NO316742B1 - Biologisk fremgangsmate for fremstilling av 7-ADCA - Google Patents
Biologisk fremgangsmate for fremstilling av 7-ADCA Download PDFInfo
- Publication number
- NO316742B1 NO316742B1 NO19940848A NO940848A NO316742B1 NO 316742 B1 NO316742 B1 NO 316742B1 NO 19940848 A NO19940848 A NO 19940848A NO 940848 A NO940848 A NO 940848A NO 316742 B1 NO316742 B1 NO 316742B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- adipoyl
- adca
- strain
- expandase
- enzyme
- Prior art date
Links
- NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 7beta-aminodeacetoxycephalosporanic acid Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](N)[C@@H]12 NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 0.000 title claims description 41
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 title description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 97
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 101710104123 Deacetoxycephalosporin C synthase Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 claims abstract description 60
- 125000003651 hexanedioyl group Chemical group C(CCCCC(=O)*)(=O)* 0.000 claims abstract description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 22
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 18
- MIFYHUACUWQUKT-UHFFFAOYSA-N Isopenicillin N Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(NC(=O)CCCC(N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-L adipate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC([O-])=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- MIFYHUACUWQUKT-QSKNDCFUSA-N isopenicillin n Chemical compound OC(=O)[C@@H]1C(C)(C)S[C@H]2[C@H](NC(=O)CCC[C@H](N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-QSKNDCFUSA-N 0.000 claims abstract 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 51
- CSGFFYNMTALICU-ZWNOBZJWSA-N adipyl-7-aminodesacetoxycephalosporanic acid Natural products CC1=C(N2[C@H](SC1)[C@H](NC(=O)CCCCC(O)=O)C2=O)C(O)=O CSGFFYNMTALICU-ZWNOBZJWSA-N 0.000 claims description 39
- 238000010170 biological method Methods 0.000 claims description 16
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 14
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 9
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 6
- 241000424942 Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 Species 0.000 claims description 5
- KYKFCSHPTAVNJD-UHFFFAOYSA-L sodium adipate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCCCC([O-])=O KYKFCSHPTAVNJD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 235000011049 sodium adipate Nutrition 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 28
- 241000187433 Streptomyces clavuligerus Species 0.000 abstract description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 3
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 abstract description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 92
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 38
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 36
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 25
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 22
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 19
- 108010012172 isopenicillin N synthetase Proteins 0.000 description 19
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 17
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 17
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- -1 (D)-α-aminoadipoyl side chain Chemical group 0.000 description 15
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 15
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 15
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 11
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 10
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000228417 Sarocladium strictum Species 0.000 description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 9
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 9
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 238000006049 ring expansion reaction Methods 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2s,3r,4r,5s)-4-carbamoyl-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)- Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(C)=O)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@@]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)(C)O[C@H]1[C@@H]([C@](O)([C@@H](O)C(CO)O1)C(N)=O)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 8
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 8
- LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N Phleomycin Natural products N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010035235 Phleomycins Proteins 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 7
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 7
- 229950008644 adicillin Drugs 0.000 description 7
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 7
- NNQIJOYQWYKBOW-JWKOBGCHSA-N deacetoxycephalosporin C Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 NNQIJOYQWYKBOW-JWKOBGCHSA-N 0.000 description 7
- MIFYHUACUWQUKT-GPUHXXMPSA-N penicillin N Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-GPUHXXMPSA-N 0.000 description 7
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XWCFYHBHOFBVIV-UHFFFAOYSA-N Deacetylcephalosporin C Natural products S1CC(CO)=C(C(O)=O)N2C(=O)C(NC(=O)CCCC(N)C(O)=O)C21 XWCFYHBHOFBVIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 6
- LXJXRIRHZLFYRP-UHFFFAOYSA-N glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=CC(O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 6
- MIFYHUACUWQUKT-GTQWGBSQSA-N isopenicillin N Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H](NC(=O)CCC[C@H](N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-GTQWGBSQSA-N 0.000 description 6
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 5
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 5
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 5
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 5
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 description 5
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- XWCFYHBHOFBVIV-JWKOBGCHSA-N deacetylcephalosporin C Chemical compound S1CC(CO)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@H]21 XWCFYHBHOFBVIV-JWKOBGCHSA-N 0.000 description 5
- NNQIJOYQWYKBOW-UHFFFAOYSA-N desacetoxycephalosphorin G Natural products S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)C(NC(=O)CCCC(N)C(O)=O)C12 NNQIJOYQWYKBOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 description 5
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 4
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 108010031946 deacetoxycephalosporin C hydroxylase Proteins 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N Cephalosporin C Natural products S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 3
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 3
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-M cephalosporin C(1-) Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-M 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 108010034416 glutarylamidocephalosporanic acid acylase Proteins 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000006241 metabolic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- JPSKCQCQZUGWNM-UHFFFAOYSA-N 2,7-Oxepanedione Chemical compound O=C1CCCCC(=O)O1 JPSKCQCQZUGWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FTMQFOCEVZLEJU-LURJTMIESA-N 6-[[(1S)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-6-oxohexanoic acid Chemical compound C(CCCCC(=O)O)(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O FTMQFOCEVZLEJU-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 7beta-aminocephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H]12 HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSVLPVUVIUVCRA-KPKNDVKVSA-N Alpha-lactose monohydrate Chemical compound O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WSVLPVUVIUVCRA-KPKNDVKVSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 125000003460 beta-lactamyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 2
- 108010093176 deacetoxycephalosporin C synthetase Proteins 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001601 sodium adipate Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfonylpiperidin-4-one Chemical compound CS(=O)(=O)N1CCC(=O)CC1 RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241001453369 Achromobacter denitrificans Species 0.000 description 1
- 241000228431 Acremonium chrysogenum Species 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241001558165 Alternaria sp. Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000187390 Amycolatopsis lactamdurans Species 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 101000765308 Aspergillus niger N-(5'-phosphoribosyl)anthranilate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000193417 Brevibacillus laterosporus Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100136727 Caenorhabditis elegans psd-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001619326 Cephalosporium Species 0.000 description 1
- 241000135254 Cephalosporium sp. Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 241000190562 Emericellopsis Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- 108020004206 Gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241001531966 Lysobacter lactamgenus Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000721603 Mycoplana Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001236817 Paecilomyces <Clavicipitaceae> Species 0.000 description 1
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 241000015473 Schizothorax griseus Species 0.000 description 1
- 241000122799 Scopulariopsis Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000203644 Streptoalloteichus hindustanus Species 0.000 description 1
- 241001147855 Streptomyces cattleya Species 0.000 description 1
- 101000981089 Streptomyces clavuligerus Deacetoxycephalosporin C synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000936757 Streptomyces filipinensis Species 0.000 description 1
- 241000913723 Streptomyces heteromorphus Species 0.000 description 1
- 241000187395 Streptomyces microflavus Species 0.000 description 1
- 241000913724 Streptomyces panayensis Species 0.000 description 1
- 241001248020 Streptomyces wadayamensis Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001278 adipic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010049411 alpha-aminoadipyl-cysteinyl-valine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940072049 amyl acetate Drugs 0.000 description 1
- PGMYKACGEOXYJE-UHFFFAOYSA-N anhydrous amyl acetate Natural products CCCCCOC(C)=O PGMYKACGEOXYJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N anhydrous glutaric acid Natural products OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 101150091913 cefE gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 1
- 150000001782 cephems Chemical group 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 108010035432 cytochrome C(L) Proteins 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 150000008049 diazo compounds Chemical class 0.000 description 1
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-M heptanoate Chemical compound CCCCCCC([O-])=O MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011850 initial investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000010699 lard oil Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- KINULKKPVJYRON-PVNXHVEDSA-N n-[(e)-[10-[(e)-(4,5-dihydro-1h-imidazol-2-ylhydrazinylidene)methyl]anthracen-9-yl]methylideneamino]-4,5-dihydro-1h-imidazol-2-amine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.N1CCN=C1N\N=C\C(C1=CC=CC=C11)=C(C=CC=C2)C2=C1\C=N\NC1=NCCN1 KINULKKPVJYRON-PVNXHVEDSA-N 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- YYIGOAMEITZADH-UHFFFAOYSA-M sodium;4-azaniumyl-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonate;hydrate Chemical compound O.[Na+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC(O)=C2C([NH3+])=CC(S([O-])(=O)=O)=CC2=C1 YYIGOAMEITZADH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
- C12P35/02—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin by desacylation of the substituent in the 7 position
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
- C12P37/04—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin by acylation of the substituent in the 6 position
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/933—Penicillium
- Y10S435/935—Penicillium chrysogenum
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Bakgrunn for oppfinnelsen
i - Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse omfatter biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-amino-deacetoksycefalosporansyre (7-ADCA) .
Foreliggende oppfinnelse angår området syntesemetoder for fremstilling av kommersielle cefalosporin-antibiotika, av hvilke det foreligger et betydelig antall, og disse terapeut- . iske midler er nå i sin fjerde generasjon. De mange, forskjellige sidekjeder som kan foreligge i kommersielle cefalosporiner, og den betydelige, økonomiske betydning av cefalosporinene, har medført økt betydning for å oppnå økonomiske og effektive metoder for fremstilling av nøkkelmellomprodukter som tillater enkel syntese av de forskjellige cefalosporiner.
Ett av disse nøkkelmellomprodukter er 7-aminodeacetoksycefalosporansyre (7-ADCA), representert ved følgende formel .-
For tiden produseres 7-ADCA fra penicillin G og fordrer fire eller fem kjemiske trinn for å utvide penicillinringsystemet fra en 5-ring til 6-ringen som karakteriserer cefalosporiner. Som typisk for fullstendig kjemisk syntese har denne prosess alvorlige mangler. Blant disse er kravene til en flertrinns-og komplisert prosess, kostbare reagenser, dannelse av betydelige mengder biprodukter som fører til avløpsbehandlingspro-blemer, og rensing av et ytterst urent startmateriale før den kjemiske behandling begynner. Det har følgelig pågått en kontinuerlig forskning for en mikrobiologisk eller fermentativ prosess som ville gi enzymatisk ringutvidelse og sidekjede-spaltning for å tilveiebringe 7-ADCA på en mer økonomisk basis
enn den kjemiske prosess som for tiden anvendes.
Nærmere bestemt angår foreliggende oppfinnelse således området fremstilling av cefalosporin-nøkkelmellomproduk-tet 7-ADCA, og mer spesielt området biologiske fremgangsmåter for fremstilling av 7-ADCA.
Hittil har forskningen etter en vellykket biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-ADCA i stor grad vist seg forgjeves, spesielt med hensyn til en fremgangsmåte i kommer-siell skala. Mens det for eksempel har vært mulig å fremstille 6-aminopenicillansyre (6-APA) ved direkte fermentering og/eller enzymatisk behandling av penicillin G, hvilket kun etterlater nødvendig ringutvidelse for å gi 7-ADCA, er det beklageligvis funnet at Cephalosporium- eller Streptomyces-enzymene som utfører ringutvidelse i de normale metabolske reaksjonsveier for disse mikroorganismer, ikke aksepterer 6-APA som et substrat. Disse enzymer som i teknikken kollektivt refereres til som DAOCS- eller ekspandaseenzymet, defineres som enzymer som katalyserer utvidelsen av penam-ringstrukturer funnet i molekyler av penicillintypen til cef-3-em-ringer, som funnet i cefalosporinene. I det etterfølgende vil disse enzymer refereres til som "ekspandaseenzymet".
Et substrat som ekspandaseenzymet virker på, er penicillin N, hvilket ved ringutvidelse gir deacetoksycefalosporin C (DAOC). Det er her kun nødvendig å spalte (D)-a-aminoadipo-ylsidekjeden for å gi 7-ADCA, men denne sidekjede har vist seg hardnakket resistent mot enzymatisk spaltning, hvilket kun gir uakseptabelt lave utbytter.
I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse er det blitt mulig å oppnå en effektiv, biologisk fremgangsmåte hvori en penicillinforbindelse (med en adipoylsidekjede) fremstilles ved hjelp av en ny fermenteringsprosess i høye titere, idet penicillinforbindelsen er et akseptabelt substrat for ekspandaseenzymsystemet som produseres in situ av den samme mikroorganisme som produserer penicillinforbindelsen og som er transformert for å uttrykke ekspandaseenzymsystemet. Ekspandaseenzymet virker deretter til å ringutvide penicillinforbindelsen til en cefalosporinforbindelse med høye utbytter. Av stor betydning er det også at i det andre kritiske trinn kan sidekjeden i penicillinforbindelsen som nå er en cefalosporinforbindelse, fjernes ved hjelp av et annet enzymsystem med overraskende høye utbytter. Det overraskende resultat av denne enestående biologiske fremgangsmåte som utgjør foreliggende oppfinnelse, er fremstilling av 7-ADCA i overraskende høye utbytter.
2 . Kort beskrivelse av kjent teknikk
Cantwell et al., i Curr. Genet. (1990) 17:213-221, har foreslått en biologisk prosess for fremstilling av 7-ADCA ved ringutvidelse av penicillin V etterfulgt av enzymatisk hydrolyse av det resulterende deacetoksycefalosporin V for å danne 7-ADCA. Denne fremgangsmåte er basert på tilgjengelig-heten av et klonet penicillin N-ekspandasegen ( cefE) fra S. clavuligerus, Kovacevic et al., J. Bacteriol. (1989) 171:754-760 og US 5 070 020. Imidlertid, fordi ekspandasen virker på penicillin N, dens naturlige substrat, men ikke på penicillin V, fordrer fremgangsmåten genteknikk for å produsere et modifisert ekspandasegen som kan ringutvide penicillin V. Den fordrede modifikasjon ble imidlertid ikke oppnådd av Cantwell et al., og de lyktes kun med å transformere Penicillium chrysogenum med cef E-genet fra Sfcrepto-myces clavuligerus og oppnå lavnivåekspresjon av DAOCS-(ekspandase)-enzymet.
Ekspandaseenzymet er grundig undersøkt i teknikken, både med hensyn til dets aktivitet og genetiske sekvens. I Wolfe, US 4 510 246 og 4 536 476, ble for eksempel syklase-, epimerase- og ringekspansjonsenzymer separat isolert fra en cellefri ekstrakt av prokaryotiske fJ-laktamproduserende organismer, inkludert Strepto/nyces clavuligerus, for å tilveiebringe stabile enzymreagenser. EP-A-0 3 66 354 beskriver et isolert og renset ekspandaseenzym fra S. clavuligerus som er karakterisert, inkludert med en terminal rest og aminosyresam-mensetning, og angis å ha en molekylvekt på ca. 34.600 dalton. Dette står imidlertid i motsetning til molekylvekten på 29.000 bestemt for det som synes å være det samme enzym i US 4 536 476. EP-A-0 233 715 beskriver isolering og endonuk-leaserestriksjonskartkarakterisering av ekspandaseenzymet erholdt fra S. clavuligerus, transformasjon og ekspresjon av enzymet i en vert, og demonstrerer ringutvidelse av penicillin N-substrat ved anvendelse av dette enzym. US 5 070 020 beskriver DNA-sekvensen som koder for ekspandaseenzymet erholdt fra S. clavuligerus, og beskriver transformasjonen av en P. chrysogenum-stamme med en ekspresjonsvektor inneholdende denne DNA-sekvens og derved oppnåelse av ekspresjon av ekspandaseenzymet . Selv om det antydes at dette enzym er anvendelig for utvidelse av substrater andre enn penicillin N, foreligger det ingen virkelig demonstrasjon av en slik utvidelse.
Det ovenfor beskrevne arbeid har fokusert på ekspandaseenzymet avledet fra prokaryotisk S. clavuligerus. Dette samme enzym, eller i det minste et enzym med tilsynelatende den samme ringutvidelsesaktivitet, uttrykkes også av stammer av eukaryotisk Cephalosporium acremonium (også referert til som Acremonium chrysogenum). I slike stammer uttrykkes imidlertid ekspandaseaktivitet av et bifunksjonelt gen ( cefEF) som også uttrykker DACS-(hydroksylase)-aktivitet hvis naturlige funksjon er å omdanne deacetoksycefalosporansyre-(DAOC)-produktet av ekspandaseenzymet til deacetylcefalosporin C (DAC). Resultatet er et enkelt, men bifunksjonelt, ekspandase/hydrok-sylaseenzym. Selv om det har vært forsøk på å atskille aktivi-tetene av disse to genprodukter, har hittil ingen vært vellykket. EP-A-0 281 391 beskriver for eksempel isolering og DNA-sekvensidentifikasjon av DAOCS/DACS-genet erholdt fra C. acremonium ATCC 11550, sammen med de tilsvarende aminosyresekvenser av enzymene. En Penicillium-stamme transformeres og uttrykker enzymene, imidlertid er den forsøkte omdannelse av penicillin G og V tilede tilsvarende cefalosporiner ikke demonstrert. Til tross for en antydning at genteknologiske teknikker tilveiebringer en tilgjengelig metode for å atskille den genetiske informasjon som koder for DAOCS fra DACS, og separat uttrykke disse, fremlegges ingen reell demonstrasjon av en slik atskillelse.
DAOCS/DACS-(ekspandase/hydroksylase)-enzymet fra
C. acremonium er også grundig undersøkt i teknikken, både med hensyn til dets aktivitet og dets karakteristika og genetiske sekvens. I Demain, US 4 178 210; 4 248 966 og 4 307 192, be-handles for eksempel forskjellige startmaterialer av penicillintypen med en cellefri ekstrakt av C. acremonium som epimer-iserer og utvider ringen for å gi et cefalosporin-antibiotika-produkt. Wu-Kuang Yeh, US 4 753 881, beskriver C. acremonium-enzymet uttrykt ved dets isoelektriske punkt, molekylvekter, aminosyrerester, forhold mellom hydroksylase- og ekspandaseak-tiviteter, og peptidfragmenter.
Den ovenfor beskrevne kjente teknikk handler kun om et enkelt aspekt ved foreliggende oppfinnelse, dvs. transformasjonen av en P. chrysogenum-stamme med genet som uttrykker ekspandaseenzymet, og oppnåelse av ekspresjon av dette enzym. Kjent teknikk beskriver imidlertid kun anvendelse av det ut-trykte enzym for å ringekspandere penicillin N og ikke penicilliner G og V. Selv i det henseende har penicillin N en sidekjede i 7-posisjonen som ikke kan spaltes enzymatisk for å gi 7-ADCA, som ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Foreliggende oppfinnelse grunner seg på det overraskende funn at en adipoylsidekjede kan tilføres effektivt ved hjelp av en P. chrysogenum-stamme, at ekspandaseenzymet uttrykt in situ, kan anvende denne forbindelse effektivt som et substrat for ringutvidelse til adipoyl-7-ADCA, og at adipoylsidekjeden deretter kan fjernes effektivt av et ytterligere enzym for å gi 7-ADCA. Selv om forskjellige isolerte fragmenter av foreliggende oppfinnelse kan finnes i den kjente teknikk, har det ikke vært noen antydning om at disse fragmenter kan kombineres for å gi de uventede resultater erholdt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.
Produksjon av 6-adipoylpenicillansyre er for eksempel kjent i teknikken; se Ballio, A. et al., Nature (1960), 185, 97-99. Den enzymatiske utvidelse av 6-adipoylpenicillansyre på en in vitro basis, er også kjent i teknikken. Se Baldwin et al., Tetrahedron (1987) 43, 3009-3014; og EP-A-0 268 343. Enzymatisk spaltning av adipoylsidekjeder er også kjent i teknikken; se Matsuda et al., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820.
Adipoylsidekjeden har den følgende struktur: COOH-(CH2)4-CO-, mens en sidekjede med nært beslektet struktur er glutarylsidekjeden med den følgende formel: COOH-(CH2)3-CO-. Den enzymatiske spaltning av glutarylsidekjeder er kjent i teknikken. Se f.eks. Shibuya et al., Agric Biol. Chem. (1981) 45, 1561-1567; Matsuda og Komatsu, J. Bact. (1985) 163, 1222-1228; Matsuda et al., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820; jap. 53-086084 (1978 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.) og jap. 52-128293 (1977 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.).
EPA-A-0 453 048 beskriver dessuten metoder for å for-bedre adipoylspaltningsaktiviteten av glutarylacylase produsert av Pseudomonas SY-77-1. Ved substitusjon av forskjellige aminosyrer i bestemte posisjoner med alfa-subenheten, ble det observert en tre til fem ganger høyere hastighet for adipoyl-spaltning (fra adipoylserin). Det bør bemerkes at selv om EP-A-0 453 048 tilsynelatende demonstrerer en acylase med forbedret aktivitet overfor adipoylsidekjeder, gir den ingen beskrivelse av måter (hverken kjemisk eller ved hjelp av en biologisk prosess som på noen måte er analog med prosessen beskrevet i foreliggende patentsøknad) ved hvilke et adipoyl-cefalosporin i utgangspunktet kan dannes.
Når en (D)-a-aminoadipoylsidekjede er til stede, er det kjent i teknikken først å fjerne aminogruppen enzymatisk og forkorte sidekjeden med en (D)-aminoacidooksidase, hvilket etterlater en glutaryl-(GL-7)-sidekjede, etterfulgt av fjerning av glutarylsidekjeden ved hjelp av et andre enzym (glutarylacylase) . En slik totrinns-spaltning er beskrevet i Matsuda, US 3 960 662; EP-A-0 275 901; jap. 61-218057 (1988 - Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.); WO 90/12110 (1990 - Wong, Biopure Corp.) og Isogai et al., Bio/Technology (1991) 9, 188-191.
Det refereres til patentsøknad PCT/US92/08585, innlevert 8. oktober 1992, som beskriver en biologisk prosess for fremstilling av 7-ACA som grunner seg på ekspresjon av aktiviteten av ekspandaseenzymet i en P. chrysogenum-transformant på samme måte som den biologiske fremgangsmåte for fremstilling av 7-ADCA beskrevet heri. I 7-ACA-bioprosessen fordres imidlertid ytterligere transformasjoner for ekspresjonen av ytterligere enzymatiske aktiviteter, for å oppnå en fullstendig forskjellig rekombinant, metabolsk reaksjonsvei til et bestemt sluttprodukt, av hvilke ingen er antydet i foreliggende patentsøknad.
For å lette forståelsen av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse og læren ifølge den ovenfor beskrevne, kjente teknikk, er det umiddelbart nedenfor vist en oversikt over de forskjellige trinn i den metabolske reaksjonsvei som fører til penicillin G og cefalosporin C, mellom-produktene og enzymene som utfører de involverte transformasjoner.
Sammendrag av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse angår en ny biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-amino-deacetoksycefalosporansyre (7-ADCA),
kjennetegnet ved trinnene:
a) opprettholdelse av en stamme av Penicillium chrysogenum som produserer isopenicillin N i et dyrkningsmedium som er i stand til å underholde dens vekst, hvoretter dyrkningsmediet tilsettes et adipat-råmateriale omfattende adipinsyre, eller ett eller flere av dets salter og estere som er i stand til å assimileres og utnyttes av stammen av Penicillium chrysogenum, hvori stammen av Penicillium chrysogenum er transformert ved hjelp av DNA som koder for et enzym med ekspandase-aktivitet, der enzymet er i stand til å akseptere adipoyl-6-APA som et substrat, hvori adipoyl-6-APA produsert av denne stamme, deretter også, som et resultat av dens ekspresjon, ringekspanderes in situ for å danne adipoyl-7-ADCA; og b) adipoyl-7-ADCA fremstilt i a), bringes i kontakt med en adipoylacylase, hvorved adipoylsidekjeden fjernes og
produktet 7-ADCA dannes; og deretter
c) isoleres det produserte 7-ADCA.
De følgende betegnelser anvendt heri, betyr: "adipoyl-6-APA" betyr [2S-(2a,5a,60)]-3,3-dimetyl-7-okso-6-[(heksan-1,6-dioyl)amino]-4-tia-l-azabisyklo-[3.2.0]-heptan-2-karboksylsyre; og
"adipoyl-7-ADCA" betyr 7-[(heksan-1,6-dioyl)amino]-3-metyl-8-okso-5-tia-l-azabisyklo-(4.2.0)-okt-2-en-2-karboksyl-syre.
Nærmere bestemt angår foreliggende oppfinnelse en ny, biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-aminodeacetoksycefalosporansyre (7-ADCA) angitt ovenfor, hvori adipat-råmaterialet er dinatriumadipat, hvori DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet, stammer fra Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, deponert ved The American Type Culture Collection at Rockville, Maryland, USA, 19.mai 1971, og hvori adipoylacylasen stammer fra Pseudomonas-arter.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Det primære aspekt ved foreliggende oppfinnelse er en ny, biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-aminodeacetoksycefalosporansyre (7-ADCA), et nøkkelmellomprodukt ved fremstilling av syntetiske, kommersielle cefalosporiner, som kan representeres ved den følgende strukturformel:
I tillegg til cefalosporinkjernen er de kjennetegnende trekk ved 7-ADCA 7-aminogruppen og 3-metylgruppen. 7-aminogruppen er en gruppe som kan omdannes til ethvert antall derivatside-kjeder og danner således basis for syntetisering av forskjellige kommersielle cefalosporiner. 3-metylgruppen må vanligvis, men ikke bestandig, som i tilfellet med cefaleksin, omdannes til en annen sidekjede for å syntetisere et kommersielt cefalosporin.
7-ADCA-produktet fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan stilles opp mot cefalosporin C, et annet cefalosporin-nøkkelmellomprodukt som kan representeres ved den følgende strukturformel:
I dette mellomprodukt kan 3-acetyloksymetylsidekjeden være akseptabel for kommersielle cefalosporiner. 7-(D)-a-aminoadi-poylsidekjeden er imidlertid ikke akseptabel for ytterligere syntetisk derivatisering og må spaltes for å gi den akseptable 7-aminogruppe. Beklageligvis har 7-(D)-a-aminoadipoylside-kjeden bestandig vist seg å være vanskelig å fjerne, både med kjemiske og biokjemiske midler.
Som anvendt i foreliggende patentbeskrivelse, og spesielt avsnittet med tittel Beskrivelse av foretrukne ut-førelsesformer, betyr de følgende betegnelser: 7-ADCA = 7-aminodeacetoksycefalosporansyre 6-APA = 6-aminopenicillansyre
DAOC = Deacetoksycefalosporansyre
DAOCS = DAOC-syntetase
DAC = Deacetylcefalosporin C
DACS = DAC-syntetase
IPNS = Isopenicillin N-syntetase
Tris = Tris[hydroksymetyl]aminometan
EDTA = Etylendiamintetraeddiksyre
DEPC = Dietylpyrokarbonat
TE = Tris/EDTA-buffer
SSC = Salt (natriumklorid), natriumsitratbuffer SDS = Natriumdodecylsulfat
PEG = Polyetylenglykol
Dyrking av Penicillium chrysogenum
Det første trinn ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter opprettholdelse av en stamme av Penicillium chrysogenum som produserer isopenicillin N i et dyrkningsmedium som er i stand til å underholde dens vekst, hvorpå dyrkningsmediet tilsettes et adipat-råmateriale omfattende adipinsyre, eller dens salter og estere. Adipat-råmaterialet kan tilsettes til dyrkningsmediet etter inokulering med Penicillium chrysogenum, men det er foretrukket at det allerede er til stede i dyrkningsmediet ved tidspunktet når inokulering finner sted. Adipinsyren eller dens salter og estere er slik at de er i stand til å assimileres og utnyttes av stammen av P. chrysogenum for å produsere adipoyl-6-APA; hvori stammen av Penicillium chrysogenum er transformert ved hjelp av DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet, hvorpå adipoyl-6-APA, som et resultat av dens ekspresjon, ringekspanderes in situ for å danne adipoyl-7-ADCA.
Andre arter av slekten Penicillium, foruten chrysogenum- artene, produserer isopenicillin N. Historisk sett har imidlertid stammene med høyest produksjon av isopenicillin N alle blitt utviklet ved hjelp av velkjente teknikker med stam-meforedling ut fra chrysogenum-artene. Foreliggende oppfinnelse er derfor av praktiske årsaker begrenset til stammer av Penicillium chrysogenum, selv om oppfinnelsens anvendelighet på andre arter er innlysende. Enhver deponert stamme av Penicillium chrysogenum, eller en annen ålment tilgjengelig kilde for en slik stamme, er et egnet startpunkt for utførelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.
Dyrkningsmediet som er i stand til å underholde veksten av en stamme av Penicillium chrysogenum som produserer isopenicillin N, er av typen som en fagmann vil være fortrolig med. Dyrkningen vil for eksempel utføres ved hjelp av den aerobe nedsenkings-fermenteringsmetode, og det anvendte medium vil være utvalgt fra et antall egnede, tilgjengelige medier. Typiske medier anvender karbonkilder som sukrose, glukose og stivelse; nitrogenkilder som soyamel og maisgryn, bomullsfrø-olje, peanøttmel og forskjellige aminosyrer, blandinger derav og peptoner. Produksjonsbehov legger vekt på utbytte og enkel isolering, og foretrukne medier for slike situasjoner kan således være melasser som karbonkilde og soyamel og aminosyrer som nitrogenkilde.
Uorganiske næringssalter tilsettes vanligvis til dyrkningsmediet og inkluderer salter som er i stand til å til-føre de følgende ionebestanddeler: natrium, kalium, ammonium, kalsium, fosfat, sulfat, klorid, bromid, nitrat, karbonat, jern(III), jern(II), magnesium, mangan, etc. Sporelementer er også vanligvis essensielle for veksten, utviklingen og meta-bolismen av Penicillium chrysogenum, og kan tilsettes direkte til dyrkningsmediet dersom de ikke allerede er tilført som forurensninger, hovedsakelig av de andre dyrkningsmediumbe-standdeler.
Penicillium chrysogenum- stammene kan dyrkes i utstyr med lite volum, slik som 1-liters ristekolber, når det ønskes å produsere kun små mengder av 7-ADCA. Når større mengder- av adipoyl-7-ADCA er ønsket, anvendes imidlertid storskala-fer-menteringstanker under aerobe nedsenkings-fermenteringsbetin-geiser.
Ved utførelse av fremstilling av adipoyl-7-ADCA i stor skala opprettholdes sporer av Penicillium chrysogenum-stammen på en skråagar. Sporene fra skråagaren anvendes for å inokulere et vegetativt medium med lite volum. Det vegetative medium inkuberes for å produsere en tykk, frisk, aktivt vok-sende kultur av mikroorganismen. Denne vegetative vekstkultur anvendes deretter som inokulat for storskala-fermenteringsmediet. I visse tilfeller kan det være ønskelig å inkludere ytterligere et vegetativt medium som inokulat for fermenteringsmediet. Slike andre-trinns-vegetative medier anvendes vanligvis når volumet av fermenteringsmediet er betydelig større enn det første vegetative medium. På denne måte blir sporene av mikroorganismene først dyrket i et lite volum av vegetativt medium for å erholde et inokulat for et vegetativt medium med større volum. Det vegetative medium med større volum tilfører deretter tilstrekkelig konsentrasjon av mikroorganismen for å initiere en hurtig start av fermenteringen i storskala-fermen-teringstanken. Det vegetative medium kan ha den samme sammensetning som fermenteringsmediet, eller det kan inneholde ytterligere bestanddeler for å tilskynde veksten og utviklingen av mikroorganismen i liten skala.
Penicillium chrysogenum-stammene anvendt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, dyrkes mest effektivt ved temperaturer mellom 20 og 30°C, men optimale utbytter vil oppnås når temperaturen er mellom 22 og 28°C, fortrinnsvis tilnærmet 25°C.
Maksimal produksjon av adipoyl-7-ADCA finner sted når Penicillium chrysogenum-stammen dyrkes i storskalatanker i en periode mellom 10 og 30 dager, fortrinnsvis 15 til 25 dager. Ved dyrkning i liten skala, slik som i 250 ml<1>s ristekolber, er imidlertid veksten av mikroorganismen hurtigere, og den produserer adipoyl-7-ADCA i løpet av kortere tid, f.eks. 4 til 15 dager, ofte 5 til 7 dager.
Dersom den endelige pH i storskala-fermenterings-tanker når 8,0 eller høyere, kan utbyttet av adipoyl-7-ADCA påvirkes ugunstig. I slike situasjoner er det ønskelig å overvåke pH i dyrkningsmediet gjennom fermenteringen. Dersom det fremgår at pH vil nå slike nivåer før tidspunktet for at maksimal produksjon av adipoyl-7-ADCA inntreffer, kan pH justeres nedover ved å tilsette en egnet syre eller en buffer til fermenteringsmediet.
Produksjonen av adipoyl-7-ADCA kan følges ved å teste prøver av fermenteringsløsningen kromatografisk.
Som ved de fleste aerobe nedsenkningsfermenteringer passeres steril luft gjennom dyrkningsmediet for å oppnå mer effektiv vekst av Penicillium chrysogenum-stammen og økt produksjon av adipoyl-7-ADCA. Volumet av luften som presses gjen-
nom dyrkningsmediet, er vanligvis minst ca. 0,2 volumer luft pr. minutt pr. volum dyrkningsmedium. En økt luftpasserings-hastighet kan imidlertid ofte ha en fordelaktig effekt på produksjonen av adipoyl-7-ADCA.
Penicillium chrysogenum-stammen vil i tillegg til adipoyl-7-ADCA typisk produsere mange biprodukter og metabolitter. Fordi noen av disse er syrelabile, er det ved gjenvinning av adipoyl-7-ADCA fra fermenteringsmediet ønskelig å behandle hele fermenteringsløsningen ved en sur pH i et kort tidsrom for å nedbryte noen av de samtidig produserte urenheter. Adipoyl-7-ADCA-fermenteringsproduktet gjenvinnes fra den således behandlede, filtrerte fermenteringsløsning og kan eventuelt atskilles fra de andre bestanddeler av fermenteringsmediet ved kromatografering gjennom en ionebytterharpiks,
og kan om nødvendig renses ytterligere før det etterfølgende trinn med enzymatisk spaltning av adipoylsidekjeden. Det er også mulig å utføre en slik ionebytterkromatografisk atskillelse etter at sidekjedespaltningen er utført. Et av de viktigste biprodukter som gir atskillelsesproblemer, er adipoyl-6-APA, og det er mulig å nedbryte dette biprodukt kjemisk eller enzymatisk for å gjøre atskillelsen lettere. Den filtrerte fermenteringsløsning underkastes først en preliminær rensningsprosedyre som kan inkludere en innledende ekstraksjon med et ikke-vannblandbart, organisk løsningsmiddel, slik som n-butanol eller amylacetat, for å fjerne urenheter. Den eks-traherte løsning kan deretter ytterligere renses på en preliminær måte ved kromatografering på aktivert karbon.
Tilsetning av adipat- råmateriale
Ved tidspunktet når fermenteringskulturen for Penicillium chrysogenum er etablert, som beskrevet ovenfor, dvs. før inokulering, tilsettes fortrinnsvis et adipat-råmateriale til de andre bestanddeler av fermenteringskulturmediet. Adipat -råmaterialet kan eventuelt tilsettes noen tid etter inokulering, f.eks. 1, 2 og/eller 3 dager etter inokulering. Adipat -råmaterialet er definert som adipinsyre, eller ett eller flere salter eller estere av adipinsyre som er i stand til å assimileres og utnyttes av stammen av Penicillium chrysogenum som dyrkes for å produsere adipoyl-6-APA. Adipinsyre, salter og estere kan anvendes alene eller i enhver kombinasjon. Di-natriumsaltet er foretrukket, selv om kaliumsaltet og blandede salter med natrium også vil være egnet. Metylesteren kan anvendes, men etylesteren er vannuoppløselig. Adipinsyresaltet eller -esteren må være slik at det kan assimileres og utnyttes av stammen av Penicillium chrysogenum for å danne adipoyl-6-APA. Selve adipinsyren kan f.eks. være egnet, selv om den er vannuoppløselig, dersom det under passende pH-betingelser dannes et assimilerbart salt.
Egnede ekspandaseenzymer
Stammen av Penicillium chrysogenum som er dyrket og tilført et adipoyl-råmateriale som beskrevet ovenfor slik at den produserer adipoyl-6-APA, er også en stamme som er blitt transformert ved hjelp av DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet, hvorpå adipoyl-6-APA, som et resultat av dets ekspresjon, ringekspanderes in situ for å danne adipoyl-7-ADCA.
Adipoyl-6-APA produseres intracellulært av Penicillium chrysogenum dyrket med adipat-råmaterialet. I dette intracellulære miljø, dvs. på en in situ-basis, uttrykker den transformerte Penicillium chrysogenum også DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet, hvorpå enzymet virker på adipoyl-6-APA som et substrat og ringekspanderer dette for å danne adipoyl-7-ADCA.
Den nye, biologiske fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer innen sin ramme transformasjonen av en Penicillium chrysogenum-stamme av typen beskrevet ovenfor med ethvert DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet, hvorpå adipoyl-6-APA, som et resultat av dets ekspresjon, ringekspanderes in situ for å danne adipoyl-7-ADCA. DNA som Penicillium chrysogenum transformeres med, må således uttrykke et enzym som ikke kun besitter den aktivitet av ekspandaseenzymet som fremgår fra teknikken, dvs. evnen til å ringekspandere isopenicillin N til DAOC, men også evnen til å ringekspandere adipoyl-6-APA til adipoyl-7-ADCA. Basert på side-kj edesamsvarighet anses det imidlertid at ethvert ekspandaseenzym vil være operabelt i den nye, biologiske fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse.
Det er allerede anført under avsnittet som beskriver kjent teknikk, at ekspandaseenzymet som stammer fra Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, er fullstendig sekvensert og karakterisert ved hjelp av endonuklease-restriksjonskartleg-ging. Det som kunne synes å være det samme enzym, avledet fra S. clavuligerus NRRL 3585, er imidlertid rapportert å ha en forskjellig molekylvekt, men det er ikke sekvensert.
Disse ekspandaseenzymer som allerede er identifisert i teknikken, er anvendelige ved den nye, biologiske fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Andre ekspandaseenzymer som ikke ennå er identifisert, avledet fra forskjellige stammer av S. clavuligerus, eller til og med fra mikroorganismer av forskjellige slekter, kan også vise seg å være egnede for utførelse av den nye, biologiske fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Prosedyrene for identifisering av slike nye stammer og slekter av anvendelige mikroorganismer, og for å isolere de antatte ekspandaseenzymer og etablere at de er egnede for anvendelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, er enkle og kan lett utføres av en dyktig fagmann. Screening av cellefrie ekstrakter fra mulige nye stammer og slekter av anvendelige mikroorganismer kan utføres på en pålitelig og reproduserbar måte ved å tilsette ekstraktene til adipoyl-6-APA-substratet i nærvær av kjente DAOCS-kofaktorer som inkluderer Fe<2+->ioner, askorbat, a-ketoglutarat og adeno-sintrifosfat (ATP). Adipoyl-6-APA-substratet kan fremstilles i tilstrekkelige mengder ved å tilføre et adipat-råmateriale til en utransformert Penicillium chrysogenum på en måte som er analog med den beskrevet i detalj i det etterfølgende. Det ønskede ekspandaseenzym er til stede dersom adipoyl-7-ADCA dannes, hvis tilstedeværelse kan påvises ved kromatografi.
Ved anvendelse av velkjente rekombinant-teknikker for å danne DNA-prober basert på ekspandasesekvensen for S. clavuligerus og C. acremonium, er det f.eks. også mulig å screene DNA-innholdet i en mulig mikroorganisme som sannsynligvis vil produsere en ekspandase egnet for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.
Potensielle kilder for ekspandaseenzymer
Ekspandaseenzymer, som allerede anført, er enzymer som katalyserer utvidelsen av penamringstrukturer (funnet i penicillin-type molekyler) til cef-3-em-ringer (som funnet i cefalosporinene). Enhver organisme som produserer metabolitter som inneholder en cefemring, er derfor en potensiell kilde for DNA som koder for en ekspandase. Eksempler på slike organismer er oppført nedenfor, men denne liste tjener kun som eksempel
og bør ikke betraktes som uttømmende:
Sopp
Cephalosporium acremonium
Cephalosporium sp.
Emericellopsis
Paecilomyces
Scopulariopsis
Diheterospora
Spiroidium
Anoxiopsis
Actinomycetes
Streptomyces clavuligerus
S. lipmanii
S. wadayamensis
S. todorominensis
S. filipinensis cephamycini
S. heteromorphus
S. panayensis
S. griseus
S. cattleya
Nocardia lactamdurans
Andre bakterier
Flavobacteriuin sp.
Alcaligenes denitrificans
Mycoplana hullata
Providencia rettgeri
Lysobacter lactamgenus
Ekspandasene fra organismene oppført ovenfor, er kun kandidater for ytterligere undersøkelse, og det kan være at ikke alle disse vil være egnede ved den nye fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Anvendelse av de enzymer som besitter både ekspandase- og hydroksylaseaktiviteter, slik som enzymet fra C. acremonium, kan f.eks. føre til syntese av hydroksylert adipoyl-7-ADCA, dvs. DAC med en adipoylsidekjede.
Isolering av DNA- fragmenter som koder for ekspandaseaktivitet
Når tilstedeværelsen av et ønsket ekspandaseenzym er påvist på måten beskrevet ovenfor, er også prosedyrer for iso-■ lering av DNA som koder for ekspandaseenzymaktiviteten, enkle og velkjente i teknikken. Det er konstruert DNA-prober basert på kjente sekvenser og partielle sekvenser av genene som koder for ekspandaseenzymene, hvilke vil hybridisere til det ønskede enzym-kodende DNA som skal isoleres. Konstruksjonen av slike prober er basert på kunnskap om aminosyresekvensen og nukleo-tidbasesekvensen som koder for ekspandaseenzymet, så vel som kodonpreferansene for den spesielle mikroorganisme involvert. En detaljert beskrivelse av typiske prosedyrer av denne type anvendt på det genomiske DNA fra Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, er beskrevet nedenfor.
Isolering av DNA som koder for ekspandaseenzymaktiviteten, oppnås ved anvendelse av restriksjons- og ligeringspro-sedyrer velkjente i rekombinant DNA-teknologi. Det er nødven-dig å ha endonukleaserestriksjonskart av genomet fra den involverte mikroorganisme slik at det korrekte restriksjonsfrag-ment kan produseres og isoleres. Restriksjonskart for S. clavuligerus og C. acremonium er allerede tilgjengelige; for det førstnevnte anvendes således restriksjonsenzymene Barn HI og Sal I, og elektroforese tilveiebringer de ønskede fragmenter med størrelse 1,8 til 2,2 kb.
Transformasjon av stammen Penicillium chrysogenum
Når først DNA-fragmentene som koder for ekspandase-aktiviteten er erholdt, kan de innføyes (ligeres) i et plasmid eller en annen ekspresjonsvektor, sammen med DNA-fragmenter omfattende promotorer, translasjonsaktiveringssekvenser, res-istensmarkører, regulatoriske sekvenser, kosmiddannere og alle andre DNA-sekvenser som tillater eller fremmer transformasjon, styrer ekspresjon av genproduktet og letter isolasjon av transformantene. Den således konstruerte ekspresjonsvektor anvendes deretter for å oppnå transformasjon av Penicillium chrysogenum-stammen og intracellulær ekspresjon av aktiviteten av ekspandaseenzymet. De anvendte teknikker for å oppnå transformasjon og ekspresjon er velkjente i teknikken, og en detaljert beskrivelse av slike typiske prosedyrer er beskrevet i
det etterfølgende.
Som allerede beskrevet i detalj i det foregående, uttrykker den transformerte Penicillium chrysogenum-stamme aktiviteten av ekspandaseenzymet intracellulært, hvilket deretter virker in situ på adipoyl-6-APA-substratet for å ringekspandere det til adipoyl-7-ADCA.
Ny transformant
Den spesifikke Penicillium chrysogenum-transformant som uttrykker aktiviteten av ekspandasegenet som er en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse, er ny i forhold til slike konstruksjoner i den kjente teknikk, slik som i Cantwell et al. (1990), Current Genetic, 17, 213-221. I begge konstruksjoner anvendes in vitro mutagenese for å for-binde promotoren med ekspandasegenet. I Cantwell-konstruksjonen innføres det ved manipulering et Ndel-sete ved ekspandasegenets ATG som ligeres til Xbal-setet ved 3'-enden av IPNS-promotoren ved hjelp av en Xbal/Ndel-linker. I konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse dannes et Ncol-sete ved ekspandasegenets ATG og ligeres til Ncol-setet ved 3<1->enden av IPNS-linkeren. Dette danner de følgende sekvenser rundt for-bindelsesstedene for promotorgenet i disse konstruksjoner:
Cantwell-konstruksjonen erstatter en C med en T, mens i konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse bibeholdes C; sekvensen av IPNS-promotoren i umiddelbar nærhet til ATG-startkodonet tilsvarer således nøyaktig sekvensen som finnes i det naturlig forekommende IPNS-gen. Det er mulig at promotoren ifølge kjent teknikk, selv om den kun atskiller seg med en enkelt nukleotidbase, kan føre til en lavere translasjons-effektivitet og følgelig til et lavere nivå for ekspandasegen-ekspresjon.
Andre forskjeller foreligger i områdene for promotoren eller genet inkludert i konstruksjonene. Cantwell-konstruksjonen inneholder 5'BamHI-XbaI 3<1->området av IPNS-promotoren, mens vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder 5' Ncol-Ncol 3<1->området av promotoren [Diez et al.,
(1990), J. Biol. Chem. 265, 16358-16365]. Dette fører til ytterligere tilnærmet 250 bp på 5<1->enden av IPNS-promotoren i Cantwell-konstruksjonen. Dette området befinner seg imidlertid i den åpne avlesningsramme for ACV-syntetasegenet oppstrøms for IPNS-genet. Cantwell-konstruksjonen inneholder også Streptomyces-genet fra ATG til BaraHI-setet 3' fra genet, mens vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder ATG til Sail-setet 3' fra genet [Kovacevic et al. (1989), J. Bacteriol., 171, 754-760]. Dette fører til ytterligere tilnærmet 1000 bp med 3'-endesekvens i Cantwell-konstruksjonen. Konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder likevel opp-strørosområdet av ekspandasegenet til BamHI-setet 5' fra ATG; dette atskilles imidlertid fra avlesningsrammen for ekspandasegenet av IPNS-promotoren. En annen forskjell mellom konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse og konstruksjonen beskrevet i den kjente teknikk, angår den velgbare markør som anvendes. Anvendelse av en Penicillium IPNS-promotor: fleomycingenfusjon i konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse har en tendens til å velge integrasjon av mange kopier, eller integrasjon ved steder som tillater ekspresjon på høyt nivå, og kan således potensielt gi en høyere prosentdel av transformanter som uttrykker ekspandasegenet på høyt nivå. En ny transformant av typen beskrevet ovenfor, er en Penicillium chrysogenum identifisert som PC100. Dens takson-omiske kjennetegn inkluderer typisk produksjon av vidtspred-ende kolonier, blågrønne til grønne av farge, glatt fløyelsak-tige med gule dråper; gul bakside som sprer seg inn i agaren, forgrenede sporehoder hvor alle deler er glatte; elliptiske til kuleformede sporer med lengde 3-4 mm. Akseptable dyrkningsbetingelser for P. chrysogenum benytter et fast medium omfattende laktose, monohydrert 1,5% (vekt/volum); maisstøpe-væske, 0,5% (volum/volum); pepton, 0,5% (vekt/volum); NaCl, 0,4% (vekt/volum); MgS04-7HaO, 0,05% (vekt/vol um) ; KHzP04, 0,06% (vekt/volum) ; FeCl3-6H20, 0,0005% (vekt/volum); CuS04-5H20, 0,0002% (vekt/volum); agar, 3,0% (vekt/volum); i én liter destillert vann, pH 4,8. Den ovenfor beskrevne P. chrysogenum betegnet PC100, er deponert hos American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, under aksesjonsnr. ATCC 74182 (deponerings-dato: mottatt 21. august 1992 og levedyktighet bekreftet 27. august 1992).
Spaltning av adipoylsidekjeden
Det neste trinn'i den nye, biologiske fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse er spaltning av adipoyl-sidekjeden fra adipoyl-7-ADCA, hvilket fordrer behandling av produktet fra det foregående trinn med et adipoylacylaseenzymsys-tem. Som allerede anført ovenfor, er et av de viktigste resultater oppnådd ved foreliggende oppfinnelse, evnen til å utføre alle trinnene som fører til dannelse av adipoyl-7-ADCA i en enkelt fermenteringskultur. Dette tilveiebringer usedvanlig forbedret effektivitet ved at mellomprodukter fra trinn til trinn i prosessen ikke må isoleres og delvis renses. I dette siste trinn er imidlertid adipoylacylaseenzymsystemet ikke tilstedeværende, dvs. at det ikke er dannet in situ i den opprinnelige fermenteringskultur.
Dersom den nye, biologiske fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse utføres på en satsvis måte, vil det være nødvendig å isolere og delvis rense produktet fra det første trinn, og preliminære prosedyrer for å utføre dette er allerede beskrevet ovenfor.
Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan likevel utføres på enhver måte som effektivt bringer adipoylacylasen i kontakt med adipoyl-7-ADCA, slik at enzymatisk omdannelse av denne forbindelse til 7-ADCA kan finne sted. Dette er definisjonen på betegnelsen "bringes i kontakt med" i sin bredeste sammenheng. Det er mulig å anvende en cellefri nær-ingsløsning av urenset adipoyl-7-ADCA som tilførselsstrømmen, og behandle denne på en satsvis måte med urenset adipoylacyl-aseløsning. Denne fremgangsmåte gir noe nyttevirkning fordi den ikke fordrer noen vesentlig rensing av reaktantene på for-hånd. Modifikasjoner er selvsagt mulige. Reaktantene kan f.eks. renses i enhver ønsket grad før de bringes i kontakt med hverandre. Det vil også være mulig å utføre fremgangsmåten på en kontinuerlig måte i stedet for en satsvis måte. Måten selve reaktantene bringes i kontakt med hverandre på, kan modifiseres på forskjellige måter i overensstemmelse med prosessteknologiske fremskritt. Et immobilisert enzym kan således anvendes, f.eks. i form av en kolonne inneholdende adipoylacylasen og hvor adipoyl-7-ADCA passeres gjennom kolonnen. Det immobiliserte enzym kan også tilsettes til adipoyl-7-ADCA-oppløsningen som en suspensjon. Slike immobiliserte enzymsys-temer gir fordelene med lett gjenvinning av enzym og mange gangers gjenbruk. Et annet eksempel på en slik prosesstekno-logi er den som angår membranreaktorer. Den foretrukne metode for å bringe reaktantene i kontakt med hverandre, er ved hjelp av den immobiliserte enzymkolonne.
Adipoylacylaseenzymer anvendelige i spaltningstrinnet
Det foreligger et stort antall enzymer med kjent
spesifisitet overfor adipoylsidekjeder. Resultater erholdt med en adipoylacylase, kommersielt tilgjengelig fra RAEV Corp., er beskrevet i detalj i de etterfølgende arbeidseksempler. Det er rapportert syv andre enzymer i litteraturen som fjerner adipoylsidekjeder fra molekyler av cefalosporintypen. Seks av disse syv enzymer er fra Pseudomonas-arter, og det syvende er fra en Bacillus-art. Noen likheter foreligger mellom visse av Ps eudomonas-enzymene, men alle syv atskiller seg i noen grad i sine fysiske/biologiske egenskaper. Noen av deres karakteristika er oppsummert nedenfor:
Alle de ovenfor angitte adipoylacylaseenzymer er anvendelige ved den nye, biologiske fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Andre adipoylacylaser anvendelige ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, kan lett påvises ved å teste det aktuelle enzym mot adipoyl-7-ADCA, det aktuelle substrat som enzymet må virke på. Et positivt resultat gir en pålitelig og reproduserbar metode for å bestemme at et aktuelt enzym virkelig er anvendelig ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Substratet kan fremstilles på en enkel måte fra reaksjonen av adipinsyreanhydrid med 7-ADCA ved anvendelse av en modifikasjon av prosedyren rapportert av Szewczuk og Wellman-Bednawska i Clin. Chim. Acta (1978) 84, 19-16. Adipinsyreanhydrid kan fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge Albertson og Lundmark beskrevet i J. Macromol. Sei. Chem. (1990) A27, 397-412. 7-ADCA er tilgjengelig fra flere kommersielle kilder, inkludert E. R. Squibb & Sons, Ltd., NJ, og Interchetn Corp.,
NJ.
Dersom det er ønskelig å utføre en grov screening av aktuelle enzymer ved anvendelse av en hurtig kolorimetrisk metode, kan adipoyl-7-ADCA-substratet erstattes med et kolorimetrisk substrat, slik som adipoyl-PABA (para-aminobenzosyre) eller adipoyl-PNA (para-nitroanilin). Spaltning av sidekjeden gir en fargefrembringende art hvis tilstedeværelse og konsentrasjon lett bestemmes ved anvendelse av et kolorimeter. For mer detaljert informasjon angående disse og andre egnede kolorimetriske metoder, se Marelli, L.P. (1968), J. Pharm. Sei. 57: 2172-2173; Szasz, G. (1969), Clin. Chem. 15: 124-136; Szewczuk, A. et al. (1980), Anal. Biochem. 103: 166-169 og Reyes, F. et al. (1989), J. Pharma. Pharmacol. 41: 136-137.
Det ble utført en sammenligning mellom de N-terminale aminosyresekvenser av RAEV-enzymet og de store subenheter av acyll og GK16-enzymene oppført i tabellen ovenfor. Resultatene fra sammenligningen er vist nedenfor (hvor parenteser indi-kerer usikre bestemmelser):
Fra de viste sekvenser fremgår det at alle tre av disse peptider er beslektet. Et protein med en N-terminal sekvens lignende de vist ovenfor, vil imidlertid ikke nødvendig-vis besitte adipoylacylaseaktivitet, noe som er tilfelle med penicillin G-acylase produsert av en stamme av Ærtiirabacter. På den annen side foreligger det adipoylacylaser anvendelige ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse som ikke oppviser signifikant homologi med den ovenfor angitte N-terminale sekvens. Asahi-enzymet acyl og Fujisawa B. laterosporus Jl-acylasen oppført i tabellen ovenfor, som er vist å ha noe adipoyl-7-ADCA-acylaseaktivitet, deler f.eks. ingen sekvens-homologi med de andre enzymer anført ovenfor. Rammen for foreliggende oppfinnelse, med hensyn til adipoylacylaser anvendelige i det andre trinn av den nye biologiske fremgangsmåte, bestemmes således av hvorvidt et aktuelt enzym er i stand til å spalte adipoylsidekjeden fra adipoyl-7-ADCA eller ikke, et spørsmål som kan løses lett og pålitelig som beskrevet i detalj ovenfor.
Andre metoder for å finne egnede adipoylacylaser er mulige. EPA-A-0 453 048 beskriver f.eks. metoder for å for-bedre adipoyl-spaltningsaktiviteten av glutarylacylasen produsert av Pseudomonas SY-77-1. Ved å bytte ut forskjellige aminosyrer ved bestemte steder innen alfa-subenheten, ble det observert en tre til fem ganger høyere adipoylspaltningshas-tighet (fra adipoyl-serin). Slike forbedrede enzymer vil også være egnede for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse. Det bør bemerkes at selv om EP-A-0 453 048 tilsynelatende demonstrerer en acylase med forbedret aktivitet overfor adipoylsidekjeder, gir den ingen beskrivelse av noen måter (hverken kjemiske eller gjennom en biologisk prosess på noen måte analog med den beskrevne i foreliggende patentsøknad) hvori et cefalosporin i utgangspunktet kan dannes.
Eksempel 1
Dyrkningsbetingelser for Penicillium chrysogenum
Den anvendte Penicillium chrysogenum-stamme i disse prosedyrer ble opprettholdt på plater inneholdende LCSB-medium sammensatt av laktose, monohydrert, 1,5% (vekt/volum); mais-støpevæske, 0,5% (volum/volum); pepton, 0,5% (vekt/volum); NaCl, 0,4% (vekt/volum); MgS04-7H20, 0,05% (vekt/volum); KH2P04, 0,06% (vekt/volum) ; FeCl3-6H20, 0,0005% (vekt/volum); CuS04-5H20, 0,0002% (vekt/volum); agar, 3,0% (vekt/volum); i 1 liter destillert vann, pH 4,8. Etter 12 dager ved 25°C og 65% relativ fuktighet ble enkle kolonier fjernet og tilsatt til 2 ral sterilisert vann i et rør med skrukork inneholdende glasskuler. Etter utbløtning av kulturen ved hvirvling ble suspensjonen anvendt for å inokulere riskolber. Riskolbene inneholdt 25 g/250 ml kolbe Uncle Ben's konverterte ris, naturlig lang-kornet, som var vasket med 3 til 4 volumer destillert vann i 7 minutter, blandet hvert 30. sekund, og deretter drenert inntil vannopptaket i risen var ca. 25%. Etter 12 dager ved 25°C og 65% fuktighet ble sporene vasket bort fra risen med 50 ml sterilt vann. Sporesuspensjonen ble anvendt for å inokulere flytende kulturer og også for å tilveiebringe lyofiler av kulturene for lagring ved 4°C. Sporene ble tilsatt til et like stort volum 5% skummet melk og lyofilisert i sterile ampuller.
En totrinns-fermentering av stammen i ristekolber ble anvendt for produksjon av penicilliner, eller for produksjon av mycel som en kilde for RNA eller DNA. Frøstadiet ble initiert ved tilsetning av 1 x 10B sporer til 50 ml/500 ml kolbe med medium sammensatt av glukose, 3,0% (vekt/volum); farmamedia, 1,0% (vekt/volum); maisstøpevæske, 3,0% (volum/volum); ammoniumsulfat, 0,2% (vekt/volum); CaC03# 0,5% (vekt/volum); vannfritt monokaliumfosfat, 0,05% (vekt/volum); laktose, 1,0%
(vekt/volum); primær tørrgjær, 1,0% (vekt/volum) i 1 liter destillert vann. Inkubasjon ble utført ved 25°C og 65% relativ fuktighet på et rotasjonsristeapparat med en amplitude med diameter 70 mm ved 220 rpm. Etter 48 timers inkubasjon ble produksjonstrinnet initiert ved å overføre 2 ml vegetativt frø til 35 ml/500 ml kolbe med medium med følgende sammensetning: KH2P04, 0,05% (vekt/volum); K2S04, 0,5% (vekt/volum) ; (NH4)2S04, 1,0% (vekt/volum); laktose, 12,0% {vekt/volum); farmamedia, 2,75% (vekt/volum); CaC03 (utfelt), 1,0% (vekt/volum); spekk-olje, 1,0% (volum/volum) i 1 liter destillert vann, pH 6,6. Etter autoklavering, men før inokulering, ble sterilt 25% natriumadipat (pH 6,6) tilsatt for å gi en sluttkonsentrasjon av natriumadipat på 2,5%. Inkubasjon, etter inokulering, ble deretter fortsatt under de samme betingelser som for frø-stadiet i 5 til 7 dager.
Når det var behov for mycel for å danne protoplaster for transformasjon, eller som en kilde for DNA, ble stammen dyrket i 50 ml/250 ml kolbe med komplett medium (CM) sammensatt av: 50 ml 20X Clutterbucks salter (120 g Na2N03, 10,4 g KC1, 10,4 g MgS04-7H20, 30,4 g KH2P04) , 2,0 ml Vogels sporelementer (0,3 M sitronsyre, 0,2 M ZnS04, 25 mM Fe (NH4) 2 (S04) 3-6H20, 10 mM CuS04, 3 mM MnS04, 8 mM borsyre, 2 mM Na2Mo04-2HaO) , 5 g trypton, 5 g gjaerekstrakt, 10 g glukose, i 1 liter destillert vann. Inkubasjonen foregikk ved 25°C på et rota-sjonsriste-apparat ved 220 rpm.
Eksempel 2
Isolering av genom- DNA og totalt RNA fra Penicillium
Det vegetative mycel fra en 48-timers kultur fremstilt som beskrevet ovenfor, ble innsamlet ved filtrering gjennom osteklede, nedfrosset i flytende nitrogen og lyofilisert over natten. Det tørkede mycel ble malt med sand ved hjelp av en morter og pistill og resuspendert i 25 ml 100 mM LiCl, 50 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,0 og 4% SDS. Etter oppvarming av suspensjonen til 50-55°C i et vannbad ved 60°C ble blandingen først ekstrahert med 1 M Tris (pH 8), mettet fenol, etterfulgt av Tris-mettet fenol:kloroform (1:1, volum:volum) og deretter kloroform. RNA ble utfelt fra den vandige fase ved tilsetning av et like stort volum kald 6 M LiCl, og deretter ble blandingen oppbevart ved -20°C i 2 til 3 timer. Etter sentrifugering ved 12.000xg i 20 minutter ved 4°C ble supernatanten tilsatt etanol til en konsentrasjon på 66% (volum/volum) og avkjølt til -20°C i 15 minutter for å utfelle DNA. Etter sentrifugering som beskrevet ovenfor, ble DNA-pelleten vasket med 70% etanol, tørket og resuspendert i TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA). DNA-konsentrasjonen ble beregnet ved sammenligning med kjente DNA-standarder etter farging med etidium-bromid i agarosegelelektroforese.
Kulturer av Penicillium chrysogenum,, som beskrevet
ovenfor i eksempel 1, ble dyrket i 96 timer i 35 ml fermenter-ingsmedium (fermenteringsbetingelser som tidligere beskrevet), ved 25°C på et rotasjonsristeapparat ved 220 rpm. Mycel ble innsamlet ved filtrering gjennom et Whatman nr. 1 filter under vakuum og vasket med ca. 50 ml vann. Myceliet ble umiddelbart
skrapt bort fra filteret, resuspendert i 5 ml "avbrytnings-buffer" (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8,0, 5% SDS), nedfrosset i flytende nitrogen og lyofilisert. Etter lyofilisering over natten ble det tilsatt 5 ml vann inneholdende 0,1% DEPC og 5 ml 1 M Tris (pH 8) mettet fenol:kloroform:isoamylalkohol (50:50:1), og blandingen ble hensatt for tining ved 37°C i 20 minutter under omrøring. Blandingen ble sentrifugert ved 12.000xg i 10 minutter ved 4°C, og det vandige lag ble fjernet og først reekstrahert med IM Tris (pH 8) mettet fenol:kloroform:isoamylalkohol (50:50:1), og deretter med 1 M Tris (pH 8) mettet fenol, og til slutt med kloroform. Et like stort volum 6 M LiCl ble kom-binert med det siste vandige lag, og oppløsningen ble hensatt ved -20°C i minst 4 timer. Det totale RNA ble pelletert ved 12.000xg i 20 minutter ved 4°C, pelleten ble oppløst i 0,3 ml TE-buffer pluss 0,03 ml 3 M natriumacetat, og 2,5 volumer etanol ble tilsatt for å gjenutfelle RNA. Den endelige pellet ble oppløst i 0,1 ml TE-buffer, og RNA-konsentrasjonen ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av absorpsjon ved 260 nm.
Eksempel 3
Dyrkningsbetingelser for Streptomyces clavuligerus
Streptomyces clavuligerus-stammen anvendt i disse prosedyrer, var ATCC 27064. Stammen ble opprettholdt på plater bestående av: gjærekstrakt, 4 g; maltekstrakt, 10 g; glukose, 4 g; agar, 20 g; i 1 liter destillert vann, pH 7,2. Etter 5 dagers dyrkning ved 30°C ble 2 ml sterilt vann tilsatt til platene, og kulturen ble skrapt bort fra agaroverflaten. Den resulterende suspensjon ble overført til et sterilt rør med skrukork inneholdende glasskuler. Etter utbløting av kulturen ved hvirvling ble suspensjonen anvendt for å inokulere flytende kulturer. Suspensjonen ble også anvendt for permanent lagring av kulturer ved -70°C ved tilsetning av glyserol til et sluttvolum på 15%.
Når det var behov for mycel for å danne protoplaster for transformasjon eller som en kilde for DNA, ble stammene dyrket i 200 ml/l liter kolbe YEME-medium sammensatt av: gjærekstrakt, 3 g; pepton, 5 g; maltekstrakt, 3 g; glukose, 10 g; sukrose, 340 g; MgCl2-6H20, 1,02 g; glysin, 5 g; agar, 18 g; i 1 liter destillert vann. Inkubasjon ble utført ved 28°C på et rotasjonsristeapparat ved 220 rpm.
Eksempel 4
Isolering av genom- DNA fra Streptomyces
Det vegetative dyrkningsprodukt fra en 48-timers kultur, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble innsamlet ved sentrifugering ved 22.100xg i 10 minutter. Cellene ble resuspendert i 10 ml TE-buffer, 10 mg lysozym ble tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 3 0°C i 15 minutter. 1 ml 20% SDS ble deretter tilsatt, umiddelbart etterfulgt av'10 ml TE (pH 8) mettet fenol og 1,5 ml 5 M NaCl, og blandingen ble forsiktig invertert i 2 0 minutter. Fasene ble atskilt ved 12.000xg i 10 minutter, hvoretter det vandige lag ble fjernet og overført til et nytt rør. Et like stort volum kloroform ble tilsatt, og blandingen ble forsiktig invertert i 10 minutter. Fasene ble på nytt atskilt ved sentrifugering ved 12.000xg i 10 minutter, og det vandige lag ble fjernet og på nytt overført til et nytt rør. 2 volumer isopropanol ble forsiktig tilsatt, og det ut-felte DNA ble oppspolet og på nytt oppløst i et minimalt volum TE-buffer. RNAse A ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 20 mg/ml, og oppløsningen ble inkubert ved 50°C i 1 time. Prote-ase K ble deretter tilsatt til en sluttkonsentrasjon på
100 mg/ml, sammen med 100 mM NaCl og 0,4% SDS, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 1 time. Oppløsningen ble ekstrahert på nytt med et like stort volum TE (pH 8) mettet fenol, etterfulgt av en ny ekstrahering med kloroform. DNA fra den siste ekstrahering ble oppspolet etter tilsetning av 2 volumer isopropanol, og konsentrasjonen ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av en absorpsjonsavlesning ved 2 60 nm.
Eksempel 5
Konstruksjon av et genbibliotek og isolering av et DNA- fragment inneholdende Streptomyces clavuligerus- ekspandasegenet
Genom-DNA fra Streptomyces clavuligerus erholdt fra den tidligere beskrevne prosedyre, ble oppsluttet med restriksjonsenzymene Barn HI og Sal I. Det oppsluttede DNA ble under-kastet elektroforese på en 0,8% agarosegel, og fragmenter med størrelse 1,8 til 2,2 kb ble eluert og ligert med pUC18-DNA som tidligere var oppsluttet med Barn HI og Sal I. Fortynninger av ligeringsblandingen ble anvendt for å transformere kompetente JM109-celler ved anvendelse av elektroporering ("Gene Pulser", Bio-Rad, Richmond, CA). Fremstilling av de kompetente celler og elektroporeringsbetingelser var begge i overensstemmelse med produsentens anvisninger. Transformeringsblandingen ble utspredt på LB-plater inneholdende 100 mg/ml ampicillin, og 75 ml 2% X-Gal. Etter inkubasjon over natten ved 37°C ble rekombinante kolonier identifisert ved hjelp av deres farge-løse utseende på grunn av inaktivering av plasmidvektorens beta-galaktosidasegenaktivitet. De fargeløse kolonier ble ut-plukket og overført til en ny LB-plate inneholdende 100 mg/ml ampicillin. Etter dyrkning over natten ved 37°C ble koloniene overført til nitrocellulose og hybridisert med en probe fremstilt ved hjelp av en polymerasekjedereaksjon som tilsvarte den publiserte Streptomyces clavuligrerus-ekspandasegensekvens fra baser 52-918 [Kovacevic et al. (1989), J. Bacteriol. 171: 754-760 og US 5 070 020]. Merking av polymerasekjedereaksjons-produktet ble oppnådd ved vilkårlig primerutvidelsesreaksjon med (<32>P) dCTP og et oligomerkingssett, etter produsentens instruksjoner. Hybridiseringsreaksjonen ble utført i nærvær av 10<6> cpm radiomerket probe, 30% formamid, 5X SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M natriumsitrat, pH 7), 0,1% SDS, 5X Denhardts (5 g ficoll, 5 g polyvinylpyrrolidon og 5 g BSA for 500 ml 50X stamløsning) og 100 mg/ml kalvethymus-DNA, ved 37°C over natten. Flere transformanter hybridiserte sterkt med proben. En koloni ble ved hjelp av restriksjonsenzymanalyse bekreftet å inneholde en vektor som bærer ekspandasegenet, og dette plasmid ble betegnet pFTSO-1.
Eksempel 6
Isolering av plasmid- DNA
E. coli-kulturer inneholdende plasmidet, ble dyrket i 500 ml LB-næringsløsning (20 g/l LB-stamløsning, Gibco, Paisley, Skottland), med 15 mg/ml tetrasyklin på et rotasjonsristeapparat ved 220 rpm i 12-16 timer ved 37°C. Cellene ble pelletert ved sentrifugering ved 4.000xg i 10 minutter ved 4°C. Cellepelleten ble resuspendert i 18 ml glukosebuffer (50 mM glukose, 25 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA), og 2 ml 40 mg/ml lysozym (Sigma, St. Louis, MO) i glukosebuffer ble tilsatt, blandet, og blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 15 minutter. 40 ml av en nypreparert oppløsning av 0,2 N NaOH og 1% SDS ble tilsatt, og blandingen ble forsiktig hvirvlet og plassert på is i 10 minutter. 30 ml 5 M kaliumacetat, pH 4,8, ble deretter tilsatt, blandet godt, og den dannede blanding ble plassert på is i ytterligere 10 minutter. Det nedbrutte cellemateriale ble pelletert ved sentrifugering ved 4.000xg i 10 minutter ved 4°C, og supernatanten ble filtrert gjennom et osteklede. Isopropanol (0,6 volumer) ble tilsatt til den klar-ede supernatant for å utfelle plasmid-DNA, og bunnfallet ble dannet under inkubasjon ved romtemperatur i 20 minutter. Plasmid-DNA ble pelletert ved 4.000xg i 20 minutter ved 4°C og deretter vasket med 70% etanol og tørket i kort tid. Pelleten ble resuspendert i 9 ml TE-buffer, og deretter ble det tilsatt 10 g CsCl og 0,387 ml av en 10 mg/ml etidiumbromidoppløsning. Denne oppløsning ble sentrifugert ved 313.100xg i 24 timer. Det resulterende plasmidbånd i cesiumkloridgradienten ble vis-ualisert med ultrafiolett lys, isolert, og deretter ble etidi-umbromidet fjernet ved ekstrahering med vannmettet butanol. CsCl i plasmidpreparatet ble deretter fjernet ved dialyse mot TE-buffer, og til slutt ble DNA konsentrert ved anvendelse av PEG (molekylvekt 8.000). Konsentrasjonen av DNA ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av en absorpsjonsavlesning ved 260 nm.
Eksempel 7
Konstruksjon av Penicillium - transformasjonsvektoren pPenFTSO
En Penicillium-transformasjonsvektor ble konstruert med et fleomycinresistent gen som en dominerende, velgbar mar-kør. Dette ble oppnådd ved først å isolere et 660 bp fragment inneholdende fleomycinresistensgenet (et fleomycinbindingspro-teingen fra Streptoalloteichus hindustanus) og også koblet til en gjær-cytokrom Cl-terminator fra en Barn HI/Bgl II-oppslutning av plasmid pUT713 (CAYLA, Toulouse Cedex, Frankrike) ved elektroforese av et eluat fra agarosegeler. Det isolerte fragment ble ligert i Barn HI-setet av vektor pSELECT<*> 1 (Promega Corporation), og orienteringen av genet ble bestemt ved restriksjonsenzymanalyse. Deretter ble et 550 bp Pst I-fragment inneholdende lambda cos-setet, innføyet, hvilket muliggjør at vektoren kan anvendes for kosmiddannelse når innføyelser med passende størrelse inkluderes. Deretter ble et 1,5 kb Nco I/Barn HI-fragment, inneholdende promotorområdet av Penicillium chrysogenum-isopenicillin N-syntetase-(IPNS)-genet, isolert
(ved elektroforese på og eluering fra agarosegeler) fra en Nco I/Barn HI-oppslutning av en genom-klon inneholdende IPNS-genet. Det isolerte IPNS-promotorfragment ble ligert i den Barn HI/Nco I-oppsluttede vektor. Nco I-setet befinner seg ved ATG-startkodonet av fleomycinresistensgenet. Denne vektor er betegnet pUTZ-2.
1,645 kb-fragmentet inneholdende Streptomyces clavuligrerus-ekspandasegenet, ble renset fra en Barn HI- og Sal I-oppslutning av pFTSO-1 (tidligere beskrevet vektor) ved elektroforese på og eluering fra en 0,8% agarosegel. Det isolerte fragment ble ligert i vektor pSELECT (Promega Corporation) som også var oppsluttet med Barn HI og Sal I. Denne vektor ble betegnet pFTSO-8. Et nytt Nco I-sete ble dannet ved ATG-startkodonet av ekspandasegenet ved setestyrt mutagenese av pFTSO-8 ved anvendelse av Altered Sites<*> in vitro-mutagenesesystemet (Promega Corporation). Mutagenese ble utført etter produsentens instruksjoner. Et oligonukleotid ble konstruert for å komplementere kodingssekvensen av DNA-området ved ATG-startkodonet fra den publiserte sekvens for Streptomyces-ekspandasegenet (Kovacevic et al. (1990), Journal of Bacteriology, 171, s. 3952-3958). Oligonukleotidet ble syntetisert ved hjelp av cyanoetylfosforamidittkjemi (Pharmacia Gene Assembler instrumentation), og oligonukleotidsekvensen var som følger:
Mutagenesen ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Deretter ble et 1,2 kb Nco I-fragment, inneholdende promotorområdet av Penicillium chrysogenum-isopenicillin N-syntetasegenet, isolert (ved elektroforese på og eluering fra agarosegeler) fra en Nco I-oppslutning av en genomklon inneholdende IPNS-genet. IPNS-promotorområdet ble ligert i pFTSO-8-vektoren ved det nye Nco I-setet dannet ved hjelp av mutagenesen ved ATG-startkodonet av ekspandasegenet. Orientering av promotoren til ekspandasegenet ble fastslått ved restriksjonsenzymanalyse. Denne IPNS-promotor:ekspandasegenkassett ble deretter flyttet som et Barn HI/Sal I-fragment inn i den Barn HI/Sal I-spaltede Penicillium-transformasjonsvektor pUTZ-2 beskrevet ovenfor. Den ferdige konstruksjon ble betegnet pPenFTSO.
Eksempel 8
Kloning av Penicillium- p- tubulinpromotoren
Penicillium-p-tubulingenet ble klonet fra et Penicillium-lambda-genombibliotek ved anvendelse av Aspergillus niger-$-tubulingenet som en hybridiseringsprobe. Sekvensering av denne klon og sammenligning med den kjente aminosyresekvens av p-tubulingenet fra Aspergillus niger identifiserte et område med 91% homologi med start med ATG-initieringskodonet. Sekvenser som omfatter en funksjonell promotor, ble isolert mellom initieringskodonet og et Barn HI-sete 1,4 kb oppstrøms.
Konstruksjon av transformasjonsvektoren som bærer Penicillium -
{3-t ubu 1 i np r omo toren
Et 2,0 kb Xba I/Hind III-fragment inneholdende Penicillium-p-tubulinpromotoren, ble ligert i vektoren pSELECT (Promega Corporation) som også var oppsluttet med Xbal/Hind III. Et nytt Nco I-sete ble dannet ved ATG-startkodonet ved hjelp av setestyrt mutagenese ved anvendelse av Altered Sites in vivo-mutagenesesysternet (Promega Corporation). Mutagenese ble utført etter produsentens instruksjoner. Det ble konstruert et oligonukleotid komplementært med ATG-startseteområdet, men som inkorporerte flere endringer for å danne et Nco I-sete, og dette ble anvendt for mutagenese. Oligonukleotidet ble syntetisert ved hjelp av cyanoetylfosforamidittkjemi (Pharmacia Gene Assembler instrumentation), og oligonukleotidsekvensen var som følger:
Mutagenesen ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Deretter ble et 1,4 kb Barn HI/Nco I-fragment inneholdende Penicillium-p -tubulinpromotoren, ligert med et konstruert Nco I-sete ved ATG i Streptomyces-ekspandasegenet i den Barn HI/Nco I-oppsluttede vektor pFTSO-8 (en vektor tidligere beskrevet i eksempel 7). Denne vektor ble betegnet btFTSO-8. 1,4 kb Barn HI/Nco I-fragmentet inneholdende £J-tubulinpromotoren, ble også ligert i en Barn HI/Nco I-oppsluttet vektor pUTZ-2 (en vektor tidligere beskrevet i eksempel 7). Denne ligering posisjonerte p-tubulinpromotoren direkte foran fleomycinresistensgenet. Denne vektor ble betegnet pCI-6. Et 2,4 kb Barn HI/Hind III-fragment fra vektor btFTSO-8 som inneholdt p-tubulinpromotor-ekspandasegenkassetten, ble deretter ligert med en Barn Hl/Hind III-oppsluttet vektor pCI-6 for å gi den endelige Penicillium-transformasjonsvektor hvori Streptomyces-ekspandasegenet og fleomycin-resistensmarkøren ble uttrykt fra p-tubulinpromotoren. Denne vektor ble betegnet pTS-2.
Eksempel 9
Kloning av Penicillium -( GAP)- promotoren
Penicillium-glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase-(GAP)-genet ble klonet fra et Penicillium-lambda genom-bibliotek ved anvendelse av GAP-genet fra Aspergillus niger som en hybridiseringsprobe. Fire potensielt positive prøver ble ytterligere probet med et PCR-produkt dannet fra primere for 5'-området av Cephalosporium-GAP-genet (Kimura, H. et al.,
(1991), J. Ferm. and Bioeng., 71, 145-150). De anvendte oligo-nukleotider for primerne av polymerasekjedereaksjonen (PCR) ble syntetisert ved hjelp av cyanoetylfosforamidittkjemi (Pharmacia Gene Assembler instrumentation), og oligonukleotid-sekvensene er som følger: En av de fire antatt positive prøver krysshybridiserte med PCR-produktet. Et 4 kb Bam HI-fragment fra denne genomklon ble ligert i Bam HI-oppsluttet vektor pSELECT (Promega Corporation) for sekvensering. Denne vektor ble betegnet pTS-O. Sekvensering av dette fragment identifiserte ATG-initieringskodonet ved sammenligning med den kjente sekvens av cefalosporin-GAP-genet.
Konstruksjon av transformasjonsvektoren som bærer Penicillium - GAP- promotoren
For å konstruere Penicillium-GAP-promotoren med Streptomyces-ekspandasegenet ble et nytt Nco I-sete dannet ved ATG i Penicillium-GAP-genet ved hjelp av in vitro setestyrt mutagenese ved anvendelse av vektor pTS-O. Mutagenese ble ut-ført etter produsentens instruksjoner. Det ble konstruert et oligonukleotid komplementært med kodingssekvensen av DNA-området ved GAP-genets ATG-startkodon, men baseendringer ble inkorporert for å danne et Nco I-sete. Oligonukleotidet ble syntetisert ved hjelp av cyanoetylfosforamidittkjemi (Pharmacia Gene Assembler instrumentation), og oligonukleotidsekvensen var som følger:
Mutagenese ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Et
1,9 kb Ncol/Bam HI-fragment fra pTS-O som inneholdt GAP-promotoren, ble deretter ligert med Ncol/Bam HI-oppsluttet vektor pFTSO-8 (en vektor tidligere beskrevet i eksempel 7) for å posisjonere GAP-promotoren med Streptomyces-ekspandasegenet. Denne vektor ble betegnet pTS-0-1. Et 3,0 kb Bam HI/Hind III-fragment fra vektor pTS-0-1 som inneholdt GAP-promotoren: ekspandasekassetten, ble deretter ligert med Bam Hl/Hind III-oppsluttet vektor pCI-6 (en vektor tidligere beskrevet i eksempel 8) for å gi den endelige Penicillium-transformasjons-
vektor pSD-1 hvori Streptomyces-ekspandasegenet ble uttrykt fra GAP-promotoren.
Eksempel 10
Transformasjon av Penicillium chrysogenum
Protoplaster fra Penicillium chrysogenum-stammen beskrevet ovenfor, ble dannet ved inokulering av 50 ml CM-nær-ingsløsning med 1 x 10<7> sporer i 67 timer ved 25°C på et rotasjonsristeapparat ved 22 0 rpm. Myceliet ble innsamlet ved filtrering gjennom ostekledefiltere, overført til 500 ml kolber og resuspendert i 25 ml KMP (0,7 M KCl, 0,8 M mannitol, 0,02 M KP04, pH 6,3), inneholdende 100 mg "Novozyme<*> 234" (Novo Bio-Labs, Bagsværd, Danmark) og inkubert ved 30°C ved 100 rpm. Sfæroplastene ble atskilt ved filtrering gjennom osteklede/- glassullfiltere og pelletert ved sentrifugering ved 350xg i 10 minutter. Sfæroplastene ble deretter vasket tre ganger med
10 ml KMP-buffer og deretter resuspendert i KMPC (KMP med
50 mM CaCl2) til en konsentrasjon på 5 x 10<1> celler/ml og hensatt ved romtemperatur i 20 minutter. For transformasjon av Penicillium ble 200 ml av sfæroplastsuspensjonen tilsatt til DNA ('5 mg vektor-DNA i 6,2 ml KMPC med 5 mg/ml heparin) sammen med 50 ml PPC (40% PEG molekylvekt 3500, 20 mM KP04, pH 6,3, 5% CaCl2 ble tilsatt like før anvendelse), og transformasjonsblandingen ble inkubert på is i 30 minutter. 1 ml nypreparert PPC ble tilsatt, og blandingen ble overført til 50 ml smeltet (50°C) regenereringsagar (CM pluss 1,3 M mannitol og 3% agar). Transformasjonsblandingen ble deretter fordelt mellom 5 petri-skåler. Etter regenerering i 24 timer ved 25"C ble platene deretter dekket med OL (1% pepton i 1% agar) inneholdende 100 mg fleomycin/50 ml OL. Mengden av dekkmateriale var like stor som mengden av regenereringsagar. Platene ble inkubert ved 25°C i 7-14 dager og observert for dannelse av transfor-mante kolonier.
Eksempel 11
HPLC- analyser av adipoyl- 6- APA- og adipoyl- 7- ADCA- fermenter-ingsprodukter
Høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) ble anvendt for å analysere produksjonen av adipoyl-6-APA i den anvendte, utransformerte P. chrysogenum-stamme, og produksjonen av adipoyl -7-ADCA i den anvendte, transformerte P. chrysogenum-stamme. Analysene ble utført på Waters system med løsningsmid-delutleveringssystem 625, 490E variabel bølgelengdedetektor innstilt ved 220 nm og 2 54 nm, 82 5 Maxima datasystem og en
Novo-C18-kolonne som den stasjonære fase. Den mobile fase (ved en gjennomstrømningshastighet på 1 ml/min.) besto av en 5-minutters isokratisk 2% metanol/98% 0,010 M KH2P04, pH 7,0, og en 15-minutters 2 til 40% lineær gradient av metanol/0,010 M KH2P04, pH 7,0. Mengdebestemmelse av adipoyl-6-APA ble utført ved anvendelse av en standardkurve av standarden penicillin N ved 220 nm, og mengdebestemmelsen av adipoyl-7-ADCA ble utført ved anvendelse av en standardkurve av standarden deacetoksycefalosporin C ved 254 nm.
Analyser for mottakeligheten av adipoyl-6-APA og adipoyl-7-ADCA for penicillinasebehandlinger ble utført ved tilsetning av 1 enhet/ml penicillinase I eller penicillinase III til filtrater og inkubasjon ved romtemperatur i 10-30 minutter. Disse analyser ble utført under identiske HPLC-betingelser som beskrevet ovenfor.
UV-spektrumanalyse av adipoyl-6-APA- og adipoyl-7-ADCA-produktene ble utført ved anvendelse av et Waters system med løsningsmiddelutleveringssystem 510, fotodiodeseriedetektor 990, datasystem 990 og en Novo-Cl8-kolonne som den stasjonære fase. Den anvendte, mobile fase var identisk med den ovenfor beskrevne.
Isolering i stor skala av adipoyl-7-ADCA-produktet fra fullstendig fermenteringsløsning ble utført ved anvendelse av et Waters system med løsningsmiddelutleveringssystem 510, fotodiodeseriedetektor 990, datasystem 990 og en mBondapak C18 preparativ kolonne som den stasjonære fase. Den mobile fase (ved en gjennomstrømningshastighet på 5 ml/min.) besto av en isokratisk 0,010 M KH2P04, pH 7,0, i 35 minutter. Absorpsjons-toppen som tilsvarte retensjonstiden for adipoyl-7-ADCA-produktet, ble innsamlet ved anvendelse av en fraksjonssamler.
Analyser på biologisk aktivitet
En agardiffusjonsbioanalyse ble anvendt for å bestemme antibiotisk aktivitet av de HPLC-isolerte adipoyl-6-APA-og adipoyl-7-ADCA-fermenteringsprodukter. 2 0 ml isolert produkt ble applisert på 5 mm skiver på en LB-agarplate
(20 g/l LB-næringsløsningsbase med 3% agar (Gibco, Paisley, Skottland) sådd med Bacillus subtilis ATCC 33677, eller E. coli supersensitiv stamme (levert av prof. Arnold L. Demain, MIT). Bacillus subtilis ble anvendt som indikatorstamme for å bestemme adipoyl-6-APA-produktet, og den E. coli supersensi-tive stamme ble anvendt som indikatorstamme for å bestemme adipoyl-7-ADCA-produktet. Etter 15 timers inkubasjon ved 37°C indikerte en ring av inhibert vekst av indikatorbakteriene rundt skiven, produktene som viste biologisk aktivitet. Kon-trollene i dette eksperiment inkluderte deacetoksycefalosporin C, cefalosporin C, penicillin V og agar inneholdende penicillinase eller uten penicillinase, som en kontroll på bekreft-else av p-laktamstrukturer.
Eksempel 13
RAEV- enzymanalyser
Renset adipoyl-7-ADCA-produkt fra fullstendig fermen-teringsløsning ble anvendt som et substrat for å bestemme den spesifikke aktivitet av RAEV-enzymet (kommersielt tilgjengelig fra RAEV Corp.). Reaksjonsblandingen inneholdt 10 mM substrat, 1 mg RAEV-enzym, 5% glyserol, i 0,16 M KH2P04 i et totalvolum på 50 ml, og ble inkubert ved 37°C. 5 ml aliquoter ble tatt ved tidspunktene 0, 1, 3, 5, 10, 20 og 30 minutter, fortynnet med 35 ml 0,010 M KHaP04, pH 3,5, og nedfrosset ved -70°C før HPLC-analyse under tidligere beskrevne betingelser.
Aktiviteten av RAEV-enzymet overfor et kolorimetrisk adipoyl-P-aminobenzosyresubstrat ble bestemt ved anvendelse av 5 mM substrat, 8,2 5 mg RAEV-enzym, 10% glyserol, i 0,065 M KH2P04, pH 7,0, i et totalt volum på 50 ml i 30 minutter ved 37°C. Reaksjonen ble utført i en 96-brønners mikrotiterskål.
50 ml av en 1/100 fortynning av 1 M NaN02 i 0,25 M eddiksyre ble tilsatt for å stanse reaksjonen, og reaksjonsblandingen ble hensatt ved romtemperatur i 3 minutter. 100 ml av en 1/100 fortynning av 10 mg/ml 4-amino-5-hydroksy-2,7-naftalendisul-fonsyre-mononatriumsalthydrat i H20 i 0,5 M NaHC03 ble tilsatt,
og fargeutviklingen ble umiddelbart overvåket ved 515 nm ved anvendelse av en EL 312 biokinetisk plateavleser {BioTek Instruments).
Eksempel 14
HPLC- analyse av RAEV- enzymreaksjonsprodukt
Alle RAEV-enzymanalyser med anvendelse av adipoyl-7-ADCA-substratet som ble overvåket ved HPLC, ble utført ved anvendelse av et Waters system med løsningsmiddelutleverings-system 625, variabel bølgelengdedetektor 490E innstilt ved 203 nM og 254 nm, datasystem 82 5 Maxima, og en Novo-Cl8-kol-
onne som den stasjonære fase. Den mobile fase (ved en gjennom-strømningshastighet på 1 ml/min.) besto av en 5-minutters isokratisk 2% metanol/98% 0,010 M KH2P04, pH 3,5, og en 15-minut-
ters 2-40% lineær gradient av metanol/0,010 M KH2P04, pH 3,5. Standarden 7-ADCA ble anvendt for å overvåke retensjonstiden
av reaksjonsproduktet. Mengdebestemmelse av reaksjonsproduktet ble utført ved anvendelse av en standardkurve av standarden 7-
ADCA ved 254 nm.
Eksempel 15
13C- NMR- analyse av adipoyl- 7- ADCA- fermenteringsproduktet
<13>C-NMR- (bredt bånd proton-avkoblet) spektre ble erholdt ved 75,4 MHz (7,IT) på et 1BM-AF-350 spektrometer i Fourier transformeringsmodus. Prøvene besto av 50 mg adipoyl-7-ADCA-produkt fra fermenteringsløsning i 0,5 ml D20 (99,8% D, Aldrich), eller 0,5 ml DMS0-d6 (99,0% D, Aldrich), i 5 ml rør
ved 350°k. NMR-dataene bekreftet produktbetegneIsen som adipoyl -7-ADCA.
Eksempel 16
Vurdering av alternative adipoylacylaseenzymer
I tillegg til undersøkelsene med anvendelse av RAEV-enzymet ble fjerning av adipoylsidekjeden fra adipoyl-7-ADCA
(og andre adipoylforbindelser) demonstrert med enzymer produs-
ert av mange forskjellige mikrobielle kilder. I en innledende undersøkelse ble Pseudomonas sp.-stammer SE-83 og SE-495 (deponert hos Fermentation Research Institute, henholdsvis under aksesjonsnr. FERM BP-817 og FERM BP-818) og Pseudomonas-stamme SY-77-1 (deponert hos Northern Regional Research Laboratory under aksesjonsnr. NNRL B-8070) dyrket i 72 timer i et medium inneholdende HyCase SF, 2,0% (vekt/volum); mono-natriumglutamat, 0,5% (vekt/volum); gjærekstrakt, 0,5%
(vekt/volum); maisstøpepulver, 0,2% (vekt/volum); bomulls-frøolje, 0,5% (vekt/volum) og glutarsyre, 0,1% (vekt/volum). Celler ble høstet ved sentrifugering og vasket med 50 mM fosfatbuffer, pH 8,0; de ble deretter resuspendert i buffer, og de ytre membraner ble gjort permeable ved tilsetning av et lite volum kloroform. Aliquoter av cellesuspensjon ble deretter blandet med adipoyl-para-nitroanilin (ad-PNA) og inkubert ved 30°C i 2 til 18 timer. Etter inkubasjon ble blandingene surgjort ved tilsetning av 10% (volum/volum) eddiksyre. Frigjort p-nitroanilin ble deretter påvist ved kolorimetriske metoder etter at det var omdannet til en diazoforbindelse ved anvendelse av reagensene levert i settform av Sigma Chemical Company for analyse av gamma-glutamyl-transferase (Sigma produkt nr. 545-A). De relative aktiviteter for de tre stammer var 100%, 85,5% og 48%, for henholdsvis SE-495, SE-83 og SY-77-1. Ved anvendelse av lignende metoder som beskrevet for RAEV-enzymet ovenfor, ble aktivitet av SE-83- og SE-495-enzymene overfor adipoyl-7-ADCA også demonstrert. Produksjonen av beta-laktamase av SY-77-1 forhindret demonstrasjon av deacylerende aktivitet av denne stamme overfor adipoyl-7-ADCA.
Ved hjelp av lignende metoder ble adipoylacylase-produksjon også demonstrert for to soppstammer ( Alternaria sp. MA-133, ATCC nr. 20492 og Aspergillus sp. MA-13, ATCC nr. 2 04 91; ref. US 4 141 790, Meiji Seika Kaisha Ltd.) og tre ytterligere bakteriestammer (en BreviJbacterium, ATCC nr. 14.649; og Achromobacterium, ATCC nr. 14.648 og en Flavobac-terium, ATCC nr. 14.650) som ble beskrevet som produsenter av cefalosporin C-acylase i US 3 239 394, Merck & Co., Inc.
Claims (7)
1. Biologisk, fremgangsmåte for fremstilling av 7-aminodeacetoksycefalosporansyre (7-ADCA), karakterisert ved trinnene: a) opprettholdelse av en stamme av Penicillium chrysogenum som produserer isopenicillin N i et dyrkningsmedium som er i stand til å underholde dens vekst, hvoretter dyrkningsmediet tilsettes et adipat-råmateriale omfattende adipinsyre, eller ett eller flere av dets salter og estere som er i stand til å assimileres og utnyttes av stammen av Penicillium chrysogenum, hvori stammen av Penicillium chrysogenum er transformert ved hjelp av DNA som koder for et enzym med ekspandase-aktivitet, der enzymet er i stand til å akseptere adipoyl-6-APA som et substrat, hvori adipoyl-6-APA produsert av denne stamme, deretter også, som et resultat av dens ekspresjon, ringekspanderes in situ for å danne adipoyl-7-ADCA; og b) adipoyl-7-ADCA fremstilt i a), bringes i kontakt med en adipoylacylase, hvorved adipoylsidekjeden fjernes og produktet 7-ADCA dannes; og deretter c) isoleres det produserte 7-ADCA.
2. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at adipat-råmaterialet er dinatriumadipat.
3. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet, stammer fra Streptomyces clavuligerus ATCC 27064.
4. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at adipoylacylasen stammer fra en Pseudomonas-art.
5. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den anvendte Penicillium chrysogenum-stamme dyrkes ved temperaturer mellom 2 0 °C og 3 0 °C.
6. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at den anvendte Penicillium chrysogenum-stamme dyrkes ved ,en temperatur på 2 5 °C.
7. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det adipate råmaterialet kan tilsettes før eller, alternativt, etter inokulering med Penicillium chrysogenum, fortrinnsvis før inokuleringen.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US75787991A | 1991-09-11 | 1991-09-11 | |
US07/933,469 US5318896A (en) | 1991-09-11 | 1992-08-28 | Recombinant expandase bioprocess for preparing 7-aminodesacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA) |
PCT/US1992/007711 WO1993005158A1 (en) | 1991-09-11 | 1992-09-11 | Novel bioprocess for preparing 7-adca |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO940848D0 NO940848D0 (no) | 1994-03-10 |
NO940848L NO940848L (no) | 1994-03-10 |
NO316742B1 true NO316742B1 (no) | 2004-04-26 |
Family
ID=27116462
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19940848A NO316742B1 (no) | 1991-09-11 | 1994-03-10 | Biologisk fremgangsmate for fremstilling av 7-ADCA |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5318896A (no) |
EP (2) | EP0843013A3 (no) |
JP (2) | JP3027847B2 (no) |
KR (2) | KR0132440B1 (no) |
CN (2) | CN1066488C (no) |
AT (1) | ATE173017T1 (no) |
AU (1) | AU657787B2 (no) |
BG (1) | BG62177B1 (no) |
CA (1) | CA2077921C (no) |
CZ (1) | CZ287357B6 (no) |
DE (1) | DE69227494T2 (no) |
DK (1) | DK0532341T3 (no) |
ES (1) | ES2126588T3 (no) |
FI (1) | FI108148B (no) |
HU (1) | HU217171B (no) |
IL (1) | IL103076A (no) |
MX (1) | MX9205175A (no) |
NO (1) | NO316742B1 (no) |
NZ (1) | NZ244236A (no) |
RO (1) | RO115886B1 (no) |
RU (1) | RU2178808C2 (no) |
SK (1) | SK282387B6 (no) |
TW (1) | TW270149B (no) |
UA (1) | UA41292C2 (no) |
WO (1) | WO1993005158A1 (no) |
Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0233715B1 (en) * | 1986-01-31 | 1994-05-25 | BEECHAM GROUP plc | Isolation and expression of genes involved in the biosynthesis of beta-lactams |
US6709859B1 (en) | 1986-01-31 | 2004-03-23 | Beecham Group P.L.C. | Chromosomal DNA Fragments Encoding Enzymes for Encoding B-Lactam Biosynthesis Enzymes, and Vector and Transformants for Their Expression |
CZ288721B6 (cs) * | 1991-10-15 | 2001-08-15 | Dsm Gist B. V. | Biologický způsob výroby kyseliny 7-aminodeacetylcefalosporanové |
US5726032A (en) * | 1993-07-30 | 1998-03-10 | Gist-Brocades B.V. | Process for the efficient production of 7-ADCA via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-ADCA and 3-(carboxymethylthio)propionyl-7-ADCA |
JP3574453B2 (ja) * | 1993-07-30 | 2004-10-06 | ギスト ブロカデス ベスローテン フェンノートシャップ | 3‐(カルボキシエチルチオ)プロピオニル‐7‐adcaを経由した7‐adcaの効果的な製造法 |
US5731165A (en) * | 1995-06-02 | 1998-03-24 | Gist-Brocades, B.V. | Process for the production of 7-ADCA via expandase activity on penicillin G |
WO1997020053A2 (en) * | 1995-11-27 | 1997-06-05 | Gist-Brocades B.V. | Improved process for the production of semi-synthetic cephalosporins via expandase activity on penicillin g |
AU2508897A (en) * | 1996-04-04 | 1997-10-29 | Gist-Brocades B.V. | An enzyme with high adipoyl-coenzyme a synthetase activity and uses thereof |
EP0924180A4 (en) | 1996-07-02 | 2005-04-20 | Toray Finechemicals Co Ltd | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF OPTICALLY ACTIVE KETONES |
AU4201897A (en) | 1996-07-16 | 1998-02-09 | Gist-Brocades B.V. | Novel process for the preparation of cephalosporins using (acremonium chrysogenum) |
AU6400098A (en) * | 1997-02-20 | 1998-09-09 | Gist-Brocades B.V. | Fermentative production of valuable compounds on an industrial scale using chemically defined media |
ZA983396B (en) * | 1997-04-22 | 1998-10-27 | Gist Brocades Bv | A method for controlling the solubility of a beta-lactam nucleus |
KR20000022106A (ko) * | 1997-04-22 | 2000-04-25 | 데 보어 빌렘 뢸프 | β-락탐 항생물질의 제조방법 |
AU7648898A (en) * | 1997-04-22 | 1998-11-13 | Gist-Brocades B.V. | Process for the fermentative production of deacylated cephalosporins |
US6410259B1 (en) * | 1997-04-22 | 2002-06-25 | Dsm Patents & Trademarks | Process for the fermentative production of deacylated cephalosporins |
EP0918878B1 (en) | 1997-04-22 | 2005-02-09 | DSM IP Assets B.V. | Improved process for the fermentative production of cephalosporin |
CA2316401A1 (en) * | 1997-12-24 | 1999-07-08 | Isis Innovation Limited | Modified deacetoxycephalosporin c synthase (daocs) and x-ray structure |
RU2219182C2 (ru) * | 1998-03-27 | 2003-12-20 | Дсм Н.В. | Новый способ ферментативного получения цефалоспорина |
US6383773B2 (en) * | 1998-04-23 | 2002-05-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Penicillin conversion |
KR100648480B1 (ko) | 1998-05-19 | 2006-11-24 | 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. | 세팔로스포린의 개선된 생체내 생산 |
ES2165276B1 (es) * | 1999-06-18 | 2003-03-01 | Antibioticos Sau | Procedimiento biotecnologico para la produccion de acido 7-aminocefal osporanico (7-adca) y compuestos de sintesis intermedios particularmente penicilina n y desacetoxicefalosporina c (daoc) |
ATE273982T1 (de) | 2000-05-13 | 2004-09-15 | Smithkline Beecham Plc | Verfahren zur reinigung eines salzes der clavulansäure |
WO2007073947A2 (en) | 2005-12-28 | 2007-07-05 | Dsm Ip Assets B.V. | Mutant type ii beta- lactam acylases |
EP1987041B1 (en) * | 2006-02-23 | 2013-05-22 | DSM Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Improved cephalosporin production |
EP2123772A1 (en) | 2008-04-29 | 2009-11-25 | DSM IP Assets B.V. | Beta-lactam antibiotic producing strains |
EP2392649A3 (en) | 2008-08-05 | 2012-01-11 | DSM IP Assets B.V. | Adipoyl-7-ADCA producing strains |
WO2010015625A1 (en) * | 2008-08-05 | 2010-02-11 | Dsm Ip Assets B.V. | Adipoyl-7-adca producing strains |
WO2010015624A1 (en) * | 2008-08-05 | 2010-02-11 | Dsm Ip Assets B.V. | Adipoyl-7-adca producing strains |
CN102369290A (zh) | 2009-04-03 | 2012-03-07 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 发酵工艺 |
CN103003439A (zh) | 2010-06-22 | 2013-03-27 | 中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司 | 气泡发酵工艺 |
CN103108879B (zh) | 2010-09-07 | 2016-08-17 | 中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司 | 用于生产头孢菌素类的方法 |
BR112013022521B1 (pt) | 2011-03-03 | 2019-05-07 | Dsm Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | PROCESSO PARA A DEGRADAÇÃO DE UM COMPOSTO ß-LACTÂMICO E USO DE SULFITO NA DEGRADAÇÃO DE UM COMPOSTO ß-LACTÂMICO |
WO2015091455A1 (en) | 2013-12-17 | 2015-06-25 | Dpx Holdings B.V. | Bioreactor |
CN113699209B (zh) * | 2021-08-30 | 2023-05-02 | 浙江昂利康制药股份有限公司 | 一种7-adca回收方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR1270852A (fr) * | 1960-09-20 | 1961-09-01 | Bayer Ag | Procédé d'acylation enzymatique d'acide 6-aminopénicillanique |
EP0233715B1 (en) * | 1986-01-31 | 1994-05-25 | BEECHAM GROUP plc | Isolation and expression of genes involved in the biosynthesis of beta-lactams |
HUT43644A (en) * | 1986-11-17 | 1987-11-30 | Univ Oxford | Process for producing 3-substituted-cephalosporines |
ES2058141T3 (es) * | 1987-01-17 | 1994-11-01 | Hoechst Ag | Utilizacion de gamma-glutamil-transpeptidasa. |
US5070020A (en) * | 1988-05-09 | 1991-12-03 | Eli Lilly And Company | Recombinant dna expression vectors and dna compounds that encode deacetoxycephalosporin c synthetase |
US5108918A (en) * | 1988-08-11 | 1992-04-28 | Gist-Brocades | Method for identifying and using biosynthetic genes for enhanced production of secondary metabolites |
IL95766A (en) * | 1989-09-27 | 1996-12-05 | Lilly Co Eli | Recombinant DNA expression vectors And DNA compounds. Which encode Aspergillus acyltransferase activity |
KR0171897B1 (ko) * | 1989-12-27 | 1999-02-01 | 후지사와 도모끼찌로 | 7-아미노세펨 화합물 또는 그 염류의 제조 방법 |
CZ288721B6 (cs) * | 1991-10-15 | 2001-08-15 | Dsm Gist B. V. | Biologický způsob výroby kyseliny 7-aminodeacetylcefalosporanové |
-
1992
- 1992-08-28 US US07/933,469 patent/US5318896A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-07 NZ NZ244236A patent/NZ244236A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-09-07 IL IL10307692A patent/IL103076A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-09-10 CN CN92112278A patent/CN1066488C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-10 CA CA002077921A patent/CA2077921C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-10 MX MX9205175A patent/MX9205175A/es unknown
- 1992-09-11 EP EP97203374A patent/EP0843013A3/en not_active Withdrawn
- 1992-09-11 DK DK92308286T patent/DK0532341T3/da active
- 1992-09-11 AU AU23542/92A patent/AU657787B2/en not_active Ceased
- 1992-09-11 ES ES92308286T patent/ES2126588T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-11 AT AT92308286T patent/ATE173017T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-09-11 UA UA94005434A patent/UA41292C2/uk unknown
- 1992-09-11 RO RO94-00380A patent/RO115886B1/ro unknown
- 1992-09-11 DE DE69227494T patent/DE69227494T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-11 JP JP5505516A patent/JP3027847B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-11 RU RU94017674/13A patent/RU2178808C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1992-09-11 EP EP92308286A patent/EP0532341B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-11 KR KR1019940700777A patent/KR0132440B1/ko active
- 1992-09-11 KR KR1019940700777A patent/KR940702544A/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-09-11 SK SK288-94A patent/SK282387B6/sk unknown
- 1992-09-11 HU HU9400715A patent/HU217171B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-09-11 CZ CZ1994532A patent/CZ287357B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-09-11 WO PCT/US1992/007711 patent/WO1993005158A1/en active IP Right Grant
- 1992-09-19 TW TW081107399A patent/TW270149B/zh active
-
1994
- 1994-03-09 BG BG98643A patent/BG62177B1/bg unknown
- 1994-03-10 NO NO19940848A patent/NO316742B1/no unknown
- 1994-03-10 FI FI941135A patent/FI108148B/fi active
-
1999
- 1999-08-26 JP JP11239731A patent/JP3072101B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-08-31 CN CN00126889A patent/CN1332247A/zh active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO316742B1 (no) | Biologisk fremgangsmate for fremstilling av 7-ADCA | |
US5559005A (en) | Bioprocess for preparing 7-ACA and 7-ADAC | |
RU2202616C2 (ru) | Способ получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты, вектор экспрессии, рекомбинантный штамм | |
PL174984B1 (pl) | Nowy proces biologiczny wytwarzania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (kwasu 7-ADC) | |
PL172155B1 (pl) | Sposób biotechnologiczny wytwarzania pochodnych kwasu cefalosporanowego |