JP6890421B2 - Ｐｄ‐１及びｌａｇ‐３との免疫反応性を有する共有結合ダイアボディ並びにその使用方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照

本出願は、米国特許出願第６２／１０７，４６７号（２０１４年６月２６日出願；係属）に対する優先権を主張するものであり、上述の特許出願は、参照によりその全体が本出願に援用される。

配列表の参照
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１３０１＿０１１５ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１５年６月２日作成、サイズ：５０，０１５バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。

本発明は、２つ以上のポリペプチド鎖を備え、ＰＤ‐１のエピトープに対して免疫特異的である少なくとも１つのエピトープ結合部位及びＬＡＧ‐３のエピトープに対して免疫特異的である少なくとも１つのエピトープ結合部位を有する、二重特異性ダイアボディ（即ち「ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ」）を対象とする。より好ましくは、本発明は、４つのポリペプチド鎖を備え、ＰＤ‐１の１つ（又は２つ）のエピトープに対して免疫特異的である２つのエピトープ結合部位及びＬＡＧ‐３の１つ（又は２つ）のエピトープに対して免疫特異的である２つのエピトープ結合部位を有する、二重特異性ダイアボディ（即ち「ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性４価ダイアボディ」）を対象とする。本発明はまた、免疫グロブリンＦｃドメインを更に備える上述のようなダイアボディ（「二重特異性Ｆｃダイアボディ」及び「二重特異性４価Ｆｃダイアボディ」）も対象とする。本発明のダイアボディは、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３に同時に結合できるが、これは特にこれらの分子がヒト細胞の表面に存在するためである。本発明は、上述のようなダイアボディを含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療における上述のようなダイアボディの使用を伴う方法を対象とする。

関連技術の説明
Ｉ．細胞仲介性免疫応答
ヒト及び他の哺乳類の免疫系は、感染及び疾患に対して保護を提供する役割を果たす。このような保護は、体液性免疫応答及び細胞仲介性免疫応答の両方によって提供される。体液性免疫応答により、異物標的（抗原）を認識して中和できる抗体及び他の生体分子の産生が得られる。対照的に、細胞仲介性免疫応答は、Ｔ細胞によるマクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び抗原特異性細胞毒性Ｔリンパ球の活性化、並びに抗原の認識に応じた様々なサイトカインの放出を伴う（非特許文献１）。

抗原に対して免疫応答を最適に仲介するＴ細胞の能力は、２つの別個のシグナリング相互作用を必要とする（非特許文献２、３）。まず、抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ‐Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ：ＡＰＣ）の表面上に存在する抗原を、抗原特異性ナイーブＣＤ４⁺Ｔ細胞に対して提示する必要がある。このような提示により、提示された抗原に対して特異的となる免疫応答を開始するようにＴ細胞に指示するＴ細胞受容体（Ｔ‐Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）を介して、シグナルが送達される。次に、ＡＰＣと別個のＴ細胞表面分子との間の相互作用によって仲介される一連の共刺激及び阻害シグナルが、まずＴ細胞の活性化及び増殖を、最終的にはＴ細胞の阻害をトリガする。従って、第１のシグナルは免疫応答に対して特異性を付与し、第２のシグナルは、上記応答の性質、強さ及び持続時間を決定する役割を果たす。

免疫系は、共刺激及び共阻害リガンド及び受容体によって厳密に制御される。これらの分子は、Ｔ細胞活性化のための第２のシグナルを提供し、また自己に対する免疫を制限しながら感染に対する免疫応答を最大化するための、ポジティブ及びネガティブシグナルの平衡ネットワークを提供する（非特許文献４、５）。特に重要なのは、抗原提示細胞のＢ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）リガンドと、ＣＤ４⁺Ｔリンパ球のＣＤ２８及びＣＴＬＡ‐４受容体との間の結合である（非特許文献６、１、７）。ＣＤ２８に対するＢ７．１又はＢ７．２の結合は、Ｔ細胞活性化を刺激し、ＣＴＬＡ‐４に対するＢ７．１又はＢ７．２の結合は、上記活性化を阻害する（非特許文献１、７、８）。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の表面上に恒常的に発現し（非特許文献９）、その一方でＣＴＬＡ４の発現は、Ｔ細胞活性化に続いて急速に上方制御される（非特許文献１０）。ＣＴＬＡ４は高親和性受容体である（非特許文献６）ため、結合はまず（ＣＤ２８による）Ｔ細胞増殖を開始させ、その後（ＣＴＬＡ４の初期発現によって）Ｔ細胞増殖を阻害し、これにより、増殖がもはや必要ない場合にその効果を減衰させる。

ＣＤ２８受容体のリガンドに対する更なる調査により、関連するＢ７分子のセット（「Ｂ７スーパファミリー（Ｂ７ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）」の識別及び特性決定が得られた（非特許文献１１、６、８、１２、１３、３、１４、１５、１６、１７）。現在、上記ファミリーの複数のメンバーが公知である：Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、誘導性共刺激因子リガンド（ＩＣＯＳ‐Ｌ）、プログラム死‐１リガンド（ＰＤ‐Ｌ１；Ｂ７‐Ｈ１）、プログラム死‐２リガンド（ＰＤ‐Ｌ２；Ｂ７‐ＤＣ）、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４及びＢ７‐Ｈ６（非特許文献１２、１８）。

ＩＩ．ＰＤ‐１
プログラム死‐１（「ＰＤ‐１」）は、免疫応答を幅広く下方制御するＴ細胞制御因子の拡張ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ファミリーの、およそ３１ｋＤのＩ型膜タンパク質メンバーである（非特許文献１９、特許文献１〜９）。ＣＴＬＡ４に比べてＰＤ‐１は多い。

ＰＤ‐１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞及び単球上で（非特許文献２０、２１）、並びにナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞中において低レベルで（非特許文献２２、２３）、発現する。

ＰＤ‐１の細胞外領域は、ＣＴＬＡ４の同等のドメインに対して２３％の同一性を有する単一免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｖドメインで構成される（非特許文献２３）。細胞外ＩｇＶドメインには、膜透過性領域及び細胞内テールが続く。細胞内テールは、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ及び免疫受容体チロシン系スイッチモチーフ内に位置する２つのリン酸化部位を含有し、これは、ＰＤ‐１がＴＣＲシグナルを下方制御することを示唆している（非特許文献１９、２４）。

ＰＤ‐１は、Ｂ７‐Ｈ１及びＢ７‐ＤＣへの結合によって、免疫系の阻害を仲介する（非特許文献１４、特許文献１０〜１７）。

Ｂ７‐Ｈ１及びＢ７‐ＤＣは、心臓、胎盤、筋肉、胎児の肝臓、脾臓、リンパ節及び胸腺、並びにマウスの肝臓、肺、腎臓、膵臓の島細胞及び小腸といった、ヒト及びマウス組織の表面上で広く発現する結合リガンドである（非特許文献２３）。ヒトでは、Ｂ７‐Ｈ１タンパク質発現は、ヒト内皮細胞（非特許文献２５、２６、２７）、心筋（非特許文献２８）、合胞体栄養細胞（非特許文献２９）において見られた。上記分子はまた、いくつかの組織の常在性マクロファージによって、インターフェロン（ＩＦＮ）‐γ又は腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ：ＴＮＦ）‐αによって活性化されたマクロファージによって（非特許文献３０）、及び腫瘍内において（非特許文献３１）も発現される。

Ｂ７‐Ｈ１とＰＤ‐１との間の相互作用は、Ｔ及びＢ細胞に対する重大な下方共刺激シグナル（非特許文献２３）、並びに細胞死誘導因子としての機能（非特許文献１９、３２）を提供することが分かっている。より具体的には、低濃度のＰＤ‐１受容体とＢ７‐Ｈ１リガンドとの間の相互作用は、抗原特異性ＣＤ８⁺Ｔ細胞の増殖を強く阻害する阻害シグナルの伝達をもたらすことが分かっており；高濃度では、ＰＤ‐１との相互作用はＴ細胞増殖を阻害しないものの、複数のサイトカインの産生を明らかに低減させる（非特許文献６）。休止ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞並びに既に活性化されたＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の両方、更には臍帯血由来のナイーブＴ細胞による、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生は、可溶性Ｂ７‐Ｈ１‐Ｆｃ融合タンパク質によって阻害されることが分かっている（非特許文献３３、３０、３４、６）。

Ｔ細胞活性化及び増殖におけるＢ７‐Ｈ１及びＰＤ‐１の役割は、これらの生体分子が、炎症及び癌の治療のための治療標的として機能し得ることを示唆している。従って、感染及び腫瘍の治療並びに適応免疫応答の上方調節のための抗ＰＤ‐１抗体の使用が提案されている（特許文献１８、１９、２０、２、２１、２２、２３、２４、２５、２６を参照）。ＰＤ‐１に免疫特異的に結合できる抗体は、非特許文献２０及び３５によって報告されている（特許文献２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、２７、２５、３６、２５、３７、３８、３９、２６、４０、４１、４２、４３、４４も参照）。

ＩＩＩ．ＬＡＧ‐３
リンパ球活性化遺伝子３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ：ＬＡＧ‐３、ＣＤ２２３）は、活性化されたＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺Ｔ細胞並びにＮＫ細胞が発現する細胞表面受容体タンパク質であり、形質細胞様樹状細胞によって恒常的に発現される。ＬＡＧ‐３はＢ細胞、単球又は試験された他のいずれの細胞タイプによって発現されない（非特許文献３６）。

ＬＡＧ‐３は、Ｔ細胞共受容体ＣＤ４に密接に関連することが分かっている（非特許文献３６、３７、３５）。ＣＤ４と同様、ＬＡＧ‐３もまた、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するが、結合の親和性が有意に高い（非特許文献３９、４０、４１）。

研究により、ＬＡＧ‐３は、Ｔ細胞増殖、機能及びホメオスタシスの下方制御において重要な役割を果たすことが示されている（非特許文献３６、４２、４３、４４、４５、４６）。

研究により、抗体遮断によるＬＡＧ‐３機能の阻害は、ＬＡＧ‐３仲介性免疫系阻害を逆転でき、エフェクタ機能を部分的に復元できることが示唆されている（非特許文献３７、４７）。ＬＡＧ‐３は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）誘導性カルシウムフラックスの阻害によってＴ細胞増殖を下方調節し、記憶Ｔ細胞プールのサイズを制御することが分かっている（非特許文献４８、４９）。

これまでの進歩にもかかわらず、癌細胞又は病原体感染細胞を、特に比較的低い治療濃度で攻撃するよう、身体の免疫系により強力に指示できる、改良された組成物に対する需要が存在し続けている。というのは、適応免疫系は、癌及び疾患に対する強力な防護機構であり得るものの、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３の発現等の、腫瘍の微環境中の免疫抑制機構によって妨げられる場合があるためである。腫瘍環境において腫瘍細胞、免疫細胞及び間質細胞が発現する共阻害性分子は、癌細胞に対するＴ細胞応答を支配的に弱化させる場合がある。

以下に詳細に説明するように、本発明は、ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性４価ダイアボディを提供することによって、この需要に対処する。このようなダイアボディは、枯渇した及び寛容性の腫瘍浸潤リンパ球の表面上に存在するＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３細胞表面分子に結合でき、またこれによって、上記細胞表面分子の、その受容体リガンドに結合する能力を弱めることができる。従って、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディは、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３仲介性免疫系阻害をブロックし、これによって上記免疫系の継続的な活性化を促進するように作用する。この属性により、上記二重特異性ダイアボディは、癌及び病原体関連疾患及び状態の治療における有用性を得ることができる。本発明は、このようなダイアボディ、及びその使用方法を対象とする。

米国特許出願公開第２００７／０２０２１００号 米国特許出願公開第２００８／０３１１１１７号 米国特許出願公開第２００９／００１１０６６７号 米国特許第６，８０８，７１０号 米国特許第７，１０１，５５０号 米国特許第７，４８８，８０２号 米国特許第７，６３５，７５７号 米国特許第７，７２２，８６８号 国際公開第０１／１４５５７号 米国特許第６，８０３，１９２号 米国特許第７，７９４，７１０号 米国特許出願公開第２００５／００５９０５１号 米国特許出願公開第２００９／００５５９４４号 米国特許出願公開第２００９／０２７４６６６号 米国特許出願公開第２００９／０３１３６８７号 国際公開第０１／３９７２２号 国際公開第０２／０８６０８３号 米国特許公開第２０１０／００４０６１４号 米国特許公開第２０１０／００２８３３０号 米国特許公開第２００４／０２４１７４５号 米国特許公開第２００９／０２１７４０１号 米国特許第７，５２１，０５１号 米国特許第７，５６３，８６９号 米国特許第７，５９５，０４８号 国際公開第２００４／０５６８７５号 国際公開第２００８／０８３１７４号 米国特許第８，００８，４４９号 米国特許第８，５５２，１５４号 米国特許出願公開第２００７／０１６６２８１ 米国特許出願公開第２０１２／０１１４６４８号 米国特許出願公開第２０１２／０１１４６４９号 米国特許出願公開第２０１３／００１７１９９号 米国特許出願公開第２０１３／０２３０５１４号 米国特許出願公開第２０１４／００４４７３８号 国際公開第２００３／０９９１９６号 国際公開第２００４／００４７７１号 国際公開第２００４／０７２２８６号 国際公開第２００６／１２１１６８号 国際公開第２００７／００５８７４号 国際公開第２００９／０１４７０８号 国際公開第２００９／０７３５３３号 国際公開第２０１２／１３５４０８号 国際公開第２０１２／１４５５４９号 国際公開第２０１３／０１４６６８号

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本発明は、２つ以上のポリペプチド鎖を備え、ＰＤ‐１のエピトープに対して免疫特異的である少なくとも１つのエピトープ結合部位及びＬＡＧ‐３のエピトープに対して免疫特異的である少なくとも１つのエピトープ結合部位を有する、二重特異性ダイアボディ（即ち「ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ」）を対象とする。より好ましくは、本発明は、４つのポリペプチド鎖を備え、ＰＤ‐１の１つ（又は２つ）のエピトープに対して免疫特異的である２つのエピトープ結合部位及びＬＡＧ‐３の１つ（又は２つ）のエピトープに対して免疫特異的である２つのエピトープ結合部位を有する、二重特異性ダイアボディ（即ち「ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性４価ダイアボディ」）を対象とする。本発明はまた、免疫グロブリンＦｃドメインを更に備える上述のようなダイアボディ（「二重特異性Ｆｃダイアボディ」及び「二重特異性４価Ｆｃダイアボディ」）も対象とする。本発明のダイアボディは、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３に同時に結合できるが、これは特にこれらの分子がヒト細胞の表面に存在するためである。本発明は、上述のようなダイアボディを含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療における上述のようなダイアボディの使用を伴う方法を対象とする。

詳細には、本発明は、ＰＤ‐１のエピトープ及びＬＡＧ‐３のエピトープに対して免疫特異的に結合できる二重特異性Ｆｃダイアボディに関し、上記ダイアボディは、アミノ末端及びカルボキシ末端をそれぞれ有する４つのポリペプチド鎖（第１乃至第４のポリペプチド鎖）を含み：
（Ａ）上記第１及び第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合し、上記第１及び第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合し、また上記第３及び第４のポリペプチド鎖は互いに共有結合し；
（Ｂ）上記ダイアボディの上記第１及び第３のポリペプチド鎖はそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端への方向に、ＰＤ‐１又はＬＡＧ‐３に対して免疫特異的である抗体の軽鎖可変ドメイン、ＬＡＧ‐３又はＰＤ‐１に対して免疫特異的である抗体の重鎖可変ドメイン、ヘテロ二量体促進ドメイン及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含み、上記軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインは、ＰＤ‐１のエピトープ又はＬＡＧ‐３のエピトープに結合できるエピトープ結合部位を形成するために連結できず；
（Ｃ）上記ダイアボディの上記第２及び第４のポリペプチド鎖はそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＰＤ‐１又はＬＡＧ‐３に対して免疫特異的である抗体の軽鎖可変ドメイン、ＬＡＧ‐３又はＰＤ‐１に対して免疫特異的である抗体の重鎖可変ドメイン、及びヘテロ二量体促進ドメインを含み、上記軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインは、ＰＤ‐１のエピトープ又はＬＡＧ‐３のエピトープに結合できるエピトープ結合部位を形成するために連結できず；
（Ｉ）（１）上記第１のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン及び上記第２のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインは、連結して第１のエピトープ結合部位を形成し、上記第１のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメイン及び上記第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインは、連結して第２のエピトープ結合部位を形成し；
（２）上記第３のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン及び上記第４のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインは、連結して第３のエピトープ結合部位を形成し、上記第３のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメイン及び上記第４のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインは、連結して第４のエピトープ結合部位を形成し；
形成された上記エピトープ結合部位のうちの２つは、ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合でき、形成された上記エピトープ結合部位のうちの２つは、ＬＡＧ‐３のエピトープに免疫特異的に結合でき；
（ＩＩ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメインは上記第２のポリペプチド鎖の上記ヘテロ二量体促進ドメインと異なっており、配列番号１６及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；
（ＩＩＩ）上記第１及び第３のポリペプチド鎖の上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、連結してＦｃドメインを形成する。

本発明はまた、上記第１及び第３のポリペプチド鎖の上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインがそれぞれ、配列番号２４のアミノ酸配列を有する、上記二重特異性Ｆｃダイアボディの実施形態にも関する。

本発明はまた、ＬＡＧ‐３に対して免疫特異的である抗体の重鎖可変ドメインが、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、ＬＡＧ‐３に対して免疫特異的である抗体の軽鎖可変ドメインが、配列番号１２のアミノ酸配列を有する、上記二重特異性Ｆｃダイアボディの実施形態にも関する。

本発明はまた、ＰＤ‐１に対して免疫特異的である抗体の重鎖可変ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＰＤ‐１に対して免疫特異的である抗体の軽鎖可変ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を有する、上記二重特異性Ｆｃダイアボディの実施形態にも関する。

本発明はまた、有効量の上述のＦｃダイアボディのいずれと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物にも関する。

本発明はまた、上記二重特異性Ｆｃダイアボディの上記有効量が、治療を必要とするレシピエント個体の癌を治療するために有効な量である、上記医薬組成物の実施形態にも関する。

本発明はまた、上記癌が：副腎癌；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；発色性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成症；胆嚢若しくは胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫；カポジ肉腫；腎臓癌、白血病、脂肪腫／良性リポソーム腫瘍、脂肪肉腫／悪性リポソーム腫瘍、肝臓癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；乳頭状甲状腺癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮細胞癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移性癌；又は子宮癌である、上記医薬組成物の実施形態にも関する。

本発明はまた、上記二重特異性Ｆｃダイアボディの上記有効量が、治療を必要とするレシピエント個体の、病原体の存在に関連する疾患を治療するために有効な量である、上記医薬組成物の実施形態にも関する。

本発明はまた、上記病原体が細菌、真菌又はウイルスである、上記医薬組成物の実施形態にも関する。

本発明はまた、有効量の上記医薬組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、癌の治療方法にも関する。

本発明はまた、有効量の請求項８又は９の医薬組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、病原体の存在に関連する疾患の治療方法にも関する。

図１は、ｂａｓｉｃ ＤＡＲＴ（登録商標）のドメインの模式図である。 図２は、Ｆｃ担持ＤＡＲＴ（登録商標）のドメインの模式図である。 図３は、Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）のドメインの模式図である。 図４は、本発明の好ましいＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性４価ダイアボディのドメインの模式図である。２つはポリペプチド鎖１及び３のドメインを有し、２つはポリペプチド鎖２及び４のドメインを有する、４つのポリペプチド鎖が、複合体化して上記ダイアボディを形成する。（縞状の線で示されている）ジスルフィド結合は、ポリペプチド鎖１及び２、ポリペプチド鎖１及び３、並びにポリペプチド鎖３及び４を共有結合させる。同一のポリペプチド鎖の可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインは、異なるエピトープ（ＰＤ‐１又はＬＡＧ‐３）を指向しており、これにより、得られるダイアボディは、ＰＤ‐１に対して免疫特異的である２つのエピトープ結合ドメイン、及びＬＡＧ‐３に対して免疫特異的であるエピトープ結合ドメインを有する。 図５は、抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３抗体の、Ｔ細胞の増殖を増強する能力を評価するためのプロトコルの図である。 図６は、アロＭＬＲアッセイの開始時におけるＰＤ‐１ ｍＡｂ １（５Ｃ４；ＢＭＳ‐９３６５５８）、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２（ＭＫ‐３４７５；Ｍｅｒｃｋ、ランブロリズマブ）及びＰＤ‐１ ｍＡｂ ３（ＥＨ１２．２Ｈ７；Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ）の添加が、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体に比べて強いＴ細胞増殖応答を誘起したことを示す。また、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４（ＣＴ‐０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ、ＢＡＴ‐１）、抗ＣＴＬＡ ｍＡｂ及びＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １（２５Ｆ７；ＢＭＳ‐９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）を用いて上記増殖応答が得られることも示されている。レスポンダ（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ：Ｒ）細胞はｐａｎ Ｔ細胞であり；スティミュレータ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ：Ｓ）細胞は成熟樹状細胞（ｍＤＣ）である。 図７は、単独での、又はＰＤ‐１ ｍＡｂ １（５Ｃ４；ＢＭＳ‐９３６５５８））、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２（ＭＫ‐３４７５；Ｍｅｒｃｋ、ランブロリズマブ）と組み合わせた場合の、Ｔ細胞増殖潜在能力に関するＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １（２５Ｆ７；ＢＭＳ‐９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）の評価の結果を示す。レスポンダ（Ｒ）細胞はｐａｎ Ｔ細胞であり；スティミュレータ（Ｓ）細胞は成熟樹状細胞（ｍＤＣ）である。 図８は、ＡＰＣ及びＣＤ４Ｔ細胞の両方において発現するヒトＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する可溶性ヒトＬＡＧ‐３（ｓｈＬＡＧ‐３）が、ＩｇＧアイソタイプ又はレスポンダ（Ｒ）（ｐａｎ Ｔ細胞）＋スティミュレータ（Ｓ）（成熟樹状細胞（ｍＤＣ））対照ウェルに比べて、ロバストな増殖応答を誘起したことを示す。 図９Ａ〜９Ｂは、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディが、抗ＰＤ‐１ ｍＡｂ（５Ｃ４）又は抗ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ（２５Ｆ７）と比較した場合に、強力なＴ細胞増殖応答を誘起したことを示す。図９Ａは、本発明の好ましいＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性４価ダイアボディ（ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）‐１及びＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）‐２）、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １（５Ｃ４；ＢＭＳ‐９３６５５８））、ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １（２５Ｆ７；ＢＭＳ‐９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）、可溶性ヒトＬＡＧ‐３（ＳｈＬＡＧ‐３）、対照ＩｇＧ、レスポンダ＋スティミュレータ細胞（ｐａｎ Ｔ細胞及び成熟樹状細胞；Ｒ＋Ｓ）、並びにスティミュレータ細胞（成熟樹状細胞；Ｓ）を用いて得られた、Ｔ細胞増殖応答を示す。図９Ｂは、ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）‐１及びＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）‐２、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １（５Ｃ４；ＢＭＳ‐９３６５５８））、ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １（２５Ｆ７；ＢＭＳ‐９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）、並びにＰＤ‐１ ｍＡｂ １（５Ｃ４；ＢＭＳ‐９３６５５８））＋ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １（２５Ｆ７；ＢＭＳ‐９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）に関する同一のデータを、異なるＹ軸スケールを用いて示す。

本発明は、２つ以上のポリペプチド鎖を備え、ＰＤ‐１のエピトープに対して免疫特異的である少なくとも１つのエピトープ結合部位及びＬＡＧ‐３のエピトープに対して免疫特異的である少なくとも１つのエピトープ結合部位を有する、二重特異性ダイアボディ（即ち「ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ」）を対象とする。より好ましくは、本発明は、４つのポリペプチド鎖を備え、ＰＤ‐１の１つ（又は２つ）のエピトープに対して免疫特異的である２つのエピトープ結合部位及びＬＡＧ‐３の１つ（又は２つ）のエピトープに対して免疫特異的である２つのエピトープ結合部位を有する、二重特異性ダイアボディ（即ち「ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性４価ダイアボディ」）を対象とする。本発明はまた、免疫グロブリンＦｃドメインを更に備える上述のようなダイアボディ（「二重特異性Ｆｃダイアボディ」及び「二重特異性４価Ｆｃダイアボディ」）も対象とする。本発明のダイアボディは、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３に同時に結合できるが、これは特にこれらの分子がヒト細胞の表面に存在するためである。本発明は、上述のようなダイアボディを含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療における上述のようなダイアボディの使用を伴う方法を対象とする。

本発明の二重特異性ダイアボディは、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３に同時に結合できるが、これは特にこれらの分子がヒト細胞の表面に存在するためである。本発明は、上述のようなダイアボディを含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療における上述のようなダイアボディの使用を伴う方法を対象とする。特に、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディは、共有結合的に複合体化するポリペプチド鎖を備える。

上述のように、Ｔ細胞活性化は、２つの別個のシグナルを必要とする。第１のシグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のコンテキスト内でペプチド抗原を認識するＴ細胞の表面に発現する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって提供される。第２のシグナルは、共刺激リガンドの同族ペア：ＡＰＣ上で発現するＢ７‐１及びＢ７‐２と、これらの対応する受容体：Ｔ細胞上で発現するＣＤ２８及びＣＴＬＡ‐４との相互作用によって提供される。

この受容体‐リガンド軸において、Ｂ７‐共刺激分子とＣＤ２８受容体とのエンゲージメントは、Ｔ細胞増殖を刺激でき、これに続いて、Ｂ７‐１及びＢ７‐２リガンドと強く競合してＴ細胞活性化及び増殖応答を「終息させる（ｗｉｎｄ ｄｏｗｎ）」ＣＤ２８に対する下方レギュレータ及び対抗受容体であるＣＴＬＡ‐４の発現を誘起できる。ＣＤ２８に結合するアゴニスト抗体は、Ｔ細胞エフェクタ機能を誘起して、腫瘍根絶性免疫の生成を増強することが分かっており、また本質的に共刺激性である。対照的に、ＣＴＬＡ‐４エンゲージメントをブロックするアンタゴニストは、自己免疫をもたらすことができる持続性増殖を維持しながら、Ｔ細胞がそのエフェクタ機能を中断するのを防止できる。

正常なホメオスタシスの間、及び抗原に対する免疫応答のプライミング段階において、免疫系を活性化するように機能する、ＣＴＬＡ‐４：Ｂ７‐１／Ｂ７‐２軸と並行して、第２の受容体‐リガンド軸は、免疫系を阻害することによって、免疫応答のエフェクタ段階中にＣＴＬＡ‐４に対する対抗点として作用するよう機能する。この第２の軸は、Ｔ細胞の表面上で発現するプログラム細胞死‐１タンパク質（ＰＤ‐１）受容体の、対応するリガンド：それぞれ抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び上皮細胞上で発現するＰＤ‐Ｌ１及びＰＤ‐Ｌ２への結合を伴う（Chen L. et al. (2013) “Molecular Mechanisms Of T‐Cell Co‐Stimulation And Co‐Inhibition,” Nature Reviews Immunology 13(4):227‐242）。Ｔ細胞応答を刺激するためにＣＤ２８に結合するアゴニスト抗体とは対照的に、Ｐ‐１又はＰＤ‐Ｌ１に結合する抗体は、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１エンゲージメントに拮抗し、又はこれを遮断し、またＴ細胞への下方シグナルの送達を防止することによって、Ｔ細胞の応答を維持できる。これは、Ｔ細胞増殖、細胞毒性及びサイトカイン分泌を増進させる、又は維持する。抗ＣＤ２８等のアゴニスト抗体は上方シグナル経路を標的とし、従って共刺激因子であり、その一方で抗ＰＤ‐１等のアンタゴニスト抗体は下方シグナル経路を標的とし、チェックポイント阻害剤と呼ばれる。

ＣＴＬＡ‐４及びＰＤ‐１は標準的なチェックポイント阻害剤を表すが、免疫調節受容体‐リガンド対のファミリーが増加している。上述のリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ‐３）は、ＡＰＣ上で発現するＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する、Ｔ細胞上で発現する追加のチェックポイント阻害剤標的である。ＬＡＧ‐３は、枯渇した及び寛容性の腫瘍浸潤性リンパ球（「ＴＩＬ」）上でＰＤ‐１と同時発現し（Matsuzaki, J. et al. (2010) “Tumor‐Infiltrating NY‐ESO‐1‐Specific CD8+ T‐Cells Are Negatively Regulated by LAG‐3 and PD‐1 in Human Ovarian Cancer,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 107(17):7875‐7880; Okazaki, T. et al. (2011) “PD‐1 and LAG‐3 inhibitor Coreceptors Act Synergistically To Prevent Autoimmunity In Mice,” J. Exp. Med. 208(2):395‐407）、ＬＡＧ‐３発現は、腫瘍免疫学及び自己免疫の両方における役割を含むＴ調節細胞について報告されている。動物モデルは、抗ＬＡＧ‐３が、腫瘍増殖を遅らせるのに十分な強力な腫瘍根絶性免疫を誘起し、また抗ＰＤ‐１ ｍＡｂと組み合わせた場合、完全な腫瘍退行をトリガすることさえできることを実証している（Woo, S.R. et al. (2012) “Immune Inhibitory Molecules LAG‐3 And PD‐1 Synergistically Regulate T‐Cell Function To Promote Tumoral Immune Escape,” Cancer Res. 72(4):917‐927）。抗体ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ ＢＭＳ‐９８６０１６を伴う併用療法は、現在、単独の、又は抗ＰＤ‐１ ｍＡｂ（ニボルマブ／ＢＭＳ‐９３６５５８）と組み合わせた早期臨床試験中である（Creelan, B.C. (2014) “Update on Immune Checkpoint Inhibitors in Lung Cancer,” Cancer Control 21(1):80‐89を参照）。

本発明の二重特異性ダイアボディは、枯渇した及び寛容性の腫瘍湿潤性リンパ球の表面上に存在するＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３細胞表面分子に結合でき、またこれにより、上記細胞表面分子がその受容体リガンドに結合する能力を弱化させることができる。従って本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディは、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３仲介性免疫系の阻害を減衰させて、継続的な免疫系の活性化を促進できる。

Ｉ．一般的な技術及び一般的な定義
本発明の実践は、そうでないことが示されていない限り、当該技術の範囲内の分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を採用する。
このような技術は：MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Third Edition (Sambrook et al. Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: METHODS AND APPLICATIONS (Methods in Molecular Biology), Herdewijn, P., Ed., Humana Press, Totowa, NJ; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (Gait, M.J., Ed., 1984); METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Humana Press, Totowa, NJ; CELL BIOLOGY: A LABORATORY NOTEBOOK (Cellis, J.E., Ed., 1998) Academic Press, New York, NY; ANIMAL CELL CULTURE (Freshney, R.I., Ed., 1987); INTRODUCTION TO CELL AND TISSUE CULTURE (Mather, J.P. and Roberts, P.E., Eds., 1998) Plenum Press, New York, NY; CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Doyle, A. et al, Eds., 1993‐8) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.) New York, NY; WEIR' S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY (Herzenberg, L.A. et al. Eds. 1997) Wiley‐Blackwell Publishers, New York, NY; GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (Miller, J.M. et al. Eds., 1987) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, F.M. et al, Eds., 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY; PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION, (Mullis, K. et al, Eds., 1994) Birkhauser, Boston MA; CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (Coligan, J.E. et al, eds., 1991) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley and Sons, 1999) Hoboken, NJ; IMMUNOBIOLOGY 7 (Janeway, C.A. et al 2007) Garland Science, London, UK; Antibodies (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, UK; ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (D. Catty., ed., 1989) Oxford University Press, USA, New York NY); MONOCLONAL ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (Shepherd, P. et al Eds., 2000) Oxford University Press, USA, New York NY; USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow, E. et al Eds., 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; THE ANTIBODIES (Zanetti, M. et al Eds. 1995) Harwood Academic Publishers, London, UK); 及びDEVITA, HELLMAN, AND ROSENBERG'S CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, EIGHTH EDITION, DeVita, V. et al Eds. 2008, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA等の文献に十分に説明されている。

本明細書において使用される場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、当該免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、この用語は、完全なポリクローナル又はモノクローナル抗体だけでなく、その突然変異体、自然に発生する変異体、必要な特異性の抗原認識部位を有する抗体部分を備える融合タンパク質、ヒト化抗体及びキメラ抗体、並びに必要な特異性の抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。自然に発生する抗体は典型的には、「重（ｈｅａｖｙ）」（「Ｈ」）ポリペプチド鎖の２つのコピー、及び「軽（ｌｉｇｈｔ）」（「Ｌ」）ポリペプチド鎖の２つのコピーを備える。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＶＬ」）及び軽鎖定常領域（「ＣＬ」）から構成され、各重鎖は、重鎖可変領域（「ＶＨ」）と、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）から構成されることが多い重鎖定常領域とから構成される。重鎖ポリペプチドのＣＨ２及びＣＨ３ドメインは互いに相互作用して、免疫系細胞の表面上に存在するＦｃ受容体に結合できるＦｃ領域を形成する。

完全な未修飾抗体（例えばＩｇＧ）の、抗原のエピトープに結合する能力は、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖上の可変ドメイン（即ちそれぞれＶＬ及びＶＨドメイン）の存在に左右される。抗体軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、抗体のエピトープ結合部位のうちの１つを形成する。対照的に、抗体の「ｓｃＦｖ」断片は、単一ポリペプチド鎖が含有する抗体のＶＬ及びＶＨドメインを備え、これらのドメインは、２つのドメインの機能性エピトープ結合部位への自己集合を可能とするのに十分な長さのフレキシブルリンカーによって隔てられる。

ＶＬ及びＶＨドメインの自己集合が、不十分な長さ（約１２個未満のアミノ酸残基）のリンカーによって不可能となる場合、ｓｃＦｖ構造のうちの２つが互いに相互作用して、「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」を形成し、これは、この分子において一方の鎖のＶＬが他方の鎖のＶＨと連結するような２価分子である（Marvin et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG‐Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649‐658において概説されている）。

抗体は、診断学におけるその公知の使用法に加えて、治療剤として有用であることが示されている。この数十年、抗体の治療的潜在能力に対する関心が再び高まっており、抗体は、生命工学由来の薬剤の筆頭となるクラスの１つとなっている（Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663‐666）。２００近くの抗体系薬剤が使用認可済み、又は開発中である。

用語「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は均質な抗体の集団を指し、上記モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関わる（自然に発生する又は自然に発生しない）アミノ酸から構成される。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に対して指向性を有する。用語「モノクローナル抗体」は、完全なモノクローナル抗体及び完全長モノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）₂、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を備える融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び必要な特異性及び抗原への結合能力を有する抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。抗原の源又は抗原を作製する方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等による）に関して、限定は意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した断片等を含む。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495‐497の方法又はその修正例である。

典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい。一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすることができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、本発明の二重特異性分子及びキメラ抗体、ヒト化抗体若しくはイヌ化抗体を生成するため、又は抗体の親和性若しくは他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体のエピトープ結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第５，８６６，６９２号；及び米国特許第６，３３１，４１５号を参照。

天然の抗体は、１つのエピトープ種のみと結合できる（即ち単一特異性である）が、これらは当該種の複数の複製にも結合できる（即ち２価性又は多価性を呈する）。幅広い組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されており（例えば国際公開第２００８／００３１１６号、国際公開第２００９／１３２８７６号、国際公開第２００８／００３１０３号、国際公開第２００７／１４６９６８号を参照）、その殆どは、抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）を更なる結合タンパク質（例えばｓｃＦｖ）に融合させるため、又は例えば２つのＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖを融合させるために、リンカーペプチドを使用する。典型的には、このようなアプローチは妥協及びトレードオフを伴う。例えば国際公開第２０１３／１７４８７３号、国際公開第２０１１／１３３８８６号及び国際公開第２０１０／１３６１７２号は、リンカーの使用によって、治療的設定に問題が生じる場合があることを開示しており、２つ以上の抗原に結合できるように、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わり、かつＶＬ及びＶＨドメインが多様化されている、三重特異性抗体を教示している（国際公開第２００８／０２７２３６号、国際公開第２０１０／１０８１２７号）。従って、これらの文書に開示されている分子は、結合特異性を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。国際公開第２０１３／１６３４２７号及び国際公開第２０１３／１１９９０３号は、ＣＨ２ドメインを修飾して、結合ドメインを備える融合タンパク付加物を含有させるステップを開示している。この文書は、ＣＨ２が、エフェクタ機能の仲介において最低限の役割しか果たさないらしいことを記載している。国際公開第２０１０／０２８７９７号、国際公開第２０１００２８７９６号及び国際公開第２０１０／０２８７９５号は、Ｆｃ領域が追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。国際公開第２００３／０２５０１８号及び国際公開第２００３０１２０６９号は、個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含有する組み換えダイアボディを開示している。国際公開第２０１３／００６５４４号は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、エフェクタ機能を仲介する能力の全て又はある程度を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。国際公開第２０１４／０２２５４０号、国際公開第２０１３／００３６５２号、国際公開第２０１２／１６２５８３号、国際公開第２０１２／１５６４３０号、国際公開第２０１１／０８６０９１号、国際公開第２００７／０７５２７０号、国際公開第１９９８／００２４６３号、国際公開第１９９２／０２２５８３号及び国際公開第１９９１／００３４９３号は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、ナイーブ抗体構造を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。

本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点で天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる能力に注目している（例えばHolliger et al. (1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444‐6448;Hollinger et al.による米国特許第２００４／００５８４００号；Mertens et al.による米国特許第２００４／０２２０３８８号；Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1‐2):90‐94; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG‐Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin‐Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665‐19672;Mertens et al.による国際公開第０２／０２７８１号；Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide‐Linked Anti‐CEA Diabody Allows Site‐Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng Des Sel. 17(1):21‐27; Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti‐CD20 Single Chain Fv‐Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1025‐1033; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P‐683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583‐588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T‐Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941‐4944参照）。

ダイアボディの設計は、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）に基づく。このような分子は、軽鎖及び／又は重鎖可変領域を、短い連鎖ペプチドを用いて連結することによって作製される。Bird et al. (1988)（“Single‐Chain Antigen‐Binding Proteins,” Science 242:423‐426）は、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（Bird et al. (1988) “Single‐Chain Antigen‐Binding Proteins,” Science 242:423‐426）。リンカーは、薬剤の付着又は剛性支持体の付着といった追加の機能のために修飾できる。単鎖変異体は、組み換えによって又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生に関しては、自動化されたシンセサイザを使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生に関しては、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞である好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の従来の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離できる。

米国特許第７，５８５，９５２号及び米国特許公開第２０１０‐０１７３９７８号は、ＥｒｂＢ２に対して免疫特異的なｓｃＦｖ分子に関する。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（「ＢｉＴＥ」）、あるタイプのｓｃＦｖ分子が記載されている（国際公開第０５／０６１５４７号； Baeuerle, P et al. (2008) “BiTE: A New Class Of Antibodies That Recruit T‐Cells,” Drugs of the Future 33: 137‐147; Bargou, et al. 2008) “Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T‐Cell‐Engaging Antibody,” Science 321: 974‐977）。このような分子は、２つの抗原結合ドメインを有する単一のポリペプチド鎖分子からなり、上記２つの抗原結合ドメインは、一方がＣＤ３エピトープに免疫特異的に結合し、もう一方が標的細胞の表面上に存在する抗原に免疫特異的に結合する。

非単一特異性ダイアボディの提供は、異なるエピトープを共連結（ｃｏ‐ｌｉｇａｔｅ）して共存させることができる能力という有意な利点を提供する。従って２価ダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。２価性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び加工の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221）。

ダイアボディの２価性により、上記ダイアボディを、異なる細胞を共結紮するため、例えば細胞毒性Ｔ細胞を腫瘍細胞に架橋させるために使用できるようになった（Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T‐Cells,” Nature 314:628‐631、及びHolliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T‐Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299‐305）。従って例えば、ダイアボディエピトープ結合ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２又はＣＤ６４のいずれの免疫エフェクタ細胞の表面決定基を指向してよく、これらはＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞上に発現する。多くの研究において、エフェクタ細胞決定基（例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ））に対するダイアボディ結合は、エフェクタ細胞を活性化させることも発見された（Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T‐Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299‐305; Holliger et al. (1999) “Carcinoembryonic Antigen (CEA)‐Specific T‐cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti‐CD3 x Anti‐CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti‐CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909‐2916；国際公開第２００６／１１３６６５号；国際公開第２００８／１５７３７９号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１２／１６２０６８号）。通常、エフェクタ細胞の活性化は、抗原に結合した抗体がＦｃ‐ＦｃγＲ相互作用によってエフェクタ細胞に結合することによってトリガされる。従ってこれに関して、ダイアボディ分子は、（例えば当該技術分野において公知の、又は本明細書例示されるいずれのエフェクタ機能アッセイ（例えばＡＤＣＣアッセイ）において分析されるように）Ｆｃドメインを備えるかどうかとは独立して、Ｉｇのような機能性を呈し得る。腫瘍とエフェクタ細胞とを架橋することによって、ダイアボディはエフェクタ細胞を腫瘍細胞近傍にもたらすだけでなく、効果的な腫瘍の殺滅をもたらす（例えばCao et al. (2003) “Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171‐197参照）。

しかしながら、上述の利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583‐588）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止するような方法で達成しなければならない（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583‐588）。

従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えばOlafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide‐Linked Anti‐CEA Diabody Allows Site‐Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21‐27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P‐683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583‐588; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG‐Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin‐Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665‐19672参照）。しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非機能性モノマーへと容易に分解することを認識している（例えばLu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG‐Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin‐Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665‐19672参照）。

この課題をものともせず、本技術分野は、ＤＡＲＴ（登録商標）と呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した（例えば米国特許公開第２０１３‐０２９５１２１号；米国特許公開第２０１０‐０１７４０５３号；及び米国特許公開第２００９‐００６０９１０号；欧州特許公開第２７１４０７９号；欧州特許公開第２６０１２１６号；欧州特許公開第２３７６１０９号；欧州特許公開第２１５８２２１号；及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；並びにMoore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T‐Cell Killing Of B‐Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542‐4551; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933‐1943; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv‐Based Dual‐Affinity Re‐Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B‐Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399(3):436‐449参照）。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを備え、１つ又は複数のシステイン残基を、ジスルフィド結合を形成でき、これによって２つのポリペプチド鎖を共有結合させる、採用したポリペプチド種それぞれの中へと加工するステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、ポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、２価分子の結合特性に干渉することなく、得られるヘテロ二量体を安定化させる。

最も単純なＤＡＲＴ（登録商標）の２つのポリペプチドはそれぞれ３つのドメインを備える（図１）。第１のポリペプチドは：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を備えるドメイン；（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を備える、第２のドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記第２のポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進する役割、及びダイアボディの第２のポリペプチドに対する第１のポリペプチドの共有結合を促進する役割を果たす、第３のドメインを備える。第２のポリペプチドは：相補的な第１のドメイン（ＶＬ２ドメイン）；相補的な第２のドメイン（ＶＨ１ドメイン）；並びに第１のポリペプチド鎖の第３のドメインと複合体化して、第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進する、第３のドメインを含有する。このような分子は、安定かつ強力であり、２つ以上の抗原を同時に結合する能力を有する。

一実施形態では、第１及び第２のポリペプチドの第３のドメインはそれぞれ、システイン残基を含有し、このシステイン残基は、ジスルフィド結合を介してポリペプチドを一体に結合させる役割を果たす。上記ポリペプチドのうちの一方又は両方の第３のドメインは更に、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの配列を有してよく、これにより、ダイアボディポリペプチドの複合体化によって、細胞（Ｂリンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞等）のＦｃ受容体に結合できるＦｃドメインが形成される（図２）。このような分子の多数の変形例が記載されている（例えば米国特許公開第２０１３‐０２９５１２１号；米国特許公開第２０１０‐０１７４０５３号；及び米国特許公開第２００９‐００６０９１０号；欧州特許公開第２７１４０７９号；欧州特許公開第２６０１２１６号；欧州特許公開第２３７６１０９号；欧州特許公開第２１５８２２１号；及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号参照）。これらのＦｃ担持ＤＡＲＴ（登録商標）は、３つのポリペプチド鎖を備えてよい。このようなダイアボディの第１のポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなＤＡＲＴ（登録商標）の第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなＤＡＲＴ（登録商標）の第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を備える。従って、このようなＤＡＲＴ（登録商標）の第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体として複合体化して、エピトープに結合可能なＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合可能なＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメイン内のシステイン残基が関与するジスルフィド結合を介して、互いに結合される。特に、第１及び第３のポリペプチド鎖は互いと複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃドメインを形成する。このようなダイアボディは、増強された強度を有する。このようなＦｃ担持ＤＡＲＴ（登録商標）は、２つの配向（表１）のうちのいずれを有してよい：

Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）（図３）と呼ばれる更に複雑なＤＡＲＴ（登録商標についても説明されている（国際公開第２０１２／０１８６８７号）。Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）は４つのポリペプチド鎖を有する。上記ダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）の第２及び第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン：並びに（ｉｉｉ）ヘテロ二量体化及びＦｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）の第１のポリペプチド鎖との共有結合を促進するドメインを含有する。第３及び第４のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメイン、並びに第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメインは、同一であってよく、又は単一特異性、二重特異性若しくは四重特異性である４価結合を可能とするために異なっていてよい（表２）。

本出願全体を通して、抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸残基の番号付与は、Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91‐3242中のもののようなＥＵインデックスに従ったものである。

用語「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は本明細書において相互交換可能に使用され、いずれの長さ特にアミノ酸残基３個、５個、１０個、２０個又は２５個超の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直鎖又は分岐であってよく、修飾アミノ酸を含んでよく、非アミノ酸によって中断されていてよい。これらの用語はまた、自然に、又は例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、若しくは標識化成分との複合体形成といった他のいずれの操作若しくは修飾の介入によって修飾された、アミノ酸ポリマーも包含する。またこの定義には、例えばアミノ酸の１つ又は複数の類似体（例えば非天然アミノ酸等を含む）及び当該技術分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドも含まれる。本発明のポリペプチドは単鎖として、又は複合体化した複数の鎖として発生し得る。

用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」及び「ＤＡＲＴ（商標）」については上述されている。ＤＡＲＴ（登録商標）は、好ましくは共有結合的相互作用によって互いに複合体化して、同一の又は異なるエピトープを認識してよい少なくとも２つのエピトープ結合部位を形成する、少なくともとも２つのポリペプチド鎖を備えるタイプのダイアボディである。ダイアボディ又はＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのポリペプチド鎖のうちの２つはそれぞれ、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を備えるが、これらの領域は、相互作用してエピトープ結合部位を形成することはない（即ちこれらの領域は相互に「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」ではない）。寧ろ、ダイアボディ又はＤＡＲＴ（商標）ポリペプチド鎖のうちの一方（例えば第１のもの）の免疫グロブリン重鎖可変領域は、異なる（例えば第２の）ダイアボディ又はＤＡＲＴ（商標）ポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域と相互作用して、エピトープ結合部位を形成する。同様に、ダイアボディ又はＤＡＲＴ（商標）ポリペプチド鎖のうちの一方（例えば第１のもの）の免疫グロブリン軽鎖可変領域は、異なる（例えば第２の）ダイアボディ又はＤＡＲＴ（商標）ポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖可変領域と相互作用して、エピトープ結合部位を形成する。ＤＡＲＴ（商標）分子は、米国特許公開第２０１３‐０２９５１２１号；米国特許公開第２０１０‐０１７４０５３号及び米国特許公開第２００９‐００６０９１０号；欧州特許公開第２７１４０７９号；欧州特許公開第２６０１２１６号；欧州特許公開第２３７６１０９号；欧州特許公開第２１５８２２１号、並びに国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２００６／１１３６６５号、国際公開第２００８／１５７３７９号、並びにMoore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T‐Cell Killing Of B‐Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542‐4551; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933‐1943;及びJohnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv‐Based Dual‐Affinity Re‐Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B‐Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399(3):436‐449に開示されている。

本明細書において使用される場合、ポリペプチド（例えばあるダイアボディポリペプチドを別のものに対して、免疫グロブリン軽鎖を免疫グロブリン重鎖に対して、あるＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを別のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに対して等）に関する用語「連結（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」又は「連結する（ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ）」は、ポリペプチドの非共有結合を表すことを意図したものである。用語「複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」又は「複合体化する（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ）」は、ポリペプチドの共有結合を表すことを意図したものである。

本明細書において使用される場合、本発明のダイアボディは、そのエピトープ結合ドメインが、それぞれの認識されたエピトープに同時に結合できる場合、「協調的結合（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）」を仲介する、と言い表される。このような結合は同時であってよい。

本発明のダイアボディのエピトープ結合ドメインは、その認識されたエピトープに、「免疫特異的な（ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」様式で結合する。本明細書において使用される場合、抗体、ダイアボディ又は他のエピトープ結合分子は、代替的なエピトープに比べて、より頻繁に、より迅速に、より長期間、及び／又はより高い親和性で当該エピトープと反応又は連結する場合、別の分子のある領域（即ちエピトープ）に「免疫特異的に」結合する、と言い表される。例えば、あるウイルスエピトープに免疫特異的に結合する抗体は、他のウイルスエピトープ又は非ウイルスエピトープに免疫特異的に結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い期間、当該ウイルスエピトープに結合する抗体である。この定義を読めば、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（又は部分若しくはエピトープ）は、第２の標的に特異的又は優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。従って「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、排他的結合を必ずしも必要としない（ただし含むことはできる）。一般に、ただし必ずしもそうではないが、結合に関する言及は「特異的」結合を意味する。

このような分子の様々な免疫グロブリンドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭを含むがこれらに限定されないいずれのアイソタイプ又はアロタイプの免疫グロブリンに由来し得る。好ましい実施形態では、以下において議論するように、このような免疫グロブリンＩｇＧ免疫グロブリンに由来する。具体的実施形態では、使用されるＩｇＧアイソタイプはＩｇＧ１であるが、他のアイソタイプのＩｇＧ（例えばＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はこれらのアロタイプ）を採用してもよい。

ＩＩ．本発明の好ましいＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ
本発明は、ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディに関する。本発明の好ましいＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディは、抗体を２つの異なるエピトープ：ＰＤ‐１のエピトープ及びＬＡＧ‐３のエピトープに協調的に結合させることによって、このような分子の阻害活性を減衰させることができる、抗体のエピトープ結合断片を有する。本明細書において使用される場合、このような減衰は、検出可能なＰＤ‐１及び／若しくはＬＡＧ‐３阻害活性の少なくとも２０％の低下、少なくとも５０％の低下、少なくとも８０％の低下若しくは少なくとも９０％の低下、又は検出可能なＰＤ‐１及び／若しくはＬＡＧ‐３阻害活性の完全な排除を指す。

Ａ．抗ＰＤ‐１結合能力
ＰＤ‐１に対して免疫特異的である抗体が公知である（例えば米国特許第８，００８，４４９号、米国特許第８，５５２，１５４号、国際公開第２０１２／１３５４０８号、国際公開第２０１２／１４５５４９号、国際公開第２０１３／０１４６６８号を参照）。更なる望ましい抗体は、ＰＤ‐１又はそのペプチド断片を用いて誘発された抗体分泌性ハイブリドーマを単離することによって作製できる。（２０個のアミノ酸残基シグナル配列（下線を付して示す）及び２６８個のアミノ酸残基成熟タンパク質を含む）ヒトＰＤ‐１は、アミノ酸配列（配列番号１）：
MQIPQAPWPV VWAVLQLGWRPGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA
TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL
PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE
VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI
GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT
IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL
を有する。

好ましい抗ＰＤ‐１抗体は：ＰＤ‐１ ｍＡｂ １（５Ｃ４；ＢＭＳ‐９３６５５８）、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２（ＭＫ‐３４７５；Ｍｅｒｃｋ、ランブロリズマブ）、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３（ＥＨ１２．２Ｈ７；ＤａｎａＦａｒｂｅｒ）及びＰＤ‐１ ｍＡｂ ４（ＣＴ‐０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ、ＢＡＴ‐１）を有する。

ＰＤ‐１ ｍＡｂ １の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号２）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMHWVRQA PGKGLEWVAV
IWYDGSKRYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCATND
DYWGQGTLVT VSS
を有する。

ＰＤ‐１ ｍＡｂ １の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号３）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ
GTKVEIK
を有する。

ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号４）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG
INPSNGGTNF NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD
YRFDMGFDYW GQGTTVTVSS
を有する。

ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号５）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL
LIYLASYLESGVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL
TFGGGTKVEIK
を有する。

ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号６）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
QVQLQQSGAE LAKPGASVQM SCKASGYSFT SSWIHWVKQR PGQGLEWIGY
IYPSTGFTEY NQKFKDKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARWR
DSSGYHAMDY WGQGTSVTVSS
を有する。

ＰＤ‐１ ｍＡｂ ３の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号７）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
DIVLTQSPAS LTVSLGQRAT ISCRASQSVS TSGYSYMHWY QQKPGQPPKL
LIKFGSNLESGIPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQHSWEIPY
TFGGGTKLEI K
を有する。

ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号８）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
QVQLVQSGSE LKKPGASVKI SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLQWMGW
INTDSGESTY AEEFKGRFVF SLDTSVNTAY LQITSLTAED TGMYFCVRVG
YDALDYWGQG TLVTVSS
を有する。

ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号９）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
EIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSARSSVS YMHWFQQKPG KAPKLWIYRT
SNLASGVPSR FSGSGSGTSY CLTINSLQPE DFATYYCQQR SSFPLTFGGG
TKLEIK
を有する。

Ｂ．抗ＬＡＧ‐３結合能力
ＬＡＧ‐３に対して免疫特異的である抗体が公知である（例えば国際公開第２０１４／００８２１８号を参照）。更なる望ましい抗体は、ＬＡＧ‐３又はそのペプチド断片を用いて誘発された抗体分泌性ハイブリドーマを単離することによって作製できる。（２８個のアミノ酸残基シグナル配列（下線を付して示す）及び４９７個のアミノ酸残基成熟タンパク質を含む）ヒトＬＡＧ‐３は、アミノ酸配列（配列番号１０）：
MWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAEVP VVWAQEGAPA QLPCSPTIPL
QDLSLLRRAG VTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT
VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAA
VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASV
HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFN
VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP
PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEQ QLNATVTLAI
ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEA
QEAQLLSQPW QCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL
LLFLILGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPPQAQSKIE
ELEQEPEPEP EPEPEPEPEP EPEQL
を有する。

好ましい抗ＬＡＧ‐３抗体は、ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １（２５Ｆ７；ＢＭＳ‐９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）である。ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号１１）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS DYYWNWIRQP PGKGLEWIGE
INHNGNTNSN PSLKSRVTLS LDTSKNQFSL KLRSVTAADT AVYYCAFGYS
DYEYNWFDPW GQGTLVTVSS
を有する。

ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、アミノ酸配列（配列番号１２）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ
GTNLEIK
を有する。

本明細書において使用される場合、用語「抗体のエピトープ結合断片（ｅｐｉｔｏｐｅ‐ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、あるエピトープに免疫特異的に結合できる、抗体の断片を意味する。エピトープ結合断片は、上記抗体のＣＤＲドメインのうちの１個、２個、３個、４個、５個又は６個全てを含有でき、またこのようなエピトープに免疫特異的に結合できる一方で、上記抗体のエピトープとは異なるエピトープに対する免疫特異性、親和性又は選択性を呈してよい。しかしながら好ましくは、エピトープ結合断片は、上記抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有する。抗体のエピトープ結合断片は、単一のポリペプチド鎖であってよく（例えばｓｃＦｖ）、又はそれぞれアミノ末端及びカルボキシル末端を有する２つ以上のポリペプチド鎖を備えてよい（例えばダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ₂断片等）。

Ｃ．本発明の好ましいＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ
１．一般的考察
本発明の好ましいダイアボディは、合計４つのポリペプチド鎖からなる二重特異性４価Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ（図３）である。上記４つのポリペプチド鎖は、一体として複合体化してＦｃドメインを形成する２つのＣＨ２‐ＣＨ３含有ポリペプチド（即ち上記ダイアボディの「第１（ｆｉｒｓｔ）」及び「第３（ｔｈｉｒｄ）」のポリペプチド鎖）と、それぞれ上記ダイアボディのＣＨ２‐ＣＨ３含有ポリペプチドと複合体化してＰＤ‐１又はＬＡＧ‐３に対して免疫特異的であるエピトープ結合ドメインを形成する２つの同一の非ＣＨ３含有ポリペプチド（即ち上記ダイアボディの「第２（ｓｅｃｏｎｄ）」及び「第４（ｆｏｕｒｔｈ）」のポリペプチド鎖）とを備える。従って例えば、第１のポリペプチド鎖は抗ＰＤ‐１（又は抗ＬＡＧ‐３）可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び抗ＬＡＧ‐３（又は抗ＰＤ‐１）可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含有し、相補的な抗ＰＤ‐１（又は抗ＬＡＧ‐３）ＶＨドメイン及び相補的な抗ＬＡＧ‐３（又は抗ＰＤ‐１）ＶＬドメインを有する第２のポリペプチド鎖と複合体化して、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３エピトープ結合ドメインの第１のペアを形成する。同様に、第３のポリペプチド鎖は抗ＰＤ‐１（又は抗ＬＡＧ‐３）可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び抗ＬＡＧ‐３（又は抗ＰＤ‐１）可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含有し、相補的な抗ＰＤ‐１（又は抗ＬＡＧ‐３）ＶＨドメイン及び相補的な抗ＬＡＧ‐３（又は抗ＰＤ‐１）ＶＬドメインを有する第４のポリペプチド鎖と複合体化して、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３エピトープ結合ドメインの第２のペアを形成する。

同一のポリペプチドの可変軽鎖及び可変重鎖ドメインは異なるエピトープを指向しているため、これらは、ＰＤ‐１又はＬＡＧ‐３に結合できるエピトープ結合ドメインを形成するために一体として複合体化できない。第１のポリペプチドの可変軽鎖及び可変重鎖ドメインは好ましくは、これらのドメインの複合体化を実質的に防止するために十分に短い介在リンカーペプチドによって互いから離間している。例示的なリンカーは、配列（配列番号１３）：GGGSGGGGを有する。あるいは、（同一のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインが互いに相互作用するのを防止するための）同様の長さの他のリンカーを採用することもできる。

図４に示すように、本発明の最も好ましい二重特異性４価Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、ヘテロ二量体促進ドメインを含有するＦｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディである。このようなドメインを含むことにより、上記ダイアボディのポリペプチド鎖間のヘテロ二量体形成が助長される。上記ドメインを含むことは必須ではなく、本発明は、上記ドメインを有しないＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディを含む。好ましいヘテロ二量体促進ドメインは、「Ｅコイル（Ｅ‐ｃｏｉｌ）」ドメイン（配列番号１４）：EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK及び「Ｋコイル（Ｋ‐ｃｏｉｌ）」ドメイン（配列番号１５）：KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKEを含む。より具体的には、一体として複合体化することが望ましいポリペプチド鎖のペアはそれぞれ、１つ（又は複数）のこのようなヘテロ二量体促進ドメインを含有するように加工され、ここで一方のポリペプチド鎖の、１つ又は複数の採用されたドメインは、もう一方のポリペプチド鎖の、１つ又は複数の採用されたドメインに対して相補的である（例えば一方のポリペプチド鎖はＥコイルドメインを含有し、もう一方はＫコイルドメインを含有する）。上記２つのポリペプチド鎖が、２つ以上のこのようなヘテロ二量体促進ドメインを含有するように加工される場合、これらは同一の電荷を有するものとすることができ、又はより好ましくは反対の電荷を有するものとすることができる。

特に好ましいのは、１つ又は複数のシステイン残基を含むための、上述のＥコイル及びＫコイル配列の修飾を備える、ヘテロ二量体促進ドメインである。このようなシステイン残基の存在により、あるポリペプチド鎖上に存在するコイルが、別のポリペプチド鎖上に存在する相補的なコイルと共有結合でき、これによりこれらのポリペプチド鎖を共有結合させて、ダイアボディの安定性を向上させることができる。このような特に好ましいものの例は、アミノ酸配列（配列番号１６）：EVAACEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKを有する修飾Ｅコイル（ここで配列番号１４のロイシン残基は、システイン残基（下線を付して示す）で置換されている）、及びアミノ酸配列（配列番号１７）：KVAACKEKVAALKEKVAALKEKVAALKEを有する修飾Ｋコイル（ここで配列番号１５のロイシン残基は、システイン残基（下線を付して示す）で置換されている）を含むヘテロ二量体促進ドメインである。

第１のポリペプチドの可変重鎖ドメイン、及び上記ポリペプチドのヘテロ二量体促進ドメインは好ましくは、１、２、３、又は４つ以上のシステイン残基を含有する介在リンカーペプチドによって、互いから分離されている。好ましいシステイン含有スペーサペプチドは、配列（配列番号１８）：GGCGGGを有する。（別のポリペプチド鎖のシステイン残基と共有結合できるシステイン残基を含むための）同様の長さの他のリンカーを採用することもできる。

好ましくは、第１のポリペプチド鎖の採用されるヘテロ二量体促進ドメイン及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、ヘテロ二量体促進ドメインに対して改善された安定化を提供する介在システイン含有リンカーペプチドによって、互いから分離されている。好適なシステイン含有リンカーペプチドは、アミノ酸配列（配列番号１９）：DKTHTCPPCPを有するが、より好ましいリンカーは、アミノ酸配列（配列番号２０）：LEPKSADKTHTCPPCを有する。あるいは、（別のポリペプチド鎖のシステイン残基と共有結合できるシステイン残基を含むための）同様の長さの他のリンカーを採用することもできる。

野生型ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は以下の通りである（位置は、Kabat et al. (1992) Sequences Of Proteins Of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91‐3242中のもののようなＥＵインデックスによるものである）（配列番号２１）：
|CH2 →
PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT
230 240 250 260 270 280
←CH2│CH3→
KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA K GQPREPQVY
290 300 310 320 330 340
TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK
350 360 370 380 390 400
←CH3|
LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
410 420 430 440

三重特異性又は四重特異性ダイアボディに関して（即ち、第１及び第３のポリペプチド鎖が同一でないダイアボディに関して）、２つの第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン間、又は２つの第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン間でのホモ二量体化の発生を低減又は防止することが望ましい。第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖との間でのヘテロ二量体化を促進するために、これらの鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは好ましくは、このようなヘテロ二量体化を促進するように修飾される。例えば、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（ｋｎｏｂ）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に突然変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した突然変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（ｈｏｌｅ）」とペアにすることができる。このような一連の突然変異は、ダイアボディ分子を構成するポリペプチドのいずれのペアに施すことができ、また更に、上記ペアのポリペプチド鎖のいずれの部分に施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えば米国特許第７，６９５，９３６号及び米国特許公開第２００７／０１９６３６３号、Ridgway et al. (1996) “‘Knobs‐Into‐Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617‐621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26‐35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95‐101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。好ましいノブは、天然ＩｇＧ Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、天然ＩｇＧ Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。本発明のダイアボディの精製を補助するために、ホール突然変異を含有するポリペプチド鎖は更に、タンパク質Ａ結合部位を除去するための、４３５位における置換（Ｈ４３５Ｒ）を備える。従って、上記ホール突然変異を含有するポリペプチドのホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で、ノブ及びホール含有ヘテロ二量体の結果として形成されるダイアボディは、ノブ突然変異を含有するポリペプチド鎖上のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を保持する。

本発明はまた、変異型Ｆｃドメインを含む分子も包含し、上記変異型Ｆｃドメインは、同等の野生型Ｆｃドメインに対する１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む。変異型Ｆｃドメインを含む分子は通常、野生型Ｆｃドメインを含む分子に対して変化した表現型を有する。この変異型表現型は、変化した血清半減期、変化した安定性、細胞酵素に対する変化した感受性、又はＮＫ依存性若しくはマクロファージ依存性アッセイで測定されるような変化したエフェクタ機能として表現され得る。変化したエフェクタ機能として表されるＦｃドメイン修飾には当該技術分野において公知であり、活性化型受容体に対する結合を増大させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ））、及び阻害型受容体に対する結合を低下させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ））が含まれる（例えばStavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low‐Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882‐8890を参照）。ＣＤ３２Ｂに対する結合が低下し、及び／又はＣＤ１６Ａに対する結合が増大した、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインの例示的な変異体は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ又はＰ２９６Ｌ置換を含有する。これらのアミノ酸置換は、いずれの組み合わせでヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに存在してよい。一実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン変異体は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン変異体は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ２９６Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン変異体は、これらの突然変異がＦｃＲ結合を消滅させるため、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換、又はＤ２６５Ａ置換を含有する。このような分子の第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、「ノブ担持（ｋｎｏｂ‐ｂｅａｒｉｎｇ）」配列（配列番号２２）：
PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV
DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP
APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV
EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH
EALHNHYTQK SLSLSPGK
又はタンパク質Ａ結合を無効化するためのＨ４３５Ｒ置換を有する「ホール担持（ｈｏｌｅ‐ｂｅａｒｉｎｇ）」配列（配列番号２３）：
PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV
DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP
APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV
EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH
EALHNRYTQK SLSLSPGK
を有する。

理解されるように、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号２３）は、第１のポリペプチド鎖において採用してよく、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号２２）は第３のポリペプチド鎖において採用されることになる。

第１及び第３のポリペプチド鎖が異なるものではない、本発明の二重特異性４価ダイアボディに関して、好ましいＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アミノ酸配列（配列番号２４）：
PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLYITREPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV
DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP
APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV
EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH
EALHNHYTQK SLSLSPG
を有する修飾ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインである。

従って要約すると、表３に示すように、本発明の好ましいＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性４価ダイアボディ、Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの、好ましい第１及び第３のポリペプチド鎖は、同一の配列を有し、上記好ましいＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性４価Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの第２及び第４のポリペプチド鎖は、同一の配列を有する：

２．第１の例示的なＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ（ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）‐１）
本発明の第１の、特に好ましいＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性４価Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、同一の配列の第１及び第３のポリペプチド鎖を有する。このような第１／第３のポリペプチド鎖は、アミノ酸配列（配列番号２５）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ
GTNLEIKGGG SGGGGQVQLV ESGGGVVQPG RSLRLDCKAS GITFSNSGMH
WVRQAPGKGL EWVAVIWYDG SKRYYADSVK GRFTISRDNS KNTLFLQMNS
LRAEDTAVYY CATNDDYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAACE KEVAALEKEV
AALEKEVAAL EKLEPKSADK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL FPPKPKDTLY
ITREPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV
VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP
PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG
SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPG
を有し、ここでアミノ酸残基１‐１０７は、ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １の軽鎖可変ドメイン（配列番号１２）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基１０８‐１１５は、リンカーGGGSGGGG（配列番号１３）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基１１６‐２２８は、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １の重鎖可変ドメイン（配列番号２）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基２２９‐２３４は、システイン含有スペーサペプチドGGCGGG（配列番号１８）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基２３５‐２６２は、修飾Ｅコイル（配列番号１６）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基２６３‐２７７は、システイン含有リンカーペプチドLEPKSADKTHTCPPC（配列番号２０）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基２７８‐４９４は、修飾ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号２４）のアミノ酸残基である。

上記第１／第３のポリペプチド鎖をエンコードする核酸分子は、以下の通りである（配列番号２６）：
gaaattgtcc tgacacagtc tcccgcaacc ctgagtttga gtcctgggga
gcgagcaact ctctcctgcc gagcctccca gagtatctcc tcctacctcg
cctggtacca acagaagcca gggcaggctc caaggctgct tatctatgac
gcctctaacc gcgcaactgg gattcccgca cgcttctccg gctctggttc
cggcacagac tttacactta ctatctctag cctggagcca gaagactttg
ccgtgtacta ttgtcagcaa cgttccaatt ggccccttac ctttgggcag
ggcactaact tggaaatcaa aggtggcgga tccggcggcg gaggccaggt
tcagctggtc gagagtggtg gcggcgttgt gcaacctggg cgttccctcc
gattggactg taaagcttcc ggcattactt tctcaaattc cggcatgcat
tgggtgaggc aagcccctgg aaaagggctc gaatgggtgg ctgtgatttg
gtacgatggc agcaaacggt actacgccga ttctgttaag ggccgcttta
ccatctcccg cgataactca aagaacacac tgtttctgca aatgaatagt
cttagagccg aggacaccgc cgtgtactac tgtgccacaa atgacgatta
ttgggggcag ggcacattgg tcacagtgtc ttccggagga tgtggcggtg
gagaagtggc cgcatgtgag aaagaggttg ctgctttgga gaaggaggtc
gctgcacttg aaaaggaggt cgcagccctg gagaaactgg agcccaaatc
tgctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagccgcgg
ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctctat
atcacccggg agcctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga
agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata
atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta
caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca
tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc
ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt
caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc
agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca
ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact
acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gt

このようなＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）‐１の第２及び第４のポリペプチド鎖は、同一の配列を有する。このような第２／第４のポリペプチド鎖は、アミノ酸配列（配列番号２７）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ QWGAGLLKPS ETLSLTCAVY GGSFSDYYWN
WIRQPPGKGL EWIGEINHNG NTNSNPSLKS RVTLSLDTSK NQFSLKLRSV
TAADTAVYYC AFGYSDYEYN WFDPWGQGTL VTVSSGGCGG GKVAACKEKV
AALKEKVAAL KEKVAALKE
を有し、ここでアミノ酸残基１‐１０７は、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １の軽鎖可変ドメイン（配列番号３）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基１０８‐１１５は、リンカーGGGSGGGG（配列番号１３）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基１１６‐２３５は、ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １の重鎖可変ドメイン（配列番号１１）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基２３６‐２４１は、システイン含有スペーサペプチドGGCGGG（配列番号１８）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基２４２‐２６９は、修飾Ｋコイル（配列番号１７）のアミノ酸残基である。

上記第２／第４のポリペプチド鎖をエンコードする核酸分子は、以下の通りである（配列番号２８）：
gagatcgtac ttacccagtc tcccgccacc ctttccctga gtcctggtga
gcgggccact ctttcctgtc gcgcaagcca atcagtttct agctacctcg
catggtatca gcagaagcca gggcaggcac ccaggcttct catctatgac
gccagtaacc gcgcaaccgg gatacctgct agattttccg gcagtggatc
tgggaccgat ttcacactga caatttcatc cttggaacca gaagatttcg
cagtctacta ctgccagcaa tcttccaact ggccaagaac tttcggacag
gggaccaaag tggaaattaa aggtggcgga tccggcggcg gaggccaggt
ccagctccag caatggggag ccgggctgct gaaaccctct gaaacactga
gtctcacatg tgccgtttat ggaggttcct tctccgatta ttactggaac
tggattcgtc agcctcccgg caagggcctg gagtggatcg gtgagattaa
ccacaatggc aataccaata gcaatcctag tttgaaatct cgcgtcactc
tttccctcga tacaagcaaa aaccagtttt ctttgaaatt gcgatctgta
actgctgctg atactgccgt gtattactgc gcattcggct actccgacta
tgaatataat tggttcgatc cttggggaca gggaacattg gtaaccgtgt
catccggagg atgtggcggt ggaaaagtgg ccgcatgtaa ggagaaagtt
gctgctttga aagagaaggt cgccgcactt aaggaaaagg tcgcagccct
gaaagag

３．第２の例示的なＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ（ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）‐２）
本発明の第２の、特に好ましいＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性４価Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは、同一の配列の第１及び第３のポリペプチド鎖を有する。このような第１／第３のポリペプチド鎖は、アミノ酸配列（配列番号２９）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ
GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ QWGAGLLKPS ETLSLTCAVY GGSFSDYYWN
WIRQPPGKGL EWIGEINHNG NTNSNPSLKS RVTLSLDTSK NQFSLKLRSV
TAADTAVYYC AFGYSDYEYN WFDPWGQGTL VTVSSGGCGG GEVAACEKEV
AALEKEVAAL EKEVAALEKL EPKSADKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP
KPKDTLYITR EPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ
YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE
PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP
PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP
G
を有し、ここでアミノ酸残基１‐１０７は、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １の軽鎖可変ドメイン（配列番号３）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基１０８‐１１５は、リンカーGGGSGGGG（配列番号１３）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基１１６‐２３５は、ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １の重鎖可変ドメイン（配列番号１１）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基２３６‐２４１は、システイン含有スペーサペプチドGGCGGG（配列番号１８）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基２４２‐２６９は、修飾Ｅコイル（配列番号１６）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基２７０‐２８４は、システイン含有リンカーペプチドLEPKSADKTHTCPPC（配列番号２０）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基２８５‐５０１は、修飾ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号２４）のアミノ酸残基である。

上記第１／第３のポリペプチド鎖をエンコードする核酸分子は、以下の通りである（配列番号３０）：
gagatcgtac ttacccagtc tcccgccacc ctttccctga gtcctggtga
gcgggccact ctttcctgtc gcgcaagcca atcagtttct agctacctcg
catggtatca gcagaagcca gggcaggcac ccaggcttct catctatgac
gccagtaacc gcgcaaccgg gatacctgct agattttccg gcagtggatc
tgggaccgat ttcacactga caatttcatc cttggaacca gaagatttcg
cagtctacta ctgccagcaa tcttccaact ggccaagaac tttcggacag
gggaccaaag tggaaattaa aggtggcgga tccggcggcg gaggccaggt
ccagctccag caatggggag ccgggctgct gaaaccctct gaaacactga
gtctcacatg tgccgtttat ggaggttcct tctccgatta ttactggaac
tggattcgtc agcctcccgg caagggcctg gagtggatcg gtgagattaa
ccacaatggc aataccaata gcaatcctag tttgaaatct cgcgtcactc
tttccctcga tacaagcaaa aaccagtttt ctttgaaatt gcgatctgta
actgctgctg atactgccgt gtattactgc gcattcggct actccgacta
tgaatataat tggttcgatc cttggggaca gggaacattg gtaaccgtgt
catccggagg atgtggcggt ggagaagtgg ccgcatgtga gaaagaggtt
gctgctttgg agaaggaggt cgctgcactt gaaaaggagg tcgcagccct
ggagaaactg gagcccaaat ctgctgacaa aactcacaca tgcccaccgt
gcccagcacc tgaagccgcg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca
aaacccaagg acaccctcta tatcacccgg gagcctgagg tcacatgcgt
ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg
tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga
ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc
cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca
ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg
tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt
ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc
atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg
ggt

ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）‐２の第２及び第４のポリペプチド鎖は、同一の配列を有する。このような第２／第４のポリペプチド鎖は、アミノ酸配列（配列番号３１）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ
GTNLEIKGGG SGGGGQVQLV ESGGGVVQPG RSLRLDCKAS GITFSNSGMH
WVRQAPGKGL EWVAVIWYDG SKRYYADSVK GRFTISRDNS KNTLFLQMNS
LRAEDTAVYY CATNDDYWGQ GTLVTVSSGG CGGGKVAACK EKVAALKEKV
AALKEKVAAL KE
を有し、ここでアミノ酸残基１‐１０７は、ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １の軽鎖可変ドメイン（配列番号１２）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基１０８‐１１５は、リンカーGGGSGGGG（配列番号１３）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基１１６‐２２８は、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １の重鎖可変ドメイン（配列番号２）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基２２９‐２３４は、システイン含有スペーサペプチドGGCGGG（配列番号１８）のアミノ酸残基であり、アミノ酸残基２３５‐２６２は、修飾Ｋコイル（配列番号１７）のアミノ酸残基である。

上記第２／第４のポリペプチド鎖をエンコードする核酸分子は、以下の通りである（配列番号３２）：
gaaattgtcc tgacacagtc tcccgcaacc ctgagtttga gtcctgggga
gcgagcaact ctctcctgcc gagcctccca gagtatctcc tcctacctcg
cctggtacca acagaagcca gggcaggctc caaggctgct tatctatgac
gcctctaacc gcgcaactgg gattcccgca cgcttctccg gctctggttc
cggcacagac tttacactta ctatctctag cctggagcca gaagactttg
ccgtgtacta ttgtcagcaa cgttccaatt ggccccttac ctttgggcag
ggcactaact tggaaatcaa aggtggcgga tccggcggcg gaggccaggt
tcagctggtc gagagtggtg gcggcgttgt gcaacctggg cgttccctcc
gattggactg taaagcttcc ggcattactt tctcaaattc cggcatgcat
tgggtgaggc aagcccctgg aaaagggctc gaatgggtgg ctgtgatttg
gtacgatggc agcaaacggt actacgccga ttctgttaag ggccgcttta
ccatctcccg cgataactca aagaacacac tgtttctgca aatgaatagt
cttagagccg aggacaccgc cgtgtactac tgtgccacaa atgacgatta
ttgggggcag ggcacattgg tcacagtgtc ttccggagga tgtggcggtg
gaaaagtggc cgcatgtaag gagaaagttg ctgctttgaa agagaaggtc
gccgcactta aggaaaaggt cgcagccctg aaagag

ＩＩＩ．医薬組成物
本発明は、癌、又は病原体の存在に関連する疾患の治療のための医薬組成物を含む。このような組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験体又は患者への投与に好適な組成物）を含む。上記組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の修飾ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ（及び特に本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性４価Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ）と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の分子のうちの１つ又は複数と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。本発明はまた、このような修飾されたダイアボディ、及び特定の病原体関連抗原に対して特異的な第２の治療用抗体、並びに薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物を包含する。

本明細書において使用される場合、用語「癌（ｃａｎｃｅｒ）」は、悪性腫瘍の存在を特徴とする疾患を指す。このような癌としては：副腎癌；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；発色性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成症；胆嚢若しくは胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫；カポジ肉腫；腎臓癌、白血病、脂肪腫／良性リポソーム腫瘍、脂肪肉腫／悪性リポソーム腫瘍、肝臓癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；乳頭状甲状腺癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮細胞癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移性癌；又は子宮癌が挙げられる。

本明細書使用される場合、用語「病原体の存在に関連する疾患（ｄｉｓｅａｓｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｐａｔｈｏｇｅｎ）」は、細菌（例えば大腸菌、クロストリジウム・ディフィシレ、サルモネラ・ティフィムリウム、緑膿菌、コレラ菌、淋菌、ヘリコバクター・ピロリ、ヘモフィルス・インフルエンザ、赤痢菌、黄色ブドウ球菌、結核菌及び肺炎連鎖球菌等）、真菌（例えばカンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス、コクシジオイデス、ヒストプラズマ、ニューモシスチス、スタキボトリス等）、原生動物（アメーボゾア、エスカバータ、クロムアルベオラータ、エントアメーバ、マラリア原虫、ジアルジア、トリパノソーマ、球虫類、胞子虫網、槍状吸虫、リーシュマニア等）又はウイルス（特にアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、Ｂウイルス（マカシンヘルペスウイルスＩ）、ＢＫウイルス、ブンヤウイルス、チクングニヤウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、サイトメガロウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラウイルス、エンテロウイルス、エプスタイン‐バーウイルス、ハンタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒト泡沫状ウイルス、ヒトヘルペスウイルス３、ヒトヘルペスウイルス５、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトβリンパ球向性ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ、インフルエンザウイルス、ＪＣウイルス、ＪＥＶ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ラッサウイルス、リンパ球性脈絡膜炎ウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ニパウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、オルトレオウイルス、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、大痘瘡ウイルス、小痘瘡ウイルス、水痘帯状疱疹ヘルペスウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、若しくは黄熱病ウイルス）による感染に関連する疾患を指す。

本明細書において使用される場合、用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、有益な又は望ましい結果（これは有益な又は望ましい臨床的結果を含み、また好ましくは有益な又は望ましい臨床的結果である）を得るためのアプローチを指す。このような有益な又は望ましい臨床的結果としては、感染した細胞若しくは他の疾患に罹患した細胞の増殖の低減（若しくは破壊）、疾患に由来する症状の低減、疾患に罹患したヒトのＱＯＬの上昇、疾患を治療するために必要な他の投薬量の低減、疾患の進行の遅延、及び／又は個体の生存期間の延長のうちの１つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない。

ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。これらの薬学的キャリアは、水及び石油、動物油、植物油若しくは合成油を含む油（例えば落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油等）等の、無菌液体とすることができる。医薬組成物を静脈投与する場合、水が好ましいキャリアである。特に注射用溶液のための液体キャリアとして、食塩水、並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も採用できる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。必要な場合は、上記組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉体、徐放性製剤等の形態を取ることができる。

一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。

本発明の組成物は、中性又は塩形態として処方できる。薬学的に許容可能な塩としては：塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の陰イオンを有して形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２‐メチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の陽イオンを有して形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明はまた、単独で又は上述の薬学的に許容可能なキャリアと併せて、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディを含有する１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ又は複数のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。

本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。一実施形態では、キットは、本発明の分子のうちの１つ又は複数を含むことができる。別の実施形態では、キットは更に、癌又は病原体関連抗原の存在を特徴とする疾患の治療に有用な１つ若しくは複数の他の予防剤又は治療剤を、１つ又は複数のコンテナ内に含む。別の実施形態では、キットは更に、１つ又は複数の病原体関連抗原に結合する１つ又は複数の抗体又はダイアボディを含む。特定の実施形態では、他の予防剤又は治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、予防剤又は治療剤は生物学的治療剤又はホルモン療法剤である。

ＩＶ．本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディの産生方法
当該技術分野において公知であるように、最も好ましくは、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディは、上述のようなポリペプチドをエンコードする核酸分子の組み換え発現によって産生される。

本発明のポリペプチドは従来、固相ペプチド合成を用いて調製できる（Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis” Science 232(4748):341‐347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid‐Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen‐Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131‐135; Ganesan, A. (2006) “Solid‐Phase Synthesis In The Twenty‐First Century”,Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3‐10）。

ある代替案では、当該技術分野において公知の方法を用いて、抗体を組み換えによって作製し、発現させてよい。抗体は、まず宿主動物から作製された抗体を単離し、遺伝子配列を取得し、上記遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）内で抗体を組み換え発現させることによって作製できる。採用できる別の方法は、植物（例えばタバコ）又はトランスジェニックミルク中で抗体配列を発現させることである。植物又はミルク中で抗体を組み換え発現させるための好適な方法は、開示されている（例えばPeeters et al. (2001) “Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants”, Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice”, Int. Rev. Immunol 13:65‐93;及びPollock et al.(1999)“Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies”, J. Immunol Methods 231 : 147‐157を参照）。例えばキメラ、ヒト化、単鎖等の抗体の誘導体を作製するための好適な方法は、当該技術分野において公知である。別の代替案では、抗体はファージディスプレイ技術によって、組み換えによって作製できる（例えば米国特許第５，５６５，３３２号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，７３３，７４３号；米国特許第６，２６５，１５０号；及びWinter, G. et al. (1994) “Making Antibodies By Phage Display Technology”, Annu. Rev. Immunol. 12.433‐455を参照）。

関心対象の抗体又はタンパク質は、エドマン分解による配列決定に供してよく、これは当業者には公知である。質量分析又はエドマン分解から生成されるペプチド情報を用いて、関心対象のタンパク質をクローニングするために使用されるプローブ又はプライマを設計できる。

関心対象のタンパク質クローニングの代替的な方法は、関心対象の抗体又はタンパク質を発現する細胞に関して、精製したタンパク質又はその一部分を用いて「パンニング（ｐａｎｎｎｉｎｇ）」することによるものである。「パンニング」手順は、第２の細胞タイプの所望のｃＤＮＡを発現又は過剰発現する組織又は細胞からｃＤＮＡライブラリを取得し、所望のタンパク質への特異的結合のために第２の細胞タイプのトランスフェクト細胞をスクリーニングすることによって、実施してよい。「パンニング」による、細胞表面タンパク質に関する哺乳類遺伝子コーディングのクローニングにおいて使用される方法の詳細な説明は、従来技術中に見ることができる（例えばAruffo, A. et al. (1987) “Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High‐Efficiency COS Cell Expression System” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573‐8577及びStephan, J. et al. (1999) “Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation” Endocrinol. 140:5841‐5854を参照）。

抗体、並びに他のペプチドアゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータをエンコードするｃＤＮＡは、当該技術分野において標準的な方法に従った特定の細胞タイプからのｍＲＮＡの逆転写によって得ることができる。具体的には、ｍＲＮＡは、既出のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．に記載の手順に従って、様々な溶解酵素若しくは化学溶液を用いて単離でき、又は市販の核酸結合樹脂により、製造者（例えばQiagen、Invitrogen、Promega）が提供する添付の説明書に従って抽出できる。次に合成ｃＤＮＡを発現ベクターに導入して、第２のタイプの細胞において関心対象の抗体又はタンパク質を産生する。発現ベクターは宿主細胞内で、エピソームとして又は染色体ＤＮＡの不可欠な部分として複製可能でなければならないことがうかがえる。好適な発現ベクターとしては、プラスミド；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス及びコスミドを含むウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

関心対象のポリヌクレオチドを含有するベクターは：電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ‐デキストラン又は他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えばベクターがワクシニアウイルス等の感染性因子である場合）を含む多数の適切な手段のうちのいずれによって、宿主細胞に導入できる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特徴に左右される場合が多い。

関心対象の抗体、ポリペプチド、又はタンパク質をエンコードする遺伝子を単離する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現できるいずれの宿主細胞を使用できる。好適な哺乳類宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞は、対応する関心対象の内因性抗体又は宿主細胞中に存在する場合はタンパク質の５倍高い、より好ましくは１０倍高い、より好ましくは２０倍高い、より好ましくは５０倍高い、より好ましくは、１００倍高いレベルのｃＤＮＡを発現する。所望のタンパク質への特異的結合に関する宿主細胞のスクリーニングは好ましくは、イムノアッセイ又はＦＡＣＳによって実行される。関心対象の抗体又はタンパク質を過剰発現する細胞は、このようにして識別できる。

親ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータ分子に対する、得られるタンパク質のアミノ酸配列の追加、欠失又は変更をエンコードする、突然変異型ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータを産生するために現在採用できる様々な技術も利用可能である。

本発明は、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディへの、その特性に有意な影響を及ぼさない修飾、及び活性が増強した又は低下した変異体を含む。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において慣用的に実践されている。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を大きく劣化するように変化させない１つ若しくは複数の欠失若しくは追加、又は化学的類似体の使用が挙げられる。互いを保存的に置換できるアミノ酸残基としては：グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニン；リジン／アルギニン；フェニルアラニン／チロシンが挙げられるが、これらに限定されない。これらのポリペプチドとしては、グリコシル化及び非グリコシル化ポリペプチド、並びに例えば異なる複数の糖によるグリコシル化、アセチル化及びリン酸化といった、その他の変換後修飾を有するポリペプチドも挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であり、即ち置換されたアミノ酸は、オリジナルのアミノ酸と同様の化学的特性を有する。このような保存的置換は当該技術分野において公知であり、その例は上述されている。アミノ酸修飾は、１つ又は複数のアミノ酸を変化させるか又は修飾することから、可変領域等の領域の完全な再設計にまで及んでよい。可変領域の変化は、結合親和性及び／又は特異性を変化させる。他の修飾方法としては、酵素的手段、酸化的置換及びキレート化を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の連結技術の使用が挙げられる。修飾は例えば、イムノアッセイのための標識の付与、例えばラジオイムノアッセイのための放射性部分の付与等のために使用できる。修飾されたポリペプチドは、当該技術分野において確立された手順を用いて作製され、また当該技術分野において公知の標準的なアッセイを用いてスクリーニングできる。

本発明はまた、本発明のポリペプチド及び抗体からの１つ又は複数の断片又は領域を備える融合タンパク質も包含する。一実施形態では、可変軽鎖領域の少なくとも１０個の連続するアミノ酸、及び可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を備える、融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を含有する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生された抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含有する。本発明の目的のために、抗体融合タンパク質は、免疫エフェクタ細胞の所望のウイルスエピトープ若しくは所望の活性化受容体、又は上述のような活性化受容体、及びネイティブ分子内では上記活性化受容体が付着しない別のアミノ酸配列、例えば別の領域からの異種配列若しくは同種配列を発現する免疫エフェクタ細胞の表面上に存在するタンパク質に特異的に結合する、１つ又は複数のポリペプチドドメインを含有する。

本発明は、本発明の抗体のアミノ酸配列を備えるポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野において公知の手順で産生できる。上記ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解若しくは他の分解によって、上述のような組み換え法（即ち単一若しくは融合ポリペプチド）によって、又は化学的合成によって産生できる。上記抗体のポリペプチド、特にアミノ酸最高約５０個分の比較的短いポリペプチドは、化学的合成によって便利に作製される。化学的合成方法は当該技術分野において公知であり、市販されている。例えば上述のようなポリペプチドは、固相法を採用した自動ポリペプチド合成器によって産生してよい。

Ｖ．本発明の組成物の使用
本発明は、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディ、上記分子由来のポリペプチド、上記分子又は上記ポリペプチドをエンコードする配列を備えるポリヌクレオチド、及び本明細書に記載の他の作用材を含む、医薬組成物を含む組成物を包含する。

本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディは、ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３が仲介する免疫系の阻害を減衰させる能力を有することから、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディは、癌、及び病原体の存在に関連する疾患（例えば細菌、真菌、ウイルス又は原虫感染）を含む、望ましくない免疫系の抑制に関連するいずれの疾患又は状態を治療するために使用できる。

ＶＩ．投与方法
本発明の組成物は、有効量の本発明の医薬組成物を被験体に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、齧歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。

例えば抗体又は融合タンパク質を発現できるリポソーム、微粒子マイクロカプセル、組み換え細胞内へのカプセル化；受容体仲介性エンドサイトーシス（例えばWu et al. (1987) “Receptor‐Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429‐4432を参照）；レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築等、様々な送達系が公知であり、本発明の組成物の投与に使用できる。

本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディを投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明の分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。更に、例えば吸入器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与を採用することもできる。例えば米国特許第６，０１９，９６８号；米国特許第５，９８５，３２０号；米国特許第５，９８５，３０９号；米国特許第５，９３４，２７２号；米国特許第５，８７４，０６４号；米国特許第５，８５５，９１３号；米国特許第５，２９０，５４０号；米国特許第４，８８０，０７８号；国際公開第９２／１９２４４号；国際公開第９７／３２５７２号；国際公開第９７／４４０１３号；国際公開第９８／３１３４６号；国際公開第９９／６６９０３号を参照（これらはそれぞれ、参照により本明細書に援用される）。

本発明はまた、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディを、上記分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディは、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験体への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディは、少なくとも５μｇ、より好ましくは少なくとも１０μｇ、少なくとも１５μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ又は少なくとも２００μｇの単位剤形で、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末として供給される。

凍結乾燥された本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディは、その元々のコンテナ内において２〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディは、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディの液体形態は、少なくとも１μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ又は少なくとも１００μｇ／ｍｌの濃度でこの分子が存在する気密性コンテナ内に供給される。

本明細書において使用される場合、医薬組成物の「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、一実施形態において：疾患によってもたらされる症状の低減；感染の症状（例えばウイルス負荷、発熱、疼痛、敗血症等）若しくは癌の症状（例えば癌細胞の増殖、腫瘍の存在、腫瘍転移等）を減弱させる疾患に起因する症状の減弱；これによる、疾患に罹患したヒトのＱＯＬの上昇；疾患を治療するために必要な他の投薬量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による別の投薬の効果の増強；疾患の進行の遅延；並びに／又は個体の生存期間の延長を含むがこれらに限定されない、有益な又は所望の結果を得るために十分な量である。

有効量は、１回又は複数回の投与で投与できる。本発明の目的のために、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、直接的又は間接的な、ウイルスの存在（又はその影響）の増殖の低減、並びにウイルス性疾患の進展の低減及び／又は遅延に十分な量である。いくつかの実施形態では、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、別の薬剤、化合物又は医薬組成物と組み合わせて達成してもしなくてもよい。従って「有効量」は、１つ又は複数の化学療法剤を投与する文脈で考えることができ、また単一の作用剤が、１つ又は複数の他の作用剤と組み合わせて所望の結果を達成できる又は所望の結果を達成する場合に、有効量で与えられているものと考えることができる。個別の必要量は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。抗体投与の典型的な用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／体重の単位用量を１回分又は複数回分含む。

障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディの量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディに関して、患者に投与される投薬量は典型的には、被験者の体重の、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ、少なくとも約１μｇ／ｋｇ、少なくとも約２μｇ／ｋｇ、少なくとも約５μｇ／ｋｇ、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ、少なくとも約２０μｇ／ｋｇ、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１５０ｍｇ／ｋｇ又はそれを超える量である。

別の実施形態では、患者は、上述のような予防的又は治療的有効量の本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディの１回又は複数回の用量を含む治療レジメンを投与され、この治療レジメンは、２日、３日、４日、５日、６日又は７日に亘って投与される。特定の実施形態では、治療レジメンは、予防的又は治療的有効量の本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディの用量を断続的に投与する（例えば所定の週の１日目、２日目、３日目及び４日目に投与し、同一の週の５日目、６日目及び７日目には、予防的又は治療的有効量の本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディの用量を投与しない）ことを含む。典型的には、１、２、３、４、５つ又はそれを超える治療のコースが存在する。各コースは、同一のレジメン又は異なるレジメンであってよい。

別の実施形態では、投与される用量は、本発明が包含するＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディの１日の予防的又は治療的有効量に到達するまで、１つ又は複数のレジメンの最初の１／４、最初の半分又は最初の２／３若しくは３／４に亘って（例えば４コース治療の第１、第２又は第３のレジメンに亘って）漸増する。

一実施形態では、患者に投与される本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディの投薬量は、単一作用剤による治療としての使用のために計算してよい。別の実施形態では、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディは、他の治療用組成物と併用され、患者に投与される投薬量は、このようなＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディを単一作用剤による治療として使用する場合よりも小さくなる。

ある具体的実施形態では、本発明の医薬組成物を、治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましい場合があり、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、シラスティック膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。

別の実施形態では、上記組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527‐1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez‐Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353‐365(1989); Lopez‐Berestein,同上、pp.317‐327参照）。

更に別の実施形態では、上記組成物は、放出制御系又は徐放系中で送達できる。１つ又は複数の本発明の分子を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号；国際公開第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained‐Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179‐189;Song et al.(1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long‐Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372‐397;Cleek et al.(1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‐854;及びLam et al. (1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759‐760を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される）。一実施形態では、放出制御系においてポンプを使用してよい（Langer, supra; Sefton,(1987)“Implantable Pumps,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201‐240;Buchwald et al.(1980)“Long‐Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,” Surgery 88:507‐516;及びSaudek et al.(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J. Med.321:574‐579参照）。別の実施形態では、分子の放出制御を達成するためにポリマー材料を使用できる（例えばMedical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984);Levy et al.(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled‐Release Diphosphonate,” Science228:190‐192;During et al.(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,” Ann. Neurol. 25:351‐356;Howard et al.(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion‐Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg. 7(1):105‐112）；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；国際公開第９９／１５１５４号；及び国際公開第９９／２０２５３号参照）。徐放性処方において使用されるポリマーの例としては、ポリ（２‐ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン‐コ‐酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物類、ポリ（Ｎ‐ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド類（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）類（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステル類が挙げられるが、これらに限定されない。更に別の実施形態では、放出制御系は、治療標的（例えば肺）の近傍に配置でき、従って全身用量の一部しか必要としない（例えばGoodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115‐138(1984)参照）。放出制御インプラントとして有用なポリマー組成物は、Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．に従って使用できる（米国特許第５，９４５，１５５号参照）。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性材料のインサイチュ放出制御の治療効果に基づく。埋入は一般に、治療的処置を必要とする患者の身体内のいずれの部位において実施できる。別の実施形態では、非ポリマー徐放系が使用され、この場合、被験体の身体内の非ポリマーインプラントを、薬剤送達系として使用する。身体内への埋入後、インプラントの有機溶媒が組成物から周辺の組織液中へと放散、分散又は浸出し、非ポリマー材料は徐々に凝集又は沈殿して、固体の微小細孔性マトリクスを形成する（米国特許第５，８８８，５３３号参照）。

放出制御系については、Ｌａｎｇｅｒ（1990,“New Methods Of Drug Delivery,” Science249:1527‐1533）による報告中で議論されている。１つ又は複数の本発明の治療剤を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号及び第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained‐Release Gel,” Radiotherapy & Oncology39:179‐189;Song et al.(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long‐Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology50:372‐397;Cleek et al.(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‐854;並びにLam et al.(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759‐760参照（これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

本発明の組成物が、本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディのポリペプチド鎖のうちの１つ又は複数をエンコードする核酸である、ある具体的実施形態では、この核酸は、この核酸がエンコードする三重特異性結合分子の発現を促進するために、この核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は直接注射によって、又は微粒子衝撃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくは遺伝子導入剤を用いてコーティングすることによって、又は細胞核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連鎖させて上記核酸を投与すること（例えばJoliot et al.(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.)88:1864‐1868を参照）等によって、上記核酸を投与することにより、インビボ投与できる。あるいは核酸を細胞内に導入して、相同遺伝子組み換えによる発現のためのホスト細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。

治療的又は予防的有効量の本発明のＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディを用いた被験体の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験体は、本発明の分子を用いて、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間に亘って週１回処置される。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、１日１回、１日２回又は１日３回投与できる。他の実施形態では、この医薬組成物は、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回投与できる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。

ここまで本発明を概説してきたが、以下の実施例を参照することにより、本発明は更に容易に理解されるだろう。これらの実施例は例示として提供されており、そうでないことが明記されていない限り本発明を制限することを意図したものではない。

実施例１ ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３二重特異性ダイアボディの産生及び特性
アロ‐ＭＬＲアッセイにおいて、Ｔ細胞を、ＨＬＡミスマッチ（Latchman, Y.E. et al. (2004) “PD‐L1‐Deficient Mice Show That PD‐L1 On T‐Cells, Antigen‐Presenting Cells, And Host Tissues Negatively Regulates T‐Cells.” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(29):10691‐10696; Wang, W. et al. (2008) “PD‐L1/PD‐1 Signal Deficiency Promotes Allogeneic Immune Responses And Accelerates Heart Allograft Rejection,” Transplantation 86(6):836‐44）又は***促進／薬理学的刺激に応答して増殖するよう誘導する。共刺激分子を標的とするアゴニスト抗体は、Ｔ細胞シグナリングの再強化、及びＴ細胞エフェクタ機能を促進する転写因子の安定化によって、増殖応答を誘導することが知られている（Melero, I. et al. (2013) “Agonist Antibodies to TNFR Molecules That Costimulate T and NK Cells,” Clin. Cancer Res. 19(5):1044‐1053）。同様に、Ｔ細胞応答を下方調節する重要なチェックポイント分子を標的とするアンタゴニスト抗体は、Ｔ細胞シグナリング及びエフェクタ機能の維持、並びにそれによる抗腫瘍免疫の改善によって、増殖応答を誘導できる（Capece, D. et al. (2012) “Targeting Costimulatory Molecules to Improve Antitumor Immunity,” J. Biomed. Biotech. 2012:926321）。同種抗原に応答しての増殖における、共刺激又はチェックポイント標的に対するモノクローナル抗体の影響は、以下の³Ｈ‐チミジンの取り込みによる続く短期混合リンパ球（アロ‐ＭＬＲ）反応において容易に測定できる。チェックポイント阻害剤に対して抗体が増殖を増強する能力を扱うために、ベンチマーク抗ＰＤ‐１又は抗ＬＡＧ‐３ ｍＡｂを産生し、精製し、アロ‐ＭＬＲアッセイの開始時に、２０、１０、５、２．５及び１．２５μｇ／ｍｌの量で外因的に添加した（図５）。５〜６日目の終わりに、９６ウェルプレートに³Ｈ‐チミジンを送り込み、１８時間培養して増殖を測定した。ヒトＰＤ‐１、ＬＡＧ‐３及びＣＴＬＡ‐４に対するいくつかのベンチマーク抗体を、アロ抗原刺激に応答してのＴ細胞増殖を増強する能力において評価した。図６に示すように、アロＭＬＲアッセイの開始時におけるＰＤ‐１ ｍＡｂ １（５Ｃ４；ＢＭＳ‐９３６５５８）、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２（ＭＫ‐３４７５；Ｍｅｒｃｋ、ランブロリズマブ）及びＰＤ‐１ ｍＡｂ ３（ＥＨ１２．２Ｈ７；Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ）の添加は、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体、又はレスポンダ及びスティミュレータを含有する対照ウェルに比べて強いＴ細胞増殖応答を誘起した。照射した刺激細胞のみを含有するウェルは、増殖を示さなかった。用量依存性増殖応答が観察されたものの、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ４（ＣＴ‐０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ、ＢＡＴ‐１）は、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １（５Ｃ４；ＢＭＳ‐９３６５５８）、ＰＤ‐１ ｍＡｂ ２（ＭＫ‐３４７５；Ｍｅｒｃｋ、ランブロリズマブ）又はＰＤ‐１ ｍＡｂ ３（ＥＨ１２．２Ｈ７；Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ）に比べて最小の増殖を示した。ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １（２５Ｆ７；ＢＭＳ‐９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）についてもわずかな用量依存性増殖応答が観察され、これを同様にＹｅｒｖｏｙ（登録商標）イピリムマブ、抗ＣＴＬＡ‐４ ｍＡｂ（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ‐Ｓｑｕｉｂ）と比較した。

ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １（２５Ｆ７；ＢＭＳ‐９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）と同時に与えられたＰＤ‐１ ｍＡｂ １（５Ｃ４；ＢＭＳ‐９３６５５８）の、動物モデルにおいて強力な抗腫瘍免疫を誘発するにあたっての、これらの抗体を単独で与える場合（Woo, S.R. et al. (2012) “Immune Inhibitory Molecules LAG‐3 And PD‐1 Synergistically Regulate T‐Cell Function To Promote Tumoral Immune Escape,” Cancer Res. 72(4):917‐927）に比べて際立った有効性は、組み合わせて与えられたベンチマークｍＡｂが、いずれかの抗体単独よりも、アロ誘起型Ｔ細胞増殖を大幅に増強し得ることを示唆した。図７に示すように、抗ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ（２５Ｆ７）を、単独の場合又は抗ＰＤ‐１ ｍＡｂ（ＰＤ‐１ ｍＡｂ１（５Ｃ４（ＢＭＳ‐９３６５５８）若しくはＰＤ‐１ ｍＡｂ ２（ＭＫ‐３４７５；Ｍｅｒｃｋ、ランブロリズマブ））と組み合わせた場合の増殖能力に関して評価した。既に観察されたように、抗ＰＤ‐１ ｍＡｂは、強力な増殖を用量依存的に誘起した。対照的に、いずれかの抗ＰＤ‐１ ｍＡｂと共に抗ＬＡＧ‐３ ｍＡｂを提供すると、抗ＰＤ‐１ ｍＡｂ単独で観察されたものを超えて増強された増殖は誘起されなかった。抗ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ単独では、アイソタイプＩｇＧ１対照又はレスポンダ＋スティミュレータ対照ウェルに比べて、ごくわずかなＴ細胞増殖しか示さなかった。

抗ＬＡＧ‐３ ｍＡｂが単独で又は組み合わせで、抗ＰＤ‐１ ｍＡｂで観察されたものを超えて増殖を誘起できないことは、アロ‐ＭＬＲアッセイ中にＴ細胞上にＬＡＧ‐３発現が存在しないこと、又は抗ＬＡＧ‐３ ｍＡｂがＬＡＧ‐３に結合して下方シグナルカスケードをブロックしないことを示唆していた。ＬＡＧ‐シグナル伝達を誘起する能力をアッセイするために、可溶性ヒトＬＡＧ‐３タンパク質（「ｓｈＬＡＧ‐３」）をアロ‐ＭＬＲに添加し、抗ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ及び／又は抗ＰＤ‐１ ｍＡｂと比較した。図８に示すように、ＡＰＣ及びＣＤ４Ｔ細胞の両方において発現するヒトＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する可溶性ヒトＬＡＧ‐３が、ＩｇＧアイソタイプ又はレスポンダ＋スティミュレータ対照ウェルに比べて、ロバストな増殖応答を誘起した。ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １（２５Ｆ７；ＢＭＳ‐９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）の添加は、可溶性ヒトＬＡＧ‐３タンパク質の増殖効果をブロックしないようであり、また、わずかな用量依存性増殖応答が観察されたため、わずかに増強されたＴ細胞増殖を有し得る。過去の観察と矛盾することなく、抗ＰＤ‐１ ｍＡｂは、可溶性ヒトＬＡＧ‐３タンパク質及び／又はＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １（２５Ｆ７；ＢＭＳ‐９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）の両方の添加によって更に増強された、強力なＴ細胞増殖を誘起した。抗ＰＤ‐１抗体へのアイソタイプＩｇＧ１対照の添加は、Ｔ細胞増殖を、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １（５Ｃ４（ＢＭＳ‐９３６５５８））単独で観察されたものを超えて増強しなかった。可溶性ＬＡＧ‐３が、抗ＬＡＧ‐３ ｍＡｂが存在する場合でさえ強力Ｔ細胞増殖を誘起する能力は、不明である。１つの可能性としては、抗ＬＡＧ‐３ ｍＡｂが単に、可溶性ＬＡＧ‐３ ｍＡｂが誘起する強い増殖シグナルをブロックできないというものがある。代替案（ただし相互に排他的な可能性では必ずしもない）としては、可溶性ヒトＬＡＧ‐３タンパク質と抗ＬＡＧ‐３とが共に、増殖応答を更に強化できる免疫架橋複合体を形成するというものがある。

可溶性ＬＡＧ‐３がＴ細胞増殖を強化できることは、抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ両方を近接して導入することにより、アロ‐ＭＬＲアッセイ内でＴ細胞増殖応答が増強され得ることを示唆していた。この可能性を扱うために、ベンチマーク抗ＰＤ‐１及び抗ＬＡＧ‐３ ｍＡｂを、二重親和性再標的化（ｄｕａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ＤＡＲＴ（登録商標））‐二重特異性フォーマット内で、２つの配向：ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １（２５Ｆ７；ＢＭＳ‐９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）‐ＰＤ‐１ ｍＡｂ １（５Ｃ４（ＢＭＳ‐９３６５５８）二重特異性４価Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ（ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）‐１）及びＰＤ‐１ ｍＡｂ １（５Ｃ４（ＢＭＳ‐９３６５５８）‐ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １（２５Ｆ７；ＢＭＳ‐９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）二重特異性４価Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ（ＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）‐１において構成した。アロ‐ＭＬＲの開始時に、両方のＦｃ‐ＤＡＲＴ（登録商標）フォーマットを（上述の用量依存的な様式で）外因的に添加し、そのＴ細胞増殖能力に関して評価した。

図９Ａ〜９Ｂに示すように、ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディは両方とも、ＰＤ‐１ ｍＡｂ １（５Ｃ４（ＢＭＳ‐９３６５５８）及び／又はＬＡＧ‐３ ｍＡｂ １（２５Ｆ７；ＢＭＳ‐９８６０１６、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＢＭＳ）によって得られるものよりも、驚くほど強力なＴ細胞増殖応答を誘起した。可溶性ヒトＬＡＧ‐３（「ｓｈＬＡＧ‐３」）もまた、アロ‐ＭＬＲアッセイ内で強いＴ細胞増殖を示した。ＤＡＲＴ（登録商標）及び可溶性ヒトＬＡＧ‐３タンパク質の両方が誘起した強い増殖シグナルは、抗ＰＤ‐１ ｍＡｂ又は抗ＬＡＧ‐３ ｍＡｂ単独の寄与を最小化した。抗ＰＤ‐１及びＬＡＧ‐３ ｍＡｂは、ＩｇＧ１アイソタイプ対照又は応答因子＋刺激因子ウェル単独で観察されたものを超えて、用量依存的にＴ細胞増殖を誘起したが、抗ＰＤ‐１と抗ＬＡＧ‐３との組み合わせは、これら単独でよりも増強された増殖を示し、これは、過去の文献中の報告が実証している通りの機能的相乗効果を示唆している（Wang, W. et al. (2008) “PD‐L1/PD‐1 Signal Deficiency Promotes Allogeneic Immune Responses And Accelerates Heart Allograft Rejection,” Transplantation 86(6):836‐44; Melero, I. et al. (2013) “Agonist Antibodies to TNFR Molecules That Costimulate T and NK Cells,” Clin. Cancer Res. 19(5):1044‐1053; Capece, D. et al. (2012) “Targeting Costimulatory Molecules to Improve Antitumor Immunity,” J. Biomed. Biotech. 2012:926321）。

本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。

配列表の数字見出し＜２２３＞の記載は以下のとおりである。
配列番号１：シグナル配列を含むヒトＰＤ‐１
配列番号２：抗ＰＤ‐１抗体 ｍＡｂ １の重鎖可変ドメイン
配列番号３：抗ＰＤ‐１抗体 ｍＡｂ １の軽鎖可変ドメイン
配列番号４：ヒト化抗ＰＤ‐１抗体 ｍＡｂ ２の重鎖可変ドメイン
配列番号５：ヒト化抗ＰＤ‐１抗体 ｍＡｂ ２の軽鎖可変ドメイン
配列番号７：抗ＰＤ‐１抗体 ｍＡｂ ３の軽鎖可変ドメイン
配列番号８：ヒト化抗ＰＤ‐１抗体 ｍＡｂ ４の重鎖可変ドメイン
配列番号９：ヒト化抗ＰＤ‐１抗体 ｍＡｂ ４の軽鎖可変ドメイン
配列番号１０：シグナル配列を含むヒトＬＡＧ‐３（ＣＤ２２３）タンパク質
配列番号１１：抗ＬＡＧ‐３抗体は ｍＡｂ １の重鎖可変ドメイン
配列番号１２：抗ＬＡＧ‐３抗体は ｍＡｂ １の軽鎖可変ドメイン
配列番号１３：リンカー１
配列番号１４：ヘテロ二量体促進Ｅコイルドメイン
配列番号１５：ヘテロ二量体促進Ｋコイルドメイン
配列番号１６：システイン含有ヘテロ二量体促進Ｅコイルドメイン
配列番号１７：システイン含有ヘテロ二量体促進Ｋコイルドメイン
配列番号１８：システイン含有スペーサペプチド
配列番号１９：システイン含有リンカーペプチド
配列番号２０：他のシステイン含有リンカーペプチド
配列番号２１：ＩｇＧ１ Ｆｃ領域
配列番号２２：「ノブ担持」ＩｇＧ１ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
配列番号２３：「ホール担持」ＩｇＧ１ ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
配列番号２４：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異ＩｇＧ１ Ｆｃ領域
配列番号２５：例示的なＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３Ｆｃ‐ＤＡＲＴ−１ダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖
配列番号２６：例示的なＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３Ｆｃ‐ＤＡＲＴ−１ダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２７：例示的なＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３Ｆｃ‐ＤＡＲＴ−１ダイアボディの第２及び第４のポリペプチド鎖
配列番号２８：例示的なＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３Ｆｃ‐ＤＡＲＴ−１ダイアボディの第２及び第４のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号２９：例示的なＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３Ｆｃ‐ＤＡＲＴ−２ダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖
配列番号３０：例示的なＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３Ｆｃ‐ＤＡＲＴ−２ダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド
配列番号３１：例示的なＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３Ｆｃ‐ＤＡＲＴ−２ダイアボディの第２及び第４のポリペプチド鎖
配列番号３２：例示的なＰＤ‐１ｘＬＡＧ‐３Ｆｃ‐ＤＡＲＴ−２ダイアボディの第２及び第４のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチド

Claims (15)

1. ＰＤ‐１のエピトープ及びＬＡＧ‐３のエピトープに対して免疫特異的に結合できる二重特異性Ｆｃダイアボディであって、
   前記ダイアボディは、アミノ末端及びカルボキシ末端をそれぞれ有する４つの第１乃至第４のポリペプチド鎖を含み：
   （Ａ）前記第１のポリペプチド鎖及び前記第２のポリペプチド鎖は互いに共有結合し、前記第１のポリペプチド鎖及び前記第３のポリペプチド鎖は互いに共有結合し、また前記第３のポリペプチド鎖及び前記第４のポリペプチド鎖は互いに共有結合し；
   （Ｂ）前記ダイアボディの前記第１のポリペプチド鎖及び前記第３のポリペプチド鎖はそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端への方向に、ＰＤ‐１又はＬＡＧ‐３に対して免疫特異的である抗体の軽鎖可変ドメイン、ＬＡＧ‐３又はＰＤ‐１に対して免疫特異的である抗体の重鎖可変ドメイン、ヘテロ二量体促進ドメイン、及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含み、前記軽鎖可変ドメイン及び前記重鎖可変ドメインは、前記ＰＤ‐１のエピトープ又は前記ＬＡＧ‐３のエピトープに結合できるエピトープ結合部位を形成するために連結できず；
   （Ｃ）前記ダイアボディの前記第２のポリペプチド鎖及び前記第４のポリペプチド鎖はそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＰＤ‐１又はＬＡＧ‐３に対して免疫特異的である抗体の軽鎖可変ドメイン、ＬＡＧ‐３又はＰＤ‐１に対して免疫特異的である抗体の重鎖可変ドメイン、及びヘテロ二量体促進ドメインを含み、前記軽鎖可変ドメイン及び前記重鎖可変ドメインは、前記ＰＤ‐１のエピトープ又は前記ＬＡＧ‐３のエピトープに結合できるエピトープ結合部位を形成するために連結できず；
   Ｉ．（１）前記第１のポリペプチド鎖の前記軽鎖可変ドメイン及び前記第２のポリペプチド鎖の前記重鎖可変ドメインは、連結して第１のエピトープ結合部位を形成し、前記第１のポリペプチド鎖の前記重鎖可変ドメイン及び前記第２のポリペプチド鎖の前記軽鎖可変ドメインは、連結して第２のエピトープ結合部位を形成し；且つ
   （２）前記第３のポリペプチド鎖の前記軽鎖可変ドメイン及び前記第４のポリペプチド鎖の前記重鎖可変ドメインは、連結して第３のエピトープ結合部位を形成し、前記第３のポリペプチド鎖の前記重鎖可変ドメイン及び前記第４のポリペプチド鎖の前記軽鎖可変ドメインは、連結して第４のエピトープ結合部位を形成し；
   形成された前記エピトープ結合部位のうちの２つは、前記ＰＤ‐１のエピトープに免疫特異的に結合でき、形成された前記エピトープ結合部位のうちの２つは、前記ＬＡＧ‐３のエピトープに免疫特異的に結合でき；
   ＩＩ．（１）前記第１及び第３のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインは配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記第２及び第４のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列を含むか；
   （２）前記第１及び第３のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列を含み、前記第２及び第４のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインは配列番号１４のアミノ酸配列を含むか；
   （３）前記第１及び第３のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインは配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記第２及び第４のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインは配列番号１７のアミノ酸配列を含むか；又は
   （４）前記第１及び第３のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインは配列番号１７のアミノ酸配列を含み、前記第２及び第４のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインは配列番号１６のアミノ酸配列を含み、
   ＩＩＩ．前記第１のポリペプチド鎖及び前記第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、連結してＦｃドメインを形成する、二重特異性Ｆｃダイアボディ。
2. 前記第１のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインは配列番号１４を含み、前記第２のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインは配列番号１５を含む、請求項１に記載の二重特異性Ｆｃダイアボディ。
3. 前記第１のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインは配列番号１６を含み、前記第２のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体促進ドメインは配列番号１７を含む、請求項１に記載の二重特異性Ｆｃダイアボディ。
4. 前記第１のポリペプチド鎖及び前記第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインはそれぞれ、配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二重特異性Ｆｃダイアボディ。
5. ＬＡＧ‐３に対して免疫特異的である抗体の前記重鎖可変ドメインは、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
   ＬＡＧ‐３に対して免疫特異的である抗体の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重特異性Ｆｃダイアボディ。
6. ＰＤ‐１に対して免疫特異的である抗体の前記重鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、
   ＰＤ‐１に対して免疫特異的である抗体の前記軽鎖可変ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性Ｆｃダイアボディ。
7. （Ａ）前記第１のポリペプチド鎖及び前記第３のポリペプチド鎖はそれぞれ、ＰＤ‐１に対して免疫特異的である抗体の軽鎖可変ドメイン、及びＬＡＧ‐３に対して免疫特異的である抗体の重鎖可変ドメインを含み；
   （Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖及び前記第４のポリペプチド鎖はそれぞれ、ＬＡＧ‐３に対して免疫特異的である抗体の軽鎖可変ドメイン、及びＰＤ‐１に対して免疫特異的である抗体の重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性Ｆｃダイアボディ。
8. （Ａ）前記第１のポリペプチド鎖及び前記第３のポリペプチド鎖はそれぞれ、ＬＡＧ‐３に対して免疫特異的である抗体の軽鎖可変ドメイン、及びＰＤ‐１に対して免疫特異的である抗体の重鎖可変ドメインを含み；
   （Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖及び前記第４のポリペプチド鎖はそれぞれ、ＰＤ‐１に対して免疫特異的である抗体の軽鎖可変ドメイン、及びＬＡＧ‐３に対して免疫特異的である抗体の重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性Ｆｃダイアボディ。
9. 有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載のＦｃダイアボディと、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
10. 前記二重特異性Ｆｃダイアボディの前記有効量は、治療を必要とするレシピエント個体の癌を治療するために有効な量である、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記癌は：副腎癌；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；発色性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；胆嚢若しくは胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫；カポジ肉腫；腎臓癌；白血病；脂肪肉腫／悪性リポソーム腫瘍；肝臓癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；乳頭状甲状腺癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮細胞癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移性癌；又は子宮癌である、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記二重特異性Ｆｃダイアボディの前記有効量は、治療を必要とするレシピエント個体の、病原体の存在に関連する疾患を治療するために有効な量である、請求項９に記載の医薬組成物。
13. 前記病原体は、細菌、真菌又はウイルスである、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 癌の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性Ｆｃダイアボディ、又は請求項１０又は１１に記載の医薬組成物の使用。
15. 病原体の存在に関連する疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜８のいずれか１項に記載の二重特異性Ｆｃダイアボディ、又は請求項１２又は１３に記載の医薬組成物の使用。

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