ES2741147T3 - Composición de vacuna - Google Patents

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Abstract

Partícula viral Maraba MG1 aislada que tiene un genoma que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una variante de SEQ ID NO: 1 para su uso en terapia viral oncolítica induciendo una respuesta inmunitaria en un mamífero en un formato de sensibilización-refuerzo, en la que un primer adenovirus que expresa una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una variante de SEQ ID NO: 1, como proteína antigénica, se administra al mamífero en una cantidad adecuada para generar una respuesta inmunitaria, y el virus Maraba MG1 se administra en una cantidad adecuada para terapia viral oncolítica; y en la que el primer adenovirus se administra como vector de sensibilización y el virus Maraba MG1 se administra como vector de refuerzo en un primer y segundo refuerzo.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición de vacuna
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/767.776 presentada el 21 de febrero de 2013.
Campo
La presente divulgación se refiere a virus oncolíticos para inducir una respuesta inmunitaria.
Antecedentes
Los virus oncolíticos (OV) específicamente infectan, se replican en y destruyen células malignas, dejando los tejidos normales sin afectar. Varios Ov han alcanzado fases avanzadas de evaluación clínica para el tratamiento de diversas neoplasias (Russell SJ. et al., (2012) Nat Biotechnol 30:658-670). Una vez aprobados, tales agentes virales podrían sustituir a o combinarse con terapias contra el cáncer convencionales y permitir la reducción de la toxicidad y la mejora de la eficacia terapéutica.
Además del virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Stojdl DF. et al., (2000) Nat Med 6:821-825; Stojdl DF. et al., (2003) Cancer Cell 4:263-275), se han descrito recientemente otros rabdovirus que muestran actividad oncolítica (Brun J. et al., (2010) Mol Ther 18:1440-1449; Mahoney DJ. et al., (2011) Cancer Cell 20:443-456). Entre ellos, el virus Maraba distinto de VSV mostró el oncotropismo más amplio in vitro (documento WO 2009/016433). Se obtuvo por ingeniería genética un virus Maraba mutado con selectividad tumoral mejorada y virulencia reducida en células normales. La cepa atenuada es una cepa mutante doble que contiene tanto mutaciones de proteína G (Q242R) como de proteína M (L123W). In vivo, esta cepa atenuada, llamada MG1 o Maraba MG1, ha demostrado potente actividad antitumoral en modelos de tumores de xenoinjerto y singénicos en ratones, con eficacia terapéutica superior al VSV atenuado, VSVAM51 (documento WO 2011/070440).
Los datos acumulados a lo largo de los últimos años han revelado que la eficacia antitumoral de virus oncolíticos no solo depende de oncólisis directa sino que también puede depender de su capacidad para estimular inmunidad antitumoral (Bridle BW. et al., (2010) Mol Ther 184:4269-4275). Este control tumoral mediado inmunitariamente parece desempeñar un papel crítico en la eficacia general de la terapia de OV. De hecho, células inmunitarias adaptativas específicas del tumor pueden vigilar los tejidos y destruir células tumorales que ha pasado por alto el OV. Además, su compartimento de memoria puede prevenir la recidiva tumoral.
Diversas estrategias se han desarrollado para mejor la inmunidad antitumoral inducida por OV (Pol J. et al., (2012) Virus Adaptation and Treatment 4:1-21). Algunos grupos han diseñado por ingeniería genética un OV que expresa citocinas inmunoestimuladoras. Un virus herpes simple y un virus vaccinia que expresan factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GMCSF) han alcanzado respectivamente la fase III y IIB de la evaluación clínica para terapia contra el cáncer al tiempo que un VSV que expresa IFN-p acaba de entrar en fase I.
Otra estrategia, definida como una vacuna oncolítica, consiste en expresar un antígeno tumoral del OV (Russell SJ. et al., (2012) Nat Biotechnol 30:658-670). Anteriormente, se ha demostrado que el VSV podría también utilizarse como vector de vacuna contra el cáncer (Bridle BW. et al., (2010) Mol Ther 184:4269-4275). Cuando se aplica en un entorno de sensibilización-refuerzo heterólogo para tratar un modelo de melanoma murino, una vacuna oncolítica de dopacromo tautomerasa (hDCT) del VSV humano no solo induce una inmunidad específica de tumor aumentada frente a DCT sino también una reducción concomitante en la inmunidad adaptativa antiviral. Como resultado, la eficacia terapéutica mejoró drásticamente con un aumento tanto de supervivientes a medio como a largo plazo (documento WO 2010/105347). Aunque se mostró que VSV es eficaz usando hDCT como antígeno asociado a tumor, no hay forma de predecir qué antígenos asociados a tumores serán eficaces en un entorno de sensibilización-refuerzo heterólogo.
Es deseable proporcionar un vector de vacuna que pueda usarse para activar el sistema inmunitario del paciente para destruir células tumorales con toxicidad reducida para tejidos normales, por ejemplo, activando anticuerpos y/o linfocitos contra un antígeno asociado a tumor en el tumor. Es deseable si tal vector de vacuna muestra tanto actividad oncolítica como capacidad para reforzar la inmunidad celular adaptativa.
Sumario
La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. El siguiente sumario está destinado a introducir al lector en una o más invenciones descritas en el presente documento pero no a definir una cualquiera de ellas.
Es un objeto de la presente divulgación evitar o mitigar al menos una desventaja de las vacunas contra el cáncer anteriores.
Los autores de la presente divulgación han determinado sorprendentemente que puede usarse MAGEA3 en un entorno de sensibilización-refuerzo heterólogo para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero. Estos resultados son inesperados y no predecibles ya que no todos los antígenos asociados a tumores son capaces de inducir una respuesta inmunitaria por medio de una sensibilización-refuerzo heterólogo. Por ejemplo, los autores de la presente divulgación también determinaron que proteína 1 específica de placenta (PLAC-1) y el antígeno 1 nuclear de Epstein-Barr no fueron capaces de estimular una respuesta inmunitaria por medio de una sensibilización-refuerzo heterólogo.
En un primer aspecto, se proporciona un kit para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un mamífero tal como se caracteriza en las reivindicaciones. El kit incluye: un primer virus que expresa una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una variante de la misma, como proteína antigénica y que se formula para generar una inmunidad frente a la proteína o variante de la misma en el mamífero. El kit también incluye un virus Maraba MG1 que codifica para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, o una variante de la misma, como proteína antigénica, el virus Maraba MG1 formulado para inducir la respuesta inmunitaria en el mamífero; siendo el primer virus inmunológicamente distinto del virus Maraba MG1. La proteína antigénica expresada por el primer virus y la proteína antigénica expresada por el virus Maraba MG1 pueden ser idénticas.
El primer virus, el virus Maraba MG1, o ambos, pueden formularse para su administración como virus aislados.
El virus Maraba MG1 puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. El virus Maraba MG1 puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de un transgén con codones optimizados que comprende una secuencia de nucleótidos de s Eq ID NO: 3.
El primer virus puede incluir un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o 3, o puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o 3, dependiendo de si el primer virus es un virus de ARN de sentido positivo, un virus de ADN o un virus de ARN de sentido negativo.
Los dos virus pueden ser capaces de expresar diferentes variantes de la proteína que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1. La variante de la proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que se expresa por el primer virus, el virus Maraba MG1, o ambos, puede incluir al menos un epítopo asociado a tumor seleccionado del grupo que consiste en: FLWGPRALV (SEQ ID NO:27), KVAELVHFL (SEQ ID NO:28), EGDCAPEEK (SEQ ID NO:35), KKLLTQHFVQENYLEY (SEQ ID NO:36) y RKVAELVHFLLLKYR (SEQ ID NO:37), y es al menos el 70% idéntico a SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la variante será al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 1. Más preferiblemente, la variante será al menos el 90% idéntica a SEQ ID NO: 1. Incluso más preferiblemente, la variante será al menos el 95% idéntica a SEQ ID NO: 1.
La variante de la proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que se expresa por el primer virus, el virus Maraba MG1, o ambos, puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. La secuencia de nucleótidos que codifica para la variante puede incluir una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5.
El virus Maraba MG1 puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5. El primer virus puede incluir un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, o puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, dependiendo de si el primer virus es un virus de ARN de sentido positivo, un virus de ADN o un virus de ARN de sentido negativo.
Si el primer virus es un virus de ARN de sentido negativo, uno de cualquiera del virus Maraba MG1 o el primer virus puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o 3, y el otro del virus Maraba MG1 y el primer virus puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de SEQ ID NO: 5.
Si el primer virus es un virus de ARN de sentido positivo o un virus de ADN, el virus Maraba MG1 puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o 3, y el primer virus puede incluir una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5. Alternativamente, el virus Maraba MG1 puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, y el primer virus puede incluir una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o 3.
Uno de cualquiera del virus Maraba MG1 o el primer virus puede ser capaz de expresar una proteína que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o 4, y el otro del virus Maraba MG1 y el primer virus puede ser capaz de expresar una proteína que comprende la otra secuencia.
El primer virus puede ser un adenovirus.
Además, se proporciona una partícula viral Maraba MG1 aislada que tiene un genoma que codifica para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una variante de la misma para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un mamífero tal como se caracteriza en las reivindicaciones.
La variante de la proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
El genoma puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o 3.
El genoma puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5.
El genoma puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6.
Otros aspectos y características de la presente divulgación resultarán más evidentes para los expertos habituales en la técnica tras la revisión de la siguiente descripción de realizaciones específicas en conjunto con las figuras adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
Se describirán ahora realizaciones de la presente divulgación, a modo de ejemplo solo, con referencia a las figuras adjuntas, en las que las figuras 1 a 5 son con propósitos de ilustración solo.
La figura 1A muestra las respuestas de células T CD8+ o CD4+ en ratones portadores de tumores administrados con MG1-hDCT.
La figura 1B muestra la eficacia terapéutica de MG1-hDCT administrado como vector de sensibilización solo en un modelo de ratón con cáncer de pulmón metastásico.
La figura 2 muestra la comparación de la respuesta inmunitaria de una vacunación de sensibilización-refuerzo en ratones C57/BI6 con Ad-hDCT como vector de sensibilización y o bien Maraba MG1-hDCT bien VSV-hDCT como vector de refuerzo.
La figura 3 muestra la respuesta de células T en un modelo de ratón con cáncer de pulmón metastásico tras Ad-vacío o Ad-hDCT, como vector de sensibilización solamente o tras vacunación de sensibilización-refuerzo con Ad-hDCT, como vector de sensibilización y o bien Maraba MG1 GFP o bien Maraba MG1-hDCT, como vector de refuerzo. La figura 4 muestra el gráfico de supervivencia en un modelo de ratón con cáncer de pulmón metastásico tras Ad­ vacío o Ad-hDCT, como vector de sensibilización solamente o tras vacunación de sensibilización-refuerzo con AdhDCT, como vector de sensibilización y o bien Maraba MG1 GFP o bien Maraba MG1-hDCT, como vector de refuerzo. La figura 5 muestra el gráfico de supervivencia en un modelo de ratón con cáncer cerebral metastásico tras Ad-vacío o Ad-hDCT, como vector de sensibilización solamente o tras vacunación de sensibilización-refuerzo con Ad-hDCT, como vector de sensibilización y Maraba MG1-hDCT, como vectormm de refuerzo.
La figura 6 es un diagrama del vector de sensibilización Ad-MAGEA3, el vector de refuerzo Maraba MG1-MAGEA3 y la estrategia de sensibilización- refuerzo utilizada en un estudio inmunogenicidad/toxicidad en primates.
La figura 7 muestra el promedio de respuesta de células T en primates a los que se les administra de Ad-MAGEA3 como vector de sensibilización y una dosis alta o baja de MG1-MAGEA3 como vector de refuerzo. Las respuestas de células T se determinaron tras 5, 13 y 84 días tras el vector de refuerzo.
La figura 8 muestra las respuestas de células T en primates individuales a los que se les administra de Ad-MAGEA3 como vector de sensibilización y MG1-MAGEA3 como vector de refuerzo tras 5 días tras el vector de refuerzo. Las respuestas de células T se estratificaron en relación a la reserva de péptido MAGEA3 utilizado para estimular la respuesta.
Descripción detallada
La presente divulgación proporciona un kit para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un mamífero tal como se caracteriza en las reivindicaciones. El equipo incluye un primer virus que expresa MAGEA3, o una variante del mismo, como antígeno y que se formula para generar una inmunidad frente al antígeno en el mamífero. El equipo también incluye un virus Maraba MG1 que codifica para el mismo antígeno, o una variante del mismo antígeno, el virus Maraba MG1 formulado para inducir la respuesta inmunitaria en el mamífero. El primer virus es inmunológicamente distinto del virus Maraba MG1 de manera que puede actuar como “sensibilización” en una vacunación de sensibilización-refuerzo heterólogo.
Pueden administrarse inmunizaciones de sensibilización:refuerzo con métodos de administración de vacunas no coincidentes al tiempo que se utiliza el mismo antígeno, en un formato de sensibilización-refuerzo 'heterólogo; o con métodos de administración de vacunas coincidentes, en una sensibilización-refuerzo 'homólogo'. Se prefieren métodos de sensibilización-refuerzo heterólogos se prefieren cuando se utilizan plataformas de vacuna vectorizadas ya que la vacunación homóloga podría conducir al refuerzo de respuestas tanto del vector como del transgén en la respuesta secundaria. En cambio, un sistema heterólogo concentra la respuesta secundaria (que es, la respuesta reforzada) en el antígeno ya que las respuestas contra el primer y segundo vector son respuestas primarias, y son, por lo tanto, mucho menos robustas.
En la presente divulgación, el primer virus y el virus Maraba MG1 se utilizan en un formato de sensibilización-refuerzo heterólogo.
MAGEA3 pertenece a proteínas antigénicas que son autoantígenos ya tolerados por el sistema inmunitario a través de un proceso fuertemente controlado de selección negativa en el timo (Kruisbeek AM y Amsen D, (1996) Curr Opin Immunol 8:233-244; Stockinger B (1999) Adv Immunol 71:229-265) o tolerancia periférica. El reto principal con el desarrollo de vacunas para estas proteínas antigénicas, y cualquier otro autoantígeno, es inducir una fuerte respuesta inmunitaria dirigida selectivamente contra células cancerosas. También se han descubierto varios péptidos antigénicos asociados a tumor, los autores de la presente divulgación han determinado que es imposible predecir qué péptidos antigénicos asociados a tumor pueden utilizarse de manera exitosa para desarrollar vacunas.
El antígeno de melanoma, familia A,3 (MAGEA3) es un “antígeno de cáncer de testículos”. La familia MAGE de genes que codifican para antígenos específicos del tumor se comenta en De Plaen etal., Immunogenetics 40:360-369 (1994), MAGEA3 se expresa en una amplia variedad de tumores incluyendo melanoma, colorrectal y pulmón. Esta proteína la usaron los autores de la presente divulgación como proteína antigénica tanto en el primer virus como en el virus Maraba MG1. Los autores también utilizaron una variante de la proteína MAGEA3 como proteína antigénica tanto en el primer virus como en el virus Maraba MG1.
La proteína 1 específica para placenta (PLAC-1) es otro ejemplo de una proteína antigénica asociada a tumor que no fue capaz de generar una respuesta inmunitaria en una vacuna de sensibilización-refuerzo heterólogo.
En el contexto de la presente divulgación, una “variante” de una proteína antigénica asociada a tumor se refiere a una proteína que (a) incluye al menos un epítopo antigénico asociado a tumor de la proteína antigénica asociada a tumor y (b) es al menos el 70% idéntica a la proteína antigénica asociada a tumor. Preferiblemente, la variante será al menos el 80% idéntica a la proteína antigénica asociada a tumor. Más preferiblemente, la variante será al menos el 90% idéntica a la proteína antigénica asociada a tumor. Incluso más preferiblemente, la variante será al menos el 95% idéntica a la proteína antigénica asociada a tumor. Variantes con identidades de secuencia más altas han aumentado la probabilidad de que los epítopos se presenten de una manera tridimensional similar a las proteínas antigénicas de tipo natural.
Generalmente, un epítopo antigénico asociado a tumor puede identificarse dividiendo la proteína antigénica completa en una serie de péptidos solapantes, o generando bibliotecas de péptidos aleatorios, y buscando respuestas de células T estimulando PBMC o esplenocitos de animales vacunados con la proteína diana usando las reservas de péptidos. Las reservas que tienen una respuesta identifican el péptido como un posible epítopo antigénico. Este enfoque se debate por Morris, GE en Encyclopedia of Life Sciences, 2007, página 1-3 (doi: 10.1002/9780470015902.a0002624.pub2).
Se proporciona una base de datos que resume epítopos antigénicos bien aceptados por Van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B en “Database of T cell-defined human tumor antigens: the 2013 update.” Cancer Immun 2013 13:15 y en <http://www.cancerimmunity.org/peptide/>.
Ya se han identificado epítopos antigénicos asociados a tumor para MAGEA3. Por consiguiente, una variante de la proteína MAGEA3 puede ser, por ejemplo, una proteína antigénica que incluye al menos un epítopo antigénico asociado a tumor seleccionado del grupo que consiste en: EVDPIGh Ly (SEQ ID NO:26), FLWGPRALV (SEQ ID NO:27), KVAELVHFL (SEQ ID NO:28), TFPDLESEF (SEQ ID NO:29), VAELVHFLL (SEQ ID NO:30), MEVDPIGHLY (SEQ ID NO:31), REPVTKAEML (SEQ ID NO:32), AELVHFLLL (SEQ ID NO:33), WQYFFPVIF (SEQ ID NO:34), EGDCAPEEK (SEQ ID NO:35), KKLLTQHFVQENYLEY (SEQ ID NO:36), RKVAELVHFLLLKYR (SEQ ID NO:37), ACYEFLWGPRALVETS (SEQ ID NO:38), VIFSKASSSLQL (SEQ ID NO:39), VFGIELMEVDPIGHL (SEQ ID NO:40), GDNQIMPKAGLLIIV (SEQ ID NO:41), TSYVKVLHHMVKISG (SEQ ID NO:42), RKVAELVHFLLLKYRA (SEQ ID NO:43), y FLLLKYRAREPVTKAE (SEQ ID NO:44); y que es al menos el 70% idéntico a la proteína MAGEA3.
Puede ser deseable que las variantes de una proteína antigénica asociada a tumor incluyan solo epítopos antigénicos que tienen frecuencias alélicas altas, tales como frecuencias mayores del 40% de la población. Por consiguiente, ejemplos preferidos de variantes de MAGEA3 pueden incluir proteínas que incluyen al menos un epítopo antigénico seleccionado del grupo que consiste en: FLWGPRALV (SEQ ID NO:27), KVAELVHFL(SEQ ID NO:28), EGDCAPEEK (SEQ ID NO:35), KKLLTQHFVQENYLEY (SEQ ID NO:36), y RKVAELVHFLLLKYR (SEQ ID NO:37); y que es al menos el 70% idéntico a la proteína MAGEA3.
El antígeno expresado por el primer virus no necesita tener exactamente la misma secuencia que el antígeno expresado por el virus Maraba MG1. El antígeno expresado por Maraba MG1 debe inducir solo una respuesta inmunitaria solapante frente al antígeno expresado por el primer virus. Por ejemplo, el primer virus puede expresar el MAGEA3 y el virus Maraba MG puede expresar una variante de MAGEA3, o viceversa. Puesto que tanto MAGEA3 como la variante del MAGEA3 inducen respuestas inmunitarias solapantes (ya que ambos incluyen al menos una secuencia antigénica asociada a tumor idéntica), el primer virus actúa como sensibilizador y el virus Maraba MG1 actúa como refuerzo. Es suficiente que la respuesta inmunitaria generada en el mamífero frente al primer antígeno de como resultado una respuesta inmunitaria principalmente frente a MAGEA3 o la variante de MAGEA3 cuando el virus Maraba MG1 se administra.
En el contexto de la presente divulgación, debe entenderse que todos los debates de, y referencias a, una proteína expresada por un virus' más exactamente se refieren a una proteína expresada por una célula infectada con el virus puesto que los virus no tienen por sí mismos la capacidad para expresar proteínas. De manera similar, todos los debates de, y referencias a, un 'virus que expresa una proteína' o 'virus capaz de expresar una proteína' más exactamente se refieren a un virus que incluye la información genética necesaria para que la proteína se exprese por una célula infectada con el virus.
El kit puede incluir adicionalmente un compuesto inmunopotenciador, tal como ciclofosfamida (CPA), que aumenta la respuesta inmunitaria primaria frente a la proteína antigénica asociada a tumor generada en el mamífero por la administración del primer virus. La ciclofosfamida es un agente quimioterápico que puede conducir a respuestas inmunitarias potenciadas contra la proteína antigénica asociada a tumor. En un modelo de tumor de melanoma murino sinérgico, la CPA administrada antes del vector de sensibilización aumentó significativamente la supervivencia, al tiempo que la CPA administrada antes del vector de refuerzo no lo hizo.
El enfoque terapéutico divulgado en el presente documento combina: (1) una vacuna viral, y (2) virus Maraba MG1 como vacuna viral oncolítica, que expresan ambas MAGEA3, o una variante del misma. El refuerzo con la vacuna oncolítica puede conducir a tanto una reducción de tumor por el virus oncolítico como a un gran aumento en el número de CTL (linfocitos T citotóxicos) específicos de tumor en animales sensibilizados por la vacuna viral. Paradójicamente, esta metodología realmente genera respuestas antitumorales más grandes en animales que portan tumores, en comparación con animales libres de tumores, ya que la replicación de virus oncolítico se amplifica en animales que portan tumores, lo que conduce a un aumento en el número de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) específicos de antígeno, en comparación con replicación de virus oncolítico en los animales libres de tumores y los números asociados de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) específicos de antígeno.
Los productos de expresión de estos genes se procesan para dar péptidos, que, a su vez, se expresan en superficies de célula. Esto puede conducir a la lisis de las células tumorales por los CTL específicos. La respuesta de células T a antígenos externos incluye tanto linfocitos T citolíticos como linfocitos T colaboradores. Las células T citolíticas o citotóxicas CD8+ (CTL) son células T que, cuando se activan, lisan células que presentan el antígeno apropiado presentado por moléculas de HLA de clase I. Las células T colaboradoras CD4+ son células T que secretan citocinas para estimular macrófagos y células B productoras de antígeno que presentan el antígeno apropiado por moléculas de HLA de clase II en su superficie.
La proteína “MAGEA3” puede denominarse también “MAGE-A3” y representa el antígeno asociado a melanoma 3. La proteína MAGEA3 antigénica según la presente divulgación es una proteína que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Esta secuencia de aminoácidos puede codificarse por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. Alternativamente, la secuencia de aminoácidos puede codificarse por un transgén con codones optimizados que incluye la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3. Un virus de ARN de sentido negativo que expresa la proteína de SEQ ID NO: 1 puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de un polinucleótido de SEQ ID NO: 2 o 3. Un virus de ARN de sentido positivo o un virus de ADN que expresa la proteína de SEQ ID NO: 1 puede incluir una secuencia que es SEQ ID NO: 2 o 3.
Un ejemplo de una proteína variante MAGEA3 antigénica según la presente divulgación es una proteína que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Esta secuencia de aminoácidos puede codificarse por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5. Un virus de ARN de sentido negativo que expresa la proteína de SEQ ID NO: 4 puede incluir un polinucleótido de ARN que incluye una secuencia que es un complemento inverso y una versión de ARN de SEQ ID NO: 5. Un virus de ADN o virus de ARN que expresa la proteína de SEQ ID NO: 4 puede incluir una secuencia que es SEQ ID NO: 5.
Un ejemplo de un virus de ARN de sentido negativo de este tipo es un virus Maraba que incluye el complemento inverso y la versión de ARN de SEQ ID NO: 6.
Las secuencias mencionadas anteriormente se muestran en el apéndice A.
El término “mamífero” se refiere a seres humanos así como a mamíferos no humanos. El término “cáncer” se utiliza en el presente documento para abarcar cualquier cáncer que exprese la proteína antigénica asociada a tumor (es decir: MAGEA3) utilizada en los virus de interés.
Por ejemplo, cuando se considera MAGEA3 como proteína antigénica, el término “cáncer” abarca cualquier cáncer que expresa MAGEA3 como antígeno. Los ejemplos de este tipo de cáncer incluyen, pero no se limitan a, melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal y cáncer de vejiga.
El primer virus, el virus Maraba MG1, o ambos pueden administrarse independientemente al mamífero por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal o por vía intranasal. Tras la administración de los virus, se genera una respuesta inmunitaria por el mamífero dentro de un intervalo de respuesta inmunitaria, por ejemplo, dentro de aproximadamente 4 días, y que se extiende durante meses, años o potencialmente toda la vida.
El primer virus puede ser cualquier virus que induce una respuesta inmunitaria frente a la proteína antigénica asociada a tumor o variante de la misma tras administrarse el primer virus al paciente. Los virus que se usan según la presente divulgación incluyen adenovirus (Ad).
Para establecer una respuesta inmunitaria frente a la proteína antigénica asociada a tumor o variante de la misma, la vacunación usando el primer virus y el virus Maraba MG1 puede llevarse a cabo utilizando técnicas bien establecidas. Como un experto en la materia apreciará, la cantidad de virus requerida para generar una respuesta inmunitaria variará con varios factores, incluyendo, por ejemplo, el antígeno seleccionado, el vector viral utilizado para administrar el antígeno y el mamífero que va a tratarse, por ejemplo, especie, edad, tamaño, etc. En este sentido, por ejemplo, la administración intramuscular de al menos aproximadamente 107 UFP de vector adenoviral a un ratón es suficiente para generar una respuesta inmunitaria. Una cantidad correspondiente debe ser suficiente para su administración a un ser humano para generar una respuesta inmunitaria.
Una vez que se ha generado una respuesta inmunitaria en el mamífero por la administración del primer virus, el virus Maraba MG1 que codifica para la proteína antigénica asociada a tumor o una variante de la misma se administra en una cantidad adecuada para terapia viral oncolítica dentro de un intervalo de respuesta inmunitaria adecuado. Un intervalo de respuesta adecuado puede ser, por ejemplo, al menos aproximadamente 24 horas, preferiblemente al menos aproximadamente 2-4 días o más grande, por ejemplo, al menos aproximadamente 1 semana, o al menos aproximadamente 2 semanas. La cantidad de virus Maraba MG1 adecuada para terapia viral oncolítica variará con el mamífero a tratar, como apreciará un experto en la técnica. Por ejemplo, 108 UFP de virus Maraba MG1 que codifica para MAGEA3 administradas por vía i.v. a un ratón es suficiente para la terapia oncolítica. Una cantidad correspondiente será suficiente para su uso en un ser humano.
El virus Maraba MG1 que codifica para una proteína antigénica asociada a tumor o una variante de la misma puede prepararse incorporando un complemento inverso de un transgén que codifica para la proteína antigénica asociada a tumor o una variante de la misma en el virus Maraba MG1 utilizando tecnología recombinante convencional. Por ejemplo, el complemento inverso del transgén puede incorporarse en el genoma del virus Marama MG1, o alternativamente, puede incorporarse en el virus utilizando un plásmido que incorpora el transgén. El transgén que codifica para el tumor puede ser un transgén con codones optimizados.
Ejemplos
El Maraba MG1 oncolítico es una plataforma de vacuna oncolítica potente. Aunque no se pueden sensibilizar repuestas detectables contra un antígeno asociado a melanoma, la vacuna de Maraba MG1 muestra la capacidad para reforzar la inmunidad de células T CD4+ y CD8+ específicas de tumor preexistente. Cuando se aplica al tratamiento de modelos de tumor de melanoma murino singénico, la inmunización de recuerdo mediada por Maraba MG1 da como resultado una extensión de la mediana de supervivencia con remisión completa en más del 20% de los animales tratados.
En un estudio de toxicidad en primates la vacunación de sensibilización-refuerzo heterólogo con una sensibilización con Ad-MAGEA3 seguido por un refuerzo con Maraba-MG1-MAGEA3 dio como resultado respuestas de células T que eran comparables con las obtenidas en modelos de tumor murino singénico demostrando que en un población de primates no consanguíneos la estrategia de vacuna oncolítica de sensibilización-refuerzo proporciona respuestas inmunitarias comparables a modelos de animales donde pueden injertarse tumores y se obtiene una extensión drástica de la supervivencia.
En contraste, los autores de la presente divulgación determinan que la administración de un primer virus que expresa proteína EBDNA-1 o proteína 1 específica para placenta (PLAC-1) seguida por administración de Maraba-MG1 que expresa proteína EBDNA-1 o PLAC-1, respectivamente, no fue capaz de estimular una respuesta inmunitaria.
Ejemplo 1: MG1-hDCT es un vector de sensibilización débil pero un vector de refuerzo potente:
Ad-vacío y Ad-hDCT son adenovirus de replicación defectuosa (deleción de E1/E3) basados en el serotipo humano 5 (Lane C. et al., (2004) Cáncer Research 64:1509-1514; Ng P. et al., (2001) Mol Ther 3:809-815). El vector de adenovirus de replicación defectuosa se diseñó para expresar el transgén de hDCT, que codifica para antígeno asociado a melanoma humano de longitud completa DCT (dopacromo tautomerasa) al tiempo que Ad-vacío no tiene transgén. El vector de adenovirus resultante se denomina “Ad-hDCT”.
La variante MG1 de virus Maraba se diseñó por ingeniería genética para expresar la forma humana del transgén hDCT de antígeno asociado a melanoma. El vector de virus MG1 resultante se denomina “MG1-hDCT” o “Maraba MG1-hDCT”. Otros vectores de virus se nombran utilizando una convención similar.
Se generaron Maraba y VSV recombinantes por inserción de transgenes entre los genes virales G y L. VSV-hDCT se deriva de la cepa de Indiana de tipo natural del VSV (Bridle BW. et al. (2009) 17:1814-1821; Lawson ND. et al., (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:4477-4481). MG1-GFP (proteína fluorescente verde usada como inserción de transgén no inmunogénico de control) y MG1-hDCT se derivan de la cepa atenuada MG1 del virus Maraba. Antes de estudios in vivo, se confirmó la expresión de DCT (y GFP) a partir del virus por inmunotransferencia de tipo Western de lisados desde células Vero infectadas cultivadas en alpha-MEM que contiene el 10% de FBS, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 mg/ml (todos de Invitrogen, Grand Island, NY).
La eficacia terapéutica de MG1-hDCT administrada como monoterapia se evaluó inicialmente. Con el fin de generar metástasis de pulmón, se les inyectó a ratones C57BI/6 (8-10 semanas de edad al inicio del estudio) por vía i.v. 2,5x105 células B16-F10 (células de melanoma murino que expresan antígeno DCT murino) en 200 pl de agua salada. La vacuna oncolítica se inyectó sistémicamente 5 o 14 días después y se midieron las respuestas de células T contra el antígeno de melanoma DCT en la sangre en el día 19. El virus se administró sistémicamente en una dosis alta (109 ufp por vía i.v en 200 pl de PBS). Se midieron respuestas de células T aislando PBMC o esplenocitos y estimulándolos con los péptidos SVYDFFVWL (SVY) o KFFHRTCKCTGNFA (KFF) correspondientes a los epítopos inmunodominantes restringidos por MHC-I o MHC-II de DCT, respectivamente. Se detectaron respuestas de células T tras tinción de citocinas intracelulares (ICS) para IFN-y por citometría de flujo.
Como se muestra en las figuras 1A y 1B, MG1-hDCt no fue capaz de sensibilizar respuestas de células T CD8+ o CD4+ específicas de DCT en ratones que portan tumores (figura 1A). Administrada sola, la vacuna de MG1-hDCT no mejoró el desenlace tumoral. De hecho, el ratón tratado 14 días después de exposición al tumor alcanzó el criterio de valoración en un periodo de tiempo similar al de un ratón no tratado: tras 20 días para el grupo de control de Ad-vacío frente a 21 días para el grupo de Ad-vacío MG1-hDCT (figura 1B). Además, la supervivencia no se prolongó incluso cuando los ratones se trataron con MG1-hDCT tan pronto como 5 días tras el injerto del tumor (grupo de MG1-hDCT, figura 1B). En conclusión, no solo MG1-hDCT no pudo inducir inmunidad anti-DCT sino que su actividad oncolítica no ofreció beneficio terapéutico. Estos resultados demuestran que MG1-hDCT no es capaz de sensibilizar respuestas de célula T significativas contra el antígeno tumoral DCT y es, por tanto, un vector de sensibilización débil.
Se notificó anteriormente que un vector de VSV oncolítico sirve como un refuerzo potente de la inmunidad preexistente (Bridle BW. et al., (2010) Mol Ther 184:4269-4275; documento WO 2010/105347). En la presente divulgación, se examinó la capacidad del virus Maraba MG1 para servir como vacuna de refuerzo. Se usaron vectores adenovirales como vectores de sensibilización y se administraron por vía intramuscular (i.m.) en una dosis total de 2x108 ufp (1x108 ufp en 50 pl PBS por muslo). Para la inyección de adenovirus, se anestesiaron los ratones en una cámara sellada que contenía isoflurano de inhalación al 5%. Usando Ad-hDCT como vector de sensibilización, se evaluó MG1-hDCT como refuerzo de respuestas pre-existentes específicas de DCT. Para evaluar virus Maraba como vector de refuerzo, se evaluaron diversas rutas de administración. Se administró una dosis oncolítica de 1x109 ufp de virus, que se tolera bien en esta cepa de ratón y se seleccionó un intervalo de 12 días después de la sensibilización con Ad como si fuese el intervalo más largo que sería factible en el modelo de tumor. Cuando esta dosis de MG1-Maraba-hDCT se administró por vías intravenosa (i.v.), intranasal (i.n.) e intramuscular (i.m.), la vía i.v. demostró ser muy superior tal como se midió por ICS para IFN-y en células T CD8+ periféricas: el 28,33% ± 3,82 i.v. frente al 4,73% ± 1,52 i.n. frente al 13,84% ± 1,88 i.m. Las respuestas se midieron en el día 5 tras la administración de Maraba que coindice con el pico de la respuesta de refuerzo mediada por MG1-hDCT. En los animales reforzados por vía intravenosa, se midió una proporción significativa de células T CD8+ específicas de DCT también en el bazo con un aumento de 3 veces en ratones a los que se les administró ambos vectores de vacuna en comparación con animales sensibilizados solamente: 3,45% ± 0,45 en el grupo de Ad-hDCT frente al 11,02% ± 2,14 en los animales inmunizados con Ad-hDCT MG1-hDCT (p=0,0085**). Mientras que Ad-hDCT no fue capaz de inducir una población de células T CD4+ específicas de DCT detectable en la sangre y una población apenas en el bazo, el refuerzo con MG1 Maraba-hDCT fue capaz de generar una respuesta de célula T c D4+ sistemática y clara pero solo cuando se administró por vía i.v. (0,30% ±0,11). La respuesta se detectó también en el bazo con el 0,14% ± 0,03 de células T CD4+ esplénicas que reaccionaron a la exposición a péptido DCT KFF. Similar al VSV, se logró el refuerzo inmunitario máximo mediante virus MG1 Maraba mediante administración i.v. En conclusión, la administración sistemática de una vacuna vectorizada por Maraba a una dosis de 109 ufp parecía permitir un refuerzo eficaz tanto de poblaciones de células T tanto CD8+ como CD4+ específicas de antígeno Por esta razón, se utilizaron esta vía y dosis para la administración de Maraba MG1 en experimentos in vivo posteriores.
Para mostrar que Maraba MG1-hDCT es un vector de refuerzo más potente que VSV-hDCT, se sensibilizaron ratones C57/BI6 con Ad-hDCT (se incluyó Ad-BHG como vector de control que carece de transgén) y después se reforzaron con una dosis intravenosa o bien de VSV-hDCT o bien de Maraba-hDCT 14 días después. En el análisis inmunológico se midieron respuestas de células T CD8+ en sangre periférica el día 5 tras el vector de refuerzo. Como dosis equivalente, la repuesta inducida por la vacunación con Maraba fue 3-8 veces tan grande como las respuestas inducidas por VSV (figura 2).
Ejemplo 2: Estrategia de vacuna de MG1-hDCT en modelos murinos de cáncer
Se investigó posteriormente la eficacia terapéutica de MG1-hDCT administrado como vector de refuerzo. Cinco días después del injerto de B16-F10 para generar metástasis de pulmón en animales, los animales recibieron una vacuna de sensibilización de Ad-hDCT y a esto le siguió 9 días después una única dosis i.v. de MG1 Maraba-hDCT como vacuna de refuerzo oncolítica. La vacunación de sensibilización con Ad-hDCT-refuerzo con MG1-hDCT generó una respuesta de células T CD8+ específicas de DCT muy fuerte (% medio de células T IFN-y+ CD8+ = 27,54 ±2,17, figura 3) que fue 14 veces mayor que en ratones sin refuerzo (1,95% ± 0,29 en el grupo de AdhDCT y 1,91% ± 0,59 en el grupo de Ad-hDCT MG1-GFP, figura 3). De manera similar, se midieron respuestas de células T CD4+ específicas de DCT en animales reforzados con MG1-hDCT al tiempo que raramente se detectaron en ratones sensibilizados solamente (% medio de células T IFN-y+ CD4+ = 0,25% ± 0,06 en el grupo de Ad-hDCT MG1-hDCT frente a <0,05% en los grupos de Ad-hDCT y Ad-hDCT MG1-GFP, figura 3).
Observando los desenlaces de tratamiento, la inmunización con Ad-hDCT permitió una prolongación de 10 días de la mediana de supervivencia en comparación con ratones no tratados: 31 días para el tratamiento con Ad-hDCT frente a 20,5 días para grupo de Ad-vacío (figura 4). El tratamiento con Ad-hDCT seguido por tratamiento oncolítico con MG1 Maraba-GFP no mejoró la supervivencia (27,5 días de mediana de supervivencia para el grupo de AdhDCT MG1-GFP, figura 4). Sin embargo, el refuerzo de la inmunidad antitumoral con la vacuna Maraba MG1-DCT mejoró drásticamente los desenlaces de tumor con una prolongación de 20 días de la mediana de supervivencia en comparación con animales sensibilizados solamente con Ad-hDCT (51 días para el grupo de Ad-hDCT MG1-hDCT, figura 4). De manera más importante, el tratamiento de refuerzo con MG1-hDCT oncolítico dio como resultado una supervivencia a largo plazo del 23,3% (figura 4).
Con el fin de caracterizar la contribución respectiva de respuestas de células T CD4+ y CD8+ específicas de tumor en la eficacia terapéutica, cada compartimento de células T se agotó selectivamente (datos no mostrados). El agotamiento de la población de células T CD8+ en el momento del refuerzo anuló el beneficio terapéutico de la administración de MG1-hDCT. Por el contrario, el agotamiento de células T CD4+ no pareció afectar significativamente a la eficacia terapéutica indicando que el refuerzo inmunitario con Maraba de células T CD8+ es independiente de CD4+. Aunque se admite el papel fundamental de células T CD8+ en el control del crecimiento tumoral, estos resultados muestran que el refuerzo de células T CD8+ específicas de tumor con vacuna Maraba es una forma potente de mejorar la terapia contra el cáncer.
Finalmente, la eficacia de la estrategia de sensibilización-refuerzo que implica la vacuna Maraba también se evaluó en un modelo B16-F10 intracraneal muy exigente de cáncer de cerebro de melanoma metastásico. La inmunoterapia mediada por Ad-hDCT mejoró significativamente la supervivencia de ratones que portan un cerebro con melanoma con una mediana prolongada desde 15 días para controles de Ad-vacío hasta 25,5 días para el grupo de Ad-hDCT (figura 5). Tal como se notificó anteriormente, tal eficacia terapéutica demuestra la capacidad de células T efectoras específicas de tumor generadas para atravesar la barrera hematoencefálica e infiltrar el lecho del tumor (Bridle BW. et al., (2010) Mol Ther 184:4269-4275). La administración adicional de un refuerzo oncolítico de Maraba MG1-hDCT además mejoró los desenlaces de tumor con una mediana de supervivencia que alcanza 42 días junto con curas observadas en el 21,4% de los animales tratados (grupo de Ad-hDCT MG1-hDCT, figura 5).
Ejemplo 3: Insuficiencia de la estrategia de vacuna para inducir una respuesta de células T anti-mPLAC1:
Aunque Maraba MG1 y VSV eran capaces de actuar como vectores de refuerzo usando hDCT como antígeno asociado a tumor, no todos los antígenos asociados a tumor pueden utilizarse en una estrategia de vacuna de sensibilizaciónrefuerzo heterólogo. Los autores de la presente divulgación sometieron a prueba una estrategia de vacuna de sensibilización-refuerzo heterólogo utilizando huAd5-mPLAC1 como vector de sensibilización y VSV-mPLAC1 como vector de refuerzo.
PLAC1 es un antígeno asociado a tumor que se describió recientemente expresado en la placenta pero se ha notificado también en varias líneas de células tumorales y en tumores de pacientes con cáncer de mama, pulmón, hígado, gástrico y colorrectal (Silva, WA et al., (2007) Cancer Immun 7:18).
Ad-mPLAC1 es un adenovirus de replicación defectuosa (deleción de E1/E3) basado en el serotipo humano 5 (Lane C. et al., (2004) Cancer Research 64:1509-1514; Ng P. et al., (2001) Mol Ther 3:809-815). El vector de adenovirus de replicación defectuosa se diseñó por ingeniería genética para expresar el transgén mPLAC1, que codifica para el antígeno murino de longitud completa PLAC1 (específica de placenta 1), el vector de adenovirus resultante se denomina “Ad-mPLAC1” o “huAd5-mPLAC1 “.
El virus VSV se diseñó por ingeniería genética para expresar la forma humana transgén de antígeno asociado a melanoma mPLACI. El vector de virus VSV resultante se denomina “VSV-mPLAC1 “. El VSV recombinante se generó por inserción del transgén entre los genes virales G y L. El VSV-mPLACI se deriva de la cepa de Indiana de tipo natural del VSV (Bridle BW. et al. (2009) 17:1814-1821; Lawson ND. et al., (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:4477-4481).
Se sensibilizaron ratones C57BI/6 con Ad-mPLAC1 (inyección i.m. de 2x109 UFP) y después se reforzaron con una única dosis i.v. de VSV-mPLAC1 (2x109 UFP) 14 días después. Se midieron respuestas de células T aislando esplenocitos y estimulándolos con péptidos de 15 meros individuales a partir de una biblioteca de péptidos de PLAC1 solapantes durante un total de 6 horas con Golgiplug añadido 1 hora dentro de la estimulación. Después de la estimulación, los esplenocitos se tiñeron para detectar CD4, CD8 e IFNy y se analizaron en FACSCanto y FlowJo. Se detectaron células T que responden tras la tinción de citocinas intracelulares (ICS) para IFN-y por citometría de flujo. Ninguno de los péptidos de mPLAC1 fueron capaces de estimular la producción de IFN-y en células T o bien CD8 o bien CD4.
Ejemplo 4: Construcción de vectores de vacuna oncolítica con MAGEA3 o una variante de la misma:
Ad-MAGEA3 es un adenovirus de replicación defectuosa (deleción de E1/E3) basado en el serotipo humano 5 (Lane C. et al., (2004) Cancer Research 64:1509-1514; Ng P. et al., (2001) Mol Ther 3:809-815) que contiene el gen Ma GeA3 humano de longitud completa. Maraba MG1-hMAGEA3 se ha desarrollado y contiene el gen MAGEA3 humano de longitud completa con codones optimizados insertado entre los genes virales G y L del mutante doble MG1 del virus Maraba (Brun J. et al., (2010) Mol Ther 18:1440-1449). Se optimizaron los codones de la secuencia de MAGEA3 (ID de gen del NCBI: 4102 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4102) para expresión en células de mamíferos y después se sintetizó con una etiqueta FLAG en el extremo 3' y con sitios de restricción MIul en ambos extremos 3' y 5'. Esta secuencia se ligó en el vector lanzadera pMRB-MG1/pNF en su sitio Mlul (entre los genes G y L) que contiene parte del genoma de Maraba-MG1 desde el principio del gen G hasta el final de L, flanqueado por sitios Kpnl y Nhel, respectivamente. La región completa desde Kpnl a Nhel, que contiene ahora MAGEA3 Flag entre G y L, se retiró después del pMRB-MG1/pNF y se ligó de nuevo en el plásmido genómico pMRB-MG1 utilizando los sitios Kpnl y Nhel. Entonces se rescató Maraba-MG1-MAGEA3 Flag y se purificó en placa. Esto se ilustra en la figura 6.
Una proteína MAGEA3 humana de longitud completa expresada por el adenovirus puede incluir la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. El adenovirus puede incluir una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. Alternativamente, la secuencia de aminoácidos puede codificarse por un transgén con codones optimizados que incluye la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3. Por consiguiente, el adenovirus puede incluir la secuencia de nucleótidos de codones optimizados de SEQ ID NO: 3.
El virus Maraba MG1 puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. Alternativamente, la secuencia de aminoácidos puede codificarse por un transgén con codones optimizados que incluye la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3. Por consiguiente, el virus Maraba MG1 puede incluir el complemento inverso y la versión de ARN de la secuencia de nucleótido de codones optimizados de SEQ ID NO: 3.
Una variante de MAGEA3 es una proteína que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Esta secuencia de aminoácidos puede codificarse por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5. El adenovirus puede incluir una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5. El virus Maraba MG1 puede incluir un complemento inverso y una versión de ARN de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5.
Un virus de ARN de sentido negativo, tal como un virus Maraba, que expresa la proteína de SEQ ID NO: 4 puede incluir un polinucleótido de ARN que incluye una secuencia que es un complemento inverso y una versión de ARN de SEQ ID NO: 6.
Ejemplo 5: Respuesta inmunitaria de la vacuna MG1-MAGEA3 en primates sanos:
Se utilizaron monos cynomolgus sanos en un estudio diseñado para recoger datos de toxicidad e inmunogenicidad para desarrollar la vacuna oncolítica MG1-MAGEA3 potencial para su uso en humanos. El uso de los monos cynomolgus maximiza la probabilidad de identificar respuestas que son cuantitativa y cualitativamente similares a aquellas esperadas en humanos. Antes de empezar el estudio los primates se aclimataron durante 4-6 semanas desde el momento de la llegada del animal hasta el momento de cirugía de implantación de vías de acceso vascular. Tras un mínimo de 2-3 semanas después de la cirugía, se vacunaron animales con un vector de sensibilización Ad-MAGEA3 de adenovirus no replicante, inyectado en cada pata, 0,5 ml por dosis que totalizan 1x1010 ufp por inyección i.m. lenta. Para el estudio de sensibilización-refuerzo con Ad-MAGEA3/MG1-MAGEA3, la sensibilización con Ad-MAGEA3 se produjo en o bien 2 semanas (14 días) o bien en 4 semanas (28 días) antes del refuerzo con MG1-MAGEA3. Por tanto, la administración de Ad-MAGEA3 se produce el día 14 o el día 28 y el refuerzo con MG1-MAGEA3 los días 0 y 3. El fundamento del nivel de dosificación de Ad-MAGEA3 proviene de la bibliografía, y de experimentos anteriores que demuestran que una dosis de 1x1010 ufp en macacos (y humanos) es una dosis segura sin toxicidades observadas (Bett et al. Vaccine, 2010). Para animales en el grupo reforzado en la semana 2, se inyectó virus MG1-MAGEA3 por vía i.v. o bien en una dosis baja de 1 x 1010 o bien en una dosis alta de 1 x 1011 en los días 0 y 3 del experimento (14 y 17 días tras Ad-MAGEA3). Para animales en el grupo reforzado en la semana 4, se inyectó virus MG1-MAGEA3 por vía i.v. o bien en una dosis baja de 1 x 1010 o bien en una dosis alta de 1 x 1011 en días 0 y 3 del experimento, (28 y 31 días tras el Ad-MAGEA3). Se infundió virus de refuerzo en 30 ml de solución salina tamponada estéril (pH 7,5) a lo largo de 30 minutos a través de la vía de acceso vascular. El fundamento para el nivel de dosificación bajo de MG1-MAGEA3 proviene de estudios preclínicos que demuestran que la dosis tolerable máxima murina es de 1x109. El aumento a escala del área de superficie corporal relativa a macacos equivale a un total de 3,5x1010 ufp. El fundamento para el nivel de dosificación alta de MG1-MAGEA3 proviene del estudio toxicológico piloto de primates no humanos (NHP), donde no se observó toxicidad en un nivel de dosis de2x1011 ufp. Los animales en el estudio de sensibilizaciónrefuerzo se sacrificaron o bien pronto (día 14) o bien tarde (día 84). Para el estudio de sensibilización-refuerzo de Ad-MAGEA3/MG1-MAGEA3, se tomaron muestras de sangre de todos los animales en 5 puntos de tiempo distintos. Para animales en la cohorte de sensibilización-refuerzo heterólogo en la semana 2, se recogieron muestras de sangre antes de cualquier vacunación y en un día anterior al día 14 (valores de referencia) y en los días 5, 13 y 84 del experimento. Para animales en la cohorte de sensibilización-refuerzo heterólogo en la semana 4, se recogieron muestras de sangre antes de cualquier vacunación y en un día anterior al día 28 (valores de referencia), y en los días 5, 13 y 84 del experimento.
Para evaluar respuestas inmunitarias en los primates de la vacunación de sensibilización-refuerzo heterólogo con Ad-MAGEA3/MG1-MAGEA3, se incubaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) durante 4 horas (las últimas 3 horas en presencia de brefeldina A) con una reserva de 10 péptidos hMAGE-A3 para la (re)estimulación de células T (o se deja sin estimular para la evaluación del fondo). Los péptidos eran de una biblioteca de péptidos solapantes que cubren el antígeno hMAGE-A3 completo desde los extremos N a C terminales en 87 péptidos (15 meros cada uno). Tras la estimulación, se tiñeron células T con anticuerpos fluorescentes anti-CD8 y anti-CD4 durante 25 minutos. Tras esta tinción de superficie, se permeabilizaron y fijaron las células con BD Cytofix/Cytoperm durante 20 minutos. Después, se detectaron células T específicas de hMAGE-A3 observando la expresión de citocinas mediante tinción intracelular con anticuerpos anti-IFNy y anti-TNFa fluorescentes durante 25 minutos. Se realizó el análisis celular en citómetro de flujo BD Canto.
La figura 7 muestra las respuestas inmunitarias de células T CD8+ promedio de monos a los que se les administró una dosis alta y baja de MG1-MAGEA3 como vector de refuerzo tras una sensibilización con Ad-MAGEA3. En animales con MG1-MAGEA3 a dosis baja hay un aumento significativo en la respuesta de células T CD8+ 5 días después del refuerzo, que disminuye con el tiempo mientras que en los animales con MG1-MAGEA3 a dosis alta hay un aumento similar significativo en la respuesta de células T CD8+ 5 días después del refuerzo, que se mantienen en un nivel más alto a lo largo del tiempo. La figura 8 muestra que todos los animales en el estudio mostraron un aumento significativo en la respuesta de células T CD8+ 5 días después del refuerzo con MG1-MAGEA3 independientemente de la dosis alta o baja. Estas respuestas de células T pico en primates demuestra que en una población no consanguínea la estrategia de vacuna oncolítica de sensibilización-refuerzo da respuestas inmunitarias comparables a modelos de animales en donde pueden injertarse tumores y se alcanza una prolongación drástica de la supervivencia.
En la descripción anterior, para propósitos de explicación, numerosos detalles se exponen con el fin de proporcionar un entendimiento completo de los ejemplos. Los ejemplos descritos anteriormente están previstos a modo de ejemplo únicamente.
Apéndice A- Secuencias de nucleótidos y proteínas
Secuencia de proteína de MAGEA3 de longitud completa, tipo natural, humana (SEQ ID NO: 1):
MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPD
PPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLL
LKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGL
SYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQ
HFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHISYPPLHEWVL
REGEE*
Secuencia de ADN que codifica para MAGEA3 de longitud completa, tipo natural, humana (SEQ ID NO: 2): ATGCCTCTTGAGCAGAGGAGTCAGCACTGCAAGCCTGAAGAAGGCCTTGAGGCCCGAG GAGAGGCCCTGGGCCTGGTGGGTGCGCAGGCTCCTGCTACTGAGGAGCAGGAGGCTG CCTCCT CCT CTT CT ACT CT AGTT G AAGT CACCCTGGGGG AGGTGCCTGCTGCCG AGT CA CCAG AT CCT CCCCAG AGT CCT CAGGG AGCCT CCAGCCTCCCCACT ACCAT G AACT ACC CTCTCTGGAGCCAATCCTATGAGGACTCCAGCAACCAAGAAGAGGAGGGGCCAAGCAC CTT CCCT G ACCT GG AGT CCG AGTT CCAAGCAGCACT CAGT AGG AAGGTGGCCG AGTT G GTTCATTTTCTGCTCCTCAAGTATCGAGCCAGGGAGCCGGTCACAAAGGCAGAAATGCT GGGG AGT GT CGT CGG AAATT GGCAGT ATTT CTTT CCT GT G AT CTT CAGCAAAGCTT CCA GTTCCTTGCAGCTGGTCTTTGGCATCGAGCTGATGGAAGTGGACCCCATCGGCCACTT GTACATCTTTGCCACCTGCCTGGGCCTCTCCTACGATGGCCTGCTGGGTGACAATCAGA T CATGCCCAAGGCAGGCCT CCT G AT AAT CGTCCT GGCCAT AAT CGCAAG AG AGGGCG A CTGTGCCCCTGAGGAGAAAATCTGGGAGGAGCTGAGTGTGTTAGAGGTGTTTGAGGGG AGGGAAGACAGTATCTTGGGGGATCCCAAGAAGCTGCTCACCCAACATTTCGTGCAGG AAAACTACCTGGAGTACCGGCAGGTCCCCGGCAGTGATCCTGCATGTTATGAATTCCTG TGGGGTCCAAGGGCCCTCGTTGAAACCAGCTATGTGAAAGTCCTGCACCATATGGTAAA G AT CAGTGG AGG ACCT CACATTT CCT ACCCACCCCT GCAT G AGTGGGTTTT G AG AG AG GGGGAAGAGTGA
Secuencia de ADN con codones optimizados que codifica para proteína MAGEA3 de longitud completa, tipo natural, humana (SEQ ID NO: 3):
ATGCCCCTGGAGCAGCGGTCTCAGCATTGCAAGCCAGAGGAGGGCCTCGAGGCGAGG GGCGAGGCCCTCGGCTTGGTGGGGGCGCAGGCTCCTGCAACCGAGGAGCAAGAGGC CGCATCCAGTTCCTCTACCCTGGTTGAGGTGACCTTGGGTGAGGTGCCCGCCGCGGAG AGCCCCGACCCGCCTCAAAGCCCCCAGGGTGCCAGCTCCCTGCCCACAACAATGAACT ACCCACT CT GG AGT CAGT CTT ACG AGG ACAGT AGT AACCAAG AGGAGG AGGG ACCCT C CACATT CCCAG ACCTGG AGT CT G AATT CCAGGCAGCATT GT CT AG AAAAGT GGCCG AAT TGGTGCACTTCCTGCTGCTGAAGTATCGCGCCCGCGAGCCAGTCACAAAAGCTGAAAT GCTGGGTTCTGTCGTGGGAAATTGGCAGTACTTCTTCCCCGTGATCTTCAGTAAAGCGT CCAGCT CCTT GCAGCTGGT CTTTGGT AT CG AGCT G ATGG AGGT GG AT CCCAT CGGCCA TCTGTATATCTTTGCCACATGCCTGGGCCTGAGCTACGATGGCCTGCTGGGCGACAAC CAGATCATGCCAAAAGCTGGCCTGCTGATCATCGTTCTGGCTATCATCGCTAGAGAAGG AGATTGCGCCCCTGAAGAAAAGATCTGGGAGGAACTGAGCGTCCTGGAAGTCTTTGAG GGTCGTGAAGACAGCATTCTCGGGGATCCCAAGAAGCTGCTGACCCAGCACTTCGTGC AGG AG AACT AT CTGGAGT ACCGCCAGGTT CCCGGCAGCG ACCCCGCTT GCT ACG AGTT CCTGTGGGGCCCCAGGGCCCTGGTCGAGACATCCTACGTGAAGGTCCTGCACCATATG GTTAAAATCAGCGGCGGCCCCCATATCTCTTATCCGCCGCTCCACGAGTGGGTGCTCC GGGAGGGAGAGGAG

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Partícula viral Maraba MG1 aislada que tiene un genoma que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una variante de SEQ ID NO: 1 para su uso en terapia viral oncolítica induciendo una respuesta inmunitaria en un mamífero en un formato de sensibilización-refuerzo, en la que un primer adenovirus que expresa una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una variante de SEQ ID NO: 1, como proteína antigénica, se administra al mamífero en una cantidad adecuada para generar una respuesta inmunitaria, y
    el virus Maraba MG1 se administra en una cantidad adecuada para terapia viral oncolítica; y
    en la que el primer adenovirus se administra como vector de sensibilización y el virus Maraba MG1 se administra como vector de refuerzo en un primer y segundo refuerzo.
  2. 2. Partícula viral Maraba MG1 aislada para su uso según la reivindicación 1, en la que la variante de SEQ ID NO: 1 tiene al menos un epítopo asociado a tumor seleccionado del grupo que consiste en: FLWGPRALV (SEQ ID NO: 27), KVAELVHFL (SEQ ID NO: 28), EGDCAPEEK (SEQ ID NO: 35), KKLLTQHFVQENYLEY (SEQ ID NO: 36), y RKVAELVHFLLLKYR (SEQ ID NO: 37), y es al menos el 70%, el 80%, el 90% o el 95% idéntico a SEQ ID NO: 1.
  3. 3. Partícula viral Maraba MG1 aislada para su uso según la reivindicación 1, en la que la variante de SEQ ID NO: 1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
  4. 4. Partícula viral Maraba MG1 aislada para su uso según la reivindicación 1, en la que el genoma incluye un complemento inverso y una versión de ARN de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, 3 o 5; o donde el genoma incluye un complemento inverso y una versión de ARN de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6.
  5. 5. Vacuna viral de sensibilización-refuerzo heterólogo oncolítica para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un mamífero en un formato de sensibilización-refuerzo que comprende:
    un primer adenovirus que expresa una proteína que comprende
    la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una variante de SEQ ID NO: 1; como proteína antigénica, formulada para generar una inmunidad frente a la proteína o variante de la misma en el mamífero; y una partícula viral Maraba MG1 que tiene un genoma que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una variante de SEQ ID NO: 1 en la que la proteína codificada se expresa como una proteína antigénica, formulada para inducir la respuesta inmunitaria en el mamífero; en la que la partícula viral Maraba MG1 ha de administrarse dentro de un intervalo de respuesta inmunitaria adecuado de aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2-4 días, aproximadamente 1 semana o aproximadamente 2 semanas tras la administración del primer adenovirus; y
    en la que el primer adenovirus se administra como vector de sensibilización y el virus Maraba MG1 se administra como vector de refuerzo en un primer y segundo refuerzo.
  6. 6. Vacuna viral oncolítica para su uso según la reivindicación 5, en la que
    el virus Maraba MG1 incluye un complemento inverso y una versión de ARN de un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2;
    el primer virus incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2; o el virus Maraba MG1 incluye un complemento inverso y una versión de ARN de un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, y
    el primer virus incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
  7. 7. Vacuna viral oncolítica para su uso según la reivindicación 5, en la que
    el virus Maraba MG1 incluye un complemento inverso y una versión de ARN de un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3;
    el primer virus incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3; o el virus Maraba MG1 incluye un complemento inverso y una versión de ARN de un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, y
    el primer virus incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3.
  8. 8 Vacuna viral oncolítica para su uso según la reivindicación 5, en la que la variante de proteína que se expresa por el primer virus incluye al menos un epítopo asociado a tumor seleccionado del grupo que consiste en: FLWGPRALV (SEQ ID NO: 27), KVAELVHFL (SEQ ID NO: 28), EGDCAPEEK (SEQ ID NO: 35), KKLLTQHFVQENYLEY (SEQ ID NO: 36) y RKVAELVHFLLLKYR (SEQ ID NO: 37), y es al menos el 70%, el 80%, el 90% o el 95% idéntico a SEQ ID NO: 1.
  9. 9 Vacuna viral oncolítica para su uso según la reivindicación 8, en la que la variante de proteína que se expresa por el primer virus, el virus Maraba MG1, o ambos, tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o se codifica por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5.
  10. 10. Vacuna viral oncolítica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en la que la proteína antigénica expresada por el primer virus y la proteína antigénica expresada por el virus Maraba MG1 son idénticas.
  11. 11. Vacuna viral oncolítica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en la que el virus Maraba MG1 y el primer virus expresan diferentes variantes de la proteína que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1.
  12. 12. Vacuna viral oncolítica para su uso según la reivindicación 11, en la que
    el virus Maraba MG1 incluye un complemento inverso y una versión de ARN de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 o 3, y el primer virus incluye una secuencia que es SEQ ID NO: 5; o
    el virus Maraba MG1 incluye un complemento inverso y una versión de ARN de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, y el primer virus incluye una secuencia que es SEQ ID NO: 2 o 3.
  13. 13. Vacuna viral oncolítica para su uso según la reivindicación 11, en la que uno de cualquiera del virus Maraba MG1 o el primer virus son capaces de expresar una proteína que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o 4, y el otro del virus Maraba MG1 y el primer virus son capaces de expresar una proteína que comprende la otra secuencia.
  14. 14. Partícula viral Maraba MG1 aislada para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el virus Maraba MG1 es para la administración aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2-4 días, aproximadamente 1 semana, o aproximadamente 2 semanas tras la administración del primer virus.
  15. 15. Kit para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un mamífero tal como se define en la reivindicación 1, comprendiendo el kit un primer virus y un virus Maraba MG1 tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
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