KR20050082389A - 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체를 포함하는 장기이식합병증 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 또는 부가적으로 당화된 이량체 단백질을 포함하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체를 포함하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질을 포함하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
조직 또는 장기의 이식에는 (1) 자가이식(autotransplantation) - 한 개체의 일부를 동일한 개체의 다른 부분에 이식; (2) 동계이식(isotransplantation) - 동일한 균일계 동물간에 행해지는 이식으로, 예를 들면, 일란성 쌍생아간에 행해지는 이식; (3) 동종이식(allotransplantation) - 유전적 조성이 다른 두 개체간에 행해지는 이식으로, 예를 들면, 이란성 쌍생아간의 이식 또는 혈연관계가 전혀 없는 개체간의 이식 및 (4) 이종이식(xenotransplantation) - 서로 다른 동물 종 개체간의 이식으로, 예를 들면, 침팬지 또는 돼지의 조직 또는 장기를 인간에게 이식하는 것 등이 있다.
조직 또는 장기 이식에 의한 질환 치료에 있어서, 가장 큰 문제점은 수령자(recipient)가 공여자(donor)로부터 조직 또는 장기를 이식받은 후에 심각한 장기이식 합병증을 보인다는 것이다. 장기이식 합병증이란, 이식편(이식되는 생체의 일부로 세포, 조직 또는 장기)의 공여자와 수령자간의 유전적 배경이 상이함에 따라(즉, 동종이식 또는 이종이식), 서로를 이물질로 인식하여 배제하려는 면역반응을 의미한다. 이러한 장기이식 합병증은 T 세포로 대표되는 면역담당 세포에 의한 세포성 면역과 항체에 의한 체액성 면역이 복잡하게 제휴된 형태로 일어나지만, 주로 T 세포에 의한 세포성 면역이다.
따라서 장기이식 합병증을 치료하기 위하여 하나의 방법으로 T 세포의 활성을 억제하는 하기 화합물들이 사용되고 있다. 예를 들면, 사이클로스포린(cyclosporin; CsA), 타크롤리무스(tacrolimus; FK-506), 아자티오프린(azathioprine; AZ), 미코페놀산 모페틸(mycophenolate mofetil; MMF), 미조리빈(mizoribine; MZ), 레플루노마이드(leflunomide; LEF), 프레도니졸론(predonisolon) 또는 메틸플레도니졸론(methylpredonisolon) 등의 부신피질 스테로이드, 시롤리무스(sirolimus), 데옥시퍼구알린(deoxypergualin; DGS) 및 FTY720(화학명칭 : 2-아미노-2-[2-(4-옥틸페닐)에틸]-1,3-프로판디올 히드로클로라이드) 등이다.
장기이식 합병증을 치료하기 위하여 다른 방법으로 T 세포의 활성을 억제하는 CTLA4의 가용성 영역과 면역글로불린의 Fc 조각이 결합된 융합 단백질(미국특허 제5,844,095호)이 임상 이용되고 있다. 일반적으로 T 세포의 활성에는 항원 제공 세포(Antigen Presenting Cell, APC)에 의해 제공되는 두 가지 신호가 필요하다. 첫 번째는 APC의 MHC에 의해 항원이 제공되는 것으로, T 세포 수용체/CD3 복합체가 인식하는 신호이고, 이러한 신호에 의해 MHC/항원 복합체를 인식하는 특정한 T 세포의 활성(activation)이 유도된다. 두 번째는 동시자극 시그날(costimulation signal)이라고도 알려져 있으며, T 세포의 분화(proliferation)를 유도한다. 이 신호는 APC의 B7에 의해 매개되며 T 세포는 B7을 인식하는 두 가지의 리간드가 있다. 첫 번째는 CD28이라고 하며, 이는 T 세포막에 항상 발현된다. CD28이 B7과 결합하면 IL-2의 분비와 T 세포의 분화를 유도한다. 두 번째 리간드는 CTLA4라고 하며, 이는 CD28과 상동성(homology)을 가지고 있으며 T 세포가 활성화된 이후에 발현이 된다. CTLA4는 B7에 대한 결합력이 CD28의 20배 정도 강력하며 이는 T 세포의 활성을 중지시킨다. 따라서 CTLA4 단백질은 B7/CD28의 신호를 차단하는 효과적인 물질로 사용될 수 있다.
한편, 이와 같이 면역반응을 억제함에 있어서 유효작용부위인 CTLA4의 세포외역 부위를 다가화 혹은 다량체화하면 그 효능의 증가를 예상할 수 있는데, 이러한 목적으로 CTLA4의 세포외역 부위를 면역글로불린의 중쇄와 연결한 융합된 단량체 단백질(중쇄융합단백질)과 CTLA4의 세포외역 부위를 면역글로불린의 경쇄와 연결한 융합된 단량체 단백질(경쇄융합단백질)을 동시에 한 세포주내에서 발현시키면 중쇄와 경쇄간의 결합에 의하여 이량체 구조의 융합 단백질을 제조할 수 있다. 이때 이량체는 유효부위가 생체내에서와 동일하게 병렬 배열된 형태로 제조되고 그 효능은 종래의 단량체에 비하여 현저히 증가됨이 제시된 바 있다.
그러나 상기와 같은 면역글로불린 융합 단백질의 제조방법은 융합 단백질을 제조할 때에 중쇄와 경쇄 각각에 융합시킨 두 개의 유전자를 동시에 생산 세포주에 주입해야하고, 세포가 두 종류의 융합 단백질을 생산할 때 두 단백질의 생산수율이 현저히 떨어지며, 생산된 중쇄융합단백질과 경쇄융합단백질들이 100% 결합되지 않아 단량체인 중쇄융합단백질 또는 경쇄융합단백질로부터 중쇄융합단백질과 경쇄융합단백질의 융합된 이량체를 순수 분리하는 공정 등의 기술적 곤란으로 인하여 실용화되기가 어려운 문제점이 있다. 이러한 이유 등으로 지금까지는 면역글로불린 융합 단백질 제제는 두 개의 융합단백질이 단순히 서로 병렬 배열된 이량체 형태로 제조 사용되고 있었다.
본 발명자들은 상기와 같은 병렬 형태의 면역접합체가 가진 문제점들을 해결한 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체를 대한민국 특허출원 제10-2001-0045028호 및 제10-2002-0045921호에 개시하였다. 이에, 본 발명자들은 장기이식 합병증을 앓고 있는 개체에게 상기 특허문헌에 개시된 직렬 연쇄체(concatamer)를 갖는 면역접합체를 투여한 결과, 상기 개체의 생존율이 증가됨을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명은 한 관점으로서 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질을 포함하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.
다른 관점으로서 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합되고 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질을 포함하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "장기이식 합병증(Transplantation Rejection)"이란, 이식편(이식되는 생체의 일부로 세포, 조직 또는 장기)의 공여자와 수령자간의 유전적 배경이 상이하여 (1) 공여자의 이식편 유래 면역 세포가 수령자를 외부물질로 인식하여 공격함으로써 유발되는 질환(즉, 이식편대 숙주질환) 및 (2) 수령자가 공여자의 이식편을 외부물질로 이식하여 공격함으로써 유발되는 질환(즉, 이식편 거부반응)을 의미한다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물들은 이들을 모두 치료 대상으로 한다.
특히, 이종 이식 또는 인공 장기 이식의 경우, 수령자와 공여자 간의 유전적 배경이 매우 상이하기 때문에 장기이식 합병증이 두드러지게 나타난다. 일례로, 돼지의 이종 이식편을 인간에게 이식하는 경우에는 초급성 거부반응이 일어나 이식편은 수분 내로 괴사 탈락하게 된다. 본 발명에서는 상기 이종 이식 뿐만 아니라 인공 장기 이식에 의한 합병증들을 또한 치료 대상으로 한다.
"이식편대 숙주질환(Graft-Versus-Host-Disease; GVHD)"은 특히, 골수이식에 의해 발병하는데, 공여자의 이식편에서 유래된 T 세포가 수령자의 조직 또는 기관을 이물질로 인식하여 공격함으로써 나타나는 질환으로, 급성 또는 만성으로 나눌 수 있다. 급성 GVHD는 일반적으로 이식 후 7~100일에 발생하는데, 조직적합성 항원이 불일치하거나 환자의 나이가 많은 경우에 더욱 심각해진다. 이 때에는 이식편의 T 세포가 수령자의 피부(예: 발진, 통증, 가려움, 수포현상), 간(예: 황달, 간기능 이상), 위장관(예: 설사, 출혈) 등에 영향을 미친다. 만성 GVDH는 장기 생존자 중 17~42%에게서 발생하며, 증상이 자가면역질환과 유사하다. 상기 급성 GVDH와 마찬가지로 피부, 위장관, 간에 각종 합병증이 나타나고 폐와 눈에도 합병증이 유발되며, 심각한 경우에 결막건조증상, 면역기능 파괴로 인한 치명적 감염증이 유발되기도 한다.
"이식편 거부반응(Graft Rejection)"은 수령자가 이식편을 이물질로 인식함으로써 수령자의 면역계가 그 이식편을 공격함으로써 유발되는 질환으로, 시기별로 (1) 이식 직후에 일어나는 강한 거부반응인 초급성 거부반응, (2) 이식 후 수개월 이내에 보이는 급성 거부반응 및 (3) 이식 후 수개월 이후에 보이는 만성 거부반응으로 나눌 수 있다. 통상적으로 조직 또는 장기 이식받은 수령자는 발열, 백혈구 수 증대, 권태감 등의 전신증상 뿐만 아니라, 이식편 부근에서 종창 또는 압통을 보인다. 최종적으로 이식편은 괴사 탈락하게 된다.
앞서 주지된 바와 같이 이러한 장기이식 합병증(이식편 숙주질환 및 이식편 거부반응)들은 모두 면역세포의 활성과 밀접한 관계가 있기 때문에 본 발명자들에 의해 개발된 면역세포의 증식을 억제하는 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체(대한민국 특허출원 제10-2001-0045028호 및 제10-2002-0045921호)를 이용하여 치료할 수 있다. 즉, 상기 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체는 면역세포의 활성을 억제함으로써 면역반응 그 자체의 억제 뿐만 아니라 부수적으로 발생하는 각종 질환을 완화, 경감 또는 완치할 수 있다.
따라서 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질을 포함하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
추가로, 본 발명자들은 본 발명에 따른 약제학적 조성물이 상이한 둘 이상의 이량체 단백질을 포함하는 경우, 장기이식 합병증의 치료 효과가 더욱 증가되는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 보다 바람직한 양태는 (1) 제 1 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 및 (2) 제 2 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질을 포함하되, 상기 제 1 면역반응에 관여하는 단백질과 상기 제 2 면역반응에 관여하는 단백질이 상이한 것임을 특징으로 하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물일 것이다.
한편, 당업계에 공지된 바와 같이 부가적으로 당화된 단백질은 물리적 성질은 물론 생체 내에서의 안정성 및 기능도 개선된다. 따라서 본 발명에 따른 약제학적 조성물이 당화된 면역접합체를 포함하게 되면 장기이식 합병증에 대한 치료 효과는 더욱 증가할 것이다.
이에, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합되고 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질을 포함하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명자들은 본 발명에 따른 약제학적 조성물이 상이한 둘 이상의 당화된 이량체 단백질을 포함하는 경우, 장기이식 합병증의 치료 효과가 더욱 증가되는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 보다 바람직한 양태는 (1) 제 1 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합되고 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 및 (2) 제 2 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합되고 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질을 포함하되, 상기 제 1 면역반응에 관여하는 단백질과 상기 제 2 면역반응에 관여하는 단백질이 상이한 것임을 특징으로 하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물일 것이다.
직렬 연쇄 융합된 면역접합체에 대한 용어 정의
본원 명세서에 사용된 용어 "면역반응에 관여하는 단백질"은 세포성 및 체액성 면역반응에서 세포간 신호 전달 과정을 담당하여 면역반응을 활성화 또는 억제시키는 단백질을 총칭한다. 면역이란 세균 또는 바이러스 등의 자신이 아닌 것으로부터 자신을 보호하는 과정이다. 면역반응은 세포성 및 체액성 면역반응으로 나눌 수 있으며, T 세포와 B 세포 등의 림프구가 가장 중요한 역할을 한다. T 세포는 주로 세포성 면역반응을 주관하며 바이러스에 감염된 세포 또는 암세포 등을 직접적으로 공격하여 죽이기도 하고 면역 또는 염증 반응을 활성화시키는 사이토카인이라는 물질을 분비하여 다른 면역세포의 작용을 돕기도 한다. B 세포는 세균과 바이러스 등의 자신이 아닌 외부의 물질(항원)이 체내에 들어올 경우 항체를 만들어 이를 몰아내도록 하여 이를 체액성 면역반응이라 한다. 세포성 면역과 체액성 면역 모두에서는 세포간의 신호 전달이 매우 필수적인 과정이며 이 과정에서 세포내 신호전달을 담당하는 세포표면 수용체 단백질과 이 수용체에 결합하는 신호물질인 리간드 단백질이 작용한다.
본 발명에 따른 면역반응에 관여하는 단백질의 대표적인 예로는 사이토카인, 사이토카인 수용체, 세포표면 수용체 및 세포표면 수용체를 인식하는 단백질 등이 포함된다. 이와 같은 단백질의 구체적인 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, TNF, G-CSF, M-CSF, IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-7R, IL-12R, IL-18R, G-CSFR, M-CSFR, Fas(Apo 1), CD4, CD22, CD27, CD28, CD30, CD31, CD40, CD44, CD54, CD70, CD80, CD86, CD95, CD100, CD119, CD130, CD137, CD154, CD166, ICOS, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, PD-1, OX40, 4-1BB, B7H 등이 포함된다. 전술한 단백질 각각의 생체내 역할은 당업계에 알려져 있으며, 모두 장기이식 합병증을 유발하는 면역반응을 억제하는데 이용될 수 있다.
본원 명세서에 사용된 용어 "세포외역 가용성 부위(soluble extracellular domain)"는 인지질로 구성된 세포막을 관통하는 단백질(integral protein)에서 소수성 아미노산으로 구성되어 있어 세포막을 통과하는 부분(transmembrane domain)을 기준으로 세포외부로 노출되어 있는 부분을 가리킨다. 이 부위는 대부분 친수성 아미노산이 단백질 표면으로 향하는 구조(folding)를 하고 있어서 수용액상에서 가용성(soluble)을 나타낸다. 대부분의 세포표면 수용체 단백질에서 리간드와 결합하는 기능을 담당하는 것은 세포외역 부위이며 세포내역 부위(intracellular domain)는 세포내 신호전달 기능을 담당하고 있다.
본원 명세서에 사용된 용어 "면역글로불린"은 다양한 종류의 항원을 특이적으로 인식하도록 B 세포에 의해 생성되고 B 세포의 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 가리킨다. 이 분자는 Y 모양으로 두 개의 동일한 경쇄와 두 개의 동일한 중쇄로 구성된다. 경쇄와 중쇄 모두는 가변 및 고정 영역을 포함한다. 4개의 쇄는 힌지 영역이라고 하는 중쇄의 플렉서블 영역(flexible region)에 위치한 디설파이드 결합에 의해 함께 고정되어 있다. 중쇄와 경쇄 모두의 가변 영역은 결합하여 두 개의 동일한 항원-결합 부위를 형성한다. 중쇄 고정 영역에 의해 면역글로불린A(IgA), D(IgD), E(IgE), G(IgG) 및 M(IgM)인 다섯개 부류로 나누어진다. 각각의 부류는 이소타입이라고 하며 독특한 구조적 특징과 상이한 생물학적 특성을 갖고 있다. 예를 들면, IgG는 Fc 구조에서 다른 이소타입과 약간 상이하다. 또한, IgG 및 IgA는 많은 아부류가 있다. 예를 들면, 인간 IgG 이소 타입내에 4가지의 아부류 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 있으며 각각은 γ1, γ2, γ3 및 γ4 중쇄를 갖는다. 보체 활성화, 식세포-Fc 수용체에의 결합, 항원-의존 세포독성과 같은 면역글로불린 분자의 기능은 중쇄의 Fc 영역에 존재하는 구조적 결정소에 의해 매개된다. 이러한 중쇄의 Fc 영역은 본 발명에 따른 이량체 단백질의 구성 요소로서 사용되며 상기 모든 부류 또는 아부류의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다.
본원 명세서에 사용된 용어 "면역글로불린 Fc 조각"은 면역글로불린분자는 기능적으로 구분되는 조각들로 나누어지는데 이 가운데 항원 결합력은 없으나 쉽게 결정체를 형성하는 조각으로서 힌지 부위(hinge region), CH2와 CH3 도메인이 결합하여 이루어지고 항체에서 효과물질 및 세포들과의 결합에 관여하는 부분을 가리킨다. 따라서 본 발명과 관련하여 언급되는 Fc 조각은 일부 문헌에 기술된 바와는 다를 수 있으나 힌지 영역을 포함하며 이것은 단순히 본 발명을 설명하는데 있어 편리를 도모하기 위한 것으로 당업자는 본원 명세서 및 도면을 참고로 하여 충분히 이해할 것이다.
본원 명세서에 사용된 용어 "연쇄체 단백질"은 직렬 연쇄 융합된 단백질(즉, 두 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위가 연결되어 하나의 긴 폴리펩타이드를 형성하고 있는 형태)을 가리킨다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각의 힌지 부위에 결합된 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 C-말단(C-terminal)에 또 다른 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 N-말단(N-terminal)이 펩타이드 결합되어 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위 두 개가 하나의 긴 폴리펩타이드를 형성하고 있는 형태를 가리킨다.
본원 명세서에 사용된 용어 "단순 융합된 단량체 단백질"은 면역글로불린 Fc 조각의 힌지 부위에 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위가 결합하여 하나의 폴리펩타이드로 형성된 단량체 구조의 융합 단백질을 가리킨다. 단순 융합된 단량체 단백질은 편의상 "단백질 명칭/Fc"로 표기할 수 있다. 예를 들면 면역반응에 관여하는 단백질인 LAG3의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 조각이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질은 LAG3/Fc로 표기된다. 또한, 면역글로불린 Fc 조각의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각이 IgG1으로부터 유래된 경우에는 LAG3/IgG1Fc로 표기된다.
본원 명세서에 사용된 용어 "단순 융합된 이량체 단백질"은 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 구조의 융합 단백질을 가리킨다. 단순 융합된 이량체 단백질은 편의상 "[단백질 명칭/Fc]2"로 표기할 수 있다. 예를 들면 면역반응에 관여하는 단백질인 LAG3의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 조각이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 구조의 융합 단백질은 [LAG3/Fc]2로 표기된다. 마찬가지로, 면역글로불린 Fc 조각의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각이 IgG1으로부터 유래된 경우에는 [LAG3/IgG1Fc]2로 표기된다.
본원 명세서에 사용된 용어 "연쇄 융합된 단량체 단백질"은 단순 융합된 단량체 단백질에서 힌지 부위에 결합된 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 N-말단에 또 다른 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 C-말단이 직렬의 연쇄체 형태로 결합하여 하나의 폴리펩타이드로 형성된 단량체 구조의 융합 단백질을 가리킨다. 연쇄 융합된 단량체 단백질은 편의상 "단백질 명칭-단백질 명칭/Fc"로 표기할 수 있다. 예를 들면 면역반응에 관여하는 단백질 LAG3의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 조각이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질인 LAG3의 세포외역 가용성 부위에 또 다른 LAG3의 세포외역 가용성 부위가 결합된 연쇄 융합된 단량체 단백질은 LAG3-LAG3/Fc로 표기된다. 마찬가지로, 면역글로불린 Fc 조각의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각이 IgG1으로부터 유래된 경우에는 LAG3-LAG3/IgG1Fc로 표기된다.
본원 명세서에 사용된 용어 "연쇄 융합된 이량체 단백질"은 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 구조의 융합 단백질을 가리킨다. 연쇄 융합된 이량체 단백질은 편의상 "[단백질 명칭-단백질 명칭/Fc]2"로 표기할 수 있다. 예를 들면 면역반응에 관여하는 단백질 LAG3의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 조각이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질의 LAG3의 세포외역 가용성 부위에 또 다른 LAG3의 세포외역 가용성 부위가 결합된 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 구조의 융합 단백질은 [LAG3-LAG3/Fc]2로 표기된다. 마찬가지로, 면역글로불린 Fc 조각의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각이 IgG1으로부터 유래된 경우에는 [LAG3-LAG3/IgG1Fc]2로 표기된다.
앞서 주지된 바와 같이 연쇄체 단백질, 연쇄 융합된 단량체 단백질 및 연쇄 융합된 이량체 단백질은 모두 면역글로불린 Fc의 힌지에 세포외역 가용성 부위 두 개가 직렬 연결되어 형성된 것이다. 본 발명에 있어, 상기 세포외역 가용성 부위 두 개는 그들이 특이적으로 결합하는 단백질(target)이 동일한 것을 특징으로 하므로, 상기 두 개의 세포외역 가용성 부위의 아미노산 서열은 동일할 수도 있고 다를 수도 있다. 동일한 예에는 CTLA4-CTLA4/Fc, CD2-CD2/Fc, LAG3-LAG3/Fc, TNFR2-TNFR2/Fc 등이 있다. 상이한 예로는 TNFR2-TNFR1/Fc가 해당되는데, TNFR2와 TNFR1은 모두 TNF 단백질과 특이적으로 결합하는 단백질이지만, 이들의 세포외역 가용성 부위의 아미노산 서열은 상이하다.
본원 명세서에 사용된 "벡터"라는 용어는 외래 유전자를 숙주 세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주 세포 내로 유입할 수 있는 방안을 갖추어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비해야 한다. 여기서, 외래 유전자로는 예를 들면 연쇄 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물이 그에 해당한다.
본원 명세서에 사용된 "재조합 발현 플라스미드"라는 용어는 일반적으로 외래 유전자가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동적으로 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다. 재조합 발현 플라스미드는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 이종 DNA가 생성될 수 있다. 당업계에 주지된 바와 같이, 숙주 세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
본원 명세서에 사용된 "조절 서열 (expression control sequence)"이라는 용어는 본 발명의 폴리펩타이드 발현에 필수적인 혹은 이로운 핵산 서열들을 말한다. 각각의 조절 서열은 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열에 천연적(native) 혹은 외래적(foreign)일 수 있다. 그러한 조절 서열에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩타이드(propeptide) 서열, 프로모터, 인핸서(enhancer) 혹은 업스트림(upstream) 활성화 서열, 시그날 펩타이드 서열 및 전사 종결인자 등을 포함한다. 최소한 조절 서열은 프로모터를 포함한다.
본원 명세서에 사용된 "작동적으로 연결된(operably linked)"이라는 용어는 벡터의 각 구성 성분들이 고유한 작용을 할 수 있도록 형성된 성분들의 배열을 의미한다. 따라서, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열(control sequence)은 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 작용하는 한 조절 서열이 코딩 서열과 인접해 있을 필요는 없다. 예를 들면, 개재 서열(intervening sequence)이 프로모터 서열과 코딩 서열사이에 존재할 수 있는데, 이 경우 프로모터 서열은 코딩 서열에 "작동적으로 연결"되었다고 할 수 있다.
본원 명세서에 사용되는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, 챠이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, 사람 태아신장 293 세포(human embryonic kidney cells), BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 클로닝할 때에는 동물세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T 안티겐(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다 고 발현을 기대할 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
본 발명에 따른 직렬 연쇄체 형태의 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 이.콜라이에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 이들 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절 서열에는 상술한 발현 벡터의 구조 유전자와 연관된 발현 조절 서열을 포함한다. 유용한 발현 조절서열의 예에는 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 폴리펩타이드를 발현시키는데 특히 유용하다.
본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되는 여부와 관계없이 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
전술한 형질전환 및 형질감염은 Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology(1986) 및 Sambrook et al. Basic Methods in Molecular Biology(1989)와 같은 기본적인 실험 지침서에 기술된 방법에 의해서 실시될 수 있다. 본 발명에 따른 DNA 작제물을 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포로 도입하는데 바람직한 방법은 예를 들어서, 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection), DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DEAE-dextran mediated transfection), 이환(transvection), 미세주입(microinjection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection), 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 스크래프 로딩(scrape loading), 총알식 도입(ballistic introduction) 혹은 감염(infection) 등을 포함한다.
한편, 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 주성분인 연쇄 융합된 이량체 단백질 또는 당화된 연쇄 융합된 이량체 단백질은 본 발명의 발명자가 이미 출원한 바 있는 대한민국 특허출원 제10-2001-0045028호 "연쇄체화에 의한 면역글로불린 융합 단백질의 제조방법 및 이 방법에 의해 제조된 TNFR/Fc 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터 및 상기 벡터에 의한 형질전환체"(메덱스젠) 및 제10-2002-0045921호 "직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체"(메덱스젠)에 기술된 제조방법을 이용하여 수득할 수 있다. 이하에서 상기 제조방법을 간략하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질은 일반적으로 (a) 면역글로불린 Fc 조각을 코딩하는 유전자와 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 유전자로부터 단순 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 제조하고, (b) 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물과 또 다른 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 유전자에 동일한 제한효소 인식서열을 중합효소 연쇄반응으로 삽입하며, (c) 상기 제한효소 인식서열과 일치하는 제한효소를 사용하여, 상기 단순 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물과 상기 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 유전자의 제한효소 인식서열 부위를 절단하고, (d) 양쪽 DNA 서열의 절단된 부분을 라이게이즈로 연결하여 연쇄 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 제조하며, (e) 제조된 연쇄 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물을 벡터에 작동적으로 연결하여 재조합 발현 플라스미드를 작제하고, (f) 작제된 재조합 발현 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키며, (g) 형성된 형질전환체 또는 형질감염체를 연쇄 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물이 발현되도록 하기에 적절한 조건하에서 배양하여 배양물로부터 목적하는 연쇄 융합된 이량체 단백질을 분리 정제함으로써 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질의 제조방법에 있어서, [LAG3-LAG3/Fc]2의 경우에는 플라스미드pLAG33-Top'(기탁번호: KCCM10556), [TNFR2-TNFR2/Fc]2의 경우에는 pTR22-Top10'(기탁번호: KCCM 10291), [CD2-CD2/Fc]2의 경우에는 플라스미드 pCD22Ig(기탁번호: KCCM 10402), [CTLA4-CTLA4/Fc]2의 경우에는 pCT44Ig(기탁번호: KCCM 10400) 및 [TNFR2-TNFR1/Fc]2의 경우에는 플라스미드 pTR21-Top10'(기탁번호: KCCM 10290)를 각각 이용하여 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 당화된 연쇄 융합된 이량체 단백질은 부가적인 당쇄 결합 부위를 갖도록 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 서열상에, 상기된 O-형 또는 N-형 당쇄수식이 발생하도록 하나 이상의 뉴클레오타이드를 변이시킨 다음 그 DNA를 진핵 숙주 세포를 통해 발현하면서 자연적으로 당쇄수식이 일어나도록 함으로써 제조할 수 있다. 한 가지 양태로서, 본 발명에 따른 당화된 연쇄 융합된 이량체 단백질은 N-형 당쇄수식이 일어날 수 있는 Asn-X-Ser/Thr 서열이 부가 및/또는 증가하도록 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA서열을 변이시킴으로써 달성된다.
약제학적 조성물
본 발명에 따른 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물은 치료학적 유효량의 연쇄 융합된 이량체 단백질 또는 부가적으로 당화된 연쇄 융합된 이량체 단백질을 약제학적으로 허용되는 담체에 혼입시킨 형태로 제공하는 것이 바람직할 것이다.
또한, 본 발명에 따른 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물은 치료학적 유효량의 연쇄 융합된 이량체 단백질들의 혼합물 또는 당화된 연쇄 융합된 이량체 단백질들의 혼합물을 약제학적으로 허용되는 담체에 혼입시킨 형태로 제공하는 것이 바람직할 것이다. 이와 같은 약제학적 조성물은 예를 들면, [CD2-CD2/Fc]2와 [CTLA4-CTLA4/Fc]2를 동시에 함유하는 약제학적 조성물 또는 [LAG3-LAG3/Fc]2와 [CTLA4-CTLA4/Fc]2를 동시에 함유하는 약제학적 조성물이다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용되는 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하며 총괄적으로 “약제학적으로 허용되는 담체”라고 한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈-계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 따라서 본 발명의 약제학적 조성물은 국부, 경구, 비경구, 안내, 경피, 직장, 장관 등으로 투여될 수 있고, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 비내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 심장내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
한 양태로서, 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구적 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액(oily injection suspension)으로 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수 양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 약제학적 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 비휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 유용하다.
앞서 제조된 액상 조성물은 박테리아 포획 필터 등을 통한 여과에 의해 살균제 또는 방사를 혼입시켜 대개 살균된다. 살균된 조성물은 예를 들면 동결건조에 의해 고형 조성물을 수득하여 고형화시킬 수 있으며, 사용시에 이를 무균수 또는 무균 희석액에 용해시킨다.
본 발명의 연쇄 융합된 이량체 단백질 또는 당화된 연쇄 융합된 이량체 단백질을 함유한 약제학적 조성물은 실온에서의 안정성을 증가시키고, 값비싼 저온 저장의 필요성을 줄이며, 저장 수명(shelf-life)을 연장하기 위해 동결건조시킬 수 있다. 동결건조 공정은 동결, 일차 건조 및 이차 건조의 연속 단계로 이루어질 수 있다. 조성물을 동결시킨 후의 이차 건조 공정은 압력을 강하하고 수증기의 승화를 위해 가열하는 것이다. 이차 건조 단계는 건조물로부터 흡수된 잔여 수분을 증발시키는 것이다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 동결건조 방법은 다음의 순서와 같다: (1) 동결건조 현미경 분석법을 사용하여 제제의 붕괴 온도(collapse temperature)를 결정한다(Pikal, M. J. et al. Int. J. Pharm., 1990,62,165-186); (2) 바이알을 실온하의 동결-건조기 선반에 놓고 이후에 -1℃에서 약 30분 동안 평형화시킨다; (3) 선반을 -55℃로 냉각시키고 이 온도를 2시간동안 유지한다; (4) 약 -32℃의 생성물 온도 또는 붕괴 온도보다 5℃ 낮은 온도에서 이차 건조를 실시한다; (5) 35℃에서 이차 건조를 실시한다. 챔버 압력을 55 내지 120 mmHg로 조절한 후 건조를 완성한다; (6) 동결-건조기의 진공하에서 바이알을 마개로 막고 동결건조된 바이알을 크림프-밀봉하여 2℃ 내지 8℃에 저장한다.
동결건조된 제제에는 부형제(excipients) 및 동결건조보호제(lyoprotectant)가 포함될 수 있다. 부형제로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 0.9% NaCl과 10 mM 인산나트륨(pH 7.0) 또는 10 mM 나트륨 시트레이트(pH 7.0)의 완충액이 포함된다. 동결건조보호제는 동결 및 건조 공정동안에 생물학적 분자를 보호하고 최종 산물에 기계성(mechanical support)을 부여하는 역할을 하며 이들의 예로는 PBS(pH 7.0), PBS/4%, 12% 또는 15% 트레할로즈 등을 들 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물과 관련하여 사용되는 용어 "치료학적 유효량"은 본 발명의 조성물이 적용되는 이식편대 숙주질환에 대해 개선 또는 치료 효과를 나타내는 활성성분의 양을 의미한다. 구체적으로 본 발명에서 치료학적 유효량은 환자의 연령, 성별, 적용부위, 투여회수, 투여시간, 제형, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있지만, 야생형보다 적은 양으로 투여하면 되는데 예를 들면 0.01~1000㎍/kg/일, 보다 바람직하게는 0.1~500㎍/kg/일, 가장 바람직하게는 1~100㎍/kg/일로 투여한다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명될 것이다. 그러나 이들 실시예는 단순히 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예 1은 LAG3에 관한 것이며, LAG3/Fc 또는 LAG3-LAG3/Fc의 아미노산 서열 및 코딩 DNA 서열 그리고 이들의 제조에 이용된 프라이머 서열들을 하기 표 1에 요약하였다.
| 유전자 명칭 | 서 열 번 호 | 설 명 |
| Oligo-LAG3-F-EcoRⅠ | 1 | LAG3 세포외역부위 5'말단EcoRⅠ포함 |
| Oligo-LAG3-R-5P | 2 | LAG3 세포외역부위 3'말단 concatamer 제조시 사용 |
| Oligo-LAG3-F-5P | 3 | LAG3 세포외역부위 5'말단 concatamer 제조시 사용 |
| Oligo-LAG3-R-SpeⅠ | 4 | LAG3 세포외역부위 3'말단SpeⅠ포함 |
| hIgG-F-SpeⅠ | 5 | IgG 힌지 5'말단 SpeⅠ포함 |
| hIgG-R-XbaⅠ | 6 | IgG 3'말단XbaⅠ포함 |
| LAG3/Fc 코딩 DNA | 7 | - |
| LAG3/Fc 단백질 | 8 | - |
| LAG3-LAG3/Fc 코딩 DNA | 9 | - |
| LAG3-LAG3/Fc 단백질 | 10 | - |
<실시예 1>
A. 단순 융합된 단량체 단백질 LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 제조
a. LAG3의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편
LAG3의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편은, 제한효소 EcoRⅠ의 인식서열과 리더서열(서열번호 8의 펩타이드 1-22)의 코딩서열(서열번호 7의 뉴클레오타이드)을 갖는 한 프라이머(서열번호 1의 뉴클레오타이드)와, 제한효소 SpeⅠ의 인식서열과 상기 세포외역 가용성 부위의 3'말단 서열을 코딩하는 안티센스 서열(서열번호 7의 뉴클레오타이드)을 갖는 다른 프라이머(서열번호 4번의 뉴클레오타이드)를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성시켰다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 건강한 성인의 단핵구 세포(T림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.
건강한 성인의 혈액을 채취하고 알피엠아이-1640[RPMI-1640(Gibco BRL, USA)] 배지와 1:1로 희석하여 이를 피콜-하이팩 [Ficoll-hypaque(Amersham, USA)]을 사용하여 밀도구배 원심분리(density-gradient centrifugation)하여 상부에 형성된 T 림프구 세포층을 얻었다. 그리고 알피엠아이-1640 배지로 3회 세척하고 여기에 10% 우태아혈청(FBS, Gibco BRL,5 USA) 함유 알피엠아이-1640 배지를 가하여 T 림프구 세포가 5 x 105개/ml로 하고, 파이토헤마굴루티닌-엠[Phytohemagglutinin-M (Calbiochem, Germany)]을 2㎍/㎖로 첨가하여 자극하였다.
mRNA는 트리리에이젠트 [Tri-Reagent(MRC, USA)] mRNA 분리 키트를 이용하여 순수 분리하였다. 우선 인간 T 림프구 2 x 107개의 세포를 인산완충 생리식염수용액(phosphate buffered saline, PBS, pH7.2)으로 3회 세척한 후 1㎖ 트리리젠트로 수차례 섞어서 RNA를 용해시켰다. 이 튜브에 0.2㎖ 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 강하게 흔들어준 후, 실온에서 15분간 방치한 다음, 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심분리하였다. 상층액을 1.5㎖ 튜브로 옮기고 0.5㎖ 이소프로판올(isopropanol)을 첨가한 후, 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 버린 후, 침전물에, 75% 에탄올(Ethanol)-25% 디이피씨[DEPC(Sigma, USA)]를 처리한 3차 증류수를 1㎖ 첨가하여 2 내지 3회 섞은 후 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 완전히 제거하고 공기 중에서 건조시켜 잔여 에탄올을 제거한 후 RNA를 디이피씨를 처리한 3차 증류수 50㎕로 녹였다.
cDNA 합성은 1.5㎖ 튜브에 정제된 2㎍ mRNA와 1㎕ 올리고 디티[oligo dT(dT30, Promega, USA)] 프라이머를 10μM의 농도로 혼합하고, 70℃에서 2분간 가열한 후, 얼음에 넣어 2분간 냉각시켰다. 이 혼합물에 200U 엠-엠엘브이(M-MLV) 역전사효소[reverse transcriptase(Promega, USA)], 10㎕ 5x 반응완충용액(reaction buffer) [250mM 트리스-에이치씨엘(Tris-HCl), pH 8.3, 375mM 염화칼륨(KCl), 15mM 염화마그네슘(MgCl2), 50mM 디티티(DTT)], 1㎕ 디엔티피[dNTP(각각 10mM의 농도, Takara, Japan)]를 넣고 디이피씨를 처리한 3차 증류수로 50㎕가 되도록 첨가한 후, 42℃에서 1시간 반응시켜 1차 cDNA를 합성하였다.
b. 면역글로불린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편
면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편은, 제한효소 SpeⅠ의 인식서열과 IgG1의 상쇄부위의 5'말단을 코딩하는 서열을 갖는 한 프라이머(서열번호 5의 뉴클레오타이드)와 XbaⅠ의 인식서열과 IgG1 Fc의 3'말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머(서열번호 6번의 뉴클레오타이드)를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성시켰다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 회복기에 있는 원인 불명의 열 환자의 말초 혈액세포(B 림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.
c. 단순 융합된 단량체 단백질 LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물
상기 생성된 LAG3의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA단편과 면역글로브린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편을 제한효소 PstⅠ으로 소화시키고 티포 디엔에이 라이게이즈(T4 DNA ligase, USB, USA)를 이용하여 결합시킴으로써 단순 단량체 형태의 LAG3/Fc 유전자를 제작하였다. 제조된 유전자는 발현 후 단백질의 분비를 용이하게 하기 위한 리더 서열을 포함시켰다.
d. 단순 융합된 단량체 단백질 LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 클로닝
상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 소화시키고, 시판되고 있는 클로닝 벡터(Stratagene사 제품) 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ(+)]의 EcoRI/XbaI 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 전체 코딩 영역 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다(서열번호 7). 이때 생성된 융합 단백질은 단순 융합된 단량체 단백질로서 LAG3/Fc라 명명하였고, 이들의 추정 아미노산 서열은 서열번호 8에 해당한다.
B. 연쇄 융합된 단량체 단백질 LAG3-LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 제조
LAG3의 세포외역 가용성 부위가 연쇄체(concatamer)의 형태를 갖는 융합된 유전자를 만들기 위해, 즉 연쇄 융합된 단량체 단백질 LAG3-LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 만들기 위해, 제한효소 EcoRⅠ의 인식서열과 리더서열(서열번호 8의 펩타이드 1-22)의 코딩서열(서열번호 7의 뉴클레오타이드)을 갖는 한 프라이머(서열번호 1의 뉴클레오타이드)와 상기 세포외역 가용성 부위의 3' 말단 서열을 코딩하는 안티센스 서열(서열번호 7의 뉴클레오타이드)을 갖는 다른 프라이머(서열번호 2의 뉴클레오타이드)를 사용하여 하나의 LAG3 세포외역 가용성 부위의 단편을 증폭하였고, 또한 LAG3 세포외역 가용성부위의 리더 서열이 종료되는 부위(서열번호 7의 뉴클레오타이드)을 갖는 한 프라이머(서열번호 3의 뉴클레오타이드)와 제한효소 XbaⅠ의 인식서열과 IgG1 Fc의 3'말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머(서열번호 6의 뉴클레오타이드)를 사용하여 다른 단순 융합된 단량체 단백질 LAG3/Fc를 코딩하는 단편을 증폭하였다. 이 반응은 상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물(서열번호 7의 뉴클레오타이드)을 주형으로 사용하였다.
중합효소 연쇄반응은 1㎕ 1차 cDNA, 2U 피에프유(Pfu) DNA 중합효소[polymerase (Stratagene, USA)], 10㎕ 10X 반응완충용액(reaction buffer) [200mM 트리스-HCI, pH8.75, 100mM 황산암모늄 [(NH4)2SO4], 100mM 염화칼륨(KCl), 20mM 염화마그네숨(MgCl2)], 1% 트리톤(등록상표 Triton) X-100, 1mg/㎖ 우혈청알부민(BSA), 3㎕ 프라이머1(10μM), 3㎕ 프라이머2(10μM), 2㎕ 디엔티피(dNTP, 각각 10mM)를 넣고 3차 증류수로 100㎕가 되도록 첨가한 후 실시하였다. 반응 조건은 94℃에서 5분 동안 처리한 다음 95℃ 1분, 58℃ 1분30초, 72℃ 1분30초씩 31회 반응시키고, 72℃ 15분간 더 반응시켜 중합효소 연쇄반응 산물이 완전한 평활 말단(blunt end)이 되도록 하였다.
중합효소 연쇄반응 산물들을 0.8% 아가로즈 젤(agarose gel)에 전기영동한 후, 큐엑스 투 젤 추출 키트[Qiaex Ⅱ gel extraction kit(Qiagen, USA)]를 이용하여 순수 분리하였다. 순수분리된 중합효소 연쇄반응 산물들을 제한효소 BamHI으로 처리한 후 페놀/클로로포름 추출 방법으로 순수 분리하였다. 이어서, BamHI으로 처리된 두 종류의 DNA 단편을 라이게이즈로 결합시켰다.
C. 연쇄 융합된 단량체 단백질 LAG3-LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 클로닝
상기 제조된 연쇄 융합된 단량체 단백질 LAG3-LAG3/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 제한효소 EcoRⅠ과 XbaⅠ으로 소화시키고, 시판되고 있는 클로닝 백터인 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KSⅡ(+), startagene, USA)]의 EcoRⅠ/XbaⅠ 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 전체 코딩 영역 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다(서열번호 9). 이때 생성된 융합 단백질은 연쇄 융합된 단량체 단백질로서 LAG3-LAG3/Fc라 명명하였고, 이들의 추정 아미노산 서열은 서열번호 10에 해당한다.
벡터로 사용할 10㎕ 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ (+), Stratagene, USA)]를 15U EcoRI과 15U XbaI, 5㎕ 10X 반응완충용액(reaction buffer) [100mM 트리스-HCl, pH 7.5, 100mM 염화마그네슘(MgCl2), 10mM 디티티 (DTT), 500nM 염화나트륨(NaCl)], 5㎕ 0.1% 우혈청알부민[BSA(Takara, Japan)]을 섞은 후, 3차 증류수로 50㎕가 되도록 첨가한 후 37℃에서 2시간 반응시켜 DNA를 소화시켰다. 반응물을 0.8% 아가로즈 겔에 전기영동한 후, 큐엑스 투 젤 추출 키트 [Qiaex Ⅱ gel extraction kit(Qiagen, USA)]로 순수 분리하였다.
EcoRI과 XbaI으로 소화된 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ(+), Stratagene, USA] 100ng과 제한효소로 소화시킨 20ng의 중합효소 연쇄반응 산물을 혼합하고 0.5U 티포(T4) DNA 라이게이즈[ligase(Amersham, USA)], 1㎕ 10X반응완충용액(reaction buffer) [300mM 트리스-에이치씨엘(Tris-HCl), pH 7.8, 100mM 염화마그네습(MgCl2), 100mM 디티티(DTT), 10mM 에이티피(ATP)]를 넣은 후 3차 증류수로 10㎕가 되도록 첨가한 후 16℃ 수조(water bath)에서 16시간 동안 반응시켰다. 대장균[E. coil Top10(Novex, USA)]을 리비듐 클로라이드(RbCl, ribidium chloride, Sigma, USA)법으로 컴피턴트 세포(competent cell)를 만든 후 형질전환시켜 암피실린(ampicillin, Sigma, USA)을 50㎍/㎖ 함유한 엘비(LB) 고체 배지에 도말하고 37℃에서 16시간 배양하였다. 생성된 콜로니들을 암피실린이 50㎍/㎖ 함유된 엘비(LB) 액체배지 4㎖에 접종한 후 37℃에서 16시간동안 진탕 배양하였다. 이 중 1.5㎖을 샘브룩(Sambrook J) 등의 문헌(Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.25-1.31, p1.63-1.69, p7.26-7.29, 1989)에 기술된 알칼리 분해(alkaline lysis)법으로 플라스미드를 소량 추출한 후, EcoRI과 XbaI으로 소화시켜 클로닝의 유무를 확인하였다.
전체 코딩영역 서열은 다이데옥시 체인 터미네이션 [Dideoxy chain termination(생어(Sanger F) 등의 문헌, PNAS USA, 74:5483, 1977)]법을 이용한 다음과 같은 DNA 서열화 방법에 의해 확인하였다. 상기의 알칼리 분해법으로 추출한 플라스미드와 시쿼네이즈(등록상표 Sequenase ver. 2.0, Amersham, USA) 및 35S 디에이티피(dATP, Amersham, USA)를 사용하여 제품 사용법에 준하는 방법으로 DNA 서열화 반응을 진행시켰다. 6% 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)에 위의 시료를 로딩(loading)하고 전압을 1800 내지 2000V 사이로 유지하여 젤의 온도를 50℃로 유지하면서 2시간 전기영동한 후, 건조시킨 다음 엑스레이 필름(Kodak, USA)에 2일 동안 노출시킨 후 DNA 염기 서열을 판독하였다.
<실시예 2>
다른 단백질인 TNFR1, TNFR2, CD2 또는 CTLA4의 단순 융합된 이량체 단백질 및 연쇄 융합된 이량체 단백질은 전술한 실시예 1과 동일한 절차에 따라 제조할 수 있다. 보다 자세한 제조방법은 본 발명의 발명자가 이미 출원한 바 있는 대한민국 특허출원 제10-2001-0045028호 "연쇄체화에 의한 면역글로불린 융합 단백질의 제조방법 및 이 방법에 의해 제조된 TNFR/Fc 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터 및 상기 벡터에 의한 형질전환체"(메덱스젠) 및 제10-2002-0045921호 "직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체"(메덱스젠)를 통하여 확인할 수 있다. 관련된 TNFR1, TNFR2, CD2 또는 CTLA4 서열들을 아래 표 2에 나타내었다.
| 유전자 명칭 | 서열목록 |
| TNFR2/Fc 코딩 DNA | 11 |
| TNFR2/Fc 단백질 | 12 |
| TNFR2-TNFR2/Fc 코딩 DNA | 13 |
| TNFR2-TNFR2/Fc 단백질 | 14 |
| CD2/Fc코딩 DNA | 15 |
| CD2/Fc 단백질 | 16 |
| CD2-CD2/Fc 코딩 DNA | 17 |
| CD2-CD2/Fc 단백질 | 18 |
| CTLA4/Fc 코딩 DNA | 19 |
| CTLA4/FC 단백질 | 20 |
| CTLA4-CTLA4/FC 코딩 DNA | 21 |
| CTLA4-CTLA4/FC 단백질 | 22 |
| TNFR1/Fc 코딩 DNA | 23 |
| TNFR1/Fc 단백질 | 24 |
| TNFR2-TNFR1/Fc 코딩 DNA | 25 |
| TNFR2-TNFR1/Fc 단백질 | 26 |
<실시예 3>
단순/연쇄 융합된 이량체 LAG3 융합 단백질의 발현 및 정제
챠이니즈 햄스터 난소 세포주 케이원(CHO-K1, ATCC CCL-61, Ovary, Chinese hamster, Cricetulus griseus)에서 융합 단백질을 발현시키기 위하여, LAG3-LAG3/Fc 융합 유전자를 포함한 블루스크립트 케이에스투 플러스 플라스미드를 형질 전환된 대장균에서 추출한 후, 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 소화시켜 얻은 LAG3-LAG3/Fc 단편을 동물세포 발현 벡터인 피씨알쓰리(pCR™3, Invitrogen, USA) 플라스미드의 EcoRI/XbaI 부위에 삽입하여, 재조합 발현 플라스미드를 pLAG33Ig를 제조하였다(도 3). 이 플라스미드를 pLAG33-Top10'이라 명명하였고, 2004년 1월 13일자로 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (KCCM, 대한민국 서울시 서대문구 홍제 1동 361-221 유림빌딩 소재)에 기탁번호 KCCM 10556로 기탁하였다.
형질 감염은 상기 LAG3-LAG3/Fc 융합 유전자를 포함한 플라스미드 pLAG33Ig DNA를 지브코 비알엘(Gibco BRL, USA)사의 리포펙타민(Lipofectamine™) 시약과 혼합함으로써 수행하였다. 1 x 105 세포/구의 농도의 챠이니즈 햄스터 난소 세포주 케이원(CHO-K1) 세포를 6구 조직 배양판 (six-well tissue culture plate, Nunc, USA)에 접종하고 10% 우태아혈청(FBS)을 함유한 디엠이엠(DMEM) 배지에서 세포가 50 내지 80%가 되도록 배양한 후, 혈청이 없는 디엠이엠(DMEM) 배지에서 플라스미드 pLAG33Ig DNA를 1 내지 2㎍ 취하고, 리포펙타민(Gibco BRL,USA)을 2 내지 25㎕ 취하여 상온에서 15 내지 45분간 반응시킨 DNA-리포좀 혼합체(Liposome complex)를 세포 배양판에 첨가시켰다. 5시간동안 배양한 후 혈청이 20%가 함유된 디엠이엠(DMEM) 배지를 첨가하여 18 내지 24시간 배양하였다. 최초 형질 감염 후에 세포를 1.5 mg/㎖의 제네티신(Geneticin, G418, Gibco BRL, USA)이 첨가된 10% 우태아혈청 디엠이엠(DMEM) 배지에서 3주간 배양하고, 형성된 집락을 분리하여 증폭 배양하였다. 융합 유전자의 발현 여부는 퍼옥시데이즈가 표지된 염소 항 인간 면역글로블린(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)을 사용한 효소 면역 검사법(ELISA)을 통해 검사하였다.
효소 면역 검사법(ELISA)은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 먼저, 1mg/㎖ 염소 항 인간 면역 글로블린(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)을 0.1M 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)에 1:2000으로 희석한 후, 96구 효소 면역 검사판(96-well flexible plate, Falcon, USA)에 100㎕씩 분주하고 랩으로 봉한 후 4℃에서 16시간 이상 방치하여 항체가 검사판 표면에 코팅되게 하였다. 이를 세척완충용액(washing buffer) [0.1% 트윈-20(Tween-20) 함유, 1X 인산완충 생리식염수(PBS, Phosphate buffered saline)]으로 3회 세척한 후 희석용액[(diluent buffer) 1X 인산완충 생리식염수 48.5㎖, 우태아 혈청 1.5㎖, 트윈-20 50㎕]을 180㎕씩 분주하였다. 첫 구(well)에 배양한 상층액 20㎕를 넣은 후 마이크로 피펫 (micropipette)을 이용하여 연속적으로 희석하였고, 양성 대조군으로 0.01㎍/㎕ 인간 면역글로블린(human IgG, Sigma, USA)을, 음성 대조군으로 형질감염되지 않은 챠이니즈 햄스터의 난소 케이원(CHO-K1) 세포의 배양액을 사용하여 동일하게 희석하였다. 희석이 끝난 96구 효소 면역 검사판(Falcon, USA)을 호일로 싸서 37℃에서 1시간 30분간 반응시킨 후, 세척용액으로 3회 세척하였다. 퍼옥시데이즈가 표지된 염소 항-인간 면역글로블린(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)을 희석용액으로 1:5000 희석한 다음 이를 100㎕씩 분주하고 호일로 싼 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 세척용액으로 3회 세척한 후 티엠비 퍼옥시데이즈 시스템(TMB microwell peroxidase substrate system, KPL, USA)을 이용하여 발색시키고, 흡광기(microplate reader, Bio-RAD, Model 550, Japan)로 파장 630nm에 대한 흡광도를 측정하여 발현 여부를 확인하였다.
이렇게 제조된 형질전환체(transfectant)가 생산한 융합 단백질을 정제할 목적으로 무혈청배지(serum free media) 중 CHO-S-SFM Ⅱ (Gibco BRL, USA)에 적응시키기 위하여 다음의 과정으로 진행하였다. 약 3 x 105개의 세포를 6구판(6-well plate)에 접종한 후 16시간동안 5% CO2 37℃ 배양기에서 배양하여 정착시킨 후 현미경 하에서 약 30 내지 50%의 면적에 세포가 부착된 것을 확인하고 10% 우태아 혈청 함유 DMEM와 CHO-S-SFM Ⅱ의 비율을 8:2가 되도록 배지를 교체하여 배양하였다. 이 비율로 3회 계대 배양한 후, 각각 6:4의 비율로 3회, 4:6의 비율로 3회, 3:7의 비율로 3회, 2:8의 비율로 3회, 및 1:9의 비율로 3회 계대 배양한 후 최종적으로 100% CHO-S-SFM Ⅱ 배지에서 계대 배양하여, 이의 발현량을 효소 면역 검사법을 이용하여 측정하였다.
이 세포들을 우혈청배지가 없는 CHO-S-SFM Ⅱ(Gibco BRL, USA) 배지에서 대량 배양후 각각의 융합 단백질을 함유한 배양액을 200xg, 12분간 원심분리하여 세포 찌꺼기들을 완전히 제거하고 프로테인 에이 컬럼(HiTrap protein A column, Amersham, USA)을 이용한 다음의 방법으로 순수 분리하였다. 20mM 인산화 나트륨(Sodium phosphate, pH 7.0, sigma, USA)을 1㎖/min의 속도로 2분간 통과시킨 후, 10㎖ 배양액을 동일한 속도로 컬럼을 통과시켜 프로테인 에이에 융합 단백질이 결합하도록 하였다. 20mM 인산화 나트륨(pH 7.0)을 2분간 동일 속도로 통과시켜 세척한 후, 0.1M 시트르산(C6H8O7 · H2O. citric acid, pH 3.0, sigma, USA)을 3분간 동일속도로 통과시키면서 500㎕씩 1.5㎖ 튜브에 순차적으로 추출물을 분주하였다. 이를 1M 트리스(Tris, pH 11.0, USB, Sigma)를 이용하여 pH 7.0으로 적정하였으며 각 튜브의 융합 단백질의 존재 유무는 상기에 기술한 효소면역 검사법(ELISA)을 통하여 확인하였다. 순수 분리한 융합 단백질은 센트리콘 30(Centricon 30, Amicon, USA)을 사용하여 4℃에서 2000xg, 30분간 원심분리하여 농축하였다.
<실시예 4>
단순/연쇄 융합된 이량체 단백질 CD2, CTLA4, TNFR의 발현 및 정제
단순/연쇄 융합된 이량체 단백질 CD2, CTLA4, TNFR의 발현 및 정제는 전술한 실시예 1과 동일한 절차에 따라 제조할 수 있었다. 보다 자세한 방법은 본 발명의 발명자가 이미 출원한 바 있는 대한민국 특허출원 제10-2001-0045028호 "연쇄체화에 의한 면역글로불린 융합 단백질의 제조방법 및 이 방법에 의해 제조된 TNFR/Fc 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터 및 상기 벡터에 의한 형질전환체"(메덱스젠) 및 제10-2002-0045921호 "직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체"(메덱스젠)를 통하여 확인할 수 있다. 한편, 이로부터 수득한 재조합 발현 플라스미드는 각각 pCD22Ig(도 1), pCT44Ig(도 2), pTR2Ig-Top'(도 4)이라 명명하였다.
아울러, 실시예 3 및 실시예 4에 따라 순수 정제된 단백질들이 목적한 단순 융합된 이량체 단백질 [CD2/Fc]2, [LAG3/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 및 연쇄 융합된 이량체 단백질 [CD2-CD2/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2가 맞는지 여부를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 실시하였고 (도 5a), 마찬가지로 [TNFR1/Fc]2, [TNFR2/Fc]2, [TNFR2-TNFR1/Fc]2, [TNFR2-TNFR2/Fc]2에 대해서도 SDS-PAGE를 실시하였다(도 5b).
<실시예 5>
이식편대 숙주질환 유발
본 발명에서 사용한 마우스는 몸무게 20~25g의 8~12주령 암컷 마우스 C57BL/6과 BDF1[(C57BL/6 x DBA/2)F1]이며, 멸균된 (filter-top microisolator)에서 사육하였다. 수령 마우스에게는 공여 마우스의 비장 세포를 주입하기 하루 전에 박트림(bactrim)을 투여하였다. BDF1 (H-2Kb/d) 수령 마우스는 연세대학교의 미생물학 교실로부터 전신에 700cGy의 감마선을 조사(irradiation)받은 것을 이용하였다. 공여 마우스로부터 수득한 비장 세포는 10% 알피엠아이(RPMI)에 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지에 준비하였고, 세포는 400g에서 10분간 원심분리하여 수득하였다.
이식편대 숙주질환을 유발하기 위하여 앞서 감마선에 의해 조사된 BDF1 수령 마우스에게 동종 공여 마우스인 C57BL/6 마우스(H-2Kb)의 살아있는 비장 세포(25 x 106개)를 역방향 주입 방법을 이용하여 이식하였다. 비장 세포의 주입 후, 조사 영향을 평가하기 위해서 매일 외관과 건강 상태를 관찰하였으며, 몸무게와 비장 지수를 측정하였다.
<실시예 6>
단순 융합된 이량체 단백질의 이식편대 숙주질환 치료효과
상기 이식편대 숙주질환에 걸린 마우스에게 단순 융합된 이량체 단백질인 [CD2/Fc]2, [LAG3/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 각각을 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다. 여기서, 대조군 수령 마우스에게는 PBS를 투여하였으며, 상기 수령 마우스들의 생존율을 비교하기 위해서 격일로 몸무게를 측정하여 생존율을 계산하였다(도 6).
대조군 수령 마우스의 경우 이식편대 숙주질환으로 인하여 체중이 빠르게 감소하였고, 공여 마우스의 활성화된 T 세포의 증식으로 인하여 수령 마우스의 비장 세포 수가 감소하였다. 결국은 비장 세포를 수령 마우스로 공급한지 2주 정도 경과한 후에 본 발명에 사용된 모든 대조군 마우스가 심각한 체중 감소를 나타냈으며, 사망에 이르렀다. 한편, 단순 융합된 이량체 단백질인 [CD2/Fc]2, [LAG3/Fc]2, [CTLA4/Fc]2를 각각 단독 투여받은 마우스의 경우에는 모두 이식편대 숙주질환에 의한 치사율이 대조군에 비하여 감소하였다. 상기와 같이 단순 융합된 이량체 단백질을 단독 투여한 경우에 [LAG3/Fc]2가 약 4주의 생존 기간을 보여서 가장 좋은 면역억제 효과를 나타내었으며, [CTLA4/Fc]2, [CD2/Fc]2의 순서로 생존율이 증가하는 결과를 보여주었다.
<실시예 7>
단순 융합된 이량체 단백질의 단독 투여 또는 복합 투여에 따른 이식편대 숙주질환 치료효과
이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에 단순 융합된 이량체 단백질 [CD2/Fc]2, [LAG3/Fc]2, [CTLA4/Fc]2 각각을 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다. 마찬가지로, 이식편대 숙주질환에 걸린 또 다른 수령 마우스에 단순 융합된 이량체 단백질의 혼합물 [CD2/Fc]2 + [CTLA4/Fc]2 또는 [LAG3/Fc]2 + [CTLA4/Fc]2를 각각 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다(도 7).
각각의 단순 융합된 이량체 단백질을 단독으로 투여한 경우보다는 복합적으로 투여한 경우에 더 높은 생존율을 보여주었다. 그 중에서도 특히 [LAG3/Fc]2 + [CTLA4/Fc]2 혼합물을 투여한 경우에 실험개체 전원이 약 40일 이상의 생존기간을 나타냄으로써 이식편대 숙주질환에 의한 치사율을 가장 많이 감소시킴을 보여주었다. 이 결과를 각각 10마리의 마우스에서 평균생존기간을 계산하여 도표화하였으며(표 3), 이 결과는 이식편대 숙주질환의 치료에는 단순 융합 이량체 단백질을 1종 단독으로 사용하는 것보다는 2종 이상 복합적으로 투여하는 것이 더 좋은 치료효과를 달성함 수 있음을 보여주는 것이다.
| 면역억제제(mg/kg/일) | 공여 마우스 | 수령 마우스 | 마리수 | 생존일수 | 평균생존일수±SEM |
| PBS | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 11~15 | 13.7±1.06 |
| [CD2/Fc]2 | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 14~22 | 15.7±3.37 |
| [LAG3/Fc]2 | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 13~26 | 18±5.12 |
| [CTLA4/Fc]2 | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 19~28 | 23.2±3.49 |
| [CD2/Fc]2 + [CTLA4/Fc]2 | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 16~29 | 23.2±5.71 |
| [LAG3/Fc]2 + [CTLA4/Fc]2 | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 21~40 | 28±7.71 |
<실시예 8>
단순 융합된 이량체 단백질 및 연쇄 융합된 이량체 단백질에 의한 이식편대 숙주질환 치료효과 비교
(1) CTLA-4의 경우
이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에 단순 융합된 이량체 단백질인 [CTLA4/Fc]2을 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다. 마찬가지로, 이식편대 숙주질환에 걸린 다른 또 다른 수령 마우스에 연쇄 융합된 이량체 단백질인 [CTLA4-CTLA4/Fc]2를 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다(도 8a).
이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에게 [CTLA4/Fc]2를 단독 투여한 경우에 약 26일의 최대 생존 기간을 보인 반면에, [CTLA4-CTLA4/Fc]2를 단독 투여한 경우에 약 38일의 최대 생존 기간을 보였다. 이 결과를 각각 10마리의 마우스에서 평균생존기간을 계산하여 도표화하였다(표 4). 이러한 결과들은 단순 융합된 이량체 단백질보다는 연쇄 융합된 이량체 단백질이 이식편대 숙주질환에 더 좋은 효과를 가지고 있음을 보여주는 것이다.
| 면역 억제제(mg/kg/일) | 공여 마우스 | 수령 마우스 | 마리수 | 생존일수 | 평균생존일수±SEM |
| PBS | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 11~15 | 13.7±1.06 |
| [CTLA4/Fc]2 | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 14~26 | 18.4±4.70 |
| [CTLA4-CTLA4/Fc]2 | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 19~38 | 28.2±8.12 |
(2) TNFR2의 경우
이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에 단순 융합된 이량체 단백질인 [TNFR2/Fc]2를 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다. 마찬가지로, 이식편대 숙주질환에 걸린 다른 또 다른 수령 마우스에 연쇄 융합된 이량체 단백질인 [TNFR2-TNFR2/Fc]2를 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다(도 8b).
이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에게 [TNFR2/Fc]2를 단독 투여한 경우에 약 20일의 최대 생존 기간을 보인 반면에, [TNFR2-TNFR2/Fc]2를 단독 투여한 경우에 약 35일의 최대 생존 기간을 보였다. 이러한 결과들은 단순 융합된 이량체 단백질보다는 연쇄 융합된 이량체 단백질이 이식편대 숙주질환에 더 좋은 효과를 가지고 있음을 보여주는 것이다.
<실시예 9>
[TNFR2-TNFR2/Fc]2와 [TNFR2-TNFR2/Fc]2 또는 [TNFR2-TNFR1/Fc]2에 의한 이식편대 숙주질환 치료효과 비교
이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에 단순 융합된 이량체 단백질인 [TNFR2/Fc]2를 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다. 마찬가지로, 이식편대 숙주질환에 걸린 다른 또 다른 수령 마우스에 연쇄 융합된 이량체 단백질인 [TNFR2-TNFR2/Fc]2 또는 [TNFR2-TNFR1/Fc]2
를 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다(도 9).
이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에게 [TNFR2/Fc]2를 단독 투여한 경우에 약 20일의 최대 생존 기간을 보인 반면에, [TNFR2-TNFR1/Fc]2를 단독 투여한 경우에 약 30일의 최대 생존 기간을 보였으며, [TNFR2-TNFR2/Fc]2를 단독 투여한 경우에는 약 35일의 최대 생존 기간을 보였다. 이러한 결과들은 단순 융합된 이량체 단백질보다는 연쇄 융합된 이량체 단백질이 이식편대 숙주질환에 더 좋은 효과를 가지고 있음을 보여주는 것이다. 또한, [TNFR2-TNFR1/Fc]2와 [TNFR2-TNFR2/Fc]2는 효과 면에서 거의 유사하였지만, [TNFR2-TNFR2/Fc]2가 보다 우수한 면역억제효과를 보유하고 있음을 확인하였다.
<실시예 10>
연쇄 융합된 이량체 단백질의 단독 투여 또는 복합 투여에 따른 이식편대 숙주질환 치료효과
이식편대 숙주질환에 걸린 수령 마우스에 연쇄 융합된 이량체 단백질인 [CD2-CD2/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2, [TNFR2-TNFR1/Fc]
2를 각각 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다. 마찬가지로, 이식편대 숙주질환에 걸린 또 다른 수령 마우스에 연쇄 융합된 이량체 단백질의 복합체인 [CD2-CD2/Fc]2 + [CTLA4-CTLA4/Fc]2 및 [LAG3-LAG3/Fc]2 + [CTLA4-CTLA4/Fc]2를 각각 인산완충용액(PBS)에 200㎍/0.5㎖의 농도로 용해하여 0, 2, 4, 6일째에 복강내 투여하였다(도 10).
대조군 마우스의 경우 상기 결과와 유사하게 약 2주 후에는 100% 치사율을 나타내었다(표 5). 실시예 7의 단순 융합된 이량체 단백질의 경우와 유사하게, 연쇄 융합된 이량체 단백질의 단독 투여보다는 복합 투여가 보다 좋은 생존율을 나타냄을 알 수 있었다. 연쇄 융합된 이량체 단백질을 복합 투여한 [CD2-CD2/Fc]2 + [CTLA4-CTLA4/Fc]2와 [LAG3-LAG3/Fc]2 +[CTLA4-CTLA4/Fc]2의 경우에 비장세포 주입 후 약 10주까지도 각각 50%와 40%의 생존율을 나타내었다. 이러한 결과들은 이식편대 숙주질환의 치료를 위하여 면역 억제제를 이용하는 경우에, 연쇄 융합된 단백질을 복합적으로 투여하는 것이 더욱 좋은 치료 효과를 달성할 수 있음을 시사하는 것이다.
| 면역억제제(mg/kg/day) | 공여마우스 | 수령마우스 | 마리수 | 생존일수 | 평균생존일수±SEM |
| PBS | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 11∼15 | 13.7±4.3 |
| [CD2-CD2/Fc]2 | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 19∼28 | 21.4±5.6 |
| [TNFR2-TNFR2/Fc]2 | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 20∼34 | 26.2±6.1 |
| [TNFR2-TNFR1/Fc]2 | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 18∼31 | 23.6±5.4 |
| [CTLA4-CTLA4/Fc]2 | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 19∼38 | 28.2±8.2 |
| [LAG3-LAG3/Fc]2 | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 22∼50 | 34.6±10.6 |
| [CD2-CD2/Fc]2+[CTLA4-CTLA4/Fc]2 | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 44이상 | 100이상 |
| [LAG3-LAG3/Fc]2+[CTLA4-CTLA4/Fc]2 | C57BL/6 | BDF1 | 10 | 50이상 | 100이상 |
본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 또는 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 광범위한 장기이식 합병증을 치료하는데 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc를 발현하는 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CTLA4-CTLA4/Fc를 발현하는 재조합 발현 플라스미드 pCT44Ig의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 LAG3-LAG3/Fc를 발현하는 재조합 발현 플라스미드 pLAG33Ig의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR1/Fc를 발현하는 재조합 발현 플라스미드 pTR21Ig-Top'의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질([CD2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2, [LAG3/Fc]2) 및 연쇄 융합된 이량체 단백질([CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2
, [LAG3-LAG3/Fc]2)의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질(1:[TNFR1/Fc]2, 2:[TNFR2/Fc]2) 및 연쇄 융합된 이량체 단백질(3:[TNFR2-TNFR1/Fc]2, 4:[TNFR2-TNFR2/Fc]2)의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질([CD2/Fc]2, [CTLA4/Fc]2, [LAG3/Fc]2)을 투여함으로써 이식편대 숙주질환에 대한 생존율이 증가하는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질의 혼합물([CTLA4/Fc]2 + [LAG3/Fc]2, [CD2/Fc]2 + [CTLA4/Fc]2)을 투여함으로써 이식편대 숙주질환에 대한 생존율이 증가하는 정도를 비교한 그래프이다.
도 8a는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질 [CTLA4/Fc]2 또는 연쇄 융합된 이량체 단백질 [CTLA4-CTLA4/Fc]2를 투여한 경우 이식편대 숙주질환에 대한 생존율이 증가하는 정도를 비교한 그래프이다.
도 8b는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR2/Fc]2 또는 연쇄 융합된 이량체 단백질 [TNFR2-TNFR2/Fc]2를 투여한 경우 이식편대 숙주질환에 대한 생존율이 증가하는 정도를 비교한 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR2/Fc]2 또는 연쇄 융합된 이량체 단백질 ([TNFR2-TNFR1/Fc]2 또는 [TNFR2-TNFR2/Fc]2)을 투여한 경우 이식편대 숙주질환에 대한 생존율이 증가하는 정도를 비교한 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질 ([CD2-CD2/Fc]2, [CTLA4-CTLA4/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2) 또는 이들의 혼합물 ([CD2-CD2/Fc]2 + [CTLA4-CTLA4/Fc]2, [LAG3-LAG3/Fc]2 + [CTLA4-CTLA4/Fc]2)을 투여함으로써 이식편대 숙주질환에 대한 생존율이 증가하는 정도를 비교한 그래프이다.
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<120> Pharmaceutical Composition for treatment of Transplantation
Rejection comprising Concatameric Immunoadhesin
<160> 26
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 31
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<220>
<223> primer, oligo-LAG3-F-EcoRI
<400> 1
ggaattcatg tgggaggctc agttcctggg c 31
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer, oligo-LAG3-R-5P
<400> 2
agtgaggtta tacatgatgg agacgttg 28
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer, oligo-LAG3-F-5P
<400> 3
ctccagccag gggctgaggt c 21
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer, oligo-LAG3-R-SpeI
<400> 4
gactagttgg gggctccaga cccagaacag 30
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer, hIgG-F-SpeI
<400> 5
gagtagtgca gagcccaaat cttgtgac 28
<210> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer, hIgG-R-XbaI
<400> 6
gctctagagc tcatttaccc ggagacaggg agag 34
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
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<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1500)
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atg tgg gag gct cag ttc ctg ggc ttg ctg ttt ctg cag ccg ctt tgg 48
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
gtg gct cca gtg aag cct ctc cag cca ggg gct gag gtc ccg gtg gtg 96
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
tgg gcc cag gag ggg gct cct gcc cag ctc ccc tgc agc ccc aca atc 144
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
ccc ctc cag gat ctc agc ctt ctg cga aga gca ggg gtc act tgg cag 192
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
cat cag cca gac agt ggc ccg ccc gct gcc gcc ccc ggc cat ccc ctg 240
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
gcc ccc ggc cct cac ccg gcg gcg ccc tcc tcc tgg ggg ccc agg ccc 288
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
cgc cgc tac acg gtg ctg agc gtg ggt ccc gga ggc ctg cgc agc ggg 336
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
agg ctg ccc ctg cag ccc cgc gtc cag ctg gat gag cgc ggc cgg cag 384
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
cgc ggg gac ttc tcg cta tgg ctg cgc cca gcc cgg cgc gcg gac gcc 432
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
ggc gag tac cgc gcc gcg gtg cac ctc agg gac cgc gcc ctc tcc tgc 480
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
cgc ctc cgt ctg cgc ctg ggc cag gcc tcg atg act gcc agc ccc cca 528
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
gga tct ctc aga gcc tcc gac tgg gtc att ttg aac tgc tcc ttc agc 576
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
cgc cct gac cgc cca gcc tct gtg cat tgg ttc cgg aac cgg ggc cag 624
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
ggc cga gtc cct gtc cgg gag tcc ccc cat cac cac tta gcg gaa agc 672
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
ttc ctc ttc ctg ccc caa gtc agc ccc atg gac tct ggg ccc tgg ggc 720
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
tgc atc ctc acc tac aga gat ggc ttc aac gtc tcc atc atg tat aac 768
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
ctc act gtt ctg ggt ctg gag ccc cca act agt gca gag ccc aaa tct 816
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Ser Ala Glu Pro Lys Ser
260 265 270
tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg 864
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
275 280 285
ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc 912
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc 960
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 1008
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg 1056
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
340 345 350
tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 1104
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 1152
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
370 375 380
atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 1200
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc 1248
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 1296
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 1344
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc 1392
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
450 455 460
gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 1440
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
465 470 475 480
atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 1488
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
485 490 495
tcc ccg ggt aaa tga 1503
Ser Pro Gly Lys
500
<210> 8
<211> 500
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
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Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Ser Ala Glu Pro Lys Ser
260 265 270
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
275 280 285
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
340 345 350
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
370 375 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
465 470 475 480
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Ser Pro Gly Lys
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> sig_peptide
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<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2208)
<223> LAG3-LAG3/Fc
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atg tgg gag gct cag ttc ctg ggc ttg ctg ttt ctg cag ccg ctt tgg 48
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
gtg gct cca gtg aag cct ctc cag cca ggg gct gag gtc ccg gtg gtg 96
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
tgg gcc cag gag ggg gct cct gcc cag ctc ccc tgc agc ccc aca atc 144
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
ccc ctc cag gat ctc agc ctt ctg cga aga gca ggg gtc act tgg cag 192
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
cat cag cca gac agt ggc ccg ccc gct gcc gcc ccc ggc cat ccc ctg 240
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
gcc ccc ggc cct cac ccg gcg gcg ccc tcc tcc tgg ggg ccc agg ccc 288
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
cgc cgc tac acg gtg ctg agc gtg ggt ccc gga ggc ctg cgc agc ggg 336
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
agg ctg ccc ctg cag ccc cgc gtc cag ctg gat gag cgc ggc cgg cag 384
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
cgc ggg gac ttc tcg cta tgg ctg cgc cca gcc cgg cgc gcg gac gcc 432
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
ggc gag tac cgc gcc gcg gtg cac ctc agg gac cgc gcc ctc tcc tgc 480
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
cgc ctc cgt ctg cgc ctg ggc cag gcc tcg atg act gcc agc ccc cca 528
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
gga tct ctc aga gcc tcc gac tgg gtc att ttg aac tgc tcc ttc agc 576
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
cgc cct gac cgc cca gcc tct gtg cat tgg ttc cgg aac cgg ggc cag 624
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
ggc cga gtc cct gtc cgg gag tcc ccc cat cac cac tta gcg gaa agc 672
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
ttc ctc ttc ctg ccc caa gtc agc ccc atg gac tct ggg ccc tgg ggc 720
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
tgc atc ctc acc tac aga gat ggc ttc aac gtc tcc atc atg tat aac 768
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
ctc act ctc cag cca ggg gct gag gtc ccg gtg gtg tgg gcc cag gag 816
Leu Thr Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu
260 265 270
ggg gct cct gcc cag ctc ccc tgc agc ccc aca atc ccc ctc cag gat 864
Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp
275 280 285
ctc agc ctt ctg cga aga gca ggg gtc act tgg cag cat cag cca gac 912
Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp
290 295 300
agt ggc ccg ccc gct gcc gcc ccc ggc cat ccc ctg gcc ccc ggc cct 960
Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro
305 310 315 320
cac ccg gcg gcg ccc tcc tcc tgg ggg ccc agg ccc cgc cgc tac acg 1008
His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr
325 330 335
gtg ctg agc gtg ggt ccc gga ggc ctg cgc agc ggg agg ctg ccc ctg 1056
Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu
340 345 350
cag ccc cgc gtc cag ctg gat gag cgc ggc cgg cag cgc ggg gac ttc 1104
Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe
355 360 365
tcg cta tgg ctg cgc cca gcc cgg cgc gcg gac gcc ggc gag tac cgc 1152
Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg
370 375 380
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Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu
385 390 395 400
cgc ctg ggc cag gcc tcg atg act gcc agc ccc cca gga tct ctc aga 1248
Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg
405 410 415
gcc tcc gac tgg gtc att ttg aac tgc tcc ttc agc cgc cct gac cgc 1296
Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg
420 425 430
cca gcc tct gtg cat tgg ttc cgg aac cgg ggc cag ggc cga gtc cct 1344
Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro
435 440 445
gtc cgg gag tcc ccc cat cac cac tta gcg gaa agc ttc ctc ttc ctg 1392
Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu
450 455 460
ccc caa gtc agc ccc atg gac tct ggg ccc tgg ggc tgc atc ctc acc 1440
Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr
465 470 475 480
tac aga gat ggc ttc aac gtc tcc atc atg tat aac ctc act gtt ctg 1488
Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu
485 490 495
ggt ctg gag ccc cca act agt gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act 1536
Gly Leu Glu Pro Pro Thr Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
500 505 510
cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca 1584
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
515 520 525
gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg 1632
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
530 535 540
acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct 1680
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
545 550 555 560
gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc 1728
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
565 570 575
aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc 1776
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
580 585 590
agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac 1824
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
595 600 605
aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc 1872
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
610 615 620
atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg 1920
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
625 630 635 640
ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc 1968
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
645 650 655
ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc 2016
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
660 665 670
aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac 2064
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
675 680 685
tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc 2112
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
690 695 700
agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct 2160
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
705 710 715 720
ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa 2208
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
725 730 735
tg a 2211
<210> 10
<211> 736
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
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Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
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Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
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65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu
260 265 270
Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp
275 280 285
Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp
290 295 300
Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro
305 310 315 320
His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr
325 330 335
Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu
340 345 350
Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe
355 360 365
Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg
370 375 380
Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu
385 390 395 400
Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg
405 410 415
Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg
420 425 430
Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro
435 440 445
Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu
450 455 460
Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr
465 470 475 480
Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu
485 490 495
Gly Leu Glu Pro Pro Thr Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
500 505 510
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
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660 665 670
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85 90 95
ctg aag acc gat gat cag gat atc tac aag gta tca ata tat gat aca 336
Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr
100 105 110
aaa gga aaa aat gtg ttg gaa aaa ata ttt gat ttg aag att caa gag 384
Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
115 120 125
agg gtc tca aaa cca aag atc tcc tgg act tgt atc aac aca acc ctg 432
Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu
130 135 140
acc tgt gag gta atg aat gga act gac ccc gaa tta aac ctg tat caa 480
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln
145 150 155 160
gat ggg aaa cat cta aaa ctt tct cag agg gtc atc aca cac aag tgg 528
Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp
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acc acc agc ctg agt gca aaa ttc aag tgc aca gca ggg aac aaa gtc 576
Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val
180 185 190
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Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Ala Glu Pro Lys
195 200 205
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Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
210 215 220
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg 768
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc 960
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
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ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca 1008
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag 1056
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340 345 350
gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc 1104
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc 1248
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
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ctg tct ccg ggt aaa tga 1314
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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acc tgg ggt gcc ttg ggt cag gac atc aac ttg gac att cct agt ttt 144
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Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr
100 105 110
aaa gga aaa aat gtg ttg gaa aaa ata ttt gat ttg aag att caa gag 384
Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
115 120 125
agg gtc tca aaa cca aag atc tcc tgg act tgt atc aac aca acc ctg 432
Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu
130 135 140
acc tgt gag gta atg aat gga act gac ccc gaa tta aac ctg tat caa 480
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln
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<213> Homo sapiens
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<221> CDS
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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg 576
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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260 265 270
ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg 864
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acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc 912
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agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac 960
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
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145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
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<211> 1509
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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Met Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
1 5 10 15
gtc ttc tgc aaa gca atg cac gtg gcc cag cct gct gtg gta ctg gcc 96
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
20 25 30
agc agc cga ggc atc gcc agc ttt gtg tgt gag tat gca tct cca ggc 144
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
35 40 45
aaa gcc act gag gtc cgg gtg aca gtg ctt cgg cag gct gac agc cag 192
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
50 55 60
gtg act gaa gtc tgt gcg gca acc tac atg atg ggg aat gag ttg acc 240
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
65 70 75 80
ttc cta gat gat tcc atc tgc acg ggc acc tcc agt gga aat caa gtg 288
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
85 90 95
aac ctc act atc caa gga ctg agg gcc atg gac acg gga ctc tac atc 336
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
100 105 110
tgc aag gtg gag ctc atg tac cca ccg cca tac tac ctg ggc ata ggc 384
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
115 120 125
aac gga acc cag att tat gta att gat cca gaa ccg tgc cca gat tcg 432
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
130 135 140
gat aac atg cac gtg gcc cag cct gct gtg gta ctg gcc agc agc cga 480
Asp Asn Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
145 150 155 160
ggc atc gcc agc ttt gtg tgt gag tat gca tct cca ggc aaa gcc act 528
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr
165 170 175
gag gtc cgg gtg aca gtg ctt cgg cag gct gac agc cag gtg act gaa 576
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
180 185 190
gtc tgt gcg gca acc tac atg atg ggg aat gag ttg acc ttc cta gat 624
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp
195 200 205
gat tcc atc tgc acg ggc acc tcc agt gga aat caa gtg aac ctc act 672
Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr
210 215 220
atc caa gga ctg agg gcc atg gac acg gga ctc tac atc tgc aag gtg 720
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
225 230 235 240
gag ctc atg tac cca ccg cca tac tac ctg ggc ata ggc aac gga acc 768
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
245 250 255
cag att tat gta att gat cca gaa ccg tgc cca gat tct gca gag ccc 816
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Ala Glu Pro
260 265 270
aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa 864
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
275 280 285
ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 912
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
290 295 300
acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 960
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
305 310 315 320
gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 1008
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
325 330 335
gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac 1056
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
340 345 350
agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc tgt cac cag gac tgg 1104
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Cys His Gln Asp Trp
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ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 1152
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
370 375 380
gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa 1200
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
385 390 395 400
cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac 1248
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
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cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 1296
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
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gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 1344
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
435 440 445
acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 1392
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450 455 460
ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc 1440
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
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tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc 1488
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1509
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Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
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Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
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gag ctg ttg gtg gga ata tac ccc tca ggg gtt att gga ctg gtc cct 96
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
cac cta ggg gac agg gag aag aga gat agt gtg tgt ccc caa gga aaa 144
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
tat atc cac cct caa aat aat tcg att tgc tgt acc aag tgc cac aaa 192
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
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gga acc tac ttg tac aat gac tgt cca ggc ccg ggg cag gat acg gac 240
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Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
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Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
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aag aac cag tac cgg cat tat tgg agt gaa aac ctt ttc cag tgc ttc 432
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Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
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Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
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aac gag tgt gtc tcc tgt agt aac tgt aag aaa agc ctg gag tgc acg 576
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
180 185 190
aag ttg tgc cta ccc cag att gag aat gtt aag ggc act gag gac tca 624
Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser
195 200 205
ggc acc aca gca gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca 672
Gly Thr Thr Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
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Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
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ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc 768
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
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Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
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aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg 864
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc 912
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
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Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
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Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
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Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
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Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
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Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
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275 280 285
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325 330 335
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385 390 395 400
Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
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420 425 430
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Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
130 135 140
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145 150 155 160
tgc aag ccc tgt gcc ccg ggg acg ttc tcc aac acg act tca tcc acg 528
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
atg gcc cca ggg gca gta cac tta ccc cag cca gtg tcc aca cga tcc 672
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210 215 220
caa cac acg cag cca act cca gaa ccc agc act gct cca agc acc tcc 720
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225 230 235 240
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Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Gly Ser
245 250 255
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Gly Asn Ile Ser Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp
260 265 270
agt gtg tgt ccc caa gga aaa tat atc cac cct caa aat aat tcg att 864
Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile
275 280 285
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Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His
385 390 395 400
gca ggt ttc ttt cta aga gaa aac gag tgt gtc tcc tgt agt aac tgt 1248
Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys
405 410 415
aag aaa agc ctg gag tgc acg aag ttg tgc cta ccc cag att gag aat 1296
Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn
420 425 430
gtt aag ggc act gag gac tca ggc acc aca gca gag ccc aaa tct tgt 1344
Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Ala Glu Pro Lys Ser Cys
435 440 445
gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg 1392
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
450 455 460
gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg 1440
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
465 470 475 480
atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac 1488
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
485 490 495
gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg 1536
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
500 505 510
cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac 1584
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
515 520 525
cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc 1632
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
530 535 540
aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc 1680
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
545 550 555 560
gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg 1728
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
565 570 575
tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc 1776
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
580 585 590
ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag 1824
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
595 600 605
tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc 1872
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
610 615 620
gtg ctg gac tcc gac ggc tcc tcc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg 1920
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
625 630 635 640
gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg 1968
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
645 650 655
cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct 2016
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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ccg ggt aaa tga 2028
Pro Gly Lys
675
<210> 26
<211> 675
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
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1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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145 150 155 160
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210 215 220
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225 230 235 240
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275 280 285
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290 295 300
Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe
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Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys
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370 375 380
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385 390 395 400
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450 455 460
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500 505 510
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530 535 540
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625 630 635 640
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645 650 655
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
660 665 670
Pro Gly Lys
675
Claims (13)
- 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질을 포함하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, (1) 제 1 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 및 (2) 제 2 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질을 포함하되, 상기 제 1 면역반응에 관여하는 단백질과 상기 제 2 면역반응에 관여하는 단백질이 상이한 것임을 특징으로 하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 면역글로불린이 IgG인 것을 특징으로 하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 면역반응에 관여하는 단백질이 CTLA-4, LAG-3, CD2, TNFR1 및 TNFR2로 이루어진 그룹 중에서 1종 선택되는 것을 특징으로 하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단량체 단백질이 서열번호 10, 서열번호 14, 서열번호 18, 서열번호 22 및 서열번호 26의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 면역반응에 관여하는 단백질이 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, TNF, G-CSF, M-CSF, IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-7R, IL-12R, IL-18R, G-CSFR, M-CSFR, Fas(Apo 1), CD4, CD22, CD27, CD28, CD30, CD31, CD40, CD44, CD54, CD70, CD80, CD86, CD95, CD100, CD119, CD130, CD137, CD154, CD166, ICOS, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, PD-1, OX40, 4-1BB 및 B7H로 이루어진 그룹 중에서 1종 선택되는 것을 특징으로 하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 제 1 면역반응에 관여하는 단백질은 CTLA-4 이고, 상기 제 2 면역반응에 관여하는 단백질은 LAG-3인 것을 특징으로 하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물.
- 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합되고 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질을 포함하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물.
- 제 8항에 있어서, (1) 제 1 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합되고 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 및 (2) 제 2 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 형성된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합되고 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질을 포함하되, 상기 제 1 면역반응에 관여하는 단백질과 상기 제 2 면역반응에 관여하는 단백질이 상이한 것임을 특징으로 하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물.
- 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 면역글로불린이 IgG인 것을 특징으로 하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물.
- 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 면역반응에 관여하는 단백질이 CTLA-4, LAG-3, CD2, TNFR1 및 TNFR2로 이루어진 그룹 중에서 1종 선택되는 것을 특징으로 하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물.
- 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 면역반응에 관여하는 단백질이 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, TNF, G-CSF, M-CSF, IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-7R, IL-12R, IL-18R, G-CSFR, M-CSFR, Fas(Apo 1), CD4, CD22, CD27, CD28, CD30, CD31, CD40, CD44, CD54, CD70, CD80, CD86, CD95, CD100, CD119, CD130, CD137, CD154, CD166, ICOS, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, PD-1, OX40, 4-1BB 및 B7H로 이루어진 그룹 중에서 1종 선택되는 것을 특징으로 하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물.
- 제 9항에 있어서, 상기 제 1 면역반응에 관여하는 단백질은 CTLA-4 이고, 상기 제 2 면역반응에 관여하는 단백질은 LAG-3인 것을 특징으로 하는 장기이식 합병증 치료용 약제학적 조성물.
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