú uvedené, ale tento zoznam slúži len ako príklad a nie je možné považovať ho za vyčerpávajúci: Plesne: Cephalosporium acremonium

Cephalosporium sp.

Emericellopsis Paecilomyces Scopulariopsis Diheterospora Spiroidium Anoxiopsis

Actinomycetes

Streptomyces clavuligerus Streptomyces lipmanii Streptomyces wadayamensis Streptomyces todorominensis Streptomyces filipinensis cephamycini Streptomyces heteromorphus Streptomyces panayensis Streptomyces griseus Streptomyces catleya Nocardia lactamdurans

Ďalšie baktérie

Flavobacterium sp. Alcaligenes denitrificans Mycoplana bullata Providencia rettgeri Lysobacter lactamgenus

Expandázy organizmov, uvedených, sú kandidátmi pre ďalší výskum a môže sa stať, že všetky nebudú vhodné pre nový postup podľa vynálezu. Využitie enzýmov, ktoré majú ako expandázovú, tak aj hydrolázovú aktivitu, ako je Cephalosporium acremonium, môže vyústiť v syntézu hydroxylovanej adipoyl-7-ADCA, napr. DAC a adipoylovým bočným reťazcom.

Izolácia fragmentov DNA kódujúcej expandázu

Keď bola prítomnosť žiadaného enzýmu expandázy zistená spôsobom uvedeným, postup izolácie DNA kódujúcej expandázu je v obore dobre známy a jednoduchý. Vzorky DNA na základe známych sekvencii a čiastočných sekvencii génov, kódujúcich expandázu sa pripravia a budú hybridizovať na žiaducu DNA kódujúcu, ktorá sa má izolovať. Príprava takých vzoriek je založená na poznatku, že aminokyselinové a nukleotidové bázy-sekvencie kódujúce expandázu, rovnako ako kódonové preferencie pre určitý mikroorganizmus, sú dané. Podrobný opis typického postupu tohto typu, aplikovaný na genomickú DNA, odvodená zo Streptomyces clavuligerus ATCC.27064, je ďalej uvedený.

Izolácia DNA kódujúcej expandázu sa docieli reštrikčnými a väzbovými postupmi, dobre známymi v technológii rekombinantnej DNA. Je potrebné mať reštrikčnú mapu genómu príslušného mikroorganizmu, aby mohol byť vyrobený a izolovaný vlastný reštrikčný fragment. Reštrikčné mapy pre Streptomyces clavuligerus a Cephalosporium acremonium sú už dostupné; použijú sa reštrikčné enzýmy Bam Hl a Sal I a elektroforézou sa vytvoria žiadané fragmenty s veľkosťou 1.8 až 2.2 kb.

Transformácia kmeňa Penicillium chrysogenum

Keď sme pripravili fragmenty DNA kódujúce expandázu, je možné ho viazať na plazmid alebo iný vektor expresie spolu s fragmentárni DNA, obsahujúcimi promótory, translačné aktivačné sekvencie, markery rezistencie, regulačné sekvencie a ďalšie DNA sekvencie, ktoré umožňujú alebo podporujú transformáciu, riadia expresiu génového produktu a uľahčujú izoláciu transformantov. Vektor expresie, ktorý bol takto pripravený, sa používa na transformáciu kmeňa Penicillium chrysogenum a na intracelulámu expresiu aktivity expandázy. Techniky transformácie a expresie sú dobre známe a detailný opis týchto typických postupov je ďalej uvedený.

Ako sme už uviedli, transformovaný kmeň Penicillium chrysogenum vykonáva expresiu aktivity expandázy intraceluláme a in situ pôsobí na adipoyl-6-ΑΡΑ substrát rozšírením kruhu na adipoyl-7-ADCA.

Nový transformant

Špecifický transformant Penicillium chrysogenum s expresiou aktivity expandázového génu, ktorý je výhodným variantom usporiadania podľa vynálezu, je nový so zreteľom na podobné konštrukcie, uskutočňované predtým Cantwellom a kol. /1990/ Current Genetic, 17, 213 - 221.

V týchto konštrukciách sa používa mutagenéza in vitro na spojenie promótora s génom expandázy. V konštrukcii podľa Cantwella sa manipuláciou zavedie Ndel miesto na ATG expandázového génu, ktoré sa naviaže na Xbal miesto na 3 konci promótora IPNS spojovačom Xbal/Ndel.

V konštrukcii podľa vynálezu Ncol miesto sa vytvorí na ATG expandázového génu a naviaže sa na miesto NcOI na 3'konci spojovača IPNS. Tak sa vytvorí sekvencia spojenia promótor-gén v týchto konštrukciách:

Xbal Ncol

TCTAGACACCATGG 3' SEQ IN č. 1 GTGAGAGTTGATGGAC 3' SEQIDč.2 TCTAGACACTATGGAC 3' SEQIDč.3 TCTAGACACCATGGAC 3' SEQIDč.4

IPNS promótor 5' óirepcxpandáza 5’ Cantwell 5' vynález 5'

V Cantwellovej konštrukcii T nahrádza C, zatiaľ čo v konštrukcii podľa vynálezu sa C zachováva; sekvencia promótora IPNS, priľahlá ATG štartovému kodónu, presne zodpovedá v prírode sa vyskytujúcemu génu. Je možné, že promótor, známy v predchádzajúcom stave techniky, ktorý sa odlišuje iba jedinou nukleotidovou bázou, môže viesť k nižšej účinnosti translácie, a tým aj k nižšej úrovni expresie expandázového génu.

Ďalšie rozdiely existujú v oblasti promótora alebo génu, používaného pre konštrukcie. Cantwellova konštrukcia obsahuje 5' BamHI - Xbal 3'oblasti promótora IPNS, zatiaľ čo vektor podľa vynálezu obsahuje 5'NcoI - Ncol 3'oblasti promótora [Diez a kol., /1990/, J. Biol. Chem. 265, 16358 - 16365], To dáva cca 250 bps ďalších na 5'konci promótora IPNS v Cantwellovej konštrukcii.

Cantwellova konštrukcia tiež obsahuje gén Streptomyces z ATG po BamHI miesto 3'génu, zatiaľ čo vektor podľa vynálezu obsahuje ATG po SalL mieste 3'génu [Kovacevic a kol., /1989/, J. Bacteriol., 171, 754-760], To dáva cca 100 bps ďalších na 3'konci sekvencie Cantwellovej konštrukcie. Konštrukcia, podľa vynálezu, stále obsahuje vyššiu oblasť génu expandázy, na BamHI mieste 5'ATG; separuje sa z čítacieho rámca génu expandázy promótorom IPNS.

Ďalší rozdiel v konštrukcii podľa vynálezu oproti tomu, čo bolo opísané v doterajšom stave techniky, sa týka voliteľného markeru, ktorý sa používa. Využitie promótora IPNS Penicillia: fúzia génu fleomycínu v konštrukcii podľa vynálezu má tendenciu uskutočniť výber na integráciu mnohonásobných kópií alebo integráciu v miestach, ktoré umožňujú vysokú úroveň expresie, a tak by mali dávať aj vyššie percento transformantov, ktoré vykonávajú expresiu génu expandázy na vysokej úrovni.

Nový transformant opísaného typuje Penicillium chrysogenum, identifikovaný ako PC 100. Jeho taxonomické znaky zahŕňajú typickú produkciu široko rozvinutých kolónií, modrozelených až zelených, zamatových so žltými bodkami; hlavičky konídií sú rozvetvené, konídie majú eliptický tvar s dĺžkou 3 - 4 mm. Vhodné podmienky na kultiváciu Penicillium chrysogenum predstavujú tuhé médium s obsahom laktózy, monohydrátu 1 ,5 %, kukuričný extrakt, 0,5 %, NaCl 0,4 %, MgSO₄.7H₂O 0,05 %; KH₂PO₄, 0,06 %, FeCl₃.6H₂O, 0,0005 %; CuSO₄.5H₂O, 0,0002 %; agar 3,0 % v jednom litri destilovanej vody s pH 4,8. Penicillium chrysogenum, takto opísané a označené PC 100,bolo uložené v Američan Type Culture Collection /ATCC/ 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod vstupným číslom ATCC 74182 /dáta depozitu: došlo 21.8.1992 a životnosť potvrdená 27.8.1992/.

Odštiepenie bočného adipoylového reťazca

Ďalším stupňom v novom bioprocese, podľa vynálezu, je odštiepenie adipoylového bočného reťazca z adipoyl-7-ADCA, čo vyžaduje, aby sa na produkt z predchádzajúceho stupňa pôsobilo systémom adipoylacylázy. Ako sme už poznamenali, jedným z významných úspechov vynálezu je schopnosť uskutočniť všetky stupne, vedúce k vytvoreniu adipoyl-7-ADCA, v jednej fermentačnej kultúre. Táto schopnosť zdokonaľuje úplne výnimočne účinnosť procesu, pretože nie je potrebné izolovať a čiastočne čistiť medziprodukty z jedného stupňa pred zapečatím stupňa druhého. V tomto poslednom stupni nie je systém adipoylacylázy prítomný, t. j. nebol vytvorený in situ v originálnej fermentačnej kultúre.

V novom bioprocese podľa vynálezu, uskutočňovanom vsádzkovým spôsobom, bude nutné izolovať a čiastočne aj čistiť produkt z prvého stupňa; tieto postupy už boli opísané.

Proces podľa vynálezu môže byť vykonávaný akýmkoľvek spôsobom, ktorý uvedie efektívne adipoylacylázu do spojenia s adipoyl-7-ADCA tak, že nastane enzymatická konverzia tejto zlúčeniny na 7-ADCA. To je definícia termínu „spojenie“ v jeho najširšom význame. Je možné využiť bezbunkový extrakt surovej adipoyl-7-ADCA ako vstupný tok a vsádzkovým spôsobom pôsobiť surovou adipoylacylázou. Tento prístup je niekedy dosť účinný, pretože nevyžaduje vyčistenie reaktantov. Samozrejme, sú možné niektoré modifikácie. Napr. reaktanty môžu byť vyčistené na žiadanú mieru predtým, než sa dostanú do spojenia. Bolo by tiež možné uskutočňovať proces kontinuálnym spôsobom skôr, než vsádzkovým. Spojene reaktantov môže byť rôzne modifikované, podľa postupu príslušnej technológie. Napr. môže byť použitý imobilizovaný enzým vo forme kolóny, obsahujúcej adipoylacylázu, a adipoyl-7ADCA bude touto kolónou prechádza . Imobilizovaný enzým možno tiež pridával do roztoku adipoyl-7-ADCA ako suspenziu. Tieto systémy s imobilizovanými enzýmami poskytujú výhody v tom, že je možné znovu získať enzým a mnohokrát ho použiť. Ďalší príklad takej technológie dáva membránový reaktor. Dáva sa však prednosť systému kolóny s imobilizovaným enzýmom.

Enzýmy adipoylacylázy, užitočnej pre stupeň odštiepenia

Existuje rad enzýmov, ktorých špecifickosť voči bočným adipoylovým reťazcom, je známa. Výsledky, dosiahnuté s komerčne dostupnou adipoylacylázou od firmy RAEV Corp., sú detailne opísané v príkladoch. Sedem iných enzýmov je opísaných v literatúre s tým, že odstraňujú bočný adiopylový reťazec z molekúl cefalosporínového typu. Šesť z týchto enzýmov je odvodených z Pseudomonas species a siedmy z Bacillus sepcies. Medzi určitými enzýmami, odvodenými z Pseudomonas, existujú isté podobnosti, ale všetkých sedem sa liši určitou mierou svojimi fyzikálnymi/biologickými vlastnosťami. Niektoré z týchto charakteristík uvádzame:

BNSÍM RBFBRBNCIB (kmene.Pseudomonas a Bacillus)

P. Sy-77-1 (Toyo J020)

Shibuya a kol. (íššfT

P. GK16 Matsuda,Komatsu (Asahi) (1985)

P. SE83 ( acyl) Matsuda a kol. (Asahi) (1987Π

P. SE83(acyll) Matsuda a kol.

(Asahi) (1987J

P. diminuta N176 Aramori a kol. (FBjlsawa) (1991a)t

P. diminuta V22 Aramori a kol. (Fujisawa) (l§9Ía)4·

Bacillus latero- Aramori a kol. sporus Jl (1991b)++

Pseudomonas sp. (RAEV Corp.)

APROX. MOLEKULOVÁ HMOTNOSf ( podjsdnotka) pravdepodobne rovnaké ako GX 15 dole

16,000

54,000

38.200

19,900

25,400

58.200

58,000

26,000 ?

70,000 ( monomáme j

16,000

54,000 + Aramori a kol., J. Ferment. Bioeng (1991) 72: 232 - 243 ++Aramori a kol: J. Bacteriol. (1991) 173: 7848 - 7855

Všetky uvedené adipoylacylázy sú užitočné pre nový bioproces podľa vynálezu. Ďalšie adipoylacylázy, ktoré by mohli byť v tomto novom procese využité, môžu byť ešte objavené testovaním do úvahy prichádzajúcich enzýmov, pokiaľ ide o ich aktivitu voči adipoyl-7-ADCA, čo je substrát, na ktorý musia pôsobiť. Pozitívny výsledok dáva spoľahlivú a reprodukovateľnú metódu, ako určiť, či enzým, prichádzajúci do úvahy, je vhodný pre metódu podľa vynálezu. Substrát je možné pripraviť priamo z reakcie adipového anhydridu so 7-ADCA počas využitia modifikácie postupu, opísaného Szewczukom a Wellman-Bednawskou v Clin. Chim. Acta /198/ 84, 19 - 26. Anhydrid kyseliny adipovej sa dá pripraviť podľa metódy Albertsona a Lundmatka, opísanej v J Nacromol. Sci. Chem. /1990/ A27,397-412. 7-ADCA je možné získať z rôznych komerčných zdrojov, vrátane E. R.Squibb and Sons, Ltd., NJ a Interchem Corp., NJ.

Ak je potrebné uskutočniť hrubý výber, do úvahy prichádzajúcich enzýmov s použitím rýchlej kolorimetrickej metódy, môžeme substituovať adipoyl-7-ADCA substrát kolorimetrickým substrátom, ako je adipoyl-PABA /para-aminobenzoová kyselina/ alebo adipoyl-PNA /para-nitroanilín/. Odštiepenie bočného reťazca vedie k farebnej reakcii, ktorej prítomnosť a koncentrácia sa dá ľahko určiť kolorimetrom. Detailné informácie, týkajúce sa i iných kolorimetrických metód - pozri Marelli, L. P. /1968/ J. Pharm. Sci, 57: 2172 - 2173; Szasz, G. /1989/ Clin

-Chem. 15 124 - 136; Szewczuk, A. a kol. /1980/ Anál. Biochem. 103: 166 - 169; Reyes, F. a kol. /1989/J. Pharma Pharmacol. 41: 136 - 137.

Bolo uskutočnené porovnanie N-terminálu aminokyselinových sekvencii RAEV enzýmu s veľkými podjednotkami acyll a GK 16 enzýmov, ako je uvedené nižšie. Výsledky dorovnania sú viditeľné /zátvorky označujú menej presvedčivé prenosy/:

RAEV - SEQ ID č. 5

SN(S) (G) A V AP G K. T AN GN AL(L)LQN(P) GK16 - SEQ ID č. 6

SNSWAVAPGKTANGNALLLQNP acyll - SEQ ID č. 7

SNNWAVAPGRTATGRPILAGDP

Z týchto sekvencii je zrejmé, že všetky tri peptidy sú príbuzné. Predsa však proteín s N-terminálovou sekvenciou, podobnou uvedeným, nemusí nutne vykazovať adipoylacylázovú aktivitu, ako je to v prípade penicilfn-G-acylázy, produkovanej kmeňom Arthrobacter. Na druhej strane existujú adipoylacylázy, ktoré sa dajú použiť v metóde podľa vynálezu a ktoré nie sú príliš podobné N-terminálovej sekvencii. Napr. Asahi enzým acyl a Fujisawa B.laterosporus Jl acyláza, už uvedená, ktorá vykazuje určitú aktivitu adipoyl-7-ADCA acylázy, nemá žiadnu rovnakú sekvenciu s uvedenými enzýmami. Z toho vyplýva, že rozsah tohto vynálezu s ohľadom na adipoylacylázy, použiteľné v druhom stupni nového bioprocesu, sú určené tým, či sú alebo nie sú schopné odštiepiť adipoylový bočný reťazec z adipoyl-7-ADCA, čo môže byť určené rýchlo a spoľahlivo, ako sa uvádza.

Sú možné ešte ďalšie prístupy, ako nájsť vhodné adipoylacylázy. Napr. EPA-A-0 453 048 opisuje metódy zdokonalenia adipoylovej odštepnej aktivity glutarylacylázy zo Pseudomonas SY-77-1. Substitúciou rôznych aminokyselín na určitých pozíciách vnútri alfa podjednotky sa dosiahne troj až päťnásobne vyššia miera odštiepenia adinoylu /z adioylserínu/. Také zdokonalené enzýmy by teda boli vhodné na použitie aj v procese podľa tohto vynálezu. Je potrebné poznamenať, že aj keď AEP-A-0 453 048 zrejme opisuje acylázu so zdokonalenou aktivitou voči bočnému adipoylovému reťazcu, neopisuje žiadny spôsob /ani chemický, ani bioproces akokoľvek analogický s procesom opísaným v tejto špecifikácii/, podľa ktorého môže vzniknúť priamo adipoyl-cefalosporín.

Opis výhodných usporiadaní

Nasleduje podrobný opis určitých výhodných usporiadaní podľa vynálezu, ktoré sú však uvádzané iba ako príklad a v žiadnom ohľade neobmedzujú rozsah vynálezu.

Príklad 1

Podmienky kultivácie Penicillium chrysogenum

Kmeň Penicillium chrysogenum, používaný v týchto postupoch, bol kultivovaný na platniach, obsahujúcich LCSB médium, skladajúce sa z laktózy 1,5 % / w/v/; kukuričného extraktu 0,5 % /v/v/; peptónu 0,5 % w/v, NaCl 0,4 % /w/v/; MgSO₄.7H₂O, 0,05 % /w/v/; KH₂PO₄ 0,06 % /w/v/; FeCl₃.6H₂O, 0,0005 % /w/v/; CuSO₄.5H₂O 0,0002 % /w/v/; agar 3,0 % /w/v/; v jednom litri destilovanej vody, pH 4,8. Po 12 dňoch pri 25 °C a 65 % relatívnej vlhkosti boli vyňaté jednotlivé kolónie a pridali sa 2 ml sterilizovanej vody do zaskrutkovanej nádoby, s obsahom sklených guľôčok. Po macerácii kultúry miešaním, sa suspenzia použije na naočkovanie ryže v bankách s obsahom 250 ml a 25 g Uncle Ben's konvertovanej naturálnej dlhozmnej ryže; ryža sa predtým premyla tromi až štyrmi ob13 jemami destilovanej vody počas 7 minút, mixovala sa každých 30 sekúnd a potom sa sušila až dovtedy, keď obsah vody v ryži robil cca 25 %. Po 12 dňoch pri 25 °C a 65 % vlhkosti sa spóry vymyli z ryže 50 mililitrami sterilnej vody. Suspenzia spór sa použila na naočkovanie tekutých kultúr a na vytvorenie lyofílov kultúr, ktoré boli skladované pri 4 °C. Spóry sa pridali do rovnakého objemu 5 % odstredeného mlieka a lyofilizovali sa v sterilných skúmavkách.

Dvojstupňová fermentácia kmeňa v trepačkách sa použila na prípravu penicilínov alebo na produkciu mycéliá, ako zdroja RNA alebo DNA. Prvé štádium bolo iniciované pridaním 1 x 10^s spór do 50 ml/500 ml banky s médiom, zloženým z glukózy 3,0 % /v/M; pharmamedia 1,0 % /w/v/; kukuričného extraktu 3,0 % Ivlvl, síranu amónneho 0,2 % /w/v/, CaCO₃ 0,5 % /w/v/; dihydrogenfosforečnanu draselného 0,05 % Mvl; laktózy 1,0 % /w/v/, suchého droždia 1,0 %/w/v/ v jednom litri destilovanej vody. Inkubácia bola uskutočnená pri 25 °C a 65 % relatívnej vlhkosti v trepačke s priemerom 70 mm a amplitúde 220 ot/min. Po 48 hodinách inkubácie bol iniciovaný produkčný stupeň prenesením 2 ml vegetatívneho „semena“ do banky s obsahom 500 ml s 35 ml média s týmto zložením: KH₂PO₄ 0,05 % /w/v/; K₂SO₄0,5 % /w/v/; /NH₄/₂SO₄ 1,0 % /w/v/; laktózy 12 % IviNI, pharmamedia 2,75 % IwInI; CaCO₃ /vyzrážaný/ 1,0 % hM, olej 1,0 % hlvlvl v jednom litri destilovanej vody s pH 6,6. Nasleduje zohriatie v autokláve a pred naočkovaním sa pridá sterilný 25 % adipát sodný /pH 6,5/ tak, že konečná koncentrácia adipátu sodného je 2,5 %. Po inkubácii nasleduje naočkovanie a potom sa pokračuje za rovnakých podmienok ako pri prvom stupni počas 5 až 7 dní.

Ak je potrebné pripraviť mycéliá pre protoplasty s cieľom transformácie alebo ako zdroj DNA, kmeň bol pestovaný v 250 ml banke s 50 ml kompletného média /CM/, s takýmto zložením: 50 ml 20X Clutterbuck's solí /120 g Na₂NO₃, 10,4 g KC1 10,4 g MgSO₄.7H₂O, 30,4 g KH₂PO₄/, 2,0 ml Vogelových Trace Elements /3M kyseliny citrónovej, 0,2 M ZnSO₄, 25 mM Fe/NH₄/₂/SO₄/₂.6H₂O, lOmM CuSO₄, 3mM MnSO₄, 8mM kyseliny boritej, 2mM Na₂Mo0₄.2H₂0/, 5 g tryptonu, 5 g extraktu droždia, 10 g glukózy v jednom litri destilovanej vody. Inkubácia sa uskutočňovala v trepačke pri 25 °C pri 220 ot/min.

Príklad 2

Izolácia genomickej DNA a totálnej RNA z Penicillia

Vegetatívny myceliálny rast kultúry počas 48 hodín bol pripravený, ako je opísané, a filtrovaný cez gazovinu, zmrazený v tekutom dusíku a cez noc lyofilizovaný. Vysušené mycéliá boli spolu s pieskom rozdrvené v miske, utlčené a resuspendované v 25 ml 100 mM LiCl, 50 mM EDTA, lOmM Tris pH 8,0, 4 % SDS. Po ohreve suspenzie na 50 - 55 °C v 60 °C vodnom kúpeli sa zmes extrahuje najskôr IM Tris /pH 8/ nasýteným fenolom, potom Tris - saturovaným fenol : chloroform /1 : 1, v : v a nakoniec chloroformom. RNA sa vyzráža z vodnej fázy pridaním rovnakého objemu studeného 6M LiCl, potom sa nechá zmes stáť pri - 20 °C dve alebo tri hodiny. Po odstredení pri 12000 g počas 20 minút pri 4 “C bol supematant zmiešaný s 66% /v/v/ etanolom a ochladený na -20 °C počas 15 minút s cieľom vyzrážania DITA. Po odstredení, ako bolo opísané, sa DITA palety premyli 70% etanolom, vysušili a resuspendovali v TE pufri/lOmM Tris-HCl, pH 7,5,1 mM EDTA/. Koncentrácia bola odhadnutá porovnaním so známymi DNA štandardmi, zafarbením editiumbromidom elekroforézou v agarózovom géle.

Kultúry Penicillium chrysogenum, ako bolo opísané v príklade 1, rástli 96 hodín v 35 ml fermentačného média /pozri opísané fermentačné podmienky/ pri 25 °C v trepačke pri 220 ot/min. Mycéliá boli oddelené filtráciou Whatman * 1 fdtrom vo vákuu a premyté asi 50 ml vody. Mycéliä boli okamžite zhrnuté z filtra, resuspendované v 5 ml pufra /50mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5mM EDTA pH 8,0, 5 % SDS/, zmrazené v kvapalnom dusíku a lyofilizované. Po lyofilizácii cez noc sa pridá 5 ml vody, obsahujúcej 0,1 % DEPC a 5 ml 1 M Tris /pH 8/ nasýteného fenol: chloroform : izoamylalkohol /50 : 50 : 1/ a zmes sa nechala roztopiť pri 37 °C počas 20 minút za tepania. Zmes sa potom odstreďovala pri 12000 g počas 10 minút a vodná vrstva sa odstránila a reextrahovala sa najskôr IM Tris, /pH 8/ nasýteným fenol: chloroform : izoamylalkohol /50 : 50 :1/ a potom IM Tris /pH 8/ nasýteným fenolom a nakoniec chloroformom. Rovnaký objem 6M LiCl bol kombinovaný s výslednou vodnou vrstvou a roztok sa nechal ustáť pri -20 °C najmenej štyri hodiny. Celková RNA bola peletovaná pri 12000 g počas 20 minút pri 4 °C, palety boli rozpustené v 0,3 ml TE pufra plus 0,03 ml acetátu sodného a potom sa pridalo 2,5 objemu etanolu s cieľom vyzrážania RNA. Výsledné palety boli rozpustené v 0,1 ml TE pufra a koncentrácia RNA bola určená spektrofotometricky počas absorbancie 260 nm.

Príklad 3

Kultivačné podmienky pre Streptomyces clavuligerus

Kmeň Streptomyces clavuligerus, používaný v týchto postupoch, bol ATCC 27064. Kmeň bol pestovaný na platniach, pozostávajúcich z drožďového extraktu -4 g; maltózového extraktu - 10 g, glukózy - 4 g; agaru - 20 g v jednom litri destilovanej vody pri pH 7,2. Po piatich dňoch rastu pri teplote 30 °C sa pridajú 2 ml sterilizovanej vody a kultúra sa zhrnie z povrchu agaru. Výsledná suspenzia sa prenesie do sterilnej skúmavky so sklenými guľôčkami a skrutkovým uzáverom. Po macerácii kultúry miešaním sa suspenzia použila na naočkovanie kvapalných kultúr. Suspenzia sa teda používala na stále skladovanie kultúr pri -70 °C pridaním glycerolu k 15 % výsledného objemu.

Keď boli potrebné mycéliá na tvorbu protoplastov, na transformáciu alebo ako zdroj DNA, 200 mg suspenzie kmeňa rástlo v 1 litrovej banke YEME média, s takýmto zložením: drožďový extrakt - 3 g; peptón - 5 g; maltózový extrakt - 3 g; glukóza - 10 g; sacharóza - 340 g; MgCl₂.6H₂O - 1,02 g; glycín - 5 g; agar - 18 g; v jednom litri destilovanej vody. Inkubácia bola uskutočňovaná pri 28 °C v trepačke pri 220 ot./min.

Príklad 4

Izolácia genómickej DNA Streptomyces

Vegetatívny rast kultúry, ktorá rástla 48 hodín, pripravená, ako bolo opísané, bol zhrnutý a odstredený pri 22100 g počas 10 minút Bunky boli resuspendované v 10 ml TE pufra a 10 mg lyzozýmu sa pridalo; potom sa zmes inkubovala pri teplote 30 °C 15 minút Pridá sa 1 ml 20 % SDS, ihneď nato potom 10 ml TE /pH 8/ saturovaného fenolu a 1,5 ml SRBI NaCl, zmes sa mieme mieša 20 minút Potom sa separovali fázy pri 12000 g počas 10 minút a potom sa vodná vrstva oddelila a preniesla novej skúmavky. Rovnaký objem chloroformu sa pridá a zmes sa ďalej mieša 10 minút. Potom sa opäť separovali fázy odstredením, pri 12000 g počas 10 minút a vodná vrstva sa oddelila a znovu preniesla do novej skúmavky. Opatrne sa pridajú dva objemy izopropanolu a vyzrážaná DNA sa navinie a znova sa rozpustí v minimálnom objeme TE pufra. Ribonukleáza A sa pridá k výslednej koncentrácii 20 mg/ml a roztok sa in kubuje pri 50 °C jednu hodinu, Proteáza K sa pridá k výslednej koncentrácii 100 mg/ml spolu so 100 mM NaCl a 0,4 % SDS a zmes sa inkubuje pri 37 °C jednu hodinu. Potom sa znova extrahuje roztok rovnakým objemom TE /pH 8/ nasýteného fenolu, po čom nasleduje ďalšia extrakcia chloroformom. DNA z konečnej extrakcie sa navinie po pridaní dvoch objemov izopropanolu a koncentrácia sa určí spektrofotometricky pri absorbancii 260 nm.

Príklad 5

Vytvorenie zbierky génu a izolácia fragmentu DNA, obsahujúceho gén expandázy Streptomyces clavuligerus

Genomická DNA zo Streptomyces clavuligerus, získaná podľa postupu, uvedeného, bola podrobená pôsobeniu reštrikčných enzýmov Bam Hl a Sal I. Takto upravená DNA prešla elektroforézou na 0,8 % agarózovom géle a fragmenty 1,8 až 2,2 kb boli eluované a napojené na pUC18 DNA, na ktorú sa vopred pôsobilo Bam Hl a Sai I. Zriedenie tejto zmesi sa použilo na transformáciu JM 109 buniek elektroporáciou /Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, Ca/. Príprava zodpovedajúcich buniek a podmienky elektroporácie boli realizované podľa doporučenia výrobcu. Transformačná zmes sa preniesla na LB platne, obsahujúce 100 mg/ml ampicilínu, 75 ml 2 % G-Gal. Inkubácia sa uskutočňovala cez noc pri 37 °C, rekombinantné kolónie sa identifikovali ich bezfarebným výskytom v dôsledku inaktivácie génovej aktivity plazmidového vektora beta-galaktozidázy. Bezfarebné kolónie boli prenesené na novú LB platňu, obsahujúcu 100 mg/ml ampicilínu. Kolónie rástli cez noc pri teplote 37 °C, potom sa preniesli na nitrocelulózu a hybridizovali sa vzorkou, získanou reakciou polymerázového reťazca, ako zodpovedá publikovanej sekvencii génu expandázy, získanej zo Streptomyces clavuligerus z báz 52-918 /Kovacevic a kol./ /1989/ J. Bacteriol. 171; 754 - 760 a US patent 5.070.020/. Značenie produktu reakcie polymerázového reťazca bolo doplnené reakciou rozšírenia s /³²P/ dCTP a Olligolabelling Kit, podľa inštrukcií výrobcu /Pharmacia, Piscataway, New Jersey/. Hybridizačná reakcia bola uskutočnená za prítomnosti 10⁶ CPM rádioaktívne označenej vzorky, 30 % formamidu, 5X SSC /0,15 M NaCl, 0,01 5M citrátu sodného pH 7/, 0,1 % SDS, 5X Denhardťs /5 g ficoll, 5 g polyvinylpyrolidín a 5 g BSA pre 500 ml 50X látky/ a 100 mg/ml DNA z teľacieho brzlíka cez noc pri teplote 37 °C. Početné transformanty silno hybridizovali ku vzorke. Bolo potvrdené, že jedna kolónia obsahuje vektor, nesúci gén expandázy a tento plazmid bol označený pFTSO-1.

Príklad 6

Izolácia plazmidovej DNA

Kultúry Escherichia coli, obsahujúce plazmid, rástli v 500 ml LB roztoku [20 g/1 LB Btoh Base /Gibco, Paisley, Scotland/J s 15 mg/ml tetracyklínu v trepačke pri 220 ot./min. počas 12-16 hodín pri 37 °C. Bunky boli peletované odstredením pri 4000 g počas 10 minút pri 4 °C. Bunkový pelet bol resuspendovaný v 18 ml glukózového pufra/150 ml glukózy, 25mM Tris pH 8,0, lOmM EDTA/ a 2 ml (40 mg/ml) lyzozómu /Sigma, St. Loius, MO/ bolo pridané do glukózového pufra, miešané a zmes bola inkubovaná pri laboratórnej teplote 15 minút. 40 ml čerstvo pripraveného roztoku C,2 N NaOH, 1 % SDS sa pridá, zmesou sa mierne mieša a potom sa umiestni na ľad na 10 minút. 30 ml 5M acetátu draselného s pH 4,8 sa pridá, dobre premieša a výsledná zmes sa umiestni na ľad na ďalších 10 minút. Bunkové tkanivo sa peletuje odstredením pri 4000 g 10 minút pri 4 °C a výsledný supematant sa filtruje cez gázu. Pridá sa izopropanol /0,6 objemu/ k vyčistenému supematantu, aby sa vyzrážala plazmidová DNA a zrazenina sa vytvorí počas inkubácie pri laboratórnej teplote za 20 minút. Plazmidová DNA peletuje pri 4000 g počas 20 minút pri 4 °C a potom sa premyje 70 % etanolom a krátko vysuší. Pelety sa resuspendujú v 9 ml TE pufra, potom sa pridá 10 g CsCl a 0,387 ml (10 mg/ml) etidiumbromidu. Tento roztok sa odstredil pri 313.160 g počas 24 hodín. Výsledný plazmid v gradiente chloridu cézneho bol zviditeľnený ultrafialovým svetlom, izolovaný, potom bol odstránený etidium-bromid extrakciou nasýteným butanolom. CsCl v plazmide bol odstránený dialýzou proti TE pufru a nakoniec bola počas použitia PEG /MW 8600/ skoncentrovaná DNA. Koncentrácia DNA bola zistená spektrofotometricky pri absorbancii 260 nm.

Príklad 7

Konštrukcia transformačného vektora pPenFTSO Penicillia Transformačný vektor Penicillia bol skonštruovaný s rezistentným génom phleomycínu, ako dominantným voliteľným markerom. Najskôr sa izoloval fragment 660 bp, obsahujúci rezistentný gén phleomycínu /phleomycin s väzbou génu proteínu zo Streptoallteichus hindustanus/ a napojil sa terminátor Cl cytochrómu kvasiniek z Bam HI/Bgl II plazmidu pUT713 /CAYLA, Toulouse Cedex, France/ elektroforézou a eluáciou z agarózového gélu. Izolovaný fragment bol vpravený na miesto Bam Hl vektora pSELECT⁴ 1 /Promega Corporation/ a orientácia génu bola určená restriktívnou enzýmovou analýzou. Ďalej bol vložený 550 bp Pst I fragment, obsahujúci lambda cos miesto, čo umožňuje, aby bol vektor použitý na vytvorenie kozmidu, ak sú prítomné zložky s vhodnou veľkosťou. Potom bol izolovaný 1,5 kb Nco I/Bam Hl fragment, obsahujúci oblasť promótora /IPNS/ génu izopenicilin-N-syntetázy Penicillium chrysogenum /elektroforézou a elúciou z agaróznvého gélu/ z Nco 1/Bam Hl genomického klonu, obsahujúceho gén IPNS. Izolovaný fragment IPNS promótor bol napojený na Bam HI/Nco I vektor. NCo I miesto je na ATG štartovom kodóne rezistentného génu phleomycínu. Tento vektor sa označuje pUT2-2.

1.645 kb fragment, obsahujúci gén expandázy Streptomyces clavuligerus bol vyčistený z výluhu Bam Hl a Sal I pFTSO-1 /už opísaný vektor/ elektroforézou a elúciou z 0,8 % agarózového gélu. Izolovaný fragment bol vpravený do vektora pSELECT /Promega Corporation/, rovnako vylúhovaného Bam Hl a Sal I. Tento vektor bol označený pFTSO-8. Nové miesto Nco I bolo vytvorené na štartovom kodóne génu expandázy mutagenézou p FTSO-8, orientovanou na miesto za využitia Altered Sites⁴ in vitro Mutagenesis Systém /Promega Corporation/. Mutagenéza sa vykonávala podľa inštrukcií výrobcu. Bol skonštruovaný nukleotid na doplnenie kódovacej sekvencie DNA oblasti na ATF štartovacom kodóne z publikovanej sekvencie génu expandázy zo Streptomyces [Kovacevic a kol. /1990/ Journal of Bacteriology 171, p. 3952 - 3958], Oligonukleotid bol vytvorený kyanoetylfosforamiditinovou syntézou /Pharmacia Gene Assembler Instrumentation/ a oligosekvencia bola nasledovná:

SEQ ID č. 8 3'CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG5'.

Mutagenéza bola potvrdená reštrikčnou enzýmovou analýzou. Fragment Nco I 1,2 kb, obsahujúci oblasť promótora Penicillium chrysogenum génu izopenicilín-N-syntetázy, bol izolovaný /elektroforézou a elúciou z agarózového gélu/ z Nco I výluhu genomického klonu, obsahujúceho IPNS gén. Oblasť IPNS promótora bola napojená na pFTSO-8 vektor nového miesta Nco I, vytvoreného mutagenézou na STG štartovom kolóne génu expandázy. O rientácia na promótor expandázového génu bola vykonaná reštrikčnou enzýmovou analýze. Tento celok IPNS-promótor gén expandázy bol potom odstránený ako Ham ΗΙ/Sal I fragment v Bam ΗΙ/Sal I transformčnom vektore Penicillia pUTZ-2, opísaného. Výsledná konštrukcia bola označená pPenFTSO.

Príklad 8

Klonovanie beta-tubulín promótora Penicillia

Beta-tubulín gén Penicillia bol klonovaný z Penicillium lambda genómovej zbierky za využitia beta-tubulín génu Aspergillus niger, ako hybridizačnej vzorky. Sekvenovanie tohto klonu a porovnanie so známymi aminokyselinovými sekvenciami beta-tubulín génu Aspergillus niger identifikovalo oblasť 91 % homológie, počínajúc s ATG iniciačným kodónom. Sekvencie, obsahujúce funkčný promótor, boli izolované medzi iniciačným kodónom a Bam Hl miestom 1,4 kb smerom nahor.

Konštrukcia transformačného vektora, zahŕňajúceho betatubulín promótor Penicillia

Fragment Xba I/Hind II 2,0 kb, obsahujúci beta-tubulín promór Penicillia, bol napojený na vektor pSELECT /Promega Corporation/, vylúhovaný Xbal/Hind III. Bolo vytvorené nové miesto Nco I na ATG štartovom kodóne mutagenézou, orientovanou na miesto za využitia Altered Sites in vitro Mutagenesis Systém /Promega Corporation/. Mutagenéza bola uskutočňovaná podľa inštrukcií výrobcu. Bol skonštruovaný oligonukleotid na doplnenie oblasti ATG štartového miesta a bol využitý na mutagenézu. Oligonukleotid bol vytvorený kyanoetylfosforamiditinovou syntézou /Pharmacia Gene Assembler Instrumentation/ a oligosekvencia bola nasledovná: SEQ ID č. 9 5' ATCTCTTTTCTAATACCTTC ACCATGGGTGAGAT TGTACGTGATCCC 3'.

Mutagenéza bola potvrdená reštrikčnou enzýmovou analýzou. Fragment Bam HI/Nco I 1,4 kb, obsahujúci betatubulín promótor Penicillia bol napojený na skonštruované Nco I miesto na ATG géne expandázy Streptomyces v Bam HI/Nco I vektora pFTSO-8 /vektor opísaný v príklade 7/. Tento vektor bol označený btFTSO-8. Fragment Bam FI/Nco 11,4 kb, obsahujúci beta-tubulín promótor, bol taktiež vpravený do Bam HI/Nco I vektora pUTZ-2 /vektor opisaný v príklade 7/. Toto napojenie umiestnilo betatubulín promótor priamo pred rezistentný gén phleomycínu. Tento vektor bol označený pCI-6. Fragment Bam HI/Hind III 2,4 kb z vektora btFTSC-8, ktorý obsahoval celok betatubulín promótor : gén expandázy bol napojený na Bam HI/Hind II vektor pCl-6 tak, aby výsledkom bol nakoniec transformačný vektor Penicillia, v ktorom gén expandázy Streptomyces a rezistentný marker phleomycinu boli exprimované z beta-tubulín promótora. Tento vektor bol označený pT S-2.

Príklad 9

Klonovanie /GAP/ promótora Penicillia

Gén glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy/GAP/Penicillia bol klonovaný z Penicillium lambda genomickej zbierky za využitia GAP génu z Aspergillus niger, ako hybridizačnej vzorky. Ďalej boli ešte skárané tri potenciálne látky s PRC produktom, pripraveným z prímerov pre 5' oblasť GAP génu Cephalosporium [Kimura, H. a kol. /1991/, J. Ferm. and Bioeng. 71, 145 - 150], Oligonukleotidy, využité na prfmery polymerázovej reťazovej reakcie /PCR/ boli vytvorené kyanoetylfosforamiditinovou synté zou /Pharmacia Gene Assembler Instrumentation/ a oligosekvencia bola nasledovná:

SEDIDč. 10 'CGCGGATCCCGGCATCAACGGCTTCGGTCGTAT 3' SEQIDč. 11

5'CGCGGATCCGGGCACGCGCATGGACATGCCAGTG 3' ledna zo štyroch skúšaných látok krížovo hybridizovala na produkt PCR. Fragment Bam Hl 4,0 kb z tohto genomického klonu bol napojený na Bam Hl vektor pSELECT /Fromega Corporation/ pre sekvenovanie. Tento vektor bol označený pTS-0. Sekvenoaanie tohto fragmentu identifikovalo ATG iniciačný kodón porovnaním so známou sekvenciou génu GAP Cephalosporinu.

Konštrukcia transformačného vektora, zahŕňajúceho GAP promótor Penicillia

Na konštrukciu GAP promótora Penicillia s génom expandázy Streptomyces bolo vytvorené nové miesto Nco I na ATG GAP génu Penicillia in vitro mutagenézou, orientovanou na miesto za využitia vektora pTS-0. Mutageruéza bola vykonaná podľa inštrukcií výrobcu. Bol skonštruovaný oligonukleotid na doplnenie kódovacej sekvencie oblasti DNA na ATG štartovacom kodóne GAP génu so zmenami bázy na vytvorenie Nco I miesta. Oligonukleotid bol pripravený kyanoetylfosforamiditinovou syntézou /Pharmacia Gene Assembler Instrumentotion/ a oligosekvencia bola nasledovná:

SEQ ID č. 12 'CAGTAAACGCAACCATGGTTGTCCAG3'

Mutagenéza bola potvrdená reštrikčnou enzýmovou analýzou. Fragment Ncol/Bam Hl 1,9 g kb z PTS-0, ktorý obsahoval GAP promótor, bol napojený na Ncol/Bam Hl vektor pFTSO-8 /vektor opísaný v príklade 7/ na umiestnenie GAP promótora s génom expandázy Streptomyces. Tento vektor bol označený pTS-0-L Fragment Bam HI/Hind III 3,0 kb z vektora pTS-0-1, ktorý obsahoval celok GAP promótor : expandáza bol napojený na Bam HI/Hind III vektor pCl-6 /vektor uvedený v príklade 8/, takže výsledkom je transformačný vektor pSD-1 Penicillia, v ktorom bol gén expandázy Streptomyces exprimovaný z GAP promótora.

Príklad 10

Transformácia Penicillium chrysogenum

Protoplasty z kmeňa Penicillium chrysogenum, už opísaného, boli vytvorené naočkovaním 50 ml CM výluhu s 1 X 107 spór na čas 67 hodín pri 25 °C v rotačnej trepačke pri 220 ot./min. Mycéliá, zhromaždené filtráciou cez gázový-filter, prenesené do 500 ml baniek a resuspendované v 25 ml KMP /0,7M KC1, 0,8M manitol, 0,02N KPO₄ pH 6,3/ s obsahom 100 mg Novozyme 234 /Novo Biolabs, Bagsvaerd, Denmark/ inkubovali pri 30 °C a 100 ot/min. Sféroplasty boli separované cez gázový filter a filter so sklenou vatou a peletované odstredením pri 350 g počas 10 minút. Sféroplasty sa potom trikrát premyli 10 ml KPM pufra a potom resuspendovali v KMPC /KMP s 50 mM CaClj/ na koncentráciu 5 X 107 buniek/ml a ponechali stáť pri laboratórnej teplote 20 minút. Pre transformáciu Penicillia bolo 200 ml suspenzie sféroplastov pridané k DNA /5 mg vektor DNA v 6,2 ml KPMC s 5 mg/ml heparínu/ spolu s 50 ml PPC /40 % PEG NW 3500, 20 mM KPO₄, pH 6,3, 5 % CaCl₂ bolo pridané pred použitím/ a transformačná zmes inkubovala na ľade 30 minút. Jeden ml čerstvo pripraveného PPC bol pridaný a zmes sa preniesla do 50 ml roztaveného /50 °C/ regeneračného agaru /CM plus 1,3M manitolu, 3 % agaru/. Transformačná zmes potom bola rozdelená do 5 Petriho misiek. Po regenerácii počas 24 ho dín pri 25 °C boli potom platne prekryté OL /1 % peptónu v 1 % agare/, obsahujúcim 100 mg/50 ml OL fleomycínu. Množstvo, použité na prekrytie bolo rovnaké ako množstvo regeneračného agaru. Mikrooganizmy na platniach inkubovali pri teplote 25 °C 7 - 14 dni a vytvorili sa generácie transformačných kolónií.

Príklad 11

HPLC stanovenie adipoyl-6-ΑΡΑ a adipoyl-7-ADCA fermentačných produktov

Bola použitá vysoko účinná kvapalinová chromatografia /HPLC/ na stanovenie produkcie adipoyl-6-ΑΡΑ v netransformovanom kmeni Penicillium chrysogenum, ktoiý bol použitý, ako aj pre stanovenie adipoyl-7-ADCA produkcie v použitom transformovanom kmeni Penicillium chrysogenum. Analýza bola vykonaná Watersovým systémom s prívodom mobilnej fázy-model 625, s premennou vlnovou dĺžkou - model 490E, nastavenou na 220 nm a 254 nm, so systémom 825 Maxima data a nakolóne NovoC18, ako stacionárnou fázou. Elúcia bola uskutočnená v prvých piatich minútach izokratický 2 % metanol/98 % 0,010M KH₂PO₄, pH 7,0 a ďalej gradientom počas 15 minút lineárne od 2 - 40% metanolu na 0,010 KH₂PO₄ pH 7,0 v mobilnej fáze. Bol použitý prietok 1 ml za minútu. Kvantifikácia adipoyl-6-ΑΡΑ bola určená podľa štandardnej krivky štandardného penicilínu N pri 220 nm a kvantifikácia adipoyl-7-ADCA bola určená podľa štandardnej krivky štandardného deacetoxycefalosporínu C pri 254 nm.

Stanovenie citlivosti adipoyl-6-ΑΡΑ a adipoyl-7-ADCA na penicilinázu boli uskutočnené pridaním 1 jednotky na ml penicilinázy I alebo penicilinázy II k filtrátom a inkubovaním pri izbovej teplote 10 - 30 minút. Tieto vzorky boli podrobené identickým HPLC podmienkam, ako je opísané.

UV spektrálna analýza adipoyl-6-ΑΡΑ a adipoyl-7-ADCA produktov bola uskutočnená s použitím Watersovho systému, s prívodom mobilnej fázy - model 510 s detektorom diódového poľa 990, data systémom 990 a s kolónou Novo C-18, ako stacionárnou fázou. Použitá mobilná fáza bola identická s opísanými podmienkami.

Širokopásmová izolácia adipoyl-7-ADCA produktov od ďalších fermentačných produktov bola uskutočnená s použitím Watersovho systému s prívodom mobilnej fázy 510, s detektorm diódového poľa, data systémom 990 a ďalej mBodapak C18 preparatívnou kolónou, ako stacionárnou fázou. Mobilná fáza /pri prietoku 5 ml za min./ bola prevedená izokratický počas 15 minút 0.010M KH₂PO₄ pH 7,0. Frakcia, zodpovedajúca retenčnej dobe adipoyl- 7-ADCA, bola zachytená s použitím deliča frakcií.

Príklad 12

Stanovenie bioaktivity

Na stanovenie antibiotickej aktivity produktov fermentácie, získaných vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou adipoyl-6-ΑΡΑ a adipoyl-7-ADCA, bola použitá biovzorka na agare, 20 ml izolovaného produktu bolo aplikovaného na 5 mm disky na LB agarovej platni [20 g/1 LB Broth Base s 3 % agarom /Gibco, Paisley, Scotland/] s Bacillus subtilus ATCC 33677 alebo Eschericia coli Super Sensitive /dodávaný Prof. Arnold L. Demain, MIT/. Bacillus subtilus bol použitý ako indikačný kmeň na stanovenie adipoyl-6-ΑΡΑ produktu a Escherichia coli Super Senzitive bol použitý ako indikačný kmeň na stanovenie adipoyl7-ADCA produktu. Po 15 hodinách inkubácie pri 37 °C koliesko inhibovaného rastu indikačnej baktérie okolo disku ukázalo, že produkty sú bioaktívne. Taktiež boli usku točnené kontrolné experimenty s deacetoxycefalosporínom C, cefalosporínom C, penicilínom V a s agarom, obsahujúcim penicilinázu alebo bez penicilinázy, ako kontrola betalaktámových štruktúr.

Príklad 13

Stanovenie enzýmu RAEV

Vyčistený produkt adipoyl-7-ADCA z fermentácie bol použitý ako substrát na stanovenie špecifickej aktivity enzýmu RAEV /komerčne dostupný od firmy RAEV Corp./. Reakčná zmes obsahovala 10M substrátu, 1 mg RAEV enzýmu, 5 % glycerolu v 0,16 KH₂PO₄ v celkovom objeme 50 ml a inkubovala pri 37 °C. 5 ml zmesi bolo odobraté v časových intervaloch 0, 1, 3, 5, 10, 20 a 30 minút, rozriedené 35 ml 0,010 KH₂PO₄ pH 3,5 a schladené na -70 °C pred analýzou HPLC za podmienok, opísaných.

Aktivita enzýmu RAEV, voči kolorimetrickému substrátu adipoyl-p-aminobónzoovej kyseliny bola stanovená s použitím 5mM substrátu, 8,25 mg enzýmu, 10 % glycerolu v 0,065M KH₂PO₄, pH 7,0 v celkovom objeme 50 ml počas 30 minút pri 37 °C. Reakcia bola uskutočnená v mikrotitrovej nádobe. 50 ml 1/100 zriedeného IM NaNO₃ v 0,25 M kyseline octovej bolo pridané na ukončenie reakcie a reakčná zmes sa nechala stáť pri laboratórnej teplote 3 minúty. 100 ml lOOx zriedeného roztoku hydrátu monosodnej soli kyseliny 4-amino-5-hydroxy-2,7-naftaléndisulfónovej v 0,5ufi NaHCO₃ bolo pridané a vznik zafarbenia bol bezprostredne zaznamenaný pri 515 nm spektrofotometrom EL 312 Bio-kinetics Plate Reader /BioTek Instruments/.

Príklad 14 HPLC stanovenie reakčného produktu enzýmu RAEV

Všetky stanovenia RAEV enzýmu /komerčne dostupného od RAEV Corg./ s využitím adipoyl-7-ADCA, ako substrátu boli monitorované HPLC s použitím Watersovho systému s prívodom mobilnej fázy - model 625, s premennou vlnovou dĺžkou nastavenou na 203 nm a 254 nm, so systémom Maxima data 825 a s kolónou Novo-C18, ako stacionárnou fázou. Elúcia bola uskutočnená izokratický v prvých piatich minútach 2 % metanol/98 % Ο,ΟΙΟΜ KH₂PO₄ a ďalej gradientom 15 minút lineárne od 2 - 40 % na 0,01 ON KH₂PO₄, pH 3,5. Štandardná ADCA bola použitá na monitorovanie retenčného času reakčného produktu. Kvantifikácia reakčného produktu bola prepočítaná pomocou štandardnej krivky štandardnej 7-ADCA pri 254 nm.

Príklad 15

13C-NMR analýza fermentačného produktu adipoyl-7-ADCA

13C-NMR spektrum bolo namerané pri 75,4 MHz /7,1 T/ na 1BM-AF-350 spektrometri spôsobom Fourier Transform. Vzorky pozostávali z 50 mg adipoyl-7-ADCA produktu z fermentácie v 0,5 ml DO /99,8 % D, Aldrich/ alebo 0,5 ml DMSO-d₆ /99,0 % D, Aldrich/ v 5 mm skúmavkách pri 350 °k. Údaje NMR potvrdili označenie produktu ako adipoyl-7-ADCA.

Príklad 16

Určenie alternatívnych enzýmov adipoylacylázy

K štúdiám, uskutočňovaným s RAEV enzýmom, bolo navyše preukázané odštiepenie bočného reťazca z adipoyl7-ADCA /a ďalších adipoylových zlúčenín/ za pomoci enzýmov, odvodených z celého radu mikrobiálnych zdrojov. Počiatočné štúdie kmeňov Pseudomonas sp. SE-83 a SE495 /uložené vo Fermentation Research Inštitúte pod prijímacím číslom FERM BP-817 a FERM BP-818/ a kmeňa

Pseudomonas SY-77-1 /uloženého v Northem Regional Research Laboratory pod prijímacím číslom NNRL B-8070/ rástli 72 hodín v médiu, obsahujúcom HyCase SF, 2 - 0 % /w/v/; glutamát monosodný 0,5 % /W/v/; drožďový extrakt 0,5 % /w/v/; kukuričný prášok 0,2 % /w/v/; bavlnený olej 0,5 % /w/v/ a kyselina glutárová 0,1 % /w/v/. Bunky boli odstredením sústredené a premyté 50mM fosfátovým pufrom pH 8,0; potom boli v pufri resuspendované a vonkajšie membrány sa stali permeabilné po pridaní malého množstva chloroformu. Rovnaké diely bunkovej suspenzie boli premiešané s adipoyl-p-nitroanilínom /ad-PNA/ a inkubované pri 30 °C 2 až 8 hodín. Po inkubácii sa zmesi okyslili pridaním 10 % /v/v/ kyseliny octovej. Uvoľnený pnitroanílín bol potom zistený kolorimetrickými prostriedkami po jeho konverzii na diazozlúčeninu s použitím reagencií firmy Sigma Chemical Company na stanovenie gama-glutamyl-transferázy /produkt Sigmy číslo 545-A/. Relatívne aktivity troch kmeňov boli 100 %, 85,5 % a 48 % pre SE-495, SE-83 a SY-77-1. Využitím metód, podobných metódam, opísaných pri enzýme RAEB, bola taktiež preukázaná aktivita SE-83 a SE-495 enzýmov na adipoyl-7-ADCA. Produkcia beta-laktamázy SY-77-1 zabránila stanoveniu deacylačnej aktivity tohto kmeňa na adipoyl-7-ADCA.

Podobnými prostriedkami bola tiež preukázaná produkcia adipoylacylázy pri dvoch kmeňoch lAternaria sp. MA-133, ATCC č. 20492 a Aspergillus sp. MA-13, ATCC č. 20491; ref. US 4,141, 790 firmy Meiji Seika Kaisha Ltd./ a troch ďalších bakteriálnych kmeňov /Brevibacterium ATCC č. 14,649, Achromobacterium ATCC č. 14,648 a Flavobacterium ATCC č. 14,550, ktoré boli opísané ako produkujúce cefalosporín-C-acylázu v US 3,239,394 firmy Merck&Co, Inc.

Zoznam sekvencií /1/ všeobecné informácie /i/ Prihlasovateľ : Conder, Nichael J. NcAda, Phyllis a Rambosek, John /ii/ Názov vynálezu : Nový bioproces na prípravu 7-ADCA /iii/Počet sekvencií: 12 /iv/ Adresa pre korenšpondenciu: /AJ Adresát: Merck&Co., Inc. /B/ Ulica: 126 E. Lincom Avenue /C/ Mesto: Rahway /D/ Krajina: USA /E/ZIP :07065 /v/ Forma pre počítač /AJ Typ : Floppy disk /B/ Počítač kompatibilný s IBM PC /C/ Operačný systém : PC-DOS/MS-DOS /D/ Software : Patentln release * 1.0, verše, * 1.25 /vi/ Dáta prihlášky:

/Al Číslo prihlášky : US 07/757,879 /B/ Dátum podania: 11. septembra 191 /C/ Zatriedenie /viii/ Zástupca/agent /A/ Meno : Speer, Raymond M. /B/Registračné číslo : 26,810 /C/Referenčné číslo : /07/757,879/18532 /ix/ Telekomunikačné spojenie /A/Telefón :/908/594-4481 /B/Telefax :/098/594-4720 /2/ Informácie o sekvencií ID č. 1 /i/ Charakteristika sekvencie: /A/ Dĺžka : 14 párov báz /B/ Typ : nukleová kyselina /C/ Štruktúra: dvojvláknová /D/ Topológia; lineárna /ii/ Typ molekuly: genomická DNA /xi/ Opis sekvencie : sekvencia ID č. 1.

TCTAGACACC ATGG /2/ Informácie o sekvencií ID č. 2 /i/ Charakteristiky sekvencie /AJ Dĺžka: 16 párov báz /B/ Typ : nukleová kyselina /C/ Štruktúra: dvojvláknová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly: genomická DNA /xi/ Opis sekvencie : sekvencia ID č. 2 GTGAGAGTTA ATGGAC /2/ Informácie o sekvencií ID č. 3 /i/ Charakteristiky sekvencie /A/ Dĺžka: 16 párov báz /B/ Typ : nukleová kyselina /C/ Štruktúra: dvojvláknová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly: genomická DNA /xi/ Opis sekvencie : sekvencia ID č. 3 TCTAGACACT ATGGAC /2/ Informácie pre sekvenciu ID č. 4 /i/ Charakteristiky sekvencie: /A/ Dĺžka: 16 párov báz /B/ Typ : nukleová kyselina /C/ Štruktúra: dvojvláknová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly: genomická DNA /xi/ Opis sekvencie : sekvencia ID č. 4 TCTAGACACC ATGGAC /2/ Informácie pre sekvenciu ID č. 5 /i/ Charakteristiky sekvencie /AJ Dĺžka: 22 aminokyselín /B/ Typ: aminokyselina /C/ Štruktúra: jednovláknová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly: peptid /xi/ Opis sekvencie : sekvencia ID č. 5 Ser Asn Ser Gly Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala 1 5 10 15 15

Leu Leu Leu Gin Asn Pro /2/ Informácie pre sekvenciu ID č. 6 /i/ Charakteristiky sekvencie /A/ Dĺžka: 22 aminokyselín /B/ Typ : aminokyselina /C/ Štruktúra: jednovláknová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly: peptid /xi/ Opis sekvencie : sekvencia ID č. 6 Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asb Gly Asn Ala 1 5 10 15

Leu Leu Leu Gin Asn Pro /2/ Informácie pre sekvenciu ID č. 7 /i/ Charakteristiky sekvencie /AJ Dĺžka : 22 aminokyselín /B/ Typ : aminokyselina /C/ Štruktúra: jednovláknová /D/ Topológia: lineárna

SK 282387 Β6 /ii/ Typ molekuly: peptid /xi/ Opis sekvencie: sekvencia ID č. 7

Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro

5 10 15 íle Leu Ala Gly Asp Pro /2/ Informácie pre sekvenciu ID č. 8 /i/ Charakteristiky sekvencie /A/ Dĺžka : 34 párov báz /B/ Typ : nukleová kyselina /C/ Štruktúra: jednovláknová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly : genomická DNA /xi/ Opis sekvencie : sekvencia ID č. 8 CGAGAGGATC AGTGAGAGTC CATGGACACG ACGG /2/ Informácie pre sekvenciu ID .č. 9 /i/ Charakteristiky sekvencie /A/ Dĺžka : 47 párov báz /B/ Typ : nukleová kyselina /C/ Štruktúra: jednovláknová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly : genomická DNA /xi/ Opis sekvencie : sekvencia ID č . 9 ATCTCTTTTC TAATA CCTTC ACCATGGGTTG AGATTGTACG TGATCCC /2/ Informácie pre sekvenciu ID č. 10 /i/ Charakteristiky sekvencie /A/ Dĺžka: 33 párov báz /B/ Typ : nukleová kyselina /C/ Štruktúra: jednovláknová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly : genomická DNA /xi/ Opis sekvencie : sekvencia ID č. 10 CGCGGATCCC GGCATCAACG GCTT CGGTCG TAT /2/ Informácie pre sekvenciu ID č. 11 /i/ Charakteristiky sekvencie /A/ Dĺžka: 34 párov báz /B/ Typ : nukleová kyselina /C/ Štruktúra: jednovláknová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly : genomická DNA /xi/ Opis sekvencie : sekvencia ID č. 11 CGCGGATCCG GGCACGCGCA TGGACATGCC AGTG /2/ Informácie pre sekvenciu č. 12 /i/ Charakteristiky sekvencie /A/ Dĺžka: 26 párov báz /B/ Typ : nukleová kyselina /C/ Štruktúra Jednovláknová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly: genomická DNA /xi/ Opis sekvencie : sekvencia ID č. 12 GAGTAAACGC AACCATGGTT GTCCAG lového reťazca enzýmovo katalyzovanou hydrolýzou adipoyl-7-ADCA, vyznačujúci sa tým, že sa kultivuje transformovaný kmeň Penicillium chrysogenum v médiu obsahujúcom adipátový prípravok, ktorý obsahuje kyselinu adipovú alebo jednu alebo aj viacero jej solí a esterov a je produkovaná adipoyl-6-ΑΡΑ, pričom kmeň Penicillium chrysogenum je transformovaný DNA kódujúcou expandázu využívajúcu adipoyl-6-ΑΡΑ ako substrát, dochádza k expresu expandázy, ktorá katalyzuje rozšírenie kruhu adipoyl-6-APÁ na adipoyl-7-ADCÁ, ktorá je hydrolyzovaná na 7-ADCA adipoylacylázou.

2. Bioproces podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že adipátový prípravok je adipát dvojsodný.

3. Bioproces podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že DNA kódujúca expandázu sa odvodí zo Streptomyces clavuligerus ATCC-27064.

4. Bioproces podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že adipoylacyláza sa odvodí zo Pseudomonas species.

Bioproces podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že kmeň Penicillium chrysogenum sa transformuje rekombinantným DNA expresným vektorom, ktorým je plazmnid pPeFTSO, na rekombinantný Penicillium chrysogenum PC 100, ATCC 74182.

6. Použitie rekombinantného DNA expresného vektora v bioprocese podľa nároku 1, kde expresný vektor obsahuje DNA kódujúci aktivitu enzýmu expandázy, odvodenej zo Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 a promótor, ktorý riadi expresiu kódujúcu DNA expandázu obsahujúcu promótor 1PNS génu Penicillium chrysogenum.

7. Použitie hostiteľskej bunky Penicillium chrysogenum v bioprocese podľa nároku 1, kde sa hostiteľská bunka transformuje rekombinantným DNA expresným vektorom obsahujúcim DNA kódujúci aktivitu enzýmu expandázy odvodenej zo Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 a promótor, ktorý riadi expresiu DNA kódujúci aktivitu expandázy obsahujúcej promótor IPNS génu Penicillium chrysogenum.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   L Bioproces na prípravu 7-aminodeacetoxycefalosporánovej kyseliny (7-ADCA) enzýmovo katalyzovaným rozšírením adipoyl-6-aminopenicilánovej kyseliny (adipoyl-6-ΑΡΑ) na dipoyl-7-ADCA a odstránením adipoy-