JP6459962B2 - L−アミノ酸の製造法 - Google Patents
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Description
[1]
L−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養してL−アミノ酸を該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりL−アミノ酸を採取すること、を含むL−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌が、acpP−fabFオペロンが弱化されるように改変されていることを特徴とする、方法。
[2]
前記acpP−fabFオペロンの弱化が、acpP−fabFオペロンの遺伝子にコードされるタンパク質の活性の低下である、前記方法。
[3]
acpP−fabFオペロンの遺伝子の発現が弱化されることにより、前記オペロンが弱化された、前記方法。
[4]
前記acpP−fabFオペロンの遺伝子の発現調節配列が改変されることにより、前記遺伝子の発現が弱化された、前記方法。
[5]
前記acpP−fabFオペロンの遺伝子が、acpP遺伝子および/またはfabF遺伝子である、前記方法。
[6]
前記acpP−fabFオペロンの遺伝子が、acpP遺伝子およびfabF遺伝子である、前記方法。
[7]
acpP遺伝子の翻訳開始点の上流−34位のシトシンが他の塩基に置換されることにより、前記acpP−fabFオペロンの遺伝子の発現が弱化された、前記方法。
[8]
acpP遺伝子の翻訳開始点の上流−34位のシトシンがアデニンに置換されることにより、前記acpP−fabFオペロンの遺伝子の発現が弱化された、前記方法。
[9]
前記細菌が、エシェリヒア属、パントエア属、またはエンテロバクター属に属する細菌である、前記方法。
[10]
前記細菌が、エシェリヒア・コリである、前記方法。
[11]
前記L−アミノ酸が、L−リジンである、前記方法。
[12]
L−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリを培地で培養してL−リジンを該培地中または該エシェリヒア・コリの菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりL−リジンを採取すること、を含むL−リジンの製造法であって、
前記エシェリヒア・コリにおいて、acpP−fabFオペロンの遺伝子の発現調節配列が改変されることにより、前記遺伝子の発現が弱化されていることを特徴とする、方法。
[13]
L−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリを培地で培養してL−リジンを該培地中または該エシェリヒア・コリの菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりL−リジンを採取すること、を含むL−リジンの製造法であって、
前記エシェリヒア・コリにおいてacpP遺伝子の翻訳開始点の上流−34位のシトシンが他の塩基に置換されていることを特徴とする、方法。
[14]
L−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリを培地で培養してL−リジンを該培地中または該エシェリヒア・コリの菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりL−リジンを採取すること、を含むL−リジンの製造法であって、
前記エシェリヒア・コリにおいてacpP遺伝子の翻訳開始点の上流−34位のシトシンがアデニンに置換されていることを特徴とする、方法。
本発明の細菌は、L−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌であって、且つ、acpP-fabFオペロンが弱化されるように改変された細菌である。
本発明において、「L−アミノ酸生産能を有する細菌」とは、培地で培養したときに、目的とするL−アミノ酸を生成し、回収できる程度に培地中または菌体内に蓄積する能力を有する細菌をいう。L−アミノ酸生産能を有する細菌は、非改変株よりも多い量の目的とするL−アミノ酸を培地に蓄積することができる細菌であってよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、L−アミノ酸生産能を有する細菌は、好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量の目的とするL−アミノ酸を培地に蓄積することができる細菌であってもよい。
L−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−グルタミン酸生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(gdhA)、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンテターゼ(gltBD)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ(prpC)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ(pyc)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ(pfkA, pfkB)、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)、6−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ(edd)、2−ケト−3−デオキシ−6−ホスホグルコン酸アルドラーゼ(eda)、トランスヒドロゲナーゼが挙げられる。なお、カッコ内は、その酵素をコードする遺伝子の略記号である(以下の記載においても同様)。これらの酵素の中では、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼから選択される1またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
L−グルタミン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−グルタミン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(gdhA)やグルタミンシンセターゼ(glnA)が挙げられる。なお、グルタミンシンセターゼの活性は、グルタミンアデニニルトランスフェラーゼ遺伝子(glnE)の破壊やPII制御タンパク質遺伝子(glnB)の破壊によって増強してもよい(EP1229121)。
L−プロリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−プロリン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、グルタミン酸−5−キナーゼ(proB)、γ‐グルタミル−リン酸レダクターゼ、ピロリン−5−カルボキシレートレダクターゼ(putA)が挙げられる。酵素活性の増強には、例えば、L−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタミン酸−5−キナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が好適に利用できる。
L−スレオニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−スレオニン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、アスパルトキナーゼIII(lysC)、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(asd)、アスパルトキナーゼI(thrA)、ホモセリンキナーゼ(homoserine kinase)(thrB)、スレオニンシンターゼ(threonine synthase)(thrC)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(アスパラギン酸トランスアミナーゼ)(aspC)が挙げられる。これらの酵素の中では、アスパルトキナーゼIII、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼから選択される1またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。L−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制された株に導入してもよい。スレオニン分解が抑制された株としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したE. coli TDH6株(特開2001-346578号)が挙げられる。
L−リジン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−リジン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dihydrodipicolinate synthase)(dapA)、アスパルトキナーゼIII(aspartokinase III)(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dihydrodipicolinate reductase)(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(diaminopimelate decarboxylase)(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(diaminopimelate dehydrogenase)(ddh)(米国特許第6,040,160号)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(phosphoenolpyruvate carboxylase)(ppc)、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(aspartate semialdehyde dehydrogenase)(asd)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspartate aminotransferase)(アスパラギン酸トランスアミナーゼ(aspartate transaminase))(aspC)、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(diaminopimelate epimerase)(dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(tetrahydrodipicolinate succinylase)(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(succinyl-diaminopimelate deacylase)(dapE)、及びアスパルターゼ(aspartase)(aspA)(EP 1253195 A)が挙げられる。これらの酵素の中では、例えば、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼから選択される1またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。また、L−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株では、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo)(EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(nicotinamide nucleotide transhydrogenase)をコードする遺伝子(pntAB)(米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、またはこれらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。アスパルトキナーゼIII(lysC)はL−リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、L−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子を利用してもよい(米国特許5,932,453号明細書)。また、ジヒドロジピコリン酸合成酵素(dapA)L−リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、L−リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA遺伝子を利用してもよい。
L−アルギニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−アルギニン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、N−アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)、N−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ(argJ)、N−アセチルグルタミン酸キナーゼ(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ(argD)、アセチルオルニチンデアセチラーゼ(argE)オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(argF)、アルギニノコハク酸シンターゼ(argG)、アルギニノコハク酸リアーゼ(argH)、カルバモイルリン酸シンターゼ(carAB)が挙げられる。N−アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)遺伝子としては、例えば、野生型の15位〜19位に相当するアミノ酸残基が置換され、L−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型N−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子を用いると好適である(欧州出願公開1170361号明細書)。
L−シトルリンおよびL−オルニチンは、L−アルギニンと生合成経路が共通している。よって、N−アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)、N−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ(argJ)、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ(argD)、および/またはアセチルオルニチンデアセチラーゼ(argE)の酵素活性を上昇させることによって、L−シトルリンおよび/またはL−オルニチンの生産能を付与または増強することができる(国際公開2006-35831号パンフレット)。
L−ヒスチジン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−ヒスチジン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(hisG)、ホスホリボシル−AMPサイクロヒドロラーゼ(hisI)、ホスホリボシル−ATPピロホスホヒドロラーゼ(hisI)、ホスホリボシルフォルミミノ−5−アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ(hisA)、アミドトランスフェラーゼ(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(hisD)が挙げられる。
L−システイン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−システイン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、セリンアセチルトランスフェラーゼ(cysE)や3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ(serA)が挙げられる。セリンアセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば、システインによるフィードバック阻害に耐性の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型cysE遺伝子を細菌に導入することにより増強できる。変異型セリンアセチルトランスフェラーゼは、例えば、特開平11-155571や米国特許公開第20050112731に開示されている。また、3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、セリンによるフィードバック阻害に耐性の変異型3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードする変異型serA遺伝子を細菌に導入することにより増強できる。変異型3−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、例えば、米国特許第6,180,373号に開示されている。
L−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、L−スレオニン要求株や、ノルロイシンに耐性を有する変異株が挙げられる(特開2000-139471)。また、L−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、L−メチオニンによるフィードバック阻害に対して耐性をもつ変異型ホモセリントランスサクシニラーゼを保持する株も挙げられる(特開2000-139471、US20090029424)。なお、L−メチオニンはL−システインを中間体として生合成されるため、L−システインの生産能の向上によりL−メチオニンの生産能も向上させることができる(特開2000-139471、US20080311632)。
L−ロイシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−ロイシン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、leuABCDオペロンの遺伝子にコードされる酵素が挙げられる。また、酵素活性の増強には、例えば、L−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)が好適に利用できる。
L−イソロイシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−イソロイシン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、スレオニンデアミナーゼやアセトヒドロキシ酸シンターゼが挙げられる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
L−バリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−バリン生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ilvGMEDAオペロンやilvBNCオペロンの遺伝子にコードされる酵素が挙げられる。ilvBNはアセトヒドロキシ酸シンターゼを、ilvCはイソメロリダクターゼ(国際公開00/50624号)を、それぞれコードする。なお、ilvGMEDAオペロンおよびilvBNCオペロンは、L−バリン、L−イソロイシン、および/またはL−ロイシンによる発現抑制(アテニュエーション)を受ける。よって、酵素活性の増強のためには、アテニュエーションに必要な領域を除去または改変し、生成するL−バリンによる発現抑制を解除するのが好ましい。また、ilvA遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼは、L−イソロイシン生合成系の律速段階であるL−スレオニンから2−ケト酪酸への脱アミノ化反応を触媒する酵素である。よって、L−バリン生産のためには、ilvA遺伝子が破壊等され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少しているのが好ましい。
L−トリプトファン生産能、L−フェニルアラニン生産能、および/またはL−チロシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、L−トリプトファン、L−フェニルアラニン、および/またはL−チロシンの生合成系酵素から選択される1またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。
本発明の細菌は、acpP-fabFオペロンが弱化されるように改変されている。acpP-fabFオペロンは脂肪酸生合成に関与する(非特許文献1)ため、acpP-fabFオペロンが弱化された細菌を用いてL−アミノ酸生産培養を行った場合、非改変株を用いてL−アミノ酸生産培養を行った場合と比較して、脂肪酸生合成経路への炭素の流入が減る結果、余剰の炭素や還元力がL−アミノ酸生産に用いられ、L−アミノ酸生産が向上すると推定される。本発明の細菌は、L−アミノ酸生産能を有する細菌を、acpP-fabFオペロンが弱化されるように改変することにより取得できる。また、本発明の細菌は、acpP-fabFオペロンが弱化されるように細菌を改変した後に、L−アミノ酸生産能を付与または増強することによっても得ることができる。また、本発明の細菌は、acpP-fabFオペロンが弱化されるように改変されたことによりL−アミノ酸生産能を獲得したものであってもよい。本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
以下に、AcpPタンパク質やFabFタンパク質等のタンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養してL−アミノ酸を該培地中又は該細菌の菌体内に生成蓄積すること、および該培地又は菌体よりL−アミノ酸を採取することを含む、L−アミノ酸の製造法である。本発明においては、1種のL−アミノ酸が製造されてもよく、2種またはそれ以上のL−アミノ酸が製造されてもよい。
L−リジン生産菌として、E. coli WC196ΔcadAΔldc株(FERM BP-11027;WO2010/061890)(以下、WC196LC株ともいう)を用いた。同株のacpPおよびfabF遺伝子からなるacpP-fabFオペロンの上流に、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645)を用いて点変異を導入した。この方法によれば、標的とする遺伝子に対応する配列を合成オリゴヌクレオチドの5'側にデザインし、抗生物質耐性遺伝子に対応する配列を3'側にデザインした合成オリゴヌクレオチドを用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で変異導入株を構築することが出来る。手順を以下に示す。
作成したWC196LCacpP*/pCABD2株を用いて、L−リジン生産培養を行った。同株を、20 mg/Lのストレプトマイシンを含むL-寒天培地にてOD600が約0.6となるまで37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した。その後、適当量ずつ分注、-80℃に保存し、グリセロールストックとした。
実施例1で作成したWC196LCacpP*/pCABD2株およびWC196LC/pCABD2株をそれぞれ実施例2に記載の条件で培養し、培養液を培養17時間目にサンプリングした。RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) とRNeasy Mini Kit (Qiagen) を用いて培養液からRNAを抽出した。得られたRNAを鋳型とし、PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio) を用いて逆転写PCRを行った。得られたcDNAを鋳型とし、配列番号13と14に示す合成オリゴヌクレオチド及び配列番号15と16に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用い、Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) を用いて定量PCRを行った。配列番号13と14に示すオリゴヌクレオチドはacpP遺伝子の塩基配列に対応する。配列番号15と16に示すオリゴヌクレオチドはrrsA (16s rRNA)のORF内部の配列に対応する。rrsA (16s rRNA)を内部標準として、acpP遺伝子のmRNA量を算出した。
L−リジン生産菌として、WC196LC株を用いる。同株のacpPおよびfabF遺伝子からなるacpP-fabFオペロンの上流の領域を、「Red-driven integration」法により、Ptac84プロモーター(ロシア特許出願公開第2006/134574号公報)又はlacプロモーターに置換する。置換される領域は、acpP-fabFオペロンの転写開始点の上流-200〜-1の一部または全体であってよい。例えば、acpP-fabFオペロンの転写開始点の上流-100〜-1、上流-50〜-1、上流-30〜-1、又は上流-30〜-10の領域を置換する。
実施例4で作成したWC196LC Ptac84acpP /pCABD2株とWC196LC Plac acpP /pCABD2株、および対照株としてWC196LC /pCABD2株を用いて、実施例2に記載の方法に従いL−リジン生産培養を行う。
実施例4で作成したWC196LC Ptac84acpP /pCABD2株とWC196LC Plac acpP /pCABD2株、およびWC196LC/pCABD2株をそれぞれ実施例2に記載の条件で培養し、実施例3に記載の方法を用いてacpP遺伝子のmRNA量を算出する。
L−スレオニン生産菌として、E. coli TDH-6株(特開2001-346578号)を用いる。TDH-6株は、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) からプラスミドpVIC40を除去することにより得られる(特開2001-346578号)。実施例1に記載した方法を用いて、TDH-6株のacpP遺伝子の翻訳開始点の34塩基上流のシトシンをアデニンに置換する。又は、実施例4に記載した方法を用いて、TDH-6株のacpP-fabFオペロンの上流の領域をPtac84プロモーター又はlacプロモーターに置換する。置換される領域は、acpP-fabFオペロンの転写開始点の上流-200〜-1の一部または全体であってよい。例えば、acpP-fabFオペロンの転写開始点の上流-100〜-1、上流-50〜-1、上流-30〜-1、又は上流-30〜-10の領域を置換する。
実施例7で作成したTDH-6acpP*/pVIC40株、TDH-6 Ptac84acpP/pVIC40株、TDH-6 Plac acpP/pVIC40株、および対照株としてTDH-6/pVIC40株を用いて、米国特許第7,915,018号に記載の方法に従いL−スレオニン生産培養を行う。
実施例7で作成したTDH-6acpP*/pVIC40株、TDH-6 Ptac84acpP/pVIC40株、TDH-6 Plac acpP/pVIC40株、および対照株としてTDH-6/pVIC40株を用いて、米国特許第7,915,018号に記載の方法に従ってL−スレオニン生産培養を行い、その培養液を用い実施例3に記載の方法に従ってacpP遺伝子のmRNA量を算出する。
配列番号1〜6:プライマー
配列番号7:E. coli MG1655のacpP-fabFオペロンおよびその上流配列の塩基配列
配列番号8:E. coli MG1655のAcpPタンパク質のアミノ酸配列
配列番号9:E. coli MG1655のFabFタンパク質のアミノ酸配列
配列番号10:Pantoea ananatis AJ13355のacpP-fabFオペロンおよびその上流配列の塩基配列
配列番号11:Pantoea ananatis AJ13355のAcpPタンパク質のアミノ酸配列
配列番号12:Pantoea ananatis AJ13355のFabFタンパク質のアミノ酸配列
配列番号13〜16:プライマー
Claims (9)
- L−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養してL−アミノ酸を該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりL−アミノ酸を採取すること、を含むL−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌が、acpP遺伝子の発現が弱化されるように改変されていることを特徴とする、方法。 - 前記遺伝子の発現調節配列が改変されることにより、前記遺伝子の発現が弱化された、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子の翻訳開始点の上流−34位のシトシンがアデニンに置換されることにより、前記遺伝子の発現が弱化された、請求項1または2に記載の方法。
- 前記細菌が、エシェリヒア属、パントエア属、またはエンテロバクター属に属する細菌である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌が、エシェリヒア・コリである、請求項4に記載の方法。
- 前記L−アミノ酸が、L−リジンである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- L−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリを培地で培養してL−リジンを該培地中または該エシェリヒア・コリの菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体よりL−リジンを採取すること、を含むL−リジンの製造法であって、
前記エシェリヒア・コリにおいて、acpP遺伝子の発現調節配列が改変されることにより、前記遺伝子の発現が弱化されていることを特徴とする、方法。 - 前記細菌または前記エシェリヒア・コリが、さらに、fabF遺伝子の発現が弱化されるように改変されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- L−リジン生産能を有するエシェリヒア・コリを培地で培養してL−リジンを該培地中または該エシェリヒア・コリの菌体内に生成蓄積すること、および該培地または菌体より
L−リジンを採取すること、を含むL−リジンの製造法であって、
前記エシェリヒア・コリにおいてacpP遺伝子の翻訳開始点の上流−34位のシトシンがアデニンに置換されていることを特徴とする、方法。
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