JP2000060582A - 7―adcaの生化学的新規製造法 - Google Patents
7―adcaの生化学的新規製造法Info
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- JP2000060582A JP2000060582A JP11239731A JP23973199A JP2000060582A JP 2000060582 A JP2000060582 A JP 2000060582A JP 11239731 A JP11239731 A JP 11239731A JP 23973199 A JP23973199 A JP 23973199A JP 2000060582 A JP2000060582 A JP 2000060582A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】
【解決手段】 アジポイル−7−アミノ−デスアセトキ
シ−セファロスポラン酸をアジポイルアシラーゼにより
脱アシル化する工程を含む7−アミノ−デスアセトキシ
−セファロスポラン酸の製造方法。
シ−セファロスポラン酸をアジポイルアシラーゼにより
脱アシル化する工程を含む7−アミノ−デスアセトキシ
−セファロスポラン酸の製造方法。
Description
【発明の詳細な説明】
【0001】1.発明の属する技術分野
本発明は、市販のセファロスポリン系抗生物質を製造す
るための合成方法の分野に関する。該抗生物質の数は現
在、かなり多く、これらの治療物質は現在、第4世代に
ある。市販のセファロスポリン系抗生物質には種々の多
数の側鎖があり、セファロスポリン系抗生物質の経済的
重要性が大きいことから、種々のセファロスポリン系抗
生物質の合成を容易にする重要中間体のより経済的で効
率的な製造方法の達成に対する重要性が高まっいてる。
るための合成方法の分野に関する。該抗生物質の数は現
在、かなり多く、これらの治療物質は現在、第4世代に
ある。市販のセファロスポリン系抗生物質には種々の多
数の側鎖があり、セファロスポリン系抗生物質の経済的
重要性が大きいことから、種々のセファロスポリン系抗
生物質の合成を容易にする重要中間体のより経済的で効
率的な製造方法の達成に対する重要性が高まっいてる。
【0002】これらの重要中間体の一つは7−アミノデ
スアセトキシセファロスポラン酸(7−ADCA)であ
り、下記式:
スアセトキシセファロスポラン酸(7−ADCA)であ
り、下記式:
【0003】
【化1】
で表すことができる。現在、7−ADCAはペニシリン
Gから製造されるが、ペニシリン環系の5員環からセフ
ァロスポリン系の特徴である6員環へ広げるには4また
は5個の化学工程を必要とする。全合成の場合の常とし
て、この方法には重大な欠点がある。とりわけ、複雑な
多段工程を必要とし、試薬が高価であり、かなりの量の
副成物が生じるため排出液の処理が問題になり、また、
化学処理を施す前にかなり不純な出発物質の精製を要す
ることが挙げられる。従って、環の拡張および側鎖の開
裂を酵素的に行って、現在使用されている化学的方法よ
りも経済的に7−ADCAを製造する微生物または醗酵
による方法に関する研究が進行している。
Gから製造されるが、ペニシリン環系の5員環からセフ
ァロスポリン系の特徴である6員環へ広げるには4また
は5個の化学工程を必要とする。全合成の場合の常とし
て、この方法には重大な欠点がある。とりわけ、複雑な
多段工程を必要とし、試薬が高価であり、かなりの量の
副成物が生じるため排出液の処理が問題になり、また、
化学処理を施す前にかなり不純な出発物質の精製を要す
ることが挙げられる。従って、環の拡張および側鎖の開
裂を酵素的に行って、現在使用されている化学的方法よ
りも経済的に7−ADCAを製造する微生物または醗酵
による方法に関する研究が進行している。
【0004】従って、本発明は特に、重要なセファロス
ポリン中間体である7−ADCAの製造分野に関し、と
りわけ、7−ADCAの生化学的製造方法の分野に関す
る。
ポリン中間体である7−ADCAの製造分野に関し、と
りわけ、7−ADCAの生化学的製造方法の分野に関す
る。
【0005】今日まで、7−ADCAの生化学的取得を
成功させるための研究は大部分が徒労に終わっており、
商業的規模での製造法に関しては特にそうである。例え
ば、直接醗酵により、および/またはペニシリンGを酵
素処理することにより、7−ADCAを得るために必要
な環の拡張を別にして、6−アミノペニシラン酸(6−
APA)を製造することは可能であるが、不幸なこと
に、自身の正常な代謝経路に環の拡張を含むCephalospo
riumまたはStreptomyces属の酵素は、6−APAを基質
として受け入れない。公知文献ではDAOCSまたはエ
クスパンダーゼ酵素と総称しているこれらの酵素を、こ
こではペニシリン型分子に見られるペナム環構造をセフ
ァロスポリン類に見られるセフ−3−エム環に拡張する
のを触媒する酵素として定義する。以後、これらの酵素
は「エクスパンダーゼ酵素」と称する。
成功させるための研究は大部分が徒労に終わっており、
商業的規模での製造法に関しては特にそうである。例え
ば、直接醗酵により、および/またはペニシリンGを酵
素処理することにより、7−ADCAを得るために必要
な環の拡張を別にして、6−アミノペニシラン酸(6−
APA)を製造することは可能であるが、不幸なこと
に、自身の正常な代謝経路に環の拡張を含むCephalospo
riumまたはStreptomyces属の酵素は、6−APAを基質
として受け入れない。公知文献ではDAOCSまたはエ
クスパンダーゼ酵素と総称しているこれらの酵素を、こ
こではペニシリン型分子に見られるペナム環構造をセフ
ァロスポリン類に見られるセフ−3−エム環に拡張する
のを触媒する酵素として定義する。以後、これらの酵素
は「エクスパンダーゼ酵素」と称する。
【0006】エクスパンダーゼ酵素が作用する基質はペ
ニシリンNであり、これは、環が拡張されるとデアセト
キシセファロスポリンC(DAOC)になる。この場
合、7−ADCAを得るためには、(D)−α−アミノ
アジポイル側鎖を開裂するだけでよいが、この側鎖は、
酵素開裂に対して頑強に抵抗して、許容されないほどの
低収量しか得られないことがわかっている。
ニシリンNであり、これは、環が拡張されるとデアセト
キシセファロスポリンC(DAOC)になる。この場
合、7−ADCAを得るためには、(D)−α−アミノ
アジポイル側鎖を開裂するだけでよいが、この側鎖は、
酵素開裂に対して頑強に抵抗して、許容されないほどの
低収量しか得られないことがわかっている。
【0007】本発明によれば、ペニシリン化合物(アジ
ポイル側鎖を有する)を新規醗酵法により高力価で製造
する効率的な生化学方法を達成することができる。そし
て、該ペニシリン化合物は、ペニシリン化合物を産生す
る同一の微生物をエクスパンダーゼ酵素系をも発現する
よう形質転換すると、それによってin situで産
生されるエクスパンダーゼ酵素系の許容可能な基質であ
る。エクスパンダーゼ酵素は、ペニシリン化合物の環を
拡張してセファロスポリン化合物が高収率で得られるよ
うに作用する。この第二の必須工程で重要なことは、ペ
ニシリン化合物、ここではセファロスポリン化合物の側
鎖が、別の酵素により驚くほど高収率で脱離可能である
ことである。本発明の一部をなすこの独自の生化学方法
は、予期しなかったことに、7−ADCAが驚くほど高
収率で製造されるという結果をもたらす。2.従来技術の簡単な説明 Cantwell et al., in Curr Genet (1990) 17:213-221
は、ペニシリンVの環を拡張した後、得られたデアセト
キシセファロスポリンVを酵素的に加水分解することに
より7−ADCAを製造する生化学方法を提案した。こ
の提案は、S.clavuligerus由来のクローン化したペニシ
リンNエクスパンダーゼ遺伝子(cefE)が入手可能
であることに基づいている(Kovacevic et al.,J. Bacte
riol. (1989) 171:754-760およびU.S.5,070,020)。しか
し、そのエクスパンダーゼは、天然基質であるペニシリ
ンNには作用するものの、ペニシリンVには作用しない
ので、その提案は、ペニシリンVの環拡張を行うことが
できるような修飾エクスパンダーゼ遺伝子が得られるよ
うな遺伝子処理を必要とする。必要な修飾は、Cantwell
et al. では達成されておらず、Streptomyces clavuli
gerus由来のcefE遺伝子により Penicillium chryso
genumを形質転換し、DAOCS(エクスパンダーゼ)
酵素を低レベルで発現することに成功したに過ぎない。
ポイル側鎖を有する)を新規醗酵法により高力価で製造
する効率的な生化学方法を達成することができる。そし
て、該ペニシリン化合物は、ペニシリン化合物を産生す
る同一の微生物をエクスパンダーゼ酵素系をも発現する
よう形質転換すると、それによってin situで産
生されるエクスパンダーゼ酵素系の許容可能な基質であ
る。エクスパンダーゼ酵素は、ペニシリン化合物の環を
拡張してセファロスポリン化合物が高収率で得られるよ
うに作用する。この第二の必須工程で重要なことは、ペ
ニシリン化合物、ここではセファロスポリン化合物の側
鎖が、別の酵素により驚くほど高収率で脱離可能である
ことである。本発明の一部をなすこの独自の生化学方法
は、予期しなかったことに、7−ADCAが驚くほど高
収率で製造されるという結果をもたらす。2.従来技術の簡単な説明 Cantwell et al., in Curr Genet (1990) 17:213-221
は、ペニシリンVの環を拡張した後、得られたデアセト
キシセファロスポリンVを酵素的に加水分解することに
より7−ADCAを製造する生化学方法を提案した。こ
の提案は、S.clavuligerus由来のクローン化したペニシ
リンNエクスパンダーゼ遺伝子(cefE)が入手可能
であることに基づいている(Kovacevic et al.,J. Bacte
riol. (1989) 171:754-760およびU.S.5,070,020)。しか
し、そのエクスパンダーゼは、天然基質であるペニシリ
ンNには作用するものの、ペニシリンVには作用しない
ので、その提案は、ペニシリンVの環拡張を行うことが
できるような修飾エクスパンダーゼ遺伝子が得られるよ
うな遺伝子処理を必要とする。必要な修飾は、Cantwell
et al. では達成されておらず、Streptomyces clavuli
gerus由来のcefE遺伝子により Penicillium chryso
genumを形質転換し、DAOCS(エクスパンダーゼ)
酵素を低レベルで発現することに成功したに過ぎない。
【0008】エクスパンダーゼ酵素は、その活性および
遺伝子配列の両方に関して十分研究されている。例え
ば、U.S.4,510,246 および4,536,476 (以上、Wolfe)
では、サイクラーゼ、エピメラーゼおよび環拡張酵素
が、Streptomyces clavuligerusを含む、原核生物のβ
−ラクタム産生微生物の無細胞抽出物から別々に単離さ
れて、安定な酵素試薬が得られた。EP-A-0366354には、
S.clavuligerusから単離・精製したエクスパンダーゼ酵
素が記載されており、該酵素は末端残基およびアミノ酸
組成物などで確認され、約34,600ダルトンの分子
量を有すると言われている。しかし、これは、U.S.4,53
6,476 では同一酵素であると思われるものの分子量が2
9,000になっており、対照的である。EP-A-0233715
は、S.clavuligerusから得られるエクスパンダーゼ酵素
の単離およびエンドヌクレアーゼ制限酵素による制限地
図作成、該酵素の宿主での形質転換および発現、ならび
に該酵素を使用したペニシリンN基質の環拡張の実例を
開示している。U.S.5,070,020は、S.clavuligerusから
得られるエクスパンダーゼ酵素をコードするDNA配列
を開示しており、また、P.chrysogenum菌株を該DNA
配列を含む発現ベクターにより形質転換してエクスパン
ダーゼ酵素を発現させることを記載している。この酵素
はペニシリンN以外の基質の拡張にも有用とされている
が、そのような拡張の実例はない。
遺伝子配列の両方に関して十分研究されている。例え
ば、U.S.4,510,246 および4,536,476 (以上、Wolfe)
では、サイクラーゼ、エピメラーゼおよび環拡張酵素
が、Streptomyces clavuligerusを含む、原核生物のβ
−ラクタム産生微生物の無細胞抽出物から別々に単離さ
れて、安定な酵素試薬が得られた。EP-A-0366354には、
S.clavuligerusから単離・精製したエクスパンダーゼ酵
素が記載されており、該酵素は末端残基およびアミノ酸
組成物などで確認され、約34,600ダルトンの分子
量を有すると言われている。しかし、これは、U.S.4,53
6,476 では同一酵素であると思われるものの分子量が2
9,000になっており、対照的である。EP-A-0233715
は、S.clavuligerusから得られるエクスパンダーゼ酵素
の単離およびエンドヌクレアーゼ制限酵素による制限地
図作成、該酵素の宿主での形質転換および発現、ならび
に該酵素を使用したペニシリンN基質の環拡張の実例を
開示している。U.S.5,070,020は、S.clavuligerusから
得られるエクスパンダーゼ酵素をコードするDNA配列
を開示しており、また、P.chrysogenum菌株を該DNA
配列を含む発現ベクターにより形質転換してエクスパン
ダーゼ酵素を発現させることを記載している。この酵素
はペニシリンN以外の基質の拡張にも有用とされている
が、そのような拡張の実例はない。
【0009】上述した研究は、原核生物S.clavuligerus
から得られるエクスパンダーゼ酵素に集中している。こ
の同一の酵素または少なくとも見かけ上同じ環拡張活性
を有する酵素は、真核生物Cephalosporium acremonium
(Acremonium chrysogenumとも言う。)の菌株によって
も発現される。しかし、そのような菌株でのエクスパン
ダーゼ活性は二機能性遺伝子(cefEF)によって発
現され、その遺伝子は、その本来の機能がエクスパンダ
ーゼ酵素のデスアセトキシセファロスポラン酸(DAO
C)産物をデアセチルセファロスポリンC(DAC)に
変換することであるDACS(ヒドロキシラーゼ)活性
も発現する。その結果、単一であるが二機能性のエクス
パンダーゼ/ヒドロキシラーゼ酵素が得られる。これら
2個の遺伝子産物の活性を分離する試みがなされている
が、まだ誰も成功していない。例えば、EP-A-0281391
は、C.acremonium ATCC11550から得られるDAOCS/
DACS遺伝子の単離およびDNA配列の同定をその酵
素の対応するアミノ酸配列とともに開示している。Peni
cilliumは形質転換され、その酵素を発現するが、ペニ
シリンGおよびVを対応するセファロスポリンに変換す
るという試みは少しも例示されていない。さらに、DA
OCSをコードする遺伝子情報をDACSから分離して
それらを別々に発現することは、遺伝子工学技術により
容易に行うことができるという示唆にもかかわらず、そ
のような分離の実例は全く記載されていない。
から得られるエクスパンダーゼ酵素に集中している。こ
の同一の酵素または少なくとも見かけ上同じ環拡張活性
を有する酵素は、真核生物Cephalosporium acremonium
(Acremonium chrysogenumとも言う。)の菌株によって
も発現される。しかし、そのような菌株でのエクスパン
ダーゼ活性は二機能性遺伝子(cefEF)によって発
現され、その遺伝子は、その本来の機能がエクスパンダ
ーゼ酵素のデスアセトキシセファロスポラン酸(DAO
C)産物をデアセチルセファロスポリンC(DAC)に
変換することであるDACS(ヒドロキシラーゼ)活性
も発現する。その結果、単一であるが二機能性のエクス
パンダーゼ/ヒドロキシラーゼ酵素が得られる。これら
2個の遺伝子産物の活性を分離する試みがなされている
が、まだ誰も成功していない。例えば、EP-A-0281391
は、C.acremonium ATCC11550から得られるDAOCS/
DACS遺伝子の単離およびDNA配列の同定をその酵
素の対応するアミノ酸配列とともに開示している。Peni
cilliumは形質転換され、その酵素を発現するが、ペニ
シリンGおよびVを対応するセファロスポリンに変換す
るという試みは少しも例示されていない。さらに、DA
OCSをコードする遺伝子情報をDACSから分離して
それらを別々に発現することは、遺伝子工学技術により
容易に行うことができるという示唆にもかかわらず、そ
のような分離の実例は全く記載されていない。
【0010】C.acremoniumのDAOCS/DACS(エ
クスパンダーゼ/ヒドロキシラーゼ)酵素も、その活性
および特徴ならびに遺伝子配列に関して十分に研究され
ている。例えば、U.S.4,178,210 、U.S.4,248,966 およ
びU.S.4,307,192 (以上、Demain)では、エピマー化し
て環を拡張することによりセファロスポリン抗生物質を
生じるC.acremoniumの無細胞抽出物によりペニシリン型
の種々の出発物質を処理している。U.S.4,753,881 (Wu
-Kuang Yeh)は、C.acremonium酵素の等電点、分子量、
アミノ酸残基、ヒドロキシラーゼ活性とエクスパンダー
ゼ活性との比およびペプチド断片に関して記載してい
る。
クスパンダーゼ/ヒドロキシラーゼ)酵素も、その活性
および特徴ならびに遺伝子配列に関して十分に研究され
ている。例えば、U.S.4,178,210 、U.S.4,248,966 およ
びU.S.4,307,192 (以上、Demain)では、エピマー化し
て環を拡張することによりセファロスポリン抗生物質を
生じるC.acremoniumの無細胞抽出物によりペニシリン型
の種々の出発物質を処理している。U.S.4,753,881 (Wu
-Kuang Yeh)は、C.acremonium酵素の等電点、分子量、
アミノ酸残基、ヒドロキシラーゼ活性とエクスパンダー
ゼ活性との比およびペプチド断片に関して記載してい
る。
【0011】上述した公知文献は、P.chrysogenum菌株
を、エクスパンダーゼ酵素を発現する遺伝子により形質
転換してその酵素を発現させるという点のみで、本発明
に関連している。そこでは、発現した酵素を使用して、
ペニシリンGおよびVではなく、ペニシリンNの環拡張
を行っているだけである。その場合ですら、ペニシリン
Nの7位には、本発明方法のように酵素的に開裂して7
−ADCAにすることができない側鎖がある。本発明
は、アジポイル側鎖がP.chrysogenum菌株により効率的
に付加され、in situ発現したエクスパンダーゼ
酵素がその化合物を環拡張の基質として効率的に使用し
てアジポイル7−ADCAにし、次いで、そのアジポイ
ル側鎖が別の酵素により効率的に脱離されて7−ADC
Aになるという驚くべき発見によるものである。本発明
個々の断片自体は公知文献に見出すことができるとして
も、それらを結合すると本発明方法のように予期しない
結果が得られるということは示唆されていない。
を、エクスパンダーゼ酵素を発現する遺伝子により形質
転換してその酵素を発現させるという点のみで、本発明
に関連している。そこでは、発現した酵素を使用して、
ペニシリンGおよびVではなく、ペニシリンNの環拡張
を行っているだけである。その場合ですら、ペニシリン
Nの7位には、本発明方法のように酵素的に開裂して7
−ADCAにすることができない側鎖がある。本発明
は、アジポイル側鎖がP.chrysogenum菌株により効率的
に付加され、in situ発現したエクスパンダーゼ
酵素がその化合物を環拡張の基質として効率的に使用し
てアジポイル7−ADCAにし、次いで、そのアジポイ
ル側鎖が別の酵素により効率的に脱離されて7−ADC
Aになるという驚くべき発見によるものである。本発明
個々の断片自体は公知文献に見出すことができるとして
も、それらを結合すると本発明方法のように予期しない
結果が得られるということは示唆されていない。
【0012】例えば、6−アジポイルペニシラン酸は文
献により公知である(Ballio, A. et al., Nature (196
0) 185, 97-99 参照)。in vitroでの6−アジ
ポイルペニシラン酸の酵素的拡張も文献により公知であ
る(Baldwin et al., Tetrahedron (1987) 43, 3009-30
14およびEP-A-0268343参照)。そして、アジポイル側鎖
の酵素的開裂も文献により公知である(Matsuda et a
l., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820)。
献により公知である(Ballio, A. et al., Nature (196
0) 185, 97-99 参照)。in vitroでの6−アジ
ポイルペニシラン酸の酵素的拡張も文献により公知であ
る(Baldwin et al., Tetrahedron (1987) 43, 3009-30
14およびEP-A-0268343参照)。そして、アジポイル側鎖
の酵素的開裂も文献により公知である(Matsuda et a
l., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820)。
【0013】アジポイル側鎖は次の構造:COOH−
(CH2)4−CO−を有するが、密接に関連した構造
の側鎖として、構造:COOH−(CH2)3−CO−
を有するグルタリル側鎖がある。グルタリル側鎖の酵素
的開裂は文献により公知である(例えば、Shibuya et a
l., Agric. Biol. Chem. (1981) 45, 1561-1567 、Mats
uda and Komatsu, J. Bact. (1985) 163, 1222- 1228、
Matsuda et al., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820、特
開昭53-086084 (萬有製薬)および特開昭52-128293
(萬有製薬)参照)。
(CH2)4−CO−を有するが、密接に関連した構造
の側鎖として、構造:COOH−(CH2)3−CO−
を有するグルタリル側鎖がある。グルタリル側鎖の酵素
的開裂は文献により公知である(例えば、Shibuya et a
l., Agric. Biol. Chem. (1981) 45, 1561-1567 、Mats
uda and Komatsu, J. Bact. (1985) 163, 1222- 1228、
Matsuda et al., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820、特
開昭53-086084 (萬有製薬)および特開昭52-128293
(萬有製薬)参照)。
【0014】また、EP-A-0453048は、Pseudomonas SY-7
7-1 によって産生されるグルタリルアシラーゼのアジポ
イル開裂活性を改善する方法を記載している。α−サブ
ユニット内に位置する種々のアミノ酸を置換することに
より、(アジポイル−セリンからの)アジポイル開裂速
度が3〜5倍高くなった。なお、EP-A-0453048は見かけ
上、アジポイル側鎖に対する活性が改善されたアシラー
ゼを実証しているが、アジポイル−セファロスポリンを
主に生じさせる方法(化学的方法または本明細書に記載
した方法と類似の生化学的方法のいずれによっても)に
ついては何も記載していない。
7-1 によって産生されるグルタリルアシラーゼのアジポ
イル開裂活性を改善する方法を記載している。α−サブ
ユニット内に位置する種々のアミノ酸を置換することに
より、(アジポイル−セリンからの)アジポイル開裂速
度が3〜5倍高くなった。なお、EP-A-0453048は見かけ
上、アジポイル側鎖に対する活性が改善されたアシラー
ゼを実証しているが、アジポイル−セファロスポリンを
主に生じさせる方法(化学的方法または本明細書に記載
した方法と類似の生化学的方法のいずれによっても)に
ついては何も記載していない。
【0015】(D)−α−アミノアジポイル側鎖が存在
する場合、最初にアミノ基を酵素的に除いて、その側鎖
を(D)−アミノ酸オキシダーゼにより短くしてグルタ
リル(GL−7)側鎖とし、これを別の酵素(グルタリ
ルアシラーゼ)によりグルタリル側鎖を脱離することは
文献により公知である。そのような二段開裂は、U.S.3,
960,662 (Matsuda )、EP-A-0275901、特開昭61-21805
7 (1988-Komatsu, 旭化成工業)、WO90/12110(1990-
Wong, Biopure Corp. )およびIsogai et al.,Bio/Tech
nology(1991) 9,188-191に開示されている。係属の出願との関連 エクスパンダーゼ酵素の活性を、本明細書に記載した7
−ADCAを得るための生化学方法と同様の方法により
P.chrysogenum形質転換細胞で発現させ7−ACAを得
るためのバイオ方法を開示した出願中の米国特許出願0
7/953,492、1992年10月6日出願(特開
平4−319194号)と関連する。しかし、この7−
ACAバイオ方法では、別個の最終産物を得るための全
く異なる組換え代謝経路を達成するために、別の酵素活
性を発現するには別の形質転換が必要であるが、本明細
書は、それに関しては何も示唆していない。
する場合、最初にアミノ基を酵素的に除いて、その側鎖
を(D)−アミノ酸オキシダーゼにより短くしてグルタ
リル(GL−7)側鎖とし、これを別の酵素(グルタリ
ルアシラーゼ)によりグルタリル側鎖を脱離することは
文献により公知である。そのような二段開裂は、U.S.3,
960,662 (Matsuda )、EP-A-0275901、特開昭61-21805
7 (1988-Komatsu, 旭化成工業)、WO90/12110(1990-
Wong, Biopure Corp. )およびIsogai et al.,Bio/Tech
nology(1991) 9,188-191に開示されている。係属の出願との関連 エクスパンダーゼ酵素の活性を、本明細書に記載した7
−ADCAを得るための生化学方法と同様の方法により
P.chrysogenum形質転換細胞で発現させ7−ACAを得
るためのバイオ方法を開示した出願中の米国特許出願0
7/953,492、1992年10月6日出願(特開
平4−319194号)と関連する。しかし、この7−
ACAバイオ方法では、別個の最終産物を得るための全
く異なる組換え代謝経路を達成するために、別の酵素活
性を発現するには別の形質転換が必要であるが、本明細
書は、それに関しては何も示唆していない。
【0016】本発明方法および上述した公知文献の開示
をより十分に理解するのを助けるために、以下に、ペニ
シリンGおよびセファロスポリンCに導く代謝経路の種
々の段階、中間物質および関与する形質転換を行う酵素
を示す。
をより十分に理解するのを助けるために、以下に、ペニ
シリンGおよびセファロスポリンCに導く代謝経路の種
々の段階、中間物質および関与する形質転換を行う酵素
を示す。
【0017】
【化2】
【0018】
【化3】
【0019】
【化4】
【0020】
【化5】
【0021】
【化6】
【0022】
【化7】
発明の要旨
本発明は、7−アミノデスアセトキシセファロスポラン
酸(7−ADCA)を製造するための新規生化学方法に
関している。本発明の方法は、下記工程: 1)イソペニシリンNを産生するPenicillium chrysoge
num菌株を、それが生育できる培養培地中で維持し、該
培養培地にアジピン酸または該Penicillium chrysogenu
m菌株によって同化・利用され得る1種以上のその塩お
よびエステルを含むアジペート原料を添加してアジポイ
ル−6−アミノペニシラン酸(アジポイル−6−AP
A)を製造する工程であって、該Penicillium chrysoge
num菌株は、アジポイル−6−APAを基質とすること
ができるエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDN
Aによって形質転換されており、その酵素の発現に伴
い、該菌株によって産生されたアジポイル−6−APA
がin situで環拡張されてアジポイル−7−AD
CAを生じる工程;および 2)該アジポイル−7−ADCAをアジポイルアシラー
ゼと接触させることによりアジポイル側鎖を脱離して7
−ADCAを生成し、次いで該物質を単離する工程を含
む。
酸(7−ADCA)を製造するための新規生化学方法に
関している。本発明の方法は、下記工程: 1)イソペニシリンNを産生するPenicillium chrysoge
num菌株を、それが生育できる培養培地中で維持し、該
培養培地にアジピン酸または該Penicillium chrysogenu
m菌株によって同化・利用され得る1種以上のその塩お
よびエステルを含むアジペート原料を添加してアジポイ
ル−6−アミノペニシラン酸(アジポイル−6−AP
A)を製造する工程であって、該Penicillium chrysoge
num菌株は、アジポイル−6−APAを基質とすること
ができるエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDN
Aによって形質転換されており、その酵素の発現に伴
い、該菌株によって産生されたアジポイル−6−APA
がin situで環拡張されてアジポイル−7−AD
CAを生じる工程;および 2)該アジポイル−7−ADCAをアジポイルアシラー
ゼと接触させることによりアジポイル側鎖を脱離して7
−ADCAを生成し、次いで該物質を単離する工程を含
む。
【0023】本明細書で使用する下記用語の意味を表示
する。
する。
【0024】「アジポイル−6−APA」は、〔2S−
(2α、5α、6β)〕−3,3−ジメチル−7−オキ
ソ−6−〔(ヘキサン−1,6−ジオイル)アミノ〕−
4−チア−1−アザビシクロ−〔3.2.0〕ヘプタン
−2−カルボン酸を意味し、「アジポイル−7−ADC
A」は、7−〔(ヘキサン−1,6−ジオイル)アミ
ノ〕−3−メチル−8−オキソ−5−チア−1−アザビ
シクロ−〔4.2.0〕オクト−2−エン−2−カルボ
ン酸を意味する。
(2α、5α、6β)〕−3,3−ジメチル−7−オキ
ソ−6−〔(ヘキサン−1,6−ジオイル)アミノ〕−
4−チア−1−アザビシクロ−〔3.2.0〕ヘプタン
−2−カルボン酸を意味し、「アジポイル−7−ADC
A」は、7−〔(ヘキサン−1,6−ジオイル)アミ
ノ〕−3−メチル−8−オキソ−5−チア−1−アザビ
シクロ−〔4.2.0〕オクト−2−エン−2−カルボ
ン酸を意味する。
【0025】特に、本発明は、上記で詳述した7−アミ
ノデアセトキシセファロスポラン酸(7−ADCA)を
製造するための新規生化学的方法において、アジペート
源がアジピン酸二ナトリウムであり、エクスパンダーゼ
酵素の活性をコードするDNAがStreptomyces clavuli
gerus ATCC27064に由来し、アジポイルアシラーゼがPse
udomonas属に由来する方法に関する。
ノデアセトキシセファロスポラン酸(7−ADCA)を
製造するための新規生化学的方法において、アジペート
源がアジピン酸二ナトリウムであり、エクスパンダーゼ
酵素の活性をコードするDNAがStreptomyces clavuli
gerus ATCC27064に由来し、アジポイルアシラーゼがPse
udomonas属に由来する方法に関する。
【0026】さらに、本発明は、Streptomyces clavuli
gerus ATCC27064に由来するエクスパンダーゼ酵素の活
性をコードするDNAおよびエクスパンダーゼ活性をコ
ードするDNAの発現を促進するプロモータを含む、後
述するプラスミドpPenFTSOから成る組換えDN
A発現ベクターに関する。
gerus ATCC27064に由来するエクスパンダーゼ酵素の活
性をコードするDNAおよびエクスパンダーゼ活性をコ
ードするDNAの発現を促進するプロモータを含む、後
述するプラスミドpPenFTSOから成る組換えDN
A発現ベクターに関する。
【0027】本発明はさらに、Streptomyces clavulige
rus ATCC27064に由来するエクスパンダーゼ酵素の活性
をコードするDNAおよびエクスパンダーゼ活性をコー
ドするDNAの発現を促進するプロモータ(Penicilliu
m chrysogenum IPNS遺伝子のプロモータなど)を含む組
換えDNA発現ベクターで形質転換されたPenicillium
chrysogenum宿主細胞に関する。特に、本発明は、後述
するプラスミドpPenFTSOから成る組換えDNA
発現ベクターで形質転換されたPenicillium chrysogenu
m宿主細胞に関する。
rus ATCC27064に由来するエクスパンダーゼ酵素の活性
をコードするDNAおよびエクスパンダーゼ活性をコー
ドするDNAの発現を促進するプロモータ(Penicilliu
m chrysogenum IPNS遺伝子のプロモータなど)を含む組
換えDNA発現ベクターで形質転換されたPenicillium
chrysogenum宿主細胞に関する。特に、本発明は、後述
するプラスミドpPenFTSOから成る組換えDNA
発現ベクターで形質転換されたPenicillium chrysogenu
m宿主細胞に関する。
【0028】さらに、本発明は、遺伝子の発現に適した
条件下で組換えPenicillium chrysogenum宿主細胞を培
養する工程を含み、該組換え宿主細胞がStreptomyces c
lavuligerus ATCC27064に由来するエクスパンダーゼ酵
素の活性をコードするDNAおよびエクスパンダーゼ活
性をコードするDNAの発現を促進するプロモータ(Pe
nicillium chrysogenum IPNS遺伝子のプロモータなど)
を含む組換えDNA発現ベクターから成る方法に関す
る。特に、本発明は、遺伝子の発現に適した条件下で組
換えPenicillium chrysogenum 宿主細胞を培養する方法
であって、該組換え宿主細胞が後述するプラスミドpP
enFTSOなどの組換えDNA発現ベクターから成る
方法に関する。発明の詳細な説明 本発明の第一は、下記構造式:
条件下で組換えPenicillium chrysogenum宿主細胞を培
養する工程を含み、該組換え宿主細胞がStreptomyces c
lavuligerus ATCC27064に由来するエクスパンダーゼ酵
素の活性をコードするDNAおよびエクスパンダーゼ活
性をコードするDNAの発現を促進するプロモータ(Pe
nicillium chrysogenum IPNS遺伝子のプロモータなど)
を含む組換えDNA発現ベクターから成る方法に関す
る。特に、本発明は、遺伝子の発現に適した条件下で組
換えPenicillium chrysogenum 宿主細胞を培養する方法
であって、該組換え宿主細胞が後述するプラスミドpP
enFTSOなどの組換えDNA発現ベクターから成る
方法に関する。発明の詳細な説明 本発明の第一は、下記構造式:
【0029】
【化8】
で表される、市販の合成セファロスポリンの重要な製造
中間体である7−アミノデスアセトキシセファロスポラ
ン酸(7−ADCA)を製造するための新規生化学的方
法である。7−ADCAの特徴は、セファロスポリン核
の他に、7−アミノ基および3−メチル基である。7−
アミノ基は多数の誘導側鎖に変換することができ、従っ
て、市販の種々のセファロスポリンを合成するためのベ
ースとなる。3−メチル基は、セファレキシンの場合の
ようにいつもではないが通常は、市販のセファロスポリ
ンを合成するためにいくつかの他の側鎖に変換されるこ
ととなる。
中間体である7−アミノデスアセトキシセファロスポラ
ン酸(7−ADCA)を製造するための新規生化学的方
法である。7−ADCAの特徴は、セファロスポリン核
の他に、7−アミノ基および3−メチル基である。7−
アミノ基は多数の誘導側鎖に変換することができ、従っ
て、市販の種々のセファロスポリンを合成するためのベ
ースとなる。3−メチル基は、セファレキシンの場合の
ようにいつもではないが通常は、市販のセファロスポリ
ンを合成するためにいくつかの他の側鎖に変換されるこ
ととなる。
【0030】本発明方法の7−ADCA物質は、下記構
造式:
造式:
【0031】
【化9】
で表される別の重要なセファロスポリン中間体であるセ
ファロスポリンCと対比させることができる。この中間
体の場合、3−アセチルオキシメチル側鎖は市販のセフ
ァロスポリンに対して許容されるかもしれないが、7−
(D)−α−アミノアジポイル側鎖は、合成によるこれ
以上の誘導には適しないので、許容可能な7−アミノ基
を得るために開裂しなければならない。不幸なことに、
7−(D)−α−アミノアジポイル側鎖は、化学的また
は生化学的ないずれの手段によっても、いつも脱離が困
難である。定義 本明細書、特に好ましい態様の説明の章で使用する下記
の用語の意味を表示する。 7−ADCA 7−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸 6−APA 6−アミノペニシラン酸 DAOC デスアセトキシセファロスポラン酸 DAOCS DAOCシンセターゼ DAC デアセチルセファロスポリンC DACS DAC シンセターゼ IPNS イソペニシリンNシンセターゼ Tris トリス〔ヒドロキシメチル〕アミノメタン EDTA エチレンジアミン四酢酸 DEPC ジエチルピロカーボネート TE Tris/EDTA緩衝液 SSC 塩(塩化ナトリウム)、クエン酸ナトリウム緩衝液 SDS ドデシル硫酸ナトリウム PEG ポリエチレングリコールPenicillium chrysogenum 培養 本発明方法の第一工程は、イソペニシリンNを産生する
Penicillium chrysogenum菌株を、それが生育できる培
養培地中で維持し、該培養培地にアジピン酸またはその
塩およびエステルを含むアジペート源を添加する工程を
含む。アジペート源は、P.chrysogenumを接種した後、
その培養培地に添加することができるが、接種を行うと
きにすでに培養培地に存在しているのが好ましい。アジ
ピン酸またはその塩およびエステルは、該P.chrysogenu
m菌株によって同化・利用されてアジポイル−6−AP
Aを生成することができるものである。ここで、P.chry
sogenumはエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするD
NAによって形質転換されており、その酵素の発現の
際、該アジポイル−6−APAがin situで環拡
張されてアジポイル−7−ADCAを生じる。
ファロスポリンCと対比させることができる。この中間
体の場合、3−アセチルオキシメチル側鎖は市販のセフ
ァロスポリンに対して許容されるかもしれないが、7−
(D)−α−アミノアジポイル側鎖は、合成によるこれ
以上の誘導には適しないので、許容可能な7−アミノ基
を得るために開裂しなければならない。不幸なことに、
7−(D)−α−アミノアジポイル側鎖は、化学的また
は生化学的ないずれの手段によっても、いつも脱離が困
難である。定義 本明細書、特に好ましい態様の説明の章で使用する下記
の用語の意味を表示する。 7−ADCA 7−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸 6−APA 6−アミノペニシラン酸 DAOC デスアセトキシセファロスポラン酸 DAOCS DAOCシンセターゼ DAC デアセチルセファロスポリンC DACS DAC シンセターゼ IPNS イソペニシリンNシンセターゼ Tris トリス〔ヒドロキシメチル〕アミノメタン EDTA エチレンジアミン四酢酸 DEPC ジエチルピロカーボネート TE Tris/EDTA緩衝液 SSC 塩(塩化ナトリウム)、クエン酸ナトリウム緩衝液 SDS ドデシル硫酸ナトリウム PEG ポリエチレングリコールPenicillium chrysogenum 培養 本発明方法の第一工程は、イソペニシリンNを産生する
Penicillium chrysogenum菌株を、それが生育できる培
養培地中で維持し、該培養培地にアジピン酸またはその
塩およびエステルを含むアジペート源を添加する工程を
含む。アジペート源は、P.chrysogenumを接種した後、
その培養培地に添加することができるが、接種を行うと
きにすでに培養培地に存在しているのが好ましい。アジ
ピン酸またはその塩およびエステルは、該P.chrysogenu
m菌株によって同化・利用されてアジポイル−6−AP
Aを生成することができるものである。ここで、P.chry
sogenumはエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするD
NAによって形質転換されており、その酵素の発現の
際、該アジポイル−6−APAがin situで環拡
張されてアジポイル−7−ADCAを生じる。
【0032】ペニシリウム属のchrysogenum種以外の種
もイソペニシリンNを産生する。しかし、歴史上、イソ
ペニシリンNの産生量が最も高い菌株は全て、周知の菌
株改良技術によりchrysogenum種から発育させている。
このため本発明は、事実上、Penicillium chrysogenum
菌株に限定したが、他の種にも適応できることは明らか
である。Penicillium chrysogenumの寄託菌株または該
菌株の他の公的に入手可能な源は、いずれも本発明方法
を行うための適する出発点である。
もイソペニシリンNを産生する。しかし、歴史上、イソ
ペニシリンNの産生量が最も高い菌株は全て、周知の菌
株改良技術によりchrysogenum種から発育させている。
このため本発明は、事実上、Penicillium chrysogenum
菌株に限定したが、他の種にも適応できることは明らか
である。Penicillium chrysogenumの寄託菌株または該
菌株の他の公的に入手可能な源は、いずれも本発明方法
を行うための適する出発点である。
【0033】イソペニシリンNを産生するPenicillium
chrysogenum菌株の生育を維持することができる培養培
地は、当業者が容易に慣れ親しむ型のものである。例え
ば、培養は水中下通気醗酵法により行い、使用培地は多
数の使用可能な適する培地から選択される。典型的な培
地は、ショ糖、グルコースおよび澱粉などの炭素源;大
豆の粉末および粕、綿実油、ピーナツ油ならびに種々の
アミノ酸、それらの混合物およびペプトンなどの窒素源
を利用する。産生条件は、収量および単離し易さに重点
が置かれ、従って、そのような状況に好ましい培地は、
炭素源を糖蜜にして、窒素源を大豆粉末およびアミノ酸
にすることができる。
chrysogenum菌株の生育を維持することができる培養培
地は、当業者が容易に慣れ親しむ型のものである。例え
ば、培養は水中下通気醗酵法により行い、使用培地は多
数の使用可能な適する培地から選択される。典型的な培
地は、ショ糖、グルコースおよび澱粉などの炭素源;大
豆の粉末および粕、綿実油、ピーナツ油ならびに種々の
アミノ酸、それらの混合物およびペプトンなどの窒素源
を利用する。産生条件は、収量および単離し易さに重点
が置かれ、従って、そのような状況に好ましい培地は、
炭素源を糖蜜にして、窒素源を大豆粉末およびアミノ酸
にすることができる。
【0034】通常は栄養無機塩を培養培地に添加し、そ
のような塩としては、次のイオン成分:ナトリウム、カ
リウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸塩、硫酸
塩、塩化物、臭化物、硝酸塩、炭酸塩、第二鉄、第一
鉄、マグネシウム、マンガンなどを供給できる塩が挙げ
られる。微量元素も、通常は、Penicillium chrysogenu
mの生育、発育および代謝のために必須であり、他の培
養培地成分にもともと成分としてすでに与えられていな
いならば、培養培地に直接添加することができる。
のような塩としては、次のイオン成分:ナトリウム、カ
リウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸塩、硫酸
塩、塩化物、臭化物、硝酸塩、炭酸塩、第二鉄、第一
鉄、マグネシウム、マンガンなどを供給できる塩が挙げ
られる。微量元素も、通常は、Penicillium chrysogenu
mの生育、発育および代謝のために必須であり、他の培
養培地成分にもともと成分としてすでに与えられていな
いならば、培養培地に直接添加することができる。
【0035】Penicillium chrysogenum菌株は、ごく少
量の7−ADCAの生産を所望する場合は、1l容振と
うフラスコなどの容積の小さい装置中で培養することが
できる。しかし、もっと大量のアジポイル−7−ADC
Aを所望する場合は、水面下通気醗酵条件下で大規模な
醗酵槽を使用する。
量の7−ADCAの生産を所望する場合は、1l容振と
うフラスコなどの容積の小さい装置中で培養することが
できる。しかし、もっと大量のアジポイル−7−ADC
Aを所望する場合は、水面下通気醗酵条件下で大規模な
醗酵槽を使用する。
【0036】アジポイル−7−ADCAを大規模に製造
する場合は、Penicillium chrysogenum菌株の胞子を傾
斜寒天培地に保持する。傾斜培地の胞子を使用して、小
さい体積の栄養培地に接種する。その栄養培地をインキ
ュベートして、その微生物の培養を大量かつ新鮮で活発
に増殖するように行う。次いで、この栄養培地を大規模
醗酵培地の接種物として使用する。場合によっては、醗
酵培地の接種物としてさらに別の栄養培地を含めるのが
好ましいかもしれない。そのような第二の栄養培地は、
通常、醗酵培地の体積が第一栄養培地よりもかなり大き
い場合に使用する。このように、微生物の胞子が最初に
体積の小さい栄養培地で培養されて体積の大きい栄養培
地用の接種物となる。次いで、体積の大きい栄養培地か
ら十分な濃度の微生物が得られたら、大規模醗酵槽での
急速な醗酵が開始される。栄養培地は、醗酵培地と同じ
組成物を有するか、小規模での微生物の生長および発育
を高めるための他の成分を含むことができる。
する場合は、Penicillium chrysogenum菌株の胞子を傾
斜寒天培地に保持する。傾斜培地の胞子を使用して、小
さい体積の栄養培地に接種する。その栄養培地をインキ
ュベートして、その微生物の培養を大量かつ新鮮で活発
に増殖するように行う。次いで、この栄養培地を大規模
醗酵培地の接種物として使用する。場合によっては、醗
酵培地の接種物としてさらに別の栄養培地を含めるのが
好ましいかもしれない。そのような第二の栄養培地は、
通常、醗酵培地の体積が第一栄養培地よりもかなり大き
い場合に使用する。このように、微生物の胞子が最初に
体積の小さい栄養培地で培養されて体積の大きい栄養培
地用の接種物となる。次いで、体積の大きい栄養培地か
ら十分な濃度の微生物が得られたら、大規模醗酵槽での
急速な醗酵が開始される。栄養培地は、醗酵培地と同じ
組成物を有するか、小規模での微生物の生長および発育
を高めるための他の成分を含むことができる。
【0037】本発明方法で使用するPenicillium chryso
genum菌株は約20〜30℃の温度で最も効率的に培養
されるが、最適な収率は、温度が約22〜28℃、好ま
しくは約25℃のときに得られる。
genum菌株は約20〜30℃の温度で最も効率的に培養
されるが、最適な収率は、温度が約22〜28℃、好ま
しくは約25℃のときに得られる。
【0038】アジポイル−7−ADCAは、Penicilliu
m chrysogenum菌株を大規模槽中で、約10〜30日
間、好ましくは15〜25日間、培養すると生産が最大
になる。しかし、250ml容の振とうフラスコなどの
小規模装置で培養すると、微生物の生長はより急速にな
り、アジポイル−7−ADCAがより短時間、例えば4
〜15日、しばしば5〜7日間で生産される。
m chrysogenum菌株を大規模槽中で、約10〜30日
間、好ましくは15〜25日間、培養すると生産が最大
になる。しかし、250ml容の振とうフラスコなどの
小規模装置で培養すると、微生物の生長はより急速にな
り、アジポイル−7−ADCAがより短時間、例えば4
〜15日、しばしば5〜7日間で生産される。
【0039】大規模醗酵槽の最終pHが8.0以上に達
すると、アジポイル−7−ADCAの収率に悪影響を及
ぼす可能性がある。そのような状況では、醗酵の間中、
培養培地のpHを監視するのが好ましい。アジポイル−
7−ADCAの生産が最大になる前にpHがそのような
レベルに達すると考えられる場合は、適切な酸または緩
衝剤を醗酵培地に添加することによりpHを下方に調整
すると好都合であると考えられる。
すると、アジポイル−7−ADCAの収率に悪影響を及
ぼす可能性がある。そのような状況では、醗酵の間中、
培養培地のpHを監視するのが好ましい。アジポイル−
7−ADCAの生産が最大になる前にpHがそのような
レベルに達すると考えられる場合は、適切な酸または緩
衝剤を醗酵培地に添加することによりpHを下方に調整
すると好都合であると考えられる。
【0040】アジポイル−7−ADCAを生産した後、
醗酵培養液のサンプルをクロマトグラフィーによりテス
トすることができる。
醗酵培養液のサンプルをクロマトグラフィーによりテス
トすることができる。
【0041】ほとんどの水面下通気醗酵と同じように、
培養培地に滅菌空気を通すことにより、Penicillium ch
rysogenum菌株の生長がより効率的に行われ、アジポイ
ル−7−ADCAの生産が高まる。培養培地に通す空気
の体積は通常、単位体積の培養培地につき、1分間に少
なくとも約0.2体積である。しかし、空気の通過速度
を高めると、アジポイル−7−ADCAの生産に対して
有益な影響が得られることが多い。
培養培地に滅菌空気を通すことにより、Penicillium ch
rysogenum菌株の生長がより効率的に行われ、アジポイ
ル−7−ADCAの生産が高まる。培養培地に通す空気
の体積は通常、単位体積の培養培地につき、1分間に少
なくとも約0.2体積である。しかし、空気の通過速度
を高めると、アジポイル−7−ADCAの生産に対して
有益な影響が得られることが多い。
【0042】Penicillium chrysogenum菌株は、典型的
には、アジポイル−7−ADCAの他に多くの副成物お
よび代謝物を生産する。これらのいくつかは酸に対して
感受性であるため、アジポイル−7−ADCAを醗酵培
地から回収する際、醗酵培養液全体を短時間、酸性pH
で処理することにより、副成した不純物の一部を分解す
るのが望ましい。アジポイル−7−ADCA醗酵産物
は、こうして処理した醗酵培養液を濾過して回収し、所
望により、イオン交換樹脂でのクロマトグラフィーによ
り醗酵培地の他の成分から分離し、さらに、必要であれ
ば、続くアジポイル側鎖の酵素的開裂工程の前にクロマ
トグラフィーにより精製することができる。また、その
ようなイオン交換クロマトグラフィーによる分離は、側
鎖の開裂を行った後に行うこともできる。分離上の問題
がある主要な副成物の一つはアジポイル−6−APAで
あり、この副成物は、化学的または酵素的に分解して分
離をより容易にすることができる。最初に、濾過した醗
酵培養液を、n−ブタノールまたは酢酸アミルなどの水
と混和しない有機溶媒で最初に抽出するなどの予備精製
にかけて不純物を除去する。次いで、抽出した培養液
は、さらに、活性炭でのクロマトグラフィーによる予備
的方法で精製することができる。アジペート源の添加 上述のように好ましくは、Penicillium chrysogenumに
対する醗酵培養を行うとき、接種の前にアジペート源を
醗酵培養液の他の成分に添加する。所望により、接種
後、例えば接種の1、2および/または3日後にアジペ
ート源を添加してもよい。アジペート源は、アジピン酸
または培養されているPenicillium chrysogenum菌株に
より同化・利用されてアジポイル−6−APAを生産す
ることができるアジピン酸の1種以上の塩もしくはエス
テルとして定義される。アジピン酸、塩およびエステル
は単独または組み合わせて使用することができる。二ナ
トリウム塩が好ましいが、カリウム塩およびナトリウム
との混合塩も適する。メチルエステルは使用できるが、
エチルエステルは水に不溶である。アジピン酸塩または
エステルは、Penicillium chrysogenum菌株により同化
・利用されてアジポイル−6−APAを生産することが
できるものでなければならない。例えば、アジピン酸自
体は水に不溶であるにもかかわらず、同化可能な塩が適
正なpH条件下で生成されるために適する。適するエクスパンダーゼ酵素 上述したように培養され、アジペート源が与えられてア
ジポイル−6−APAを生産するPenicillium chrysoge
num菌株はまた、エクスパンダーゼ酵素の活性をコード
するDNAによって形質転換されており、その発現の
際、該アジポイル−6−APAはin situで環拡
張されてアジポイル−7−ADCAになる。
には、アジポイル−7−ADCAの他に多くの副成物お
よび代謝物を生産する。これらのいくつかは酸に対して
感受性であるため、アジポイル−7−ADCAを醗酵培
地から回収する際、醗酵培養液全体を短時間、酸性pH
で処理することにより、副成した不純物の一部を分解す
るのが望ましい。アジポイル−7−ADCA醗酵産物
は、こうして処理した醗酵培養液を濾過して回収し、所
望により、イオン交換樹脂でのクロマトグラフィーによ
り醗酵培地の他の成分から分離し、さらに、必要であれ
ば、続くアジポイル側鎖の酵素的開裂工程の前にクロマ
トグラフィーにより精製することができる。また、その
ようなイオン交換クロマトグラフィーによる分離は、側
鎖の開裂を行った後に行うこともできる。分離上の問題
がある主要な副成物の一つはアジポイル−6−APAで
あり、この副成物は、化学的または酵素的に分解して分
離をより容易にすることができる。最初に、濾過した醗
酵培養液を、n−ブタノールまたは酢酸アミルなどの水
と混和しない有機溶媒で最初に抽出するなどの予備精製
にかけて不純物を除去する。次いで、抽出した培養液
は、さらに、活性炭でのクロマトグラフィーによる予備
的方法で精製することができる。アジペート源の添加 上述のように好ましくは、Penicillium chrysogenumに
対する醗酵培養を行うとき、接種の前にアジペート源を
醗酵培養液の他の成分に添加する。所望により、接種
後、例えば接種の1、2および/または3日後にアジペ
ート源を添加してもよい。アジペート源は、アジピン酸
または培養されているPenicillium chrysogenum菌株に
より同化・利用されてアジポイル−6−APAを生産す
ることができるアジピン酸の1種以上の塩もしくはエス
テルとして定義される。アジピン酸、塩およびエステル
は単独または組み合わせて使用することができる。二ナ
トリウム塩が好ましいが、カリウム塩およびナトリウム
との混合塩も適する。メチルエステルは使用できるが、
エチルエステルは水に不溶である。アジピン酸塩または
エステルは、Penicillium chrysogenum菌株により同化
・利用されてアジポイル−6−APAを生産することが
できるものでなければならない。例えば、アジピン酸自
体は水に不溶であるにもかかわらず、同化可能な塩が適
正なpH条件下で生成されるために適する。適するエクスパンダーゼ酵素 上述したように培養され、アジペート源が与えられてア
ジポイル−6−APAを生産するPenicillium chrysoge
num菌株はまた、エクスパンダーゼ酵素の活性をコード
するDNAによって形質転換されており、その発現の
際、該アジポイル−6−APAはin situで環拡
張されてアジポイル−7−ADCAになる。
【0043】アジポイル−6−APAは、アジペート源
を添加して培養したPenicillium chrysogenumにより細
胞内で生産される。また、その細胞内、すなわちin
situ条件では、形質転換されたPenicillium chryso
genum がエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDN
Aを発現し、その際、その酵素が基質としてのアジポイ
ル−6−APAに作用して環を拡張させ、アジポイル−
7−ADCAを生成させる。
を添加して培養したPenicillium chrysogenumにより細
胞内で生産される。また、その細胞内、すなわちin
situ条件では、形質転換されたPenicillium chryso
genum がエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDN
Aを発現し、その際、その酵素が基質としてのアジポイ
ル−6−APAに作用して環を拡張させ、アジポイル−
7−ADCAを生成させる。
【0044】本発明の新規生化学的方法は、エクスパン
ダーゼ酵素の活性をコードするDNAによる上述した型
の Penicillium chrysogenum菌株の形質転換をその範囲
内に含み、その酵素の発現の際、アジポイル−6−AP
Aがin situで環拡張されてアジポイル−7−A
DCAを生じる。すなわち、Penicillium chrysogenu m
を形質転換するDNAは、従来技術において理解されて
いるエクスパンダーゼ酵素の活性、すなわちイソペニシ
リンNを環拡張してDAOCにする能力だけでなく、ア
ジポイル−6−APAを環拡張してアジポイル−7−A
DCAにする能力も有する酵素を発現しなければならな
い。しかし、側鎖の類似性からして、どのエクスパンダ
ーゼ酵素も本発明の新規生化学的方法において使用可能
であると考えられる。
ダーゼ酵素の活性をコードするDNAによる上述した型
の Penicillium chrysogenum菌株の形質転換をその範囲
内に含み、その酵素の発現の際、アジポイル−6−AP
Aがin situで環拡張されてアジポイル−7−A
DCAを生じる。すなわち、Penicillium chrysogenu m
を形質転換するDNAは、従来技術において理解されて
いるエクスパンダーゼ酵素の活性、すなわちイソペニシ
リンNを環拡張してDAOCにする能力だけでなく、ア
ジポイル−6−APAを環拡張してアジポイル−7−A
DCAにする能力も有する酵素を発現しなければならな
い。しかし、側鎖の類似性からして、どのエクスパンダ
ーゼ酵素も本発明の新規生化学的方法において使用可能
であると考えられる。
【0045】従来技術の章ですでに述べたように、Stre
ptomyces clavuligerus ATCC27064由来のエクスパンダ
ーゼ酵素は、その全塩基配列が分析されているととも
に、エンドヌクレアーゼ制限酵素による地図作製により
特徴付けられている。しかし、同一酵素であると思われ
るS.clavuligerus NRRL3585 由来のものは、分子量が異
なると報告されているに止まり、塩基配列は分析されて
いない。
ptomyces clavuligerus ATCC27064由来のエクスパンダ
ーゼ酵素は、その全塩基配列が分析されているととも
に、エンドヌクレアーゼ制限酵素による地図作製により
特徴付けられている。しかし、同一酵素であると思われ
るS.clavuligerus NRRL3585 由来のものは、分子量が異
なると報告されているに止まり、塩基配列は分析されて
いない。
【0046】従来技術においてすでに同定されたこれら
のエクスパンダーゼ酵素は、本発明の新規生化学的方法
において有用である。まだ同定されていないS.clavulig
erusの異なる菌株または別の属の微生物に由来する他の
エクスパンダーゼ酵素でさえも、本発明の新規生化学的
方法を行うのに適すると考えられる。有用な微生物の新
しい菌株および属を同定し、エクスパンダーゼ酵素とさ
れるものを単離し、それらが本発明方法での使用に適し
ていることを検証するための方法は簡単であり、当業者
には周知である。有用な微生物の候補となる新しい菌株
および属の無細胞抽出物のスクリーニングは、該抽出物
を、第一鉄(Fe2+)イオン、アスコルビン酸塩、α−
ケトグルタル酸塩およびアデノシン三リン酸(ATP)
などの公知のDAOCS補助因子の存在下でアジポイル
−6−APAに添加するという、信頼でき再現性のある
方法で行うことができる。アジポイル−6−APA基質
は、下記に詳細に記載する方法と同様にしてアジペート
源を未形質転換Penicillium chrysogenumに供給するこ
とにより十分な量で製造することができる。所望のエク
スパンダーゼ酵素は、アジポイル−7−ADCAが生成
するならば存在し、その有無はクロマトグラフィーによ
り検出することができる。
のエクスパンダーゼ酵素は、本発明の新規生化学的方法
において有用である。まだ同定されていないS.clavulig
erusの異なる菌株または別の属の微生物に由来する他の
エクスパンダーゼ酵素でさえも、本発明の新規生化学的
方法を行うのに適すると考えられる。有用な微生物の新
しい菌株および属を同定し、エクスパンダーゼ酵素とさ
れるものを単離し、それらが本発明方法での使用に適し
ていることを検証するための方法は簡単であり、当業者
には周知である。有用な微生物の候補となる新しい菌株
および属の無細胞抽出物のスクリーニングは、該抽出物
を、第一鉄(Fe2+)イオン、アスコルビン酸塩、α−
ケトグルタル酸塩およびアデノシン三リン酸(ATP)
などの公知のDAOCS補助因子の存在下でアジポイル
−6−APAに添加するという、信頼でき再現性のある
方法で行うことができる。アジポイル−6−APA基質
は、下記に詳細に記載する方法と同様にしてアジペート
源を未形質転換Penicillium chrysogenumに供給するこ
とにより十分な量で製造することができる。所望のエク
スパンダーゼ酵素は、アジポイル−7−ADCAが生成
するならば存在し、その有無はクロマトグラフィーによ
り検出することができる。
【0047】また、公知の組換え技術を使用すると、S.
clavuligerusおよびC.acremoniumのエクスパンダーゼ配
列に基づいてDNAプローブを作り、本発明方法での使
用に適するエクスパンダーゼを生産しそうな候補微生物
のDNA部分をスクリーニングすることができる。エクスパンダーゼ酵素の可能源 すでに述べたように、エクスパンダーゼ酵素は、ペナム
環構造(ペニシリン型分子に見られる)を拡張してセフ
−3−エム環(セファロスポリンに見られる)にするの
を触媒する酵素である。従って、セフェム環を含む代謝
産物を生産するどの有機体もエクスパンダーゼをコード
するDNAの可能源である。そのような有機体の例を下
記に挙げるが、このリストは例示に過ぎず、全てを網羅
していると考えるべきではない。 真菌:Cephalosporium acremonium Cephalosporium sp.Emericellopsis Paecilomyces Scopulariopsis Diheterospora Spiroidium Anoxiopsis 放線菌:Streptomyces clavuligerus S.lipmanii S.wadayamensis S.todorominensis S.filipinensis cephamycini S.heteromorphus S.panayensis S.griseus S.cattleya Nocardia lactamdurans 他の細菌:Flavobacterium sp.Alcaligenes denitrificans Mycoplana bullata Providencia rettgeri Lysobacter lactamgenus 上記で挙げた生体のエクスパンダーゼは、さらに研究す
るための単なる候補に過ぎず、それらが全て本発明の新
規方法に適するとは限らない。例えば、C.acremoniumに
由来する酵素などのエクスパンダーゼ活性およびヒドロ
キシラーゼ活性の両方を有する酵素を使用すると、ヒド
ロキシル化アジポイル−7−ADCA、すなわちアジポ
イル側鎖のついたDACが製造される可能性がある。エクスパンダーゼ活性をコードするDNA断片の単離 所望のエクスパンダーゼ酵素の存在が上記方法により検
出されると、エクスパンダーゼ酵素活性をコードするD
NAの単離法も簡単で、当業者には周知である。エクス
パンダーゼ酵素をコードする遺伝子の公知配列および部
分配列に基づくDNAプローブは、所望の酵素をコード
する単離すべきDNAとハイブリッド形成するように構
成される。そのようなプローブの構成は、エクスパンダ
ーゼ酵素をコードするアミノ酸およびヌクレオチド塩基
配列ならびに関与する特定の微生物の優先コドンに関す
る知見に基づく。Streptomyces clavuligerus ATCC2706
4のゲノムDNAに適用されるこの種の典型的方法の詳
細な説明を以下でさらに述べる。
clavuligerusおよびC.acremoniumのエクスパンダーゼ配
列に基づいてDNAプローブを作り、本発明方法での使
用に適するエクスパンダーゼを生産しそうな候補微生物
のDNA部分をスクリーニングすることができる。エクスパンダーゼ酵素の可能源 すでに述べたように、エクスパンダーゼ酵素は、ペナム
環構造(ペニシリン型分子に見られる)を拡張してセフ
−3−エム環(セファロスポリンに見られる)にするの
を触媒する酵素である。従って、セフェム環を含む代謝
産物を生産するどの有機体もエクスパンダーゼをコード
するDNAの可能源である。そのような有機体の例を下
記に挙げるが、このリストは例示に過ぎず、全てを網羅
していると考えるべきではない。 真菌:Cephalosporium acremonium Cephalosporium sp.Emericellopsis Paecilomyces Scopulariopsis Diheterospora Spiroidium Anoxiopsis 放線菌:Streptomyces clavuligerus S.lipmanii S.wadayamensis S.todorominensis S.filipinensis cephamycini S.heteromorphus S.panayensis S.griseus S.cattleya Nocardia lactamdurans 他の細菌:Flavobacterium sp.Alcaligenes denitrificans Mycoplana bullata Providencia rettgeri Lysobacter lactamgenus 上記で挙げた生体のエクスパンダーゼは、さらに研究す
るための単なる候補に過ぎず、それらが全て本発明の新
規方法に適するとは限らない。例えば、C.acremoniumに
由来する酵素などのエクスパンダーゼ活性およびヒドロ
キシラーゼ活性の両方を有する酵素を使用すると、ヒド
ロキシル化アジポイル−7−ADCA、すなわちアジポ
イル側鎖のついたDACが製造される可能性がある。エクスパンダーゼ活性をコードするDNA断片の単離 所望のエクスパンダーゼ酵素の存在が上記方法により検
出されると、エクスパンダーゼ酵素活性をコードするD
NAの単離法も簡単で、当業者には周知である。エクス
パンダーゼ酵素をコードする遺伝子の公知配列および部
分配列に基づくDNAプローブは、所望の酵素をコード
する単離すべきDNAとハイブリッド形成するように構
成される。そのようなプローブの構成は、エクスパンダ
ーゼ酵素をコードするアミノ酸およびヌクレオチド塩基
配列ならびに関与する特定の微生物の優先コドンに関す
る知見に基づく。Streptomyces clavuligerus ATCC2706
4のゲノムDNAに適用されるこの種の典型的方法の詳
細な説明を以下でさらに述べる。
【0048】エクスパンダーゼ酵素活性をコードするD
NAの単離は、組換えDNA技術でよく知られた制限お
よび連結方法により行われる。適正な制限断片を得て単
離するには、関与する微生物のゲノムのエンドヌクレア
ーゼによる制限酵素地図を知ることが必要である。S.cl
avuligerusおよびC.acremoniumの制限酵素地図はすでに
入手可能である。すなわち、前者の場合は、制限酵素B
amHIおよびSalIを使用すると、電気泳動によ
り、所望の1.8および2.2kbの断片が得られる。Penicillium chrysogenum 菌株の形質転換 エクスパンダーゼ活性をコードするDNA断片が得られ
たら、それらを、プロモータ、翻訳活性化配列、耐性マ
ーカー、調節配列、コスミドフォーマー、ならびに形質
転換を可能にし、または促進し、遺伝子産物の発現を行
い、形質転換細胞の単離を容易にする他のDNA塩基配
列とともに、プラスミドまたは他の発現ベクターに挿入
(連結)することができる。こうして構成した発現ベク
ターを使用すると、Penicillium chrysogenum菌株の形
質転換およびエクスパンダーゼ酵素の活性の細胞内発現
が達成される。形質転換および発現を達成するために使
用される技術は文献により公知であり、そのような典型
的な方法の詳細な説明を以下でさらに述べる。
NAの単離は、組換えDNA技術でよく知られた制限お
よび連結方法により行われる。適正な制限断片を得て単
離するには、関与する微生物のゲノムのエンドヌクレア
ーゼによる制限酵素地図を知ることが必要である。S.cl
avuligerusおよびC.acremoniumの制限酵素地図はすでに
入手可能である。すなわち、前者の場合は、制限酵素B
amHIおよびSalIを使用すると、電気泳動によ
り、所望の1.8および2.2kbの断片が得られる。Penicillium chrysogenum 菌株の形質転換 エクスパンダーゼ活性をコードするDNA断片が得られ
たら、それらを、プロモータ、翻訳活性化配列、耐性マ
ーカー、調節配列、コスミドフォーマー、ならびに形質
転換を可能にし、または促進し、遺伝子産物の発現を行
い、形質転換細胞の単離を容易にする他のDNA塩基配
列とともに、プラスミドまたは他の発現ベクターに挿入
(連結)することができる。こうして構成した発現ベク
ターを使用すると、Penicillium chrysogenum菌株の形
質転換およびエクスパンダーゼ酵素の活性の細胞内発現
が達成される。形質転換および発現を達成するために使
用される技術は文献により公知であり、そのような典型
的な方法の詳細な説明を以下でさらに述べる。
【0049】上記で既に詳述したように、形質転換され
たPenicillium chrysogenum菌株は、エクスパンダーゼ
酵素の活性を細胞内で発現し、in situでアジポ
イル−6−APA基質に作用して環を拡張し、アジポイ
ル−7−ADCAにする。新規な形質転換細胞 エクスパンダーゼ遺伝子の活性を発現する特定のPenici
llium chrysogenum形質転換細胞は、本発明の好ましい
態様であり、Cantwell et al. (1990) CurrentGenetic,
17, 213-221 にあるような従来の構成と比べて新規で
ある。いずれの構築でも、in vitro突然変異誘
発を使用してプロモータをエクスパンダーゼ遺伝子に連
結する。Cantwellの構築では、エクスパンダーゼ遺伝子
のATGにNdeI部位を導入し、それを、XbaI/
NdeIリンカーによりIPNSプロモータの3′−末
端にあるXbaI部位に連結する。本発明の構築では、
エクスパンダーゼ遺伝子のATGにNcoI部位を作
り、IPNSリンカーの3’−末端にあるNcoI部位
に連結する。この結果、これらの構築におけるプロモー
タ−遺伝子連結部の周りの塩基配列は次のようになる。
たPenicillium chrysogenum菌株は、エクスパンダーゼ
酵素の活性を細胞内で発現し、in situでアジポ
イル−6−APA基質に作用して環を拡張し、アジポイ
ル−7−ADCAにする。新規な形質転換細胞 エクスパンダーゼ遺伝子の活性を発現する特定のPenici
llium chrysogenum形質転換細胞は、本発明の好ましい
態様であり、Cantwell et al. (1990) CurrentGenetic,
17, 213-221 にあるような従来の構成と比べて新規で
ある。いずれの構築でも、in vitro突然変異誘
発を使用してプロモータをエクスパンダーゼ遺伝子に連
結する。Cantwellの構築では、エクスパンダーゼ遺伝子
のATGにNdeI部位を導入し、それを、XbaI/
NdeIリンカーによりIPNSプロモータの3′−末
端にあるXbaI部位に連結する。本発明の構築では、
エクスパンダーゼ遺伝子のATGにNcoI部位を作
り、IPNSリンカーの3’−末端にあるNcoI部位
に連結する。この結果、これらの構築におけるプロモー
タ−遺伝子連結部の周りの塩基配列は次のようになる。
【0050】
Xba1 NcoI
IPNS プロモータ 5' TCTAGACACC ATGG 3' 配列番号:1Strep
エクスパンダーゼ 5' GTGAGAGTTG ATGGAC 3' 配列番号:2
Cantwell 5' TCTAGACACT ATGGAC 3' 配列番号:3
本発明 5' TCTAGACACC ATGGAC 3' 配列番号:4
Cantwell構築では、CがTで置き換わっているが、本発
明の構築では、Cは保持されている。すなわち、ATG
開始コドンのすぐ隣のIPNSプロモータの配列は、天
然に存在するIPNS遺伝子に見られるものと正確に一
致する。この従来のプロモータは、ただ1個のヌクレオ
チド塩基が異なるだけだが、翻訳効率が低下し、その結
果エクスパンダーゼ遺伝子の発現レベルを下げる可能性
がある。
明の構築では、Cは保持されている。すなわち、ATG
開始コドンのすぐ隣のIPNSプロモータの配列は、天
然に存在するIPNS遺伝子に見られるものと正確に一
致する。この従来のプロモータは、ただ1個のヌクレオ
チド塩基が異なるだけだが、翻訳効率が低下し、その結
果エクスパンダーゼ遺伝子の発現レベルを下げる可能性
がある。
【0051】他の違いは、構築に含まれるプロモータま
たは遺伝子の領域である。Cantwell構築には、IPNS
プロモータの5′BamHIからXbaI3′までの領
域を含むが、本発明のベクターはそのプロモータの5′
NcoIからNcoI3′までの領域を含む〔Diez, et
al., (1990), J. Biol. Chem. 265, 16358-16365 〕。
この結果、Cantwell構築のIPNSプロモータには5′
末端に約250塩基対が付加される。しかし、この領域
はIPNS遺伝子の上流にあるACVシンセターゼ遺伝
子の読み取り枠にある。
たは遺伝子の領域である。Cantwell構築には、IPNS
プロモータの5′BamHIからXbaI3′までの領
域を含むが、本発明のベクターはそのプロモータの5′
NcoIからNcoI3′までの領域を含む〔Diez, et
al., (1990), J. Biol. Chem. 265, 16358-16365 〕。
この結果、Cantwell構築のIPNSプロモータには5′
末端に約250塩基対が付加される。しかし、この領域
はIPNS遺伝子の上流にあるACVシンセターゼ遺伝
子の読み取り枠にある。
【0052】また、Cantwell構築は、Streptomyces遺伝
子を、ATGからその遺伝子の3′側のBamHI部位
まで含むが、本発明のベクターは、ATGからその遺伝
子の3′側のSalI部位まで含む〔Kovacevic et a
l., (1989), J. Bacteriol., 171, 754-760〕。この結
果、Cantwell構築の3′末端には約1000 bpsの
塩基配列が付加される。本発明の構築はさらに、エクス
パンダーゼ遺伝子の上流域を、ATGの5′側のBam
HI部位まで含むが、エクスパンダーゼ遺伝子の読み取
り枠とは IPNSプロモータにより分離されている。
子を、ATGからその遺伝子の3′側のBamHI部位
まで含むが、本発明のベクターは、ATGからその遺伝
子の3′側のSalI部位まで含む〔Kovacevic et a
l., (1989), J. Bacteriol., 171, 754-760〕。この結
果、Cantwell構築の3′末端には約1000 bpsの
塩基配列が付加される。本発明の構築はさらに、エクス
パンダーゼ遺伝子の上流域を、ATGの5′側のBam
HI部位まで含むが、エクスパンダーゼ遺伝子の読み取
り枠とは IPNSプロモータにより分離されている。
【0053】本発明の構築が公知文献に記載されたもの
とさらに異なる点は、使用する選択的マーカーに関す
る。Penicillium IPNSプロモータの使用:本発明の構築
におけるphleomycin遺伝子融合は、多重複製の組み込み
または高レベルの発現を可能にし、従ってエクスパンダ
ーゼ遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を高い割
合で産生する可能性がある位置での組み込みを選択する
ようになる。
とさらに異なる点は、使用する選択的マーカーに関す
る。Penicillium IPNSプロモータの使用:本発明の構築
におけるphleomycin遺伝子融合は、多重複製の組み込み
または高レベルの発現を可能にし、従ってエクスパンダ
ーゼ遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を高い割
合で産生する可能性がある位置での組み込みを選択する
ようになる。
【0054】上述した型の新規形質転換細胞は、PC1
00と命名したPenicillium chrysogenumである。その
菌学上の特性としては、典型的には、広範囲に広がる緑
青色〜緑色で、滑らかなベルベット様で黄色の粒のつい
たコロニーを生じ、寒天中に黄色が逆拡散し、分生子頭
の分枝は全体に滑らかで、分生子は長さが3〜4mmの
楕円形〜球形であることが挙げられる。P.chrysogenum
に対する許容可能な培養条件は、1lの蒸留水中にラク
トース一水和物1.5%(w/v)、コーン浸出液0.
5%(v/v)、ペプトン0.5%(w/v)、NaC
l0.4%(w/v)、MgSO4・7H2O0.05
%(w/v)、KH2PO40.06%(w/v)、F
eCl3・6H2O0.0005%(w/v)、CuS
O4・5H2O0.0002%(w/v)、寒天3.0
%(w/v)を含む固形培地を使用し、pH4.8であ
る。すぐ上に記載し、PC100と命名したP.chrysoge
numは、American Type Culture Collection(ATCC)(1
2301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852)に
ATCC74182の受託番号(寄託日:1992年8月21日に受理さ
れ、生存は1992年8月27日に確認)で寄託されている。アジポイル側鎖の開裂 本発明の新規生化学的方法の次の工程は、アジポイル−
7−ADCAからアジポイル側鎖を開裂することであ
り、この工程では、前の工程の産物をアジポイルアシラ
ーゼ酵素系で処理する必要がある。上記ですでに述べた
ように、本発明の重要な成果の一つは、アジポイル−7
−ADCAの製造に導く全工程を単一の醗酵培養で行う
ことができることである。これにより、その方法の工程
ごとに中間物質を単離し、部分的に精製する必要がない
点で有効性が非常に改善される。しかし、この最終工程
にアジポイルアシラーゼ酵素系は存在しない、すなわ
ち、最初の醗酵培養においてin situで生成され
ていない。
00と命名したPenicillium chrysogenumである。その
菌学上の特性としては、典型的には、広範囲に広がる緑
青色〜緑色で、滑らかなベルベット様で黄色の粒のつい
たコロニーを生じ、寒天中に黄色が逆拡散し、分生子頭
の分枝は全体に滑らかで、分生子は長さが3〜4mmの
楕円形〜球形であることが挙げられる。P.chrysogenum
に対する許容可能な培養条件は、1lの蒸留水中にラク
トース一水和物1.5%(w/v)、コーン浸出液0.
5%(v/v)、ペプトン0.5%(w/v)、NaC
l0.4%(w/v)、MgSO4・7H2O0.05
%(w/v)、KH2PO40.06%(w/v)、F
eCl3・6H2O0.0005%(w/v)、CuS
O4・5H2O0.0002%(w/v)、寒天3.0
%(w/v)を含む固形培地を使用し、pH4.8であ
る。すぐ上に記載し、PC100と命名したP.chrysoge
numは、American Type Culture Collection(ATCC)(1
2301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852)に
ATCC74182の受託番号(寄託日:1992年8月21日に受理さ
れ、生存は1992年8月27日に確認)で寄託されている。アジポイル側鎖の開裂 本発明の新規生化学的方法の次の工程は、アジポイル−
7−ADCAからアジポイル側鎖を開裂することであ
り、この工程では、前の工程の産物をアジポイルアシラ
ーゼ酵素系で処理する必要がある。上記ですでに述べた
ように、本発明の重要な成果の一つは、アジポイル−7
−ADCAの製造に導く全工程を単一の醗酵培養で行う
ことができることである。これにより、その方法の工程
ごとに中間物質を単離し、部分的に精製する必要がない
点で有効性が非常に改善される。しかし、この最終工程
にアジポイルアシラーゼ酵素系は存在しない、すなわ
ち、最初の醗酵培養においてin situで生成され
ていない。
【0055】本発明の新規生化学的方法をバッチ式で行
う場合は、最初の工程の産物を単離し、部分的に精製す
る必要がある。このための予備的操作については上記で
すでに記載した。
う場合は、最初の工程の産物を単離し、部分的に精製す
る必要がある。このための予備的操作については上記で
すでに記載した。
【0056】にもかかわらず、本発明の方法は、アジポ
イル−7−ADCAが7−ADCAに酵素的に変換でき
るようにアジポイルアシラーゼをアジポイル−7−AD
CAに効果的に接触させる方法であればどの方法でも行
うことができる。これは、「接触」の最も広い意味での
定義である。原料として粗アジポイル−7−ADCAの
無細胞培養液を使用し、それを、粗アジポイルアシラー
ゼ培養液によりバッチ式で処理することが可能である。
この方法は、最初の反応物の実質的な精製を必要としな
いので、ある程度の有効性が得られる。もちろん、改良
は可能である。例えば、反応物は、互いに接触させる前
に所望する程度に精製してもよい。また、バッチ法では
なく連続的方法でその工程を行うこともできる。反応物
自体の接触は、処理技術の向上に応じ、種々の方法で改
良することができる。すなわち、固定化酵素を、例えば
アジポイルアシラーゼを含むカラムの形で使用し、アジ
ポイル−7−ADCAをそのカラムに通す。また、固定
化酵素を懸濁物としてアジポイル−7−ADCAに添加
してもよい。そのような固定化酵素系は、酵素の回収が
容易で、何度でも再使用できるという利点を有する。そ
のような処理技術の他の例は、膜反応器に関するもので
ある。反応物を接触させる好ましい方法は、固定化酵素
カラムによる方法である。開裂工程に有用なアジポイルアシラーゼ酵素 アジポイル側鎖に対して既知特異性を有する酵素は多数
存在する。市販のRAEVCorp.製アジポイルアシラーゼを
使用して得られる結果は、下記の実施例でさらに詳述す
る。文献には、セファロスポリン型分子からアジポイル
側鎖を脱離する他の7種類の酵素が報告されている。こ
れら7種類の酵素のうち6個はPseudomonas種に由来
し、7番目はBacillus種に由来する。各々のPseudomona
s酵素はいくつかの類似性があるが、全7種は、物理的
/生物学的特性がある程度異なる。それらの特性のいく
つかを下記にまとめる。
イル−7−ADCAが7−ADCAに酵素的に変換でき
るようにアジポイルアシラーゼをアジポイル−7−AD
CAに効果的に接触させる方法であればどの方法でも行
うことができる。これは、「接触」の最も広い意味での
定義である。原料として粗アジポイル−7−ADCAの
無細胞培養液を使用し、それを、粗アジポイルアシラー
ゼ培養液によりバッチ式で処理することが可能である。
この方法は、最初の反応物の実質的な精製を必要としな
いので、ある程度の有効性が得られる。もちろん、改良
は可能である。例えば、反応物は、互いに接触させる前
に所望する程度に精製してもよい。また、バッチ法では
なく連続的方法でその工程を行うこともできる。反応物
自体の接触は、処理技術の向上に応じ、種々の方法で改
良することができる。すなわち、固定化酵素を、例えば
アジポイルアシラーゼを含むカラムの形で使用し、アジ
ポイル−7−ADCAをそのカラムに通す。また、固定
化酵素を懸濁物としてアジポイル−7−ADCAに添加
してもよい。そのような固定化酵素系は、酵素の回収が
容易で、何度でも再使用できるという利点を有する。そ
のような処理技術の他の例は、膜反応器に関するもので
ある。反応物を接触させる好ましい方法は、固定化酵素
カラムによる方法である。開裂工程に有用なアジポイルアシラーゼ酵素 アジポイル側鎖に対して既知特異性を有する酵素は多数
存在する。市販のRAEVCorp.製アジポイルアシラーゼを
使用して得られる結果は、下記の実施例でさらに詳述す
る。文献には、セファロスポリン型分子からアジポイル
側鎖を脱離する他の7種類の酵素が報告されている。こ
れら7種類の酵素のうち6個はPseudomonas種に由来
し、7番目はBacillus種に由来する。各々のPseudomona
s酵素はいくつかの類似性があるが、全7種は、物理的
/生物学的特性がある程度異なる。それらの特性のいく
つかを下記にまとめる。
【0057】
【表1】
上記アジポイルアシラーゼ酵素は全て、本発明の新規性
化学的方法に有用である。本発明方法に有用な他のアジ
ポイルアシラーゼを、候補の酵素を、作用すべき実際の
基質であるアジポイル−7−ADCAに対してテストす
ることにより容易に発見できるかもしれない。よさそう
な結果が得られたら、信頼できて再現性のある方法によ
り、候補の酵素が本発明方法に実際に有用であることを
測定する。基質は、Szewczuk and Wellman-Bednawska i
n Clin. Chim. Acta (1978) 84,19-26により報告された
方法を改良して無水アジピン酸と7−ADCAとの反応
から直接調製できる。無水アジピン酸は、J. Macromol.
Sci. Chem. (1990) A27,397-412に記載されたAlbertso
n and Lundmarkの方法に従って調製できる。7−ADC
Aは、いくつかの市販のもの(例えば、E. R. Squibb &
Sons, Ltd., NJおよび Interchem Corp., NJ)を利用
する。
化学的方法に有用である。本発明方法に有用な他のアジ
ポイルアシラーゼを、候補の酵素を、作用すべき実際の
基質であるアジポイル−7−ADCAに対してテストす
ることにより容易に発見できるかもしれない。よさそう
な結果が得られたら、信頼できて再現性のある方法によ
り、候補の酵素が本発明方法に実際に有用であることを
測定する。基質は、Szewczuk and Wellman-Bednawska i
n Clin. Chim. Acta (1978) 84,19-26により報告された
方法を改良して無水アジピン酸と7−ADCAとの反応
から直接調製できる。無水アジピン酸は、J. Macromol.
Sci. Chem. (1990) A27,397-412に記載されたAlbertso
n and Lundmarkの方法に従って調製できる。7−ADC
Aは、いくつかの市販のもの(例えば、E. R. Squibb &
Sons, Ltd., NJおよび Interchem Corp., NJ)を利用
する。
【0058】高速比色法を使用して候補の酵素を粗選別
する場合は、アジポイル−7−ADCA基質の代わりに
アジポイル−PABA(パラ−アミノ安息香酸)または
アジポイル−PNA(パラ−ニトロアニリン)などの呈
色基質を使用してもよい。側鎖の開裂により発色種が生
じ、その種の有無および濃度が比色計により容易に測定
される。これらおよび他の適する比色法に関するさらに
詳細な情報は、Marelli, L. P. (1968), J. Pharm. Sc
i., 57:2172-2173; Szasz, G. (1969), Clin. Chem. 1
5:124-136; Szewczuk, A. et al.,(1980) Anal. Bioche
m. 103:166-169;およびReyes, F. et al.,(1989) J. Ph
arma. Pharmacol. 41:136-137を参照。
する場合は、アジポイル−7−ADCA基質の代わりに
アジポイル−PABA(パラ−アミノ安息香酸)または
アジポイル−PNA(パラ−ニトロアニリン)などの呈
色基質を使用してもよい。側鎖の開裂により発色種が生
じ、その種の有無および濃度が比色計により容易に測定
される。これらおよび他の適する比色法に関するさらに
詳細な情報は、Marelli, L. P. (1968), J. Pharm. Sc
i., 57:2172-2173; Szasz, G. (1969), Clin. Chem. 1
5:124-136; Szewczuk, A. et al.,(1980) Anal. Bioche
m. 103:166-169;およびReyes, F. et al.,(1989) J. Ph
arma. Pharmacol. 41:136-137を参照。
【0059】acyIIの大きいサブユニットを持つRA
EV酵素のN−末端アミノ酸配列を、上記表に記載した
GK16と比較した。比較結果を下記に示す(括弧内
は、決定的なものではないことを示す。)。 RAEV 配列番号:5 S N (S)(G) A V A P G K T A N G N A L (L) L Q N (P) GK16 配列番号:6 S N S W A V A P G K T A N G N A L L L Q N P acyII 配列番号:7 S N N W A V A P G R T A T G R P I L A G D P 示した配列から、これら3個のペプチドは全て、明らか
に関連している。しかし、上記で示した配列と同様のN
−末端配列を有する蛋白は、Arthrobacter菌株により産
生されるペニシリンGアシラーゼの場合のように、必ず
しもアジポイルアシラーゼ活性を有するとは限らない。
他方、上記N−末端配列との相同性が小さくとも本発明
方法に有用なアジポイルアシラーゼがある。例えば、上
記の表で述べた Asahi酵素acyIおよび Fujisawa B.
laterosporus J1 アシラーゼは一応のアジポイル−7−
ACAアシラーゼ活性を示すが、上記に記載した他の酵
素との配列の相同関係はない。従って、新規生化学的方
法の第二工程に有用なアジポイルアシラーゼに関する本
発明の範囲は、候補の酵素がアジポイル−7−ADCA
からアジポイル側鎖を開裂することができるかどうかで
決定され、それは、上記で詳述したように容易かつ確実
に決定することができる。
EV酵素のN−末端アミノ酸配列を、上記表に記載した
GK16と比較した。比較結果を下記に示す(括弧内
は、決定的なものではないことを示す。)。 RAEV 配列番号:5 S N (S)(G) A V A P G K T A N G N A L (L) L Q N (P) GK16 配列番号:6 S N S W A V A P G K T A N G N A L L L Q N P acyII 配列番号:7 S N N W A V A P G R T A T G R P I L A G D P 示した配列から、これら3個のペプチドは全て、明らか
に関連している。しかし、上記で示した配列と同様のN
−末端配列を有する蛋白は、Arthrobacter菌株により産
生されるペニシリンGアシラーゼの場合のように、必ず
しもアジポイルアシラーゼ活性を有するとは限らない。
他方、上記N−末端配列との相同性が小さくとも本発明
方法に有用なアジポイルアシラーゼがある。例えば、上
記の表で述べた Asahi酵素acyIおよび Fujisawa B.
laterosporus J1 アシラーゼは一応のアジポイル−7−
ACAアシラーゼ活性を示すが、上記に記載した他の酵
素との配列の相同関係はない。従って、新規生化学的方
法の第二工程に有用なアジポイルアシラーゼに関する本
発明の範囲は、候補の酵素がアジポイル−7−ADCA
からアジポイル側鎖を開裂することができるかどうかで
決定され、それは、上記で詳述したように容易かつ確実
に決定することができる。
【0060】他の方法により適するアジポイルアシラー
ゼを見出すことは可能である。例えば、EPA-A-0453048
は、Pseudomonas SY-77-1により生産されるグルタリル
アシラーゼのアジポイル開裂活性の改善方法を記載して
いる。α−サブユニット内の特定位置の種々のアミノ酸
を置き換えることにより、(アジポイル−セリンから
の)アジポイル開裂速度が3〜5倍高まるのが認められ
た。そのような改善された酵素も本発明での使用に適す
る。なお、EP-A-0453048は、確かにアジポイル側鎖に対
する活性が改善されたアシラーゼを例示しているが、ア
ジポイル−セファロスポリンをまず生成させる(化学的
または本明細書に記載した方法と類似した生化学的方法
による)方法は全く記載していない。好ましい態様の記載 以下に本発明の好ましい態様について詳細に記載する
が、これらは説明のためのものに過ぎず、本発明はこれ
らの態様によって限定されるものではない。
ゼを見出すことは可能である。例えば、EPA-A-0453048
は、Pseudomonas SY-77-1により生産されるグルタリル
アシラーゼのアジポイル開裂活性の改善方法を記載して
いる。α−サブユニット内の特定位置の種々のアミノ酸
を置き換えることにより、(アジポイル−セリンから
の)アジポイル開裂速度が3〜5倍高まるのが認められ
た。そのような改善された酵素も本発明での使用に適す
る。なお、EP-A-0453048は、確かにアジポイル側鎖に対
する活性が改善されたアシラーゼを例示しているが、ア
ジポイル−セファロスポリンをまず生成させる(化学的
または本明細書に記載した方法と類似した生化学的方法
による)方法は全く記載していない。好ましい態様の記載 以下に本発明の好ましい態様について詳細に記載する
が、これらは説明のためのものに過ぎず、本発明はこれ
らの態様によって限定されるものではない。
【0061】
【実施例】実施例1 Penicillium chrysogenum 培養条件
これらの方法で使用するPenicillium chrysogenumは、
1lの蒸留水中にラクトース一水和物1.5%(w/
v)、コーン浸出液0.5%(v/v)、ペプトン0.
5%(w/v)、NaCl0.4%(w/v)、MgS
O4・7H2O0.05%(w/v)、KH2PO
40.06%(w/v)、FeCl3・6H2O0.0
005%(w/v)、CuSO4・5H2O0.000
2%(w/v)、寒天3.0%(w/v)を含むLCS
B培地(pH4.8)を含む平板上に保持した。25
℃、相対湿度65%で12日間後、単集落を取り出し、
ガラスビーズを含むねじ栓付き試験管中の蒸留水2ml
に添加した。増殖培養物をかきまぜて解離した後、その
懸濁物を使用してライスフラスコに接種した。ライスフ
ラスコは、3〜4倍体積の蒸留水で7分間洗浄し、30
秒ごとに混合した後、米の水の吸収が約25%になるま
で排水した、天然長粒種のUncle Ben 転換米を25g/
250mlフラスコで含んでいた。25℃、湿度65%
で12日間後、50mlの滅菌水で胞子をその米から洗
い流した。その胞子懸濁物を使用して液体培地に接種
し、また、4℃で貯蔵するために培養液の親液性を付与
した。胞子を同体積の5%スキムミルクに添加し、滅菌
アンプル中に凍結乾燥した。
1lの蒸留水中にラクトース一水和物1.5%(w/
v)、コーン浸出液0.5%(v/v)、ペプトン0.
5%(w/v)、NaCl0.4%(w/v)、MgS
O4・7H2O0.05%(w/v)、KH2PO
40.06%(w/v)、FeCl3・6H2O0.0
005%(w/v)、CuSO4・5H2O0.000
2%(w/v)、寒天3.0%(w/v)を含むLCS
B培地(pH4.8)を含む平板上に保持した。25
℃、相対湿度65%で12日間後、単集落を取り出し、
ガラスビーズを含むねじ栓付き試験管中の蒸留水2ml
に添加した。増殖培養物をかきまぜて解離した後、その
懸濁物を使用してライスフラスコに接種した。ライスフ
ラスコは、3〜4倍体積の蒸留水で7分間洗浄し、30
秒ごとに混合した後、米の水の吸収が約25%になるま
で排水した、天然長粒種のUncle Ben 転換米を25g/
250mlフラスコで含んでいた。25℃、湿度65%
で12日間後、50mlの滅菌水で胞子をその米から洗
い流した。その胞子懸濁物を使用して液体培地に接種
し、また、4℃で貯蔵するために培養液の親液性を付与
した。胞子を同体積の5%スキムミルクに添加し、滅菌
アンプル中に凍結乾燥した。
【0062】ペニシリンの生産またはRNAもしくはD
NA源としての菌糸体の生産のために、菌株を振とうフ
ラスコ中で2段階醗酵した。接種段階は、1lの蒸留水
にグルコース3.0%(w/v)、pharmamedia 1.0
%(w/v)、コーン浸出液3.0%(v/v)、硫酸
アンモニウム0.2%(w/v)、CaCo30.5%
(w/v)、無水リン酸一カリウム0.05%(w/
v)、ラクトース1.0%(w/v)、一次乾燥酵母
1.0%(w/v)を含む培地50ml/500mlフ
ラスコに1×108胞子を添加することにより開始し
た。インキュベーションは、直径70mmの円を描いて
回転する(220rpm)盤上、25℃、相対湿度65
%で行った。48時間インキュベーションした後、生産
段階を、1lの蒸留水にKH2PO40.05%(w/
v)、K2SO40.5%(w/v)、(NH4)2S
O41.0%(w/v)、ラクトース12.0%(w/
v)、pharmamedia 2.75%(w/v)、CaCO3
(沈降)1.0%(w/v)、ラード油1.0%(v/
v)の組成物を含む培地(pH6.6)35ml/50
0mlフラスコに生長能力のある種子2mlを移すこと
により開始した。オートクレーブ後、しかし接種の前
に、滅菌した25%アジピン酸ナトリウム(pH6.
6)を添加して最終のアジピン酸ナトリウム濃度を2.
5%にした。次いで、接種後、前段階と同じ条件下で5
〜7日間インキュベーションを続けた。
NA源としての菌糸体の生産のために、菌株を振とうフ
ラスコ中で2段階醗酵した。接種段階は、1lの蒸留水
にグルコース3.0%(w/v)、pharmamedia 1.0
%(w/v)、コーン浸出液3.0%(v/v)、硫酸
アンモニウム0.2%(w/v)、CaCo30.5%
(w/v)、無水リン酸一カリウム0.05%(w/
v)、ラクトース1.0%(w/v)、一次乾燥酵母
1.0%(w/v)を含む培地50ml/500mlフ
ラスコに1×108胞子を添加することにより開始し
た。インキュベーションは、直径70mmの円を描いて
回転する(220rpm)盤上、25℃、相対湿度65
%で行った。48時間インキュベーションした後、生産
段階を、1lの蒸留水にKH2PO40.05%(w/
v)、K2SO40.5%(w/v)、(NH4)2S
O41.0%(w/v)、ラクトース12.0%(w/
v)、pharmamedia 2.75%(w/v)、CaCO3
(沈降)1.0%(w/v)、ラード油1.0%(v/
v)の組成物を含む培地(pH6.6)35ml/50
0mlフラスコに生長能力のある種子2mlを移すこと
により開始した。オートクレーブ後、しかし接種の前
に、滅菌した25%アジピン酸ナトリウム(pH6.
6)を添加して最終のアジピン酸ナトリウム濃度を2.
5%にした。次いで、接種後、前段階と同じ条件下で5
〜7日間インキュベーションを続けた。
【0063】形質転換のため、またはDNA源としてプ
ロトプラストを生成させるために菌糸体が必要な場合
は、その菌株を、1lの蒸留水に50mlの20X Clu
tterbuck塩(120gのNaNO3、10.4gのKC
l、10.4gのMgSO4・7H2O、30.4gの
KH2PO4)、2.0mlのVogel微量元素(0.3
Mのクエン酸、0.2MのZnSO4、25mMのFe
(NH4)2(SO4) 2・6H2O、10mMのCu
SO4、3mMのMnSO4、8mMのホウ酸、2mM
のNa2MoO4・2H2O)、5gのトリプトン、5
gの酵母抽出物、10gのグルコースを含む完全媒体
(CM)50ml/250mlフラスコ中で生長させ
た。インキュベーションは、220rpmの回転盤上、
25℃で行った。実施例2 Penicillium ゲノムDNAおよび全RNAの単離 上記したように調製した、48時間培養して生長させた
植物菌糸体を寒冷紗により濾取し、液体窒素中で凍結
し、一夜凍結乾燥した。乾燥した菌糸体を乳鉢・すりこ
ぎで砂とともにすりつぶし、100mMのLiCl、5
0mMのEDTA、10mMのTris(pH8.
0)、4%SDSの25mlに再懸濁した。その懸濁物
を60℃の湯浴中で50〜55℃に加熱した後、その混
合物を、最初に1MのTris(pH8)飽和フェノー
ル、次いでTris飽和フェノール:クロロホルム
(1:1,v/v)、次いでクロロホルムで抽出した。
同量の6M冷LiClを添加し、次いでその混合物を−
20℃で2〜3時間保持すると、RNAが水相から析出
した。4℃、12000×gで20分間遠心分離した
後、上澄みを66%(v/v)エタノール溶液にして、
−20℃で15分間冷却すると、DNAが析出した。上
述したように遠心分離した後、DNAペレットを70%
エタノールで洗浄し、脱水してTE緩衝液(10mMの
Tris−HCl、pH7.5、1mMのEDTA)に
再懸濁した。DNA濃度を、アガロースゲル電気泳動に
おいて臭化エチジウムにより染色して、既知DNA基準
と比較することにより推定した。
ロトプラストを生成させるために菌糸体が必要な場合
は、その菌株を、1lの蒸留水に50mlの20X Clu
tterbuck塩(120gのNaNO3、10.4gのKC
l、10.4gのMgSO4・7H2O、30.4gの
KH2PO4)、2.0mlのVogel微量元素(0.3
Mのクエン酸、0.2MのZnSO4、25mMのFe
(NH4)2(SO4) 2・6H2O、10mMのCu
SO4、3mMのMnSO4、8mMのホウ酸、2mM
のNa2MoO4・2H2O)、5gのトリプトン、5
gの酵母抽出物、10gのグルコースを含む完全媒体
(CM)50ml/250mlフラスコ中で生長させ
た。インキュベーションは、220rpmの回転盤上、
25℃で行った。実施例2 Penicillium ゲノムDNAおよび全RNAの単離 上記したように調製した、48時間培養して生長させた
植物菌糸体を寒冷紗により濾取し、液体窒素中で凍結
し、一夜凍結乾燥した。乾燥した菌糸体を乳鉢・すりこ
ぎで砂とともにすりつぶし、100mMのLiCl、5
0mMのEDTA、10mMのTris(pH8.
0)、4%SDSの25mlに再懸濁した。その懸濁物
を60℃の湯浴中で50〜55℃に加熱した後、その混
合物を、最初に1MのTris(pH8)飽和フェノー
ル、次いでTris飽和フェノール:クロロホルム
(1:1,v/v)、次いでクロロホルムで抽出した。
同量の6M冷LiClを添加し、次いでその混合物を−
20℃で2〜3時間保持すると、RNAが水相から析出
した。4℃、12000×gで20分間遠心分離した
後、上澄みを66%(v/v)エタノール溶液にして、
−20℃で15分間冷却すると、DNAが析出した。上
述したように遠心分離した後、DNAペレットを70%
エタノールで洗浄し、脱水してTE緩衝液(10mMの
Tris−HCl、pH7.5、1mMのEDTA)に
再懸濁した。DNA濃度を、アガロースゲル電気泳動に
おいて臭化エチジウムにより染色して、既知DNA基準
と比較することにより推定した。
【0064】上記実施例1で記載したPenicillium chry
sogenumの培養を、25℃、220rpmの回転盤上に
載せた35mlの醗酵培地中(醗酵条件は前述した通
り)で96時間生長させた。菌糸体を、真空下、Whatma
n #1フィルターにより濾取し、約50mlの水で洗浄し
た。直ちに菌糸体をそのフィルターからこすり取り、5
mlの「破壊緩衝液」(50mMのTris−HCl,
pH7.4、150mMのNaCl、5mMのEDT
A,pH8.0、5%のSDS)に再懸濁し、液体窒素
で凍結し、凍結乾燥した。一夜凍結乾燥した後、0.1
%のDEPCを含む5mlの水および5mlの1M T
ris(pH8)飽和フェノール:クロロホルム:イソ
アミルアルコール(50:50:1)を添加し、その混
合物を振とうしながら37℃で20分間溶かした。混合
物を4℃、12000×gで10分間遠心分離し、水相
を分離して、最初に1MのTris(pH8)飽和フェ
ノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(50:
50:1)、2番目に1Mのトリス(pH8)飽和フェ
ノール、3番目にクロロホルムで再抽出した。同量の6
MLiClを最終的に得られた水相と混合し、その溶液
を−20℃で最低4時間放置した。全RNAを4℃、1
2000×gで20分間ペレット化し、そのペレットを
0.3mlのTE緩衝液+0.03mlの3M酢酸ナト
リウムに溶解し、2.5倍体積のエタノールを添加して
RNAを両析出させた。最終的に得られたペレットを
0.1mlのTE緩衝液に溶解し、RNA濃度を、分光
光度計による260nmでの吸光度により測定した。実施例3 Streptomyces clavuligerus 培養条件 以下の操作で使用するStreptomyces clavuligerus菌株
は、ATCC27064 であった。その菌株を、1lの蒸留水に
酵母エキス4g、麦芽エキス10g、グルコース4g、
寒天20gを含む(pH7.2)平板上で維持した。3
0℃で5日間生長させた後、2mlの滅菌水をその平板
に添加し、培養増殖したものを寒天表面からこすり採っ
た。得られた懸濁物を、ガラスビーズを含む滅菌ねじ栓
つき管に移した。培養増殖したものを、かきまぜて解離
させた後、その懸濁物を液体培地の接種に使用した。ま
た、その懸濁物は、最終体積が15%になるまでグリセ
ロールを添加して、−70℃での永久保存培地に使用し
た。
sogenumの培養を、25℃、220rpmの回転盤上に
載せた35mlの醗酵培地中(醗酵条件は前述した通
り)で96時間生長させた。菌糸体を、真空下、Whatma
n #1フィルターにより濾取し、約50mlの水で洗浄し
た。直ちに菌糸体をそのフィルターからこすり取り、5
mlの「破壊緩衝液」(50mMのTris−HCl,
pH7.4、150mMのNaCl、5mMのEDT
A,pH8.0、5%のSDS)に再懸濁し、液体窒素
で凍結し、凍結乾燥した。一夜凍結乾燥した後、0.1
%のDEPCを含む5mlの水および5mlの1M T
ris(pH8)飽和フェノール:クロロホルム:イソ
アミルアルコール(50:50:1)を添加し、その混
合物を振とうしながら37℃で20分間溶かした。混合
物を4℃、12000×gで10分間遠心分離し、水相
を分離して、最初に1MのTris(pH8)飽和フェ
ノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(50:
50:1)、2番目に1Mのトリス(pH8)飽和フェ
ノール、3番目にクロロホルムで再抽出した。同量の6
MLiClを最終的に得られた水相と混合し、その溶液
を−20℃で最低4時間放置した。全RNAを4℃、1
2000×gで20分間ペレット化し、そのペレットを
0.3mlのTE緩衝液+0.03mlの3M酢酸ナト
リウムに溶解し、2.5倍体積のエタノールを添加して
RNAを両析出させた。最終的に得られたペレットを
0.1mlのTE緩衝液に溶解し、RNA濃度を、分光
光度計による260nmでの吸光度により測定した。実施例3 Streptomyces clavuligerus 培養条件 以下の操作で使用するStreptomyces clavuligerus菌株
は、ATCC27064 であった。その菌株を、1lの蒸留水に
酵母エキス4g、麦芽エキス10g、グルコース4g、
寒天20gを含む(pH7.2)平板上で維持した。3
0℃で5日間生長させた後、2mlの滅菌水をその平板
に添加し、培養増殖したものを寒天表面からこすり採っ
た。得られた懸濁物を、ガラスビーズを含む滅菌ねじ栓
つき管に移した。培養増殖したものを、かきまぜて解離
させた後、その懸濁物を液体培地の接種に使用した。ま
た、その懸濁物は、最終体積が15%になるまでグリセ
ロールを添加して、−70℃での永久保存培地に使用し
た。
【0065】形質転換のため、またはDNA源としてプ
ロトプラストを生成させるために菌糸体が必要な場合
は、その菌株を、1lの蒸留水に酵母エキス3g、ペプ
トン5g、麦芽エキス3g、グルコース10g、ショ糖
340g、MgCl2・6H2O1.02g、グリシン
5g、寒天18gを含むYEME培地200ml/1l
フラスコ中で生長させた。インキュベーションは、22
0rpmの回転盤上、28℃で行った。実施例4 StreptomycesゲノムDNAの単離 上述したように調製した培地で48時間培養して生長さ
せた植物菌糸体を、22100×gで10分間遠心分離
することにより集めた。その細胞を10mlのTE緩衝
液に再懸濁し、10mgのリゾチームを添加して、その
混合物を30℃で15分間インキュベートした。次い
で、1mlの20%SDSを添加し、次いですぐに10
mlのTE(pH8)飽和フェノールおよび1.5ml
の5M−NaClを添加して、その混合物を20分間静
かに上下動させた。12000×gで10分間、相分離
を行った後、水相を取り出して新しい管に移した。同量
のクロロホルムを添加し、その混合物を10分間静かに
上下動させた。再び12000×gで10分間遠心分離
することにより相分離を行い、水相を取り出して新しい
管に移した。2倍体積のイソプロパノールを注意しなが
ら添加し、析出したDNAを取り、最少量のTE緩衝液
に再溶解した。RNAアーゼAを添加して最終濃度を2
0mg/mlとし、その溶液を50℃で1時間インキュ
ベートした。次いで、100mMのNaClおよび0.
4%のSDSとともにプロテアーゼKを添加して最終濃
度を100mg/mlとし、その混合物を37℃で1時
間インキュベートした。その溶液を同量のTE(pH
8)飽和フェノールで再び抽出し、さらにクロロホルム
で抽出した。最後の抽出により得られたDNAを2倍体
積のイソプロパノールを添加した後に取り、その濃度を
分光光度計による260nmでの吸光度により測定し
た。実施例5 遺伝子ライブラリーの構築およびStreptomyces clavuli
gerusエクスパンダーゼ遺伝子を含むDNA断片の単離 前記操作により得たStreptomyces clavuligerusゲノム
DNAを制限酵素BamHIおよびSalIで消化し
た。消化されたDNAを0.8%アガロースゲル上で電
気泳動にかけ、1.8〜2.2kbの大きさの断片を溶
離し、予めBamHIおよびSalIで消化してあるp
UC18DNAに連結した。連結混合物を希釈し、電気
穿孔法(Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, CA)により
コンピテントJM109細胞に取り込んで形質転換し
た。コンピテント細胞の作製および電気穿孔法の条件は
ともに、製造者の指示に従った。形質転換混合物を10
0mg/mlのアンピシリンおよび75mlの2%X−
Galを含むLB平板上で平板培養した。37℃で一夜
インキュベートした後、組換えコロニーを、プラスミド
ベクターβ−ガラクトシダーゼ遺伝子活性の不活化によ
り無色になることから同定した。無色のコロニーを選ん
で、100mg/mlのアンピシリンを含む新しいLB
平板に移した。37℃で一夜生長させた後、コロニーを
ニトロセルロースに移し、複製連鎖反応により作製し
た、公開された Streptomyces clavuligerusエクスパン
ダーゼ遺伝子配列の52〜918の塩基〔Kovacevic et
al., (1989)J. Bacteriol. 171:754-760;およびU.S.
5,070,020〕に対応するプローブとハイブリッド形成さ
せた。複製連鎖反応産物の標識を、(32P)dCTP
およびオリゴ標識キットを使用し、製造者(Pharmacia,
Piscateway, New Jersey )の指示に従ってランダムプ
ライマー伸長法により行った。ハイブリッド形成反応
は、106CPMの放射性同位体で標識したプローブ、
30%のホルムアミド、5XSSC(0.15MのNa
Cl、0.015Mのクエン酸ナトリウム、pH7)、
0.1%のSDS,5×Denhardt(5gのフィコール、
5gのポリビニルピロリドンおよび5gのBSA(50
0mlの50Xストック用))および100mg/ml
の牛胸腺DNAの存在下、37℃で一夜行った。いくつ
かの形質転換細胞がプローブと強くハイブリッドを形成
した。うち1個のコロニーについて、制限酵素分析によ
りエクスパンダーゼ遺伝子を有するベクターを含むこと
が確認され、このプラスミドをpFTSO−1と命名し
た。実施例6 プラスミドDNAの単離 プラスミドを含むE.coli培養液を500mlのLB培養
液(20g/lのLB培養液ベース)(Gibco, Paisle
y, Scotland)中で、15mg/mlのテトラサイクリ
ンとともに、37℃、220rpmの回転盤上で12〜
16時間生長させた。4℃、4000×gで10分間遠
心分離することにより細胞をペレット状にした。その細
胞ペレットを18mlのグルコース緩衝液(50mMの
グルコース、25mMのTris(pH8.0)、10
mMのEDTA)に再懸濁し、40mg/mlのリゾチ
ーム(Sigma, St. Louis, MO)/グルコース緩衝液を2
ml添加して混合し、その混合物を室温で15分間イン
キュベートした。新しく調製した0.2NのNaOHお
よび1%のSDSの溶液を40ml添加し、その混合物
を静かに攪拌して氷上に10分間置いた。次いで、5M
の酢酸カリウム(pH4.8)30mlを添加して十分
混合し、得られた混合物を氷上にさらに10分間置い
た。細胞片を、4℃、4000×gで10分間遠心分離
することによりペレット化し、得られた上澄みを寒冷紗
フィルターにより濾過した。プラスミドDNAを析出さ
せるためにイソプロパノール(0.6倍体積)を透明な
上澄みに添加し、室温で20分間インキュベートしてい
る間に析出物が生成した。プラスミドDNAのペレット
化を4℃、4000×gで20分間行い、次いで、70
%エタノールで洗浄して軽く乾燥した。そのペレットを
9mlのTE緩衝液に再懸濁した後、10gのCsCl
および10mg/mlの臭化エチジウム溶液0.387
mlを添加した。この溶液を313,100×gで24
時間遠心分離した。塩化セシウム勾配において得られた
プラスミドのバンドを紫外線により可視化して単離した
後、臭化エチジウムを抽出用の飽和ブタノール水溶液に
より除去した。次いで、プラスミドの作製に使用したC
sClをTE緩衝液に対する透析により除去し、最後に
DNAをPEG(MW8000)を使用して濃縮した。
DNAの濃度は分光光度計による260nmでの吸光度
により測定した。実施例7 Penicillium 形質転換ベクターpPenFTSOの構築 Penicillium 形質転換ベクターは、優性選択マーカーと
してのフレオマイシン耐性遺伝子を入れて構築した。こ
れは、まず、フレオマイシン耐性遺伝子(Streptoallot
eichus hindustanus由来のフレオマイシン結合蛋白遺伝
子)を含み、酵母シトクロムC1ターミネータに結合し
た660bp断片を、BamHI/BglIIで消化した
プラスミドpUT713(CAYLA, Toulouse Cedex, Fra
nce )からアガロースゲル上で電気泳動して溶離するこ
とにより単離して行った。単離した断片はベクターpS
ELECT*1(Promega Corporation)のBamHI部
位に連結し、遺伝子の方向は制限酵素分析により決定し
た。次に、λ付着末端部位を含む550bpのPstI
断片を挿入して、適切な大きさの挿入配列を含む場合は
そのベクターを使用してコスミドが形成できるようにし
た。次いで、Penicillium chrysogenumイソペニシリン
Nシンセターゼ(IPNS)遺伝子のプロモータ領域を
含む1.5kbのNcoI/BamHI断片を、Nco
I/BamHIで消化したIPNS遺伝子を含むゲノム
クローンから(アガロースゲル上で電気泳動して溶離す
ることにより)単離した。単離したIPNS−プロモー
タ断片をBamHI/NcoIで消化したベクターに連
結した。NcoI部位は、フレオマイシン耐性遺伝子の
ATG開始コドンにある。このベクターをpUTZ−2
と命名する。
ロトプラストを生成させるために菌糸体が必要な場合
は、その菌株を、1lの蒸留水に酵母エキス3g、ペプ
トン5g、麦芽エキス3g、グルコース10g、ショ糖
340g、MgCl2・6H2O1.02g、グリシン
5g、寒天18gを含むYEME培地200ml/1l
フラスコ中で生長させた。インキュベーションは、22
0rpmの回転盤上、28℃で行った。実施例4 StreptomycesゲノムDNAの単離 上述したように調製した培地で48時間培養して生長さ
せた植物菌糸体を、22100×gで10分間遠心分離
することにより集めた。その細胞を10mlのTE緩衝
液に再懸濁し、10mgのリゾチームを添加して、その
混合物を30℃で15分間インキュベートした。次い
で、1mlの20%SDSを添加し、次いですぐに10
mlのTE(pH8)飽和フェノールおよび1.5ml
の5M−NaClを添加して、その混合物を20分間静
かに上下動させた。12000×gで10分間、相分離
を行った後、水相を取り出して新しい管に移した。同量
のクロロホルムを添加し、その混合物を10分間静かに
上下動させた。再び12000×gで10分間遠心分離
することにより相分離を行い、水相を取り出して新しい
管に移した。2倍体積のイソプロパノールを注意しなが
ら添加し、析出したDNAを取り、最少量のTE緩衝液
に再溶解した。RNAアーゼAを添加して最終濃度を2
0mg/mlとし、その溶液を50℃で1時間インキュ
ベートした。次いで、100mMのNaClおよび0.
4%のSDSとともにプロテアーゼKを添加して最終濃
度を100mg/mlとし、その混合物を37℃で1時
間インキュベートした。その溶液を同量のTE(pH
8)飽和フェノールで再び抽出し、さらにクロロホルム
で抽出した。最後の抽出により得られたDNAを2倍体
積のイソプロパノールを添加した後に取り、その濃度を
分光光度計による260nmでの吸光度により測定し
た。実施例5 遺伝子ライブラリーの構築およびStreptomyces clavuli
gerusエクスパンダーゼ遺伝子を含むDNA断片の単離 前記操作により得たStreptomyces clavuligerusゲノム
DNAを制限酵素BamHIおよびSalIで消化し
た。消化されたDNAを0.8%アガロースゲル上で電
気泳動にかけ、1.8〜2.2kbの大きさの断片を溶
離し、予めBamHIおよびSalIで消化してあるp
UC18DNAに連結した。連結混合物を希釈し、電気
穿孔法(Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, CA)により
コンピテントJM109細胞に取り込んで形質転換し
た。コンピテント細胞の作製および電気穿孔法の条件は
ともに、製造者の指示に従った。形質転換混合物を10
0mg/mlのアンピシリンおよび75mlの2%X−
Galを含むLB平板上で平板培養した。37℃で一夜
インキュベートした後、組換えコロニーを、プラスミド
ベクターβ−ガラクトシダーゼ遺伝子活性の不活化によ
り無色になることから同定した。無色のコロニーを選ん
で、100mg/mlのアンピシリンを含む新しいLB
平板に移した。37℃で一夜生長させた後、コロニーを
ニトロセルロースに移し、複製連鎖反応により作製し
た、公開された Streptomyces clavuligerusエクスパン
ダーゼ遺伝子配列の52〜918の塩基〔Kovacevic et
al., (1989)J. Bacteriol. 171:754-760;およびU.S.
5,070,020〕に対応するプローブとハイブリッド形成さ
せた。複製連鎖反応産物の標識を、(32P)dCTP
およびオリゴ標識キットを使用し、製造者(Pharmacia,
Piscateway, New Jersey )の指示に従ってランダムプ
ライマー伸長法により行った。ハイブリッド形成反応
は、106CPMの放射性同位体で標識したプローブ、
30%のホルムアミド、5XSSC(0.15MのNa
Cl、0.015Mのクエン酸ナトリウム、pH7)、
0.1%のSDS,5×Denhardt(5gのフィコール、
5gのポリビニルピロリドンおよび5gのBSA(50
0mlの50Xストック用))および100mg/ml
の牛胸腺DNAの存在下、37℃で一夜行った。いくつ
かの形質転換細胞がプローブと強くハイブリッドを形成
した。うち1個のコロニーについて、制限酵素分析によ
りエクスパンダーゼ遺伝子を有するベクターを含むこと
が確認され、このプラスミドをpFTSO−1と命名し
た。実施例6 プラスミドDNAの単離 プラスミドを含むE.coli培養液を500mlのLB培養
液(20g/lのLB培養液ベース)(Gibco, Paisle
y, Scotland)中で、15mg/mlのテトラサイクリ
ンとともに、37℃、220rpmの回転盤上で12〜
16時間生長させた。4℃、4000×gで10分間遠
心分離することにより細胞をペレット状にした。その細
胞ペレットを18mlのグルコース緩衝液(50mMの
グルコース、25mMのTris(pH8.0)、10
mMのEDTA)に再懸濁し、40mg/mlのリゾチ
ーム(Sigma, St. Louis, MO)/グルコース緩衝液を2
ml添加して混合し、その混合物を室温で15分間イン
キュベートした。新しく調製した0.2NのNaOHお
よび1%のSDSの溶液を40ml添加し、その混合物
を静かに攪拌して氷上に10分間置いた。次いで、5M
の酢酸カリウム(pH4.8)30mlを添加して十分
混合し、得られた混合物を氷上にさらに10分間置い
た。細胞片を、4℃、4000×gで10分間遠心分離
することによりペレット化し、得られた上澄みを寒冷紗
フィルターにより濾過した。プラスミドDNAを析出さ
せるためにイソプロパノール(0.6倍体積)を透明な
上澄みに添加し、室温で20分間インキュベートしてい
る間に析出物が生成した。プラスミドDNAのペレット
化を4℃、4000×gで20分間行い、次いで、70
%エタノールで洗浄して軽く乾燥した。そのペレットを
9mlのTE緩衝液に再懸濁した後、10gのCsCl
および10mg/mlの臭化エチジウム溶液0.387
mlを添加した。この溶液を313,100×gで24
時間遠心分離した。塩化セシウム勾配において得られた
プラスミドのバンドを紫外線により可視化して単離した
後、臭化エチジウムを抽出用の飽和ブタノール水溶液に
より除去した。次いで、プラスミドの作製に使用したC
sClをTE緩衝液に対する透析により除去し、最後に
DNAをPEG(MW8000)を使用して濃縮した。
DNAの濃度は分光光度計による260nmでの吸光度
により測定した。実施例7 Penicillium 形質転換ベクターpPenFTSOの構築 Penicillium 形質転換ベクターは、優性選択マーカーと
してのフレオマイシン耐性遺伝子を入れて構築した。こ
れは、まず、フレオマイシン耐性遺伝子(Streptoallot
eichus hindustanus由来のフレオマイシン結合蛋白遺伝
子)を含み、酵母シトクロムC1ターミネータに結合し
た660bp断片を、BamHI/BglIIで消化した
プラスミドpUT713(CAYLA, Toulouse Cedex, Fra
nce )からアガロースゲル上で電気泳動して溶離するこ
とにより単離して行った。単離した断片はベクターpS
ELECT*1(Promega Corporation)のBamHI部
位に連結し、遺伝子の方向は制限酵素分析により決定し
た。次に、λ付着末端部位を含む550bpのPstI
断片を挿入して、適切な大きさの挿入配列を含む場合は
そのベクターを使用してコスミドが形成できるようにし
た。次いで、Penicillium chrysogenumイソペニシリン
Nシンセターゼ(IPNS)遺伝子のプロモータ領域を
含む1.5kbのNcoI/BamHI断片を、Nco
I/BamHIで消化したIPNS遺伝子を含むゲノム
クローンから(アガロースゲル上で電気泳動して溶離す
ることにより)単離した。単離したIPNS−プロモー
タ断片をBamHI/NcoIで消化したベクターに連
結した。NcoI部位は、フレオマイシン耐性遺伝子の
ATG開始コドンにある。このベクターをpUTZ−2
と命名する。
【0066】Streptomyces clavuligerusエクスパンダ
ーゼ遺伝子を含む1.645kb断片をBamHIおよ
びSalIで消化したpFTSO−1(前述のベクタ
ー)から、0.8%アガロースゲル上で電気泳動して溶
離することにより精製した。単離した断片は、やはりB
amHIおよびSalIで消化したベクターpSELE
CT(Promega Corporation)に連結した。このベクタ
ーは、pFTSO−8と命名した。新規NcoI部位
を、 Altered Sites* in vitro突然変異誘発系(Promeg
a Corporation )を使用したpFTSO−8の部位特異
的突然変異誘発によりエクスパンダーゼ遺伝子のATG
開始コドンに作った。突然変異誘発は、製造者の指示に
従って行った。オリゴヌクレオチドは、Streptomycesエ
クスパンダーゼ遺伝子の公開された塩基配列(Kovacevi
c et al., (1990) Journal of Bacteriology, 171, p.3
952-3958)由来のATG開始コドンにあるDNA領域の
コード配列と相補的であるように構築した。オリゴヌク
レオチドの合成は、シアノエチルホスホラミディト化学
(Pharmacia Gene Assembler instrumentation)により
行い、オリゴ塩基配列は次の通りであった。 配列番号:8 5' CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG 3' 突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。次に、
Penicillium chrysogenumイソペニシリンNシンセター
ゼ遺伝子のプロモータ領域を含む1.2kbのNcoI
断片を、IPNS遺伝子を含むNcoIで消化したゲノ
ムクローンから(アガロースゲル上で電気泳動して溶離
することにより)単離した。IPNS−プロモータ領域
は、エクスパンダーゼ遺伝子のATG開始コドンに突然
変異誘発により作ったpFTSO−8ベクターの新規N
coI部位に連結した。プロモータのエクスパンダーゼ
遺伝子に対する方向は、制限酵素分析により確認した。
次いで、IPNS−プロモータ:エクスパンダーゼ遺伝
子カセットをBamHI/SalI断片として、上述し
たPenicillium形質転換ベクターpUTZ−2のBam
HI/SalI切断部位に移した。最終的な構成物をp
PenFTSOと命名した。実施例8 Penicillium β−チューブリンプロモータのクローン化 Penicillium β−チューブリン遺伝子を、ハイブリッド
形成プローブとしてAspergillus niger β−チューブリ
ン遺伝子を使用して、Penicillium λゲノムライブラリ
ーからクローン化した。このクローンの配列決定および
Aspergillus nigerのβ−チューブリン遺伝子の既知ア
ミノ酸配列との比較により、ATG開始コドンで始まる
91%の相同率の領域があることが確認された。機能性
プロモータを含む配列が、開始コドンと1.4kb上流
のBamHI部位との間で単離された。Penicillium β−チューブリンプロモータを有する形質
転換ベクターの構築 Penicillium β−チューブリンプロモータを含む2.0
kbのXbaI/Hind III断片を、やはりXbaI
/HindIII で消化したベクターpSELECT(Pro
mega Corporation)に連結した。新規NcoI部位を、
Altered Sites *in vitro突然変異誘発系(Promega Co
rporation )を使用した部位特異的突然変異誘発により
ATG開始コドンに作った。突然変異誘発は、製造者の
指示に従って行った。オリゴヌクレオチドはATG開始
部位領域に対して相補的に構築したが、NcoI部位を
作るための変更をいくつか挿入し、突然変異誘発のため
に使用した。オリゴヌクレオチド合成は、シアノエチル
ホスホラミディト化学(Pharmacia Gene Assembler ins
trumentation)により行い、オリゴ塩基配列は次の通り
であった。 配列番号:9 5' ATCTCTTTTCTAATACCTTCACCATGGGTGAGATTGTACGTGATCCC
3' 突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。
次に、Penicillium β−チューブリンプロモータを含む
1.4kbのBamHI/NcoI断片を、BamHI
/NcoIで消化したベクターpFTSO−8(前記実
施例7に記載したベクター)においてStreptomycesエク
スパンダーゼ遺伝子のATGに作ったNcoI部位に連
結した。このベクターをbtFTSO−8と命名した。
β−チューブリンプロモータを含む1.4kbのBam
HI/NcoI断片はまた、BamHI/NcoIで消
化したベクターpUTZ−2(前記実施例7に記載した
ベクター)にも連結した。この連結により、フレオマイ
シン耐性遺伝子のすぐ前にβ−チューブリンプロモータ
が位置した。このベクターはpCI−6と命名した。次
に、β−チューブリンプロモータエクスパンダーゼ遺伝
子カセットを含む、ベクターbtFTSO−8由来の
2.4kbのBamHI/Hind III断片をBamH
I/Hind IIIで消化したベクターpCI−6に連結
して、最終的なPenicilliu形質転換ベクターを得た。こ
のベクターにおいて、Streptomycesエクスパンダーゼ遺
伝子およびフレオマイシン耐性マーカーをβ−チューブ
リンプロモータから発現させた。このベクターをpTS
−2と命名した。実施例9 Penicillium(GAP)プロモータのクローン化 Penicillium グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ(GAP)遺伝子を、Aspergillus niger由来
のGAP遺伝子をハイブリッド形成プローブとして使用
することにより、Penicillium λゲノムライブラリーか
らクローン化した。陽性の可能性がある4個のクローン
について、 Cephalosporium GAP遺伝子(Kimura, H.
et al., (1991), J. Ferm. and Bioeng., 71, 145-15
0)の5′領域のプライマーから生じたPCR産物によ
りさらに探索した。複製連鎖反応(PCR)のプライマ
ーに使用したオリゴヌクレオチドは、シアノエチルホス
ホラミディト化学(Pharmacia Gene Assembler instrum
entation)により合成し、オリゴ配列は次の通りであ
る。 配列番号:10 5' CGCGGATCCCGGCATCAACGGCTTCGGTCGTAT 3' 配列番号:11 5' CGCGGATCCGGGCACGCGCATGGACATGCCAGTG 3' 4個の陽性と目されたクローンの1個が、PCR産物と
クロスハイブリッド形成した。このゲノムクローンのB
amHI断片(4kb)を、配列決定目的でBamHI
で消化したベクターpSELECT(Promega Corporat
ion)に連結した。このベクターをpTS−0と命名し
た。この断片を配列決定すると、セファロスポリンGA
P遺伝子の既知配列との比較によりATG開始コドンが
確認された。Penicillium(GAP)プロモータを有する形質転換ベ
クターの構築 Penicillium GAPプロモータにStreptomycesエクスパ
ンダーゼ遺伝子を入れるために、ベクターpTS−0を
使用したin vitro部位特異的突然変異誘発によ
り新規NcoI部位をPenicillium GAP遺伝子のAT
Gに作った。突然変異誘発は、製造者の指示に従って行
った。オリゴヌクレオチドは、GAP遺伝子のATG開
始コドンのDNA領域をコードする配列に相補的である
ように構築したが、NcoI部位を作るために塩基を変
えて挿入した。オリゴヌクレオチドの合成はシアノエチ
ルホスホラミディト化学(Pharmacia Gene Assemblerin
strumentation)により行い、オリゴ配列は次の通りで
ある。配列番号:12 5' CAGTAAACGCAACCATGGTTGTCCAG 3' 突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。次に、
GAPプロモータを含むpTS−0のNcoI/Bam
HI断片(1.9kb)をNcoI/BamHIで消化
したベクターpFTSO−8(上記実施例7に記載のベ
クター)に連結し、Streptomycesエクスパンダーゼ遺伝
子とともにGAPプロモータの位置付けた。このベクタ
ーをpTS−0−1と命名した。次に、GAPプロモー
タ:エクスパンダーゼカセットを含むpTS−0−1の
BamHI/Hind III断片(3.0kb)をBam
HI/Hind IIIで消化したベクターpCI−6(上
記実施例8に記載のベクター)に連結して、GAPプロ
モータからStreptomycesエクスパンダーゼ遺伝子が発現
する最終的なPenicillium 形質転換ベクターpSD−1
を得た。実施例10 Penicillium chrysogenum の形質転換 上記Penicillium chrysogenum 菌株由来のプロトプラス
トを、25℃、220rpmの回転盤上で67時間、5
0mlのCM培養液に1×107個の胞子を接種するこ
とにより生成させた。菌糸体を寒冷紗上に濾取し、50
0ml容フラスコに移し、100mgのNovozyme 234(N
ovo BioLabs, Bagsvaerd,Denmark)を含む25mlのK
MP(0.7MのKCl、0.8Mのマンニトール、
0.02MのKPO4、pH6.3)に再懸濁し、30
℃、100rpmでインキュベートした。スフェロプラ
ストを寒冷紗/グラスウールフィルターでの濾過により
分離し、350×gで10分間遠心分離することにより
ペレット化した。次いで、スフェロプラストを10ml
のKMP緩衝液で3回洗浄し、KMPC(50mMのC
aCl2を有するKMP)に再懸濁して5×107細胞
/mlの濃度にし、室温で20分間放置した。Penicill
ium の形質転換のために、200mlのスフェロプラス
ト懸濁物を、50mlのPPC(40%PEG,MW3
500、20mMのKPO4,pH6.3、5%CaC
l2は使用直前に添加した)とともにDNA(5mg/
mlヘパリンを含む5mgのベクターDNA/6.2m
lのKMPC)に添加し、形質転換混合物を氷上で30
分間インキュベートした。新しく調製したPPC1ml
を添加し、その混合物を50mlの溶融した(50℃)
再生寒天(CM+1.3Mのマンニトールおよび3%寒
天)に移した。次いで、形質転換混合物を5枚のペトリ
皿に分配した。25℃で24時間再生した後、プレート
に、100mg/50mlOL(1%ペプトン/1%寒
天)のフレオマイシンを含むOLを上塗りした。上塗り
の量は再生寒天の量に等しい。プレートは、25℃で7
〜14日間インキュベートし、形質転換コロニーの発生
を観察した。実施例11 アジポイル−6−APAおよびアジポイル−7−ADC
A醗酵生成物のHPLC分析 高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用し
て、使用した未形質転換P.chrysogenum菌株でのアジポ
イル−6−APAの生産および使用した形質転換P.chry
sogenum菌株でのアジポイル−7−ADCAの生産の分
析を行った。その分析は、625溶媒供給システム、2
20nmおよび254nmにセットした490E可変波
長検出器、825Maximaデータシステムおよび固定相と
しての Novo-C-18カラムを有するWatersシステムで行っ
た。移動相(流量は1ml/分)は、2%メタノール/
98%の0.010M−KH2PO4によるイソクラテ
ィク溶離を5分間、2→40%直線勾配のメタノール/
0.010M−KH2PO4、pH7.0を15分間と
した。アジポイル−6−APAの定量は、220nmで
の標準ペニシリンNの基準線を使用して求め、アジポイ
ル−7−ADCAの定量は254nmでの標準デアセト
キシセファロスポリンの基準線を使用して求めた。
ーゼ遺伝子を含む1.645kb断片をBamHIおよ
びSalIで消化したpFTSO−1(前述のベクタ
ー)から、0.8%アガロースゲル上で電気泳動して溶
離することにより精製した。単離した断片は、やはりB
amHIおよびSalIで消化したベクターpSELE
CT(Promega Corporation)に連結した。このベクタ
ーは、pFTSO−8と命名した。新規NcoI部位
を、 Altered Sites* in vitro突然変異誘発系(Promeg
a Corporation )を使用したpFTSO−8の部位特異
的突然変異誘発によりエクスパンダーゼ遺伝子のATG
開始コドンに作った。突然変異誘発は、製造者の指示に
従って行った。オリゴヌクレオチドは、Streptomycesエ
クスパンダーゼ遺伝子の公開された塩基配列(Kovacevi
c et al., (1990) Journal of Bacteriology, 171, p.3
952-3958)由来のATG開始コドンにあるDNA領域の
コード配列と相補的であるように構築した。オリゴヌク
レオチドの合成は、シアノエチルホスホラミディト化学
(Pharmacia Gene Assembler instrumentation)により
行い、オリゴ塩基配列は次の通りであった。 配列番号:8 5' CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG 3' 突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。次に、
Penicillium chrysogenumイソペニシリンNシンセター
ゼ遺伝子のプロモータ領域を含む1.2kbのNcoI
断片を、IPNS遺伝子を含むNcoIで消化したゲノ
ムクローンから(アガロースゲル上で電気泳動して溶離
することにより)単離した。IPNS−プロモータ領域
は、エクスパンダーゼ遺伝子のATG開始コドンに突然
変異誘発により作ったpFTSO−8ベクターの新規N
coI部位に連結した。プロモータのエクスパンダーゼ
遺伝子に対する方向は、制限酵素分析により確認した。
次いで、IPNS−プロモータ:エクスパンダーゼ遺伝
子カセットをBamHI/SalI断片として、上述し
たPenicillium形質転換ベクターpUTZ−2のBam
HI/SalI切断部位に移した。最終的な構成物をp
PenFTSOと命名した。実施例8 Penicillium β−チューブリンプロモータのクローン化 Penicillium β−チューブリン遺伝子を、ハイブリッド
形成プローブとしてAspergillus niger β−チューブリ
ン遺伝子を使用して、Penicillium λゲノムライブラリ
ーからクローン化した。このクローンの配列決定および
Aspergillus nigerのβ−チューブリン遺伝子の既知ア
ミノ酸配列との比較により、ATG開始コドンで始まる
91%の相同率の領域があることが確認された。機能性
プロモータを含む配列が、開始コドンと1.4kb上流
のBamHI部位との間で単離された。Penicillium β−チューブリンプロモータを有する形質
転換ベクターの構築 Penicillium β−チューブリンプロモータを含む2.0
kbのXbaI/Hind III断片を、やはりXbaI
/HindIII で消化したベクターpSELECT(Pro
mega Corporation)に連結した。新規NcoI部位を、
Altered Sites *in vitro突然変異誘発系(Promega Co
rporation )を使用した部位特異的突然変異誘発により
ATG開始コドンに作った。突然変異誘発は、製造者の
指示に従って行った。オリゴヌクレオチドはATG開始
部位領域に対して相補的に構築したが、NcoI部位を
作るための変更をいくつか挿入し、突然変異誘発のため
に使用した。オリゴヌクレオチド合成は、シアノエチル
ホスホラミディト化学(Pharmacia Gene Assembler ins
trumentation)により行い、オリゴ塩基配列は次の通り
であった。 配列番号:9 5' ATCTCTTTTCTAATACCTTCACCATGGGTGAGATTGTACGTGATCCC
3' 突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。
次に、Penicillium β−チューブリンプロモータを含む
1.4kbのBamHI/NcoI断片を、BamHI
/NcoIで消化したベクターpFTSO−8(前記実
施例7に記載したベクター)においてStreptomycesエク
スパンダーゼ遺伝子のATGに作ったNcoI部位に連
結した。このベクターをbtFTSO−8と命名した。
β−チューブリンプロモータを含む1.4kbのBam
HI/NcoI断片はまた、BamHI/NcoIで消
化したベクターpUTZ−2(前記実施例7に記載した
ベクター)にも連結した。この連結により、フレオマイ
シン耐性遺伝子のすぐ前にβ−チューブリンプロモータ
が位置した。このベクターはpCI−6と命名した。次
に、β−チューブリンプロモータエクスパンダーゼ遺伝
子カセットを含む、ベクターbtFTSO−8由来の
2.4kbのBamHI/Hind III断片をBamH
I/Hind IIIで消化したベクターpCI−6に連結
して、最終的なPenicilliu形質転換ベクターを得た。こ
のベクターにおいて、Streptomycesエクスパンダーゼ遺
伝子およびフレオマイシン耐性マーカーをβ−チューブ
リンプロモータから発現させた。このベクターをpTS
−2と命名した。実施例9 Penicillium(GAP)プロモータのクローン化 Penicillium グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ(GAP)遺伝子を、Aspergillus niger由来
のGAP遺伝子をハイブリッド形成プローブとして使用
することにより、Penicillium λゲノムライブラリーか
らクローン化した。陽性の可能性がある4個のクローン
について、 Cephalosporium GAP遺伝子(Kimura, H.
et al., (1991), J. Ferm. and Bioeng., 71, 145-15
0)の5′領域のプライマーから生じたPCR産物によ
りさらに探索した。複製連鎖反応(PCR)のプライマ
ーに使用したオリゴヌクレオチドは、シアノエチルホス
ホラミディト化学(Pharmacia Gene Assembler instrum
entation)により合成し、オリゴ配列は次の通りであ
る。 配列番号:10 5' CGCGGATCCCGGCATCAACGGCTTCGGTCGTAT 3' 配列番号:11 5' CGCGGATCCGGGCACGCGCATGGACATGCCAGTG 3' 4個の陽性と目されたクローンの1個が、PCR産物と
クロスハイブリッド形成した。このゲノムクローンのB
amHI断片(4kb)を、配列決定目的でBamHI
で消化したベクターpSELECT(Promega Corporat
ion)に連結した。このベクターをpTS−0と命名し
た。この断片を配列決定すると、セファロスポリンGA
P遺伝子の既知配列との比較によりATG開始コドンが
確認された。Penicillium(GAP)プロモータを有する形質転換ベ
クターの構築 Penicillium GAPプロモータにStreptomycesエクスパ
ンダーゼ遺伝子を入れるために、ベクターpTS−0を
使用したin vitro部位特異的突然変異誘発によ
り新規NcoI部位をPenicillium GAP遺伝子のAT
Gに作った。突然変異誘発は、製造者の指示に従って行
った。オリゴヌクレオチドは、GAP遺伝子のATG開
始コドンのDNA領域をコードする配列に相補的である
ように構築したが、NcoI部位を作るために塩基を変
えて挿入した。オリゴヌクレオチドの合成はシアノエチ
ルホスホラミディト化学(Pharmacia Gene Assemblerin
strumentation)により行い、オリゴ配列は次の通りで
ある。配列番号:12 5' CAGTAAACGCAACCATGGTTGTCCAG 3' 突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。次に、
GAPプロモータを含むpTS−0のNcoI/Bam
HI断片(1.9kb)をNcoI/BamHIで消化
したベクターpFTSO−8(上記実施例7に記載のベ
クター)に連結し、Streptomycesエクスパンダーゼ遺伝
子とともにGAPプロモータの位置付けた。このベクタ
ーをpTS−0−1と命名した。次に、GAPプロモー
タ:エクスパンダーゼカセットを含むpTS−0−1の
BamHI/Hind III断片(3.0kb)をBam
HI/Hind IIIで消化したベクターpCI−6(上
記実施例8に記載のベクター)に連結して、GAPプロ
モータからStreptomycesエクスパンダーゼ遺伝子が発現
する最終的なPenicillium 形質転換ベクターpSD−1
を得た。実施例10 Penicillium chrysogenum の形質転換 上記Penicillium chrysogenum 菌株由来のプロトプラス
トを、25℃、220rpmの回転盤上で67時間、5
0mlのCM培養液に1×107個の胞子を接種するこ
とにより生成させた。菌糸体を寒冷紗上に濾取し、50
0ml容フラスコに移し、100mgのNovozyme 234(N
ovo BioLabs, Bagsvaerd,Denmark)を含む25mlのK
MP(0.7MのKCl、0.8Mのマンニトール、
0.02MのKPO4、pH6.3)に再懸濁し、30
℃、100rpmでインキュベートした。スフェロプラ
ストを寒冷紗/グラスウールフィルターでの濾過により
分離し、350×gで10分間遠心分離することにより
ペレット化した。次いで、スフェロプラストを10ml
のKMP緩衝液で3回洗浄し、KMPC(50mMのC
aCl2を有するKMP)に再懸濁して5×107細胞
/mlの濃度にし、室温で20分間放置した。Penicill
ium の形質転換のために、200mlのスフェロプラス
ト懸濁物を、50mlのPPC(40%PEG,MW3
500、20mMのKPO4,pH6.3、5%CaC
l2は使用直前に添加した)とともにDNA(5mg/
mlヘパリンを含む5mgのベクターDNA/6.2m
lのKMPC)に添加し、形質転換混合物を氷上で30
分間インキュベートした。新しく調製したPPC1ml
を添加し、その混合物を50mlの溶融した(50℃)
再生寒天(CM+1.3Mのマンニトールおよび3%寒
天)に移した。次いで、形質転換混合物を5枚のペトリ
皿に分配した。25℃で24時間再生した後、プレート
に、100mg/50mlOL(1%ペプトン/1%寒
天)のフレオマイシンを含むOLを上塗りした。上塗り
の量は再生寒天の量に等しい。プレートは、25℃で7
〜14日間インキュベートし、形質転換コロニーの発生
を観察した。実施例11 アジポイル−6−APAおよびアジポイル−7−ADC
A醗酵生成物のHPLC分析 高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用し
て、使用した未形質転換P.chrysogenum菌株でのアジポ
イル−6−APAの生産および使用した形質転換P.chry
sogenum菌株でのアジポイル−7−ADCAの生産の分
析を行った。その分析は、625溶媒供給システム、2
20nmおよび254nmにセットした490E可変波
長検出器、825Maximaデータシステムおよび固定相と
しての Novo-C-18カラムを有するWatersシステムで行っ
た。移動相(流量は1ml/分)は、2%メタノール/
98%の0.010M−KH2PO4によるイソクラテ
ィク溶離を5分間、2→40%直線勾配のメタノール/
0.010M−KH2PO4、pH7.0を15分間と
した。アジポイル−6−APAの定量は、220nmで
の標準ペニシリンNの基準線を使用して求め、アジポイ
ル−7−ADCAの定量は254nmでの標準デアセト
キシセファロスポリンの基準線を使用して求めた。
【0067】アジポイル−6−APAおよびアジポイル
−7−ADCAのペニシリナーゼ処理に対する感受性の
分析を、濾液に1単位/mlのペニシリナーゼIまたは
ペニシリナーゼIII を添加し、室温で10〜30分間イ
ンキュベートすることにより行った。これらのサンプル
を、上記と同じHPLC条件下で分析した。
−7−ADCAのペニシリナーゼ処理に対する感受性の
分析を、濾液に1単位/mlのペニシリナーゼIまたは
ペニシリナーゼIII を添加し、室温で10〜30分間イ
ンキュベートすることにより行った。これらのサンプル
を、上記と同じHPLC条件下で分析した。
【0068】アジポイル−6−APAおよびアジポイル
−7−ADCA物質のUVスペクトル分析を510溶媒
供給システム、990フォトダイオードアレイ検出器、
990データシステムおよび固定相としての Novo-C-18
カラムを有するWatersシステムを使用して行った。使用
した移動相は上記と同じ条件であった。
−7−ADCA物質のUVスペクトル分析を510溶媒
供給システム、990フォトダイオードアレイ検出器、
990データシステムおよび固定相としての Novo-C-18
カラムを有するWatersシステムを使用して行った。使用
した移動相は上記と同じ条件であった。
【0069】全醗酵培養液からのアジポイル−7−AD
CA物質の大規模な単離を、510溶媒供給システム、
990フォトダイオードアレイ検出器、990データシ
ステムおよび固定相としてのmBondapak C18 予備カラム
を使用したWatersシステムを使用して行った。移動相
(流量は5ml/分)は、0.010M−KH2P
O4、pH7.0によるイソクラティク溶離が35分間
であった。アジポイル−7−ADCA物質の保持時間に
対応する吸収ピークをフラクションコレクターにより集
めた。実施例12 生理活性分析 寒天拡散バイオアッセイを使用して、HPLCにより単
離したアジポイル−6−APAおよびアジポイル−7−
ADCA醗酵物質の抗生活性を測定した。20mlの単
離物質を、LB寒天平板培地(Bacillus subtilus ATCC
33677またはE.coli超感受性菌株(Prof. Arnold L. Dem
ain, MITからの提供)を接種した3%寒天(Gibco, Pai
sley, Scotland)を有する20g/lのLB培養液ベー
ス)の5mmディスクに広げた。Bacillus subtilusを
アジポイル−6−APA物質を分析するための指示菌株
として使用し、E.coli超感受性菌株をアジポイル−7−
ADCA物質を分析するための指示菌株として使用し
た。37℃で15時間インキュベートした後のディスク
周辺の生育阻害のハロ形成は、その物質が生理活性を有
することを示した。この実験におけるコントロールは、
デアセトキシセファロスポリンC、セファロスポリン
C、ペニシリンVおよびβ−ラクタム構造確認のための
コントロールとしてのペニシリナーゼを含んだ、または
含まない寒天であった。実施例13 RAEV酵素分析 全醗酵培養液から精製したアジポイル−7−ADCA物
質を、RAEV酵素(RAEV Corp.から市販されたもの)
の比活性を測定するための基質として使用した。0.1
6MのKH2PO4に10mMの基質、1mgのRAE
V酵素、5%のグリセロールを含む全体積50mlの反
応混合物を37℃でインキュベートした。0、1、3、
5、10、20および30分後に5mlずつ取り、35
mlの0.010M−KH2PO4、pH3.5で希釈
して−70℃に冷凍した後、前記条件下でのHPLC分
析を行った。
CA物質の大規模な単離を、510溶媒供給システム、
990フォトダイオードアレイ検出器、990データシ
ステムおよび固定相としてのmBondapak C18 予備カラム
を使用したWatersシステムを使用して行った。移動相
(流量は5ml/分)は、0.010M−KH2P
O4、pH7.0によるイソクラティク溶離が35分間
であった。アジポイル−7−ADCA物質の保持時間に
対応する吸収ピークをフラクションコレクターにより集
めた。実施例12 生理活性分析 寒天拡散バイオアッセイを使用して、HPLCにより単
離したアジポイル−6−APAおよびアジポイル−7−
ADCA醗酵物質の抗生活性を測定した。20mlの単
離物質を、LB寒天平板培地(Bacillus subtilus ATCC
33677またはE.coli超感受性菌株(Prof. Arnold L. Dem
ain, MITからの提供)を接種した3%寒天(Gibco, Pai
sley, Scotland)を有する20g/lのLB培養液ベー
ス)の5mmディスクに広げた。Bacillus subtilusを
アジポイル−6−APA物質を分析するための指示菌株
として使用し、E.coli超感受性菌株をアジポイル−7−
ADCA物質を分析するための指示菌株として使用し
た。37℃で15時間インキュベートした後のディスク
周辺の生育阻害のハロ形成は、その物質が生理活性を有
することを示した。この実験におけるコントロールは、
デアセトキシセファロスポリンC、セファロスポリン
C、ペニシリンVおよびβ−ラクタム構造確認のための
コントロールとしてのペニシリナーゼを含んだ、または
含まない寒天であった。実施例13 RAEV酵素分析 全醗酵培養液から精製したアジポイル−7−ADCA物
質を、RAEV酵素(RAEV Corp.から市販されたもの)
の比活性を測定するための基質として使用した。0.1
6MのKH2PO4に10mMの基質、1mgのRAE
V酵素、5%のグリセロールを含む全体積50mlの反
応混合物を37℃でインキュベートした。0、1、3、
5、10、20および30分後に5mlずつ取り、35
mlの0.010M−KH2PO4、pH3.5で希釈
して−70℃に冷凍した後、前記条件下でのHPLC分
析を行った。
【0070】比色用のアジポイル−p−アミノ安息香酸
基質に対するRAEV酵素の活性を、0.065MのK
H2PO4、pH7.0に5mMの基質、8.25mg
のRAEV酵素、10%のグリセロールを入れて全体積
50mlとし、これを使用して37℃で30分間分析し
た。反応は、96ウェルのマイクロタイターディッシュ
で行った。1/100に希釈した1MのNaNO2/
0.25M酢酸を50ml添加して反応を停止し、その
反応物を室温で3分間放置した。10mg/mlの4−
アミノ−5−ヒドロキシ−2,7−ナフタレン−ジスル
ホン酸一ナトリウム塩水和物/水を0.5MのNaHC
O3で1/100に希釈し、その100mlを添加し
て、EL312 Bio-Kinetics Plate Reader(BioTek I
nstruments)により515nmですぐに発色をモニター
した。実施例14 RAEV酵素反応物質のHPLC分析 アジポイル−7−ADCA基質を使用したRAEV酵素
(RAEV Corp.から市販されたもの)分析を全てHPLC
でモニターしたが、これは、625溶媒供給システム、
203nmおよび254nmにセットした490E可変
波長検出器、825Maximaデータシステムおよび固定相
としてのNovo-C18カラムを有するWatersシステムを使用
して行った。移動相(流量は1ml/分)は、2%メタ
ノール/98%の0.010M−KH2PO4、pH
3.5によるイソクラティク溶離を5分間、2→40%
直線勾配のメタノール/0.010M−KH2PO4、
pH3.5を15分間とした。反応物質の保持時間をモ
ニターするために標準7−ADCAを使用した。反応物
質の定量は、254nmでの標準7−ADCAの基準線
を使用して求めた。実施例15 アジポイル−7−ADCA醗酵物質の13C−NMR分
析 13 C−NMR(広幅プロトンデカップル)スペクトル
を、フーリエ変換方式のIBM−AF−350分光器に
より75.4MHz(7.1T)で求めた。サンプル
は、0.5mlのD2O(99.8%D、Aldrich)ま
たは0.5mlのDMSO−d6(99.0%D、Aldr
ich )における醗酵培養液から得た50mgのアジポイ
ル−7−ADCA物質から成り、350゜Kで5mmの
管に入れた。NMRデータにより、その物質がアジポイ
ル−7−ADCAであることが確認された。実施例16 別のアジポイルアシラーゼ酵素の評価 RAEV酵素を使用した研究の他に、アジポイル−7−
ADCA(および他のアジポイル化合物)からのアジポ
イル側鎖の脱離を、種々の微生物源から得た酵素により
例証した。最初の研究では、Pseudomonas sp. 菌株SE-8
3 およびSE-495(日本国微工研に各々、FERM BP-817お
よびFERM BP-818の受託番号で寄託されている。)なら
びにPseudomonas 菌株SY-77-1 (the Northern Regiona
l ResearchLaboratory にNNRLB-8070の受託番号で寄託
されている。)を、2.0%(w/v)のHyCase SF 、
0.5%(w/v)のグルタミン酸一ナトリウム、0.
5%(w/v)の酵母エキス、0.2%(w/v)のコ
ーンスティープ粉末、0.5%(w/v)の綿実油およ
び0.1%(w/v)のグルタル酸を含む培地で72時
間生長させた。細胞を遠心分離により集め、50mMの
リン酸塩緩衝液、pH8.0で洗浄した後、緩衝液に再
懸濁し、少量のクロロホルムを添加することにより外膜
を透過性にした。次いで、細胞懸濁物の一部をアジポイ
ル−p−ニトロアニリン(ad−PNA)と混合し、3
0℃で2〜18時間インキュベートした。インキュベー
ション後、その混合物を10%(v/v)の酢酸を添加
することにより酸性にした。遊離したp−ニトロアニリ
ンを次いで、γ−グルタミル−トランスフェラーゼ(Si
gma製品番号545-A )の分析用の試薬(キット型、 Sigm
aChemical Company 製)を使用してジアゾ化合物に変換
した後、比色法により検出した。3種類の菌株の相対的
活性は、各々、SE-495、SE-83 およびSY-77-1 に対して
100%、85.5%および48%であった。上記RA
EV酵素に対して記載したものと同様の方法を使用し
て、SE-83 およびSE-495酵素のアジポイル−7−ADC
Aに対する活性も示された。 SY-77-1のアジポイル−7
−ADCAに対するデアシル化活性は、この菌株がβ−
ラクタマーゼを生成するため、示すことができなかっ
た。
基質に対するRAEV酵素の活性を、0.065MのK
H2PO4、pH7.0に5mMの基質、8.25mg
のRAEV酵素、10%のグリセロールを入れて全体積
50mlとし、これを使用して37℃で30分間分析し
た。反応は、96ウェルのマイクロタイターディッシュ
で行った。1/100に希釈した1MのNaNO2/
0.25M酢酸を50ml添加して反応を停止し、その
反応物を室温で3分間放置した。10mg/mlの4−
アミノ−5−ヒドロキシ−2,7−ナフタレン−ジスル
ホン酸一ナトリウム塩水和物/水を0.5MのNaHC
O3で1/100に希釈し、その100mlを添加し
て、EL312 Bio-Kinetics Plate Reader(BioTek I
nstruments)により515nmですぐに発色をモニター
した。実施例14 RAEV酵素反応物質のHPLC分析 アジポイル−7−ADCA基質を使用したRAEV酵素
(RAEV Corp.から市販されたもの)分析を全てHPLC
でモニターしたが、これは、625溶媒供給システム、
203nmおよび254nmにセットした490E可変
波長検出器、825Maximaデータシステムおよび固定相
としてのNovo-C18カラムを有するWatersシステムを使用
して行った。移動相(流量は1ml/分)は、2%メタ
ノール/98%の0.010M−KH2PO4、pH
3.5によるイソクラティク溶離を5分間、2→40%
直線勾配のメタノール/0.010M−KH2PO4、
pH3.5を15分間とした。反応物質の保持時間をモ
ニターするために標準7−ADCAを使用した。反応物
質の定量は、254nmでの標準7−ADCAの基準線
を使用して求めた。実施例15 アジポイル−7−ADCA醗酵物質の13C−NMR分
析 13 C−NMR(広幅プロトンデカップル)スペクトル
を、フーリエ変換方式のIBM−AF−350分光器に
より75.4MHz(7.1T)で求めた。サンプル
は、0.5mlのD2O(99.8%D、Aldrich)ま
たは0.5mlのDMSO−d6(99.0%D、Aldr
ich )における醗酵培養液から得た50mgのアジポイ
ル−7−ADCA物質から成り、350゜Kで5mmの
管に入れた。NMRデータにより、その物質がアジポイ
ル−7−ADCAであることが確認された。実施例16 別のアジポイルアシラーゼ酵素の評価 RAEV酵素を使用した研究の他に、アジポイル−7−
ADCA(および他のアジポイル化合物)からのアジポ
イル側鎖の脱離を、種々の微生物源から得た酵素により
例証した。最初の研究では、Pseudomonas sp. 菌株SE-8
3 およびSE-495(日本国微工研に各々、FERM BP-817お
よびFERM BP-818の受託番号で寄託されている。)なら
びにPseudomonas 菌株SY-77-1 (the Northern Regiona
l ResearchLaboratory にNNRLB-8070の受託番号で寄託
されている。)を、2.0%(w/v)のHyCase SF 、
0.5%(w/v)のグルタミン酸一ナトリウム、0.
5%(w/v)の酵母エキス、0.2%(w/v)のコ
ーンスティープ粉末、0.5%(w/v)の綿実油およ
び0.1%(w/v)のグルタル酸を含む培地で72時
間生長させた。細胞を遠心分離により集め、50mMの
リン酸塩緩衝液、pH8.0で洗浄した後、緩衝液に再
懸濁し、少量のクロロホルムを添加することにより外膜
を透過性にした。次いで、細胞懸濁物の一部をアジポイ
ル−p−ニトロアニリン(ad−PNA)と混合し、3
0℃で2〜18時間インキュベートした。インキュベー
ション後、その混合物を10%(v/v)の酢酸を添加
することにより酸性にした。遊離したp−ニトロアニリ
ンを次いで、γ−グルタミル−トランスフェラーゼ(Si
gma製品番号545-A )の分析用の試薬(キット型、 Sigm
aChemical Company 製)を使用してジアゾ化合物に変換
した後、比色法により検出した。3種類の菌株の相対的
活性は、各々、SE-495、SE-83 およびSY-77-1 に対して
100%、85.5%および48%であった。上記RA
EV酵素に対して記載したものと同様の方法を使用し
て、SE-83 およびSE-495酵素のアジポイル−7−ADC
Aに対する活性も示された。 SY-77-1のアジポイル−7
−ADCAに対するデアシル化活性は、この菌株がβ−
ラクタマーゼを生成するため、示すことができなかっ
た。
【0071】同様にして、2種類の真菌性菌株(Altern
aria sp.MA-133、ATCC No.20492およびAspergillus sp.
MA-13、ATCC No.20491 ;U.S.4,141,790 (明治製菓)
参照)およびU.S.3,239,394 (Merck & Co., Inc. )に
セファロスポリンCアシラーゼ生産源として記載されて
いる3種類の別の細菌性菌株(Brevibacterium、ATCCN
o.14,649;Achromobacterium、ATCC No.14,648;および
Flavobacterium、ATCCNo.14,650)についても、アジポ
イル−アシラーゼ産生が示された。 〔配列表〕 配列番号:1 配列の長さ:14 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列
aria sp.MA-133、ATCC No.20492およびAspergillus sp.
MA-13、ATCC No.20491 ;U.S.4,141,790 (明治製菓)
参照)およびU.S.3,239,394 (Merck & Co., Inc. )に
セファロスポリンCアシラーゼ生産源として記載されて
いる3種類の別の細菌性菌株(Brevibacterium、ATCCN
o.14,649;Achromobacterium、ATCC No.14,648;および
Flavobacterium、ATCCNo.14,650)についても、アジポ
イル−アシラーゼ産生が示された。 〔配列表〕 配列番号:1 配列の長さ:14 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列
【0072】
【化10】
配列番号:2
配列の長さ:16
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0073】
【化11】
配列番号:3
配列の長さ:16
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0074】
【化12】
配列番号:4
配列の長さ:16
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0075】
【化13】
配列番号:5
配列の長さ:22
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
【0076】
【化14】
配列番号:6
配列の長さ:22
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
【0077】
【化15】
配列番号:7
配列の長さ:22
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列
【0078】
【化16】
配列番号:8
配列の長さ:34
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0079】
【化17】
配列番号:9
配列の長さ:47
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0080】
【化18】
配列番号:10
配列の長さ:33
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0081】
【化19】
配列番号:11
配列の長さ:34
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0082】
【化20】
配列番号:12
配列の長さ:26
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0083】
【化21】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
C12R 1:465)
(C12N 15/09 ZNA
C12R 1:645)
(C12N 1/15
C12R 1:645)
(C12N 9/80
C12R 1:38)
(C12P 35/00
C12R 1:82)
(72)発明者 ロリリー・クラウフオード
アメリカ合衆国、ワシントン・98011、ボ
セル、ノース・イースト、ナインテイファ
ースト・プレイス・14049
(72)発明者 フイリス・シー・マクエイダ
アメリカ合衆国、ワシントン・98072、ウ
ツデインビル、ノース・イースト、ワンハ
ンドレツドセブンテイサード・アベニユ
ー・15611
(72)発明者 ジヨン・エイ・ランボセツク
アメリカ合衆国、ワシントン・98115、シ
アトル、ノース・イースト、セブンテイー
ンズ・アベニユー・7701
Claims (7)
- 【請求項1】 アジポイル−7−アミノ−デスアセトキ
シ−セファロスポラン酸をアジポイルアシラーゼにより
脱アシル化する工程を含む7−アミノ−デスアセトキシ
−セファロスポラン酸の製造方法。 - 【請求項2】 アジポイル−7−アミノ−デスアセトキ
シ−セファロスポラン酸が、下記菌株によってアジポイ
ル−6−アミノペニシラン酸を産生するために利用され
得るアジピン酸の塩及びエステルの一つもしくはそれ以
上を含むアジペート源が添加された培地中にアジポイル
−6−アミノペニシラン酸を産生する能力を有するペニ
シリュウム(Penicillium)属の菌株を培養してアジポ
イル−6−アミノペニシラン酸を生成せしめる工程、お
よびアジポイル−6−アミノペニシラン酸を環拡張して
アジポイル−7−アミノデスアセトキシセファロスポラ
ン酸を生成する反応を触媒するエキスパンダーゼにより
アジポイル−6−アミノペニシラン酸をその場で(in s
itu)処理する工程により製造される請求項1に記載の
方法。 - 【請求項3】 ペニシリュウム属の菌株がエキスパンダ
ーゼをコードするDNAを有する組換えDNA発現ベク
ターにより形質転換された宿主菌株である請求項2に記
載の方法。 - 【請求項4】 アジポイル−7−アミノ−デスアセトキ
シ−セファロスポラン酸を、アジポイル−7−アミノ−
デスアセトキシ−セファロスポラン酸が発酵ブロスから
イオン交換クロマトグラフィにより分離される前または
分離された後に、アジポイルアシラーゼにより脱アシル
化する請求項2に記載の方法。 - 【請求項5】 アジポイルアシラーゼがシュードモナス
(Pseudomonas)の種由来である請求項1ないし4のい
ずれか一項に記載の方法。 - 【請求項6】 7−アミノデスアセトキシセファロスポ
ラン酸産物がフェニル酢酸を実質的に含まない請求項1
ないし5のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項7】 7−アミノデスアセトキシセファロスポ
ラン酸産物がフェノキシ酢酸を実質的に含まない請求項
1ないし5のいずれか一項に記載の方法。
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