DE69033179T3

DE69033179T3 - Nachweis einer nukleinsäuresequenz oder einer änderung darin

Info

Publication number: DE69033179T3
Application number: DE69033179T
Authority: DE
Inventors: James Langham Moggill DALE; Peter East Ipswich TIMMS; Terence Patrick Acacia Ridge WALSH
Original assignee: Geneco Pty Ltd
Current assignee: Geneco Pty Ltd
Priority date: 1989-02-13
Filing date: 1990-02-13
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2010-02-14
Also published as: EP0457824A1; JP3021036B2; CA2044591A1; ES2136059T3; IE900501L; AU5106990A; SG50434A1; AU656514B2; DK0457824T3; EP0457824B1; WO1990009455A1; CA2044591C; JPH04503158A; DK0457824T4; IE66572B1; ES2136059T5; EP0457824A4; DE69033179T2; ATE181576T1; EP0457824B2

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung, ob sich ein spezielles Nucleotid oder eine spezielle Base an einer bestimmten Position in einer speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, ein Verfahren zur Bestimmung, ob sich dieselben oder verschiedene spezielle Nucleotide oder Basen an bestimmten Positionen in mindestens zwei verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen in einem Material mit einer Mehrzahl verschiedener Polynucleotid-Sequenzen befinden, und Screening-Verfahren zur Bestimmung, ob sich dieselben oder verschiedene spezielle Nucleotide oder Basen an bestimmten Positionen in mindestens zwei verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen in einem Material mit einer Mehrzahl verschiedener Polynucleotid-Sequenzen befinden.
Stand der Technik
Gegenwärtig ist die üblichste Technik zur Bestimmung oder zum Nachweis von Polynucleotid-Sequenzen die Hybridisierung unter Verwendung von Oligonucleotid- oder Polynucleotid-Sonden. Für diese Technik wird die Proben- oder Ziel-Nucleinsäure üblicherweise irreversibel an einen festen Träger wie Cellulose oder Nylon gebunden. Die markierte Probe wird dann in Lösung unter Hybridisierungs-Bedingungen zugegeben, und wenn es eine Sequenzhomologie zwischen der Sonde und der Ziel-Nucleinsäure gibt, bildet die Sonde ein Hybridmolekül mit dem Ziel-Polynucleotid. Dieses Hybrid kann auf vielfältigen Wegen, wie durch radioaktive Markierung oder Biotin-Markierung, nachgewiesen werden. Die Nachteile dieser Technik sind: erstens, daß sie beträchtliche Fachkunde beim Ausführenden erfordert, zweitens, daß die Technik langwierig und zeitraubend ist, und drittens, nicht leicht automatisiert werden kann. Oft dauert das gesamte Verfahren mehr als 48 Stunden.
Die Flüssig-Fest-Verfahren, die zum Nachweis spezieller Nucleinsäuren in Proben üblicherweise verwendet werden, sind beispielsweise Southern-Blot-, Northern-Blot- und Dot-Blot-Hybridisierungen. Diese Verfahren sind langsam, nicht effizient, technisch anspruchsvoll und können nicht leicht automatisiert werden. Die Southern-Blot- und Northern-Blot-Protokolle haben den weiteren Nachteil einer nicht effizienten Übertragung von Nucleinsäure vom Gel auf Papier. Andere Gruppen haben Flüssig-Fest-Hybridisierungen verwendet, bei denen eine Fänger-Sonde an einen festen Träger gebunden ist und die DNA-Sequenz von Interesse in der Probe an die Fänger-Sonde gebunden wird. Ein Beispiel dafür befindet sich in der Beschreibung des australischen Patents Nr. AU-70152/87, das die Verwendung von zwei Oligonucleotid-Sonden, die zu einander ausschließenden Regionen derselben Ziel-Nucleinsäure komplementär sind, in einem flüssigen Hybridisierungs-Format, um die Sonden an das Ziel, wenn es anwesend ist, zu assoziieren, und das Nachweisen der Anwesenheit des Ziels durch Immobilisierung des Zwei-Sonden-Ziel-Sandwichs durch eine der Sonden und den nachfolgenden Nachweis der anderen Sonde beschreibt. Dieses Verfahren erfordert jedoch eine zweite, eine Nachweis-Sonde, um an die DNA-Sequenz von Interesse zu hybridisieren. Dieser Schritt verringert die Spezifität des Tests und verstärkt danach den Hintergrund. Die vorliegende Erfindung überwindet dieses Problem durch Verwendung nur eines verlängerten Primers, der sowohl Fänger- als auch Nachweis-Elemente enthält.
Im Gegensatz zur Flüssig-Fest-Hybridisierung besitzt die Flüssig-Flüssig-Hybridisierung eine sehr schnelle Kinetik und eine verbesserte Empfindlichkeit wegen des besseren Zutritts der Sonde zur Ziel-Sequenz. Gene-Probe Inc beispielsweise verwendet ein Flüssig-Hybridisierungs-Hydroxylapatit-Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung von DNA-Sequenzen. Der Hauptnachteil dieses Systems ist, daß es auf adsorptiver Unterscheidung doppelsträngiger DNA-Sequenzen von einzelsträngigen DNA-Sequenzen statt auf sequenzspezifischer Trennung von Hybriden von überschüssiger Sonde beruht. Die vorliegende Erfindung überwindet diese Nachteile, indem sie die Nucleinsäure-Hybridisierungen in Lösung stattfinden läßt, gefolgt von der Entfernung der "Hybrid"-Moleküle auf eine feste Träger-Matrix. Ein weiterer potentieller Vorteil der Flüssig-Hybridisierung ist, daß ein generalisierter fester Träger für eine Vielzahl von Zielen funktionieren kann, wenn die Träger-Bindungssonden mit demselbem Einfang- oder Fänger-Molekül markiert sind.
Es gibt mehrere Fälle (australische Patentbeschreibungen Nr. AU-A-70152/87, Nr. AU-A-26755/88, Nr. AU-A-53105/86, Nr. AU-B-89575/82 und Nr. AU-A-80097/87), die eine Kombination von zwei Oligonucleotid-Sonden zum Nachweis spezieller Nucleinsäure-Sequenzen in einer Probe verwenden. Sie alle erfordern die Verwendung von zwei kurzen DNA-Sequenzen an dem Ziel. Diese Sequenzen müssen beide bei allen möglichen Zielen erhalten bleiben, müssen einander ausschließen und dürfen einander nicht überlappen und müssen ein ähnliches G+C-Verhältnis haben, um zu ermöglichen, daß beide Sonden unter denselben Bedingungen an ihre komplementäre Sequenz hybridisieren.
Es gibt dazu in Beziehung stehenden Stand der Technik, der die Verwendung einer Fänger-Sonde betrifft, um die Nucleinsäure-Sequenz von Interesse zu bestimmen und sie aus der Lösung zu entfernen, indem das Hybrid an eine feste Trägermatrix gebunden wird (australische Patentbeschreibungen Nr. AU-A-70152/87, Nr. AU-A-53105/86, Nr. AU-A-21781/88, Nr. AU-A-69724/87, Nr. AU-A-14005/88). Diese Techniken verwenden jedoch getrennte Fänger- und Nachweis-Sonden, was zu einer Anzahl von Nachteilen führt, wie sie vorstehend beschrieben sind. Die vorliegende Erfindung überwindet diese Probleme durch Verwendung eines einzigen verlängerten Primers, der sowohl Fänger- als auch Nachweis-Elemente eingebaut besitzt.
Es gibt viele Beispiele, nichtradioaktive Reportermoleküle an DNA zu binden, um den Nachweis spezieller Hybride zu ermöglichen. Wenn jedoch Biotin zum Nachweis in das DNA-Molekül eingebaut wird, ist der Mechanismus des Sichtbarmachens des eingebauten Biotins kompliziert und zeitraubend, obwohl mehrere Biotin-Moleküle pro Zielmo lekül (wodurch die Nachweisempfindlichkeit erhöht wird) eingebaut werden können.
Im Gegensatz dazu erlaubt der Einbau oder die Inkorporierung anderer nichtradioaktiver Reportermoleküle (wie fluoreszierender, lumineszierender, chemilumineszierender Moleküle) einen schnellen und einfachen Nachweis der Ziel-Sequenz. Der gegenwärtige Stand der Technik erlaubt jedoch nur, daß ein einziges Reportermolekül an jede Ziel-Sequenz gebunden wird. Diese Tatsache verringert die Gesamtempfindlichkeit des endgültigen Tests.
Daher gibt es einen Bedarf an einem einfachen Verfahren, das die schnelle Kinetik von Flüssig-Hybridisierung verwendet, das nur eine einzige Sonde zur Analyse benötigt und das zu stabilen Hybriden führt, wodurch es erlaubt, daß das unhybridisierte Material leicht von den zu bestimmenden Sequenzen entfernt werden kann. Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung ein Flüssig-Hybridisierungs-System, bei dem eine einzige Sonde an die Sequenz von Interesse hybridisiert und dann zur Erzeugung eines stabilen Hybrids kovalent verlängert wird. Dieses Hybrid wird dann auf einer Trägermatrix festgehalten und nachfolgend zur Entfernung von unhybridisiertem Material gewaschen. Das von der vorliegenden Erfindung beschriebene System ist einfach, schnell, empfindlich, kann visuell oder auf einem einfachen Plattenleser abgelesen werden und kann leicht automatisiert werden.
Auf diesem Gebiet der Nucleinsäure-Hybridisierung gibt es die Notwendigkeit, zwei breitgefächerte Arten von Krankheiten nachzuweisen: infektiöse und genetische. Was infektiöse Krankheiten betrifft, wurde eine Anzahl von Systemen auf DNA-Basis zum Nachweis von Krankheiten, die verursacht werden von Bakterien, wie Salmonella, Neisseria, parasitischen Organismen, wie Chlamydia und Rickettsiae, von Viren, wie Hepatitis B und von Protozoen, wie Plasmodium, beschrieben. All diese leiden jedoch unter einem oder mehreren der vorstehend angegebenen Nachteile.
Was genetische Krankheiten betrifft, die durch eine Mutation (Deletion, Insertion, Punktmutation oder Translokation) gekennzeichnet sind, ist die Technologie weniger gut entwickelt. Diese Arten von Krankheiten werden gegenwärtig entweder durch Verwendung von Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (RFLP)-Analyse oder durch präzise Hybridisierung kurzer Oligonucleotid-Sonden diagnostiziert. Der RFLP-Nachweis erfordert, daß durch die Mutation eine Restriftionsenzym-Stelle verändert ist, und das ist nicht immer der Fall. Außerdem erfordert die RFLP-Analyse die Verwendung der Southern-Blot-Hybridisierung zum Nachweis. Die Verwendung kurzer Oligonucleotid-Sonden zum Nachweis von Punktmutationen hat auch mehrere ernste Nachteile. Insbesondere müssen die Hybridisierungsbedingungen präzise sein, um sicherzustellen, daß bei der Hybridisierung nicht eine einzige Basenpaar-Fehlpaarung auftritt. In der Praxis bestimmen die Salzkonzentration und die Temperatur die Spezifität der Hybridisierungsbedingungen, und diese sind nicht leicht mit der erforderlichen Präzision zu kontrollieren. Die vorliegende Erfindung überwindet die Notwendigkeit der Southern-Hybridisierungs-Analyse und der präzisen Kontrolle der Hybridisierungsbedingungen. Sie erzielt dies durch den speziellen Primer, der an einen konstanten Abschnitt des Gens, der der Mutation benachbart ist, hybridisiert und dem Enzym, einer DNA-Polymerase, erlaubt, die DNA-Kette bis zu und einschließlich der Nucleotid- oder Basen-Mutation zu verlängern. Durch Manipulierung des bei der Polymerase-Reaktion zugegebenen Didesoxynucleotids können alle der möglichen Nucleotid-Veränderungen nachgewiesen werden.
Der Nachweis sowohl infektiöser als auch genetischer Krankheiten erfordert die Inkorporierung irgendeiner Art von markiertem Molekül in das System. Verschiedene radioaktive Isotope oder radioaktiv markierte Verbindungen können als Markierungen verwendet werden. Radioaktive Markierungen haben jedoch mehrere Nachteile, wozu gehört: (i) gefährlich, (ii) teuer, (iii) begrenzte Lagerbeständigkeit, (iv) erfordern teure Ausrüstung zur Messung des erzeugten Signals. In jüngerer Zeit wurde ein Bereich nichtradioaktiver Substanzen zum Nachweis von DNA-Molekülen verwendet. Beispiele für nichtradioaktive Markierungen sind fluoreszierende, lumineszierende, chemilumineszierende, enzymatische oder immunologische Verbindungen. Es können auch Markierungen, die auf der Affinität von Biotin und Avidin oder Streptavidin basieren, Lanthaniden-Chelate, Lektine und Proteine verwendet werden. Das bevorzugte Nachweismittel würde durch Spektroskopie oder Photochemie oder durch die Bildung eines nachweisbaren Komplexes zwischen dem Markierungsteil und dem Polypeptid, Lektin oder einem Antikörper sein, der an ein Gebilde gebunden ist, das in der Lage ist, eine nachweisbare Veränderung zu erzeugen, wozu Enzyme wie alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase gehören.
EP-A-0 297 379 beschreibt ein Verfahren zum Vervielfachen spezieller Ziel-Nucleinsäuren, das den Gebrauch immobilisierter Primer beinhaltet. WO 89/10414 beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung neuer genetischer Macker und gleichzeitige Bestimmung multipler genetischer Macker, das die Vervielfachung einer genomischen DNA-Probe, die eine Sequenzveränderung umspannt, den Nachweis der DNA-Sequenzveränderung in dem vervielfachten Fragment und den Nachweis des vervielfachten Fragments aufweist. Das US-Patent Nr. 4,851,331 beschreibt ein Sonden-Polynucleotid, das an eine Ziel-Nucleotidsequenz in der Nucleinsäure einer biologischen Probe bindet und dann mit einem Gemisch von Nucleosid-triphosphaten, das mindestens ein Nucleosid-triphosphat, das nachweisbar markiert wurde, enthält, enzymatisch in der 3'-Richtung verlängert wird. WO 90/06042 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis einer Ziel-RNA oder -DNA in einer Analyt-Probe, das ein Inberührungbringen des Analyten mit magnetischen Teilchen, die eine einzelsträngige 5'-gebundene DNA-Sonde, die in der Lage ist, an die RNA oder DNA zu binden, tragen, beinhaltet.
Was jedoch in der gegenwärtigen Technologie fehlt, ist ein einziges System, das umfaßt: (i) ein schnelles Mittel zum Nachweis eines Nucleotids in einer Polynucleotid-Sequenz, (ii) das genügend empfindlich ist, um geringe Anzahlen des Ziel-Nucleotids in der Probe nachzuweisen, und (iii) das nichtradioaktiv ist. Gegenwärtig werden alle diese Erfordernisse nicht von einem einzigen System erfüllt.
Als ein abschließender Aspekt erfordert die Notwendigkeit, spezielle Nucleotide in Sequenzen in einer Probe nachzuweisen, die Organisation aller Schritte entweder: (i) in ein einfaches Kit-Format oder (ii) in eine automatisierte Vorrichtung. Während sowohl Kits als auch automatisierte Maschinen zum Nachweis von Proteinen mittels Antikörpern verfügbar sind, sind noch keine Systeme verfügbar, die spezielle Nucleotide in Polynucleotid-Sequenzen in einer Probe einfach, schnell und preiswert nachweisen.
Aufgaben der Erfindung
Eine Aufgabe ist es, Verfahren zur Bestimmung, ob sich ein spezielles Nucleotid oder eine spezielle Base an einer bestimmten Position in einer speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe ist es, Verfahren zur Bestimmung, ob sich dieselben oder verschiedene spezielle Nucleotide oder Basen an bestimmten Positionen in mindestens zwei verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen in einem Material mit einer Mehrzahl verschiedener Polynucleotid-Sequenzen befinden, bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe ist es, Screening-Verfahren zur Bestimmung, ob sich dieselben oder verschiedene spezielle Nucleotide oder Basen an bestimmten Positionen in mindestens zwei verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen in einem Material mit einer Mehrzahl verschiedener Polynucleotid-Sequenzen befinden, bereitzustellen.
Offenbarung der Erfindung
Die folgenden Abkürzungen und Definitionen gelten in der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen:

SP – spezifischer Primer: eine Nucleotid-Sequenz, die zu einem Bereich oder Teil der Ziel-Sequenz komplementär ist
Ziel – die in der Probe nachzuweisende oder zu bestimmende Nucleotid-Sequenz; kann beispielsweise aus irgendeinem infektiösem oder parasitären Organismus einschließlich irgendeines Virus-, Pilz-, Bakterien-, Mycoplasma-, Nematoden-, Protozoen-Organismus stammen
Polymeraseenzym – irgendeine DNA-abhängige DNA-Polymerase oder RNA-abhängige DNA-Polymerase
dNTP – alle vier Desoxyribonucleotide, das heißt dATP, dCTP, dGTP und dTTP, sowie dITP und dUTP
ddNTP – alle vier Didesoxyribonucleotide, das heißt ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP, sowie ddITP
D – Nachweis-Molekül: ein Molekül, das kovalent an ein Nucleotid oder eine Nucleotid-Sequenz gebunden werden kann, und auf das nachfolgend entweder direkt oder indirekt getestet werden kann. Beispielsweise Biotin; Radioisotope von Kohlenstoff, Wasserstoff, Iod, Phosphor und Schwefel; irgendein Antigen; Haptene; flureszierende Moleküle einschließlich Fluorescein, Rhodamin und Eosin; Enzyme einschließlich alkalische Phosphate, Peroxidasen und Luciferase; irgendein monoklonaler Antikörper
dNTP-D – ein kovalent an eines der vier Desoxyribonucleotide gebundenes Nachweis-Molekül
C – Einfang- oder Halte-Molekül oder Fänger-Molekül: ein Molekül, das kovalent an ein Nucleotid oder eine Nucleotid-Sequenz gebunden werden kann und das nachfolgend an ein Molekül mit spezifischer Affinität binden wird. Beispielsweise Biotin (bindet an Avidin oder Streptavidin); Antikörper (bindet an Antigen); Antigen (bindet an Antikörper)
SAM – Molekül mit spezifischer Affinität: ein Molekül, das spezifisch an ein bestimmtes Fänger-Molekül binden wird. Beispielsweise Avidin oder Streptavidin; ein Antikörper, ein Antigen
SS – fester Träger: irgendeine feste Matrix, an die SAM gebunden ist. Beispielsweise Agarose; Polyacrylamid; magnetische Kügelchen; Polystyrol; Mikrotiterplatten; Nylon, Nitrocellulose
Waschen – Zugabe und Entfernung einer Lösung zum Zweck des Entfernens nicht reagierter Moleküle
Stringenz – Salz- und Temperatur-Bedingungen, die die Stabilität der Wasserstoffbindungen zwischen zwei Nucleinsäure-Molekülen beeinflussen. Beispielsweise sind die Wasserstoffbindungen am instabilsten bei hoher Stringenz, die entweder eine hohe Temperatur oder wenig Salz oder beides widerspiegelt.
Test – irgendein Verfahren, das für den Nachweis des Nachweis-Moleküls spezifisch ist und entweder qualitativ oder quantitativ gemessen werden kann
X – irgendeines der vier Desoxyribonucleotide
Y – irgendeines der vier Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide; in dem Beispiel wird Y Wasserstoffbindungen mit X ausbilden, d. h. eine Nucleotid-Sequenz von neun Y's wird zu einer Nucleotid-Sequenz von neun X's komplementär sein
Z – irgendeines der vier Nucleotide, das eine zu der Sequenz nicht komplementäre Sequenz ausbildet
ddT – Didesoxythymidin-5'-triphospat: ddT wurde als Beispiel verwendet, da es mit A in der Ziel-Sequenz eine Basenpaarung bildet. Wenn die nachzuweisende Base C wäre, würde ddG verwendet werden, G mit ddC und T mit ddA.
ddT-C – Didesoxythymidin-5'-triphosphat/Fängermolekül-Komplex: ddT wurde als Beispiel verwendet, da es mit A in der Ziel-Sequenz eine Basenpaarung bildet. Wenn die nachzuweisende Base C wäre, würde ddG verwendet werden, G mit ddC und T mit ddA. Das Fänger-Molekül ist kovalent an ddT gebunden und stellt irgendeines der vorstehend beschriebenen Fängermoleküle dar.
direkt angrenzend – bedeutet, daß zwischen einem an einen Teil einer speziellen Polynucleotid-Sequenz gebundenen Primer und einem speziellen nachzuweisenden Nucleotid oder einer speziellen nachzuweisenden Base keine Nucleotide oder Basen sind
Fraktion – bedeutet mindestens einen Teil eines Gemisches, das sich aus der Reaktion eines Oligonucleotid-Primers oder von Oligonucleotid-Primern, Extensionsreagenzien, (einer) speziellen Polynucleotid-Sequenz(en), (einem) nachweisbaren Elementen) und/oder Trenn-Elementen ergibt.
intervenierende Sequenz – bedeutet mindestens ein Nucleotid oder eine Base zwischen einem an einen Teil einer speziellen Polynucleotid-Sequenz gebundenen Primer und einem speziellen Nucleotid oder einer speziellen Base, das oder die zu bestimmen ist
Oligonucleotid-Primer – ein einzelsträngiges Nucleinsäure-Molekül mit einer typischen Länge von 5 bis 60 Nucleotiden, das aber 200 oder mehr Nucleotide haben kann, das eine zu einem Teil der nachzuweisenden oder zu bestimmenden Polynucleotid-Sequenz komplementäre Sequenz hat
spezifische oder spezielle Polynucleotid-Sequenz – eine teilweise oder vollständig bekannte Sequenz von Nucleotiden
Hybridisierung – die physische Assoziierung oder Verknüpfung des Oligonucleotid-Primers mit dem komplementären Bereich der Ziel-Polynucleotid-Sequenz unter Ausbildung eines doppelsträngigen Hybrid-Nucleinsäure-Moleküls

Ein störendes nachweisbares Element und/oder Trenn-Element ist beispielsweise eines, das dasselbe ist wie dasjenige, das an der Position inkorporiert ist, die zu dem nachzuweisenden speziellen Nucleotid oder der nachzuweisenden speziellen Base komplementär ist, z. B.:

(A) Man betrachte ein einzelnes Nucleotid oder eine einzelne Base N₁, das oder die in einer speziellen Polynucleotid-Sequenz S₁ nachzuweisen ist. Man nehme an, es gibt einen gebundenen Oligonucleotid-Primer P₁ mit einer zu einem Teil von S₁ komplementären Sequenz, und der an S₁ gebunden ist. Man nehme an, daß es zwischen P₁ und N₁ intervenierende Nucleotide N_A, N_B und N_C gibt. Verlängere P₁ bis zu und einschließlich von N, mit zu N_A, N_B, N_C und N₁ komplementären Nucleotiden, nämlich N_D, N_E, N_F beziehungsweise N₂ – S₁ (S₁ entspricht einem Trenn-Element); dann sind die folgenden Bedingungen erforderlich: N_A, N_B oder N_C können nicht N₁ sein.
(B) Man betrachte zwei Nucleotide oder Basen N₁ und N₂, die in zwei verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen S₁ und S₂ nachzuweisen sind. Man nehme an, daß es zwei verschiedene Oligonucleotid-Primer P₁ und P₂ (an S₁ bzw. S₂ gebunden) gibt, die eine zu einem Teil von S₁ und S₂ komplementäre Sequenz haben. Man nehme an, daß es intervenierende Nucleotide N_A, N_B und N_C zwischen P₁ und N₁, und intervenierende Nucleotide N_X, N_Y und N_Z zwischen P₂ und N₂ gibt. Man verlängere (a) P₁ bis zu und einschließlich N₁ mit zu N_A, N_B, N_C und N₁ komplementären Nucleotiden, nämlich N_D, N_E, N_F beziehungsweise N₁ – D₁ (D₁ entspricht einem nachweisbaren Element); und (b) P₂ bis zu und einschließlich N₂ mit zu N_X, N_Y, N_Z und N₂ komplementären Nucleotiden, nämlich N_O, N_P, N_Q und N₄ – D₂ (D₂ entspricht einem anderen nachweisbaren Element); dann sind die folgenden Bedingungen erforderlich:

Wenn N₁ = N₂ und D₁ = D₂
Wenn N₁ ungleich N₂ ist, D₁ = D₂
Wenn N₁ nicht gleich N₂ ist, D₁ nicht gleich D₂ ist,
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren bereitgestellt zur Bestimmung, ob sich ein spezielles Nucleotid oder eine spezielle Base an einer bestimmten Position in einer speziellen Polynucleotid-Sequenz in einem Material befindet, aufweisend:

a) Aussetzen des Materials, unter hybridisierenden Bedingungen, einem Oligonucleotid-Primer mit einer zu einem Teil der speziellen Polynucleotid-Sequenz komplementären Sequenz, wobei der Primer an seinem 5'-Ende ein Trennelement oder ein nachweisbares Element beinhaltet, und wobei der Primer an einen Teil der speziellen Polynucleotid-Sequenz in dem Material (i) direkt angrenzend an die bestimmte Position bindet oder (ii) nicht direkt angrenzend an die bestimmte Position bindet, wodurch es eine intervenierende Sequenz zwischen der bestimmten Position und an die spezielle Polynucleotid-Sequenz gebundenem Primer gibt;
b) Verlängern von an die spezielle Polynucleotid-Sequenz gebundenem Primer mit der Maßgabe, daß der gebundene Primer nur bis zu und einschließlich des speziellen Nucleotids oder der speziellen Base verlängert wird, wenn sich das spezielle Nucleotid oder die spezielle Base an der bestimmten Position in der speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, wobei der verlängerte Primer ein nachweisbares Element und/oder ein Trenn-Element an einer zu dem speziellen Nucleotid- oder der speziellen Base komplementären Position besitzt, mit der Maßgabe, daß der verlängerte Primer mindestens ein Trenn-Element und mindestens ein nachweisbares Element besitzt und, wenn es eine intervenierende Sequenz zwischen der bestimmten Position und an die spezielle Polynucleotid-Sequenz gebundenem Primer gibt, mit der weiteren Maßgabe, daß die intervenierende Sequenz keine sein kann, bei der Basen oder Nucleotide, die zu der intervenierenden Sequenz komplementär sind und die in den verlängerten Primer inkorporiert werden, ein Inkorporieren eines störenden nachweisbaren und/oder Trenn-Elements verursachen;
c) Abtrennen von irgendwelchem verlängerten Primer in eine Fraktion, wobei die Fraktion kein nicht in dem verlängerten Primer enthaltenes nachweisbares Element besitzt, mit der Maßgabe, daß das Abtrennen nicht den Schritt des Verdaus der speziellen Polynucleotid-Sequenz mit dem daran gebundenen verlängerten Primer beinhaltet; und
d) Bestimmen, ob der verlängerte Primer in der Fraktion anwesend ist, durch Untersuchen der Fraktion auf den verlängerten Primer, wobei die Anwesenheit des verlängerten Primers anzeigt, daß sich das spezielle Nucleotid oder die spezielle Base an der bestimmten Position in der speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, und das Fehlen des verlängerten Primers anzeigt, daß sich das spezielle Nucleotid oder die spezielle Base nicht an der bestimmten Position in der speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet;

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Bestimmung, ob sich an bestimmten Positionen in mindestens zwei verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen in einem Material mit einer Mehrzahl verschiedener Polynucleotid-Sequenzen dieselben oder verschiedene spezielle Nucleotide oder Basen befinden, aufweisend:

a) Aussetzen, unter hybridisierenden Bedingungen, des Materials mindestens zwei verschiedenen Oligonucleotid-Primern, wobei jeder der verschiedenen Oligonucleotid-Primer eine zu einem Teil einer der verschiedenen Polynucleotid-Sequenzen komplementäre Sequenz hat, wobei: jeder der Primer an seine komplementäre Polynucleotid-Sequenz bindet, wenn sie in dem Material vorhanden ist, wobei jeder der Oligonucleotid-Primer an einen Teil einer von derjenigen des (der) anderen Primer(s) verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenz bindet, jeder der Primer an seine komplementäre spezielle Polynucleotid-Sequenz in dem Material (i) direkt angrenzend an die bestimmte Position bindet oder (ii) nicht direkt angrenzend an die bestimmte Position bindet, wodurch es eine intervenierende Sequenz zwischen der bestimmten Position und an die spezielle Polynucleotid-Sequenz, wenn sie in dem Material vorhanden ist, gebundenem Primer gibt, und jeder der Primer ein Trenn-Element oder ein nachweisbares Element an seinem 5'-Ende beinhaltet;
b) Verlängern der verschiedenen, an ihre komplementären Polynucleotid-Sequenzen gebundenen Oligonucleotid-Primer mit der Maßgabe, daß jeder der gebundenen Primer nur bis zu und einschließlich der bestimmten Position verlängert wird, wenn sich das spezielle Nucleotid oder die spezielle Base an der bestimmten Position in der speziellen Nucleotid-Sequenz befindet, wobei jeder der verlängerten Primer ein nachweisbares Element und/oder ein Trennelement an einer zu dem speziellen Nucleotid oder der speziellen Base komplementären Position besitzt, mit der weiteren Maßgabe, daß jeder der verlängerten Primer mindestens ein Trenn-Element und mindestens ein nachweisbares Element besitzt und, wenn es intervenierende Sequenzen zwischen den bestimmten Positionen und an die speziellen Polynucleotid-Sequenzen gebundenen Primern gibt, mit der weiteren Maßgabe, daß die intervenierenden Sequenzen keine sein können, bei denen Basen oder Nucleotide, die zu den intervenierenden Sequenzen komplementär sind und die in den (die) verlängerten Primer inkorporiert werden, ein Inkorporieren eines störenden nachweisbaren und/oder Trenn-Elements oder von störenden nachweisbaren und/oder Trenn-Elementen verursachen;
c) Abtrennen von irgendwelchem (irgendwelchen) verlängerten Primer(n), der (die) nur bis zu einem speziellen Nucleotid oder einer speziellen Base in einer bestimmten Position verlängert wurde(n), in mindestens eine Fraktion, wobei die Fraktion kein nicht in dem verlängerten Primer enthaltenes nachweisbares Element besitzt, mit der Maßgabe, daß das Abtrennen nicht den Schritt des Verdaus der speziellen Polynucleotid-Sequenz mit dem daran gebundenen Primer enthält; und
d) Bestimmen, ob irgendwelche der verlängerten Primer in der (den) Fraktionen) anwesend sind, durch Untersuchen der Fraktionen) auf den (die) verlängerten Primer, wobei die Anwesenheit eines verlängerten Primers anzeigt, daß sich ein spezielles Nucleotid oder eine spezielle Base an einer bestimmten Position in einer speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, und das Fehlen des (der) verlängerten Primer(s) in der (den) Fraktionen) anzeigt, daß sich mindestens ein spezielles Nucleotid oder eine spezielle Base nicht an einer bestimmten Position in mindestens einer der verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen befindet;

Die Erfindung stellt auch ein dem vorstehenden Verfahren ähnliches Screening-Verfahren bereit zur Bestimmung, ob sich dieselben oder verschiedene spezielle Nucleotide oder Basen an bestimmten Positionen in mindestens zwei verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen in einem Material mit einer Mehrzahl verschiedener Polynucleotid-Sequenzen befinden.
Im wesentlichen verwendet das Verfahren:

einen Nucleinsäure-Primer, der für einen Teil einer teilweise oder vollständig bekannten Nucleotid-Sequenz, die an das zu bestimmende Nucleotid oder die zu bestimmende Base direkt angrenzt, spezifisch ist oder für einen Teil einer teilweise oder vollständig bekannten Nucleotid-Sequenz, die an das zu bestimmende Nucleotid oder die zu bestimmende Base nicht direkt angrenzend ist, sondern eine intervenierende Sequenz zwischen dem gebundenen Primer und dem zu bestimmenden Nucleotid oder der zu bestimmenden Base hat, spezifisch ist;
Extension des Primers, katalysiert durch ein Nucleinsäure-Polymerase-Enzym;
entweder (i) die Bindung eines Einfang-Moleküls am 5'-Ende des spezifischen Primers, Zugabe der Ziel-Sequenz unter Hybridisierungs-Bedingungen und Einbau eines Nachweis-Moleküls oder von Nachweis-Molekülen in den enzymkatalysierten verlängerten Primer oder (ii) Bindung eines Nachweis-Moleküls an das 5'-Ende des spezifischen Primers, Zugabe der Ziel-Sequenz unter Hybridisierungs-Bedingungen und Einbau eines Einfang-Moleküls oder von Einfang-Molekülen in den enzymkatalysierten verlängerten Primer;
Einfangen oder Festhalten des verlängerten Primers unter Verwendung eines an einem festen Träger befestigten Moleküls mit spezifischer Affinität; und
Test auf das Nachweis-Molekül.

Vorteilhafterweise umfaßt das Verlängern des Primers die Verwendung vier verschiedener Nucleotide, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP, dITP, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP und ddTTP, wobei mindestens eines der Nucleotide ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP und ddTTP, wobei die Nucleotide ein nachweisbares Element und/oder ein Trenn-Element beinhalten.
Das Verlängern kann die Verwendung eines Nucleotids, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus ddITP, ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP, aufweisen, wobei das Nucleotid ein nachweisbares Element und/oder ein Trenn-Element beinhaltet.
Zusätzlich zu dem Nucleotid oder den Nucleotiden werden beim Verlängern des Primers auch typischerweise mindestens ein geeignetes Polymerase-Enzym und ein geeignetes Puffer-Mittel verwendet.
Beispiele für Polymerase-Enzyme sind E.coli DNA-Polymerase, E.coli DNA-Polymerase (Klenow-Fragment), Bakteriophage T7- und DNA-Polymerase, Bakteriophage T4 DNA-Polymerase, Taq DNA-Polymerase und AMV-reverse Transkriptase.
Puffer-Mittel, die wässrige Lösungen zwischen pH 6 bis 8,5 puffern, sind im allgemeinen geeignet zur Verwendung mit einem Polymerase-Enzym zur Verlängerung des Primers. Im allgemeinen wird ein Magnesiumsalz (z. B. MgCl₂ oder MgSO₄ dem Puffer-Mittel beigegeben. Eine Gesamtsalzkonzentration zwischen 50 und 300 mM ist im allgemeinen annehmbar.
Die Temperatur der Extensions-Reaktion wird je nach verwendetem Polymerase-Enzym gewählt und liegt typischerweise in dem Bereich von 25 bis 80° C, besonders typisch 30 bis 70° C.
Es ist bevorzugt, daß mindestens eines der Nucleotide das nachweisbare Element aufweist.
Alternativ oder zusätzlich ist das nachweisbare Element an den Oligonucleotid-Primer gebunden.
Typischerweise ist das nachweisbare Element ein radioaktives Markierungselement, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus ³H, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴C, ³⁵S und ³²P.
Das nachweisbare Element kann nicht radioaktiv sein und wird im allgemeinen ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus einer enzymatischen Gruppe, einer immunologischen Gruppe und einer spektroskopisch nachweisbaren Gruppe. Die spektroskopisch nachweisbare Gruppe kann eine lumineszierende Gruppe, eine chemilumineszierende Gruppe, eine durch NMR nachweisbare Gruppe, eine fluoreszierende Gruppe oder eine durch IR nachweisbare Gruppe sein.
Im allgemeinen ist die spezielle Polynucleotid-Sequenz eine DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz.
Die spezielle Polynucleotid-Sequenz kann aus einem infektiösen oder Krankheit verursachenden Organismus stammen, der ein lebender oder nicht lebensfähiger viraler, bakterieller, Pilz- oder Protozoen-Organismus sein kann.
Die Extension kann umfassen:

Zugabe einer Mehrzahl von Nucleotid-Arten zu dem an die Polynucleotid-Sequenz gebundenen Primer, um den Primer zu verlängern; oder
Zugabe einer einzigen Nucleotid-Art zu dem an die Polynucleotid-Sequenz gebundenen Primer, um den Primer zu verlängern; oder
Zugabe mindestens einer einzigen Nucleotid-Art zu dem an die Polynucleotid-Sequenz gebundenen Primer, um den Primer zu verlängern.

In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist das Trenn-Element mit dem Oligonucleotid-Primer verbunden. Alternativ beinhaltet der verlängerte Primer ein Trenn-Element, das die Abtrennung des verlängerten Primers aus dem Gemisch erleichtert und bei dem mindestens eines der Nucleotide das Trenn-Element besitzt.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt der Trennschritt:
Inberührungbringen von irgendwelchem verlängerten Primer mit einem Molekül, das Affinität zu dem Trenn-Element besitzt, wobei das Molekül mit einem Träger verbunden ist, was die Abtrennung erleichtert; und Abtrennung des (der) in Berührung gebrachten verlängerten Primer(s), um die Fraktion zu liefern.

Vorteilhafterweise werden das Trenn-Element und das Molekül aus der direkt nachstehend aufgelisteten Gruppe ausgewählt:

Trenn-Element	Molekül mit Affinität für das Trenn-Element
a) ein Ligand, für den es einen Rezeptor gibt	einen Rezeptor für den Liganden;
b) ein Rezeptor	der Ligand für den Rezeptor
c) ein Antigen	ein Antikörper für das Antigen
d) ein Antikörper für ein Antigen	das Antigen;
e) ein anti-idiotyper Antikörper	ein Antikörper für den anti-idiotypen Antikörper;
f) ein Antikörper für einen antiidiotypen Antikörper	ein anti-idiotyper Antikörper für den Antikörper;
g) eine Hapten-Gruppe	ein Antikörper für die Hapten-Gruppe;
h) ein Antikörper für eine HaptenGruppe	die Hapten-Gruppe;

i) ein Enzym	ein Bindungs-Hemmer für das Enzym; und
j) ein Bindungs-Hemmer für ein Enzym	das Enzym.

Typischerweise werden das Trenn-Element und das Molekül aus der nachstehend aufgelisteten Gruppe ausgewählt:

Trenn-Element	Molekül mit Affinität für das Trenn-Element
a) ein Ligand, für den es einen spezifischen Rezeptor gibt	ein spezifischer Rezeptor für den Liganden;
b) ein spezifischer Rezeptor	der Ligand für den spezifischen Rezeptor;
c) ein Antigen	ein spezifischer Antikörper für das Antigen;
d) ein spezifischer Antikörper für ein Antigen	das Antigen;
e) ein anti-idiotyper Antikörper	ein spezifischer Antikörper für den anti-idiotypen Antikörper;
f) ein Antikörper für einen antiidiotypen Antikörper	ein für den Antikörper spezifischer anti-idiotyper Antikörper;

g) eine Hapten-Gruppe	ein spezifischer Antikörper für die Hapten-Gruppe;
h) ein spezifischer Antikörper für eine Hapten-Gruppe	die Hapten-Gruppe;
i) ein Enzym	ein fest bindender Inhibitor für das Enzym; und
j) ein fest bindender Inhibitor für ein Enzym	das Enzym.

Typische Beispiele für Liganden, für die Rezeptoren verfügbar sind, sind:
ein Vitamin wie Biotin, ein Zucker-Molekül wie Glukose oder Mannose, ein Hormon wie Adrenalin oder Cortison und ein Steroid wie Progesteron oder Testosteron. Es gibt zahlreiche Arten von Liganden, die verfügbare Rezeptoren haben, und die vorstehende Liste ist nur zur Erläuterung angegeben.
Die Trennung beinhaltet typischerweise einen festen Träger, der typischerweise ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Latex, Magnetkügelchen, Nitrocellulose, Agarose, Cellulose, Polyacrylamid, Nylon, Glas und Polystyrol.
Vorteile
1. Allgemeine Vorteile
Ein besonderer Vorteil des Verfahrens der Erfindung ist, daß das System Trenn- und Nachweis-Elemente auf dem einen Oligonucleotid nach Primer-Extension vereinigt. Die meisten anderen Systeme erfordern die Verwendung einer Einfang-Sonde und einer Nachweis-Sonde.
Ein weiterer Vorteil ist, daß das System zum Einbau eines Trenn- oder Nachweis-Elements oder von Trenn-oder Nachweis-Elementen (abhängig von der Konfiguration) von der Enzym-getriebenen Extension des Primers abhängt, und daher wird das Element oder werden die Elemente kovalent an den speziellen Primer gebunden. Wegen dieser kovalenten Anbindung können die Wasch-Schritte bei sehr hoher Stringenz durchgeführt werden, was zu verringertem Hintergrund und erhöhter Spezifizität führt.
Ein weiterer Vorteil ist, daß das Verfahren der Erfindung leicht automatisiert werden kann.
Bei dem Verfahren der Erfindung können die Schritte in ein einfaches Kit-Format inkorporiert werden.
Ein weiterer Vorteil ist, daß ein Oligonucleotid-Primer verwendet werden kann, der eine zu einem beibehaltenen oder variablen Bereich des Genoms des Organismus von Interesse komplementäre Sequenz hat, und daher für hohe oder geringe Spezifizität (d. h. gattungsspezifisch, artspezifisch oder stammspezifisch) ausgelegt werden kann. Die Erfindung schafft ein schnelles und empfindliches Verfahren zum Nachweis spezieller Nucleotid-Änderungen in speziellen Polynucleotid-Sequenzen unter Verwendung einer einzigen Oligonucleotid-Sonde.
Allgemein wird bei dem Verfahren der Erfindung das nachweisbare Hybrid von einer festen Matrix festgehalten, um das Wegwaschen von nicht eingebautem nachweisbarem Element zu erlauben. Dies ist zwar kein schwieriger Schritt, aber er trägt zur für das Verfahren erforderlichen Zeit bei. Der Schritt kann umgangen werden durch Wahl eines nachweisbaren Elements, wodurch irgendwelches nicht eingebautes nachweisbares Element einfach inaktiviert und in dem Reaktionsgemisch gelassen werden kann, statt daß es phyisch entfernt werden muß.
Im allgemeinen ist eine Nachweis-Empfindlichkeit in der Größenordnung von 10³ bis 10⁴ Genom-Kopien recht passend zum Nachweis eines breiten Bereichs von Virus-, Bakterien- und parasitären Organismen, die in ihren jeweiligen Krankheitsstadien üblicherweise in mäßigen bis hohen Anzahlen vorhanden sind. Für Defekt-Krankheiten, bei denen das infektiöse Mittel nur in sehr geringen Anzahlen anwesend ist (z. B. HIV), kann das Verfahren der Erfindung von der Technik der Polymerase-Kettenreaktion (PCA) Gebrauch machen, die effektiv ein Vervielfachungsschritt ist, der zu einer Erhöhung der Empfindlichkeit führt.
2. Vorteile bei der Diagnose infektiöser Krankheiten
Das Verfahren der Erfindung erlaubt die schnelle, einfache und ungefährliche Bestimmung spezieller Nucleotide in speziellen Polynucleotid-Sequenzen in Proben von biologischem Material, insbesondere infektiösen Krankheitserregern. Die Sequenz kann ein Teil eines infektiösen Organismus sein, wie einem Virus-, Bakterien-, Protozoen- oder Pilz-Organismus, oder Teil eines Gens sein, bei dem eine Abnormalität zu einer genetischen Störung führt: beispielsweise Sichelzellen-Anämie, zystische Fibrose,α-Thalassämie oder β-Thalassämie.
Nicht lebensfähige Organismen können unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung nachgewiesen werden.
Ein weiterer Vorteil ist, daß das Verfahren ein Gemisch von Oligonucleotid-Primern zur Bestimmung einer Reihe von Erregern, die verdächtigt werden, einen breitgefächerten Bereich von Krankheitszuständen zu verursachen (z. B. Pneumonia, Mykoplasma, Chlamydia, Streptokokkus, Legionella, RSV), verwenden kann.
3. Vorteile bei der Diagnose genetischer Krankheiten
Das Verfahren kann verwendet werden zum schnellen Nachweis einer veränderten Nucleotid-Base (Punktmutation) und zum Nachweis der Insertion oder Deletion eines Nucleotids oder mehrerer Nucleotide in einer Polynucleotid-Sequenz. In diesem Fall muß die genetische Veränderung auf der DNA-Sequenz-Stufe bekannt sein und charakterisiert werden.
Der Nachweis einer einzigen Basenveränderung oder mehrerer Basenveränderungen kann automatisiert werden.
Das Verfahren kann zum Screening oder Absuchen auf einzelne (oder mehrere) Nucleotid-Veränderungen im großen Maßstab angepaßt werden. Dies ist insbesondere wichtig beim Absuchen auf genetische Krankheiten wie zystische Fibrose, kann aber auch geeignet sein für die Unterscheidung von Allelen, die nicht notwendigerweise bei der Gen-Expression beteiligt sind, wie sie zur DNA-Profilierung verwendet werden.
Dieses besondere Verfahren beinhaltet keine Fest-Flüssig-Hybridisierung, keine präzisen Flüssig-Hybridisierungs-Bedingungen, und ist nicht technisch anspruchsvoll. Andere Systeme, wie Southern-Blot-Hybridisierung, erfordern, daß die Ziel-Polynucleotid-Sequenz an einen festen Träger gebunden wird (technisch anspruchsvoll) und/oder erfordern die Verwendung von Oligonucleotid-Sonden, die präzise Hybridisierungs-Bedingungen verlangen. Diese Systeme können nicht automatisiert werden und können nicht leicht für Screening in großem Maßstab angepaßt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichungen
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
1 eine schematische Zeichnung eines Verfahrens zur Bestimmung einer speziellen Polynucleotid-Sequenz ist;
2a eine schematische Zeichnung eines Verfahrens zur Bestimmung einer speziellen Polynucleotid-Sequenz unter Verwendung eines Trenn-Elements, das sich mit dem Oligonucleotid-Primer-Teil eines verlängerten Primers verbindet, ist;
2b eine schematische Zeichnung eines Verfahrens zur Bestimmung einer speziellen Polynucleotid-Sequenz unter Verwendung eines Trenn-Elements, das sich mit dem verlängerten Teil eines verlängerten Primers verbindet, ist;
3a eine schematische Zeichnung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung einer Nucleotid- oder Basen-Veränderung unter Verwendung eines Trenn-Elements, das sich mit dem Oligonucleotid-Primer-Teil eines verlängerten Primers verbindet, ist;
3b eine schematische Zeichnung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung einer Nucleotid- oder Basen-Veränderung unter Verwendung eines Trenn-Elements, das sich mit dem verlängertem Teil eines verlängerten Primers verbindet, ist;
3c eine schematische Zeichnung eines Verfahrens zur Bestimmung einer Nucleotid- oder Basen-Veränderung unter Verwendung eines nachweisbaren Elements, das mit dem verlängerten Teil eines verlängerten Primers verbunden ist, ist;
4 ein Autoradiogramm zeigt, das zur Feststellung der Größe des in dem dritten Beispiel hergestellten verlängerten Oligonucleotids verwendet wurde; und
5 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Durchführung irgendeines der erfindungsgemäßen Verfahren ist.
Beste Art und andere Arten zur Durchführung der Erfindung
Es gibt zwei besonders bevorzugte Anwendungen der erfindungsgemäßen Verfahren, das heißt (i) der Nachweis oder die Bestimmung einer Nucleotid- oder Basen-Änderung (Hauptanwendungen: genetische Krankheiten und DNA-Fingerprinting) und (ii) Nachweis oder Bestimmung mehrfacher Nucleotid- oder Basen-Änderungen in verschiedenen Polynucleotid-Sequenzen (Hauptanwendungen: genetische Mehrfach-Erkrankungen und DNA-Fingerprinting). Eine einzige Vorrichtung (mit geringen Veränderungen) ist zur Verwendung bei beiden Anwendungen geeignet.
1. Bestimmung einer Nucleotid- oder Basen-Veränderung
Dieses Verfahren beinhaltet die folgenden Schritte:

– die Synthese eines spezifischen Primers, der zu einem Teil einer bekannten oder teilweise bekannten Nucleinsäure-Sequenz, dem Ziel, komplementär ist. Die spezifische Primer-Sequenz ist komplementär zu der Ziel-Sequenz, die entweder an das zu bestimmende einzelne Nucleotid oder die zu bestimmende einzelne Base direkt angrenzt, es oder sie aber nicht einschließt, oder an das zu bestimmende einzelne Nucleotid oder die zu bestimmende einzelne Base nicht direkt angrenzt, son dern zwischen dem gebundenen Primer und dem zu bestimmenden Nucleotid oder der zu bestimmenden Base eine intervenierende Sequenz besitzt.
– die Anbringung eines Halte- (Konfiguration A 3a) oder Nachweis- (Konfiguration B 3b) Moleküls an dem 5'-Ende des spezifischen Primers.
– die Zugabe zu der Lösung nur eines Typs Didesoxyribonucleotid (oder Desoxyribonucleotid), das heißt desjenigen, der mit der zu bestimmenden Base oder dem zu bestimmenden Nucleotid in der Ziel-Sequenz ein Paar bilden oder eine Wasserstoffbindung ausbilden kann, und entweder einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase (wenn das Ziel DNA ist) oder einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (wenn das Ziel RNA ist) unter Bedingungen, die für die enzymatische Extension des spezifischen Primers geeignet sind. Das Didesoxyribonucleotid (oder Desoxyribonucleotid) hat ein kovalent an es gebundenes Nachweis-Molekül (Konfiguration A) oder Einfang- oder Halte-Molekül (Konfiguration B).
– Das Polymerase-Enzym verlängert den Primer unter Verwendung der Ziel-Nucleinsäure als eine Matrize, wobei nur ein Molekül des Didesoxyribonucleotids (oder Desoxyribonucleotids) angefügt wird, wenn Basenpaarung möglich ist. Der spezifische Primer wird nicht verlängert, wenn eine Basenpaarung zwischen dem Didesoxyribonucleotid (oder Desoxyribonucleotid) und der Ziel-Sequenz nicht möglich ist.
– Die Reaktion kann hitzedenaturiert werden, und der Zyklus kann wiederholt werden, um die Menge an verlängertem spezifischen Primer zu vervielfachen.
– Für Konfiguration A wird das Molekül mit spezifischer Affinität (an einen festen Träger gebunden) unter Bedingungen, die der Bindung des Halte-Moleküls an das Molekül mit spezifischer Affinität förderlich sind, zu der Lösung zugegeben.
– Für Konfiguration B wird der verlängerte spezifische Primer mit Ethanol gefällt, zur Entfernung von nicht inkorporiertem Didesoxyribonucleotid-Haltemolekül-Komplex (oder Desoxyribonucleotid-Haltemolekül-Komplex) gewaschen. Nach dem Waschen wird der verlängerte spezifische Primer in einer Lösung, die der Bindung des Haltemoleküls an das Molekül mit spezifischer Affinität förderlich ist, erneut suspendiert. Dann wird das Molekül mit spezifischer Affinität (an einen festen Träger gebunden) zugegeben.
– Für Konfigurationen A und B wird, sobald der verlängerte spezifische Primer über das Haltemolekül an den Komplex aus Molekül mit spezifischer Affinität und festem Träger gebunden ist, das Gemisch extensiv unter Bedingungen hoher Stringenz gewaschen.
– Für Konfiguration A und B wird am Schluß des Wasch-Schritts das Gemisch unter Verwendung eines Verfahrens, das zum Nachweis des Nachweis-Moleküls geeignet ist, untersucht.

2. Bestimmung multipler Nucleotid- oder Basen-Änderungen in verschiedenen Polynucleotid-Sequenzen, d. h. multipler genetischer Defekte oder Krankheiten oder genetisches Fingerprinting
Dieses Verfahren beinhaltet die folgenden Schritte:

– die Synthese mehrerer verschiedener spezifischer Primer, von denen jeder zu einer verschiedenen bekannten Nucleinsäure-Sequenz, den Zielen, komplementär ist. Die verschiedenen spezifischen Primer-Sequenzen sind komplementär zu ihren jeweiligen verschiedenen Ziel-Sequenzen, die an die nachzuweisende einzelne Base direkt angrenzen.
– die Anbringung verschiedener Halte-Moleküle an dem 5'-Ende der verschiedenen spezifischen Primer.
– die Hybridisierung, in Lösung, dieser verschiedenen spezifischen Primer an ihre jeweiligen verschiedenen Ziel-Nucleinsäure-Sequenzen.
– die Zugabe der Lösung aller vier Typen von Didesoxyribonucleotiden (z. B. ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) und entweder einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase (wenn alle Ziele DNA sind) oder einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (wenn alle Ziele RNA sind) oder von beiden (wenn die Ziele ein Gemisch aus sowohl DNA als auch RNA sind) unter Bedingungen, die für die enzymatische Extension der verschiedenen spezifischen Primer geeignet sind. Jedes Didesoxyribonucleotid hat ein kovalent an es gebundenes verschiedenes Nachweis-Molekül.
– Das Polymerase-Enzym verlängert die verschiedenen spezifischen Primer unter Verwendung der verschiedenen Ziel-Nucleinsäure-Sequenzen als Matrizen, wobei nur ein Molekül eines der Didesoxyribonucleotide angefügt wird.
– Die Reaktion kann hitzedenaturiert werden, und der Zyklus kann wiederholt werden, um die Mengen an verlängerten verschiedenen spezifischen Primern zu vervielfachen.
– Die Moleküle mit spezifischer Affinität (mit spezifischer Affinität für die jeweils verschiedenen Halte-Moleküle, und die an festen Trägem wie "Teststreifen" befestigt sind) werden zu der Lösung unter Bedingungen, die der Bindung der verschiedenen Halte-Moleküle an die verschiedenen Moleküle mit spezifischer Affinität förderlich sind, zugegeben.
– Wenn die verschiedenen verlängerten spezifischen Primer über die verschiedenen Halte-Moleküle an ihren Komplexen aus Molekül mit spezifischer Affinität und festem Träger angebracht sind, wird jeder verschiedene Komplex individuell mit dem geeigneten Teststreifen entfernt, der danach unter Bedingungen hoher Stringenz gründlich gewaschen wird.
– Am Ende des Wasch-Schritts wird einer der Teststreifen auf die Anwesenheit eines Nachweis-Moleküls getestet, wobei ein für das bestimmte Nachweis-Molekül geeignetes Verfahren verwendet wird. Wenn der Test anzeigt, daß das Nachweis-Molekül auf dem Teststreifen anwesend ist, dann ist dies ein Anzeichen dafür, daß die spezifische Nucleotid-Sequenz, die das Ziel des Primers mit dem bestimmten nachweisbaren Molekül ist, in der Testprobe vorliegt. Wenn der Test anzeigt, daß auf dem Teststreifen kein Nachweis-Molekül anwesend ist, dann ist dies ein Anzeichen dafür, daß die spezifische Nucleotid-Sequenz, die das Ziel des Primers mit jenem bestimmten nachweisbaren Molekül ist, in der Testprobe nicht anwesend ist.
– Das Verfahren des letzten Schrittes wird für jeden der Teststreifen wiederholt.

3. Vorrichtung zur Durchführung von erfindungsgemäßen Verfahren
Es wird auf 5 Bezug genommen. Die Vorrichtung 100 ist zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nach nichtautomatischer oder automatischer Vorgehensweise allgemein geeignet. Die Vorgänge des Verlängerns und Trennens finden in dem entfernbaren Reaktor 10 statt, der in dem Haltegefäß 11 angeordnet ist. Das Gefäß 11 wird durch die thermisch geregelte Ummantelung 12 temperaturgeregelt. Der Inhalt des Reaktors 10 wird durch Schütteln des Gefäßes 11 unter Verwendung einer Schüttelvorrichtung 13 gemischt. Das Unterteil des Reaktors 10 besitzt eine Membran 14 mit spezieller Porosität, die durch die Membran-Haltevorrichtung 15 gestützt wird. Der Reaktor 10 wird in dem Gefäß 11 durch die Halterung für den entfernbaren Reaktor 21 gehalten.
Probenmaterial, Primer und Extensions-Reagenzien werden aus ihren jeweiligen Gefäßen 16, 17 und 18 an den Reaktor 10 abgegeben. Man läßt für eine geeignete Dauer unter schonendem Mischen und unter festgelegten Temperaturbedingungen Primer-Annealing und -Extension stattfinden. Diese Reaktion erzeugt einen verlängerten Primer mit einem nachweisbaren Element und einem Trenn-Element, vorausgesetzt, die Probe hat eine spezifische Polynucleotid-Sequenz, für die der Primer eine Sequenz hat, die zu einem Teil der spezifischen Polynucleotid-Sequenz komplementär ist.
Nachfolgend wird (werden) an einem inerten Träger angebrachtes) Moleküle) mit spezifischer Affinität (SAM(S)) für das Trenn-Element aus dem SAM-Vorratsgefäß 19 in den Reaktor 10 gegeben, und für eine geeignete Dauer mit verlängertem Primer reagieren lassen. Nicht reagierte Reagenzien, Puffer und nicht verlängerter) Primer werden dann über eine Vakuumleitung 25 mit zugeordneter Vakuumpumpe 24, die am Unterteil des Haltegefäßes 11 angebracht ist, zu dem Abfallbehälter 25 entfernt, während verlängerter) Primer mit gebundenem (gebundenen) SAMS) durch die Membran 14 in dem Reaktor 10 zurückgehalten wird (werden). Die zurückgehaltenen Primer-SAM-Komplexe werden mit aus dem Gefäß 22 zugeführtem Waschreagenreagens gewaschen, um Hintergrund zu entfernen und dadurch die erste Fraktion in dem Reaktor 10 zu erzeugen. Die erste Fraktion wird dann mit dem Detektor 23 auf die Anwesenheit von nachweisbarem Element untersucht. Typischer weise ist das nachweisbare Element ein radioaktives Element, wie ³²Pund der Detektor 23 ist ein Szintillationszähler.
Wenn der Test anzeigt, daß das Nachweis-Molekül anwesend ist, dann ist dies ein Anzeichen dafür, daß die spezifische Nucleotid-Sequenz in der Testprobe anwesend ist. Wenn der Test anzeigt, daß kein Nachweis-Molekül anwesend ist, dann ist dies ein Anzeichen dafür, daß die spezifische Nucleotid-Sequenz in der Testprobe nicht anwesend ist.
Beispiel 1
In diesem Beispiel zum Nachweis einer spezifischen Polynucleotid-Sequenz wurde das in 1 dargestellte Verfahren zur Bestimmung der eingsträngigen genomischen DNA des Bakteriophagen M13 verwendet.
1. Synthese des künstlichen Primers
Eine zu einzelsträngiger (ss)M13-DNA komplementäre 17-Mer-DNA wurde auf einer DNA-Synthesevorrichtung von Applied Biosystems synthetisiert.
Das 17-Mer hatte die Nucleotid-Sequenz:
Dieser Primer ist nicht nur zu einzelsträngiger M13-DNA komplementär, sondern auch zu dem bakteriellen doppelsträngigen DNA-Plasmid, pUC 12.
2. Anbringung des Primers auf Cellulose
Zur Anbringung des Primers auf ABM-Cellulose wurde das Verfahren von Ashley und MacDonald (1984) verwendet.
Die Amino-benzyloxymethyl (ABM)-Gruppen auf ABM-Cellulose wurden unter Bildung von Diazobenzyloxymethyl-Cellulose (DBM-Cellulose) diazotiert. Der spezifische Primer wurde an die DBM-Cellulose gebunden. Es wurden etwa 40 μg des spezifischen Primers an 20 mg Cellulose gebunden.
3. Hybridisierung von spezifischer Primer-Cellulose (SP-Zellulose) mit Ziel-Nucleinsäure
SP-Cellulose wurde in einer Lösung, die die Ziel-Nucleinsäure, entweder M 13 ssDNA oder pUC 12, und Wasser enthielt, erneut suspendiert. Dies wurde gemischt, fünf Minuten lang gekocht und auf Eis abgeschreckt. Das Gemisch wurde dann zur Entfernung von Nucleinsäuren, die nicht mit der SP-Cellulose hybridisiert hatten, durch Zentrifugieren unter Verwendung eines Waschpuffers, der 140mM Natriumchlorid, 15mM Natriumcitrat und 20mM Natriumphosphat, pH 7,0, enthielt, gewaschen.
4. Primer-Extension
Der spezifische Primer wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) zusammen mit markierten und nicht markierten Nucleotiden verlängert.
Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 20 : 1 Reaktionsgemisch

50mM Tris-HCL, pH 8,3

8mM Magnesiumchlorid

4mM Dithiothreitol

4mM Natrium-pyrophosphat

1mM jeweils dATP, dGTP und dTTP

1Ci ³²P dCTP

7 Einheiten DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment.
Es wurde gefunden, daß die Zugabe von Polyethylenglykol 6000 bis zu einer Endkonzentration von 4 % die Inkorporierung von Radioaktivität bis zum Dreifachen erhöhte.
Das Reaktionsgemisch wurde zwei Stunden lang bei 20°C inkubiert.
Am Ende der Inkubation wurde nicht inkorporierte Nucleotide durch viermaliges Waschen durch Zentrifugierung der SP-Cellulose entfernt. Der Waschpuffer war 140mM Natriumchlorid, 15mM Natriumcitrat und 20mM Natriumphosphat, pH 7,0. Die Probe wurde eine Minute lang bei Raumtemperatur gewirbelt, dann fünf Minuten lang bei 12.000g zentrifugiert. Dies wurde viermal wiederholt.
Schließlich wurde die SP-Cellulose in eine Szintillations-Lösung enthaltende Ampulle gegeben, und die Inkorporierung wurde unter Verwendung eines Flüssig-Szintillationszählers bestimmt.
Beispiel 2
In diesem Beispiel zur Bestimmung einer spezifischen Polynucleotid-Sequenz wurde einzelsträngige genomische DNA von dem Bakteriophagen M13 mp18 bestimmt unter Verwendung des folgenden Oligonucleotid-Primers:
Die in diesem Beispiel verwendete Konfiguration ist in 2b gezeigt; das Nachweis-Molekül in diesem Beispiel ist ³²P, und es ist an das 5'-Ende des spezifischen Primers gebunden; das Halte-Molekül ist Biotin, und es ist in den verlängerten Primer als Biotin-16-dUTP (ein Analoges von dTTP) inkorporiert; das Molekül mit spezifischer Affinität ist Streptavidin, und der feste Träger ist Agarose.
Der spezifische Primer wurde unter Verwendung einer Oligonucleotid-Synthesevorrichtung synthetisiert und unter Verwendung von Polynucleotid-Kinase am 5'-Ende mit ³²P wie folgt markiert:

Reaktionsgemisch:

Spezifischer Primer (50 pMole 5' OH-Enden)	1μl
100 mM Dithiothreitol	5μl
10× TM Puffer (600 mM Tris, pH 7,6, 90mM MgCl₂	5μl
γ-³²P-dATP (3000 Ci/mMol)	15μl
T₄ Polynucleotide-Kinase (8,6 Einheiten/ml)	2μl
ddH₂O	22μl

Das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Der markierte Primer wurde unter Verwendung einer DEAE-Cellulose-Säule von nicht inkorporiertem ³²P getrennt.
Die Primer-Extensions-Reaktion wurde unter Verwendung des folgenden Reaktionsgemisches entweder mit M13 mp18 oder Lambda-Bakteriophagem (als nicht-homologe Kontrolle) durchgeführt:
Das Reaktionsgemisch wurde 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde der verlängerte Primer mit Ethanol gefällt, um nicht inkorporiertes Biotin-16-dUTP zu entfernen. Zu dem Reaktionsgemisch wurde ein Volumen (50μl) 5M Ammoniumacetat und 250μl Ethanol zugegeben, gefolgt von kurzem Mischen und einstündiger Inkubation bei –20°C. Die Fällung wurde durch Zentrifugieren gesammelt, kurz getrocknet, in 50μl ddH₂O erneut suspendiert und auf eine 200μl Streptavidin/Agarose-Säule (die 0,12mg Streptavidin enthielt), die vorher mit Bindungspuffer (10 mM Tris HCl, pH7,5; 200 mM NaCl; 1 mM EDTA) ins Gleichgewicht gebracht worden war, aufgebracht. Die Säule wurde fünfmal mit jeweils 500μl Bindungspuffer gewaschen. Die Streptavidin/Agarose wurde in 1 ml Bindungspuffer, zu dem 6 ml Szintillationsflüssigkeit zugegeben worden waren, suspendiert, und das Gemisch wurde in einem Flüssig-Szintillationszähler gezählt.
Die Ergebnisse für das M13- und das Lambda-System waren wie folgt:

Matrize cpm

M13 29.055

lambda 1.043
Die Ergebnisse zeigen, daß der Primer nur in Gegenwart der homologen Matrize M13 spezifisch verlängert wurde, aber in Gegenwart der nicht homologen Matrize Lambda nicht verlängert wurde. Außerdem wurde Biotin in den verlängerten Primer inkorporiert.
Beispiel 3
In diesem Beispiel zur Bestimmung einer veränderten Nucleotid-Base wurde die in 3c gezeigte Konfiguration verwendet. Die bestimmte M13-Sequenz und die verwendete Oligonucleotid-Primer-Sequenz waren wie folgt:
Der spezifische Primer wurde unter Verwendung einer Oligonucleotid-Synthesevorrichtung synthetisiert.
Das Reaktionsgemisch wurde wie folgt zusammengestellt:

500 ng M13mp18 ssDNA 2,5μl

0,8 pMole spezifischer Primer 2,0μl

10× Reaktionspuffer 1,5μl

ddH₂0 1,0μl
Dieses Reaktionsgemisch wurde bei 55°C zehn Minuten lang inkubiert, zu welcher Zeit das Folgende zugegeben wurde:

³⁵P dATP (3000 Ci/mMol, 10 mCi/ml) 0,5μl

³⁵P ddATP (3000 Ci/mMol, 10 mCi/ml) 1,5μl

DNA-Polymerase (Klenow) (1 Einheit/μl) 1,0μl
Dieses Reaktionsgemisch wurde weitere 15 Minuten lang bei 25°C inkubiert.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4μl Formamid-Farbstoff (95 % Formamid, 0,1 % Xylol-Cyanol, 0,1 % Bromphenolblau) beendet. Das Reaktionsgemisch wurde drei Minuten lang bei 100°C erhitzt, bevor es auf ein 20 %-iges Polyacrylamid-Gel geladen und 30 Minuten lang bei 30 Milliampere elektrophoretisiert wurde. Das Gel wurde dann in 10 %-iger Essigsäure fixiert, mit ddH₂O gewaschen und zwölf Stunden lang bei –80°C einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Das sich ergebende Autoradiogramm (4) zeigte nur eine Bande mit einer Länge von 18 Nucleotiden. Daher wurde der Primer durch die Inkorporierung eines markierten Adenin-Rests nur um ein Nucleotid verlängert, und so wurde ein spezielles einziges Nucleotid in einer Nucleinsäure-Sequenz bestimmt.
Beispiel 4
In diesem Beispiel zur Bestimmung einer spezifischen Polynucleotid-Sequenz wurde das Verfahren der 2a zur Bestimmung der einzelsträngigen genomischen DNA des Bakteriophagen M13 verwendet.
1. Synthese des künstlichen Primers
Eine zu MIS ssDNA komplementäre 25-Mer DNA wurde von Clontex (USA) synthetisiert.
Das 25-Mer hatte die Nucleotid-Sequenz
in der X kovalent an ein modifiziertes Nucleotid gebundenes Biotin ist.
2. Hybridisierung und Primer-Extension
Der Primer wurde mit Puffer gemischt, der entweder M 13 DNA (Ziel) oder Heringssperma-DNA (Kontrolle) enthielt, und unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) verlängert.
Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt:

50 mM Tris pH 7,5
10 mM MgCl₂
4 mM DTT
100 mM NaCl
50 μg/ml Rinderserumalbumin
jeweils 0,02 mM dATP, dGTP, dTTP
1 Ci ³²P dCTP
742,5 ng/50μl M13- oder Heringssperma-DNA
25,8 ng/50μl Biotin-Primer
0,5 Einheiten DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment.

Die Reaktionsgemische wurden 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert und durch Fällung und Waschen beendet.
Die Fällung wurde durchgeführt durch Zugabe von 5M Ammoniumacetat, Kälberthymus-DNA als Träger und Ethanol. Durch Zentrifugieren gesammelte Pellets wurden mit 70 % Ethanol gewaschen, bis die Waschflüssigkeiten weniger als 500 cpm enthielten.
Die gewaschenen Pellets wurden dann in Bindungspuffer, der aus 200 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA bestand, gelöst und auf eine Streptavidin-Agarose-Säule aufgebracht. Die Säulen wurden mit mehreren Volumina Puffer gewaschen, und Streptavidin-Agarose (SA)-gebundene Zählimpulse wurden mit den folgenden Ergebnissen gemessen:

Ziel SA-gebundene cpm (Zählimpulse pro Minute)

M13 11.939

Heringssperma 83
Die Ergebnisse zeigen, daß nur in Anwesenheit von Ziel-M13-DNA verlängerte Primer dazu führen, daß signifikante Radioaktivität an die Säule gebunden wird.
Industrielle Anwendbarkeit
Das erfindungsgemäße Verfahren kann leicht bei den folgenden Anwendungen verwendet werden:

a) die einfache, schnelle, empfindliche und automatisierbare Bestimmung infektiöser Krankheiten bei Menschen, Tieren und Pflanzen;
b) die spezifische, schnelle Bestimmung und die Bestimmung in großem Maßstab von Basen-Änderungen in Nucleinsäure-Sequenzen, insbesondere bei der Bestimmung von Gen-Defekten und bei DNA-Fingerprinting;
c) Kits für den Gebrauch bei den vorstehenden Anwendungen; und
d) automatisierte Geräte zur Verwendung bei den vorstehenden Anwendungen.

Claims

Verfahren zur Bestimmung, ob sich ein spezielles Nucleotid oder eine spezielle Base an einer bestimmten Position in einer speziellen Polynucleotid-Sequenz in einem Material befindet, aufweisend: a) Aussetzen des Materials, unter hybridisierenden Bedingungen, einem Oligonucleotid-Primer mit einer zu einem Teil der speziellen Polynucleotid-Sequenz komplementären Sequenz, wobei der Primer an seinem 5'-Ende ein Trennelement oder ein nachweisbares Element beinhaltet, und wobei der Primer an einen Teil der speziellen Polynucleotid-Sequenz in dem Material (i) direkt angrenzend an die bestimmte Position bindet oder (ii) nicht direkt angrenzend an die bestimmte Position bindet, wodurch es eine intervenierende Sequenz zwischen der bestimmten Position und an die spezielle Polynucleotid-Sequenz gebundenem Primer gibt; b) Verlängern von an die spezielle Polynucleotid-Sequenz gebundenem Primer mit der Maßgabe, daß der gebundene Primer nur bis zu und einschließlich des speziellen Nucleotids oder der speziellen Base verlängert wird, wenn sich das spezielle Nucleotid oder die spezielle Base an der bestimmten Position in der speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, wobei der verlängerte Primer ein nachweisbares Element und/oder ein Trenn-Element an einer zu dem speziellen Nucleotid- oder der speziellen Base komplementären Position besitzt, mit der Maßgabe, daß der verlängerte Primer mindestens ein Trenn-Element und mindestens ein nachweisbares Element besitzt und, wenn es eine intervenierende Sequenz zwischen der bestimmten Position und an die spezielle Polynucleotid-Sequenz gebundenem Primer gibt, mit der weiteren Maßgabe, daß die intervenierende Sequenz keine sein kann, bei der Basen oder Nucleotide, die zu der intervenierenden Sequenz komplementär sind und die in den verlängerten Primer inkorporiert werden, ein Inkorporieren eines störenden nachweisbaren und/oder Trenn-Elements verursachen; c) Abtrennen von irgendwelchem verlängerten Primer in eine Fraktion, wobei die Fraktion kein nicht in dem verlängerten Primer enthaltenes nachweisbares Element besitzt, mit der Maßgabe, daß das Abtrennen nicht den Schritt des Verdaus der speziellen Polynucleotid-Sequenz mit dem daran gebundenen verlängerten Primer beinhaltet; und d) Bestimmen, ob der verlängerte Primer in der Fraktion anwesend ist, durch Untersuchen der Fraktion auf den verlängerten Primer, wobei die Anwesenheit des verlängerten Primers anzeigt, daß sich das spezielle Nucleotid oder die spezielle Base an der bestimmten Position in der speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, und das Fehlen des verlängerten Primers anzeigt, daß sich das spezielle Nucleotid oder die spezielle Base nicht an der bestimmten Position in der speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet; bei dem das Verlängern die Verwendung von mindestens einem Didesoxynucleotid umfaßt, wobei das Didesoxynucleotid zu dem speziellen Nucleotid oder der speziellen Base komplementär ist.
Verfahren zur Bestimmung, ob sich an bestimmten Positionen in mindestens zwei verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen in einem Material mit einer Mehrzahl verschiedener Polynucleotid-Sequenzen dieselben oder verschiedene spezielle Nucleotide oder Basen befinden; aufweisend: a) Aussetzen, unter hybridisierenden Bedingungen, des Materials mindestens zwei verschiedenen Oligonucleotid-Primern, wobei jeder der verschiedenen Oligonucleotid-Primer eine zu einem Teil einer der verschiedenen Polynucleotid-Sequenzen komplementäre Sequenz hat, wobei: jeder der Primer an seine komplementäre Polynucleotid-Sequenz bindet, wenn sie in dem Material vorhanden ist, wobei jeder der Oligonucleotid-Primer an einen Teil einer von derjenigen des (der) anderen Primer (s) verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenz bindet, jeder der Primer an seine komplementäre spezielle Polynucleotid-Sequenz in dem Material (i) direkt angrenzend an die bestimmte Position bindet oder (ii) nicht direkt angrenzend an die bestimmte Position bindet, wodurch es eine intervenierende Sequenz zwischen der bestimmten Position und an die spezielle Polynucleotid-Sequenz, wenn sie in dem Material vorhanden ist, gebundenem Primer gibt, und jeder der Primer ein Trenn-Element oder ein nachweisbares Element an seinem 5'-Ende beinhaltet; b) Verlängern der verschiedenen, an ihre komplementären Polynucleotid-Sequenzen gebundenen Oligonucleotid-Primer mit der Maßgabe, daß jeder der gebundenen Primer nur bis zu und einschließlich der bestimmten Position verlängert wird, wenn sich das spezielle Nucleotid oder die spezielle Base an der bestimmten Position in der speziellen Nucleotid-Sequenz befindet, wobei jeder der velängerten Primer ein nachweisbares Element und/oder ein Trennelement an einer zu dem speziellen Nucleotid oder der speziellen Base komplementären Position besitzt, mit der weiteren Maßgabe, daß jeder der verlängerten Primer mindestens ein Trenn-Element und mindestens ein nachweisbares Element besitzt und, wenn es intervenierende Sequenzen zwischen den bestimmten Positionen und an die speziellen Polynucleotid-Sequenzen gebundenen Primern gibt, mit der weiteren Maßgabe, daß die intervenierenden Sequenzen keine sein können, bei denen Basen oder Nucleotide, die zu den intervenierenden Sequenzen komplementär sind und die in den (die) verlängerten Primer inkorporiert werden, ein Inkorporieren eines störenden nachweisbaren und/oder Trenn-Elements oder von störenden nachweisbaren und/oder Trenn-Elementen verursachen; c) Abtrennen von irgendwelchem (irgendwelchen) verlängerten Primer (n), der (die) nur bis zu einem speziellen Nucleotid oder einer speziellen Base in einer bestimmten Position verlängert wurde (n), in mindestens eine Fraktion, wobei die Fraktion kein nicht in dem verlängerten Primer enthaltenes nachweisbares Element besitzt, mit der Maßgabe, daß das Abtrennen nicht den Schritt des Verdaus der speziellen Polynucleotid-Sequenz mit dem daran gebundenen Primer enthält; und d) Bestimmen, ob irgendwelche der verlängerten Primer in der (den) Fraktionen) anwesend sind, durch Untersuchen der Fraktionen) auf den (die) verlängerten Primer, wobei die Anwesenheit eines verlängerten Primers anzeigt, daß sich ein spezielles Nucleotid oder eine spezielle Base an einer bestimmten Position in einer speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, und das Fehlen des (der) verlängerten Primer(s) in der (den) Fraktionen) anzeigt, daß sich mindestens ein spezielles Nucleotid oder eine spezielle Base nicht an einer bestimmten Position in mindestens einer der verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen befindet; wobei das Verlängern die Verwendung von mindestens einem Didesoxynucleotid umfaßt, wobei das Didesoxynucleotid zu dem speziellen Nucleotid oder der speziellen Base komplementär ist.
Screening-Verfahren zur Bestimmung, ob sich dieselben oder verschiedene spezielle Nucleotide oder Basen an bestimmten Positionen in mindestens zwei verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen in einem Material mit einer Mehrzahl verschiedener Polynucleotid-Sequenzen befinden, aufweisend: a) Aussetzen des Materials, unter hybridisierenden Bedingungen, mindestens zwei verschiedenen Oligonucleotid-Primern, wobei jeder der verschiedenen Oligonucleotid-Primer eine zu einem Teil einer der verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen komplementäre Sequenz hat, wobei: jeder der Primer an seine komplementäre Polynucleotid-Sequenz bindet, wenn sie in dem Material vorhanden ist, wobei jeder der Oligonucleotid-Primer an einen Teil einer speziellen Polynucleotid-Sequenz, die von der des (der) anderen Primer(s) verschieden ist, bindet, jeder der Primer an seine komplementäre spezielle Polynucleotid-Sequenz in dem Material (i) direkt angrenzend an die bestimmte Position bindet oder (ii) nicht direkt angrenzend an die bestimmte Position bindet, wodurch es eine intervenierende Sequenz zwischen der bestimmten Position und an die spezielle Polynucleotid-Sequenz, wenn sie in dem Material vorhanden ist, gebundenem Primer gibt, und jeder der Primer ein Trenn-Element oder ein nachweisbares Element an seinem 5'-Ende beinhaltet; b) Verlängern der verschiedenen, an ihre komplementären Polynucleotid-Sequenzen gebundenen Oligonucleotid-Primer mit der Maßgabe, daß jeder der gebundenen Primer nur bis zu und einschließlich der bestimmten Position verlängert wird, wenn sich das spezielle Nucleotid oder die spezielle Base an der bestimmten Position in der speziellen Nucleotid-Sequenz befindet, wobei jeder der verlängerten Primer ein nachweisbares Element und/oder ein Trenn-Element an einer zu dem speziellen Nucleotid oder der speziellen Base komplementären Position besitzt, mit der weiteren Maßgabe, daß jeder der verlängerten Primer mindestens ein Trenn- Element und mindestens ein nachweisbares Element besitzt und, wenn es intervenierende Sequenzen zwischen den bestimmten Positionen und an die speziellen Polynucleotid-Sequenzen gebundenen Primer gibt, mit der weiteren Maßgabe, daß die intervenierenden Sequenzen keine sein können, bei denen Basen oder Nucleotide, die zu den intervenierenden Sequenzen komplementär sind und die in den (die) verängerten Primer inkorporiert werden, ein Inkorporieren eines störenden nachweisbaren und/oder Trenn-Elements oder störender nachweisbarer und/oder Trenn-Elemente verursachen; c) Abtrennen von irgendwelchem (irgendwelchen) verlängerten Primer(n), der (die) nur bis zu einem speziellen Nucleotid oder bis zu einer speziellen Base an einer bestimmten Position verlängert wurde(n), in eine Fraktion, wobei die Fraktion kein nicht in dem verlängerten Primer enthaltenes nachweisbares Element besitzt, mit der Maßgabe, daß das Abtrennen nicht den Schritt des Verdaus der speziellen Polynucleotid-Sequenzen mit den daran gebundenen verlängerten Primern beinhaltet; und d) Bestimmen, ob mindestens einer der verlängerten Primer in der Fraktion vorhanden ist, durch Untersuchen der Fraktion auf alle der verlängerten Primer, wobei die Anwesenheit eines verlängerten Primers anzeigt, daß sich mindestens ein spezielles Nucleotid oder eine spezielle Base an einer bestimmten Position in einer speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, und das Fehlen aller der verängerten Primer in der Fraktion anzeigt, daß sich mindestens ein spezielles Nucleotid oder mindestens eine spezielle Base nicht in einer bestimmten Position in irgendeiner der verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen befindet; bei dem das Verlängern die Verwendung von mindestens einem Didesoxynucleotid umfaßt, wobei das Didesoxynucleotid zu dem speziellen Nucleotid oder der speziellen Base komplementär ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Primer an einen direkt an die bestimmte Position angrenzenden Teil der speziellen Polynucleotid-Sequenz in dem Material bindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Primer an einen nicht direkt an die bestimmte Position angrenzenden Teil der speziellen Polynucleotid-Sequenz in dem Material bindet, wodurch es eine intervenierende Sequenz zwischen der bestimmten Position und an die spezielle Polynucleotid-Sequenz gebundenem Primer gibt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei dem jeder der Primer ein verschiedenes Trenn-Element beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem das Verlängern die Verwendung von vier verschiedenen Nucleotiden umfaßt, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP, dITP, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP und ddTTP, wobei mindestens eines der Nucleotide ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP und ddTTP, wobei die Nucleotide ein nachweisbares Element und/oder ein Trenn-Element beinhalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem das Verlängern die Verwendung eines Nucleotids umfaßt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus ddITP, ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP, wobei das Nucleotid ein nachweisbares Element und/oder ein Trenn-Element beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, bei dem mindestens eines der Nucleotide ein nachweisbares Element enthält.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, bei dem mindestens eines der Nucleotide ein Trenn-Element enthält.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, bei dem mindestens eines der Nucleotide Trenn- und nachweisbare Elemente enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem der Trenn-Schritt aufweist: in Berührung bringen von irgendwelchem verlängerten Primer mit einem Molekül, das Affinität zu dem Trenn-Element besitzt; und Abtrennen des (der) in Berührung gebrachten verlängerten Primer(s), um die Fraktion zu liefern, in der das Trenn-Element und das Molekül ausgewählt sind aus der wie folgt aufgelisteten Gruppe: Trenn-Element Molekül mit Affinität für das Trenn-Element a) ein Ligand, für den es einen Rezeptor gibt einen Rezeptor für den Liganden; b) ein Rezeptor der Ligand für den Rezeptor c) ein Antigen ein Antikörper für das Antigen d) ein Antikörper für ein Antigen das Antigen; e) ein anti-idiotyper Antikörper ein Antikörper für den antiidiotypen Antikörper;

f) ein Antikörper für einen antiidiotypen Antikörper ein anti-idiotyper Antikörper für den Antikörper; g) eine Hapten-Gruppe ein Antikörper für die Hapten-Gruppe; h) ein Antikörper für eine HaptenGruppe die Hapten-Gruppe; i) ein Enzym ein Bindungs-Hemmer für das Enzym; und j) ein Bindungs-Hemmer für ein Enzym das Enzym.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Trenn-Schritt aufweist: in Berührung bringen von irgendwelchem verlängerten Primer mit einem Molekül, das Affinität zu dem Trenn-Element besitzt, wobei das Molekül an einen Träger, der die Trennung erleichtert, gebunden ist; und Abtrennen des in Berührung gebrachten verlängerten Primers, um die Fraktion zu tiefem.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei dem der Trenn-Schritt aufweist: in Berührung bringen von irgendweichen verlängerten Primern mit Molekülen, die Affinität für die Trenn-Elemente besitzten, wobei die Moleküle an Träger, die das Trennen erleichtern, gebunden sind; und Abtrennen der in Berührung gebrachten verlängerten Primer, um die Fraktion zu tiefem.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, bei dem das (die) Trenn-Elemente) und das (die) Moleküle) ausgewählt ist (sind) aus der wie folgt aufgelisteten Gruppe: Trenn-Element Molekül mit Affinität für das Trenn-Element a) ein Ligand, für den es einen spezifischen Rezeptor gibt ein spezifischer Rezeptor für den Liganden; b) ein spezifischer Rezeptor der Ligand für den spezifischen Rezeptor; c) ein Antigen ein spezifischer Antikörper für das Antigen; d) ein spezifischer Antikörper für ein Antigen das Antigen; e) ein anti-idiotyper Antikörper ein spezifischer Antikörper für den anti-idiotypen Antikörper; f) ein Antikörper für einen antiidiotypen Antikörper ein für den Antikörper spezifischer anti-idiotyper Antikörper, g) eine Hapten-Gruppe ein spezifischer Antikörper für die Hapten-Gruppe; h) ein spezifischer Antikörper für eine Hapten-Gruppe die Hapten-Gruppe;

i) ein Enzym ein festsitzender Bindungs-Inhibitor für das Enzym; und j) ein festsitzender Eindungs-Inhibitor für ein Enzym das Enzym.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem der Träger ein Prüfstreifen ist.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, bei dem die Träger Prüfstreifen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem die spezielle(n) Polynucleotid-Sequenz(en) (eine) DNA-Sequenzen) ist (sind).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem die spezielle(n) Polynucleotid-Sequenzen} (eine) RNA-Sequenz(en) ist (sind).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem die spezielle(n) Polynucleotid-Sequenz(en) von einem infektiösen oder Krankheit verursachenden Organismus stammt (stammen).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem der Oligonucleotid-Primer ein nachweisbares Element an seinem 5'-Ende beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem das Trennen ein Abscheiden von irgendwelchem (irgendwelchen) verlängerten Primer(n) und ein erneutes Suspendieren des (der) verlängerten Primer(s) in einer Lösung, die der Bindung des Trenn-Elements (der Trenn-Elemente) an (ein) Moleküle) mit Affinität für das (die) Trenn-Element(e) förderlich ist, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Schritt d) aufweist: d) Bestimmen, ab die spezielle Polynucleotid-Sequenz mit dem daran gebundenen verlängerten Primer in der Fraktion vorhanden ist, durch Untersuchen der Fraktion auf den verlängerten Primer, wobei die Anwesenheit des verlängerten Primers anzeigt, daß sich das spezielle Nucleotid oder die spezielle Base an der bestimmten Position in der speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, und das Fehlen des verlängerten Primers anzeigt, daß sich das spezielle Nucleotid oder die spezielle Base nicht an der bestimmten Position in der speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem Schritt d) aufweist: d) Bestimmen, ob irgendwelche der speziellen Polynucleotid-Sequenzen mit den daran gebundenen verlängerten Primern in der Fraktion (den Fraktionen) vorhanden sind, durch Untersuchen der Fraktionen) auf den (die) verlängerten Primer, wobei die Anwesenheit eines verlängerten Primers anzeigt, daß sich ein spezielles Nucleotid oder eine spezielle Base an einer bestimmten Position in einer speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, und das Fehlen des (der) verlängerten Primers) in einer Fraktionen) anzeigt, daß sich mindestens ein spezielles Nucleotid oder mindestens eine spezielle Base nicht an einer bestimmten Position in mindestens einer verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem Schritt d) aufweist: d) Bestimmen, ob sich mindestens eine spezielle Polynucleotid-Sequenz, an die einer der verlängerien Primer gebunden ist, in der Fraktion befindet, durch Untersuchen der Fraktion auf alle der verlängerten Primer, wobei die Anwesenheit eines verlängerten Primers anzeigt, daß sich mindestens ein spezielles Nucleotid oder mindestens eine spezielle Base an einer bestimmten Position in einer speziellen Polynucleotid-Sequenz befindet, und das Fehlen aller der verlängerien Primer in der Fraktion anzeigt, daß sich mindestens ein spezielles Nucleotid oder mindestens eine spezielle Base nicht an einer bestimmten Position in irgendeiner der verschiedenen speziellen Polynucleotid-Sequenzen befindet.