RO115886B1

RO115886B1 - Bioprocedeu pentru prepararea acidului 7-aminodezacetoxicefalosporanic

Info

Publication number: RO115886B1
Application number: RO94-00380A
Authority: RO
Inventors: J Michael Conder; Lorilee Crawford; C Phyllis Mcada; A John Rambosek
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1991-09-11
Filing date: 1992-09-11
Publication date: 2000-07-28
Also published as: BG62177B1; CN1066488C; SK282387B6; JPH07501931A; US5318896A; DE69227494D1; NO940848D0; EP0843013A2; SK28894A3; IL103076A; EP0532341B1; AU2354292A; DE69227494T2; HU9400715D0; ATE173017T1; KR940702544A; DK0532341T3; CN1332247A; AU657787B2; CZ53294A3

Abstract

Inventia se refera la un bioprocedeu pentru prepararea acidului 7-aminodezacetoxicefalosporanic (7-ADCA), care cuprinde transformarea unei tulpini de Penicillium chrysogenum, capabile sa produca izopenicilina N, cu o gena care codifica expandaz enzima, din Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, pentru a se obtine o tulpina de Penicillium chrysogenum recombinata, urmata de mentinerea intr-un mediu de cultura a tulpinii recombinante de Penicillium chrysogenum mentionate, in care se adauga rezerve nutritive de adipat reprezentate de acidul adipic sau de una sau mai multe dintre sarurile si esterii sai, care au capacitatea de a fi asimilati si utilizati de catre tulpina de Penicillium chrysogenum, pentru a produce acid adipoil-6-amino-penicilanic (adipoil-6-APA), si in final, supunerea in situ a acidului adipoil-6-amino-penicilanic (adipoil-6-APA) unei extinderi a ciclului in prezenta tulpinii de Penicillium crysogenum recombinante, pentru a forma acidul adipoil-7-amino-dezacetoxicefalos poranic (adipo il-7- ADCA) si apoi punerea adipoil-7-ADCA in contact cu enzima adipoil acilaza derivata, de preferinta de la o specie de Pseudomonas, apoi indepartarea moleculei de adipoil si formarea acidului 7-amino-dezacetoxicefalosporanic (7-ADCA), care se izoleaza.

Description

Invenția se referă la un bioprocedeu pentru prepararea acidului 7-aminodezacetoxi-cefalosporanic (7-ADCA), utilizat în prepararea prin sinteză a antibioticelor cefalosporinice comerciale.

Se cunoaște un număr semnificativ de antibiotice cefalosporinice, iar acești agenți terapeutici sunt acum la a patra generație. Marea varietate de catene găsite în cefalosporinele comerciale și importanța lor economică semnificativă a făcut să crească necesitatea pentru găsirea unor metode mai economice și eficiente pentru prepararea intermediarilor cheie care permit sinteza rapidă a variatelor cefalosporine. Unul din acești intermediari cheie este acidul 7-amino-dezacetoxicefalosporanic (7ADCA), care poate fi reprezentat prin următoarea formulă generală:

COOH

De obicei, 7-ADCA se produce de la penicilina G și necesită patru sau cinci etape chimice pentru a extinde ciclul de 5 membri al penicilinei, la ciclul de 6 membri care caracterizează cefalosporinele.

Ca orice sinteză chimică totală, acest procedeu are dezavantaje serioase. Printre acestea sunt necesitățile unui procedeu complex cu numeroase etape, reactivi costisitori, cantități importante de produși secundari care rezultă din etapele de tratare a efluentului și purificarea unei cantități sporite de materie primă înaintea începerii tratamentului chimic. Ca urmare, s-a acționat în vederea cercetării unui procedeu microbiologic sau fermentativ care ar putea realiza extinderea enzimatică a ciclului și desprinderea catenei laterale pentru furnizarea de 7-ADCA pe o bază mai economică decât procedeul chimic folosit de obicei.

Până în prezent, cercetarea unui astfel de bioprocedeu pentru fabricarea la scară industrială a 7-ADCA s-a dovedit a fi superficială. De exemplu, în timp ce a fost posibil să se prepare acid-6-aminopenicilanic (6-APA) prin fermentație directă, și/sau prin tratamentul enzimatic al penicilinei G, inițierea numai a extinderii ciclului necesară pentru a da 7-ADCA s-a considerat a fi inadecvată, enzimele de la Cephalosporium sau Streptomyces, enzime care realizează expansiunea ciclului pe căile metabolice normale ale acestor microorganisme, neacceptând ca substrat 6-APA. Aceste enzime, cunoscute în domeniu sub denumirea generică de DAOCS sau expandaz-enzimă, sunt definite ca enzime care catalizează extinderea structurilor ciclului penam găsit în moleculele de tipul penicilinei la cicluri cef-3-em de tipul celor întâlnite în cefalosporine. în continuare, la aceste enzime se va face referire ca “expandaz-enzimă”.

Un substrat pe care operează expandaz-enzima este penicilina N, pe care extinderea ciclului dă deacetoxicefalosporina C (DADC). Aici, este necesar numai să se desprindă catena (D)-a-aminoadipoil pentru a da 7-ADCA, dar această catenă este prevăzută cu rezistență la clivaj enzimatic, dând doar randamente inacceptabil de mici.

Cantwell et al., în Curr Genet” (1990) 17: 213-221, au propus un bioprocedeu pentru prepararea 7-ADCA prin extinderea ciclului penicilinei V, urmată de hidroliza enzimatică a deacetoxicefalosporinei V rezultate pentru a forma 7-ADCA. Această propunere se bazează pe disponibilitatea genei expandază [cefE] a unei peniciline N donate de la S. Clavuligerus: Kovacavic et al., “J. Bacteriol.” (1989) 171:

RO 115886 Bl

754-760; și US 5070020. Totuși, deși expandaza operează asupra penicilinei N, substratul său natural, dar nu și asupra penicilinei V, propunerea necesită inginerie genetică pentru a produce o genă expandază modificată, care poate extinde ciclul penicilinei V. Modificarea necesară nu a fost realizată de către Cantwel et al., totuși, 50 ei reușind numai transformarea Penicillium chrysogenum cu gena cefE de la Streptomyces clavuligerus și obținerea unui nivel scăzut de expresie al enzimei DAOCS (expandază).

Expandaz-enzima a fost bine studiată în domeniu, atât în ce privește activitatea sa, cât și secvența genetică. De exemplu, în Wolfe US 4510246 și 4536476 au 55 fost izolate separat enzimele ciclază, epimerază și de extindere a ciclului dintr-un extract de celule de organisme procariote producătoare de beta-lactamă, incluzând Streptomyces clavuligerus, pentru a furniza reactivi enzimatici stabili. Publicația EP-A-0366354 descrie o expandaz-enzimă izolată și purificată de la S. Clavuligerus, care este caracterizată inclusiv printr-un rest terminal și compoziția de aminoacizi și 6o se afirmă că are o greutate moleculară de aproximativ 34600 daltoni. Aceasta este în contrast față de greutatea moleculară de 29000 ce pare a fi pentru aceeași enzimă în US 4536476, EP-A-0 233715 descrie izolarea și configurația endonucleazei de restricție a expandaz-enzimei obținută de la S. Clavuligerus, transformarea și expresia într-o gazdă a numitei enzime și demonstrează extinderea ciclului 65 substratului penicilină N folosind numita enzimă. Brevetul US 5070020 descrie secvența DNA care codifică expandaz-enzima obținută de la S. clavuligerus și transformarea unei tulpini de P. chrysogenum cu un vector de expresie care conține numita secvență DNA, prin care se obține expresia expandaz-enzimei. Deși se sugerează că această enzimă este folositoare pentru extinderea substratelor, altele decât penicilina 7 o

N, până în prezent nu există demonstrația unei astfel de extinderi.

Lucrarea descrisă mai sus este îndreptată asupra expandaz-enzimei derivată de la S. clavuligerus. Aceeași enzimă, sau cel puțin una care are aceeași activitate de extindere a ciclului este, de asemenea, exprimată de către tulpinile eucariote Cephalosporium acremonium (cunoscută, de asemenea, ca Acremonium 75 chrysogenum). Totuși, în astfel de tulpini, activitatea expandazică este exprimată printr-o genă bifuncțională (cefEF), care exprimă, de asemenea, activitate DACS (hidrolază) a cărei funcție naturală este de a converti acidul dezacetoxicefalosporanic (DAOC), produs al expandaz-enzimei, la deacetilcefalosporină C (DAC). Rezultatul acestei expresii este o singură enzimă, dar bifuncțională, cu activitate expandază/ 80 hidrolază. în timp ce au existat eforturi pentru a separa activitățile acestor două produse genetice, acest lucru nu s-a reușit pentru nici una dintre ele. De exemplu, EP-A-O 281391 descrie izolarea și identificarea secvenței DNA a genei DAOCS/DACS obținută de la C. acremonium ATCC 11550, împreună cu secvența de aminoacizi care corespund enzimei. S-a transformat un Penicillium și s-au exprimat 8 5 enzimele, însă,cu toate acestea, conversia așteptată a penicilinelor G și V la cefalosporinele corespunzătoare nu s-a demonstrat niciodată. în plus, în ciuda unei sugestii că tehnicile de inginerie genetică asigură mijloace eficace pentru a separa informația genetică care codifică DAOCS de DACS și exprimarea separată a lor, până în prezent nu se menționează demonstrarea unei astfel de separări. 90

Enzima DAOCS/DACS (expandază/hidrolază) de la C. acremonium a fost, de asemenea, bine studiată în domeniu cu privire atât la activitatea și caracteristicile

RO 115886 Bl sale, cât și la secvența genetică. De exemplu, în cererile US 4178210; 4248966 și 4307192, diferite materii prime de tipul penicilinei s-au tratat cu extract liber de celule de la C. acremonium care epimerizează și extind ciclul pentru a da un produs antibiotic cefalosporinic. Wu-Kuang Yeh în brevetul US 4753881 descrie enzima C. acremonium în termenii punctului său izoelectric, greutății moleculare, resturilor aminoacide, raportului activităților hidrolazei față de expandază și fragmentelor peptidice.

Stadiul tehnicii discutat mai sus tratează numai transformarea unei tulpini P.chrysogenum cu gena care exprimă expandaz-enzimă și obținerea expresiei acestei gene, și anume exprimarea enzimei numai pentru extinderea ciclului penicilinei N, nu și pentru penicilinele G și V. Chiar în acest caz, penicilina N are o catenă în poziția a 7-a care nu poate fi desprinsă enzimatic pentru a rezulta 7-ADCA, ca în metoda din invenția de față. Invenția de față se bazează pe descoperirea surprinzătoare că o catenă adipoil poate fi adăugată eficient printr-o tulpină P. chrysogenum, astfel că expandaz-enzima exprimată in situ poate folosi eficient acest compus drept substrat pentru extinderea ciclului la adipoil-7-ADCA și acel adipoil poate fi apoi reluat eficient printr-o altă enzimă pentru a da 7-ADCA.

De exemplu, producerea acidului 6-adipoil penicilanic este cunoscută în domeniu; vezi, Ballio A. et al., “Nature (196D) 185: 97-99. Extinderea enzimatică a acidului 6-adipoilpenicilanic, dar numai in vitro, este, de asemenea, cunoscută în domeniu; vezi Baldwin et al., “Tetrahedron” (1987), 43: 3009-3014 și EP-A-0 268343. Si clivajul enzimatic al catenelor de adipoil este cunoscut în domeniu; vezi, de exemplu, Matsuda etal., “J.Bact.” (1987) 169: 5815-5820.

Catena de adipoil are următoarea structură:

C00H-(CH₂)₄-C0în timp ce o catenă cu care este îndeaproape înrudită este cea a glutarilului având următoarea structură:

C00H-(CH₂)₃-C0-.

Clivajul enzimatic al catenelor glutarilului este cunoscut în domeniu; vezi, de exemplu, Shibuya et al., “Agric.Biol.Chem.” (1981) 45: 1561-1567 ; Matsuda și Komatsu, “J.Bact.” (1985) 163; 1222-1228; Matsuda et al., J.Bact.” (1987) 169; 5815-5820; JP 53-086084 (1978-Banyu Pharmaceutical Co.Ltd.) și

JP 52-128293 (1977-Banxu Pharmaceutical Co.Ltd.).

De asemenea, EP-A-O 453048 descrie metode pentru îmbunătățirea activității de clivare a adipoilului a glutarilacilazei produsă de către Pseudomonas SY-77-1. Prin substituirea diferiților aminoacizi la diferite localizări din subunitatea alfa, s-a observat o rată a clivajului adipoilului de trei până la cinci ori mai ridicată (de la adipoil serină). Ar fi de notat că, deși EP-A-0 453048 demonstrează aparent o acilază cu activitate îmbunătățită împotriva catenelor adipoil, ea nu descrie nici o cale (fie chimică,fie printrun bioprocedeu analog în vreun fel celui descris în descrierea de față] în care ar putea fi generată o adipoil-cefalosporină.

RO 115886 Bl

140

Acolo unde este prezentă o catenă(D)-a/fa-aminoadipoil, este cunoscută îndepărtarea, pentru început, pe cale enzimatică, a grupului amino și scurtarea catenei cu o (D)-aminoacid-oxidază, păstrarea unei catene glutaril (GL-7), cu îndepărtarea catenei glutaril printr-o a doua enzimă (glutaril acilază). Un astfel de clivaj în două etape este descris în Matsuda US 3960662; EP-A-O 275901; JP 61-218057 (1988-Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.); WO 90/12110 (1990, Wong, Biopure Corp.) și Isogai et al., Bio/Technology (1991) 9: 188-191.

în prezenta cerere de brevet se face referire la cererea de brevet US 18572IA, care descrie un bioprocedeu pentru producerea 7-ACA, care se bazează pe expresia activității expandaz-enzimei într-un transformat P.chrysogenum obținut în același mod ca si prin bioprocedeul pentru producerea 7-ADCA descris aici. Cu toate acestea, în bioprocedeul de producere a 7-ACA sunt necesare transformări suplimentare pentru expresia activității enzimelor suplimentare, în scopul realizării, pe căi metabolice recombinante diferite, a produselor finale distincte, care nu sunt sugerate în descrierea de față.

Prezenta invenție se referă la un bioprocedeu pentru prepararea acidului 7aminodezacetoxicefalosporanic (7-ADCA).

Problema pe care o rezolvă invenția este un bioprocedeu pentru prepararea acidului 7-aminodezacetoxicefalosporanic.

Bioprocedeul conform invenției cuprinde următoarele etape:

- transformarea unei tulpini de Penicillium chrysogenum capabile să producă izopenicilina N, cu o genă care codifică expandaz enzima, din Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, pentru a se obține o tulpină de Penicillium chrysogenum recombinantă,

- menținerea într-un mediu de cultură a tulpinii recombinante de Penicillium chrysogenum menționate, în care se adaugă rezerve nutritive de adipat care cuprind acid adipic sau una sau mai multe dintre sărurile sale și esteri care au capacitatea de a fi asimilați și utilizați de către tulpina Penicillium chrysogenum, pentru a produce acid adipoil-6-amino-penicilanic (adipoil-6-ΑΡΑ),

- supunerea, în continuare, in situ, a acidului adipoil-6-amino-penicilanic (adipoil-

6- APA), unei extinderi a ciclului în prezența tulpinii de Penicillium chrysogenum recombinante, pentru a forma acidul adipoil-7-amino-dezacetoxicefalosporanic (adipoil-

7- ADCA) și apoi punerea adipoil-7-ADCA în contact cu enzima adipoil acilază derivată, de preferință, de la o specie de Pseudomonas, apoi îndepărtarea moleculei de adipoil și formarea acidului 7-amino-dezacetoxicefalosporanic (7-ADCA) care se izolează.

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

- obținerea unui derivat de penicilină printr-un procedeu de fermentație;

- creșterea randamentului.

izolat.

în scopul ușurării înțelegerii bioprocedeului prezentei invenții și a însușirii referințelor din stadiul tehnicii, mai sus discutate, în continuare se menționează o reprezentare a diferitelor stadii din căile metabolice care conduc la penicilina G și cefalosporina C, produși intermediari, și enzimele care realizează transformările implicate.

145

150

155

160

165

170

175

180

RO 115886 Bl

Acid L-alfa-aminoadipic + L-cisteină + L-valma

ACV sintetaza

LLD+ACV

IZOPENICILINĂ N (IPN)

IPN AMIOOLAZA ACIL CoA: B-APA ACILTRANSFERZA

FENILACETIL CoA

PENICILINA G

IZOPENICILINAN (IPN)

COOH

RO 115886 Bl

IPN EPIMERAZA

230

FENILACETIL CaA

PENICILINA N

235

PENICILINA IM EXP AN OAZĂ

COOH

ACIO DEZACETOXICEFALOSPORANIC (QAOC)

240 □AOC 3 -HIDROXILAZA

ACID DEZACETOXICEFALOSPORADIC

CEFALOSPORIIMA C

255

260

Conform prezentei invenții, a fost posibil să se realizeze un bioprocedeu eficient 2 65 în care un compus de penicilină (care are o catenă laterală adipoil) se produce printrun nou procedeu de fermentație la titruri ridicate, numitul compus de penicilină fiind un substrat acceptabil pentru sistemul expandaz-enzimă care se produce in situ de către același microorganism care produce compusul de penicilină, care a fost transformat pentru a exprima numitul sistem expandaz-enzimă. 270

Expandaz-enzima acționează apoi pentru extinderea ciclului compusului de penicilină la un compus de cafalosporină cu randamente ridicate. Important în a doua etapă critică, catena laterală a compusului de penicilină, acum compus de

RO 115886 Bl cefalosporină, este îndepărtată prin alt sistem enzimatic cu randamente surprinzător de ridicate. Rezultatul neșteptat al acestui bioprocedeu unic care cuprinde prezenta invenție este producerea de 7-ADCA cu randamente surprinzător de ridicate.

Așa cum se utilizează aici, următorii termeni au semnificațiile următoare: “Adipoil-6-APA”înseamnă acid 2S-[(2a, 5a, 6p)]-3,3-dimetil-7-oxo-6-((hexan-1,6dioil)amino]-4-tia-1-aza-biciclo-[3,2,O]heptan-2-carboxilic; și “Adipoil-7-ADCA” înseamnă acid 7-[(hexan-1,6-dioil)amino]-3-metil-8-oxo-5-tia-1azabiciclo[4,2,O]oct-2-enă-2-carboxilic.

Prezenta invenție se referă, în particular, la bioprocedeul nou pentru prepararea acidului 7-aminodezacetoxi cefalosporanic (7-ADCA] expus mai sus, în care rezerva nutritivă de adipat este adipat disodic, în care DNA-ul care codifică activitatea expandaz-enzimei este derivat de la Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 și în care adipoil acilaza este derivată de la specii de Pseudomonas.

Invenția de față se referă, în continuare, la un vector de expresie DNA recombinant, care cuprinde DNA-ul care codifică activitatea expandaz-enzimei derivate de la Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, și un promotor care conduce expresia DNA-ului, care codifică numita activitate de extindere, cuprinzând plasmida pPenFTSO, descrisă în continuare.

Prezenta invenție se referă, în continuare, la o celulă gazdă de Penicillium chrysogenum transformată cu un vector de expresie DNA recombinant, care cuprinde DNA-ul care codifică activitatea expandaz-enzimei derivată de la Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 și un promotor care conduce expresia numitei activități de extindere codificată prin DNA-ul care cuprinde promotorul genei IPNS de la Penicillium chrysogenum.

în particular, invenția de față se referă la o celulă gazdă de Penicillium chrysogenum transformate cu un vector de expresie DNA recombinant, cuprinzând plasmida pPenFTSO descrisă în continuare.

Invenția prezentă se referă, în continuare, la o metodă care cuprinde etapa cultivării unei celule gazdă Penicillium chrysogenum recombinante în condiții corespunzătoare pentru expresia genei, în care numita celulă gazdă recombinantă cuprinde un vector de expresie DNA recombinant care conține DNA-ul care codifică activitatea expandaz-enzimei derivată de la Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 și un promotor care conduce expresia DNA-ului care codifică activitatea expandazei cuprinzând promotorul genei IPNS de la Penicillium chrysogenum. în special,invenția de față se referă la o metodă de cultură a unei celule gazdă recombinante de Penicillium chrysogenum în în condiții corespunzătoare pentru expresia genei, în care numita celulă gazdă recombinantă cuprinde un vector de expresie DNA recombinant care cuprinde plasmida pPenFTSO care va fi descrisă în continuare.

Principalul aspect al invenției de față este un bioprocedeu pentru prepararea acidului 7-aminodezacetoxicefalosporanic (7-ADCA), intermediar cheie pentru prepararea cefalosporinelor comerciale sintetice, care poate fi reprezentat prin următoarea formulă structurală:

COOH

RO 115886 Bl

ΙΡΛ1 ERIMERAZA

230

FENILACETIL CoA <D>

PENICILINA N

235

PENICILINA N expanoazA

COOH

ACID DEZACETOXICEFALOSPORANIC (DAOC)

240

DAOC 3'-HIDROXILAZA

245

250 (D)

COOH

ACID DEZACETOXICEFALOSPORADIC (DAC)

255 □AC ACETILTRANSFERAZĂ

CEFALOSPORINÂ C

260

Conform prezentei invenții, a fost posibil să se realizeze un bioprocedeu eficient 2 65 în care un compus de penicilină (care are o catenă laterală adipoil] se produce printrun nou procedeu de fermentație la titruri ridicate, numitul compus de penicilină fiind un substrat acceptabil pentru sistemul expandaz-enzimă care se produce in situ de către același microorganism care produce compusul de penicilină, care a fost transformat pentru a exprima numitul sistem expandaz-enzimă. 270

Așa cum se utilizează aici, următorii termeni au semnificațiile următoare:

“Adipoil-6-APA”înseamnă acid 2S-[(2a, 5a, 6pj]-3,3-dimetil-7-oxo-6-[(hexan-1,6dioil]amino]-4-tia-1-aza-biciclo-[3,2,O]heptan-2-carboxilic; și “Adipoil-7-ADCA” înseamnă acid 7-[(hexan-1,6-dioil)amino]-3-metil-8-oxo-5-tia-1azabiciclo[4,2,O]oct-2-enă-2-carboxilic.

Prezenta invenție se referă, în particular, la bioprocedeul nou pentru prepararea acidului 7-aminodezacetoxi cefalosporanic (7-ADCA) expus mai sus, în care rezerva nutritivă de adipat este adipat disodic, în care DNA-ul care codifică activitatea expandaz-enzimei este derivat de la Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 și în care adipoil acilaza este derivată de la specii de Pseudomonas.

COOH

RO 115886 Bl

320 în plus, fața de nucleul cefalosporinic, trăsăturile distincte ale 7-ADCA sunt grupările 7-amino și 3-metil. Gruparea 7-amino este o grupare care poate fi convertită la orice număr de catene laterale derivate și astfel formează baza pentru sinteza diferitelor cefalosporine comerciale. Gruparea 3-metil în general va exista, dar nu întotdeauna, ca în cazul cefalexinei, trebuind să fie convertită întotdeauna la altă catenă laterală în vederea sintetizării unei cefalosporine comerciale.

Produsul 7-ADCA al bioprocedeului din prezenta invenție poate fi diferit de cefalosporina C, alt intermediar cefalosporanic cheie care poate fi reprezentat prin

325

330

Pentru acest intermediar, catena 3-acetiloximetil poate fi acceptabilă pentru cefalosporine comerciale. Cu toate acestea, catena 7-(D)-a-aminoadipoil nu este acceptabilă pentru derivare sintetică și trebuie să fie clivat pentru a da gruparea 7amino acceptabilă. Din nefericire, catena 7-(D]-a-aminoadipoil prezintă întotdeuna dificultăți la îndepărtare atât prin mijloace chimice, cât și biochimice.

Așa cum se folosesc în descrierea de față, următorii termeni au semnificațiile:

7-ADCA Acid 7-aminodezacetoxicefalosporanic

6-APA Acid 6-aminopenicilanic

DAOC Acid dezacetoxicefalosporanic

DAOCS DAOC sintetaza

DAC Deacetilcefalosporina C

DACS DAC sintetaza

IPNS Izopenicilină N sintetaza

Tris tr/s[(hidroximetil)]aminometan

EDTA Acid etilendiaminotetraacetic

DEPC Dietilpirocarbonat

TE Tampon Tris/EDTA

SSC Tampon sare (clorură de sodiu], citrat de sodiu

SDS Dodecilsulfat de sodiu

PEG Polietilenglicol

Cultura de Penicillium chrysogenum

Etapa de menținere într-un mediu de cultură capabil să susțină creșterea unei tulpini recombinante Penicillium chrysogenum care produce izopenicilină N are loc prin adăugarea la numitul mediu de cultură a unei rezerve nutritive adipat, cuprinzând acid adipic sau sărurile și esterii săi. Rezerva nutritivă adipat se poate adăuga mediului de cultură după inoculare cu P. chrysogenum, dar este preferabil ca aceasta să fie deja prezentă în mediul de cultură la momentul inoculării. Acidul adipic sau sărurile și esterii săi sunt aleși astfel încât să fie capabili de asimilare și utilizare de către numita tulpină P. chrysogenum pentru a produce adipoil-6-ΑΡΑ; în care numita tulpină de P. chrysogenum a fost transformată prin DNA-ul care codifică activitatea expandazenzimei, unde, ca urmare a expresiei sale in situ, ciclul numitului adipoil-6-ΑΡΑ este extins pentru a forma adipoil-7-ADCA.

335

340

345

350

355

360

365

RO 115886 Bl

Alte specii ale genului Penicillium, înrudite cu speciile Chrysogenum, sunt producătoare de izopenicilină N. Cu toate acestea, din punct de vedere istoric, au fost dezvoltate cele mai productive tulpini prin tehnici bine cunoscute de îmbunătățire a tulpinii plecând de la speciile Chrysogenum. Din motive practice, invenția prezentă s-a limitat la tulpinile Penicillium chrysogenum, deși aplicabilitatea sa la alte specii este evidentă. Orice tulpină depozitată de Penicillium chrysogenum, sau altă sursă publicată accesibilă pentru o astfel de tulpină este adecvată ca un punct de plecare corespunzător pentru realizarea metodei din prezenta invenție.

Mediul de cultură capabil de susținerea creșterii tulpinii de Penicillium chrysogenum producătoare de izopenicilină N este de tipul cu care o persoană cu pregătire obișnuită din domeniu se poate familiariza imediat. De exemplu, cultivarea ar putea fi realizată prin metoda fermentației aerobice submerse, iar mediul folosit sar putea alege dintre numeroase medii accesibile potrivite. De obicei, mediile utilizează surse de carbon, precum sucroză, glucoză și amidon; surse de azot, precum făina de soia și tărâțe, ulei de semințe de bumbac, făina de arahide și diferiți aminoacizi, amestecuri ale acestora și peptone. Producția necesită randamente crescute și izolare facilă și, de aceea, mediile de cultură preferate pentru astfel de situații pot fi melasele ca surse de carbon și făina de soia și amino acizii ca surse de azot.

Săruri nutritive anorganice adăugate mediului de cultură sunt uzuale și includ sărurile capabile să suplimenteze următoarele componente ionice.sodiu, potasiu, amoniu, calciu, fosfat, sulfat, clorură, bromură, azotat, carbonat, feric, feros, magneziu, mangan etc. Microelementele sunt de obicei esențiale pentru creșterea, dezvoltarea și metabolismul Penicillium chrysogenum și se pot adăuga direct mediului de cultură împreună cu ceilalți ingredienți.

Tulpinile Penicillium chrysogenum se pot cultiva în instalații de volum mic, cum ar fi baloanele cu agitare de 1 I, atunci când se dorește producerea de cantități mici de 7-ADCA. Când se dorește obținerea de cantități mai mari de adipoil-7-ADCA, se vor folosi fermentatoare prevăzute cu posibilități de fermentație aerobă submersă.

Pentru realizarea preparării pe scară largă de adipoil-7-ADCA, sporii tulpinii Penicilliun chrysogenum se păstrează pe un agar înclinat. Sporii de pe agar se folosesc pentru inocularea unui mediu vegetativ de volum mic. Mediul de cultură se incubează pentru a produce o cultură a microorganismului puternică, proaspătă și cu creștere activă. Această creștere vegetativă este folosită apoi ca inocul pentru mediul de fermentație la scară mare. în anumite situații, poate fi de dorit să se includă mediul vagetativ suplimentar ca inocul pentru mediul de fermentare. Un astfel de al doilea mediu vegetativ se folosește, de obicei, atunci când volumul mediului de fermentație este semnificativ mai mare decât primul mediu vegetativ. în acest mod, sporii microorganismului sunt cultivați la început într-un volum mic de mediu vegetativ, în vederea obținerii inoculului pentru un mediu vegetativ de volum mai mare. Volumul mai mare de mediu vegetativ alimentează apoi o concentrație suficientă a microorganismului pentru a iniția intrarea rapidă în fermentație în fermentatorul de scară mare. Mediul vegetativ poate avea aceeași compoziție ca mediul de fermentație sau poate conține ingrediente suplimentare pentru a grăbi creșterea și dezvoltarea microorganismului la scară mică.

RO 115886 Bl

Tulpinile Penicillium chrysogenum folosite în procedeul prezentei invenții sunt 410 cultivate cel mai eficient la temperaturi între aproximativ 20 și 30°C, dar randamentele optime se vor obține atunci când temperatura este între aproximativ 22 și 28°C, de preferință, aproximativ 25°C.

Producția maximă de adipoil-7-ADCA este întâlnită când tulpina Penicillium chrysogenum se cultivă în fermentatoare mari pentru o periodă între aproximativ 10 415 și 30 zile, de preferință 15 până la 25 zile. Cu toate acestea, când se cultivă în instalații de scară mică, cum ar fi balcoanele cu agitare de 250 ml, creșterea microorganismului este mai rapidă și se produce adipoil-7-ADCA într-un timp mai scurt, de exemplu, 4 la 15 zile, frecvent 5 la 7 zile.

Dacă în fermentatoarele de scară mare pH-ul final atinge valorile de opt sau 42o mai mult, randamentul adipoil-7-ADCA poate fi efectuat în mod nedorit. în asemenea situații este de dorit să se urmărească pH-ul mediului de cultură în timpul fermentației. Dacă pH-ul va tinde să atingă astfel de niveluri înaintea timpului pentru producția maximă de adipoil-7-ADCA, pH-ul poate fi ajustat prin adăugarea unui acid corespunzător sau un agent de tamponare a mediului de fermentație. 42 5

Producția adipoil-7-ADCA poate fi urmărită prin probe de testare cromatografică a mediului de fermentație.

Cea mai eficientă creștere și mărire a producției de adipoil-7-ADCA se obține prin culturile aerobe submerse atunci când se trece prin mediu aer steril. Volumul de aer trecut prin mediul de cultură este, de obicei, de cel puțin aproximativ 0,2 volume 4 30 aer/minut/volum de mediu de cultură. Cu toate acestea, o rată crescută a trecerii aerului poate avea, adeseori, un efect benefic asupra producției de adipoil-7-ADCA.

Tulpina de Penicillium chrysogenum va produce, pe lângă adipoil-7-ADCA, mulți produși secundari și metaboliți. Deoarece câțiva dintre aceștia sunt acizi instabili, este de dorit ca la îndepărtarea adipoil-7-ADCA din mediul de fermentație să se mențină 435 întregul mediu de fermentație la un pH acid pentru un timp scurt, în vederea distrugerii unora dintre impuritățile produse. Adipoil-7-ADCA ca produs de fermentație este reluat din mediul de fermentație astfel tratat și, opțional, poate fi separat de alți componenți ai mediului de fermentație prin cromatografie pe o rășină schimbătoare de ioni și poate fi purificat în continuare prin cromatografie, dacă este necesar, 440 înaintea etapei următoare de clivaj enzimatic al catenei laterale de adipoil. Este posibil, de asemenea, să se realizeze o astfel de separare prin cromatografie de schimb ionic după clivajul catenei laterale. Unul dintre produsele secundare importante care prezintă probleme la separare este adipoil-6-ΑΡΑ și este posibil să se degradeze chimic sau enzimatic pentru a face separarea mai ușoară. Inițial, mediul de fermen- 445 tație filtrat se supune unei proceduri de purificare preliminară, care poate include o extracție inițială cu un solvent organic nemiscibil, precum n-butanol sau acetat de amil, pentru îndepărtarea impurităților. Mediul extras poate fi, în continuare, purificat în mod preliminar prin cromatografie pe cărbune activ.

Adăugarea rezervei nutritive adipat 4 50

De preferință, în momentul stabilizării culturii de Penicillium chrysogenum, așa cum s-a descris mai sus, înaintea inoculării se adaugă o rezervă nutritivă adipat la mediul de cultură pentru fermentație. Opțional, rezerva nutritivă de adipat se poate adăuga la un oarecare timp după inoculare, de exemplu, la una, două și/sau trei zile după inoculare.

455

RO 115886 Bl

Rezerva nutritivă adipat este definită ca acid adipic sau una sau mai multe săruri sau esteri ai acidului adipic care sunt capabili să fie asimilați și utilizați de către tulpina Penicillium chrysogenum care a fost cultivată în vederea producerii de adipoil-6-ΑΡΑ. Acidul adipic, sărurile sau esterii pot fi utilizați singuri sau în oricare combinație. Este preferată sarea disodică, deși sărurile de potasiu amestecate cu sodiu ar putea fi, de asemenea, adecvate. Ar putea fi folosit esterul de metil, iar esterul de etil este insolubil în apă. Sarea de acid adipic sau esterul trebuie să fie dintre cei care pot fi asimilați și utilizați de către tulpina Penicillium chrysogenum pentru a produce adipoil-

6- APA. De exemplu, acidul adipic însuși poate fi potrivit, chiar dacă este insolubil în apă, dacă în condițiile specifice de pH se formează o sare asimilabilă.

Expandaz-enzime adecvate

Tulpina de Penicillium chrysogenum care a fost cultivată și asigurată cu o rezervă nutritivă adipat, așa cum s-a descris mai sus, astfel încât ea să producă adipoil-6-ΑΡΑ, poate fi, de asemenea, transformată prin DNA care codifică activitatea expandaz-enzimei prin care, ca un rezultat al expresiei sale, numitul adipoil-6-ΑΡΑ in situ este extins în ciclu pentru formarea de adipoil-7-ADCA.

Adipoil-6-APA se produce intracelular de către Penicillium chrysogenum cultivată în prezență de rezervă nutritivă adipat. în acest sediment intracelular, adică pe o bază in situ, Penicillium chrysogenum transformat exprimă, de asemenea, DNA-ul care codifică activitatea expandaz-enzimei, după care enzima acționează asupra adipoil-6-ΑΡΑ ca un substrat și produce extinderea ciclului său pentru a forma adipoil-

7- ADCA.

Noul bioprocedeu al prezentei invenții include în scopul său transformarea unei tulpini de Penicillium chrysogenum de tipul descris mai sus cu orice DNA care codifică activitatea expandaz-enzimei după care, ca un rezltat al expresiei sale, adipoil-6-ΑΡΑ își extinde in situ ciclul pentru a forma adipoil-7-ADCA. Astfel, DNA-ul cu care este transformat Penicillium chrysogenum trebuie să exprime o enzimă care are nu numai activitate de enzimă- expandază așa cum este înțeles în stadiul tehnicii, adică abilitatea să extindă ciclul izopenicilinei N la DAOC, dar și abilitatea să extindă cilul adipoil-B-APA la adipoil-7-ADCA. Totuși, se preconizează, pe baza similarității de catenă, că orice expandaz-enzimă va fi operabilă în noul bioprocedeu al prezentei invenții.

Deja s-a remarcatîn secțiunea care descrie stadiul tehnicii, că enzima expandază derivată de la Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 a fost secvențată în întregime și caracterizată prin cartografierea endonucleazei de restricție. Cu toate acestea, ceea ce pare a fi aceeași enzimă, derivată de la S. clavuligerus NRRL 3585, s-a raportat a avea o greutate moleculară diferită, însă ea nu a fost secvențată.

Aceste expandaz-enzime identificate deja în stadiul tehnicii sunt folositoare în noul bioprocedeu al prezentei invenții. Alte expandaz-enzime încă neidentificate, derivate de la diferite tulpini de S. clavuligerus sau chiar de la microorganisme din genuri diferite, pot fi, de asemenea, potrivite pentru realizarea noului bioprocedeu al prezentei invenții. Procedurile pentru identificarea acestor tulpini și genuri de microorganisme folositoare și pentru izolarea presupuselor expandaz-enzime și stabilirea dacă ele sunt potrivite pentru folosire în metoda prezentei invenții, sunt simple pentru un specialist în domeniu. Trierea (screening) extractelor de celule-libere ale noilor genuri și tulpini candidate ale microorganismelor folositoare poate fi făcută în manieră sigură și reproductibilă prin adăugarea numitelor extracte la substratul adipoil-6-ΑΡΑ,

RO 115886 Bl

505 în prezență de co-factori DAOCS cunoscuți, care includ ioni feroși (Fe²⁺), ascorbat, alfacetoglutarat și adenozintrifosfat (ATP). Substratul adipoil-6-ΑΡΑ poate fi preparat în cantități suficiente prin adăugarea de rezervă nutritivă adipat la o tulpină Penicillium chrysogenum netransformată într-un mod analog celui descris în detaliu în continuare. Enzimă expandază dorită este prezentă dacă se formează adipoil-7-ADCA, a cărui prezență poate fi detectată prin cromatografie.

Este posibil, de asemenea, prin folosirea tehnicilor de recombinare cunoscute, să se creeze sonde DNA, bazate pe secvența expandazei de la S. clavuligerus și

C.acremonium, de exemplu, pentru a selecta conținuturile DNA ale unui microorganism candidat probabil să producă o expandază adecvată pentru folosirea în metoda prezentei invenții.

Surse potențiale de expandaz-enzime

Enzimele expandază, așa cum s-a expus deja, sunt enzime care catalizează extinderea ciclului penam (găsit în moleculele de tipul penicilinei) la cicluri cef-3-em (precum cele întâlnite în cefalosporine). Orice organism care produce metaboliți care conțin un ciclu cefem este, prin urmare, o sursă potențială pentru un DNA care codifică o expandază. Exemple de astfel de organisme sunt enumerate mai jos, dar această listă este doar pentru exemplificare și nu va fi considerată exclustivă:

Fungi

Cephalosporium acremonium

Cephalosporium sp. Emericellopsis Paecilomyces Scopulariospora Diheterospora Spiroidium Anoxiopsis

Actinomicete

Streptomyces clavuligerus

S. lipmanii

S. wadayamensis

S. todorominensis

S. filipinensis cephamycini

S. heteromorphus

S. panayensis

S. griseus

S. cattleya

Nocardia lactamdurans

Alte bacterii

Flavobacterium sp. Alcaligenes denitrificans Mycoplana bullata Providencia rettgeri Lysobacter lactamgenus

Expandazele de la organismele listate mai sus sunt candidați nu numai pentru continurea investigării, unele dintre ele fiind chiar adecvate pentru procedeul nou al

510

515

520

525

530

535

540

RO 115886 Bl prezentei invenții. De exemplu, folosirea acelor enzime care posedă atât activitate de expandaze, cât și activitate hidrolazică, precum cea de la C. acremonium, poate rezulta din sinteza adipoil-7-ADCA hidroxilat, adică, DAC cu o catenă laterală adipoil.

Izolarea fragmentelor DNA care codifică activitatea expandazică

O dată detectată prezența unei expandaz-enzime dorite urmând maniera de lucru descrisă mai sus, procedurile pentru izolarea DNA-ului care codifică activitatea enzimei -expandază sunt, de asemenea, simple pentru cunoscătorii în domeniu. Sonde DNA bazate pe secvențe cunoscute și secvențe parțiale ale genelor care codifică expandaz-enzime se pot construi pentru hibridizări în vederea izolării DNA-ul care codifică enzima dorită. Construcția unor astfel de sonde se bazează pe cunoașterea secvenței de aminoacizi și a secvenței de baze nucleotidice care codifică expandazenzima, precum și codonii, de preferință a microorganismului implicat. 0 descriere detaliată a procedurilor specifice de acest tip aplicate pentru DNA-ul genomic de la Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 se prezintă în continuare.

Izolarea DNA-ului care codifică activitatea expandaz-enzimei este realizată folosind procedurile de restricție și ligare binecunoscute în tehnicile DNA-ului recombinant. Este necesar să existe o hartă a endonucleazelor de restricție a genomului microorganismului implicat, astfel încât fragmentul de restricție potrivit să poată fi produs și izolat. Configurațiile de restricție pentru S.clavuligerus sunt deja accesibile; astfel, pentru primul sunt folosite enzimele de restricție Bam HI și Sal I, electroforeză asigurând fragmentele dorite de mărimi de 1,8 până la 2,2 kb.

Transformarea tulpinii Penicillium chrysogenum □ dată fragmentele DNA care codifică activitatea expandazică obținute, ele pot fi introduse [ligate] într-o plasmidă sau alt vector de expresie de-a lungul fragmentelor DNA cuprinzând promotori, secvența activatoare a translației, marker de rezistență, secvență regulatoare, uneori cosmide și orice alte secvențe DNA care să permită inițierea transformării, conducerea expresiei produsului genei și facilitarea izolării transformanților. Vectorul de expresie care a fost astfel construit este folosit apoi pentru a realiza transformarea tulpinii Penicillium chrysogenum și expresia intracelulară a activității expandaz-enzimei. Tehnicile folosite pentru realizarea transformării și expresiei sunt binecunoscute în domeniu și o descriere detaliată a unor astfel de proceduri specifice se menționează în continuare.

Așa cum s-a descris deja mai sus, tulpina transformată de Penicillium chrysogenum exprimă intracelular activitatea expandaz-enzimei, care apoi operează in situ asupra substratului adipoil-6-ΑΡΑ pentru extinderea ciclului său la adipoil-7ADCA.

Recombinatul nou

Transformantul specific care exprimă activitatea genei expandazei, care este o realizare preferată a invenției de față, este nou față de construcțiile similare din stadiul tehnicii, precum cea din Cantwell et al., (1990) “Curent Genetics” 17, 213221. în ambele construcții se utilizează mutageneza in vitro pentru a lega promotorul la gena expandazei. în construcția lui Cantwell, se introduce prin manipulare genetică un sit Nedl la ATG-ul genei expandazei care este ligat la situl Xbal la terminația 3' a promotorului IPNS printr-un lincher Xbal/Ndel. în construcția prezentei invenții se creează un sit Ncol la ATG-ul genei expandazei și se leagă la situl Ncol la terminația 3' a lincherul PNS.

595

RO 115886 Bl

Aceasta creează următoarele secvențe împrejurul joncțiunilor promotor-cjenă în aceste construcții:

	Xbal	Ncol
Promotor IPNS	5'	TCTAGACACCATGG	3' Secv.	ID nr. 1
Expandază Strep.	5'	GTGAGAGTTGATGGAC	3' Secv.	ID nr. 2
Cantwell	5'	TCTAGACACȚATGGAC	3' Secv.	ID nr. 3
Invenția prezentă	5'	TCTAGACACCATGGAC	3' Secv.	ID nr. 4

600

Construcția lui Cantwell înlocuiește o C cu o T, în timp ce în construcția prezentei invenții C se menține; astfel, secvența promotorului IPNS imediat adiacentă la codonul de start ATG împerecheat exact la cel care se găsește în gena IPNS întâlnită în mod natural. Este posibil ca promotorul din stadiul anterior al tehnicii, deși diferă printr-o singură bază nucleotidică, să poată conduce la o eficiență mai mică a translării și, ca urmare, la un nivel mai mic al expresiei genei expandazei.

Alte diferențe sunt în regiunile promotorului sau genei incluse în construcții. Construcția Cantwell conține regiunea 5'BamHI până la Xbal a promotorului IPNS, în timp ce vectorul invenției de față conține regiunea 5'Ncol până la Ncol 3' (Diez et al., 1990, “J.Biol.Chem.” 265, 16358-16365). Astfel, rezultă în plus aproximativ 250 bp la terminația 5' a promotorului IPNS față de construcția Cantwell. Cu toate acestea, această regiune este în cadrul deschis al genei sintetazei de la ACV în amontele genei IPNS.

Construcția Cantwell conține, de asemenea, gena Streptomyces de la ATG la stul BamHI 3' al genei, în timp ce vectorul prezentei invenții conține ATG la situl Sall 3' al genei (Kovacevic et al., 1989, “J.Bacteriol.” 171, 754-760). Rezultă astfel aproximativ 1000 bp în plus la secvența 3' terminală față de construcția Cantwell. Construcția prezentei invenții mai conține regiunea din amonte a genei expandazei până la situl BamHI 5' al ATG; totuși, ea este separată de cadrul de citire al genei expandazei prin promotorul IPNS.

Altă diferență a construcției invenției de față, comparativ cu cea descrisă în stadiul tehnicii, se referă la marcherul selectabil care este folosit. Folosirea unui promotor IPNS de la Penicilliurrr. gena fleomicinei fuzionată în construcția invenției de față tinde să selecteze pentru integrarea de copii multiple sau la loci ce permit nivel ridicat de expresie și, astfel, se poate obține un procent mai ridicat al transformanților ce exprimă gena expandazei la nivel ridicat.

Un nou transformant de tipul descris mai sus este un Penicillium chrysogenum identificat ca PC100. Trăsăturile sale taxonomice tipice includ producerea de colonii cu mare extindere, de culoare albastru-verzui până la verde,netede, cu aspect catifelat și cu puncte galbene, galbenul difuzând în agar; conidii ramificate în întregime netede; conidii eliptice până la sferice în lungime de 3-4 mm. Condițiile de cultură acceptabile pentru P. chrysogenum utilizează un mediu solid care cuprinde lactoză, monohidrat 1,5% (g/v); 0,5% (v/v) suc de porumb; 0,5% (g/v) peptonă; 0,4% (g/v) NaCI; 0,05%(g/v) MgS0₄-7H₂0; 0,6% (g/v) KH₂P0₄; 0,0005% (g/v) FeCL^I/O; 0,0002% (g/v) CuS0₄-5H₂0; 3,0% (g/v) agar; într-un litru de apă distilată pH 4,8. Tulpina P. chrysogenum descrisă și desemnată PC100 s-a depozitat în Colecția Americană de Tipuri de Culturi (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, sub numărul de acces ATCC 74182 (data de depozit: recepționat 21 aug. 1992 și confirmarea viabilității 27 aug. 1992).

605

610

615

620

625

630

0

RO 115886 Bl

Clivajul catenei laterale de adipoil

Următoarea etapă în noul bioprocedeu al prezentei invenții este clivarea lanțului lateral de adipoil de la adipoil-7-ADCA , care necesită tratamentul produsului din etapa anterioară cu un sistem enzimatic adipoil-acilază. Așa cum s-a menționat deja mai sus, o realizare semnificativă a prezentei invenții este capacitatea realizării tuturor etapelor care conduc la formarea de adipoil-7-ADCA într-o singură cultură de fermentație. Această realizare asigură îmbunătățirea excepțională a eficienței, nemaifiind nevoie să se izoleze și să se purifice parțial produsele intermediare de la o etapă la alta a procedeului. în această ultimă etapă, totuși, sistemul enzimatic adipoil-acilază nu este prezent, el nefiind generat in situ în cultura de fermentație inițială.

Dacă noul bioprocedeu al prezentei invenții s-a realizat într-o singură șarjă, este necesar să se izoleze și să se purifice parțial produsul primei etape și procedurile preliminare pentru a-l face pe acesta așa cum a fost descris mai sus.

Cu toate acestea, procedeul prezentei invenții poate fi realizat pe orice cale care să aducă eficient în contact adipoil-acilaza cu adipoil-7-ADCA, astfel încât conversia enzimatică a compusului la 7-ADCA să poată avea loc. Aceasta este definiția termenului contactare în sensul său cel mai larg din context. Este posibil să se folosească o celulă fără mediu cu adipoil-7-ADCA brut și să se trateze în maniera întro singură șarjă cu mediu adipoil-acilază brut. Această abordare realizează aceleași eficiențe, însă nu necesită nici o purificare substanțială a reactanților inițiali.

Desigur, sunt posibile și modificări. De exemplu, reactanții pot fi purificați atât cât se dorește înainte de a-i aduce în contact unul cu altul. De asemenea, ar fi posibil să se realizeze procedeul în mod continuu mai degrabă decât într-o singură etapă. Contactarea reactanților însăși poate fi modificată în diferite moduri, în conformitate cu tehnologia procedeului prezentat. Astfel, poate fi folosită o enzimă imobilizată, de exemplu, printr-o coloană care conține adipoil-acilază trecând adipoil-7-ADCA. Enzima imobilizată poate, de asemenea, să fie adăugată la soluția de adipoil-7-ADCA ca suspensie. Astfel de sisteme de enzime imobilizate oferă avantajele recuperării enzimei și reutilizarea multiplă. Alt exemplu de astfel de proces tehnologic este cel în legătură cu reactoarele cu membrană. Metoda preferată de contactare a reactanților este pe calea coloanei cu enzimă imobilizată.

Enzime adipoil-acilază folositoare în etapa de clivare

Există numeroase enzime cu specificitate cunoscută față de catenele adipoil. Rezultatele obținute cu o adipoil-acilază comercial accesibilă de la RAEV Corp, sunt detaliate în exemplele de mai jos. în literatură au fost raportate alte șapte enzime care îndepărtează catenele adipoil de la moleculele de tipul cefalosporinei. Șase din aceste șapte enzime sunt de la specii de Pseudomonas, iar a șaptea este de la o specie de Bacillus. Există anumite asemănări între anumite tipuri de enzime de la Pseudomonas, dar toate șapte diferă prin câteva proprietăți fizico-biologice. Câteva dintre caracteristicile lor sunt prezentate mai jos:

RO 115886 Bl

685

ENZIMA	REFERINȚA	GREUTATEA MOLEC.APROX.
[Pseudomonas șl Bacillus]		(Subunitate)
P.SY-77-1	Shibuya, et al,	Aparent aceeași ca GK 16
(Toyo Jozo)	(1981)	de mai jos
P.GK16	Matsuda,	16 OOO
(Asahi)	Kamatsu (1985)	54 000
P.SE83(acil)	Matsuda, et al,	38 000
(Asahi)	(1987)	19 OOO
P.SE83 (acill)	Matsuda, et al,	25 400
(Asahi)	(1987)	58 200
P. diminuta N176	Aramori, et al.	58 OOO
(Fujisawa)	(1991a)^x	26 OOO
P. diminuta V22	Aramori, et al.	Q
(Fujisawa)	(1991a)^x	9
Bacillus laterosporus J1	Aramori, et al.	70 000
	(1991 a)”¹	(monomerică)
Pseudomonas sp. (RAEV Corp]		16 OOO 54 000

* Aramori etal., J.Fermet.Bioeng.” (1991) 72: 232-243 ** Aramori etal., J.Bacteriol.” (1991) 173: 7848-7855.

690

695

700

Toate enzimele adipoil-acilază de mai sus pot fi folosite în bioprocedeul nou al prezentei invenții. Alte adipoil-acilaze folositoare în metoda prezentei invenții pot fi descoperite imediat prin testarea enzimei candidate împotriva adipoil-7-ADCA, substratul actual asupra căruia ea trebuie să acționeze. în metoda din prezenta invenție este folositoare o metodă sigură și reproductibilă pentru determinarea enzimei candidat, care să dea rezultate pozitive. Substratul poate fi preparat în mod direct din reacția anhidridei adipice cu 7-ADCA, folosind o modificare a procedurii raportată de către Szewczuk și Wellman-Bednawska în “Clin.Chim.Acta” (1978), 84, 19-26. Anhidrida adipică poate fi preparată conform metodei lui Albertson și Lundmark descrisă în “J.Macromol.Sci.Chem.” (1990) A27, 397-412. 7-ADCA este accesibilă din mai multe surse comerciale, incluzând E.R. Squibb & Sons, Ltd., NJ și Interchem Corp., NJ.

Dacă este de dorit să se realizeze o cercetare brută a enzimelor candidate folosind o metodă colorimetrică rapidă, se poate substitui substratul adipoil-7-ADCA cu un substrat colorimetric, precum adipoil-PABA (acid para-aminobenzoic) sau adipoilPNA (para-nitroanilină). Clivajul catenei laterale generează specii colorate a căror prezență și concentrație este determinată imediat prin folosirea unui colorimetru. Pentru informații mai detaliate privind acestea, precum și alte metode colorimetrice corespunzătoare, vezi Marelli, L.P. (1968) “J.Pharm.Sci.” 57: 2172-2173; Szasz, G. (1969) “Clin.Chem.” 15: 124-136; Szewczuk, A. etal., (1980) “Anal.Biochem.” 103, 166-169 și Reyes.F. Et al., (1989),”J.Pharma.Pharmacol.” 41: 136-137.

705

710

715

720

RO 115886 Bl

S-a făcut o comparație între secvențele aminoacide N-terminale ale enzimei RAEV cu subunitățile mari ale enzimelor acill și GK16 menționate în tabelul de mai sus. Rezultatele comparației sunt prezentate mai jos (unde parantezele indică mai puțin decât concluziile finale):

RAEV-Secv. ID nr.5

S N(S)(G]AVAPGKTANGNAL(L)LQN(P)

GK16-Secv. ID nr.6

S N S W AVAPGKTANGNAL L LQN P acill-Secv. ID nr.7

S N N W AVAPGRTATGRPI L AGD P

Din secvențele prezentate, apare că toate aceste trei peptide sunt înrudite. Cu toate acestea, o proteină care are o secvență N-terminală similară cu cele prezentate mai sus nu va trebui să posede activitate adipoil-acilazică, cum este cazul cu penicilin G acilaza produsă de către o tulpină Arthrobacter. Pe de altă parte, există adipoilacilaze folositoare în metoda prezentei invenții care nu prezintă homologie semnificativă față de secvența N-terminală de mai sus. De exemplu, enzima Asahi acil și acilaza J1 B.laterosporus Fujisawa menționate în tabelul de mai sus, care au arătat că au aceeași activitate adipoil-7-ADCA acilazică, nu au nici o homologie de secvență cu alte enzime menționate mai sus. Ca urmare, întinderea prezentei invenții față de adipoil-acilazele folosite în a doua etapă a noului bioprocedeu este determinată prin faptul dacă o enzimă candidată este sau nu aptă să cliveze catena adipoil-7-ADCA îndepărtând adipoilul lateral, o problemă care poate fi determinată rapid și sigur, așa cum s-a arătat mai sus.

Sunt posibile și alte abordări pentru găsirea adipoil-acilazelor potrivite. De exemplu, EP -A-O 453048 descrie metode pentru îmbunătățirea activității de clivare a adipoilului a glutaril-acilazei produsă prin Pseudomonas SY-77-1. Prin substituirea diferiților aminoacizi la anumite localizări din subunitatea alfa s-a observat o rată de trei până la cinci ori mai ridicată a clivării adipoilului (de la adipoil-serină). Astfel de enzime îmbunătățite ar putea, de asemenea, să fie potrivite pentru utilizare în prezenta invenție. Ar fi de remarcat că, deși EP-A-0 453048 aparent demonstrează o acilaza cu activitate crescută față de moleculele de adipoil, ea nu descrie în nici un mod (fie chimic,fie printr-un bioprocedeu în orice fel analog celui descris în invenția de față), în care în primul rând poate fi generată o adipoil-cefalosporină.

în continuare se prezintă 16 exemple de realizare a invenției:

Exemplul 1. Condițiile de cultură pentru Penicillium chrysogen

Tulpina de Penicillium chrysogenum folosită în aceste proceduri se menține pe plăci care conțin mediu LCSB compus din lactiză monohidrată 1,5%(g/v]; sos de porumb 0,5% (g/v); peptonă 0,5% (g/v); NaCI 0,4 (g/v); MgS0₄-7H₂0 0,05% (g/v); KH₂P0₄ 0,06% (g/v); FeCI₃-6H₂0 0,0005% (g/v); CuS0₄-5H₂0 0,0002 (g/v); agar 3,0% (g/v); înre-un litru de apă distilată, pH 4,8. După 12 zile de reiau și se adaugă la 12 ml apă sterilizată într-un tub cu partea superioară filetată care conține perle de sticlă. După macerarea culturii sub barbotare, suspensia se folosește pentru inocularea baloanelor cu orez. Baloanele cu orez conțin 25 g orez convertit Uncie Ben's pentru fiecare balon de 250 ml. Orezul natural, cu bob lung, se spală de trei ori până la patru volume de apă distilată timp de 7 min. Se amestecă la fiecare 30 sec, și apoi se usucă până când conținutul de apă în orez rămâne de aproximativ 25%.

RO 115886 Bl

După 12 zile la 25°C și umiditate 65%, sporii se spală de pe orez cu 50 ml apă sterilă. Suspensia de spori se folosește pentru a inocula culturi lichide și, de asemenea, pentru a asigura liofilizarea culturii pentru o păstrare la 4°C. Sporii se adaugă la un volum egal de 5% lapte degresat și se liofilizează în fiole sterile.

Un al doilea stadiu de fermentație a tulpinii în baloane de pe agitator se folosește pentru producerea de peniciline sau pentru producerea de miceliu ca sursă de DNA sau RNA. Stadiul de inocul se inițiază prin adăugarea de 1x10⁸ spori în baloane de 500 ml care conțin 50 ml de mediu compus din 3% (g/v) glucoza; 1,0% (g/v) farmamediu; 3,0 % (g/v) sirop de porumb; 0,2% (g/v) sulfat de amoniu; 0,5 %(g/v) CaC0₃; 0,05% (g/v) fosfat monopotasic anhidru; 1,0 % (g/v) lactoză; 1 % (g/v) drojdie uscată primară; într-un litru de apă distilată. Se incubează la 25°C și umiditate relativă de 65% pe un agitator roativ cu un diametru de amplititudine 70 mm, la 220 rot/min. După 48 h de incubare se inițiază stadiul de protecție prin transferarea a 2 ml de inocul vegetativ în baloane de 500 ml la 35 ml de mediu având următoarea compoziție: 0,05 % (g/v) KH₂P0₄; o,o5 % (g/v) K₂S0₄; 1,0 % (g/v) (HN₄)₂S0₄: 12% (g/v) lactoză; 2,75% (g/v) farmamediu; 1,0 % (g/v) CaCO₃ (precipitat); 1,0 % (v/v) ulei de grâu, într-un litru de apă distilată, pH 6,6. După autoclavare, dar înaintea inoculării, se adaugă 25% adipat de sodiu steril pH 6,6 pentru a obține o concetrație finală de adipat de sodiu de 2,5 %. Incubarea care urmează inoculării se continuă în aceleași condiții ca și stadiul de inocul, timp de 5-7 zile.

Când este nevoie de miceliu pentru a genera protoplaști sau ca sursă de DNA, tulpina este crescută în baloane de 250 ml conținând 50 ml mediu complet (CM), compus din; 50 ml din 20 x săruri Clutterbuck (120 g Na₂N0₃, 10,4 Kcl; 10,4 g MgS0₄-H₂0; 30,4 g KH₂P0₄) 2,0 ml microelemente Vogel, (0,3 M acid citric, 0,2 M ZnS0₄,25 mM Fe(NH₄)₂(S0₄)₂-6H₂0, 10 mM CuS0₄, 3mM MnS0₄, 8mMacid boric, 2mM Na₂Mo0₄-2H₂0), 6 g triptonă, 5 g extract de drojdie, 10 g glucoza într-un litru de apă distilată.Se incubează la 25°C pe un agitator rotativ la 220 rot/min.

Exemplul 2. Izolarea DNA-ului genomic și RNA-ului total de Penicillium

Miceliul vegetativ crescut de la o cultură de 48 h, preparat cum s-a descris mai sus, se colectează prin filtrare prin tifon, se îngheață în azot lichid și se liofilizează peste noapte. Miceliul uscat este mojarat cu nisip într-un mojar cu pistil, este măcinat și se resuspendăîn 25 ml din 10 mM LiCI, EDTA 50 mM, Tris 10 mM, p/-/8,0 și SDS 4%. După încălzirea suspensiei la 5O...55°C, într-o baie de apă la 60°C se extrage amestecul mai întâi cu Tris 1M [pH 8) saturat cu fenol, urmat Tris-saturat cu fenol: cloroform (1:1, v/v) și apoi cu cloroform. Se precipită RNA-ul din fază apoasă prin adăugarea unui volum egal de LiCI 6M cald și, apoi, se lasă amestecul la -20°C timp de 2-3 h. După cetrifugare la 12 000 x g timp de 20 min. La 4°C se diluează supernatantul la 66% (v/v) cu etanol și se răcește la -20°C timp de 15 min, pentru a precipita DNA-ul. După cetrifugare, cum s-a descris mai sus, peleții DNA se usucă și se resuspendă în tampon TE (Tris-HCI 10mM, pH 7,5, EDTA 1mM). Concentrația DNA-ului se estimează prin comparație față de standarde DNA cunoscute, după colorare cu bromură de etidiu electroforeză pe gel de agaroză.

Culturile de Penicillium crysogenum, obținute cum s-a descris mai sus în exemplul 1, sunt crescute timp de 96 h în mediul de fermentație (condițiile de fermentație au fost descrise anterior), la 25°C, pe un agitator rotativ la 22 rot/min. Se colectează miceliul prin filtrare printr-un filtru Whatman sub vid și se spală cu

770

775

780

785

790

795

800

805

810

815

RO 115886 Bl aproximativ 50 ml de apă. Miceliul se desprinde imediat de pe filtru și se resuspendă în 5 ml de tampon de sfărâmare (Tris-HCI 50 mM, pH 8,05% SDS), se îngheață în azot lichid și se liofilizează. După liofilizare peste noapte, se adaugă 5 ml apă care conține 0,1 % DEPC și 5 ml Tris 1M (pH 8) saturat cu fenol.cloroform: alcool izopropilic (50:50.1) și amestecul este lăsat să se dezghețe la 37°C timp de 20 min, cu agitare. Amestecul se centrifughează la 12 000 x g pentru 10 min la 4°C, se îndepărtează stratul apos și se reextrage mai întâi cu Tris 1M (ph 8) saturat cu fenol: cloroform: alcool izoamilic (50:50:1), o a doua oară cu Tris 1M (pH 8) saturat cu fenol și a treia oară cu cloroform. Se combină un volum egal de LiCI 6M cu stratul apos final și soluția se lasă la -20°C pentru minimum 4 h. Se concentrează RNA-ul total prin cetrifugare 12 000 x g, timp de 20 min. La 4°C, peleta se dizolvă în 0,3 ml tampon TE și se determină concentrația RNA-ului spectrofotometrie folosind absorbanța la 260 nm.

Exemplul 3. Condiții de cultură pentru Streptomyces clavuligerum

Tulpina Streptomyces clavuligerum folosită în aceste proceduri este ATCC 27064. Tulpina este menținută pe plăci constând din 4 g extract de drojdie; 10 g extract de malț; 4 g glucoză; 20 g agar; într-un litru de apă distilată, pH 7,2. După 5 zile de creștere la 30°C, se adaugă la plăci 2 ml apă sterilă și cultura crescută este îndepărtată de pe suprafața agarului. Suspensia rezultată se transferă într-un tub steril cu partea superioară filetată, care conține bile de sticlă. După macerarea culturii de creștere prin turbionare, se folosește suspensia pentru a inocula culturi lichide. Suspensia se folosește, de asemenea, pentru păstrarea permanentă a culturii la 70°C, prin adăugarea de glicerol până la un volum final de15%.

Când este nevoie de miceliu, pentru a genera protoplaști necesari transformării unei surse DNA, tulpinile se cresc în baloane de 1 I în 200 ml mediu YEME, compus din 3 g extract de glucoză, 340 g sucroză, 1,02g MgCI₂-6H₂0, 5 g glicerină, 18 g agar, într-un litru de apă distilată. Incubarea se face la 28°C pe un agitator rotativ, la 220 rot/min.

Exemplul 4. Izolarea DNA-ului genomic Streptomyces

Se colectează un inocul vegetativ de la cultură de 48 h, preparată cum s-a descris mai sus, prin centrifugare la 22 x 100 g, timp de 10 min. Celulele sunt resuspendate în 10 ml tampon TE, se adaugă 10 mg lizozim și se incubează amestecul la 30°C timp de 15 min. Se adaugă apoi 1 ml de 20°C SDS, urmată imediat de 10 ml tampon TE (pH 8), saturat cu fenol, și 1,5 ml de NaCI 5M, amestecul apoi este agitat blând pentru 20 min. Se separă fazele la 12 000 x g, pentru 10 min, după care se recuperează stratul apos și se transferă într-o eprubetă curată. în continuare, se adaugă un volum egal de cloroform, continuându-se agitarea blândă pentru încă 10 min. Se separă din nou fazele prin centrifugare la 12 000 x g, timp de 10 min. Se îndepărtează stratul apos și se transferă din nou într-o eprubetă curată. Se adaugă, cu multă grijă, două volume de izopropanol și DNA-ul precipitat se colectează și se redizolvă într-un volum minim de tampon TE. Se adaugă RNA-aza a până la o concentrația finală de 20mg/ml și se incubează soluția timp de o oră la 50°C. Se adaugă apoi proteaza K până la o concentrație finală de 100 mg/ml, împreună cu NaCI 100 mM și 0,4% SDS, apoi amestecul se incubează la 37°C timp de o oră. Se extrage soluția, din nou, cu un volum egal de TE (pH 8) saturat cu fenol, urmată de o altă extracție cu cloroform. DNA-ul din extrasul final se colectează după adăugarea a două

RO 115886 Bl volume de izopropanol și se determină concentrația spectrofotometrică folosind o absorbanță martor de 26nm.

Exemplul 5. Construcția unei bănci de gene și izolarea fragmentului DNA care conține gena expandază de Streptomyces clavuligerus.

DNA-ul genomic de la Streptomyces clavugerus, obținut prin procedura descrisă anterior, se digeră cu enzimele de restricție BamHI și Sall. DNA-ul digerat este supus electroforezei pe un gel de agaroză 0,8% și se eluează fragmentele cu mărimi între 1,8 până Ia2,2 kb, fiind apoi ligate la pUC18 DNA-ul care este digerat anterior cu BamHI și Sall. Diluții ale amestecului de ligare se folosesc pentru transformarea suficientă a celulelor JM09, folosind electroporarea (Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, CA). Prepararea celulelor componente și condițiile pentru electroporare sunt conforme cu recomandările fabricantului. Amestecul transformat se depune pe plăci LB care conțin 100 mg/ml ampicilină și 75 ml de 2% X-Gal. Urmează incubarea peste noapte la 37°C, coloniile recombinante fiind identificate prin pierderea de culoare datorită inactivării acțiunii genei betagalactozidazei vector plasmidă. Coloniile mai puțin colorate se depun pe plăci noi LB care conțin 100 mg/ml ampicilină. După ce sunt lăsate să crescă peste noapte, la 37°C, coloniile se transferă pe nitroceluloză și se hibridizează cu o sondă produsă prin reacție polimerazică în lanț care corespunde secvenței genei expandazei publicate de la Streptomyces clavuligerus de la bazele 52 la 918 (Kovacevic et al., (1989) J. Bacteriol. 171: 754-760; și Ingolia et al., US 5 070 020] Marcarea produsului reacției polimerazei în lanț se realizează prin reacție de extensie a primerului cu (^3aP) dCTP și un Kit de oligomarcare, conform indicațiilor fabricantului (Pharmacia, Piscataway, NewJersey). Reacția de hibridizare se realizează în prezența a 10^{6 CPM}sondă radiomarcată, 30% formamidă, 5 x SSC (NaCI 0,15 M, citrat de sodiu 0,015 M, pH 7), 0,1% SDS. % x Denhardt (ficol 5 g, polivinilpropilidonă 5 g și BSA 5g, pentru 500 ml de 50 x mediu] și 100 mg/ml DNA din mușchi de vițel, la 37°C, peste noapte. Mai mulți transformați au hibridizat strâns la sondă. Se confirmă o colonie care conține un vector purtător al genei expandază prin analize cu enzime de restricție și această plasmidă este desemnată pFTSO-1.

Exemplul 6. Izolarea plasmidei DNA.

Culturi de E.coli conținând plasmida de interes, sunt crescute în 500 ml de bulion LB (20 g/l de bulion bază LB (Gico, Paisley, Scotland]), cu 15 mg/ml tetraciclină pe un agitator rotativ la 220 rot/min. Timp de 12...16 h la 37°C. Celulele sunt compactate prin centrifugare la 4 000 x g, pentru 10 min. la 4°C. Peleta conținând celulele se resuspendă în 18 ml tampon glucoza (glucoză 50 mM, Tris 25 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM) și 2 ml de 40 mg/ml lizozim (Sigma, St. Louis, MO), după amestecare se incubează la temperatura camerei timp de 15 min. Se adaugă 40 ml de soluție proaspăt preparată NaOH 0,2 N, 0,1% SDS, amestecul se învârte ușor plasându-se apoi pe gheață pentru 10 min. Apoi, se adaugă 30 ml de acetat de potasiu 5M, pH 4,8, se amestecă bine, amestecul rezultat fiind plasat pe gheață pentru 10 min. Fragmentele celulare sunt compactate prin centrifugare la 4 000 x g, pentru 10 min. la supernatantul rezultat se filtrează printr-un filtru de tifon. Se adaugă izopropanol (0,6 volume) pentru clarificarea supernatantului până la precipitarea DNA-ului plasmidic și se formează un precipitat în timpul incubării la temparatura camerei pentru 20 min. DNA-ul plasmidic se peletează la 4 000 x g, pentru 20 min. La 4°C, se spală, apoi, cu etanol 70 % și se usucă rapid.

865

870

875

880

885

890

895

900

905

RO 115886 Bl

Peletele se resuspendă în 9 ml tampon TE adăugându-se, apoi, 10 g CsCI și □,387 ml soluție de bromură de etidiu 10 mg/ml. Această soluție se centrifughează la 313 1OO x g, pentru 24 h.Banda plasmidică rezultată în gradientul de clorură de cesiu se vizualizează cu lumină ultravioletă, se izolează apoi, bromură de etidiu se îndepărtează folosind butanol saturat în apă pentru extracție. Clorură de cesiu de la prepararea plasmidei se îndepărtează apoi prin dializă contra tampon TE și, în final, DNA-ul se concentrează folosind PEG (MW 8000 ). Se determină concentrația de DNA spectrofotometric folosind la o absorbanță de 260 nm.

Exemplul 7.Construcția vectorului de transformare pPenFTSO de Penicillium

Se construiște un vector de transformare Penicillum cu o genă de rezistență la fleomicinăca marker de selecție dominant.Aceasta se realizează mai întâi prin izolarea unui fragment de 660 bp, care conțin gena de rezistență la fleomicină (gena fleomicinei legată la o proteină de la Streptoalloteichus hindustanus) și, de asemenea, se cuplează la citocromul de drojdie C1 terminal dintr-un digest Bam Hi/Ng1 II al plasmidei pUT713 (CAYLA Toulouse Cedex France) prin electroforeză și eluție depe gel de agazoză. Fragmentul s-a ligat într-un sit BamHI al vectorului pSELECT^R 1 (Promega Corporation) și se determină orientarea genei prin analiza cu enzime de restricție. Apoi o secvență de 1,5 kb/nco l/Bam HI, care conține regiunea promotoare de genă sintetază/izopenicilină N a Penicillium chrysogenum [IPNS], se izolează (prin electroforeză și eluare din geluri de agaroză) dintr-o digestie Ncol/Bam HI a unei clonegenomice care conține gena IPNS. Fragmentul IPNS-promotor izolat se leagă într-un vector digerat Bam Hl/Nco I. Situl Nco I este la codonul de start ATG al genei de rezistență fleomicină. Acest vector a fost desemnat pUTZ-1.

Fragmentul de 1,645 kb care conține 2gena expandază de Streptomyces clavuligerus se purifică de la un digerat Bam HI și Sal I al lui pFTSO-1 (vector descris anterior) prin eleectroforeză și eluție de p un gel de agaroză 0,8%. Fragmentul izolat este ligat în vectorul pSELECT (Promega Corporation) digerat, de asemenea cu Bam HI și Sal I. S-a denumit acest vector pFTSO-8. Se creează un sit nou Nco I la codonul de start ATG al genei expandazei prin mutageneză direct in situ a pFTSO-8 folosind Sistemul de mutageneză prin realizara după instrucțiunile fabricantului. Se construiește o oligonucleotidă drept complement la secvența de codificare a regiunii DNA a codonului de start ATG după secvența pubicată a genei expandază de la Streptomyces (Kovacevic atal., (1990) Journal of Bacteriology, 171, p.3952-3958). Oligonucleotidă se sintetizează prin cianoetilfosfoamidită (Pharmacie Gene Assembler instrumentation), și oligosecvența este cum urmează:

Secv. Nr.:8

3' CGAGAGGACTCAGTCGAGAGTCCATGGACACGACGG 5'

Mutageneză se confirmă prin analiză cu gene de restricție. Imediat, se izolează fragmentul Ncol de 1,2 kb de la pUTZ-2 care conține regiunea promotoare a genei izopenicilinN sintetazei prelucrată a IPNS de la P.Chrysogenum prin electroforeză în și eluție de pe gel de agazoză de la digerat Nco I al clonei genomice care conține gena IPNS. Regiunea promotorului IPNS este ligat în gectorul pFTSO-8 la noul sit Ncol creat prin mutageneză la codonul de start ATG al genei expandazei, se stabilește prin analize cu enzime de restricție. Această casetă promotor IPNS:genă expandază se îndepărtează apoi ca fragment Hl/Salî în vectorul de transformare pUTZ-2 în BamHI/Sall descris mai sus. Construția finală s-a denumit pPenFTSO.

RO 115886 Bl

Exemplul 8. donarea promotorului Penicillium beta-tubulinei.

Gena beta-tubulinei din Penicillium este donată de la o bancă de gene lamda de Penicillium folosind ca sondă de hibridizare gena Aspergillus niger beta-tubulinei. Secvențierea acestei clone și compararea cu secvența cunoscută de aminoacizi a genei beta-tubulinei de la Aspergillus niger a identificat o regiune de 91% homologie începând cu codonul de inițiere ATG. S-au izolat secvențele care cuprind un promotor funcțional dintre codonul de inițiere și un sit Bam HI la 1,4 kb în amonte.

Construcția vectorului de transformare purtător al promotorului Penicillium beta-tubulinei

Se leagă un fragment de 2,0 kb Xba l/Hind III care conține promotorul Penicillium beta-tubulinei într-un vector pSELECT (Promega Corporation) de asemenea digerat cu Xba l/Hind III. Se creează un nou sit Nco I la codonul de start ATG prin mutageneză direct în sit, folosind sistemul de mutageneză prin alterarea siturilor, in vitro (Promega Corporation). Mutageneză se realizează după instrucțiunile producătorului. Se construiește o oligonucleotidă la regiunea sitului de start ATG, dar care încorporează câteva schimbări la situl creat Nco I și se folosește pentru mutageneză. Oligonucleotidă se sintetizează prin fosforamidită de cianoetil (Pharmacia Gene Assembler instrumentation) și oligosecvența este după cum urmează: Secv. ID nr.9

3' ATCTCTTTTCTAATACCTTCACCATGGGTGAGATTGTACGTGATCCC 5'

Mutageneză se confirmă prin analiză de restricție enzimatică. Imediat se leagă un fragment Bam Hl/Nco I de 1,4 kb care conține promotorul Penicillium betatubulinei la un sit Nco I la ATG-ul genei expandazei în digeratul Bam Hl/Nco I vectorului pFTSO-8 (vector descris anterior în exemplul 7). Acest vector se desemnează btFTSO8. Fragmentul Bam Hl/Nco I de 1,4 kb care conține promotorul beta-tubulinei se leagă, de asemenea, într-un digerat Bam Hl/Nco I al vectorului pUTZ-2 (vector descris anterior în exemplul 7). Această ligare plasează promotorul beta-tubulinei direct în fața genei de rezistență a fleomicinei. Acest vector se desemnează pCI-6. în continuare, un fragment Bam Hl/Hind III de 2,4 kbde la vectorul btFTSO-8 care conține caseta promotorul beta-tubulinei gena expandazei se leagă la un digerat Bam Hl/Hind III al vectorului pCI-6 la randamentul vectorului final de transformare pentru Penicillium în care gena expandazei de la Streptomyces și marcherul de rezistență la fleomicină se suprimă de la promotorul beta-tubulinei. Acest vector se desemnează pTS-2.

Exemplul 9. donarea promotorului Penicillium [GAP]

Gena gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenază (GAP) de la Penicillium este donată de la o bancă genomică lamda de la Penicillium, folosind gena GAP de la Aspergillus niger drept sondă de hibridizare. în continuare, se testează patru pozitivi potențiali cu un produs PCR generat de la primerii pentru regiunea 5' a genei GAP de la Cephalosporium (Kimura.H. etal., “J.Ferm. and Bioeng.”, 71, 145-150). Oligonucleotidele folosite pentru primerii de reacție în lanț a polimerazei (PCR) se sintetizează prin Foforamidita de cianoetil (Pharmacia Gene Assembler instrumentation) și oligosecvențele sunt după cum urmează:

Secv. nr. 10

5' CGCGGATCCCGGCATCAACGGCTTCGGTCGTAT 3'

Secv. nr. 11

5’ CGCGGATCCGGGCACGCGCATGGACATGCCAGTG 3'

955

960

965

970

975

980

985

990

995

RO 115886 Bl

Una dintre cele patru presupuse pozitive hibridizează încrucișat la produsul PCR. Un fragment Bam HI de patru kb de la această clonă genomică se leagă într-un digerat Bam HI al vectorului pSELECT (Promega Corporation] pentru secvențare. Acest vector se desemnează pTS-o. Secvențierea acestui fragment a identificat codonul inițiator ATG prin comparație față de secvența cunoscută a genei GAP de la cefalosporină.

Construcția vectorului de transformare purtător al promotorului GAP de Penicillium

Pentru producerea promotorului GAP de Penicillium cu gena expandazei de Streptomyces se creează un sit nou Nco I la ATG-ul genei GAP de Penicillium prin mutageneze in vitro direct în sit, folosind vectorul pTS-o. Mutageneza se realizează după instrucțiunile producătorului. Se construiește o oligonucleotidă pentru a fi complementară la secvența care codifică regiunea DNA-ului la codonul de start ATG al genei GAP, dar care încorporează schimbările bazei la un sit Nco I creat. Oligonucleotida este sintetizată prin fosforamidită de cianoetil (Pharmacia Gene Assembler instrumentation] și oligosecvența este după cum urmează:

Secv. nr. 12

5’ CAGTAAACGCAACGATGGTTGTCCAG 3'

Mutageneza se confirmăprin analize de restricție enzimatică. Imediat un fragment Nco l/Bam HI de 1,9 kb de la pTS-o care conține promotorul GAP se leagă la digeratul Nco l/Bam HI al vectorului pFTSO-8 (vector descris anterior în exemplul 7) pentru poziționarea promotorului GAP cu gena expandazei de Streptomyces. Acest vector se desemnează pTS-o-1. Alături se leagă un fragment Bam Hl/Hind III de 3 kb de la vectorul pTS-O-1 care conține caseta promotor GAP:expandază la digeratul Bam Hl/Hind III al vectorului pCI-6 (vector descris anterior în exemplul 8] la randamentul final de transformare pentru Penicilliumpnn vectorul pSD-1 în care gena expandazei de Streptomycesse exprimă de la promotorul GAP.

Exemplul 10. Transformarea Penicillium chrysogenum

Se generează protoplaste de ia tulpina Penicillium chrysogenum descrisă mai sus, prin inocularea a 50 ml mediu CM cu 1x10⁷ spori pentru 67h la 25°C pe un agitator rotativ la 220 rpm. Se colectează miceliul prin filtrare pe filtre de tifon, se transferă în baloane de 500 ml și se resuspendă în 25 ml KMP (KCI 0,7 M, manitol 0,8 M și KP04 0,002 M, pH 6,3), care conține 1OO mg Novozinc 234 (Novo Bio Labs, Bagsvaerd, Denmark) și se lasă să incubeze la 3O°C la 1OO rpm. Se separă sferoplastele prin filtrare prin filtre tifon/vată de sticlă și se sedimentează prin centrifugare la 350 x g pentru 10 min.. Sferoplastele sunt spălate apoi de trei ori cu 10 ml tampon KMP și apoi se resuspendă în KMPC (KMP cu CaCI2 50mM), la o concentrație de 5 x 1O⁷ celule/ml și se lasă la temperatura camerei timp de 20 min. Pentru transformarea Penicillium se adaugă 200 ml suspensie de sferoplaste la DNA (5 mg vector DNA în 6,2 ml KMPC cu 5 mg/ml heparină] împreună cu 50 ml de PPC (40% PEG MW 3500, KP04 20 mM, pH 6,3, înainte de utilizare adăugându-se CaCI₂5%) și amestecul de transformare se incubează pe gheață 30 min. Se adaugă 1 ml PPC proaspăt preparat și amestecul se transferă la 50 ml de agar pentru regenerare topit (5O°C) (CM plus manitol 1,3 M și 3% agar). Amestecul de transformare este apoi împărțit în cinci cutii Petri. După regenerare timp de 24h la 25°C, plăcile se acoperă cu OL (1% peptonă în 1% agar) care conține 100 mg/50 ml OL de

RO 115886 Bl fleomicină. Cantitatea de acoperit este egală cu cantitatea agarului de regenerare. Plăcile se incubează la 25°C timp de 7...14 zile și se urmăresc pentru generarea de colonii transformante.

Exemplul 11. Teste HPLC ale produselor de fermentație adipoil-6-ΑΡΑ și adipoil7-ADCA

Se folosește cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC), pentru a cerceta producerea de adipoil-6-ΑΡΑ în tulpina netransformată P. chrysogenum folosită și producerea adipoil-7-ADCA în tulpina transformată P. chrysogenum care s-a folosit. Analizele se realizează pe un sistem Waters cu un sistem de eliberare a solventului 625,un detector de lungimi de undă variabil 490E, reglat la 220 nm și 254 nm, un sistem de date Maxima 825 și ca fază staționară o coloană Novo-C 18. Faza mobilă (la o rată de curgere 1 ml/1 min) constă din 5 min amestec 2% metanol/ 98% KH₂P0₄ 0,010 M, pH 7,0 și 15 min, 2...40% gradient linear de metanol /0,01 OM KH₂P0₄, pH 7,0. Cantitatea de adipoil-6-ΑΡΑ se determină folosind o curbă standard de Penicilină N la 220 nm, iar cantitatea de adipoil-7-ADCA se determină folosind o curbă standard de deacetoxicefalosporină C la 254 nm.

Cercetările pentru susceptibilitățile adipoil-6-ΑΡΑ și adipoil-7-ADCA față de tratamentele cu penicilinază se fac prin adăugarea unei unități/ml penicilinază I sau penicilinază III la filtrate și incubare la temperatura camerei timp de 10...30 min. Aceste probe se supun condițiilor HPLC identice cu cele descrise mai sus.

Analizele spectrului UV al produselor adipoil-6-ΑΡΑ și adipoil-7-ADCA se fac folosind un sistem Waters cu sistem de eliberare a solventului 510, detector în serie fotodiodic 990, sistem de date 990 și, ca fază staționară, o coloană Novo-C18. Faza mobilă folosită este identică condițiilor descrise mai sus.

Izolarea pe scară largă a produsului adipoil-7-ADCA din întregul mediu de fermentație se face cu un sistem Waters cu sistem de eliberare a solventului 510, detector în serie fotodiodic 990, sistem de date 990 și, ca fază staționară, o coloană preparative mBondapak C18. Faza mobilă (la o rată de curgere 5 ml/1 minut) constă din 0,010 M KH₂P0₄, pH 7,0 timp de 35 min. Maximul de absorbție corespunzător timpului de retenție al produsului adipoil-7-ADCA se colectează folosind un colector de fracții.

Exemplul 12. Cercetările bioactivității

Se folosește o cercetare de difuzie în agar pentru pentru a determina activitatea antibiotică a produselor adipoil-6-ΑΡΑ și adipoil-7-ADCA izolate HPLC. Se aplică 20 ml produse de izolare la discuri de 5 mm pe agar plat LB(20 g/l de mediu LB cu 3% agar (Gibco, Paisley, Scotland)) însămânțat cu Bacillus subtilus ATCC 33677 sau E. coli tulpină supersensibilă (asigurată de către Prof. Arnold L. Demain, MIT). Se folosește ca tulpină indicatoare Bacillus subtilus pentru cercetarea produsului adipoil-6APA, iar tulpina E. coli se folosește ca tulpină indicatoare pentru cercetarea produsului adipoil-7-ADCA. După 15h de incubare la 37°C, un halou de inhibare a creșterii bacteriilor indicatoare împrejurul discurilor indică bioactivitatea produselor. Controalele în acest experiment includ deacetoxicefalosporină C, cefalosporină C, penicilină V și agar care conține sau nu penicilinază drept control pentru confirmarea structurilor beta-lactamice.

1050

1055

1060

1065

1070

1075

1080

1085

RO 115886 Bl

Exemplul 13. Cercetările enzimei RAEV

Produsul purificat adipoil-7-ADCA din întregul mediu de fermentație se folosește drept substrat pentru a determina activitatea specifică a enzimei RAEV (accesibilă comercial de la RAEV Corp.). Amestecul de reacție conține 10 mM substrat, 1 mg enzimă RAEV, glicerol 5% în KH₂PO₄ 0,16 M într-un volum total de 50 ml și se incubează la 37°C. Se iau 5 ml alicote la momentele O, 1, 3, 5, 10, 20 și 30 min, se diluează cu 35 ml KH₂P0₄ 0,010 M, pH 3,5 și se îngheață la -7O°C înaintea analizei prin HPLC în condițiile descrise anterior.

Activitatea enzimei RAEV față de un substrat colorimetric adipoil-acid p-aminobenzoic se cercetează folosind 5 mM substrat, 8,25 mg enzimă RAEV, glicerol 10% în KH₂P0₄ 0,065 M, pH 7,0 într-un volum total de 50 ml, timp de 30 min la 37°C. Reacția se realizează într-un vas de microtitrare cu 96 godeuri. Se adaugă o diluție 1/100 dintr-un mol NaN0₂în acid acetic 25 M pentru terminarea reacției și reacția se lasă la temperatura camerei 3 min. Se adaugă 100 ml dintr-o diluție 1/100 de 10 mg/ml acid 4-amino-5-hidroxi-2,6-naftalen-disulfonic, sare monohidrată de sodiu în NaHC0₃ 5M și culoarea dezvoltată se urmărește imediat la 515 nm folosind un EL 312 Bio-kinetics Plate Reader (BioTek Instruments).

Exemplul 14. Cercetarea HPLC a produsului de reacție a enzimei RAEV

Toate cercetările enzimei RAEV (accesibile comercial de la RAEV Corp.), care folosesc ca substrat adipoil-7-ADCA urmărite prin HPLC, se fac folosind un sistem Waters cu un sistem de eliberare a solventului 625, un detector variabil de lungimi de undă 490L, reglat la 203 nm și 254 nm, un sistem de date Maxima și ca fază staționară o coloană Novo-C18. Faza mobilă (la o rată de curgere de 1 ml/1 min) constă din 5 min 2% metanol/ 98% KH₂P0₄ 0,010 M, pH 3,5 și 15 min 2...40% gradient linear de metanol /0,01 OM KH₂P0₄, pH 3,5. Se folosește 7-ADCA standard pentru a urmări timpul de retenție a produsului de reacție. Cuantificarea produsului de reacție se calculează folosind o curbă standard de 7-ADCA standard la 254 nm.

Exemplul 15. Analiza 13C-NMR ale produsului de fermentație adipoil-7-ADCA

Spectrele RMN-13C (broad bând proton-decoupled) se obțin la 75,4 MHz (7,1T) pe un spectrometru 1MB-AF-350în modul de transformare Fourier. Probele constând din 50 mg produs adipoil-7-ADCA din mediul de fermentație în 0,5 ml D2O (99,8% D, Aldrich) sau 0,6 ml DMS0-d₆ (99,0% D, Aldrich) în tuburi de 5 mm la 35O°K. Datele RMN confirmă produsul desemnat ca adipoil-7-ADCA.

Exemplul 16.Stabilirea enzimelor alternative adipoil acilaze în plus față de studiile care folosesc enzimă RAEV, îndepărtarea catenei adipoil de la adipoil-7-ADCA (și alți compuși adipoil) este demonstrată cu enzime produse de o multitudine de surse microbiene. într-un studiu inițial, tulpinile Pseudomonas species SE-83 și SE-495 (depozitate la Institutul de Cercetare a Fermentației sub numărul de acces FERM BP-817 și, respectiv, FERM BP-818) și tulpina Pseudomonas SY-77-1 (depozitată la Laboratorul Regional de Cercetări din Nord, sub numărul de acces NNPL B-8070) sunt crescute 72 h într-un mediu care conține HyCase SF, 2,0% (g/v); glutamat de monosodiu 0,5% (g/v); extract de drojdie 0,5% (g/v); pudră de porumb 0,2 % (g/v); ulei de semințe de bumbac 0,5% (g/v) și acid glutaric 0,1% (g/v). Se recoltează celulele prin centrifugare și se spală cu 50 mM tampon fosfat pH 8,0; ele sunt apoi resuspendate în tampon și membranele exterioare se permeabilizează prin adăugarea unui volum mic de cloroform. Alicote din suspensia

RO 115886 Bl

1140 celulară sunt apoi amestecate cu adipoil-par&-nitroanilină (ad-PNA) și se incubează la 3O°C pentru perioade de 2...18h . După incubare, amestecurile sunt acidulate prin adăugare de acid acetic 10% (v/v). para-nitroanilina eliberată este detectată apoi prin mijloace colorimetrice ca urmare a conversiei sale la un compus diazo, utilizând reactivi furnizați sub formă de truse de către Sigma Chemical Company pentru cercetarea gama-glutamil-transferazei (produsul Sigma numărul 545-A). Activitățile relative ale celor trei tulpini sunt 100%, 85,5% și 48% pentru SE-495, SE-83 și, respectiv, SY-77-1. Activitățile relative se demonstrează folosind metode similare celor descrise mai sus pentru enzima RAEV, demonstrându-se, de asemenea, activitatea enzimelor SE-83 și SE-495 asupra adipoil-7-ADCA. Producția de beta-lactamază de către SY-77-1 a împiedicat demonstrarea activității de deacilare prin această tulpină a adipoil-7-ADCA.

Prin mijloace similare se demonstrează, de asemenea, producerea de adipoilacilază pentru două tulpini fungice [Altenaria sp. MA-133, ATCC nr. 20492 și Aspergillus sp. MA-13, ATCC nr. 20491; ref. US 4141790 pentru Meiji Seika Kaisha Ltd.) și trei tulpini bacteriene suplimentare (un Brevibacterium, ATCC nr. 14649, un Achromobacterium, ATCC nr. 14648 și un Flavobacterium, ATCC nr. 14650), care sunt descrise ca producătoare de cefalosporin C acilază în US 3239394 pentru Merck & Co., Inc.

Claims

Revendicări 1. Bioprocedeu pentru prepararea acidului 7-amino-dezacetoxicefalosporanic (7-ADCA), caracterizat prin aceea că cuprinde; - transformarea unei tulpini de Penicillium chrysogenum capabile să producă izopenicilina N, cu o genă care codifică expandaz-enzima, din Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, pentru a se obține o tulpină de Penicillium chrysogenum recombinantă, - menținerea într-un mediu de cultură a tulpinii recombinante de Penicillium chrysogenum menționate, în care se adaugă rezerve nutritive de adipat care cuprind acid adipic sau una sau mai multe dintre sărurile sale și esteri care au capacitatea de a fi asimilați și utilizați de către tulpina Penicillium chrysogenum, pentru a produce acid adipoil-6-amino-penicilanic (adipoil-6-ΑΡΑ), - supunerea, în continuare, in situ, a acidului adipoil-6-amino-penicilanic (adipoil- 6-APA), unei extinderi a ciclului în prezența tulpinii de Penicillium chrysogenum recombinante, pentru a forma acidul adipoil-7-amino-dezacetoxicefalosporanic (adipoil-7ADCA) și apoi punerea adipoil-7-ADCA în contact cu enzima adipoil acilază derivată, de preferință, de la o specie de Pseudomonas, apoi îndepărtarea moleculei de adipoil și formarea acidului 7-amino-dezacetoxicefalosporanic (7-ADCA) care se izolează. 2. Bioprocedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că rezerva nutritivă de adipat este adipat de sodiu. 3. Bioprocedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că tulpina de Penicillium chrysogenum este Penicillium chrysogenum PC 100, ATCC 74182. 4. Bioprocedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că transformarea tulpinii de Penicillium chrysogenum se realizează prin introducerea în celula gazdă de Penicillium chrysogenum a vectorului de expresie recombinant, vector care 1145 1150 1155 1160 1165 1170 1175 1180 RO 115886 Bl consta din plasmida pPenFTSO, gena care codifică expandaz-enzima din Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 și un promotor care constă, în principal, din promotorul genei IPNS de la Penicillium chrysogenum. LISTA DE SECVENȚE (1) INFORMAȚIE GENERALĂ: (1) SOLICITANT:Conder, Michael J. McAda, Phyllis și Rombosek John (ii) TITLUL INVENȚIEI:BIOPROCEDEU NOU PENTRU PREPARAREA 7-ADCA (iii) NUMĂR DE SECVENȚE : 12 (iv) ADRESA PENTRU CORESPONDENȚĂ: (A) ADRESA: Merck & Co., Inc. (B) STRADA: 126 E. Lincoln Avenue (C) ORAȘ: Rahway (D) STAT: New Jersey (E) ȚARA: SUA (F) ZIP: 07065 (v) COMPUTER PENTRU CITIRE DE LA: (A) TIP MEDIU: Flopy disk (B) COMPUTER: compatibil IBM PC (C) SISTEM DE OPERARE: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent in Release=1,0 Version ==1,25 (vi) DARE CURENTE DESPRE CERERE: (A) CEREREA NUMĂRUL: US 07/757 879 (B) DATA DEPOZITULUI: 11.09.1991 (C) CLASIFICARE: (viii) MANDATAR/AGENT PENTRU INFORMAȚII: (A) NUME: Speer, Raymond M. (B) NUMĂRUL DE ÎNREGIATRARE: 26 810 (C) REFERINȚA/DOSAR NR: (07/757 879) 18532 (ix) INFORMAȚIA PENTRU TELECOMUNICAȚII (A) TELEFON: (908) 594-4481 (B) TELEFAX: (908) 594-4720 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV. nr. 1 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ : (A) LUNGIME : 14 perechi baze (B) TIP : acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: Dublă (D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIPUL MOLECULEI : DNA (xi) DESCRIERE SECVENȚEI : SECV. nr.1 RO 115886 Bl TCTAGACACC ATGG (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV. nr.2 (i) CARACTERISTICI SECVENȚĂ : (A) LUNGIME: 15 baze perechi (B) TIP : acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: dublă (D) TOPOLOGIE : lineară 1230 (ii) TIPUL MOLECULEI: DNA (genomic) 1235 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECV. nr.2 GTGASAGTTC ATGGAC (2) INFORMAȚIA PENTRU SECV. ID NR.3 (0 CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ : (A) LUNGIME: 16 aminoacizi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: dublă (D) TOPOLOGIE : lineară 1240 (ii) TIPUL MOLECULEI: DNA (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECV. ID nr.3 TCTAGACACT ATGGAC 1245 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV. ID NR.4 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ : (A) LUNGIME : 16 perechi baze (B) TIP : acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: dublă (D) TOPOLOGIE : lineară 1250 (ii) TIPUL MOLECULEI: DNA (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECV. nr.4 TCTAGACACC ATGGAC 1255 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV. NR.5 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ : (A) LUNGIME : 22 aminoacizi (B) TIP : aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE : lineară 1260 (ii) TIPUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECV. ID NR. 5 Ser Asn Ser Gly Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gin Asn Pro

1 5 10 15 20 1265

(2) INFORMAȚIE PENTRU SECV. NR.6 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ :

(A) LUNGIME : 22 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă 12 7 o (D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECV. NR. 6

RO 115886 Bl

Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gin Asn Pro 15 10 15 20 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV. NR.7 (1) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ :

(A) LUNGIME : 22 aminoacizi (B) TIP : aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECV. ID NR. 7

Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile Leu Ala Gly Asp Pro 15 10 15 20 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV. ID NR.8 (1) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ :

(A) LUNGIME : 47 perechi baze (B) TIP : acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE : lineară (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECV. ID NR. 8

CGAGAGGATC AGTGAGAGTC CATGGACACG ACGG (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV. nr.9 (1) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ :

(A) LUNGIME : 47 perechi baze (B) TIP : acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE : lineară (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECV. NR. 9

ATGTCTTTTC TAATACCTTC ACCATGGGTTG AGATTGTACG TGATCCC (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV. nr. 10 (1) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ :

(A) LUNGIME : 33 perechi baze (B) TIP : acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cDNA (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECV. ID NR. 10

CGCCGATCCC CGCATAAACG GCTTCGGTCG TAT (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV. nr. 11 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ :

(A) LUNGIME : 34 perechi baze (B) TIP : acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE : lineară

RO 115886 Bl (ii) TIPUL MOLECULEI: DNA (genomic) 1320 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECV. NR. 11

CGCGGATCCG GGCACGCGCA TGGACATGCC AGTG (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV. nr. 12 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ :

(A) LUNGIME : 26 perechi baze 132 5 (B) TIP : acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simpla (D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: DNA (genomic) (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI : SECV. NR. 12 1330

CAGTAAACGC AACCATGGTT GTCCAG