BG62177B1 - Нов биологичен метод за получаване на7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина (7-adca) - Google Patents

Description

Настоящото изобретение е в областта на синтезните методи за получаване на търговски продукти цефалоспоринови антибиотици, от които в момента съществува голям брой - тези терапевтичи агенти се явяват четвърто поколение. От гледна точка на голямото разнообразие на страничните вериги, които се откриват в търговскте продуки, както и голямата икономическо значение на цефалоспорините, от особена важност е създаването на по-ефективни и икономични методи за получаването на ключови междинни продукти, които дават възможност за синтезиране на редица цефалоспорини.

Един от тези междинни продукти е

7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина (7-ADCA), която може да бъде представена със следната формула:

H₂N

СН₃

По настящем 7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина се получава от пеницилин G, като се изисква пет-степенна химическа реакция, за да се разшири

5-членния пръстен на пеницилина в 6-степенен пръстен, характеризиращ цефалоспорините. Както е характерно за всичките химически синтези, този метод има сериозни недостатъци. Между тях са необходиостта от многостепенен и комплексен метод, скъпите реагенти, значителното количество странични продукти, които създават проблеми при обработката, и пречистването на силно онечистените изходни материали преди започване на химическите реакции. Освен това съществува едно непрекъснато търсене на микробиологичен или ферментационен метод, който да доведе до разширение на пръстена и отцепване на страничната верига по

ферментен път за получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина на по-икономична основа в сравнение с използваните по настоящем химични методи.

И така, настоящето изобретение се отнася до получаване на ключовия цефалоспоринов междинен продукт 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, и още по-точно - до биологичен метод за получаване на

7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.

До сега търсенето на удачен биологичен метод за получаване

7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина до голяма степен се оказва неуспешно, разбира се става въпрос за метод, съответстващ на промишленотърговски мащаби. Например, докато е възможно да се получи 6-аминопеницилинова киселина (6-АРА) чрез директна ферментация и/или чрез ензимна обработка на пеницилин G, като се остави само необходимото за получаване на

7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина разширение на пръстена, установено е за съжеление, че ензимите на Cephalosporium или Streptomyces, които предизвикват разширение на пръстена при нормалните пътища на метаболизъм на тези микроорганизми, не възприемат 6-аминопеницилиновата киселина като субстрат. Тези ензими, които колективно са отнесени към групата на DAOCS или експандазни ензими, са дефинирани като ензими, които катализират разширенето на фенамните пръстенни структури, открити в пеницилино-подобните молекули до цеф-3-ем пръстени, които са открити в цефалоспорините. Оттук нататък тези ензими се наричат „разширяващи пръстена ензими“ или „експандазни ензими“.

Субстратът, върху който ще действа ензимът е пеницилин N който наред с разширение на пръстена дава деацетокцицефалоспорин С (DAOC). Tyke необходимо само да се отцепи (О)-а-аминоадипоиловата странична верига, за да се получи 7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, но тази странична верига има доказана устойчивост към действието на ензима, поради което реакцията протича

с много нисък добив.

В съответвие с настоящето изобретение е възможно да се осъществи биологичен процес, при който по нов ферментационен метод се получава пеницилиново съединение (с адипоилова странична верига) с висок титър, като пеницилиновото съединение се явява приемлив субстрат за разширяващата пръстена ензимна система, получена in situ със същите микроорганизми, които произвеждат пеницилиновото съединение, което се преобразува в посочената разширяваща пръстена ензимна система. Разширяващата пръстена ензимна система впоследствие действа за разширяване на пръстена на пеницилиновото съединение до получаването и то с висок добив на цефалоспориново съединение. И което е особено важно, във втората критична степен на реакцията тази странична верига на пеницилиновото съединение - вече цефалоспориново съединение - може да се отцепи и то с учудващо голям ефект посредством друга ензимна система. Неочакваният резултат от този уникален биологичен метод, обект на настоящето изобретение, е получаването с висок добив на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Cantwell et al., в Curr Genet (1990) 17:213-221 предлагат биологичен метод за получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина чрез разширяване на пръстена на пеницилин V и следваща ензимна хидролиза на получения деацетоксицефалоспорин V до образуването на

7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. Предложеният метод се основава на наличието на клониран N-пеницилинов експандазен ген (cefE) от Streptomyces clavuligerus. Kovacevic etal., j. Bacteriol, (1989) 171:754-760 и U.S. 5,070,020. Тъй като обаче, експандазата действа върху пеницилин N - нейния естествен субстрат, но не

действа върху пеницилин V, предложеният метод изисква генна технология за получаване на модифициран експандазен ген, който да предизвика разширяване на пръстена на пеницилин V. Необходимото модифициране, обаче, не е постигнато от Cantwell et al. Те постигат успех само в превръщането на Penicilinum chrvsogenum с cef Е ген от Streptomyces clavuligerus и получаването с нисък добив на ензима DAOCS (експандаза).

Ензимът експандаза е е изследван пълно както по отношение на неговата активност, така и по отношение на неговата генетична последователност. Например във Wolfe U.S. 4,510,246 и 4,536,476, за да се осигурят стабилни ензимни реагенти, циклазата, епимеразата и и разширяващите пръстена ензими се изолират разделени от свободен от клетки екстракт от прокариотинов β-лактам, като се получават микроорганизми, включително Streptomyces clavuligerus. В ΕΡ-Α-0 366 354 се описва изолиран от Streptomyces clavuligerus и пречистен разширяващ пръстена ензим, който е охарактеризиран, включително чрез крайните му групи и аминокиселинен състав и е посочено, че има молекулна маса около 34 600 Daltons. Тази молекулна маса обаче, е в противоречие с молекулната маса 29 000 на съединението, което се явява същия ензим според U.S. 4,536,476. ЕР-А-0 233 715 показва изолирането и рестрикционната ендонуклеазна характеристика на ензима експандаза, получен от S. clavoligerus. преобразуването му и действието му в среда на посочения ензим и разширяване на пръстена на субстрат от пеницилин N при използване на същия ензим. U.S. 5,070,020 показва последователността на дезоксинуклеиновата киселина (ДНК), кодираща ензима експандаза, получен от Streptomyces clavuligerus и описва трансформацията на щама на PeniciIlium chrysogenum с експресионния вектор, съдържащ цитираната последователност на ДНК, като с това се получава и експресия на ензима експандаза. Въпреки че ензимът се предлага като удачен за разширяване на пръстена и на други субстрати освен пеницилин N, в същност не е показано такова разширяване.

Описаната по-горе работа е фокусирана върху ензима експандаза, получен от прокариотов Streptomyces clavuligerus. Същият този ензим или ензим с приблизително същата активност по отношение на разширяване на пръстена с експресиран също така чрез щамовете на еукариотовия Cephatosporium acremonium (назоваван съшо Acremonium chrisogenum). В тези щамове, обаче, активността на експандазата е експресирана посредством бифункционален ген (Get EF), който експресира също и активността на хидроксилазата (DACS), чиято естествена функция е да превръща дезацетоксицефалоспориновата киселина (DAOC) на ензима експандаза в деацетилцефалоспорин С (DAC). Като резултат се получава един ензим, който, обаче, е бифункционален - ензимът експандаза/хидроксилаза. Въпреки че са правени опити да се разделят активностите на тези два генни продукта, досега никой не е имал успех. Например, ЕР-А-0 281 391 описва изолирането и идентифицирането на последователността на гена DAOCS/DACS, получен от С, acremonium АТСС 11550, заедно със съответстващата последователност на аминокиселините на ензимите. Трансформиран е Penicillium и са експресирани ензимите, обаче изобщо не е демонстриран опит за превръщане на пеницилини G и V в съответните им цефалоспорини. Освен това, независимо от изказаното мнение, че генната инженерна техника предлага готов начин за разделяне на кодиращите генетична информация DAOCS и DACS и от това, че са експресирани поотделно, не е демонстрирано такова разделяне.

Ензимът DAOCS/DACS (експандаза/кидроксилаза) на е изследван много пълно както по отношение на неговата активност, така и по отношение на неговите характеристики и генетична последователност. Например в Demain U.S. 4,178,210,

4,248,966 и 4,307,192 редица изходни материали от пеницилинов тип са обработени със свободен от клетки екстракт от С, acremonium, който епимеризира и разширява пръстена до получаването на цефалоспориново антибиотиково съединение. WuKuang Yeh U.S. 4,753,881 описва ензимът на С. Acremonium от гледна точка на неговата изоелектрична точка, на молекулната му маса, на аминокиселинните остатъци, на отношението между активностите на ехпандазата и хидроксилазата и на пептидните фрагменти.

Предишната работа дискутира нещата само в един от аспектите на настоящето изобретение, т.е. трансформацията на щама на Р. chrisogenum чрез генна експресия на ензима експандаза и чрез получаване на експресията на този ензим. В тази работа, обаче, експресираният ензим се използва само за разширяване на пръстена на пеницилин N , но не и на пеницилин G и V. Дори в този случай пеницилин N има странична верига на седмо място, която не може да бъде отцепена ензимно, така че да се получи 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, както е според метода на настоящето изобретение. Настоящето изобретение се основава на изненадващото откритие, че адипоилова странична верига може да бъде ефективно присъединена към щам на Р. chrisogenum. че ензимът експандаза, експресиран in situ може да използва ефективно това съединение като субстрат за разширяване на пръстена до адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина и че адипоиловата странична верига след това може да бъде отделена ефективно чрез друг ензим до получаването на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. Тъй като редица отделни фрагменти от настоящето изобретение могат да бъдат открити в предишната работа, не е внушение, че те могат да бъдат съчетани така, че да дадат неочакваните резултати, получени по метода на настоящето изобретение.

Например известно е получаването на 6-адипоилпеницилиновата киселина (виж Ballio et al., Nature (1960) 185, 97-99). Ензимното разширяване на 6адипоилпеницилиновата киселина върху бази in vitro също е известно - виж Baldwin et al., Tetrahedron (1987) 43, 3009-3014 и EP-A-O 268 343. Известно е и ензимното отцепване на адипоиловата странична верига - виж Matsuda et al., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820. Адипоиловата странична верига има следната формула: СООН-(СН₂)₄СО-, докато страничната верига на тясно свързаната структура е тази на глутарила, имащ следната формула: СООН-(СН₂)₃-СО-. Ензимното отцепване на глутариловата странична верига е известно - виж Shibuya et al., Agric. Biol. Chem. (1981) 45, 15611567; Matsuda and Komatsu, J. Bact. (1985) 163,1222-1228; Matsuda etal., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820; Jap. 53-086084 (1987 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd; Jap. 52-128293 (1977 -Banyu Pharmaceutical Co Ltd.).

EPA-A-0 453 048 също описва методи за повишаване на активността към адипоилово отцепване на глутарилацилазата, получена с Pseudomonas SY-77-1. Чрез заместване на различни аминокиселини с определено разположение с алфа9 субединици се наблюдава от три до пет пъти по-висока скорост на отцепване на адипоила (от адипоилсерина). Трябва да се отбележи, че въпреки че ЕР-А-0 453 048 очевидно демонстрира една ацилаза с повишена активност към адипоиловите странични вериги, той не описва някакви начини (или химични или чрез биопроцес, аналогичен на метода, описан в настоящето изобретение), по които на първо място да се получи адипоилцефалоспорин.

Известно е, че когато е на лице (D)- а -аминоадипоилова странична верига, ензимно с (О)-аминоацидоксидаза се отцепва първо една аминогрупа и се скъсява страничната верига, като остава глутарилова (GL-7) странична верига. С втория ензим (глутарилацилаза) се отцепва глутариловата странична верига. Това двустепенно отцепване е описано от Matsuda U.S. 3,960,662; EP-A-0 275 901; Jap. 61218057 (1988 - Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.); WO 90/12110 (1990 - Wong, Biopure Corp.); Isogai etal., Bio/Technology (1991) 9,188-191.

Справка със заявка, намираща се в процес на едновременно разглеждане

Направена е справка със заявка, намираща се в процес на едновременно разглеждане □ публикувана (Включена в списъка за разглеждане

под □ 18572IA), която описва биологичен метод за получаване на

7-аминопеницилинова киселина чрез експресиране на активността на ензима експандаза в трансформиран Penicillium chrysogenum по същия начин както при описания тук биологичен метод за получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. В биологичния метод за получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина обаче, са необходими допълнителни трансформации, за да се експресира допълнителна ензимна активност с цел да се получи напълно различен рекомбинативен метаболитен път към специалния краен продукт, като нито един от тях не е предложен в цитираната спесификация.

С цел да се улесни по-доброто разбиране на метода от настоящето изобретение и на включените по-горе техники от предшестващите работи в тази област, непосредствено след този текст са представени различните етапи в метаболитните пътища, водещи до пеницилин G и цефалоспорин С, до междинните продукти и до ензимите, които осъществяват включените трансформации.

L-алфа - аминоадипинова киселина + L-цистеин + L-валин

ACV СИНТЕТАЗА

LLD - ACV

ИЗОПЕНИЦИЛИН N СИНТЕТАЗА (IPNS) (L)

НООС

H₂N

ИЗОПЕНИЦИЛИН N (IPN)

IPN АМИДОЛИАЗА

АЦИА СоА: 6 - АРА

АЦЕТИЛТРАНСфЕРАЗА

ФЕНИЛАЦЕТИЛ СоА

ПЕНИЦИЛИН G

ИЗОПЕНИЦИЛИН N (IPN)

ИЗОПЕНИЦИЛИН N (IPN)

IPN ЕПИМЕРАЗА

ФЕНИЛАЦЕТИЛ СоА (0)

H₂N

НООС

ПЕНИЦИЛИН N

РЕНИЦИЛИН N

ЕКСПАНДАЗА

(D)

Η2Ν

НООС

ДЕЗАЦЕТОКСИ ЦЕФАЛОСПОРИНОВА КИСЕЛИНА (DAOC)

DAOC3' - ХИДРОКСИЛАЗА (D)

Η2Ν

НООС

СН2ОН

ДЕЗАЦЕТОКСИ ЦЕФАЛОСПОРИНОВА КИСЕЛИНА (DAOC)

DAOC АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА (D)

HgN

НООС

о

II CH2OOCH3

ЦЕфАЛОСПОРИН С

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение се отнася до нов биологичен метод за получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, включващ следните етапи:

1) култивиране в хранителна среда, способна да осигури неговото израстване, щам на PeniciIlium chrysogenum. който произвежда изопеницилин N, и добавяне към посочената среда на адипатна хранителна среда, съдържаща адипинова киселина или една или повече от нейните соли и естери, които могат да бъдат асимилирани и използвани от споменатия щам на Penicillium chrysogenum за получаването на адипоил-6-аминопеницилинова киселина, чрез който е полууучена цитираната адипоил-6-аминопеницилинова киселина;

в който щамът на Penicillium chrysogenum се трансформира чрез ДНК кодиране на активността на ензима експандаза, даващ възможност за приемане на адипоил-6-аминопеницилиновата киселина като субстрат, след което в резултат на неговата експресия същата тази адипоил-6-аминопеницилиновата киселина, получена от посочения щам, разширява пръстена си in situ до образуване на адипоил7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина; и

2) Свързване на получената адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова

киселина с адипоиласилаза, чрез която адипоиловата странична верига се отстранява и се получава 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, която след това бива изолирана.

Както са използвани, следните термини имат съответните определени значения: „адипоил-6-АРА“ означава [2S-(2 а , 5 а , 6 β )]-3,3-диметил-7-окси-6[ (хексан-1,6-диоил)амино]-4-тио-1 -азабицикло-[ 3.2.0]хептан-2-карбонова киселина;

и „адипоил-7-ADCA“ означава 7-[ (хексан-1,6-диоил)амино]-3-метил-8-окси5-тио-1-азабицикло-(4.2.0)-окт-2-ен-2-карбонова киселина.

По-специално, настоящето изобретение се отнася до нов метод за получаване на7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина (7-ADCA), цитирани по-горе, при който адипатната хранителна среда е динатриев адипат, кодиращата активността на ензима експандаза ДНК е получена от Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 и при които адипоилацилазата е получена от вида Pseudomonas.

Освен това настоящето изобретение се отнася до рекомбинативен ДНК експресионен вектор, съдържащ кодираща активността на ензима експандаза ДНК, получена от Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, и промотор, който стимулира експресията на кодиращата експандазната активност НКА, съдържаща плазмиден pPenFTSO, както е описано в следващата част.

Настоящето изобретение се отнася и до клетката на гостоприемника Penicillium chrysogenum. трансформирана с рекомбинативен ДНК експресивен вектор, съдържащ ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, получен от Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 и промотор, който стимулира експресията на ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, съдържаща промотор на синтатазния ген на Penycillium chrisogenum изопеницилин N (IPNS).

По-специално, настоящето изобретение се отнася до клетката на гостоприемника Penicillium chrysogenum. трансформирана с рекомбинативен ДНК експресивен вектор, съдържащ плазмиден pPenFTSO, както е описано в следващата част.

Настоящето изобретение се отнася също така и до метод, съдържащ етап на култивиране на клетка на гостоприемника -рекомбинативен Penicillium chrysogenum при условия, подходящи за генна експресия, при който метод клетката на рекомбинативния гостоприемник съдържа рекомбинативен ДНК експресивен вектор, съдържащ ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, получен от Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 и промотор, който стимулира експресията на ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, съдържащ промотор на ген на Penicillium chrysogenum IPNS. По-специално, настоящето изобретение се отнася до метод на култивиране на клетка на гостоприемника - рекомбинативен Penicillium chrysogenum при условия, подходящи за генна експресия, при който метод клетката на рекомбинативния гостоприемник съдържа рекомбинативен ДНК експресивен вектор, съдържащ плазмиден pPenFTSO, както е описано в следващата част.

Главният аспект на настоящето изобретение е създаването на един нов метод за получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина (7-ADCA), която е ключово междинно съединение при получаването на синтетичен цефалоспорин търговски продукт, който може да бъде преставен със следната структурна формула:

Освен цефалоспориновите ядра, отличителни черти на

7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина са 7-аминогрупата и 3-метиловата група. 7-аминогрупата е група, която може да се превръща във всяка една производна странична верига и това е основата на синтеза на различните търговски продукти цефалоспорини. Обикновено, но не винаги, 3-метиловата група трябва (както е в случая с цефалексина) да се превърне в някаква друга странична верига, за да се синтезира търговски продукт цефалоспорин.

Полученият по този метод 7-DDNA може да се различава от цефалосорин С -

друго ключово междинно цефалоспориново съединение, което може да бъде представено със следната структурна формула:

H2N

НООС

О

СН2ОССН3

З-ацетоксиметиловата странична верига на това съединение може да се яви приемлива за търговските цефалоспоринови продукти.

7-(О)-а-аминоадипоиловата странична верига, обаче, не е приемлива за следващите синтезни производни и трябва да се отцепи, за да се получи приемливата 7-аминогрупа. За съжеление, 7-(0)-а-аминоадипоиловата странична верига създава винаги затруднения с отцепването си, както по химичен, така и по биологичен път. Дефиниции

В смисъла, в който са използвани в настоящата спесификация, следващите термини имат съответните определени значения:

7-ADCA 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина

6-АРА 6-аминопеницилинова киселина

DAOC Дезацетоксицефалоспоринова киселина

DAOCS DAOC синтетаза

Деацетилцефалоспорин

DAC синтетаза

Изопеницилин N синтетаза

Т ris [хидроксиметил]аминометан

Етилендиаминтетраоцетна киселина Диетилпирокарбонат

Буфер Tris/Етилендиаминтетраоцетна киселина

Буфер сол (натриев хлорид), натриев цитрат Натриев додецилсулфат

Полиетиленгликол

DAC

DACS

IPNS

Tris

EDTA

DEPC

ТЕ

SSC

SDS

PEG

Култивиране на Penicillium chrysogenum

Първият етап от метода на настоящето изобретение се състои в етап на култивиране в хранителна среда, способна да осигури неговото израстване, на щам на Penicillium chrysogenum. който произвежда изопеницилин N, и добавяне към посочената културна среда на адипатна хранителна среда, съдържаща адипинова киселина или нейни соли и естери. Адипагната хранителна среда може да бъде прибавена към културата след инокулация с Penicillium chrysogenum. но за предпочитане е тя да присъства в културната среда по времето, когато се извършва инокулацията. Адипиновата киселина или нейните соли или естери трябва да бъдат такива, че да могат да бъдат асимилирани и преработени от посочения щам на PeniciIlium chrysogenum. така че да се получи адипоил-6-аминопеницилинова киселина; в която щамът на PeniciIlium chrysogenum се трансформира посредством кодираща активността на ензима експандаза ДНК, при което като резултат на неговата експресия въпросната адипоил-6-аминопеницилинова киселина разширява

пръстена си in situ до получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.

Други видове от гените Penicillium. наред с вида chrysogenum съшо произвеждат изопеницилин N. До сега, обаче, най-продуктивният щам на изопеницилин N винаги е получаван чрез добре познатата техника на преобразувания в щама от вида chrysogenum. От практическа гледна точка настоящето изобретение се ограничава до щамове на Penicillium chrysogenum. но неговата приложимост към други видове е очевидна. Всеки наличен щам на Penici Ilium chrysogenum или друг наличен източник на такъв щам са подходяща изходна точка за изпълнение на метода на настоящето изобретение.

Хранителната среда, годна да осигури израстването на щама на Penicillium chrysogenum. който произвежда изопеницилин N, е от типа среди, с които работещите в тази област са добре запознати. Например, култивирането може да се проведе чрез метода на субмаргинална аеробна ферментация, като използваната среда може да бъде избрана измежду многото налични подходящи среди. Една типична среда използва като източници на въглерод захароза, глюкоза и нишесте; като източници на азот соево брашно или трици, памуково масло, фъстъчено брашно и различни аминокиселини, смеси от тях и пептони. Производството изисква висок добив и лесно изолиране на съединението. Предпочитана среда, която отговаря на тези изисквания, е съдържащата меласа - като източник на въглерод и соево брашно и аминокиселини - като източник на азот.

Обикновено към културната среда се прибавят хранителни неорганични соли.

Те включват соли, които предоставят следните йонни компоненти: натриеви, калиеви, амониеви, калциеви, фосфатни, сулфатни, хлоридни, бромидни, нитратни, карбонатни, феро-, фери-, магнезиеви, манганови и др. Микроелементите обикновено също са от значение за растежа, развитието и метаболизма на Penicillium chrysogenum и могат да бъдат прибавяни директно към хранителната среда, освен ако вече не са налични под формата на онечиствания на другите съставки на хранителната среда.

Когато се изисква да бъде произведено само малко количество 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, шамът на Penicillium chrysogenum може да се култивира в съоръжение с малък обем, например клатачна колба с обем 1 I. Когато е необходимо да се произведат по-големи количества адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, обаче, се използват голямогабаритни ферментационни съдове в условията на субмаргинална аеробна ферментация.

При получаване на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, в голям мащаб, спорите на щама на Penicillium chrysogenum се хранят върху поставен под наклон агар. Остърганите от агара спори се използват за инокулиране на вегетативна среда с малък обем. Вегетативната среда се инкубира, за получаването на обилна, свежа, активно размножаваща се култура от микроорганизми. Това вегетативно образувание след това се използва за инокулиране на ферментационна среда в голям мащаб. В определени случаи може да е необходимо да се включи допълнителна вегетативна среда като инокулант за ферментационната среда. Включването на втора вегетативна среда обикновено се прилага, когато обемът на ферментационната среда е значително по-голям от обема на първата вегетативна среда. В този случай спорите на микроорганизмите първо се култивират в малък обем вегетативна среда за получаването на инокулант за големия обем вегетативна среда. По-големият обем вегетативна среда впоследствие осигурява достатъчна концентрация микроорганизми за инициране на бързо започване на ферментацията в голямогабаритния ферментационен съд. Вегетативната среда може да има същия състав както ферментационната среда или може да съдържа допълнителни съставки, които да стимулират растежа и развитието на микроорганизмите в малък мащаб.

Щамовете на Penicillium chrysogenum, използвани в метода на настоящето изобретение, най-ефективно се култивират при температури между 20°С и 30°С, като оптимални добиви се получават, когато температурата е между 22°С и 28°С, и за предпочитане - около 25°С.

Максимална продукция на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина се получава, когато щамът Ha_Penicillium chrysogenum е култивиран в голямогабаритни вани за период между 10 и 30 дни, за предпочитане от 15 до 25 дни. Когато се култивира, обаче, в съоръжение с малък обем, например клатачни колби с обем 250 ml, растежът на микроорганизмите е много бърз и адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина се произвежда за много по-кратък период от време, например от 4 до 15 дни и най-често - от 5 до 7 дни.

Ако крайното pH в голямо габаритните ферментационни вани достигне 8.0 или по-висока стойност, добивът на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина може да се повлияе неблагоприятно. При такава ситуация е желателно да се регистрират стойностите на pH на културната среда по време на ферментацията. В случай, че pH достигне тази стойност преди времето на максимален добив на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, pH трябва да се понижи чрез добавяне на подходяща киселина или буферен агент към ферментационната среда. Получаването на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина може да бъде последвано отхроматографски анализ на образци от ферментиралата среда.

Както при повечето субмаргинални аеробни ферментации през културната среда се пропуска стерилен въздух, за да се постигне по-ефективен растеж на щама на Penicillium chrysogenum и за да се увеличи добивът на адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. Обемът на пропускания през културната среда въздух е приблизително поне 0.2 обем въздух на минута на един обем културна среда. Едно увеличение на скоростта на преминаващия въздух, обаче, влияе благоприятна върху добивана адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.

Обикновено щамът на Penicillium chrysogenum наред с адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина произвежда редица странични продукти и метаболити. Тъй като някои от тях са киселинно неустойчиви, желателно е при възстановяването наадипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина от ферментационната среда цялата ферментационна среда да се обработи за кратко време при едно кисело pH, с цел да се разградят някои от успоредно получените онечиствания. Ферментното съединение адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина се възстановява от филтруваната и обработена ферментационна среда и при желание може да бъде отделен от останалите компоненти на ферментационната среда чрез йонообменна хроматография и ако е необходимо, може допълнително да се пречисти хроматографски преди следващия етап на отцепване на адипоиловата странична верига. Възможно е след отцепването на страничната верига да се направи също разделяне чрез йонообменна хроматография. Един от главните странични продукти, представляващ проблем по отношение на разделянето, е адипоил-6аминопеницилинова киселина. За да се облекчи разделянето, възможно е този страничен продукт да се разгради по химичен или по ензимен път. Първоначално филтруваният ферментационен продукт се подлага на предварителна процедура на пречистване, която включва първа екстракция с несъвместим с вода органичен разтворител, например n-бутанол или амилацетат, с цел да се отстранят онечистванията. След това екстрахираната среда може да се пречисти по предишния начин чрез екстракция и чрез хроматография върху активиран въглен.

Добавяне на адипатна хранителна среда

За предпочитане, в момента, в който ферментационната култура за Penicillium chrysogenum е установена по гореописания начин, т.е. преди инокулацията, към останалите компоненти на ферментационната културна среда се добавя адипатна хранителна среда. При желание адипатната хранителна среда може да бъде добавена и в някой момент след инокуладията - например 1, 2 или 3 дни след инокулацията. Адипатната хранителна среда се дефинира като адипинова киселина или една или повече от нейните соли или естери, които да могат да бъдат асимилирани и преработени от щама на Penicillium chrysogenum. култивиран, за да произведе адипоил-6-аминопеницилинова киселина. Адипиновата киселина, солите и естерите и могат да бъдат използвани поотделно или във всяка една комбинации. Динатриевата сол е предпочитана, но подходящи са и калиевата сол и смесените соли с натриевата

сол. Може да се използва метиловия естер, но неразтворим във вода е етиловият естер. Адипиновата киселинна сол или естер трябва да бъдат такива, че да могат да бъдат асимилирани и преработени от щама на Penicillium chrysogenum. култивиран, за да произведе адипоил-6-аминопеницилинова киселина. Например, адипиновата киселина сама за себе си може да бъде подходяща, още повече че тя е неразтворима във вода, в случай, че при правилно подържани условия по отношение на pH, се образува асимилируема сол.

Подходящи експандазни ензими

Щамът на Penicillium chrysogenum. култивиран и осигурен с адипатна хранителна среда, съгласно описания по-горе начин, така че да произведе адипоил-

6-аминопеницилинова киселина, е този, който трябва да бъде трансформиран в ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, при което в резултат на неговата експресия адипоил-6-аминопеницилиновата киселина in situ разширява пръстена си, при което се образува адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.

Адипоил-6-аминопеницилиновата киселина е произведена вътрешноклетъчно от култивиран с адипатна хранителна среда Penicillium chrysogenum. При това вътрешноклетъчно образуване, т.е. in situ, трансформираният Penicillium chrysogenum също експресира кодиращата активността на ензима експандаза ДНК, при което ензимът действа върху адипоил-б-аминопеницилинова киселина като субстрат и разширява пръстена и до адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.

Новият биологичен метод от настоящето изобретение включва в своя обсег трансформацията на щама на Penicillium chrysogenum по описания по-горе начин с всяка кодираща активността на експандазния ензим ДНК, при което в резултат на неговата експресия адипоил-6-аминопеницилиновата киселина in situ разширява разширява пръстена си до образуване на адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. ДНК, посредством която е трансформиран Penicillium chrysogenum. трябва да експресира ензим, който има не само активността на експандазен ензим, т.е. да може да разшири пръстена на изопеницилин N до дезацетоксицефалоспоринова киселина, но да е в състояние и да разшири пръстена на адипоил-6-аминопеницилинова киселина до адипоил-7 аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. Очаква се, обче, че в случай че има аналогична страничната верига, всеки експандазен ензим може да бъде използван в новия биологичен метод на настоящето изобретение.

При описанието на предшестващите работи вече бе отбелязано, че ензимът експандаза, получен от Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, има пълна последователност и е охарактеризиран чрез създаване на ендонуклеазна рестрикционна карта. Ензимът, получен от Streptomyces clavuligerus NRRL 3585, може да бъде взет за същия ензим, но за него се съобщава различно молекулно тегло и той не е подреден последователно.

Разширяващите пръстена ензими, посочени в предшестващите работи, могат да бъдат използвани в новия метод на настоящето изобретение. Други неспецифицирани досега разширяващи пръстена ензими, получени от различни щамове на Streptomyces clavuligerus. а дори и от микроорганизми от различни генерации, могат също да се окажат подходящи за осъществяване на новия метод на настоящето изобретение. Процедурите по специфицирането на тези нови щамове и видове полезни микроорганизми, както и за изолирането на предполагаемите експандазни ензими и оценяване на тяхната приложимост в метода на настоящето изобретение, са прости и добре известни на работещите в тази област. Изолирането на свободни от клетки екстракти от тези нови щамове и видове полезни микроорганизми може да стане по изпитан и възпроизводим начин чрез добавяне на екстрактите към субстрат от адипоил-6-аминопеницилинова киселина в присъствието на известни ко-фактори - DAOCS, които съдържат феройони (Fe²⁺), аскорбат, а -кетоглутарат и аденозинтрифосфат (АТР). Субстратът от адипоил-6аминопеницилинова киселина може да бъде изготвен в достатъчно количество чрез захранване с адипатна хранителна среда на Penicillium chrysogenum по начин,

аналогичен на описания подробно по-долу. Желаният експандазен ензим е наличен в случай, че се образува адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, чието наличие се установява по хроматографски път.

Възможно е също така при използване на добре известната рекомбинативна техника да се получат образци от ДНК, основаващи се на експандазната последователност на Streptomyces clavuligerus и на Cephalosporium acremonium.

например, за да се отдели съдържащата се в микроорганизмите ДНК, както и да се произведе експандаза, подходяща за използване в метода на настоящето изобретение.

Потенциални източници на експандазни ензими

Разширяващите пръстена ензими (експандазни ензими), са ензими, които катализират разширяването на петчленните пръстенни структури (открити в молекулите на съединения от пеницилинов тип) до сеЕЗ-ет пръстени (открити във цефалоспориновите съединения). Всеки организъм, произвеждащ метаболити, съдържащи cef-em пръстени, следователно, е потенциален източник за една кодираща експандазата ДНК. По-долу са изброени примери за такива организми, но този списък е примерен и не трябва да се счита за изчерпателен:

Фунгициди:

Cephalosporium acremonium

Cephalosporium sp, Emericellopsis Paecilomyces Scopulariopsis Diheterospora Spiroidium Anoxiopsis

Актиномицети:

Streptomyces clavuligerus

Streptomyces lipmanii

Streptomyces wadayamensis

Streptomyces todorominensis

Streptomyces filipinensis cephamycini Streptomyces heteromorphus Streptomyces.panayensis Streptomyces. griseus Streptomyces cattleya Nocardia lactamdumns

Други бактерии:

Flavobacterium sp.

Alcaligenes denitrificans

Mycoplana bullata

Providencia rettgeri

Lysobacter lactamgenus

Експандазите на изброените по-горе организми са само кандидати за допълнителни изсладвания и е възможно не всичките да са подходящи по отношение на новия метод на настоящето изобретение. Например, използването на ензими, които притежават едновременно експандазна и хидролазна активност, например ензимът Cephalosporium acremonium. може да доведе до синтезиране на хидроксилирана адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, т.е. до деацетилцефалоспорин с адипоилова странична верига.

Изолиране на фрагменти от ДНК, кодиращи активността на експандазата

След като се установи по описания по-горе начин наличието на разширяващия пръстена ензим, процедурите за изолиране на кодиращата експандазната активност ДНК са прости и добре известни на работещите в тази област. Конструирани са образци от ДНК, основаващи се на известната последователност или на частичната последователност на гените, кодиращи експандазните ензими, които се хибридизират към желаната комбинация ензим-кодираща ДНК, за да бъдат изолирани. Конструкцията на тези образци се основава на познанията върху аминокиселините и на нуклеотидните последователности, кодиращи ензима експандаза, както и на предимствата на кодона на допълнително включените микроорганизми. По-долу са описани подробно типичните процедури от този тип, приложени върху геномната ДНК на Streptomyces clavuligerus ATCC 27064.

Изолирането на кодиращата активността на експандазния ензим ДНК, се

осъществява чрез използване на процедури на рестрикция и лигиране, които са добре известни в технологията на рекомбинация на НДК. Необходимо е да има ендонуклеазна рестрикционна карта на на генома на включените микроорганизми, така че да бъде получен и изолиран подходящият рестрикционен фрагмент. Вече съществуват рестрикционни карти на Streptomyces clavuligerus и на Cephalosporium acremonium: рестрикционните ензими Bam HI и Sal I по-рано са използвани и чрез електрофореза са получени желаните фрагменти с размери 1.8 до 2.2 kb. Трансформация на щамът на PeniciIlium chrysogenum

След като веднъж са получени фрагментите на ДНК, кодиращи експандазната активност, те могат да бъдат вградени в плазмид или в друг експресионен вектор заедно с фрагменти от ДНК, съдържащи активиращи транслацията последователности, устойчиви сигнални гени, регулаторни последователности, образуващи козмиди и всякакви други последователности, които разрешават или стимулират трансформацията, подпомагат експресията на генния продукт и улесняват изолирането на трансформантите. Така конструираният експресионен вектор след това се използва за извършване на трансформацията на щама на Penicillium chrysogenum и вътрешноклетъчната експресия на активността на експандазния ензим. Техниката, използвана за осъществяване на трансформацията и на експресията е добре известна По-долу допълнително е дадено подробно описание на типичните за нея процедури.

Както вече беше показано по-горе, трансформираният щам на Penicillium chrysogenum експресира вътрешноклетъчно активността на експандазния ензим, който след това действа in situ върху адипоил-6-аминопеницилинова киселина, разширявайки пръстена и до получаването на адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.

Нов трансформант

Специфичният трансформант Penicillium chrysogenum. експресиращ

активността на експандазния ген, който е предпочитаният обект на настоящето изобретение, е нов по отношение на съществуващите в предишните работи конструкции, например в Cantwell etal. (1990) Current Genetic, 17,213-221. И в двете конструкции мутагенезата е използвана in vitro за свързване на промотора с експандазния ген. В конструкцията на Cantwell се въвежда Ndel място при ATG на експандазния ген, който е свързан към Xbal място при 3' края на изопеницилин N синтетазкгз промотор чрез Xbal/Ndel връзка. В конструкцията от настоящето изобретение се създава Ncol място при 3' края на изопеницилин N синтетазната връзка. Това създава следната последователност около връзката промотор-ген в тези конструкции:

Xbal Ncol

IPNS промотор	5'	TCTAGACACCATGG	3'	SEQ	ID	N 1
Streptomlces	5'	GTGAGAGTTGATGGAC	3'	, SEQ	ID	N 2
експандаза				ί I	--
Cantwell	5'	TCTAGACACTATGGAC	3'	SEQ	ID	N 3
Настоящо	5'	TCTAGACACCATGGAC	3'	SEQ	ID	N 4

изобретение

Конструкцията на Cantwell замества С с Т, докато в конструкцията на настоящето изобретение С се запазва; последоватерността на промотора на изопеницилинсинтетаза N се ориентира незабавно към началния кодон ATG, което точно съответства на това, което се открива в природния изопеницилин N синтетазен ген. Възможно е, промоторзт от предишната работа, въпреки че се различава само по единичната нуклеотидна база, да води до по-слаба транслационната ефективност и с това - до по-ниско ниво на експресия на експандазния ген.

Другите разлики са в областта на промотора и гена, включени в конструкциите.

Конструкцията на Cantwell съдържа областите 5' BamHI до Xbal З'на изопеницилин

N синтетазкга промотор, докато векторът според настоящето изобретение съдържа областите 5' Ncol до Ncol 3' на промотора [Diezq et dl., (1990), J. Biol. Chem. 265, 16358-16365]. Това води до приблизително 250 bps допълнително на 5' края на промотора в конструкцията на Cantwell. Тази област, обаче е в отворената рамка на разчитане на синтетазния ген ACV нагоре по продължение на гена на изопеницилин N синтетазата.

Конструкцията на Cantwell съдържа също така и ген на Streptomyces от ATG нъм BamHI място 3' на гена, докато векторът съгласно настоящето изобретение съдържа ATG към Sall мястоЗ' HareHa[Kovacevicetal., (1990), J. Bacteriol., 171, 754760]. Това води до приблизително 1000 bps от допълнителна 3' крайна последователност в конструкцията на Cantwell. Конструкцията от настоящето изобретение съдържа участък upstream от експандазния ген на място BamHI 5' на ATG; тя, обаче, е разделена от рамката на разчитане на експандазния ген чрез изопеницилин N синтетазния промотор.

Друга разлика в построяването на настоящето изобретение и описаното в предишните работи се отнася до използването на селективен маркер. Използването на смес промотор-Penicillium изопенииилин N синтетаза:флеомицинов ген в конструкцията на настоящето изобретение спомага за избора на интегриране на многобройни копия или интегриране на местата, което дава високо ниво на експресията, а с това може да доведе и до по-висок процент трансформанти, с което експресира експандазния ген на високо ниво.

Нов трансформант от описания по-горе тип е Penicillium chrysogenum. означаван като РС100. Неговата характеристика обикновено включва производството на широко разпространени колонии - синьо-зелени до зелени на цвят гладки като кадифе с жълти точки; променят цвета си в жълт при дифундиране в агар; разклонени конидиални глави, като всичките им части са гладки; елиптична до кръгла конидия с дължина 3-4 mm. Приемливите условия за култивиране на Penicillium chrysogenum

включват използване на твърда среда, съдържаща монохидрирана лактоза -1.5% (тегло/обем); разтвор за накисване на зърното - 0,5% (обем/обем); пептон - 0.5% (тегло/обем); NaCI - 0.4% (тегло/обем); MgSO₄.7 Н₂О -0.05% (тегло/обем); КН₂РО₄ 0.06% (тегло/обем); FeCI₃.6H₂O -0.0005% (тегло/обем); CuSO₄.5H₂O - 0.0002% (тегло/ обем); агар -3% (тегло/обем); в един литър дестилирана вода, pH 4.8. Току що описаният Penicillium chrysogenum и означен с PC 100 е депозиран с Американска типова колекция на култури (АТСС), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, под каталожен номер АТСС 74182 (дата на депозита: приет на 21.08.1992 г., потвърдена валидност на 27.08.1992 г.).

Отцепване на адипоиловата странична верига

Следващият етап на новия биологичен метод от настоящето изобретение е отцепването на адипоиловата странична верига от адипоил-7 аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, което изисква обработка на съединението, получено в предишния етап с адипоилова ацилазна ензимна система. Както вече беше отбелязано по-горе, едно от значителните постижения на настоящето изобретение е възможността всичките етапи, водещи до образуването на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, да се извършат в една единствена ферментационна култура. Това постижение осигурява изключително повишена ефективност с това, че не трябва да се изолират и пречистват междинните продукти от отделни етапи на процеса. В този последен етап, обаче, не присъства

адипоилова ацилазна ензимна система, т.е. не се образува in situ в оригиналната ферментационна култура.

Ако новият биологичен метод от настоящето изобретение се реализира в затворена система (на отделни партиди), тогава ще бъде необходимо да се изолира и частично да се пречиства съединението, получено в предишния етап, като предварителните процедури за това са вече описани по-горе.

Въпреки всичко, методът от настоящето изобретение може да се реализира по всеки от начините, който ефективно води до взаимодействие на адипоилацилазата с адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина, така че да протече

ензимно превръщане на съединението в 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. Терминът „взаимодействие“ тук се използува в неговия най-широк смисъл. Възможно е да се използва свободна от клетки среда от непречистена адипоил-7 аминодезацетоксицефалоспоринова киселина като хранителен поток и да се обработи в затворена система с адипоилацилазен бульон. По този начин се постига известна ефективност, тъй като не е необходимо доплнително първоначално пречистване на реагентите. Разбира се, възможни са модификации. Например, реагентите могат да бъдат пречистени до някакво желано ниво преди да се приведат в контакт помежду им. Също така, възможно е методът да се реализира в непрекъснат режим вместо на отделни партиди. Взаимодействието между реагентите може да се модифицира по различни начини при запазване на предимствата на технологията на процеса. Така например, може да бъде използван несвързан ензим, например под формата колона, съдържаща адипоилацилаза, с преминаване на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина през колоната. Несвързаният ензим може да бъде прибавен към адипоил-7аминодезацетоксицефалоспориновата киселина под формата на суспензия. Такава свободна ензимна система предлага предимствата на лесно освобождаване на ензима и многократното му използване. Друга реализация на тази технология е свързана с използването на мембранни реактори. Предпочитаният метод за осъществяване на взаимодействие между реагентите е използването на колона с несвързан (свободен) ензим.

Адипоилацилазни ензими, използваеми в етапа на отцепване

Съществуват редица ензими с известна специфичност към адипоиловата странична верига. Получените резултати с адипоилацилаза -търговски продукт на RAEV Corp., са описани в следващите работни примери. В литературата са цитирани 7 други ензима, отцепващи адипоиловата странична верига от молекули от цефалоспоринов тип. Шест от тези седем ензима са от вида Pseudomonas, а седмият е от вида Bacillus. Съществува известна прилика между ензимите от Pseudomonas.

но и седемте ензима се различават в известна степен по своите физично/биологични свойства. Някои от техните характеристики са обобщени по-долу:

ЕНЗИМ	УКАЗАНИЕ	ПРИБЛИЗИТЕЛНО
(щамове на		МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО
Pseudomonas и Baccilus)		(субединици)
Pseudomonas SY-77-1	Shibuya, et al.	Приблизително
(Toyo Jozo)	(1981)	като на GK16
Pseudomonas GK16	Matsuda, Komatsu	16 000
(Asahi)	(1985)	54 000
Pseudomonas SE83 (acyl)	Matsuda, et al.	38 200
(Asahi)	(1987)	19 900
Pseudomonas SE83 (acyll)	Matsuda, et al.	25 400
(Asahi)	(1987)	58 200
Pseudomonas diminuta N176	Aramori, etal.	58 000
(Fujisawa)	(1991a)*	26 000
Pseudomonas diminuta V22	Aramori, et al.	?
(Fujisawa)	(1991a)*	?
Bacillus laterosporus J1	Aramori, et al. (мономерен)	70 000(19916)**
Pseudomonas sp.		16 000
(RAEV Corp.)		54 000

* Aramori, etal., J. Ferment Bioeng. (1991) 72: 232-243.

** Aramori, etal. J. Bacteriol. (1991) 173: 7848-7855.

Всичките изброени по-горе адипоилацилазни ензими могат да бъдат използвани в новия биологичен метод на настоящето изобретение. И други адипоилацилази, използваеми в метода на настоящето изобретение, могат да бъдат лесно открити посредством тестване на даден ензим спрямо адипоил-7аминодезацетоксицефалоспориновата киселина - действителният субстрат, върху който ензимът трябва да действа. Един положителен резултат би дал надежден и възпроизводим метод за определяне на използваемостта на даден ензим в метода на настоящето изобретение. Субстратът може да бъде изготвен по лесен начин чрез реакция на адипинов анхидрид със 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина при използване на една модификация на методиката, предложена от Szewczuk и Wellman-Bednawska в Clin. Chim. Acta (1978), 84,19-26. Адипиновият анхидрид може да бъде получен в съответствие с метода на Albertson и Lundmark, описан в J.

Macromol. Sci. Chem. (1990) А27, 397-412. 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина се доставя от редица търговски фирми, в това число и E.R. Squibb & Sons, Ltd., New York и Interchem Corp., New York.

Ако е желателно да се направи грубо пресяване на ензима, който ще се използва, чрез използване на бърз колориметричен метод, субстратът от адипоил-

7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина може да бъде заместен временно с един колориметричен субстрат, например адипоил-РАВА (пара-аминобензоена киселина) илиадипоил-PNA (пара-нитроанилин). Отцепването на страничната верига води до получаване на оцветени образци, чието присъствие и концентрацията им се определят с помощта на колориметър. За по-подробна информация относно този и други подходящи колориметрични методи виж Marelli, L.P. (1968) J. Pharm. Sci. 57: 2172-2173; Szasz, G. (1969) Clin. Chem. 15: 124-136; Szewczuk, A. et al. (1980) Anal. Biochem. 103:166-169; и Reyes, F. et al. (1989) J. Pharma. Pharmacol. 41:136-137.

Направено е сравнение между N-крайни аминокиселинни последователности на ензима на RAEV с високомолекулните ензими acyll и GK16, посочени в предшестващата таблица. Резултатите от сравняването са показани по-долу (където кръглите скоби показват по-малко решаващото отнасяне).

одр\/ _ SEQ ID N 5

SN (S) (G) A V A Р G КТ А N G N A L (L) LQ N (Р)

GK16SEQ ID N 6

SNSWAVAPGKTANGNALLLQNP acyll SEQ ID Ν 7

SNNWAVAPGRTATGRPILAGDP

От показаните последователности е очевидно, че тези пептиди са свързани. Протеин, имащ N-крайна последователност, аналогична на показаната по-горе, 35обаче, не трябва задължително да притежава адипоилацилазна активност, както е в случая с пеницилин-й-ацилазата, получена от щама на Arthrobacter. От друга страна, съществуват адипоилацилази, използваеми в метода от настоящето изобретение, които не притежават значителна прилика с горепосочената N-крайна последователност. Например, ацилазните ензими acyl на Asahi и Bacillus laterosporus J1 на Fujisawa, описани в предшестващата таблица, които показват известна адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина-ацилазна активност, не споделят еднаква последователност с другите описани по-горе ензими. Освен това, обсегът нанастоящето изобретение по отношение на адипоилацилазата, използвана

във втория етап на новия биологичен метод, се определя от това, дали даден ензим е или не е в състояние да отцепи адипоиловата странична верига от адипоил-7 аминодезацетоксицефалоспориновата киселина, факт, който може да бъде определян лесно и възпроизводимо, както е описано по-горе.

Възможни са и други подходи за намиране на подходящи адипоилацилази.

Например, ЕРА-А-0 453 048 описва методи за повишаване на активността по отношение на отцепване на адипоиловата верига от страна на глутарилацилаза, получена с Pseudomonas SY-77-1. Чрез заместване на различни аминокиселини със съответни лактони вътре в алфа-субединицата се наблюдава три до пет пъти по голяма скорост на отцепване на адипоиловата верига (от здипоил-серина). Такива

усъвършенствани ензими са подходящи да бъдат използвани в настоящето изобретение. Трябва да се отбележи, че въпреки че ЕР-А-О-453 048 недвусмислено показва една ацилаза с повишена активност към адипоиловата странична верига, той не показва никакви начини (химични или чрез биологичен метод в някакъв смисъл аналогичен на описания в настоящето изобретение), по които на първо място трябва да се получи адипоил-цефалоспорин.

Следва детайлно описание на предпочитаните реализации на настоящето изобретение, които претендират само за илюстративен характер и по никакъв начин не ограничава настоящето изобретение.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

ПРИМЕР 1

Условия за получаване на култура на Penicillium chrysogenum

Щамът на Penicillium chrysogenum. използван в този метод, се поставя върху плочки, съдържащи среда LCSB, състояща се от монохидрирана лактоза 1.5% (тегло/обем); разтвор за накисване на зърното - 0,5% (обем/обем); пептон 0.5% (тегло/обем); NaCl-0.4% (тегло/обем); MgSO₄.7 Н₂О-0.05% (тегло/обем); КН₂РО₄ -0.06% (тегло/обем); FeCI₃.6H2O-0.0005% (тегло/обем);CuSO₄.5H₂O-0.0002% (тегло/ обем); ат ар - 3.0% (тегло/обем); в един литър дестилирана вода, pH 4.8. След престоянане в продължение на 12 дни при 25 °C и 65% относителна влажност, единичните колонии се отделят и се добавят към 2 ml стерилна вода в затваряща се на винт тръбичка, съдържаща стъклени перли. След умокряне на израстналата култура чрез създаване на вихрово движение на течността, суспензията се използва

за инокулация на колби, съдържащи оризови зърна. Те съдържат 25 g на 250 ml колба преработен ориз Uncle Ben’s със зърна с естествена дължина, измит с три до четири обема дестилирана вода за около 7 минути при разбъркване всеки 30 секунди, след което водата е отцедена, така че в ориза да остане около 25% от нея. След 12 дни при 25 °C и 65% относителна влажност спорите се измиват от ориза с 50 ml стерилна вода. Суспензията от спори се използва за инокулиране на течни култури, а също и за осигуряване налиофили от култури за съхраняване при 4 °C. Спорите се прибавят към равен обем 5% обезмаслено мляко и се лиофилизират в стерилни ампули.

За получаване на пеницилини или за получаване на мицели като източници на дезоксинуклеинова и на рибонуклеинова киселина е използвана двустепенна ферментация на щама в клатачни колби. Зародишообразуването се инициира чрез добавяне на 1 х 10^в спори към 50 ml (в колба с обем 500 ml) среда, състояща се от глюкоза - 3.0% (тегло/обем); фармацевтична среда - 1.0 (тегло/обем); разтвор за накисване на зърното - 3.0% (обем/обем); амониев сулфат - 0.2 (тегло/обем); СаСО3 -0.5% (тегло/обем); монокалиев анхидрофосфат-0.05% (тегло/обем); лактоза-1.0% (тегло/обем); първични сухи дрожди -1.0% (тегло/обем); в един литър дестилирана вода. Инкубацията е при 25°С и 65% относителна влажност върху ротационна клатачна установка с амплитуда с диаметър 70 mm при 220 min-¹ . След 48 часова инкубация процесът се инициира чрез прехвърляне на 2 ml от вегетативния зародиш към 35 ml (в колба с обем 500 ml) среда със следния състав: КН2РО₄ - 0.05% (тегло/ обем); КН₂РО₄-0.5% (тегло/обем); (NH₄)₂SO₄-1.0% (тегло/обем);лактоза-12% (тегло/ обем); фармацетична среда - 2.75% (тегло/обем); СаСО₃ (преципитат) -1.0% (тегло/ обем); свинска мас -1.0% (тегло/обем); в един литър дестилирана вода, pH 6.6. След поставяне в автоклав, но преди инокулирането, се прибавя стерилен 25% натриев адипат (pH 6.6), така че да се получи крайна концентрация на натриев адипат 2.5%. Инкубацията и следващатая инокулация след това продължават при същите условия както в етапа на зародишообразуване още 5 до 7 дни.

Когато са необходими мицели за получаване на протопласти за трансформацията или като източници на ДНК, щамът се отглежда в 50 ml (в колба с обем 250 ml) експериментална хранителна среда, съставена от: 50 ml от 20Х соли на Clutterbuck (120 g NaNO₃ -10.4 g MgSO₄.7H₂O, 30.4 g KH.POJ, 2.0 ml 2.0 ml микроелементи HaVogel (3M лимонена киселина, 0.2M ZnSO₄,25mM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂.6 H₂O, 10mM CuSO₄, 3mM MnS0₄, 8mM борна киселина, 2mM Na₂MoO₄.2H₂O), 5 g триптон, 5 g екстракт от мая, 10 g глюкоза в един литър вода. Инкубацията е при 25°С върху ротационна клатачна установка при 220 min¹ .

ПРИМЕР2

Изолиране на Penicillium геномна ДНК и цялостна РНК

Вегетативният мицел, израстнал за 48 часа от култура, получена според описания по-горе начин, се събира чрез филтруване през марля, замръзява се в азот и се лиофилизира в продължение на една нощ. Изсушените мицели се раздробяват с пясък в хаван с пестик и се суспендират отново в 25 ml ЮОтМ UCI, 50тМ етилендиаминтетраоцетна киселина, 10mM Tris pH 8.0, 4% натриев додецилсулфат. След загряване на суспензията до 50-55°С на водна баня с температура 60°С, сместа се екстрахира първо с буфериран с 1М Tris (pH 8) фенол, а след товас буферирана с Tris смес фенол:хлороформ (1:1,обем:обем) и накрая с хлороформ. РНК се утаява от водната фаза чрез добавяне на равен обем студен 6М LiCI и оставяне на сместа да престои при -20°С в продължение на 2-3 часа. След центрофугиране 20 минути при 12 000 хд и при 4°С, към избистрения разтвор се добавя етанол, така че да се получи концентрация на етанола 66% (обем/обем), и се охлажда до -20 °C в продължение на 15 минути, за да се утаи ДНК. След центрофугирането по описания по-горе начин сбитата утайка се промива със 70% етанол, изсушава се и се суспендира отново в Tris-етилендиаминтетраоцетна киселина (10mM Tris-HCI, pH 7.5, 1тМ етилендиаминтетраоцетна киселина). Концентрацията на ДНК се оценява чрез сравняване с познати еталони от ДНК при електрофореза в агарен гел и оцветяване с етидиев бромид. Култури на Penicillium chrysogenum. както са описани в Пример 1, се култивират 96 часа в 35 ml ферментационна среда (съгласно описаните преди това условия) при 25°С върху ротационна клатачна установка при 220 min¹. Мицелите се събират чрез вакуумно филтруване през филтър тип Whatman, и се промиват с приблизително 50 ml вода. Мицелите се остъргват незабавно от филтъра, суспендират се отново в 5 ml „прекъсващ буфер“ (50тМ Tris-HCI pH 7.4, 150тМ NaCI, 5тМ етилендиаминтетраоцетна киселина pH 8.0, 5% натриев додецилсулфат), замразяване в течен азот и лиофилизиране. След лиофилизиране в продължение на една нощ се добавят 5 ml вода, съдържаща 0.1% диетилпирокарбонат и 5 ml буфериран с 1М Tris (pH 8) фенол:хлороформ:изоамилов алкохол (50:50:1) и сместа се затопля до 37°С с разклащане в продължение на 20 минути. Сместа се центрофугира с 12 000 хд в продължение на 10 минути при 4°С, след което водният разтвор се екстрахира отново - първо с 1М Tris (pH 8)-наситен фенол:хлороформ: изоамилов алкохол (50:50:1), след това с буфериран с 1М Tris (pH 8) фенол и накрая с хлороформ. Равен обем 6М UCI се смесва с крайния воден слой и разтворът се оставя при -20 °C минимум 4 часа. Цялостната РНК се изолира под формата на уплътнена утайка чрез центрофугиране 20 минути при 12 000 хд при 4°С. Утайката се разтваря в 0.3 ml буфер ТЕ (Tris-етилендиаминтетраоцетна киселина) плюс 0.03 ml ЗМ натриев ацетат и се прибавят 2.5 обема етанол, за да утаи РНК. Крайната утайка се разтваря в 0.1 ml Tris-етилендиаминтетраоцетна киселина и се определя спектрофотометрично при отчитане на абсорбцията при 260 nm.

ПРИМЕР 3

Условия за получаване на култура на Sreptomyces clavuligerus

Използваният в тази методика щам на Streptomyces clavuligerus е АТСС 27064. Щамът се поставя върху плочки, състоящи се от дрожден екстракт - 4 д; малцов екстракт - 10 д; глюкоза - 4 д; агар - 20 д; в един литър дестилирана вода, pH 7.2. След култивиране в продължение на 5 дни при 30°С към плочките се добавят 2 ml стерилна вода и порастналата култура се остъргва от повърхността на плочките. Получената суспензия се прехвърля в стерилна тръбичка със затваряне на винт, съдържаща стъклени перли. След омокряне на израстналата култура (чрез създаване на вихрово движение на течността), суспензиятасе използва за инокулация на течни култури. Чрез прибавяне на глицерол до концентрация 15% в крайния обем, суспензията може да се използва за продължително съхраняване на културата при

-70 °C.

Когато са необходими мицели за получаване на протопласти за трансформацията или като източници на ДНК, щамът се отглежда в 200 ml (в колба с обем 1 I) среда YEME, съставена от дрожден екстракт - 3 д; пептон - 5 д; малцов екстракт - 3 д; глюкоза-10 д; захароза- 340 д; МдС1₂.6Н₂ -1.02 д; глицин - 5 д; агар 18 д; в един литър дестилирана вода. Инкубацията се извършва при 28°С върху ротационна клатачна установка при 220 min-¹ .

ПРИМЕР 4

Изолиране на Streptomyces геномна ДНК

Вегетативният мицел, израстнал за 48 часа от култура, получена според описания по-горе начин, се събира чрез центрофугиране 10 минути при 22 100 хд. Клетките се суспендират отново в 10 ml буфер Tris-етилендиаминтетраоцетна киселина, прибавят се 10 mg лизоцим и сместа се инкубира 15 минути при 30 °C. След това се прибавя 1 ml натриев додецилсулфат и веднага след него - 10 ml буфериран с Tris-етилендиаминтетраоцетна киселина (pH 8) наситен фенол и 1.5 ml 5М NaCl. Сместа се разклаща леко в продължение на 20 минути. Фазите се разделят чрез центрофугиране в продължение на 10 минути, след което водният слой се отделя и прехвърля в пресна тръбичка. Прибавя се равен обем хлороформ и сместа се разклаща леко 10 минути. Фазите отново се разделят чрез центрофугиране 10 минути при 12 000 хд. Водният слой се отделя и отново прехвърля в пресна тръбичка. Внимателно се прибавят два обема изопропанол и утаената ДНК се разтваря отново в минимално количество Тris-етилендиаминтетраоцетна киселина. Добавя се RNAse А до получаване на крайна концентрация 20 mg/ml, заедно със 100 mM NaCl и 0.4% натриев додецилсулфат и сместа се инкубира един час при 37°С Разтворът се екстрахира отново с равен обем буфериран с Tris-етилендиаминтетраоцетна киселина (pH 8) фенол, а след това и с хлороформ. ДНК, получена при последната екстракция, се отделя след прибавяне на два обема изопропанол и концентрацията и се определя спектроскопски при отчитане на абсорбцията при 260 пт.

ПРИМЕР 5

Конструиране на генна банка и изолиране на фрагменти от ДНК, съдържащи експандазен ген на Streptomyces clavuligerus

Streptomyces clavoligerus геномна киселина, получена по гореописания начин, се смила с рестрикционните ензими Bam HI и Sal I. Смляната ДНК се подлага на електрофореза върху 0.8% агарозен гел и фрагментите с размер 1.8 до 2.2 kb се елуират и лигират към pUC18 ДНК, предварително смляна с Bam HI и Sal I. Разтворите на лигираната смес се използват за трансформиране на подготвени компетентни клетки JM109 при използване на електропорация (Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, СА). Подготвянето на компетентните клетки и условията на електропорацията са съгласно предписанията на производителя. Трансформационната смес се разстила върху плочки LB, съдържащи 100 mg/ml ампицилин и 75 ml 2% X-Gal. След инкубация при 37 °C в продължение на една нощ рекомбинантните колонии се идентифицират по тяхното обезцветяване, причинено от активността на плазмидния вектор на бетагалактозидазния ген. Безцветните колонии се остъргват и пренасят върху плочки, съдържащи 100 mg/ml ампицилин. След култивиране в продължение на една нощ при 37°С колониите се пренасят върху нитроцелулоза и се хибридизират с проба, получена чрез верижна реакция с полимераза, която съответства на публикуваната експандазна генна последователност на Streptomyces clavoligerus от бази 52-918 [Kovacevic et al. (1989) J. Bacteriol. 171: 754-760; и U.S. 5,070, 020]. Белязянето на продукта от полимеразната верижна реакция се извършва последством екстензионна реакция на произволен праймер с (³² Р) dCTP и с олигобележещ кит съгласно инструкциите на производителя (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Хибридизационната реакция се извършва в присъствието на 10⁶ СРМ от белязаната с радиоактивен елемент проба, 30% формамид, 5Х SSC (0.15М NaCl, 0.015М натриев

I цитрат, pH 7), 0.1% натриев додецилсулфат, 5Х Denhardt’s (5 g фикол, 5 g j поливинилпиролидон и 5 g говежди серумен албумин за 500 ml на 50Х линия) и 100 ι

i mg/ml телешка тимусна ДНК, при 37°С в продължение на една нощ. Към пробата се хибридизират здраво редица трансформанти. Чрез рестрикционен ензимен анализ е установено, че една от колониите съдържа вектор, носещ експандазния ген и този плазмид е означен като pFTSO-1.

ПРИМЕР 6

Изолиране на плазмидна ДНК

Култури от E.coli. съдържащи плазмид, се култивират в 500 ml базова бактериологична среда LB [20 g/1 Broth Base (Gibco, Paisley, Scotland)] c 15 mg/ml тетрациклин върху ротационна клатачна установка при 220 min¹ в продължение на 12-16 часа при 37°С. Клетките се уплътняват чрез 10 минутно центрофугиране при 4000 хд и при 4°С. Уплътнените клетки се ресуспендират в 18 ml глюкозен буфер (50тМ глюкоза, 25тМ Tris pH 8.0, ЮтМ етилендиаминтетраоцетна киселина) и 2 ml 40 mg/ml лизозим (Sigma, St. Louis, МО), сместа се хомогенизира и се инкубира 15 минути при стайна температура. Добавят се 40 ml прясно приготвен разтвор на 0.2N NaOH и 1% натриев додецилсулфат, сместа се разклаща внимателно (така че да се получи вихрово движение) и се поставя за 10 минути върху лед. Добавят се 30 ml 5М калиев ацетат, pH 4.8, разбърква се добре и получената смес се оставя да престои още 10 минути върху лед. Клетъчните остатъци се уплътняват чрез центрофугиране при 4000 хд в продължение на 10 минути при 4 °C. Полученият избистрен разтвор се филтрува през марлен филтър. Към бистрия разтвор се добавя изопропанол (0.6 обема), за да утаи плазмидната ДНК. Утайката се получава по време на инкубация при стайна температура в продължение на20 минути. Плазмената ДНК се уплътнява при центрофугиране 20 минути при 4°С и 4000 хд, след което се измива със 70% етанол и се изсушава за кратко време. Уплътнената утайка се ресуспендира в 9 ml

Tris-етилендиаминтетраоцетна киселина и към суспензията се добавят 10 g CsCI и 0.387 ml 10mg/ml разтвор на етидиев бромид. Разтворът се центрофугира 24 часа при 313 ЮОхд. Плазмидният слой, разположен в разтвора с градираща концентрация на цезиевия хлорид, се визуализира с помощта на ултравиолетова светлина, изолира се, след което етидиевият бромид се отделя чрез екстрахиране с наситен воден разтвор на бутанол. Използваният при получаването на плазмида CsCI се отстранява чрез диализа срещу Tris-етилендиаминтетраоцетна киселина. Накрая ДНК се концентрира при използване на полиетиленгликол (молекулна маса 8000). Концентрацията на ДНК се определя спектрофотометрично като се отчита адсорбцията при 260 nm.

ПРИМЕР 7

Конструиране на трансформационен вектор на Penicillium pPenFTSO

Конструира се трансформационен вектор на Penicillium с флеомицинов устойчив ген като доминантен селективен маркер. Това се изпълнява първо като чрез електрофореза и следващо елуиране от агарозния гел се изолира фрагмент 660 Ьр, съдържащ флеомицинов устойчив ген (протеинов ген от Streptoalloteichus hinduslanus, свързващ флеомицин) и куплиран към дрожден цитохромен С1 терминатор, от смлян с Bam Hl/Bg 1 II плазмид pUT713 (CAYLA, Toulouse Cedex, France). Изолираният фрагмент се лигира в Bam HI място на вектора pSELECT* 1 (Promega Corporation) и ориентацията на гена се определя чрез рестрикционен ензимен анализ. След това се лигира фрагмент 550 bp Pst I, съдържащ ламбда cosмясто, което дава възможност векторът да бъде използван за образуване на козмид при положение, че във вектора е включен фрагмент на ДНК с подходящ размер. Впоследствие от един смлян с Neo l/Bam HI геномен клон, съдържащ синтатазния ген на Penycillium chrisogenum изопеницилин N се изолира (чрез електрофореза върху агарозен гел и елуиране от него) фрагмент 1.5 kb Neo l/Bam HI, съдържащ промоторния участък на синтатазния ген на Penycillium chrisogenum изопеницилин N. Изолираният промоторен фрагмент на синтатазния ген на Penycillium chrisogenum изопеницилин N се лигира в Neo l/Bam HI отделения вектор. Мястото Neo I се намира върху стартовия кодон ATG на флеомициновия устойчив ген. Този вектор се обозначава като pUTZ-2.

Фрагментът (1.645 kb), съдържащ експандазният ген на Streptomyces clavuligerus. се пречиства от Bam HI и Sal I на pFTSO-1 (векторът, описан преди това) чрез електрофореза и следващо елуиране от 0.8% агарозен гел. Изолираният

фрагмент се лигира във вектораpSELECT (Promega Corporation), също смлян с Ват

HI и Sal I. Този вектор се обозначава като pFTSO-8. Върху началния кодон ATQ на експандазния ген се създава ново Neo кмясто чрез насочена мутагенеза на pFTSO8, при използване на променящя местата in vitro мутагенна система Altered Sites * (Promega Corporation). Мутагенезата се провежда при предписаните от производителя условия . За да се допълни кодиращата последователност на участъка от ДНК върху началния кодон ATG от публикуваната последователност на експандазния ген на Streptomyces, се изгражда един олигонуклеотид [ Kovacevic et al., (1990) Journal of Bacteriologyq 171, p. 3952-3958]. Олигонуклеотидът се синтезира по химически път от цианоетилфосфоамидит (Pharmacia Gene Assembler instrumentation) и има следната последователност:

SEQ ID N 8

3' CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG 5'

Мутагенезата се потвърждава чрез ензимен рестрикционен анализ. След това фрагмент (1.2 kb Neo I), съдържащ промоторния участък на синтатазния ген на Penycillium chrisogenum изопеницилин N, се изолира (чрез електофореза и елуиране от агарозния гел) от Neo l/Bam HI отрязъка на геномен клон, съдържащ синтатазния ген на К изопеницилин N. Промоторната част на синтатазния ген на Penycillium chrisogenum изопеницилин N се лигира във вектора pFTSO на ново Neo I място, създадено чрез мутагенеза върху началния кодон ATG на експандазния ген. Ориентирането на промотора към експандазния ген се определя чрез рестрикционен ензимен анализ. Тази касета - промотор на синтатазния ген на Penycillium chrisogenum изопеницилин N: експандазен ген след това се отделя под формата на фрагмент Bam Hl/Sal I в Ват Hl/Sal I отрязъка на трансформационния вектор pUTZ-2 на Penicillium, описан по-горе. Крайната конструкция е обозначена като pPenFTSO.

ПРИМЕР 8

Клониране на промотора на Penicillium β* -тубулин

Генът на Penicillium β* -тубулин се клонира от ламбда геномната банка на Penicillium при използване на ген на Aspergillus niger β-тубулин като хибридационна проба. Определянето на последователността на аминокиселините остатъци и сравняването с познатата аминокиселинна последователност на β-тубулиновия ген на Aspergillus niger показва област с 91% хомоложност, започваща с началния кодон ATG. Изолирани са последователности, съдържащи функционален промотор между началния кодон и Bam HI мястото 1.4 kb upstream.

Конструиране на трансформационния вектор, носещ промотора на Penicillium β -тубулин

Фрагмент 2.0 kb Xba l/Hind III, съдържащ промотор на Penicillium β -тубулин се лигира във вектора pSELECT (Promega Corporation) също смлян с Xba l/Hind III. Върху стартовия кодон се въвежда ново Neo I място чрез насочена мутагенеза при използване на променяща местата in vitro мутагенна система (Promega Corporation). Мутагенезата се провежда при предписаните от производителя условия. Допълнително е изграден олигонуклеотид към ATG началното място, но това е свързано с редица промени, за да се създаде Neo I място, което да бъде използвано за мутагенезата. Олигонуклеотидът е синтезиран с помощта на цианоетилфосфоамидит (Pharmacia Gene Assembler instrumentation) и има следната последователност:

I SEQ ID N 9

5' ATCTCTTTTCTAATACCTTCACCATGGGTGAGATTGTACGTQATCCC 3'.

Мутагенезата се потвърждава чрез ензимен рестрикционен анализ. След това фрагмент 1.4 kb Bam Hl/Nco I, съдържащ промотор на Penicillium β -тубулин се лигира към създадено Neo I място върху ATG на експандазния ген на Streptomyces в Ват Hl/Nco I digested вектор pFTSO-8 (вече описан в пример 7). Този вектор се обозначава с btFTSO-8. Фрагмент 1.4 kb Bam Hl/Nco I, съдържащ β-тубулинов промотор също се лигира в Bam Hl/Nco I digested вектор pUTZ-2 (вектор, описан вече в пример 7). Вграждането позиционира β-турболиновия промотор директно на предната страна на флеомициновия резистентен ген. Този вектор се обозначава с рСГб. След това фрагмент 2.4 kb Bam Hl/Hind III от вектора btFTSO-8, съдържащ β-турбулинов промоторна експандазна генна касета се лигира към Bam Hl/Hind III digested вектор pCI-6, с цел да се получи крайният трансформационен вектор на Penicillium. в който експандазният ген на Streptomyces и флеомициновия резистентен маркер се експресират от β-тубулиновия промотор. Този вектор се означава с pTS-2.

ПРИМЕР9

Клониране на промотора на Penicillium глииериналдехид-3-фосфатдехидрогеназа (GAP)

Генът на Penicillium глииериналдехид-3-фосфатдехидрогеназа се клонира от Penicillium ламбда геномната банка при използване на глицериналдехид-3фосфатдехидрогеназен ген на Aspergillus niger като хибридизационна проба. Четири потенциални позитива допълнително са изпробвани с продукта от полимеразната верижна реакция (PCR), получен от праймери за 5' участъка на Cephalosporium глицериналдехид-3-фосфатдехидрогеназния ген [Kimura, Н. et al., (1991), J. Ferm, and Bioeng., 71, 145-150]. Олигонуклеотидите, използвани за праймерите на полимеразната верижна реакция (PCR) се синтезират с помощта на цианоетилфосфорамидит (PharmaciaGene Assembler instrumentation) и има следната последователност:

SEQ ID Ν 10

5' CGCGGATCCCGGCATCAACGGCTTCGGTCGTAT 3'

SEQ id n и

5' CGCGGATCCGGGCACGCGCATGGACATGCCAGTG 3'

Един от четирите предполагаеми позитива е напречно хибридизиран към продукта на полимеразната верижна реакция. За определяне на последователността на аминокиселинните остатъци фрагмент 4 kb Bam HI от този геномен клон се лигира в

digested вектор pSELECT (Promega Corporation). Този вектор се означава с pTS-O. Идентифицирането на инициращия кодон ATG става чрез сравняване на последователността на този фрагмент с познатата последователност на цефалоспориновия глицериналдехид-3-фосфатдехидрогеназен ген.

Конструиране на трансформационния вектор, носещ промотор на Penicillium глицериналд ехид-3-фосф атдехидрогеназа (GA Р)

За конструиране на промотор на Penicillium глицериналд ехид-3фосфатдехидрогеназа (GAP) със Streptomyces експандазния ген се създава ново Neo I масто в ATG на Penicillium глицериналдехид-3-фосфатдехидрогеназния ген чрез насочена мутагеназа in vitro при използване на вектор pTS-O. Мутагенезата се провежда съгласно инструкциите на производителя. Конструира се олигонуклеотид, комплементарен на кодиращата част на ДНК при ATG началния кодон на глицериналдехид-3-фосфатдехидрогеназния ген, но се включват промени на базата, които да създадат Neo I място. Олигонуклеотидите се получават чрез цианоетилфосфорамидитна синтеза. (Pharmacia Gene Assembler instrumentation) и имат следната последователност:

. SEQ ID N 12

5' CAGTAAACGCAACCATGGTTGTCCAG 3'

Мутагенезата се потвърждава чрез ензимен рестрикционен анализ. След това фрагмент 1.9 kb Neo l/Bam HI от pTS-O, съдържащ глицериналдехид-3 фосфатдехидрогеназен промотор се лигира в Neo l/Bam HI digested вектор pFTSO-8 (вектор, описан в пример 7) за установяване на мястото на глицериналдехид-3 фосфатдехидрогеназния промотор със Streptomyces експандазния ген. Този вектор се означава cpTS-0-1. Следвалигиране на фрагмент 3.0 kb Bam Hl/Hind III от вектора pTS-0-1, съдържащ глицериналдехид-3-фосфатдехидрогеназен промотор:експандазна касета, към Bam Hl/Hind III digested вектор pl-6 (описан в пример 7), при което се получава крайният Penicillium трансформационен вектор pSD-1, в който Streptomyces експандазния ген се експресира от глицериналдехид-

3-фосфатдехидрогеназния промотор.

ПРИМЕР 10

Трансформация на Penycillium chrisogenum

Описаните по-горе протопласти на щам на Penycillium chrisogenum се получават чрез инокулиране на 50 ml хранителна среда СМ с 1 X 107 спори в продължение на часа при 25°С върху ротационна клатачна установка при 220 min·¹. Мицелът се събира чрез филтруване през марлен филтър, прехвърля се в колба с обем 500 ml, ресуспендира се в 25 ml буфер КМР (0.75 KCL, 0.8М манитол, 0.02М К₂РО₄ - pH 6.3), съдържащ 100 mg Novozyme 234 (Novo BioLabs, Bagsvaerd, Denmark), и се оставя за инкубация при 30°С при 100 min¹. Сферопластите се отделят чрез филтруване през филтри от марля и стъклено влакно и се уплътняват чрез центрофугиране при 350 хд в продължение на 10 минути. След това сферопластите се промиват трикратно с 10 ml буфер КМР.ресуспендират се в буфер КМ PC (KMPcSOmM CaCI^ до концентрация

X 107 клетки/ml и се оставят 20 минути при стайна температура. За да се извърши трансформация на Penycillium. 200 ml от суспензията от сферопласти се добавят към ДНК (5 mg вектор ДНК в 6.2 ml КМPC в 5 mg/ml хепарин) заедно с 50 ml РРС (40% полиетиленгликол с молекулна маса 3500,20 mM K₃P0₄, pH 6.3,5% СаС1₂, прибавен непосредствено преди използване). Трансформационната смес се инкубира върху лед в продължение на 30 минути. Добавя се 1 ml прясно приготвен РРС и сместа се прехвърля към 50 ml стопен (50°С) регенериран arap (CM +- 1.3М манитол и 3% агар). Трансформационната смес след това се разпределя в 5 блюда „петри“. След регенериране 24 часа при 25°С плочките се покриват с OL (1% пептон и 1% агар), съдържащ 100 mg/50ml OL на флеомицин. Количеството на OL е равно на количеството на регенерирания агар. Плочките се инкубират при 25°С за 7-14 дни и се наблюдават за образуване на трасформантни колонии.

ПРИМЕРИ

Високоефективен течен хроматографски (HPLC) анализ на ферментационните продукти адипоил-6-аминопеницилинова киселина и адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина

Използва се високоефективна течна хроматография за анализ на получаването на адипоил-6-аминопеницилинова киселина в използвания нетрансформиран щам на Penycillium chrisogenum и на получаването на адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина в използвания трансформиран щам на Penycillium chrisogenum. Анализът е проведен на система Waters със захранваща с разтворители система 625, детектор навълни с променлива дължина 490Е, настроен на 220 nm и 254 nm, система за данни 825 Maxima и колона Novo-C18 като стационарна фаза. Подвижната фаза (при скорост на потока 1 ml/min) се състои от: за 5 минути - изократна (непроменяща се) смес от 2% метанол/98% 0.010М КН₂РО₄, pH 7.0; и 15 минути - 2 до 40% линеен градиент на метанол/О.ОЮМ КН₂РО₄, pH 7.0. За количествено определяне наадипоил-6-аминопеницилиновата киселина е използвана стандартната крива на пеницилин N-стандарт при 220 nm, а за количествено определяне на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина стандартната крива на стандартен деацетоксицефалоспорин С при 254 nm.

Анализите на чувствителността на адипоил-6-аминопеницилиновата киселина и на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина към обработки с пеницилаза се извършват чрез добавяне на 1 единица/rrt пеницилаза 1илипеницилаза III към съответните филтрати и инкубиране при стайна температура в продължение на 10-30 минути. Получените образци се подлагат на високоефективен течен хроматографски анализ при описаните по-горе условия.

Ултравиолетовият спектрален анализ на адипоил-6-аминопеницилиновата киселина и на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина се

провежда при използване на Waters система с 510 захранваща с разтворители система, 990 фотодиоден лъчев детектор, 990 система данни и Novo 18 колона като стационерна фаза. Използваната подвижна фаза е идентична на описаната по-горе.

Изолиране на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина в голям мащаб от цялата ферментационна среда се провежда при използване на Waters система с 510 захранваща с разтворители система, 990 фотодиоден лъчев детектор, 990 система данни и mBondapak С18 препаративна колона като стационерна фаза. Подвижната фаза (при скорост на потока 5ml/min) се състои от изократен 0.01 ОМ

КН₂РО₄, pH 7.0 в интервал на35 минути. Абсорбционният пик, отговарящ на времето

на задържане на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина се получава при използване на фракционен колектор.

ПРИМЕР 12

Анализ на биоактивност

За определяне на антибиотиковата активност на изолираните чрез високоефективна течна хроматография адипоил-6-аминопеницилинова киселина и адипоил-7-аминодезаиетоксицефалоспоринова киселина се използва агардифузионен биоанализ. 20 ml от изолираното съединение се нанасят под формата на дискче с диаметър 5 mm върху плочки от LB агар [20 g/l LB базова бактериологична среда с 3% arap (Gibco, Paisley, Scotland), със зародиши на Bacillus subtilus ATCC

33677 или особено чувствителния щам на E.coli (доставян от Prof. Arnold L. Demain,

M IT). Bacillus subtilus се използва като индикаторен щам за анализиране на адипоил-

6-аминопеницилинова киселина, а суперактивния щам на Е. coli се използва като индикаторен щам за анализ на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. След 15 часа инкубация при 37°С появата на ореол от индикаторни бактерии със забавен растеж около дискчето показва,че съединението проявява п биоактивност. Контролните опити в този ексеримент включват

деацетоксицефалоспорин С, цефалоспорин С, пеницилин V и агар, съдържащ и несъдържащ пеницилиназа- като контролен опит за потвърждаване на β-лактамната структура.

ПРИМЕР 13

Анализ на ензим на RAEV

Пречистен адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина от цялата бактериологична ферментационна среда се използва като субстрат за определяне

на специфичната активност на ензима на RAEV (доставян като търговски продукт от фирмата RAEV Corp.) Реакционната смес съдържа ЮМт субстрат, 1 mg ензим на RAEV, 5% глицерол, в 0.16М КН₂ РО₄, в общ обем 50 ml. Сместа се инкубира при 37°С. Взимат се аликвотни проби от по 5 ml през следните интервали от време: 0,1,

3, 5,10,20 и 30 минути, разреждат се с 35 ml 0.010М КН₂ РО₄ рН3.5 и се замразяват при -70°С преди да се подложат на високоефективен течен хроматографски анализ при описаните по-горе условия.

Активността на ензима на RAEV към колориметричния субстрат от адипоил-Раминобензоена киселина се определя при използване на 5тМ субстрат, 8.25 mg ензим на RAEV, 10% глицерол в 0.065 КН₂ Р0₄ рН7.0, в общ обем 50 ml в продължение на 30 минути при 37°С. Реакцията се извършва в чашка за микротитруване. Прибавят се 50 ml разтвор на 1М NaNO₂ в 0.25М оцетна киселина, за да се прекъсне реакцията и реакционната смес се оставя 3 минути при стайна температура. Поставят се 100 ml от разредена с вода в съотношение 1/100 10 mg/ml 4-амино-5-хидрокси-2,7нафталендисулфонова киселина, мононатриева сол-хидрат в 5М NaHCO₃. Появата на оцветяване се отчита незабавно при 515 nm, като се използва EL 312 Bio-kinetics Plate Reader (BioTek Instrments).

ПРИМЕР 14

Високоефективен течен хроматографски анализ на реакционните продукти на ензима на RAEV

Всички ензими на RAEV (търговски продукти на RAEV Corp.) се изследват при използване на субстрат от адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, чийто течен хроматографски анализ е проведен на система Waters със захранваща с разтворители система 625, детектор навълни с променлива дължина490Е, настроен на 220 nm и 254 nm, система за данни 825 Maxima и колона Novo-C18 като стационарна фаза. Подвижната фаза (при скорост на потока 1 ml/min) се състои от: за 5 минути - изократна (непроменящ се) смес от 2% метанол/98% 0.010М КН₂РО₄, pH 7.0; и 15 минути - 2 до 40% линеен градиент на метанол/О.ОЮМ КН₂РО₄, pH 3.5. За определяне на времето на задържане на реакционния продукт е използван 7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. За количествено определяне на реакционния продукт е използвана стандартна крива на стандартен 7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина при 254 nm.

ПРИМЕР 15

13С-ЯМР анализи на ферментационния продукт адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина

13С-ядреномагнитният резонансен (широка ивица на освободения протон) спектър се получава при 75.4 MHz (7.1Т) на IBM-AF-350 спектрофотометър във версия Fourier Transform. Пробите съдържат 50 mg адипоил-7 аминодезацетоксицефалоспоринова киселина от ферментационната бактериална среда в 0.5 ml D20 (99.8% D, Aldrich) или 0.5 ml DMSO-d₆ (99.0% D, Aldrich) в 5 mm тръбички при 350°K. Данните от ЯМР потвърждават, че продуктът е така нареченият адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.

ПРИМЕР 16

Оценка на алтернативния адипоилацилазен ензим

В допълнение на изследванията на ензима на RRAEV отцепването на адипоиловата странична верига от адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина (и от други адипоилови съединения) се демонстрира с ензими, получени от различни микробиологични източници. В едно начално изследване щамовете на Pseudomonas sp. SE-83 и SE-495 (депозирани от Fermentation Research Institute под добавени номера съответно FERM ВР-817 и FERM ВР-818) и щамът Pseudomonas SY-77-1 (депозиран от Northern Regional Research Laboratory под добавен номер NNRL В-8070) се култивират в продължение наа 72 часа в среда, съдържаща HyCase SF, 2.0% (тегло/обем); мононатриев глутамат, 0.5% (тегло/обем); екстракт от дрожди, 0.5% (тегло/обем); умокрено брашно, 0.2% (тегло/обем); памуково масло. 0.5% (тегло/ обем); иглутарова киселина0.1% (тегло/обем).

Клетките се събират чрез центрофугиране и промиване с 50 тМ фосфатен буфер, pH 8.0, след което се ресуспендират в буфер и външните им мембрани се правят пропускливи чрез добавка на малко количество хлороформ. Смесват се равни количества от суспензията от клетки и адипоил-пара-нитроанилин (ad-PNA) и се инкубират при 30°С в продължение на 2 до 18 часа. След инкубацията сместа се подкислява чрез добавка на 10% (обемни) оцетна киселина. Освободеният р нитроанилин се доказва по колориметричен начин въз основа на неговото превръщане в диазосъединение под действието на доставените под формата на китове реагенти на Sigma Chemical Company за анализ на гама-глутамил-

трансфераза (Sigma продукт номер 545-А). Относителната активност на трите щама е съответно 100%, 85.5%, и 48% съответно за SE-495, SE-83 и SY-77-1. При използване на аналогични ензими на описаните при анализа на ензима на RAEV, се определя и активността на SE-83 и на SE-495 върху адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. Получаването на бета-лактамаза при използването на SY-77-1 пречи на определянето на деацилиращата активност на този щам върху адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.

По аналогичен начин се демонстрира получаването на адипоил-ацилаза и за двагъбични щама (Alternaria sp. МА-133, АТСС No. 20491: Aspergillus sp.MA-13, АТСС No. 20491 ;виж U.S. 4,141,790 на Meiji Seika Kaisha Ltd.) и за три допълнителни бактериални щама (Brevibacterium. АТСС No. 14, 649 Achromobacterium. АТСС No. 14,648 и Flavobacterium. АТСС No. 14,650), описани като производители на цефалоспорин С ацилаза в U.S. 3,239,394 на Merck & Co., Inc.

ЛИСТИНГ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ (i) ЗАЯВИТЕЛ: Conder, Michael J.

McAda, Phyllis и

Rambosek, John (II) НАИМЕНОВАНИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: HOB БИОЛОГИЧЕН МЕТОД ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА 7-АМИНОДЕЗАЦЕТОКСИЦЕфАЛОСПОРИНОВА КИСЕЛИНА (iii) БРОЙ НА ИДЕНТИФИЦИРАНИТЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИ: 12 (iv) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ:

(A) АДРЕС: Merck & Co., Inc.

(B) УЛИЦА: 126 Е. Lincoln Avenue (C) ГРАД: Rahway (D) LIJAT: NewYersey (E) ДЪРЖАВА. USA (F) КОД: 07065 (ν) КОМПЮТЪРНА СИСТЕМА:

(A) Магнитна записваща среда: Гъвкав диск (B) Къмпютър: IBM PC съвместим (C) Операционна система: PC-DOS/MS-DOS (D) Програма: Pajentln Release#1.0, Version #1.25 (vi) ДАННИ ЗА ПАТЕНТНАТА ЗАЯВКА:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА. US 07/757,879 (B) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 11 СЕПТЕМВРИ 1991 (C) КЛАСИФИКАЦИЯ (viii) ИНФОРМАЦИЯ, ОТНАСЯЩА СЕ ЗА ПАТЕНТНИЯ ПОСРЕДНИК (A) ИМЕ: Speer, Raymond Μ.

(B) РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 26.810 (C) СПИСЪЧЕН НОМЕР:(07/757,879] 18532 (ix) ТЕЛЕКОМУНИКАЦИОННА ИНФОРМАЦИЯ:

(A) ТЕЛЕФОН: (908) 594-4481 (B) ТЕЛЕФАКС: (908) 594-4720 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА seq id ν ι (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 14 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА seq id ν ι

TCTAGACACC ATGC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА seq id n 2

0) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 16 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА seq id ν 2

GTQAGAGTTG ATGGAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА seq ID N 3 (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 16 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА ^SEQ ID N з

TCTAGACACT ATGQAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА seq id ν 4 (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 16 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА I seq id ν 4

TCTAGACACC ATGGAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА seq id Ν 5 (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (B) ТИП: Аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (xi) ОПИСАНИЕ НА seq id ν 5

Ser Asn SerGly Ala Vai Ala Pro Gly Lys ThrAlaAsn Gly Asn Ala

Leu Leu Leu Gin Asn Pro (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА seq ID N 6 (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (B) ТИП: Аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (xi) ОПИСАНИЕ НА seq id n 6

Ser Asn Ser Trp Ala Vai Ala Pro Gly LysThr AlaAsn GlyAsnAla Ф 1 5 10 15

Leu Leu Leu Gin Asn Pro (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА _{SEQ ID N 7} (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (B) ТИП: Аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП. пептид (xi) ОПИСАНИЕ НА seq id n 7

Ser Asn Asn Trp Ala Vai Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro 15 10 15 lie Leu Ala Gly Asp Pro (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА I SEQ ID N 8 (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 34 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА seq id n 8

CGAGAGGATC AGTGAGAGTC CATGGACACG ACGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N 9 (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 47 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА SEQ id N 9

АТСТСТТТТС ТААТАССТТС ACCATGGGTTG AGATTGTACG TGATCCC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА _{SEQ ID N 10} (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 33 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА I seq id ν io

CGCGGATCCC GGCA TCAACG GCTTCGGTCG TAT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ id N 11 (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 34 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна

МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА I seq id ν п λ

CGVGGATCCG GGCACGCGCA TGGACATGCC AGTC ® (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ id ν 12 (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 26 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА I seq id ν 12

CAGTAAACGC AACCATGGTT GTCCAG

Claims (7)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1.

   биологичен аминодезацетоксицефалоспоринова киселина (7-ADCA), характеризиращ се с това, че се състои от следните етапи:

   - култивиране в хранителна среда, годна да осигури растежа, на щам на

   Penicillium chrysogenum. който произвежда изопеницилин N, и добавяне към тази среда на адипатна хранителна среда, съдържаща адипинова киселина или една или повече нейни соли и естери, които могат да бъдат асимилирани и използвани от посочения щам на Penicillium chrysogenum за получаване на адипоил-6аминопеницилинова киселина (адипоил-6-АРА), при което цитираната адипоилгбаминопеницилинова киселина се получава:

   като въпросният щам на Penicillium chrysogenum се трансформира от Д НК, кодираща активността на експандазния ензим, способен да приеме посочената адипоил-6-аминопеницилинова киселина като субстрат, при което като резултат на ензимната експресия адипоил-6-аминопеницилиновата киселина, получена от този щам, впоследствие също разширява пръстена си in situ до получаването на адипоил-

   7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина (адипоил-7-ADCA);

   - взаимодействие на получената 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина с адипоилацилаза, при което адипоиловата странична верига се отцепва и се получава 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина (7-ADCA), и следващо изолиране на полученото съединение.
2. 2. Биологичен метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че адипатната хранителна среда е динатриев адипат.
3. 3. Биологичен метод съгласно претенция 1. характеризираш се с това, че Днк^ кодираща активността на експандазния ензим се получава от Streptomyces clavuliaerus ATCC 27064.
4. 4. Метод съгласно претенция 1 .характеризиращ се с това, че адипоилацилазата е получена от вида Pseudomonas
5. 5. Рекомбинантен ДНК експресионен вектор, характеризиращ се с това, че плазмидът му pPenFTSO може да бъде интегриран в хромозомната ДНК на рекомбинантния шам на Penicillium chrysogenum. означен с РС100. АТСС 74182 състоящ се главно от ДНК. кодираща активността на експандазния ензим, получен от Streptomyces clavuligerus АТСС 27064. и промотор. който стимулира експресията на тази кодираща експандазната активност ДНК. съдържаща главно промотор на изопеницилин N синтетазния ген на Penicillium chrysogenum.
6. 6. Гостоприемна клетка на Penicillium chrysogenum, означен с PC 100. АТСС 74182. характеризираща се с това, че е трансформирана с рекомбинантен експресионен вектор на ДНК. че плазмидът PenFTSO е интегриран в хромозомната ДНК на тази гостоприемна клетка и че се състои главно от ДНК. кодираща активността на експандазния ензим, получен от Streptomyces clavuligerus АТСС 27064. и промотор. който стимулира експресията на тази кодираща експандазната активност ДНК. състоящ се главно от промотор на изопеницилин N синтетазния ген на РепюШшт^Ьгу^едепит.
7. 7. Метод, характеризиращ се с това че съдържа етап на култивиране при подходящи за генна експресия условия на рекомбинантна гостоприемникова клетка на Penicillium chrysogenum. означенас PC 100. АТСС 74182, при което рекомбинантната гостоприемна клетка съдържа рекомбинантен Д НК експресионен вектор, плазмид pPenFTSO. интегриран в хромозомната ДНК на гостоприемниковата клетка и състоящ се главно от ДНК. кодираща активността на експандазния ензим, получен от Streptomyces clavuligerus АТСС 27064, и промотор, който стимулира експресията на тази кодираща експандазната активност ДНК, състоящ се главно от промотор на изопеницилин N синтетазния ген на Penicillium chrysogenum.