BR112015005215B1

BR112015005215B1 - Métodos para a produção de um l-aminoácido e para a produção de l-lisina

Info

Publication number: BR112015005215B1
Application number: BR112015005215-0A
Authority: BR
Inventors: Miku Toyazaki; Keiko Noguchi; Mika Moriya; Yuri Uehara
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc
Priority date: 2013-10-21
Filing date: 2014-10-21
Publication date: 2022-12-13
Also published as: ES2694011T3; EP2886651B1; JP6459962B2; EP2886651A1; CN104736707B; US20150275246A1; BR112015005215A2; EP2886651A4; WO2015060314A1; US9487806B2; JPWO2015060314A1; CN104736707A; PL2886651T3

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO É fornecido um método para produzir de um L-aminoácido. Um L-aminoácido é produzido cultivando um bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e com uma capacidade de produzir L-aminoácido, que foi modificado de maneira tal que o operon acpP-fabF seja atenuado, em um meio, e coletando o L-aminoácido do meio ou células da bactéria.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção refere-se a um método para produzir um L-aminoácido usando uma bactéria. L-aminoácidos são usados de maneira industrial como aditivos para rações de animal, ingredientes de temperos, alimentos e bebidas, infusões de aminoácido, dentre outros.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] L-aminoácidos são produzidos de maneira industrial, por exemplo, por fermentação usando vários micro-organismos com uma capacidade de produzir L-aminoácido. Exemplos de métodos para produzir um L-aminoácido por fermentação incluem, por exemplo, métodos de usar um micro-organismo tipo selvagem (cepa tipo selvagem), métodos de usar uma cepa auxotrófica derivada de uma cepa tipo selvagem, métodos de usar uma cepa mutante de regulação metabólica derivada de uma cepa mutante resistente a qualquer de vários medicamentos de uma cepa tipo selvagem, e métodos de usar uma cepa com características tanto como uma cepa auxotrófica quanto como cepa mutante de regulação metabólica.

[0003] Adicionalmente, nos últimos anos, são usados os microorganismos cuja uma capacidade de produzir L-aminoácido é melhorada por técnicas do DNA recombinante, para a produção de L-aminoácido. Exemplos de métodos para melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido de um micro-organismo incluem, por exemplo, melhorar a expressão de um gene que codifica uma enzima biossintética de L-aminoácido (Documentos de patente 1 e 2), e melhorar o fluxo de uma fonte de carbono em um sistema de biossíntese de L-aminoácido (Documento de patente 3).

[0004] O gene acpP é um gene que codifica a proteína carreadora acil (ACP) (Documento não associado à patente 1). ACP é traduzida como apo- ACP inativa, a seguir 4'-fosfopanteteina como um cofator é adicionado ao resíduo de serina da posição 36 (no caso de Escherichia coli) de apo-ACP por ACP sintase, e apo-ACP é por meio disso colocada em holo-ACP ativa. ACP é uma proteína que desempenha um importante papel na biossíntese de ácido graxo de bactérias, dentre outros. Especificamente, na biossíntese de ácido graxo, ACP (holo-ACP) se liga a uma cadeia de ácido graxo por meio do grupo 4’-fosfopanteteina, carregando por meio disso a cadeia de ácido graxo.

[0005] O gene fabF é um gene que codifica β-cetoacil-ACP sintase II (Documento não associado à patente 1). A β-cetoacil-ACP sintase II é uma das enzimas de biossíntese de ácido graxo, e participa na extensão de cadeia de ácido graxo. Especificamente, β-cetoacil-ACP sintase II catalisa a reação que gera um 3-oxoacil-ACP (número de carbono = n + 2) de um acil ACP (número de carbono = n) e malonil-ACP (EC 2.3.1.41).

[0006] Em Escherichia coli, os genes que participam da biossíntese de ácido graxo, incluindo o gene acpP e gene fabF, existem como o agrupamento de gene yceD-rpmF-plsX-fabHDG-acpP-fabF. Os genes de deste agrupamento de gene são co-transcritos como vários pares de gene (Documento não associado à patente 1). Por exemplo, o gene acpP e o gene fabF são co-transcritos como o operon acpP-fabF. Além disso, o gene fabF também é transcrito de maneira independente com seu próprio promotor. Além do mais, o gene acpP também pode ser co-transcrito a partir do gene fabD e do gene fabG no agrupamento de gene yceD-rpmF-plsX-fabHDG-acpP-fabF.

[0007] Entretanto, a relação entre os genes acpP e fabF, e produção de L-aminoácido não é conhecida.

REFERÊNCIAS À TÉCNICA ANTERIOR

[0008] Documentos de patente: Documento de patente 1: Patente U.S. 5.168.056 Documento de patente 2: Patente U.S. 5.776.736 Documento de patente 3: Patente U.S. 5.906.925

[0009] Documento não associado à patente: Documento não associado à patente 1: Zhang Y, Cronan JE Jr., J Bacteriol., 1996 Junho; 178(12):3614-20

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Objetivo a ser atingido pela invenção

[00010] Um objetivo da presente invenção é desenvolver uma técnica inédita para melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido de uma bactéria, e fornecer por meio disso um método para produzir de maneira eficiente um L-aminoácido. Meios para atingir o objetivo

[00011] Conduziram-se várias pesquisas a fim de atingir o objetivo anteriormente mencionado. Em função disso, foi observado que uma capacidade de produzir L-aminoácido de uma bactéria pode ser melhorada modificando a bactéria, de maneira tal que a expressão dos genes acpP e fabF seja reduzida, e finalize a presente invenção.

[00012] Isto é, a presente invenção pode ser realizada, por exemplo, da maneira a seguir: [1] Um método para produzir um L-aminoácido compreendendo: cultivar uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e com uma capacidade de produzir L-aminoácido em um meio para produzir e acumular um L-aminoácido no meio ou células da bactéria; e coletar o L-aminoácido do meio ou células, em que a bactéria foi modificada de maneira tal que o operon acpP-fabF seja atenuado. [2] O método tal como mencionado acima, em que a dita inclinação do operon acpP-fabF refere-se a uma redução na atividade de uma proteína codificada por um gene do operon acpP-fabF. [3] O método da maneira mencionada anteriormente, em que o operon acpP-fabF seja atenuado atenuando a expressão de um gene do operon acpP-fabF. [4] O método da maneira mencionada anteriormente, em que a expressão do gene do operon acpP-fabF seja atenuado modificando uma sequência de controle de expressão do gene. [5] O método da maneira mencionada anteriormente, em que o gene do operon acpP-fabF consiste no gene acpP e/ou no gene fabF. [6] O método da maneira mencionada anteriormente, em que o gene do operon acpP-fabF consiste no gene acpP e no gene fabF. [7] O método da maneira mencionada anteriormente, em que a expressão do gene do operon acpP-fabF seja atenuado substituindo a citosina na posição -34 a montante a partir do sítio de iniciação de tradução do gene acpP por uma outra base. [8] O método da maneira mencionada anteriormente, em que a expressão do gene do operon acpP-fabF seja atenuado substituindo a citosina na posição -34 a montante a partir do sítio de iniciação de tradução do gene acpP por adenina. [9] O método da maneira mencionada anteriormente, em que a bactéria é uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia, Pantoea, ou Enterobacter. [10] O método da maneira mencionada anteriormente, em que a bactéria é Escherichia coli. [11] O método da maneira mencionada anteriormente, em que o L- aminoácido é L-lisina. [12] Método para a produção de L-lisina que compreende: a cultura de Escherichia coli, com capacidade de produção de L-lisina num meio para produzir e acumular a L-lisina nas células de Escherichia coli ou de forma; e recolha de L-lisina a partir do meio ou células, em que a expressão de um gene do operon acpP-fabF foi atenuada na Escherichia coli, modificando uma sequência de controle da expressão do gene. [13] Método para a produção de L-lisina que compreende: a cultura de Escherichia coli, com capacidade de produção de L-lisina num meio para produzir e acumular a L-lisina na células de Escherichia coli ou de forma; e recolha de L-lisina a partir do meio ou células, em que a citosina na posição -34 a montante do local de iniciação da tradução do gene acpP foi substituída com uma outra base na Escherichia coli. [14] Método para a produção de L-lisina que compreende: a cultura de Escherichia coli, com capacidade de produção de L-lisina num meio para produzir e acumular a L-lisina na células de Escherichia coli ou de forma; e recolha de L-lisina a partir do meio ou células, em que a citosina na posição -34 a montante do local de iniciação da tradução do gene acpP foi substituído com adenina na Escherichia coli.

[00013] Daqui por diante, a presente invenção será explicada em detalhes.

[00014] O método da presente invenção é um método para produzir um L-aminoácido compreendendo cultivar uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae, e com uma capacidade de produzir L-aminoácido em um meio para produzir e acumular um L-aminoácido no meio ou células da bactéria, e coletar o L-aminoácido do meio ou células, em que a bactéria foi modificada, de maneira tal que o operon acpP-fabF seja atenuado. A bactéria usada para este método também é referida como "a bactéria da presente invenção". <1> Bactéria da presente invenção

[00015] A bactéria da presente invenção é uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e com uma capacidade de produzir L-aminoácido, que foi modificada de maneira tal que o operon acpP-fabF seja atenuado. <1-1> Bactéria com capacidade de produzir L-aminoácido

[00016] Na presente invenção, uma "bactéria com uma capacidade de produzir L-aminoácido" refere-se a uma bactéria com uma capacidade para produzir e acumular um L-aminoácido objetivo em um meio ou células da bactéria, em um grau tal que o L-aminoácido pode ser coletado, quando a bactéria é cultivada no meio. A bactéria com uma capacidade de produzir L-aminoácido pode ser uma bactéria que pode acumular um L- aminoácido objetivo em um meio, em uma quantidade maior do que aquela obtida com uma cepa não modificada. Exemplos da cepa não modificada incluem cepas tipo selvagem e cepas parentais. A bactéria com uma capacidade de produzir L-aminoácido pode ser uma bactéria que pode acumular um L-aminoácido objetivo em um meio, em uma quantidade preferivelmente de 0,5 g/L ou mais, mais preferivelmente 1,0 g/L ou mais.

[00017] Exemplos do L-aminoácido incluem aminoácidos básicos tais como L-lisina, L-ornitina, L-arginina, L-histidina, e L-citrulina; aminoácidos alifáticos tais como L-isoleucina, L-alanina, L-valina, L-leucina, e glicina; aminoácidos que são ácidos hidróxi-monoaminocarboxílicos tais como L- treonina e L-serina; aminoácidos cíclicos tais como L-prolina; aminoácidos aromáticos tais como L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano; aminoácidos contendo enxofre tais como L-cisteína, L-cistina, e L-metionina; aminoácidos acídicos tais como ácido L-glutâmico e ácido L-aspártico; e aminoácidos com um grupo amida na cadeia lateral tais como L-glutamina e L-asparagina. A bactéria da presente invenção pode apresentar uma capacidade de produzir um único tipo de L-aminoácido, ou dois ou mais tipos de L-aminoácidos.

[00018] Na presente invenção, o termo “aminoácido” pode referir-se a um L-aminoácido a menos que de outra forma declarada. Adicionalmente, o L-aminoácido a ser produzido pode ser um composto livre, um sal deste, ou uma mistura destes. Isto é, na presente invenção, o termo “L-aminoácido” pode referir-se a um L-aminoácido em uma forma livre, um sal deste, ou uma mistura destes a não ser que condicionado de outra forma. Exemplos do sal serão descritos posteriormente.

[00019] Exemplos de bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae incluem bactérias que pertencem ao gênero Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Morganella, ou similares. Especificamente, bactérias classificadas na família Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada na base de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347) podem ser usadas.

[00020] As bactérias Escherichia não são particularmente limitadas, e exemplos destas incluem aquelas classificadas no gênero Escherichia de acordo com a taxonomia conhecida pelos versados na técnica de microbiologia. Exemplos das bactérias Escherichia incluem, por exemplo, aquelas descritas no trabalho de Neidhardt et al. (Backmann B.J., 1996, Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K- 12, pp.2460-2488, tabela 1, Em F.D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, Segunda Edição, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.). Exemplos das bactérias Escherichia incluem, por exemplo, Escherichia coli. Os exemplos específicos de Escherichia coli incluem, por exemplo, Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) e Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) derivadas do protótipo de cepa tipo selvagem, cepa K-12.

[00021] As bactérias Enterobacter não são particularmente limitadas, e exemplos destas incluem aquelas classificadas no gênero Enterobacter, de acordo com classificação conhecida pelos versados na técnica de microbiologia. Exemplos da bactéria Enterobacter incluem, por exemplo, Enterobacter agglomerans e Enterobacter aerogenes. Exemplos específicos de Enterobacter agglomerans incluem, por exemplo, a cepa Enterobacter agglomerans ATCC 12287. Exemplos específicos de Enterobacter aerogenes incluem, por exemplo, a cepa Enterobacter aerogenes ATCC 13048, cepa NBRC 12010 (Biotechnol Bioeng., 2007, Mar. 27;98(2):340-348), e cepa AJ110637 (FERM ABP-10955). Exemplos da bactéria Enterobacter também incluem, por exemplo, as cepas descritas no pedido de patente Européia submetida à inspeção pública (EP-A) No. 0952221. Além disso, Enterobacter agglomerans também incluem algumas cepas classificadas como Pantoea agglomerans.

[00022] As bactérias Pantoea não são particularmente limitadas, e exemplos destas incluem aquelas classificadas no gênero Pantoea de acordo com classificação conhecida pelos versados na técnica de microbiologia. Exemplos das bactérias Pantoea incluem, por exemplo, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans, e Pantoea citrea. Exemplos específicos de Pantoea ananatis incluem, por exemplo, a cepa Pantoea ananatis LMG20103, cepa AJ13355 (FERM BP-6614), cepa AJ13356 (FERM BP-6615), cepa AJ13601 (FERM BP-7207), cepa SC17 (FERM BP- 11091), e cepa SC17(0) (VKPM B-9246). Algumas cepas de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, ou Pantoea stewartii com base na análise de sequência de nucleotídeo de RNAr 16S etc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)). Na presente invenção, as bactérias Pantoea incluem aquelas reclassificadas no gênero Pantoea as descrito anteriormente.

[00023] Exemplos das bactérias Erwinia incluem Erwinia amylovora e Erwinia carotovora. Exemplos das bactérias Klebsiella incluem Klebsiella planticola.

[00024] Estas cepas são disponíveis, por exemplo, a partir de American Type Culture Collection (Address: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos). Isto é, os números de registro são fornecidos às respectivas cepas, e as cepas podem ser ordenadas usando e números de registro (refere-se a http://www.atcc.org/). Os números de registro das cepas são listados no catálogo do American Type Culture Collection.

[00025] A bactéria da presente invenção pode ser uma bactéria inerente com uma capacidade de produzir L-aminoácido, ou pode ser uma bactéria modificada de maneira tal que apresenta uma capacidade de produzir L- aminoácido. A bactéria com uma capacidade de produzir L-aminoácido pode ser obtida aumentando uma capacidade de produzir L-aminoácido em uma bactéria como esta, da maneira mencionada anteriormente, ou melhorando uma capacidade de produzir L-aminoácido de uma bactéria como esta, da maneira mencionada anteriormente.

[00026] Para aumentar ou melhorar uma capacidade de produzir L- aminoácido, os métodos convencionalmente empregados na produção de cepas que produzem aminoácido de bactérias corineformes, Escherichia bactérias, dentre outros (ver "Amino acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1a Edição, publicada em 30 de maio de 1986, pp.77-100) podem ser usados. Exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, adquirir uma cepa mutante auxotrófica, adquirir uma cepa resistente análoga à L- aminoácido, adquirir uma cepa mutante de regulação metabólica, e construir uma cepa recombinante na qual a atividade de uma enzima biossintética de L- aminoácido é melhorada. Na produção de bactérias que produzem L- aminoácido, uma das propriedades descritas anteriormente tais como auxotrofia, resistência ao análogo, e mutação por regulação metabólica pode ser melhorada sozinha, ou duas ou três ou mais de tais propriedades podem ser melhoradas em combinação. Também, na produção de bactérias que produzem L-aminoácido, a atividade de uma das enzimas biossintéticas de L- aminoácido pode ser melhorada sozinha, ou as atividades de duas ou três ou mais de tais enzimas pode ser melhorada em combinação. Além do mais, melhorar a(s) propriedade(s) tais como auxotrofia, resistência ao análogo, e mutação por regulação metabólica pode ser combinado com melhorar a(s) atividade(s) de enzima(s) biossintética(s).

[00027] Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente análoga à L- aminoácido, ou cepa mutante de regulação metabólica com uma capacidade de produzir L-aminoácido pode ser obtida submetendo uma cepa parental ou cepa tipo selvagem a um tratamento de mutagênese usual, e a seguir selecionando uma cepa que exibe autotrofia, resistência ao análogo, ou uma mutação por regulação metabólica, e com uma capacidade de produzir L- aminoácido a partir das cepas mutantes obtidas. Exemplos do tratamento de mutagênese usual incluem irradiação de raios-X ou ultravioleta e um tratamento com um agente de mutação tais como N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina (MNNG), metanossulfonato de etila (EMS), e metanossulfonato de metila (MMS).

[00028] Uma capacidade de produzir L-aminoácido também pode ser aumentada ou melhorada melhorando a atividade de uma enzima envolvida na biossíntese de um L-aminoácido objetivo. Uma atividade enzimática pode ser melhorada, por exemplo, modificando uma bactéria de maneira tal que a expressão de um gene que codifica a enzima seja melhorada. Métodos para melhorar a expressão de gene são descritos em WO00/18935, EP 1010755 A, dentre outros. Os procedimentos detalhados para melhorar a atividade enzimática serão descritos posteriormente.

[00029] Adicionalmente, uma capacidade de produzir L-aminoácido também pode ser aumentada ou melhorada reduzindo a atividade de uma enzima que catalisa uma reação que se ramifica a partir da via biossintética de um L-aminoácido objetivo para gerar um composto sem ser o L-aminoácido objetivo. A "enzima que catalisa uma reação que se ramifica a partir da via biossintética de um L-aminoácido objetivo para gerar um composto sem ser o L-aminoácido objetivo" aqui referida inclui uma enzima envolvida na decomposição do aminoácido objetivo. O método para reduzir uma atividade enzimática será descrito posteriormente.

[00030] Daqui por diante, bactérias que produzem L-aminoácido e métodos para aumentar ou melhorar uma capacidade de produzir L- aminoácido será especificamente exemplificada. Todas as propriedades das bactérias que produzem L-aminoácido e modificações para aumentar ou melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido podem ser usadas independentemente ou em qualquer combinação apropriada. <Bactérias produtoras de ácido L-glutâmico>

[00031] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar a capacidade de produzir ácido L-glutâmico incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma maior atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas de biossíntese de ácido L-glutâmico. Exemplos de tais enzimas incluem, mas sem limitação particular, glutamato desidrogenase (gdhA), glutamina sintetase (glnA), glutamato sintetase (gltBD), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (gltA), metilcitrato sintase (prpC), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato carboxilase (pyc), piruvato desidrogenase (aceEF, lpdA), piruvato quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgmI), fosfoglicerato quinase (pgk), gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (tpiA), frutose bisfosfato aldolase (fbp), fosfofrutoquinase (pfkA, pfkB), glucose fosfato isomerase (pgi), 6-fosfogluconato desidratase (edd), 2-ceto-3-desóxi-6- fosfogluconato aldolase (eda), e transidrogenase. São mostrados nos parênteses após os nomes das enzimas os nomes dos genes que codificam as enzimas (o mesmo pode se aplicar às mesmas ocasiões daqui por diante). É preferível melhorar a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas, por exemplo, de glutamato desidrogenase, citrato sintase, fosfoenol piruvato carboxilase, e metilcitrato sintase, entre estas enzimas.

[00032] Exemplos de cepas que pertencem à família Enterobacteriaceae e são modificadas de maneira tal que a expressão do gene citrato sintase, gene fosfoenolpiruvato carboxilase, e/ou gene glutamato desidrogenase seja aumentada, incluem aqueles revelados em EP 1078989 A, EP 955368 A, e EP 952221 A. Adicionalmente, exemplos de cepas que pertencem à família Enterobacteriaceae e são modificadas de maneira tal que a expressão de um gene da via Entner-Doudoroff (edd, eda) seja melhor incluem aqueles revelados em EP 1352966 B.

[00033] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar capacidade de produzir ácido L-glutâmico também incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma atividade ou atividades reduzidas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas que catalisam uma reação ramificada a partir da via de biossíntese de L-glutamina para gerar um composto sem ser ácido L-glutâmico. Exemplos de tais enzimas incluem, mas sem limitação particular, isocitrato liase (aceA), α-cetoglutarato desidrogenase (sucA), fosfotransacetilase (pta), acetato quinase (ack), ácido acetoidróxi sintase (ilvG), acetolactato sintase (ilvI), formato acetiltransferase (pfl), lactato desidrogenase (ldh), álcool desidrogenase (adh), glutamato decarboxilase (gadAB), succinato desidrogenase (sdhABCD), e 1-pirolina-5-carboxilato desidrogenase (putA). É preferível reduzir ou deletar, por exemplo, a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase, entre outras enzimas.

[00034] As bactérias Escherichia com uma menor atividade de α- cetoglutarato desidrogenase ou deficiência na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase, e métodos para obtê-los são descritos nas patentes U.S. 5.378.616 e 5.573.945. Adicionalmente, métodos para reduzir ou eliminar a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase de bactérias Enterobacteriaceae tais como bactérias Pantoea, bactérias Enterobacter, bactérias Klebsiella e bactérias Erwinia são reveladas nas patentes U.S. 6.197.559, 6.682.912, 6.331.419, 8.129.151 e WO2008/075483. Exemplos específicos de bactérias Escherichia com uma menor atividade de α-cetoglutarato desidrogenase ou deficiência na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase incluem as seguintes cepas. E. coli W3110sucA::Kmr E. coli AJ12624 (FERM BP-3853) E. coli AJ12628 (FERM BP-3854) E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)

[00035] E. coli W3110sucA::Kmr é uma cepa obtida interrompendo o gene sucA que codifica α-cetoglutarato desidrogenase de E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase.

[00036] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e cepas parentais para derivá-las também incluem bactérias Pantoea, tais como a cepa Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), cepa Pantoea ananatis SC17 (FERM BP-11091), e cepa Pantoea ananatis SC17(0) (VKPM B-9246). A cepa AJ13355 é uma cepa isolada do solo em Iwata-shi, Shizuoka-ken, Japão como uma cepa que pode proliferar em um meio com pH baixo contendo ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono. A cepa SC17 é uma cepa selecionada como uma cepa mutante que produz pouco phlegm a partir da cepa AJ13355 (Patente U.S. 6.596.517). A cepa SC17 foi depositada na agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depository (atualmente Agência administrativa independente, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 4 de fevereiro de 2009, e determinado um número de acesso de FERM BP-11091. A cepa AJ13355 foi depositada na National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente, agência administrativa independente, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 19 de fevereiro de 1998 e determinado um número de acesso de FERM P-16644. A seguir, o depósito foi convertido em um depósito internacional nas provisões de Budapest Treaty em 11 de janeiro de 1999, e determinado um número de acesso de FERM BP-6614.

[00037] Adicionalmente, exemplos de bactérias produtoras de ácido L- glutâmico e cepas parentais para derivá-las também incluem bactérias Pantoea com uma menor atividade de α-cetoglutarato desidrogenase ou deficiência na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase. Exemplos de tais cepas incluem a cepa AJ13356 (Patente U.S. 6.331.419), que é uma cepa deficiente no gene da subunidade de α-cetoglutarato desidrogenase E1 (sucA) da cepa AJ13355, e a cepa SC17sucA (Patente U.S. 6.596.517), que é uma cepa deficiente no gene sucA da cepa SC17. A cepa AJ13356 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente, agência administrativa independente, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 19 de fevereiro de 1998, e determinado um número de acesso de FERM P-16645. A seguir, o depósito foi convertido em um depósito internacional nas provisões do Budapest Treaty em 11 de janeiro de 1999, e determinado um número de acesso de FERM BP-6616. A cepa SC17sucA foi determinada com um número privado de AJ417, e depositada na agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (atualmente, agência administrativa independente, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 26 de fevereiro de 2004, com um número de acesso de FERM BP-8646.

[00038] A cepa AJ13355 foi identificada como Enterobacter agglomerans quando foi isolada, mas foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis com base no sequenciamento de nucleotídeos de RNAr 16S dentre outros. Portanto, embora as cepas AJ13355 e AJ13356 sejam depositadas no local de depósito anteriormente mencionado como Enterobacter agglomerans, estas são referidas como Pantoea ananatis nesta especificação.

[00039] Além do mais, exemplos de bactérias produtoras de ácido L- glutâmico e cepas parentais para derivá-las também incluem bactérias Pantoea, tais como a cepa Pantoea ananatis SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, cepa Pantoea ananatis AJ13601, cepa Pantoea ananatis NP106, e cepa Pantoea ananatis NA1. A cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB foi obtida introduzindo o plasmídeo RSFCPG contendo o gene citrato sintase (gltA), gene fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), e gene glutamato desidrogenase (gdhA), derivados de Escherichia coli, e o plasmídeo pSTVCB contendo o gene citrato sintase (gltA) derivado de Brevibacterium lactofermentum, na cepa SC17sucA. A cepa AJ13601 é uma cepa selecionada da cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB como uma cepa resistente a uma concentração elevada de ácido L-glutâmico em pH baixo. A cepa NP106 foi obtida da cepa AJ13601 curando os plasmídeos RSFCPG e pSTVCB. A cepa AJ13601 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente, agência administrativa independente, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 18 de agosto de 1999, e determinado um número de acesso FERM P-17516. A seguir, o depósito foi convertido em um depósito internacional nas provisões do Budapest Treaty em 6 de julho de 2000, e determinado um número de acesso FERM BP-7207.

[00040] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e cepas parentais para derivá-las também incluem cepas em que tanto a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase (sucA) quanto a atividade de succinato desidrogenase (sdh) são reduzidas ou eliminadas (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2010-041920). Exemplos específicos de tais cepas incluem, por exemplo, a cepa duplamente deficiente sucAsdhA da cepa Pantoea ananatis NA1 (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2010-041920).

[00041] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e cepas parentais para derivá-las também incluem cepas mutantes auxotróficas. Exemplos específicos de cepas mutantes auxotróficas incluem, por exemplo, E. coli VL334thrC+ (VKPM B-8961, EP 1172433). E. coli VL334 (VKPM B-1641) é uma cepa auxotrófica L-isoleucina e L-treonina com mutação nos genes thrC e ilvA (Patente U.S. 4.278.765). E. coli VL334thrC+ é um Bactéria auxotrófica L- isoleucina produtora de ácido L-glutâmico, obtida introduzindo um alelo tipo selvagem do gene thrC na cepa VL334. O alelo tipo selvagem do gene thrC foi introduzido pelo método de transdução geral usando um bacteriófago P1 crescido nas células da cepa tipo selvagem E. coli K-12 (VKPM B-7).

[00042] Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e cepas parentais para derivá-las também incluem cepas com resistência a um análogo de ácido aspártico. Tais cepas também podem ser deficientes na atividade de α- cetoglutarato desidrogenase. Exemplos específicos de cepas com resistência a um análogo de ácido aspártico e deficiência na atividade de α-cetoglutarato desidrogenase incluem, por exemplo, E. coli AJ13199 (FERM BP-5807, Patente U.S. 5.908.768), E. coli FFRM P-12379, que apresenta adicionalmente uma menor capacidade de decompor ácido L-glutâmico (Patente U.S. 5.393.671), e E. coli AJ13138 (FERM BP-5565, Patente U.S. 6.110.714).

[00043] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar capacidade de produzir ácido L-glutâmico também incluem um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou a atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase são/é melhorada(s) (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kohyo) No. 2008-509661). Cada uma de atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e atividade de frutose- 6-fosfato fosfocetolase pode ser melhorada, ou ambas podem ser melhoradas. Nesta especificação, D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e frutose-6-fosfato fosfocetolase podem ser coletivamente referidas como fosfocetolase.

[00044] A atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase significa uma atividade para converter xilulose-5-fosfato em glicelaldeído-3-fosfato e acetil fosfato com consumo de ácido fosfórico para liberar uma molécula de H2O. Esta atividade pode ser medida pelo método descrito por Goldberg, M. et al. (Methods Enzymol., 9, 515-520, 1996) ou o método descrito por L. Meile (J. Bacteriol., 183:2929-2936, 2001).

[00045] A atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase significa uma atividade para converter frutose-6-fosfato em eritrose-4-fosfato e acetil fosfato com consumo de ácido fosfórico para liberar uma molécula de H2O. Esta atividade pode ser medida pelo método descrito por Racker, E. (Metods Enzymol., 5, 276-280, 1962) ou o método descrito por L. Meile (J. Bacteriol., 183:2929-2936, 2001).

[00046] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar capacidade de produzir L-glutamina também incluem, por exemplo, um método de melhorar a expressão do gene yhfK (WO2005/085419) ou do gene ybjL (WO2008/133161), que é um gene de secreção de ácido L-glutâmico.

<Bactérias produtoras de L-glutamina>

[00047] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar capacidade de produzir L-glutamina incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma maior atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas de biossíntese de L-glutamina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas sem limitação particular, glutamato desidrogenase (gdhA) e glutamina sintetase (glnA). A atividade de glutamina sintetase também pode ser melhorada por interrupção do gene glutamina adenililtransferase (glnE) ou interrupção do gene de controle de proteína PII (glnB) (EP 1229121).

[00048] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar capacidade de produzir L-glutamina também incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma atividade ou atividades reduzidas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas que catalisam uma reação ramificada a partir da via de biossíntese de L-glutamina, para gerar um composto sem ser L-glutamina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas sem limitação particular, glutaminase.

[00049] Exemplos específicos de bactérias produtoras de ácido L- glutâmico e cepas parentais para derivá-las incluem uma cepa que pertence ao gênero Escherichia e com um mutante de glutamina sintetase, em que o resíduo tirosina da posição 397 é substituído por um outro resíduo de aminoácido (Pedido de patente publicado U.S. 2003/0148474).

<Bactérias produtoras de L-Prolina>

[00050] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar capacidade de produzir L- prolina incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma maior atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas da biossíntese de L-prolina. Exemplos de tais enzimas incluem glutamato-5- quinase (proB), Y-glutamilfosfato redutase, e pirolina-5-carboxilato redutase (putA). Para melhorar a atividade de uma enzima como esta, por exemplo, o gene proB que codifica uma glutamato quinase, dessensibilizado na inibição por retroalimentação por L-prolina (Patente Alemã 3127361) pode ser preferivelmente usado.

[00051] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar capacidade de produzir L-glutamina também incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma atividade reduzida de uma enzima envolvida na decomposição de L-prolina. Exemplos de uma enzima como esta incluem prolina desidrogenase e ornitina aminotransferase.

[00052] Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-prolina e cepas parentais para derivá-las incluem, por exemplo, E. coli NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (Patente Inglesa 2075056), E. coli VKPM B-8012 (Pedido de patente Russa 2000124295), cepas mutantes do plasmídeo de E. coli descritas na patente Alemã 3127361, as cepas mutantes do plasmídeo de E. coli descritas por Bloom F.R. et al. (O 15th Miami winter symposium, 1983, p. 34), a cepa E. coli 702 (VKPMB-8011), que é uma cepa resistente à 3,4-desidroxiprolina e azetidina-2- carboxilato, e a cepa de E. coli 702ilvA (VKPMB-8012), que é uma cepa deficiente no gene ilvA da cepa 702 (EP 1172433).

<Bactérias produtoras de L-Treonina>

[00053] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar a capacidade de produzir L-treonina incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma maior atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas de biossíntese de L-treonina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas sem limitação particular, aspartoquinase III (lysC), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), aspartoquinase I (thrA), homoserina quinase (thrB), treonina sintase (thrC), e aspartato aminotransferase (aspartato transaminase) (aspC). Entre estas enzimas, é preferível melhorar atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas de aspartoquinase III, aspartato semialdeído desidrogenase, aspartoquinase I, homoserina quinase, aspartato aminotransferase, e treonina sintase. Qualquer dos genes que codificam as enzimas de biossíntese de L-treonina pode ser introduzido em uma bactéria com uma capacidade reduzida de decompor treonina. Exemplos de uma cepa como esta, em que a decomposição de treonina é suprimida incluem, por exemplo, a cepa E. coli TDH6, que é deficiente na atividade de treonina desidrogenase (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2001-346578).

[00054] As atividades das enzimas de biossíntese de L-treonina são inibidas pelo produto final, L-treonina. Portanto, para construir cepas produtoras de L-treonina, é preferível que os genes das enzimas de biossíntese de L-treonina sejam modificados de maneira tal que as enzimas são dessensibilizadas na inibição por retroalimentação por L-treonina. Os genes anteriormente mencionados thrA, thrB, e thrC constituem o operon treonina, que forma uma estrutura atenuadora. A expressão do operon treonina é inibida por isoleucina e treonina no meio de cultura e também suprimida por atenuação. Portanto, a expressão do operon treonina pode ser melhorada removendo a sequência principal ou o atenuador na região de atenuação (refere-se a Lynn, S.P., Burton, W.S., Donohue, T.J., Gould, R.M., Gumport, R.L, e Gardner, J.F., J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); WO02/26993; WO2005/049808; e WO2003/097839).

[00055] O promotor natural do operon treonina está presente a montante do operon treonina, e pode ser substituído por um promotor não natural (refere-se a WO98/04715). Também, o operon treonina pode ser construído de maneira tal que os genes de biossíntese de treonina sejam expressos no controle do repressor e promotor de fago X (Patente Europeia 0593792). Além do mais, uma bactéria modificada, de maneira tal que seja dessensibilizada na inibição por retroalimentação por L-treonina, também pode ser obtida selecionando uma cepa resistente ao ácido α-amino-β-hidroxi- isovalérico (AHV), que é um análogo de L-treonina.

[00056] É preferível que a expressão quantidade do operon treonina, isto é, modificada de maneira a ser dessensibilizada na inibição por retroalimentação por L-treonina da maneira descrita anteriormente, seja aumentada em um hospedeiro aumentando o número de cópia deste ou ligando-o a um potente promotor. O número de cópia pode ser aumentado introduzindo um plasmídeo contendo o operon treonina em um hospedeiro. O número de cópia também pode ser aumentado transferindo o operon treonina ao genoma de um hospedeiro usando um transposon, fago Mu, ou similares.

[00057] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar a capacidade de produzir L-treonina também incluem, por exemplo, um método de aumentar resistência à L-treonina em um hospedeiro, e um método de aumentar resistência à L-homoserina em um hospedeiro. Tal resistência pode ser aumentada, por exemplo, melhorando a expressão de um gene que aumenta resistência à L-treonina ou um gene que aumenta resistência à L- homoserina. Exemplos dos genes que aumentam a resistência anteriormente mencionada incluem o gene rhtA (Res. Microbiol. 154:123-135 (2003)), gene rhtB (Patente Europeia submetida à inspeção pública 0994190), gene rhtC (Patente Europeia submetida à inspeção pública 1013765), gene yfiK, e gene yeaS (Patente Europeia submetida à inspeção pública 1016710). Assim como os métodos para aumentar a resistência à L-treonina em um hospedeiro, aqueles descritos na patente Europeia submetida à inspeção pública 0994190 e WO90/04636 podem ser referidos.

[00058] Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-Treonina e cepas parentais para derivá-las incluem, por exemplo, E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996, patentes U.S. 5.175.107 e 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081, Patente U.S. 5.631.157), E. coli NRRL-21593 (Patente U.S. 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (Patente U.S. 5.474.918), E. coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (Patente U.S. 5.376.538), E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (em Russo), 14, 947-956 (1978)), E. coli VL643 e VL2055 (EP 1149911 A), e E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792 B).

[00059] A cepa VKPM B-3996 é uma cepa obtida introduzindo o plasmídeo pVIC40 na cepa TDH-6. A cepa TDH-6 apresenta capacidade de assimilar sacarose e é deficiente no gene thrC, e o gene ilvA desta apresenta uma mutação fraca. Esta cepa VKPM B-3996 também apresenta uma mutação no gene rhtA, que aumenta a resistência à concentração elevada de treonina ou homoserina. O plasmídeo pVIC40 é um plasmídeo obtido inserindo o operon thrA*BC contendo um gene mutante thrA que codifica uma aspartoquinase-homoserina desidrogenase I resistente a inibição por retroalimentação por treonina e os genes tipo selvagem thrBC em um vetor derivado de RSFl0l0 (Patente U.S. 5.705.371). Este gene mutante thrA codifica uma aspartoquinase-homoserina desidrogenase I que é substancialmente dessensibilizada na inibição por retroalimentação por treonina. A cepa B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 no AllUnion Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Rússia) com o número de acesso RIA 1867. Esta cepa também foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, FGUP GosNII Genetika, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Rússia) em 7 de abril de 1987 com o número de acesso VKPM B-3996.

[00060] A cepa VKPM B-5318 é prototrófica com relação à isoleucina, e carrega o plasmídeo pPRT614, que corresponde ao plasmídeo pVIC40, do qual a região regulatória do operon treonina é substituída pelo reprossor fago X Cl sensível à temperatura e promotor PR. A cepa VKPM B-5318 foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Rússia) em 3 de maio de 1990 com o número de acesso de VKPM B-5318.

[00061] O gene thrA que codifica aspartoquinase-homoserina desidrogenase I de E. coli foi elucidado (números de nucleotídeos 337 a 2799, acesso ao GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrA está localizado entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E. coli K-12. O gene thrB que codifica homoserina quinase de Escherichia coli foi elucidado (números de nucleotídeos 2801 a 3733, acesso ao GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrB está localizado entre os genes thrA e thrC no cromossomo de E. coli K-12. O gene thrC que codifica treonina sintase de E. coli foi elucidado (números de nucleotídeos 3734 a 5020, acesso ao GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). O gene thrC está localizado entre o gene thrB e o quadro de leitura aberto yaaX no cromossomo de E. coli K-12. O operon thrA*BC contendo um gene mutante thrA que codifica uma aspartoquinase- homoserina desidrogenase I resistente a inibição por retroalimentação por treonina e os genes tipo selvagem thrBC podem ser obtidos do bem conhecido plasmídeo pVIC40, que está presente na cepa E. coli VKPM B-3996 produtora de treonina (Patente U.S. 5.705.371).

[00062] O gene rhtA de E. coli está localizado em 18 min no cromossomo de E. coli, próximo do operon glnHPQ, que codifica componentes do sistema de transporte de glutamina. O gene rhtA é idêntico ao ORF1 (gene ybiF, números de nucleotídeos 764 a 1651, número de acesso ao GenBank AAA218541, gi:440181) e localiza-se entre os genes pexB e ompX. A unidade que expressa uma proteína codificada pela ORF1 foi determinada gene rhtA (rht: resistência à homoserina e treonina). Revelou-se também que a mutação rhtA23 que aumenta resistência à concentração elevada de treonina ou homoserina é uma substituição A-por-G na posição -1, com relação ao códon inicial ATG (Resumos do 17° International Congress of Biochemistry and Molecular Biology junto com Annual Meeting of the American Society for Biochemistry eand Molecular Biology, San Francisco, Califórnia 24-29 de agosto, 1997, resumo 457; EP 1013765 A).

[00063] O gene asd de E. coli já foi elucidado (números de nucleotídeos 3572511 a 3571408, acesso ao GenBank NC_000913.1, gi:16131307), e pode ser obtido por PCR (refere-se a White, T.J., et al., Trends Genet, 5:185-189, 1989) que utiliza oligonucleotídeos iniciadores preparados com base na sequência de nucleotídeos do gene. Os genes asd de outros micro-organismos também podem ser obtidos de uma maneira similar.

[00064] O gene aspC de E. coli também já foi elucidado (números de nucleotídeos 983742 a 984932, acesso ao GenBank NC_000913.1, gi:16128895), e pode ser obtida por PCR utilizando oligonucleotídeos iniciadores preparados com base na sequência de nucleotídeos do gene. Os genes aspC de outros micro-organismos também podem ser obtidos de uma maneira similar. <Bactérias produtoras de L-Lisina>

[00065] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar capacidade de produzir L-lisina incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma maior atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas de biossíntese de L-lisina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas sem limitação particular, di-hidrodipicolinato sintase (dapA), aspartoquinase III (lysC), di- hidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelato decarboxilase (lysA), diaminopimelato desidrogenase (ddh) (Patente U.S. 6.040.160), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), aspartato aminotransferase (aspartato transaminase) (aspC), diaminopimelato epimerase (dapF), tetra-hidrodipicolinato succinilase (dapD), succinil diaminopimelato deacilase (dapE), e aspartase (aspA) (EP 1253195 A). É preferível melhorar a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas de, por exemplo, di-hidrodipicolinato redutase, diaminopimelato decarboxilase, diaminopimelato desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, diaminopimelato epimerase, aspartato semialdeído desidrogenase, tetra-hidrodipicolinato succinilase, e succinil diaminopimelato deacilase, entre estas enzimas. Além disso, bactérias produtoras de L-lisina e cepas parentais para derivá-las podem expressar um maior nível do gene envolvido na eficiência de energia (cyo) (EP 1170376 A), o gene que codifica nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (pntAB) (Patente U.S. 5.830.716), o gene ybjE (WO2005/073390), ou combinações destes. Uma vez que a aspartoquinase III (lysC) é sujeita à inibição por retroalimentação por L-lisina, um gene mutante lysC que codifica uma aspartoquinase III dessensibilizada na inibição por retroalimentação por L-lisina (Patente U.S. 5.932.453) pode ser usado para melhorar a atividade desta enzima. Adicionalmente, uma vez que a di- hidrodipicolinato sintase (dapA) é sujeita à inibição por retroalimentação por L-lisina, um gene mutante dapA que codifica uma di-hidrodipicolinato sintase dessensibilizada na inibição por retroalimentação por L-lisina pode ser usado para melhorar a atividade desta enzima.

[00066] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar capacidade de produzir L-lisina também incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma atividade ou atividades reduzidas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas que catalisam uma reação que se ramifica a partir da via biossintética de L-lisina, para gerar um composto sem ser L-lisina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas sem limitação particular, homoserina desidrogenase, lisina decarboxilase (Patente U.S. 5.827.698), e enzima málica (WO2005/010175).

[00067] Exemplos de bactérias produtoras de L-lisina e cepas parentais para derivá-las também incluem cepas mutantes com resistência a um análogo de L-lisina. Os análogos de L-Lisina inibem o crescimento de bactérias tais como bactérias da família Enterobacteriaceae e bactérias corineformes, mas esta inibição é completamente ou parcialmente liberada quando L-lisina está presente no meio. Exemplos destes análogos de L-lisina incluem, mas sem limitação particular, oxalisina, lisina hidroxamato, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), Y-metilisina, e α-clorocaprolactam. Cepas mutantes com resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidas submetendo uma bactéria a um tratamento de mutagênese artificial convencional.

[00068] Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-lisina e cepas parentais para derivá-las incluem E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B- 12185, ver patente U.S. 4.346.170) e E. coli VL611. Nestas cepas, aspartoquinase é dessensibilizada para inibição por retroalimentação por L-lisina. Os exemplos específicos de bactérias produtoras de L-lisina produtoras e cepas parentais para derivar deles também incluem E. coli AJIK01 (NITE BP-01520). A cepa AJIK01 foi designada E. coli AJ111046, e depositado na agência administrativa independente, Instituto Nacional de Tecnologia e Avaliação, Organismo Internacional de Patentes Depositário (# 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292- 0818, Japão) em 29 de janeiro de 201. Em seguida, foi convertido em um depósito internacional nos termos do Tratado de Budapeste, em 15 de maio de 2014, e atribuído um número de registo de NITE BP-01520.

[00069] Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-lisina e cepas parentais para derivá-las também incluem a cepa E. coli WC196. A cepa WC196 foi gerada aumentando a resistência AEC na cepa W3110, que foi derivada de E. coli K-12 (Patente U.S. 5.827.698). A cepa WC196 foi determinada E. coli AJ13069 e depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente, agência administrativa independente, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 6 de dezembro de 1994 e determinado um número de acesso de FERM P-14690. A seguir, o depósito foi convertido em um depósito internacional nas provisões do Budapest Treaty em 29 de setembro 1995, e determinado um número de acesso de FERM BP-5252 (Patente U.S. 5.827.698).

[00070] Os exemplos preferidos de bactérias produtoras de L-lisina incluem E. coli WC196ΔcadAΔldc e E. coli WC196ΔcadAΔldc/pCABD2 (WO2006/078039). A E. coli WC196ΔcadAΔldc é uma cepa construída a partir da cepa WC196 interrompendo os genes cadA e ldcC que codificam lisina decarboxilase. A cepa WC196ΔcadAΔldc/pCABD2 foi construída introduzindo o plasmídeo pCABD2 contendo os genes de biossíntese da enzima lisina (Patente U.S. 6.040.160) na cepa WC196ΔcadAΔldc. A cepa WC196ΔcadAΔldc, determinada como AJ110692, foi depositada na agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (atualmente, agência administrativa independente, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 7 de outubro de 2008 como um depósito internacional, e determinado um número de acesso de FERM BP-11027. O plasmídeo pCABD2 contém um gene mutante dapA de Escherichia coli e codifica uma di-hidrodipicolinato sintase (DDPS) com uma mutação por dessensibilização para inibição por retroalimentação por L-lisina, um gene mutante lysC derivado de Escherichia coli e que codifica aspartoquinase III com uma mutação por dessensibilização para inibição por retroalimentação por L-lisina, o gene dapB derivado de Escherichia coli e que codifica di-hidrodipicolinato redutase, e o gene ddh derivado de Brevibacterium lactofermentum e que codifica diaminopimelato desidrogenase. <Bactérias produtoras de L-Arginina>

[00071] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar capacidade de produzir L-arginina incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma maior atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas de biossíntese de L-arginina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas sem limitação particular, N-acetilglutamato sintase (argA), N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), ornitina acetil transferase (argJ), N-acetilglutamato quinase (argB), acetilornitina transaminase (argD), acetilornitina deacetilase (argE), ornitina carbamoil transferase (argF), argininosuccinato sintetase (argG), argininosuccinato liase (argH), e carbamoil fosfato sintetase (carAB). Como o gene N-acetilglutamato sintase (argA), por exemplo, um gene que codifica um mutante de N-acetilglutamato sintase dessensibilizado na inibição por retroalimentação por L-arginina por substituição dos resíduos de aminoácido, que corresponde às posições 15 a 19 da enzima tipo selvagem (Patente Europeia submetida à inspeção pública 1170361), pode ser preferivelmente usada.

[00072] Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-arginina e cepas parentais para derivá-las incluem, por exemplo, a cepa E. coli 237 (VKPM B-7925) (Pedido de patente publicado U.S. 2002/058315A1), cepas derivadas desta introduzida com o gene codificando argA para um mutante de N-acetil glutamato sintase (pedido de patente Russa 2001112869, EP 1170361), cepa E. coli 382 derivada da cepa 237 e com uma melhor capacidade de assimilar ácido acético (VKPM B-7926, EP 1170358 A1), e cepa E. coli 382ilvA +, que é uma cerpa obtida a partir da cepa 382 de introdução do gene de tipo selvagem Ilva a partir da cepa E. coli K-12 da mesma. O E. coli cepa 237 foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Rússia) em 10 de abril de 2000 com um número de acesso de VKPM B-7925, e o depósito foi convertido em um depósito internacional nas provisões de Budapest Treaty em 18 de maio de 2001. A cepa E. coli 382 foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, 1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Rússia) em 10 de abril 2000, com número de acesso de VKPM B-7926.

[00073] Exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e cepas parentais para derivá-las também incluem cepas com resistência aos análogos de aminoácido, dentre outros. Exemplos de tais cepas incluem cepas mutantes de Escherichia coli com resistência a α-metilmetionina, p-fluorofenilalanina, D-arginina, arginina hidroxamato, S-(2-aminoetil)-cisteína, α-metilserina, β- 2-tienilalanina, ou sulfaguanidina (refere-se a Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 56-106598).

<Bactérias produtoras de L-citrulina e bactérias produtoras de L-ornitina>

[00074] As vias biossintéticas de L-citrulina e L-ornitina são comuns àquelas de L-arginina. Portanto, uma capacidade para produzir L-citrulina e/ou L-ornitina pode ser aumentada ou melhorada aumentando a atividade ou atividades de N-acetilglutamato sintase (argA), N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), ornitina acetiltransferase (argJ), N-acetilglutamato quinase (argB), acetilornitina transaminase (argD), e/ou acetilornitina deacetilase (argE) (WO2006/35831).

<Bactérias produtoras de L-histidina>

[00075] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar capacidade de produzir L-histidina incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma maior atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas de biossíntese de L-histidina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas sem limitação particular, ATP fosforibosiltransferase (hisG), fosforibosil AMP cicloidrolase (hisI), fosforibosil-ATP pirofosfoidrolase (hisI), fosforibosilformimino-5-aminoimidazol carboxamide ribotídeo isomerase (hisA), amidotransferase (hisH), histidinol fosfato aminotransferase (hisC), histidinol fosfatase (hisB), e histidinol desidrogenase (hisD).

[00076] Entre estas enzimas, as enzimas de biossíntese de L-histidina codificadas por hisG e hisBHAFI são conhecidas por serem inibidas por L- histidina. Portanto, a capacidade de produzir L-histidina pode ser aumentada ou melhorada, por exemplo, introduzindo uma mutação para conferir resistência à inibição por retroalimentação no gene que codifica ATP fosforibosiltransferase (hisG) (Patentes Russas 2003677 e 2119536).

[00077] Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-histidina e cepas parentais para derivá-las incluem, por exemplo, cepas pertencentes à classe Escherichia, tais como a cepa E. coli 24 (VKPM B-5945, RU 2003677), E. coli NRRL B-12116 a B-12121 (Patente U.S. 4.388.405), E. coli H-9342 (FERM BP-6675) e H-9343 (FERM BP-6676, Patente U.S. 6.344.347), E. coli H-9341 (FERM BP-6674, EP 1085087), E. coli AI80/pFM201 (Patente U.S. 6.258.554), E. coli FERM P-5038 e FERM P5048, que foram introduzidas com um vetor que carrega um DNA que codifica uma enzima de biossíntese de L-histidina (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 56-005099), cepas de E. coli introduzidas com um gene para o transporte de aminoácido (EP 1016710 A), e cepa E. coli 80, que foi melhorada com resistência a sulfaguanidina, DL- 1,2,4-triazol-3-alanina, e estreptomicina (VKPM B-7270, patente Russa 2119536). <Bactérias produtoras de L-cisteína>

[00078] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar a capacidade de produzir L-cisteína incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma maior atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas de biossíntese de L-cisteína. Exemplos de tais enzimas incluem, mas sem limitação particular, serina acetiltransferase (cysE) e 3-fosfoglicerato desidrogenase (serA). A atividade de serina acetiltransferase pode ser melhorada, por exemplo, introduzindo um gene mutante cysE que codifica um mutante de serina acetiltransferase resistente a inibição por retroalimentação por cisteína em uma bactéria. Um mutante de serina acetiltransferase como este é revelado em, por exemplo, Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 11-155571 e Pedido de patente publicado U.S. 20050112731. Adicionalmente, a atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase pode ser melhorada, por exemplo, introduzindo um gene mutante serA que codifica um mutante de 3-fosfoglicerato desidrogenase resistente a inibição por retroalimentação por serina em uma bactéria. Um mutante de 3- fosfoglicerato desidrogenase é revelado em, por exemplo, Patente U.S. 6.180.373.

[00079] Adicionalmente, exemplos de métodos para aumentar ou melhorar capacidade de produzir L-cisteína também incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma atividade ou atividades reduzidas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas que catalisam uma reação ramificada a partir da via de biossíntese de L-cisteína para gerar um composto sem ser L-cisteína. Exemplos de tais enzimas incluem, por exemplo, enzimas envolvidas na decomposição de L-cisteína. Exemplos das enzimas envolvidas na decomposição de L-cisteína incluem, mas sem limitação particular, cistationina-β-liase (metC, Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 11-155571; Chandra et al., Biochemistry, 21 (1982) 3064-3069), triptofanoase (tnaA, Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2003-169668; Austin Newton et al., J. Biol. Chem., 240 (1965) 12111218), A-acetilserina sulfidrilase B (cysM, Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2005-245311), o produto de gene malY (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2005-245311), e o produto de gene d0191 de Pantoea ananatis (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2009-232844).

[00080] Adicionalmente, exemplos de métodos para aumentar ou melhorar capacidade de produzir L-cisteína também incluem, por exemplo, um método de melhorar o sistema de excreção de L-cisteína, e um método de melhorar o sistema de transporte de sulfato/tiossulfato. Exemplos de proteínas do sistema de excreção de L-cisteína incluem a proteína codificada pelo gene ydeD (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2002-233384), a proteína codificada pelo gene yfiK (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2004-49237), as proteínas codificadas pelos genes emrAB, emrKY, yojIH, acrEF, bcr, e cusA (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2005-287333), e a proteína codificada pelo gene yeaS (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2010-187552). Exemplos das proteínas do sistema de transporte de sulfato/tiossulfato incluem as proteínas codificadas pelo agrupamento de gene cysPTWAM.

[00081] Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-cisteína e cepas parentais para derivá-las incluem, por exemplo, E. coli JM15 transformada com diferentes alelos cysE que codificam serina acetiltransferases resistentes à retroalimentação (Patente U.S. 6.218.168, pedido de patente Russa 2003121601), E. coli W3110 com um gene super- expresso que codifica uma proteína adequada para a secreção de uma substância citotóxica (Patente U.S. 5.972.663), cepas de E. coli com uma atividade reduzida de cisteína desulfoidrase (JP11155571A2), e E. coli W3110 com uma maior atividade de um regulador transcricional positivo para a regulação de cisteína codificada pelo cysB (WO0127307A1). <Bactérias produtoras de L-metionina>

[00082] Exemplos de bactérias produtoras de L-metionina e cepas parentais para derivá-las incluem cepas auxotróficas de L-treonina e cepas mutantes resistentes à norleucina (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2000-139471). Exemplos de bactérias produtoras de L- metionina e cepas parentais para derivá-las também incluem uma cepa contendo um mutante de homoserina transsuccinilase resistente a inibição por retroalimentação por L-metionina (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2000-139471, Pedido de patente publicado U.S. 20090029424). Uma vez que a L-metionina é biossintetizada por meio de L- cisteína como um intermediário, a capacidade de produzir L-metionina também pode ser melhorada fornecendo a capacidade de produzir L-cisteína (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2000-139471, Pedido de patente publicado U.S. 20080311632).

[00083] Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-metionina e cepas parentais para derivá-las incluem, por exemplo, E. coli AJ11539 (NRRL B-12399), E. coli AJ11540 (NRRL B-12400), E. coli AJ11541 (NRRL B- 12401), E. coli AJ11542 (NRRL B-12402, Patente Inglesa 2075055), a cepa E. coli 218 (VKPM B-8125, patente Russa 2209248) e a cepa 73 (VKPM B- 8126, patente Russa 2215782), que são resistentes à norleucina, que é um análogo de L-metionina, e E. coli AJ13425 (FERMP-16808, Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2000-139471). A cepa AJ13425 é uma cepa auxotrófica de L-treonina derivada da E. coli W3110, em que o repressor de metionina é eliminado, a atividade intracelular de S- adenosilmetionina sintetase é atenuada, e a atividade intracelular de homoserina transsuccinilase, atividade de cistationina Y-sintase, e atividade de aspartoquinase-homoserina desidrogenase II são melhoradas.

<Bactérias produtoras de L-leucina>

[00084] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar capacidade de produzir L-leucina incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma maior atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas de biossíntese de L-leucina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas sem limitação particular, as enzimas codificadas pelos genes do operon leuABCD. Adicionalmente, para melhorar a atividade de uma enzima como esta, por exemplo, o gene mutante leuA que codifica um isopropil maleato sintase dessensibilizado na inibição por retroalimentação por L-leucina (Patente U.S. 6,403,342) pode ser preferivelmente usado.

[00085] Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-leucina e cepas parentais para derivá-las incluem, por exemplo, bactérias Escherichia tais como cepas de E. coli resistentes a leucina (por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, Patente U.S. 6.124.121)), as cepas E. coli resistentes a um análogo de leucina tais como β-2-tienilalanina, 3-hydroxileucina, 4- azaleucina, e 5,5,5-trifluoroleucina (publicação de patente Japonesa (Kokoku) No. 62-34397 e Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 8-70879), cepas de E. coli obtidas por uma técnica de engenharia genética descrita em WO96/06926, e E. coli H-9068 (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 8-70879).

<Bactérias produtoras de L-isoleucina>

[00086] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar a capacidade de produção L-isoleucina- incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria has increased atividade ou atividades de uma ou mais enzimas selecionadas from o L-isoleucina enzimas de biossíntese. Exemplos de tais enzimas incluem, mas sem limitação particular, treonina de aminase e ácido acetoidróxi sintase (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2-458, FR 0356739, Patente U.S. 5.998.178).

[00087] Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-isoleucina e cepas parentais para derivá-las incluem, por exemplo, Escherichia bactérias tais como cepas mutantes com resistência a 6-dimetilaminopurina (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 5-304969), cepas mutantes com resistência a um análogo de isoleucina, tais como tiaisoleucina e isoleucina hidroxamato, e cepas mutantes com resistência a um análogo de isoleucina como este e adicionalmente com resistência a DL- hidroxamato de etionina e/ou arginina (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 5-130882). <Bactérias produtoras de L-valina>

[00088] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar a capacidade de produzir L-valina incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma maior atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas a partir das enzimas de biossíntese de L-valina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas sem limitação particular, as enzimas codificadas pelos genes do operon ilvGMEDA e as enzimas codificadas pelo operon ilvBNC. O gene ilvBN codifica ácido acetoidróxi sintase, e o gene ilvC codifica isomeroredutase (WO00/50624). Expressões do operon ilvGMEDA e do operon ilvBNC são suprimidas (atenuadas) por L-valina, L-isoleucina, e/ou L-leucina. Portanto, para melhorar a atividade de uma enzima como esta, é preferível que a supressão de expressão pela L-valina produzida seja liberada removendo ou modificando uma região exigida para a atenuação. Adicionalmente, a treonina desaminase codificada pelo gene ilvA é uma enzima que catalisa a desaminação da reação de L-treonina que resulta em ácido 2-cetobutírico, que é a etapa de limitação de taxa do sistema de biossíntese de L-isoleucina. Portanto, para a produção de L-valina, é preferível que o gene ilvA seja, por exemplo, interrompido, e por meio disso a atividade da treonina deaminase seja diminuída.

[00089] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar a capacidade de produzir L-valina também incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma atividade ou atividades reduzidas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas que catalisam uma reação ramificada a partir da via de biossíntese de L-valina para gerar um composto sem ser L-valina. Exemplos de tais enzimas incluem, mas sem limitação particular, treonina desidratase envolvida na síntese de L-leucina, e as enzimas envolvida na síntese do efeito do ácido D- pantotênico (WO00/50624).

[00090] Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-valina e cepas parentais para derivá-las incluem, por exemplo, cepas de E. coli modificadas de maneira a super-expressar o operon ilvGMEDA (Patente U.S. 5.998.178).

[00091] Exemplos de bactérias produtoras de L-valina e cepas parentais para derivá-las também incluem cepas mutantes com uma mutação em amino-acil RNAt sintetase (Patente U.S. 5.658.766). Exemplos de tais cepas incluem, por exemplo, E. coli VL1970, que apresenta uma mutação no gene ileS que codifica isoleucina RNAt sintetase. E. coli VL1970 foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, 1 Dorozhny Proezd, 1 Moscou 117545, Rússia) em 24 de junho de 1988 com o número de acesso de VKPM B-4411. Exemplos de bactérias produtoras de L-valina e cepas parentais para derivá-las também incluem cepas mutantes que exigem ácido lipóico para o crescimento e/ou perda de H+-ATPase (WO96/06926).

<Bactérias produtoras de L-triptofano, bactérias produtoras de L-fenilalanina, e bactérias produtoras de L-tirosina>

[00092] Exemplos de métodos para aumentar ou melhorar a capacidade de produzir L-triptofano, capacidade de produzir L-fenilalanina, e/ou capacidade de produzir L-tirosina incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma maior atividade ou atividades de uma ou mais enzimas selecionadas das enzimas de biossíntese de L-triptofano, L-fenilalanina, e/ou L-tirosina.

[00093] Exemplos de enzimas comuns aos sistemas de biossíntese destes aminoácidos aromáticos incluem, mas sem limitação particular, 3-desóxi-D- arabinoeptulosonato-7-fosfato sintase (aroG), 3-deidroquinato sintase (aroB), chiquimato desidrogenase (aroE), chiquimato quinase (aroL), 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (aroA), e corismato sintase (aroC) (Patente Europeia 763127). As expressões dos genes que codificam estas enzimas são controladas pelo repressor tirosina (tyrR), e as atividades destas enzimas podem ser melhoradas eliminando o gene tyrR (Patente Europeia 763127).

[00094] Exemplos das enzimas de biossíntese de L-triptofano incluem, mas sem limitação particular, antranilato sintase (trpE), triptofano sintase (trpAB), e fosfoglicerato desidrogenase (serA). Por exemplo, introduzindo um DNA contendo o operon triptofano, a capacidade de produzir L-triptofano pode ser aumentada ou melhorada. Triptofano sintase consiste em subunidades α e β codificadas pelos genes trpA e trpB, respectivamente. Uma vez que a antranilato sintase está sujeita à inibição por retroalimentação por L-triptofano, um gene que codifica esta enzima introduzida com uma mutação por dessensibilização para inibição por retroalimentação pode ser usado para melhorar a atividade desta enzima. Uma vez que a fosfoglicerato desidrogenase está sujeita à inibição por retroalimentação por L-serina, um gene que codifica esta enzima introduzido com uma mutação por dessensibilização para inibição por retroalimentação pode ser usado para melhorar a atividade desta enzima. Adicionalmente, aumentando a expressão do operon (operon ace) que consiste no gene maleato sintase (aceB), gene isocitrato liase (aceA), e gene isocitrato desidrogenase quinase/fosfatase (aceK), a capacidade de produzir L-triptofano pode ser aumentada ou melhorada (WO2005/103275).

[00095] Exemplos das enzimas de biossíntese de L-fenilalanina incluem, mas sem limitação particular, corismato mutase e prefenato desidratase. A corismato mutase e prefenato desidratase são codificadas pelo gene pheA como uma enzima bifuncional. Uma vez que a corismato mutase e prefenato desidratase estão sujeitas à inibição por retroalimentação por L- fenilalanina, genes que codificam estas enzimas introduzidos com uma mutação por dessensibilização para inibição por retroalimentação podem ser usados para melhorar as atividades destas enzimas.

[00096] Exemplos das enzimas L-tirosina de biossíntese incluem, mas sem limitação particular, corismato mutase e prefenato desidrogenase. A corismato mutase e prefenato desidrogenase são codificadas pelo gene tyrA comoas uma bifuncional. Uma vez que a corismato mutase e prefenato desidrogenase são submetidas à inibição por retroalimentação por L-tirosina, os genes que codificam estas enzimas introduzidas com uma mutação por dessensibilização para a inibição por retroalimentação podem ser usados para melhorar a atividades destas enzimas.

[00097] As bactérias que produzem L-triptofano, L-fenilalanina, e/ou L-tirosina podem ser modificadas de maneira tal que a biossíntese de um aminoácido aromático, sem ser o aminoácido aromático objetivo, seja reduzida. Adicionalmente, as bactérias que produzem L-triptofano, L- fenilalanina, e/ou L-tirosina pode ser modificadas de maneira tal que um sistema de absorção de subproduto seja melhorado. Exemplos do subproduto incluem aminoácidos aromáticos sem ser o aminoácido aromático objetivo. Exemplos do gene que codifica um sistema de absorção de subproduto incluem, por exemplo, tnaB e mtr, que são os genes que codificam o sistema de absorção de L-triptofano, pheP, que é um gene que codifica o sistema de absorção de L-fenilalanina, e tyrP, que é um gene que codifica o sistema de absorção de L-tirosina (EP 1484410).

[00098] Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-triptofano e cepas parentais para derivá-las incluem, por exemplo, E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 (DSM10123), que apresentam um gene mutante trpS que codifica uma triptofanoil-RNAt sintetase parcialmente inativada (Patente U.S. 5.756.345), E. coli SV164, que apresenta um alelo trpE que codifica uma antranilato sintase dessensibilizada na inibição por retroalimentação por triptofano, E. coli SV164 (pGH5), que apresenta um alelo serA que codifica uma fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizado na inibição por retroalimentação por serina, e um alelo trpE que codifica um antranilato sintase dessensibilizado na inibição por retroalimentação por triptofano (Patente U.S. 6.180.373), uma cepa introduzida com um operon triptofano contendo um alelo trpE que codifica um antranilato sintase dessensibilizada na inibição por retroalimentação por triptofano (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) Nos. 5771397 e 62-244382, Patente U.S. 4.371.614), E. coli AGX17(pGX44) (NRRL B-12263) e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264), que são deficientes em triptofanoase (Patente U.S. 4.371.614), E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps, que apresenta uma maior capacidade de produzir fosfoenolpiruvato (WO97/08333, Patente U.S. 6.319.696), e cepas que pertencem ao gênero Escherichia com uma melhor atividade do proteína codificada pelo gene yedA ou yddG (pedidos de patente publicados U.S. 2003/0148473 A1 e 2003/0157667 A1).

[00099] Exemplos específicos de bactérias que produzem L- fenilalanina e cepas parentais para derivá-las incluem, por exemplo, E. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197), que é deficiente em corismato mutase-prefenato desidrogenase e repressor tirosina (WO03/044191), E. coli HW1089 (ATCC 55371), que contém um gene mutante pheA34 que codifica um corismato mutase-prefenato desidratase dessensibilizada para inibição por retroalimentação (Patente U.S. 5.354.672), E. coli MWEC101-b (KR8903681), E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146, e NRRL B-12147 (Patente U.S. 4.407.952). Exemplos específicos de bactérias que produzem L-fenilalanina e cepas parentais para derivá-las também incluem, por exemplo, E. coli K-12 <W3110(tyrA)/pPHAB> (FERM BP- 3566), E. coli K-12 <W3110(tyrA)/pPHAD> (FERM BP-12659), E. coli K- 12 <W3110(tyrA)/pPHATerm> (FERM BP-12662), e E. coli K-12 AJ12604 <W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB> (FERM BP-3579), que contém um gene que codifica uma corismato mutase-prefenato desidratase dessensibilizada para inibição por retroalimentação (EP 488424 B1). Exemplos específicos de bactérias que produzem L-fenilalanina e cepas parentais para derivá-las incluem adicionalmente, por exemplo, cepas que pertencem ao gênero Escherichia com uma melhor atividade da proteína codificada pelo gene yedA ou gene yddG (pedidos de patente publicados U.S. 2003/0148473 e 2003/0157667, WO03/044192).

[000100] Adicionalmente, exemplos de métodos para aumentar ou melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma maior atividade para secretar um L-aminoácido de uma célula bacteriana. Uma atividade como esta para secretar um L-aminoácido pode ser aumentada, por exemplo, aumentando a expressão de um gene que codifica uma proteína responsável pela secreção do L-aminoácido. Exemplos de genes que codificam as proteínas responsáveis pela secreção de vários aminoácidos incluem, por exemplo, o gene b2682 (ygaZ), gene b2683 (ygaH), gene b1242 (ychE), e gene b3434 (yhgN) (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2002-300874).

[000101] Adicionalmente, exemplos de métodos para aumentar ou melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido também incluem, por exemplo, um método de modificar uma bactéria de maneira tal que a bactéria apresente uma maior atividade ou atividades de uma ou mais proteínas selecionadas de proteínas envolvidas no glicometabolismo e proteínas envolvidas no metabolismo de energia.

[000102] Exemplos das proteínas envolvidas no glicometabolismo incluem proteínas envolvidas na absorção de sacarídeos e as enzimas do sistema de glicólise. Exemplos de genes que codificam uma proteína envolvida no glicometabolismo incluem o gene glicose-6-fosfato isomerase (pgi, WO01/02542), gene fosfoenolpiruvato sintase (pps, Patente Europeia submetida à inspeção pública 877090), gene fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc, WO95/06114), gene piruvato carboxilase (pyc, WO99/18228, Patente Europeia submetida à inspeção pública 1092776), gene fosfoglucomutase (pgm, WO03/04598), gene frutose bisfosfato aldolase (pfkB, fbp, WO03/04664), gene piruvato quinase (pykF, WO03/008609), gene transaldolase (talB, WO03/008611), gene fumarase (fum, WO01/02545), gene de absorção de sacarose não PTS (csc, Patente Europeia submetida à inspeção pública 149911), e gene de assimilação de sacarose (operon scrAB, WO90/04636).

[000103] Exemplos de genes que codificam a proteína envolvida no metabolismo de energia incluem o gene transidrogenase (pntAB, Patente U.S. 5.830.716) e gene de oxidase do tipo citocromo bo (cyoB, Patente Europeia submetida à inspeção pública 1070376).

[000104] Os genes usados para a geração das bactérias anteriormente mencionadas que produzem L-aminoácido não são limitados aos genes exemplificados anteriormente e os genes com uma sequência de nucleotídeos conhecida, e podem ser um variante destes, contant que sua função original seja mantida. Por exemplo, os genes usados para a geração das bactérias que produzem L-aminoácido podem ser um gene que codifica uma proteína com uma sequência de aminoácido de uma proteína conhecida, mas incluindo substituição, eliminação, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições. Para os variantes de genes e proteínas, as descrições para variantes dos genes acpP e fabF, e as proteínas codificadas por meio disso, mencionadas posteriormente, podem ser aplicadas, mutatis mutandis.

<1-2> Atenuação de operon acpP-fabF

[000105] A bactéria da presente invenção foi modificada de maneira tal que o operon acpP-fabF fosse atenuado. O operon acpP-fabF participa na biossíntese de ácidos graxos (documento não patente 1). Assim, presume-se que quando a cultura de produção de L-aminoácido é realizada pelo uso de uma bactéria na qual o operon acpP-fabF foi atenuado, fluxo de entrada de uma fonte de carbono para a via de biossíntese de ácido graxo é diminuída, e como resultado, fonte de carbono em excesso e redução de energia excedente podem ser utilizados para a produção de L-aminoácido, assim, para melhorar a produção de L-aminoácido, em comparação com a cultura quando a produção de L-aminoácido é realizada utilizando uma cepa não modificada. A bactéria da presente invenção pode ser obtida modificando uma bactéria com uma capacidade de produzir L-aminoácido de maneira tal que o operon acpP- fabF seja atenuado. Adicionalmente, a bactéria da presente invenção também pode ser obtida modificando uma bactéria de maneira tal que o operon acpP-fabF seja atenuado, e a seguir aumentando uma capacidade de produzir L-aminoácido da bactéria ou melhorando a capacidade de produzir L-aminoácido da bactéria. A bactéria da presente invenção também pode ser uma bactéria que adquiriu uma capacidade de produzir L-aminoácido, sendo modificada de maneira tal que o operon acpP-fabF fosse atenuado. As modificações para construir a bactéria da presente invenção podem ser realizadas em uma ordem arbitrária.

[000106] A expressão que "o operon acpP-fabF seja atenuado" significa que a atividade de uma proteína codificada por um gene do operon acpP-fabF seja reduzida, e/ ou que a expressão de um gene do operon acpP-fabF é reduzida. A expressão que "a expressão de um gene é reduzida" significa que a quantidade de transcrição do gene (a quantidade de ARNm) é reduzida, e / ou que a quantidade da tradução do gene (a quantidade da proteína) é reduzida. O "gene do operon acpP-fabF" significa o gene acpP e/ou o gene fabF. Isto é, a "proteína codificada por um gene do operon acpP-fabF" refere- se a uma proteína codificada pelo gene fabF e/ou uma proteína codificada pelo gene acpP, isto é, a proteína acpP e/ou a proteína FabF. A atividade de uma proteína pode ser reduzida, por exemplo, atenuando a expressão de um gene que codifica a proteína, ou interrompendo um gene que codifica a proteína, da maneira descrita posteriormente. Isto é, a expressão que “o operon acp-fabF é atenuado” pode também significar que, por exemplo, a expressão de um gene de operon acpP-fabF é atenuada.Na presente invenção, por exemplo, a expressão tanto de um quanto de ambos do gene acpP e gene fabF pode ser atenuada. Isto é, a expressão do operon acpP-fabF inteiro pode também ser atenuado.

[000107] O gene acpP é um gene que codifica a proteína carreadora acil (ACP). "ACP" é um proteína com uma função de se ligar com uma cadeia de ácido graxo por meio do grupo 4’-fosfopanteteina, e carregar por meio disso a cadeia de ácido graxo no momento da biossíntese de ácido graxo. Esta função também é referida como a "atividade ACP". ACP é traduzida como uma apo-ACP inativa, a seguir 4'-fosfopanteteina como um cofator é adicionado ao resíduo de serina da posição 36 (no caso de Escherichia coli) de apo-ACP pela ACP sintase, e apo-ACP é transformada por meio disso em holo-ACP ativo.

[000108] O gene fabF é um gene que codifica β-cetoacil-ACP sintase II. A "β-cetoacil-ACP sintase II" refere-se a uma enzima que catalisa o reação que gera um 3-oxoacil-ACP (número de carbono = n + 2) de um acil-ACP (número de carbono = n) e malonil-ACP (EC 2.3.1.41). A atividade de catalisar esta reação é também referida como a "atividade de β-cetoacil-ACP sintase II".

[000109] O gene acpP da cepa Escherichia coli K-12 MG1655 corresponde à sequência das posições 1150838 a 1151074 na sequência do genoma registrada na base de dados NCBI como acesso ao GenBank NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI: 49175990). O gene acpP da cepa MG1655 é sinônimo com ECK1080 e JW1080. Adicionalmente, a proteína acpP da cepa MG1655 é registrada como acesso ao GenBank NP_415612 (versão NP_415612.1 GI: 16129057, locus_tag"b1094").

[000110] O gene fabF da cepa Escherichia coli K-12 MG1655 corresponde à sequência das posições 1151162 a 1152403 na sequência do genoma registrada na base de dados NCBI como acesso ao GenBank NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI: 49175990). O gene fabF da cepa MG1655 é sinônimo com ECK1081 e JW1081. Adicionalmente, a proteína FabF da cepa MG1655 é registrada como acesso ao GenBank NP_415613 (versão NP_415613.1 GI: 16129058, locus_tag"b1095").

[000111] A sequência de nucleotídeos do operon acpP-fabF (incluindo a montante 210 bp deste) da cepa MG1655 é mostrada como SEQ ID NO: 7. Em SEQ ID NO: 7, a sequência de nucleotídeos do gene acpP corresponde ás posições 211 a 447, e a sequência de nucleotídeos do gene fabF corresponde às posições 535 a 1776. Adicionalmente, as sequências de aminoácido da proteína acpP e proteína FabF da cepa MG1655 são mostradas como SEQ ID NOS: 8 e 9, respectivamente.

[000112] O gene acpP da cepa Pantoea ananatis AJ13355 corresponde à sequência das posições 986154 a 986528 na sequência do genoma registrado na base de dados NCBI como acesso ao GenBank NC_017531 (Versão NC_017531.1 GI: 386014600). Adicionalmente, a proteína acpP da cepa AJ13355 é registrada como acesso ao GenBank YP_005933706 (versão YP_005933706.1 GI: 386015425).

[000113] O gene fabF da cepa Pantoea ananatis AJ13355 corresponde à sequência das posições 986650 a 987855 na sequência do genôma registrado na base de dados NCBI como acesso ao GenBank NC_017531 (Versão NC_017531.1 GI: 386014600). Adicionalmente, a proteína FabF da cepa AJ13355 é registrada como acesso ao GenBank YP_005933707 (versão YP_005933707.1 GI: 386015426).

[000114] A sequência de nucleotídeos do operon acpP-fabF (incluindo a montante 210 bp deste) da cepa AJ13355 é mostrada como SEQ ID NO: 10. Em SEQ ID NO: 10, a sequência de nucleotídeos do gene acpP corresponde às posições 211 a 585, e a sequência de nucleotídeos do gene fabF corresponde às posições 707 a 1912. Adicionalmente, as sequências de aminoácido da proteína acpP e da proteína FabF da cepa AJ13355 são mostradas como SEQ ID NOS: 11 e 12, respectivamente.

[000115] A proteína acpP ou proteína FabF pode ser um variante da proteína acpP ou proteína FabF anteriormente mencionada, contanto que a função original de cada proteína seja mantida. Da mesma forma, o gene acpP ou o gene FabF pode ser uma variante do gene acpP ou do gene FabF acima mencionado FabF, enquanto a função original de cada gene é mantida. Um variante como este, o qual a função original é mantida, também pode ser denominado "variante conservativo". O termo "proteína acpP" ou "proteína FabF" não se limita à proteína acpP acima mencionada ou proteína FabF, mas também inclui variantes conservativas da mesma. Da mesma forma, o termo "gene acpP" ou "gene fabF" não se limita ao gene acpP ou ao gene fabF supracitado, mas também inclui variantes conservativas da mesma. Exemplos de um variante conservativo como este incluem, por exemplo, homólogos e variantes modificados de maneira artificial da proteína acpP ou proteína fabF anteriormente mencionada, ou do gene acpP ou gene fabF acima mencionados.

[000116] A expressão que "a função original da proteína é mantida" significa que uma variante da proteína ou do gene apresenta uma função (i.e atividade ou propriedade) que corresponde à função (i.e atividade ou propriedade) da proteína original ou do gene original. A saber, por exemplo, a expressão que "a função original da proteína é mantida" usada para a proteína acpP significa que a proteína apresenta a atividade ACP, e a expressão que "a função original da proteína é mantida" usada para a proteína FabF significa que a proteína apresenta a atividade de β-cetoacil-ACP sintase II. Além disso, por exemplo, a expressão de que "a função original do gene é mantida" utilizado para o gene acpP significa que o gene codifica uma proteína possuindo a atividade ACP, e que a expressão "a função original do gene é mantida" usado para o gene fabF significa que o gene codifica uma proteína possuindo a atividade β-cetoacil-ACP-sintase II.

[000117] Um gene que codifica um homólogo da proteína acpP ou proteína FabF anteriormente mencionada é facilmente obtido a partir de uma base de dados pública, por exemplo, por pesquisa BLAST ou pesquisa FASTA usando qualquer das sequências de nucleotídeo anteriormente mencionadas do gene acpP ou gene fabF como uma sequência de entrada. Adicionalmente, um gene que codifica um homólogo da proteína acpP ou proteína FabF anteriormente mencionada pode ser obtido, por exemplo, por PCR usando o cromossomo de um organismo tal como uma bactéria como o molde, e oligonucleotídeos preparados com base em uma sequência de gene conhecida destes como oligonucleotídeos iniciadores.

[000118] O gene acpP ou gene fabF pode ser um gene que codifica uma variante conservativo da proteína acpP ou proteína FabF anteriormente mencionada. Por exemplo, o gene acpP ou gene fabF pode ser, por exemplo, um gene que codifica uma proteína com qualquer das sequências de aminoácido anteriormente mencionadas (por exemplo, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8, 9, 11, ou 12) incluindo substituição, eliminação, inserção ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições, contanto que codifique uma proteína com a função original. Em um caso como este, em geral 70% ou mais, preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90 % ou mais, da atividade correspondente da proteína (i.e a atividade ACP ou a atividade β-cetoacil-ACP-sintase II) pode ser mantida com relação à proteína, não incluindo adição, eliminação, inserção ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido. Embora o número de "um ou vários" possa diferir dependendo das posições de resíduos de aminoácido na estrutura tridimensional da proteína ou tipos de resíduos de aminoácido, especificamente, é 1 a 50, 1 a 40, ou 1 a 30, preferivelmente 1 a 20, mais preferivelmente 1 a 10, ainda mais preferivelmente 1 a 5, particularmente preferível 1 a 3.

[000119] A substituição, eliminação, inserção, ou adição anteriormente mencionada de um ou vários resíduos de aminoácido é uma mutação conservatia que mantém função normal da proteína. Os exemplos típicos da mutação conservativa são substituições conservativas. A substituição conservativa é uma mutação em que a substituição ocorre mutualment entre Phe, Trp, e Tyr, se o sítio de substituição for um aminoácido aromático; entre Leu, Ile, e Val, se for um aminoácido hidrofóbico; entre Gln e Asn, se for um aminoácido polar; entre Lys, Arg, e His, se for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se for um aminoácido acídico; e entre Ser e Thr, se for um aminoácido com um grupo hidroxila. Exemplos de substituições consideradas como substituições conservativas incluem, especificamente, substituição de Ser ou Thr por Ala, substituição de Gln, His, ou Lys por Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His, ou Asp por Asn, substituição de Asn, Glu, ou Gln por Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp, ou Arg por Gln, substituição de Gly, Asn, Gln, Lys, ou Asp por Glu, substituição de Pro por Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg, ou Tyr por His, substituição de Leu, Met, Val, ou Phe por Ile, substituição de Ile, Met, Val, ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His, ou Arg por Lys, substituição de Ile, Leu, Val, ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile, ou Leu por Phe, substituição de Thr ou Ala por Ser, substituição de Ser ou Ala por Thr, substituição de Phe ou Tyr por Trp, substituição de His, Phe, ou Trp por Tyr, e substituição de Met, Ile, ou Leu por Val. Adicionalmente, tal substituição, eliminação, inserção, adição, inversão, ou similares de resíduos de aminoácido da maneira mencionada anteriormente inclui uma mutação de ocorrência natural em virtude de uma diferença individual, ou uma diferença de espécies do organismo a partir do qual o gene é derivado (mutante ou variante).

[000120] Além do mais, o gene com uma mutação conservativa como esta, da maneira mencionada anteriormente, pode ser um gene que codifica uma proteína que exibe uma homologia de 80 % ou mais, preferivelmente 90 % ou mais, mais preferivelmente 95 % ou mais, ainda mais preferivelmente 97 % ou mais, particularmente preferível 99 % ou mais, com a sequência total de aminoácido de qualquer das sequências de aminoácido anteriormente mencionadas, e com a função original. Nesta especificação, "homologia" significa "identidade".

[000121] Adicionalmente, o gene acpP ou gene fabF pode ser um DNA, isto é, capaz de hibridizar com uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de gene conhecida, tal como uma sequência complementar à toda ou uma parte de qualquer das sequências de nucleotídeo anteriormente mencionadas (por exemplo, sequências de nucleotídeo da posições 211 a 447 de SEQ ID NO: 7, as posições 535 a 1776 de SEQ ID NO: 7, as posições 211 a 585 de SEQ ID NO: 10, ou as posições 707 a 1912 de SEQ ID NO: 10), em condições de severidade, e codifica um proteína com a função original. Adicionalmente, o operon acpP-fabF pode ser um DNA que é capaz de hibridizar com uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de gene conhecida, tal como uma sequência complementar à toda ou uma parte de qualquer das sequências de nucleotídeo anteriormente mencionadas (por exemplo, total sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, sequência de nucleotídeos da posições 211 a 1776 de SEQ ID NO: 7, sequência total de nucleotídeos de SEQ ID NO: 10, ou sequência de nucleotídeos das posições 211 a 1912 de SEQ ID NO: 10), em condições de severidade, e codifica uma proteína com a função original. As "condições de severidade" referem-se às condições nas quais um assim denominado híbrido específico é formado, e um híbrido não específico não é formado. Exemplos das condições de severidade incluem aquelas nas quais DNAs altamente homólogos hibridizam uns com os outros, por exemplo, DNAs não menos que 80 % homólogo, preferivelmente não menos que 90 % homólogo, mais preferivelmente não menos que 95 % homólogo, ainda mais preferivelmente não menos que 97 % homólogo, particularmente preferivelmente não menos que 99 % homólogo, hibridizam uns com os outros, e DNAs menos homólogos que os anteriores não hibridizam uns com os outros, ou condições de lavagem de hibridização Southern típica, isto é, condições de lavar uma vez, preferivelmente 2 ou 3 vezes, em uma concentração de sal e temperatura que corresponde a 1 x SSC, 0,1 % SDS a 60 °C, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1 % SDS a 60°C, mais preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1 % SDS a 68 °C.

[000122] Da maneira descrita anteriormente, a sonda usada para a hibridização anteriormente mencionada pode ser uma parte de uma sequência que é complementar ao gene anteriormente mencionado. Uma sonda como esta pode ser preparada por PCR usando oligonucleotídeos preparados com base em uma sequência de gene conhecida como oligonucleotídeos iniciadores e um fragmento de DNA contendo qualquer das sequências de nucleotídeo como molde. Assim como a sonda, por exemplo, um fragmento de DNA com um tamanho de cerca de 300 bp pode ser usado. Quando um fragmento de DNA com um tamanho de cerca de 300 bp é usado como a sonda, as condições de lavagem da hibridização podem ser, por exemplo, 50 °C, 2 x SSC e 0,1 % de SDS.

[000123] Adicionalmente, no gene acpP ou gene fabF, um códon arbitrário pode ser substituído por um códon equivalente, contanto que o gene codifica um proteína com a função original. Por exemplo, o gene acpP ou gene fabF pode ser modificado de maneira tal que apresente códons ideais, de acordo com as frequências de códon observadas em um hospedeiro a ser usado.

[000124] As descrições anteriores que dizem respeito aos variantes dos genes e proteínas também podem ser aplicadas mutatis mutandis às proteínas arbitrárias tais como enzimas de biossíntese L-aminoácido e genes que codificam as mesmas.

<1-3> Método para reduzir atividade de proteína

[000125] Daqui por diante, métodos para reduzir a atividade de uma proteína tais como a proteína acpP e a proteína FabF serão explicados.

[000126] A expressão "a atividade de uma proteína é reduzida" significa que a atividade da proteína por célula é menor comparada com aquela de uma cepa não modificada tais como uma cepa tipo selvagem ou cepa parental, e inclui um estágio no qual a atividade foi completamente eliminada. Especificamente, a expressão "a atividade de uma proteína é reduzida" significa que o número de moléculas da proteína por célula seja reduzida, e/ou a função de cada molécula da proteína seja reduzida, comparada com aquelas de uma cepa não modificada. Isto é, o termo "atividade" na expressão "a atividade de uma proteína é reduzida" não é limitado à atividade catalítica da proteína, mas pode significar a quantidade de transcrição de um gene (a quantidade de RNAm) que codifica s proteína ou a quantidade de tradução da proteína (a quantidade da proteína). O estágio em que "o número de moléculas da proteína por célula é reduzido" inclui um estágio no qual a proteína não existe de maneira alguma. O estágio em que "a função de cada molécula da proteína é reduzida" inclui um estágio em que a função de cada molécula de proteína desaparece completamente. Embora o grau da redução na atividade de uma proteína não seja particularmente limitado, contanto que a atividade seja reduzida, comparado com aquele de uma cepa não modificada, este pode ser reduzido, por exemplo, em 90% ou menos, 80% ou menos, 70% ou menos, 60% ou menos, 55% ou menos, 50 % ou menos, 30% ou menos, 20 % ou menos, 10 % ou menos, 5 % ou menos, ou 0 % daquele de uma cepa não modificada.

[000127] A modificação para reduzir a atividade de uma proteína pode ser obtida, por exemplo, reduzindo a expressão de um gene que codifica a proteína. O estágio que "a expressão de um gene é reduzida" inclui um estágio em que o gene não é expresso de maneira alguma. O estágio em que "a expressão de um gene é reduzida" é também referido como "a expressão de um gene é atenuado". A expressão de um gene pode ser reduzida em 90% ou menos, 80% ou menos, 70% ou menos, 60% ou menos, 55% ou menos, 50 % ou menos, 30% ou menos 20 % ou menos, 10 % ou menos, 5 % ou menos, ou 0 % daquela de uma cepa não modificada.

[000128] Além disso, sabe-se que, por exemplo, em E. coli, o gene acpP é indispensável (essencial). Portanto, quando a atividade da proteína acpP seja reduzida, a atividade da proteína acpP permanece ainda em um grau tal que, quando a bactéria da presente invenção é cultivada em um meio, a bactéria da presente invenção possa proliferar, e um L-aminoácido objetivo seja produzido. Ou seja, a quantidade de proteína acpP não deve ser reduzida para 0% da quantidade de uma cepa não modificada. Por exemplo, 1 % ou mais, 5 % ou mais, 10 % ou mais, 15% ou mais, 17% ou mais, 20 % ou mais, 30 % ou mais, ou 50 % ou mais da atividade da proteína acpP pode ser mantida em comparação com a de uma cepa não modificada. Especificamente, a atividade da proteína acpP também pode ser reduzida, por exemplo, 1% a 90%, 5% a 80%, 10% a 70%, 15% a 60%, ou 17% a 55% do que de uma cepa não modificada. Adicionalmente, a quantidade de expressão do gene acpP não deve ser reduzida a 0% da cepa não modificada. Por exemplo, 1% ou mais, 5% ou mais, 10% ou mais, 15% ou mais, 17% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, ou 50% ou mais da expressão quantidade do gene acpP pode ser mantida em comparação com a de uma cepa não modificada. Especificamente, a quantidade de expressão do gene acpP também pode ser reduzida, por exemplo, 1% a 90%, 5% a 80%, 10% a 70%, 15% a 60%, ou 17% a 55% do que de uma cepa não modificada. Tais descrições relativas ao caso em que a atividade da proteína acpP é reduzido pode também ser aplicada mutatis mutandis a qualquer caso em que a atividade da proteína fabF é reduzida.

[000129] A redução na expressão de gene pode ser em virtude de, por exemplo, uma redução na eficiência de transcrição, uma redução na eficiência de tradução, ou uma combinação destas. A expressão de um gene pode ser reduzida modificando uma sequência de controle de expressão do gene tais como um promotor, sequência Shine-Dalgarno (SD) (também referida como sítio de ligação de ribossomo (RBS)), e uma região espaçadora entre RBS e o códon inicial. Sabe-se que a proteína acpP é uma proteína abundante nas células, e, por conseguinte, sugeriu-se que o promotor de tipo selvagem do gene acpP mostra uma elevada atividade (documento não patente 1). Assim, a expressão do gene acpP pode ser reduzida através de, por exemplo, substituindo o promotor de tipo selvagem do gene acpP com um promotor que apresenta uma atividade mais fraca. Exemplos do promotor que apresenta uma atividade mais fraca do que o promotor de tipo selvagem do gene acpP incluem, por exemplo, promotor lac e promotor Ptac84 descrito na Patente Russa Publicado N ° 2006/134574. Quando uma sequência de controle de expressão é modificada, preferivelmente um ou mais nucleotídeos, mais preferivelmente dois ou mais nucleotídeos, particularmente preferível três ou mais nucleotídeos, da sequência de controle de expressão são modificados. Adicionalmente, uma parte ou toda uma sequência de controle de expressão pode ser eliminada. A expressão de um gene também pode ser reduzida, por exemplo, manipulando um fator responsável pelo controle de expressão. Exemplos do fator responsável por controle de expressão incluem moléculas de baixo peso molecular responsáveis por controle de transcrição ou tradução (indutores, inibidores, etc.), proteínas responsáveis por controle de transcrição ou tradução (fatores de transcrição etc.), ácidos nucléicos responsáveis por controle de transcrição ou tradução (RNAsi etc.), dentre outros. Adicionalmente, a expressão de um gene também pode ser reduzida, por exemplo, introduzindo uma mutação que reduz a expressão do gene na região codificante do gene. Por exemplo, a expressão de um gene pode ser reduzida substituindo um códon na região codificante do gene com um códon sinônimo usado menos frequentemente em um hospedeiro. Adicionalmente, por exemplo, a expressão do próprio gene pode ser reduzida por interrupção de um gene, da maneira descrita posteriormente.

[000130] O gene acpP e o gene fabF são co-transcritos como o operon acpP-fabF. O gene fabF também é transcrito de maneira independente com seu próprio promotor. Adicionalmente, o gene acpP também pode ser co- transcrito a partir do gene fabD e gene fabG no agrupamento de gene yceD- rpmF-plsX-fabHDG-acpP-fabF. Portanto, por exemplo, modificando o promotor que controla a cotranscrição do operon acpP-fabF, a expressão total do gene acpP e gene fabF pode ser reduzida. Alternativamente, por exemplo, modificando o próprio promotor do gene fabF, a expressão do gene fabF pode ser independentemente reduzida. Adicionalmente, por exemplo, modificando o promotor do gene fabD e/ou o gene fabG, a expressão do gene acpP pode ser reduzida junto com a expressão do gene fabD e/ou o gene fabG. Além do mais, por exemplo, introduzindo uma mutação que reduz a expressão de um gene na região codificante do gene acpP e/ou o gene fabF, a expressão do gene acpP e/ou o gene fabF pode ser reduzida.

[000131] Adicionalmente, exemplos específicos da mutação que reduz a expressão do gene acpP e/ou do gene fabF incluem, por exemplo, uma mutação como esta em que a citosina (C) na posição -34 a montante do sítio de iniciação de tradução do gene acpP é substituída por uma outra base. A outra base é preferivelmente adenina (A).

[000132] A "posição -34 a montante do sítio de iniciação de tradução do gene acpP" referida anteriormente significa que a 34a posição no lado a montante contada a partir de A do códon inicial (ATG) do gene acpP, na sequência de nucleotídeos mostrada como SEQ ID NO: 7. A posição de A do códon inicial (ATG) corresponde à posição +1, e a posição a seguir áquela posição no lado a montante é a posição -1. Em outras palavras, a "posição -34 a montante do sítio de iniciação de tradução do gene acpP" significa uma posição que corresponde à posição 177 da sequência de nucleotídeos mostrada como SEQ ID NO: 7 (a saber, a posição 1150804 da sequência do genoma da cepa Escherichia coli K-12 MG1655 registrada como acesso ao GenBank NC_000913). A "posição -34 a montante do sítio de iniciação de tradução do gene acpP" representa uma posição relativa com base na sequência de SEQ ID NO: 7, e a posição absoluta pode se deslocar para frente ou para trás em virtude da eliminação, inserção, adição, ou similares de um ou mais nucleotídeos. Isto é, quando um nucleotídeo é eliminado na sequência de SEQ ID NO: 7 entre o nucleotídeo da posição 177 e A do códon inicial, a "posição -34 a montante do sítio de iniciação de tradução do gene acpP" significa a 33a posição no lado a montante contado a partir de A do códon inicial do gene acpP. Quando um nucleotídeo é inserido na sequência de SEQ ID NO: 7 entre o nucleotídeo da posição 177 e A do códon inicial, a "posição -34 a montante do sítio de iniciação de tradução do gene acpP" significa a 35a posição no lado a montante contado à partir de A do códon inicial do gene acpP.

[000133] Qual nucleotídeo corresponde ao nucleotídeo da "posição -34 a montante do sítio de iniciação de tradução do gene acpP" pode ser determinada no operon acpP-fabF de uma bactéria arbitrária, por exemplo, alinhando a sequência do gene acpP a montante da bactéria e a sequência do gene acpP a montante mostrada como SEQ ID NO: 7. Tal alinhamento pode ser realizado, por exemplo, usando software de análise de gene conhecido. Exemplos específicos de tal software incluem DNASIS produzido por Hitachi Solutions, GENETYX produzido por Genetyx, dentre outros (Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24 (1) 72-96, 1991; Barton GJ et al., Journal of Molecular Biology, 198 (2), 327-37, 1987).

[000134] A modificação para reduzir a atividade de uma proteína também pode ser obtida, por exemplo, interrompendo um gene que codifica a proteína. A interrupção de um gene pode ser obtida, por exemplo, eliminando uma parte ou toda a região codificante do gene em um cromossomo. Além do mais, a região completa de um gene incluindo sequências a montante e a jusante do gene em um cromossomo pode ser eliminada. A região a ser eliminada pode ser qualquer região tais como uma região N-terminal, uma região interna, ou uma região C-terminal, contanto que a atividade da proteína possa ser reduzida. A eliminação de uma região mais longa podem em geral inativa mais exatamente o gene. Adicionalmente, é preferível que quadros de leitura das sequências a montante e a jusante a partir da região a serem eliminados não sejam os mesmos.

[000135] A interrupção de um gene também pode ser mantida, por exemplo, introduzindo uma mutação por uma substituição de aminoácido (mutação com troca de sentido), um códon de parada (mutação sem sentido), uma mutação por deslocamento de quadro que adiciona ou elimina um ou dois resíduos de nucleotídeo, ou similares na região codificante do gene em um cromossomo (Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, Estados Unidos, 95 55115515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 26 116, 20833-20839 (1991)).

[000136] A interrupção de um gene também pode ser obtida, por exemplo, inserindo uma outra sequência em uma região codificante do gene em um cromossomo. O sítio da inserção pode ser em qualquer região do gene, e inserção de uma região mais longa pode em geral inativas mais exatamente o gene. É preferível que quadros de leitura das sequências a montante e a jusante a partir do sítio de inserção não sejam os mesmos. A outra sequência não é particularmente limitada, contanto que uma sequência que reduz ou elimina a atividade da proteína codificada seja escolhida, e exemplos destas incluem, por exemplo, um gene marcador tal como genes de resistência aos antibióticos, e um gene usado para a produção da substância objetiva.

[000137] Tal modificação de um gene em um cromossomo da maneira descrita anteriormente pode ser obtida, por exemplo, preparando um gene do tipo deficiente, em que uma sequência parcial do gene é eliminada de maneira tal que não possa produzir uma proteína que pode funcionar normalmente, e transformando um hospedeiro com um DNA recombinante contendo o gene do tipo deficiente para causar recombinação homóloga entre o gene do tipo deficiente e o gene tipo selvagem gene em um cromossomo, e substitui por meio disso o gene do tipo deficiente pelo gene tipo selvagem no cromossomo. Neste procedimento, se um gene marcador selecionado de acordo com as características do hospedeiro tais como auxotrofia estiver contido no DNA recombinante, a operação se torna fácil. A proteína codificada pelo gene do tipo deficiente apresenta uma conformação diferente daquela da proteína tipo selvagem, mesmo se for produzida, e assim a função desta é reduzida ou eliminada. Tal interrupção de gene com base na substituição de gene que utiliza recombinação homóloga já é bem estabelecida, e existem métodos de usar um DNA linear tal como um método denominado "integração direcionada por Red" (Datsenko, K.A, e Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 97:6640-6645 (2000)), e um método que utiliza a integração direcionada por Red em combinação com um sistema de excisão derivado de fago X (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol., 184:5200-5203 (2002)) (refere-se a WO2005/010175), um método de usar um plasmídeo com uma origem de replicação sensível à temperatura, um método de usar um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, um método de utilizar um vetor suicida sem uma origem de replicação que funciona em um hospedeiro (Patente U.S. 6.303.383, Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 05-007491), dentre outros.

[000138] A modificação para reduzir a atividade de uma proteína também pode ser obtida, por exemplo, por um tratamento de mutagênese. Exemplos do tratamento de mutagênese incluem irradiação de raios-X, irradiação ultravioleta, e um tratamento com uma agente de mutação tais como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanossulfonato de etila (EMS), e metanossulfonato de metila (MMS).

[000139] Quando uma proteína funciona como um complexo que consiste em uma pluralidade de subunidades, uma parte ou toda a pluralidade de subunidades pode ser modificada, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente reduzida. Isto é, por exemplo, uma parte ou toda uma pluralidade de genes que codifica as respectivas subunidades pode ser interrompida ou similares. Adicionalmente, quando existe uma pluralidade de isozimas de uma proteína, uma parte ou todas as atividades da pluralidade de isozimas pode ser reduzida, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente reduzida. Isto é, por exemplo, uma parte ou toda uma pluralidade de genes que codifica as respectivas isozimas pode ser interrompida ou similares.

[000140] Uma redução na atividade de uma proteína pode ser confirmada medindo a atividade da proteína.

[000141] Uma redução na atividade de uma proteína também pode ser confirmada confirmando uma redução na expressão de um gene que codifica a proteína. Uma redução na expressão de um gene pode ser confirmada confirmando uma redução na quantidade de transcrição do gene ou uma redução na quantidade da proteína expressa a partir do gene.

[000142] Uma redução na quantidade de transcrição de um gene pode ser confirmada comparando a quantidade de RNAm transcrito a partir do gene com aquele observado em uma cepa não modificada. Exemplos do método para avaliar A quantidade de RNAm incluem hibridização Northern, RT-PCR, dentre outros (Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (Estados Unidos), 2001). A quantidade de RNAm pode ser diminuída, por exemplo, em 90% ou menos, 80% ou menos, 70% ou menos, 60% ou menos, 55% ou menos, 50 % ou menos, 30% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0% daquela observada em uma cepa não modificada. No entanto, a quantidade de ARNm transcrito a partir do gene acpP não deve ser reduzida para 0% da quantidade de uma cepa não modificada. Por exemplo, quando a expressão do gene acpP é reduzida, 1% ou mais, 5% ou mais, 10% ou mais, 15% ou mais, 17% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, ou 50% ou mais da quantidade de RNAm transcrito a partir do gene podem também ser mantida em comparação com o observado numa cepa não modificada. Especificamente, quando a expressão do gene acpP é reduzida, a quantidade de ARNm transcrito a partir do gene acpP pode ser reduzida para, por exemplo, de 1% a 90%, 5% a 80%, 10% a 70%, 15% e 60%, ou 17% a 55% do que a quantidade de uma cepa não modificada.

[000143] Uma redução na quantidade de uma proteína pode ser confirmada por Western blotting usando anticorpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (Estados Unidos) 2001). A quantidade da proteína pode ser diminuída, por exemplo, 90% ou menos, 80% ou menos, 70% ou menos, 60% ou menos, 55% ou menos, 50% ou menos, 30% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0% daquela observada em uma cepa não modificada. No entanto, a quantidade de proteína acpP não deve ser reduzida a 0% da cepa não modificada. Por exemplo, quando a expressão do gene acpP é reduzida, 1% ou mais, 5% ou mais, 10% ou mais, 15% ou mais, 17% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, ou 50% ou mais da quantidade de uma proteína acpP pode ser também mantida em comparação com o observado na cepa não modificada. Especificamente, quando a expressão do gene acpP é reduzida, a quantidade de proteína acpP pode ser reduzida a, por exemplo, 1% a 90%, 5% a 80%, 10% a 70%, 15% a 60%, ou 17% a 55% da cepa não modificada.

[000144] A interrupção de um gene pode ser confirmada determinando a sequência de nucleotídeos de uma parte ou a região inteira do gene, mapa de enzima de restrição, tamanho completo ou similares do gene, dependendo do meio usado para a interrupção.

[000145] Os métodos anteriormente mencionados para reduzir a atividade de uma proteína podem ser aplicados, apesar da atenuação do operon acpP-fabF, à redução na atividade de uma proteína arbitrária tal como enzimas que catalisam uma reação que se ramifica a partir da via biossintética de um L-aminoácido objetivo para gerar um composto, sem ser o L- aminoácido objetivo, e redução na expressão de um gene arbitrário tais como genes que codificam estas proteínas arbitrárias.

<1-4> Métodos para aumentar atividade de proteína

[000146] Daqui por diante, métodos para aumentar a atividade de uma proteína serão explicados.

[000147] A expressão "a atividade de uma proteína é aumentada" significa que a atividade da proteína por célula é maior comparada com aquela de uma cepa não modificada, tal como uma cepa tipo selvagem e cepa parental. O estágio de que "a atividade de uma proteína é aumentada" é também expresso como "a atividade de uma proteína é melhorada". Especificamente, a expressão "a atividade de uma proteína é aumentada" significa que o número de moléculas da proteína por célula é maior, e/ou a função de cada molécula da proteína é aumentada comparada com aquela de uma cepa não modificada. Isto é, o termo "atividade" na expressão "a atividade de uma proteína é aumentada" não é limitado à atividade catalítica da proteína, mas pode significar a quantidade de transcrição de um gene (a quantidade de RNAm) que codifica a proteína, ou a quantidade de tradução do gene (a quantidade da proteína). Adicionalmente, o estágio de que "a atividade de uma proteína é aumentada" inclui não apenas um estágio no qual a atividade de uma proteína objetiva é aumentada em uma cepa inerente com a atividade da proteína objetiva, mas também um estágio em que a atividade de uma proteína objetiva é melhor em uma cepa de maneira não inerente com a atividade da proteína objetiva. Adicionalmente, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente maior, a atividade da proteína objetiva de maneira inerente contida em um hospedeiro pode ser reduzida ou eliminada, e a seguir um tipo apropriado da proteína pode ser aumentado a partir desta.

[000148] Embora o grau do aumento na atividade de uma proteína não seja particularmente limitato, contanto que a atividade da proteína seja aumentada comparada com uma cepa não modificada, a atividade da proteína pode ser aumentada, por exemplo, 1,5 vez ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, comparado com aquela de uma cepa não modificada. Adicionalmente, quando a cepa não modificada não apresenta a atividade da proteína objetiva, é suficiente que a proteína seja produzida introduzindo o gene que codifica a proteína e, por exemplo, a proteína pode ser produzida em um grau tal que a atividade enzimática possa ser medida.

[000149] A modificação que aumenta a atividade de uma proteína é obtida, por exemplo, aumentando a expressão de um gene que codifica a proteína. O estágio em que "a expressão de um gene é aumentada" é também referido como "a expressão de um gene é melhorada". A expressão de um gene pode ser aumentada 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, comparada com aquela observada em uma cepa não modificada. Adicionalmente, o estágio em que "a expressão de um gene é aumentada" inclui não apenas um estágio em que a quantidade de expressão de um gene alvo é aumentada em uma cepa que expressa de maneira inerente o gene alvo, mas também um estágio em que o gene é introduzido em uma cepa que não expressa de maneira inerente o gene alvo, e o expressou. Isto é, a frase "a expressão de um gene é aumentada" também significa, por exemplo, que o gene alvo é introduzido em uma cepa que não apresenta o gene, e o expressou.

[000150] A expressão de um gene pode ser aumentada, por exemplo, aumentando o número de cópia do gene.

[000151] O número de cópia de um gene pode ser aumentado introduzindo o gene no cromossomo de um hospedeiro. Um gene pode ser introduzido em um cromossomo, por exemplo, usando recombinação homóloga (Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). Apenas uma cópia, ou duas ou mais cópias de um gene podem ser introduzidas. Por exemplo, realizando a recombinação homóloga que usa uma sequência que está presente em cópias múltiplas em um cromossomo como um alvo, cópias múltiplas de um gene podem ser introduzidas no cromossomo. Exemplos de uma sequência como esta que está presente em cópias múltiplas em um cromossomo incluem DNAs repetitivos, e repetições invertidas localizadas em ambas as extremidades de um transposon. Alternativamente, a recombinação homóloga pode ser realizada usando uma sequência apropriada em um cromossomo, tal como um gene não necessário para a produção das substâncias objetivas como um alvo. A recombinação homóloga pode ser realizada, por exemplo, por um método de usar um DNA linear tal como integração direcionada por Red (Datsenko, K.A., e Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 97:6640-6645 (2000)), um método de usar um plasmídeo com uma origem de replicação sensível à temperatura, um método de usar um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, um método de usar um vetor suicida sem uma origem de replicação que funciona em um hospedeiro, ou um método de transdução usando um fago. Adicionalmente, um gene também pode ser aleatoriamente introduzido em um cromossomo usando um transposon ou Mini-Mu (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2109985, Patente U.S. 5.882.888, EP 805867 B1).

[000152] Introdução de um gene alvo em um cromossomo pode ser confirmada por Southern hibridização usando uma sonda com uma sequência complementar ao gene completo ou uma parte deste, PCR usando oligonucleotídeos iniciadores preparados com base na sequência do gene, ou similares.

[000153] Adicionalmente, o número de cópia de um gene também pode ser aumentado introduzindo um vetor contendo o gene em um hospedeiro. Por exemplo, o número de cópia de um gene alvo pode ser aumentado ligando um fragmento de DNA contendo o gene alvo com um vetor que funciona em um hospedeiro para construir um vetor de expressão do gene, e transformando o hospedeiro com o vetor de expressão. O fragmento de DNA incluindo o gene alvo pode ser obtido, por exemplo, por PCR usando o DNA genômico de um micro-organismo com o gene alvo como o molde. Assim como o vetor, um vetor replicável de maneira autônoma na célula do hospedeiro pode ser usado. O vetor é preferivelmente um vetor multicópias. Adicionalmente, o vetor apresenta preferivelmente um marcador tal como um gene de resistência a antibióticos para a seleção de transformante. Adicionalmente, o vetor pode apresentar um promotor e/ou finalizador para expressar o gene introduzido. O vetor pode ser, por exemplo, um vetor derivado de um plasmídeo bacteriano, um vetor derivado de um plasmídeo de levedura, um vetor derivado de um bacteriófago, cosmídeo, fagemídeo, ou similares. Exemplos específicos de vetor autonomamente replicável em bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae, tal como Escherichia coli, incluem, por exemplo, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pBR322, pSTV29 (todos estes são disponíveis a partir da Takara Bio), pACYC184, pMW219 (NIPPON GENE), pTrc99A (Pharmacia), vetores em série pPROK (Clontech), pKK233-2 (Clontech), vetores em série pET (Novagen), vetores em série pQE (QIAGEN), e vetor RSF1010 com ampla faixa de hospedeiro.

[000154] Quando um gene é introduzido, é suficiente que o gene seja carregado de maneira expressiva pela bactéria da presente invenção. Especificamente, é suficiente que o gene seja introduzido de maneira tal que seja expresso no controle por uma sequência promotora que funciona na bactéria da presente invenção. O promotor pode ser um promotor derivado do hospedeiro, ou um promotor heterogêno. O promotor pode ser o promotor natural do gene a ser introduzido, ou um promotor de um outro gene. Assim como o promotor, por exemplo, um promotor mais forte como este mencionado posteriormente também pode ser usado. Adicionalmente, por exemplo, um finalizador para terminação de gene transcrição pode ser localizado a jusante do gene. O finalizador não é particularmente limitado, contanto que funcione na bactéria da presente invenção. O finalizador pode ser um finalizador derivado do hospedeiro, ou um finalizador heterogêneo. O finalizador pode ser o finalizador natural do gene a ser introduzido, ou um finalizador de um outro gene. Exemplos específicos de finalizador incluem, por exemplo, finalizador T7, finalizador T4, finalizador de fago fd, finalizador tet, e finalizador trpA. Os vetores, promotores e finalizadores disponíveis em vários micro-organismos são revelados em detalhes em “Fundamental Microbiology Vol. 8, Genetic Engineering, KYORITSU SHUPPAN CO., LTD, 1987”, e estes podem ser usados.

[000155] Adicionalmente, quando dois ou mais de genes são introduzidos, é suficiente que os genes sejam cada qual carregados de maneira expressiva pela bactéria da presente invenção. Por exemplo, todos os genes podem ser realizados por um único vetor de expressão ou um cromossomo. Adicionalmente, os genes podem ser carregados de maneira separada por dois ou mais vetores de expressão, ou carregados de maneira separada por um único ou dois ou mais vetores de expressão e um cromossomo. Um operon constituído por dois ou mais genes também pode ser introduzido.

[000156] O gene a ser introduzido não é particularmente limitado, contanto que codifique uma proteína que funciona no hospedeiro. O gene a ser introduzido pode ser um gene derivado do hospedeiro, ou pode ser um gene heterogêneo. O gene a ser introduzido pode ser obtido, por exemplo, por PCR usando oligonucleotídeos iniciadores determinados com base na sequência de nucleotídeos do gene, e do DNA genômico de um organismo com o gene ou um plasmídeo que carrega o gene como molde. O gene a ser introduzido também pode ser totalmente sintetizado, por exemplo, com base na sequência de nucleotídeos do gene (Gene, 60 (1), 115-127 (1987)).

[000157] Além disso, quando uma proteína funciona como um complexo que consiste em uma pluralidade de subunidades, uma parte ou toda a pluralidade de subunidades pode ser modificada, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente aumentada. Isto é, por exemplo, quando a atividade de uma proteína é aumentada melhorando a expressão de um gene, a expressão de uma parte ou toda a pluralidade de genes que codificam as subunidades pode ser melhorada. Em geral, é preferível melhorar a expressão de toda a pluralidade de genes que codificam as subunidades. Adicionalmente, as subunidades que constituem o complexo podem ser derivadas de um único tipo de organismo ou dois ou mais tipos de organismos, contanto que o complexo apresente uma função da proteína objetiva. Isto é, por exemplo, genes do mesmo organismo que codificam uma pluralidade de subunidades podem ser introduzidos em um hospedeiro, ou genes de diferentes organismos que codificam uma pluralidade de subunidades podem ser introduzidos em um hospedeiro.

[000158] Adicionalmente, a expressão de um gene pode ser aumentada melhorando a eficiência de transcrição do gene. A eficiência de transcrição de um gene pode ser melhorada, por exemplo, substituindo o promotor do gene em um cromossomo com um promotor mais forte. O "promotor mais forte" significa um promotor que fornece uma melhor transcrição de um gene, comparado com um promotor do gene tipo selvagem que existe de maneira inerente. Exemplos de promotores mais fortes incluem, por exemplo, os promotores conhecidos com expressão elevada tais como promotor T7, promotor trp, promotor lac, promotor tac, promotor thr, promotor trc, promotor tet, promotor araBAD, promotor rpoH, promotor PR e promotor PL. Adicionalmente, como promotor mais forte, um tipo altamente ativo de um promotor existente também pode ser obtido usando vários genes repórteres. Por exemplo, tornando as regiões -35 e -10 em uma região promotora mais próxima da sequência consensual, a atividade do promotor pode ser melhorada (WO00/18935). Exemplos de promotor do tipo altamente ativo incluem vários promotores do tipo tac (Katashkina JI et al., Pedido de patente da Federação Russa2006134574) e promotor pnlp8 (WO2010/027045). Métodos para avaliar o tamanho dos promotores e exemplos de promotores fortes são descritos no artigo de Goldstein et al. (Prokaryotic Promoters in Biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)), dentre outros.

[000159] Adicionalmente, a expressão de um gene também pode ser aumentada melhorando a eficiência de tradução do gene. A eficiência de tradução de um gene pode ser melhorada, por exemplo, substituindo a sequência Shine-Dalgarno (SD) (também referida como sítio de ligação de ribosomo (RBS)) para o gene em um cromossomo com uma sequência SD mais forte. A "sequência SD mais forte" significa uma sequência SD que fornece uma melhor tradução de RNAm, comparada com a sequência do gene SD tipo selvagem que existe de maneira inerente. Exemplos de sequências SD mais fortes incluem, por exemplo, RBS do gene 10 derivado do fago T7 (Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235). Adicionalmente, sabe-se que substituição, inserção, ou eliminação de vários nucleotídeos em uma região espaçadora entre RBS e o códon inicial, especialmente em uma sequência imediatamente a montante do códon inicial (5'-UTR), afeta de maneira significativa a estabilidade e eficiência de tradução de RNAm, e consequentemente, a eficiência de tradução de um gene também pode ser melhorada modificando-o.

[000160] Na presente invenção, os sítios que afetam a expressão de gene, tais como um promotor, sequência SD, e região espaçadora entre RBS e o códon inicial, são também coletivamente denominados "região de controle de expressão". Uma região de controle de expressão pode ser identificada usando um vetor de pesquisa de promotor ou software de análise de gene tal como GENETYX. Uma região de controle de expressão como esta pode ser modificada, por exemplo, por um método de usar um vetor de sensibilidade à temperatura ou o método de integração direcionada por Red (WO2005/010175).

[000161] A eficiência de tradução de um gene também pode ser melhorada, por exemplo, modificando códons. Em Escherichia coli etc., um viés de códon limpo existe entre o códon 61 do aminoácido encontrado na população de moléculas de RNAm, e o nível de RNAt cognato aparece diretamente proporcional à frequência de uso de códon (Kane, J.F., Curr. Opin. Biotechnol., 6 (5), 494-500 (1995)). Isto é, se existir uma grande quantidade de RNAm contendo uma quantidade em excesso de códons raros, um problema translacional pode aparecer. De acordo com as pesquisas recentes, sugere-se que agrupamentos de códons AGG/AGA, CUA, AUA, CGA, ou CCC pode reduzir especialmente tanto a quantidade quanto a qualidade de uma proteína sintetizada. Um problema como este ocorre especialmente no período de expressão de um gene heterólogo. Portanto, no caso de expressão heterogênea de um gene ou similares, a eficiência de tradução do gene pode ser melhorada substituindo um códon raro presente no gene com um códon sinônimo mais frequentemente usado. Códons podem ser substituídos, por exemplo, pelo método de mutação sítio-específico para introduzir uma mutação objetiva em um sítio objetivo de DNA. Exemplos do método de mutação sítio-específico incluem o método que utiliza PCR (Higuchi, R., 61, em PCR Technology, Erlich, H.A. Eds., Stockton Press (1989); Carter, P., Meth. em Enzymol., 154, 382 (1987)), e o método que utiliza fago (Kramer, W. e Frits, H.J., Meth. em Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T.A. et al., Meth. em Enzymol., 154, 367 (1987)). Alternativamente, um fragmento de gene em que códons objetivos são substituídos pode ser totalmente sintetizado. As frequências de códons em vários organismos são reveladas no "Codon Usage Database" (http://www.kazusa.ou.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)).

[000162] Adicionalmente, a expressão de um gene também pode ser aumentada amplificando um regulador que aumenta a expressão do gene, ou eliminando ou atenuando um regulador que reduz a expressão do gene.

[000163] Tais métodos para aumentar a expressão de gene da maneira mencionada anteriormente podem ser usados independentemente, ou em uma combinação arbitrária.

[000164] Adicionalmente, a modificação que aumenta a atividade de uma proteína também pode ser obtida, por exemplo, melhorando a atividade específica da enzima. A melhoria da atividade específica também inclui redução ou eliminação de inibição por retroalimentação. Uma proteína que exibe uma melhor atividade específica pode ser obtida, por exemplo, pesquisando vários organismos. Adicionalmente, um tipo altamente ativo de uma proteína existente também pode ser obtida introduzindo uma mutação na proteína existente. A mutação a ser introduzida pode ser, por exemplo, substituição, eliminação, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições da proteína. A mutação pode ser introduzida, por exemplo, por um método de mutação sítio-específico como este, da maneira mencionada anteriormente. A mutação também pode ser introduzida, por exemplo, por um tratamento de mutagênese. Exemplos do tratamento de mutagênese incluem irradiação de raios-X, irradiação de ultravioleta, e um tratamento com um agente de mutação tais como N-metil- N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanossulfonato de etila (EMS), e metanossulfonato de metila (MMS). Adicionalmente, uma mutação aleatória pode ser induzida tratando diretamente o DNA in vitro com hidroxilamina. A melhoria da atividade específica pode ser independentemente usada, ou pode ser usada em uma combinação arbitrária com tais métodos para melhorar a expressão de gene da maneira mencionada anteriormente.

[000165] O método para a transformação não é particularmente limitado, e métodos convencionalmente conhecidos podem ser usados. Pode ser usado, por exemplo, um método de tartar células receptoras com cloreto de cálcio de maneira a aumentar a permeabilidade desta para o DNA, que foi relatado para a cepa Escherichia coli K-12 (Mandel, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 1970, 53, 159-162), e um método de preparar células competentes a partir das células que estão na fase de crescimento, seguido por transformação com DNA, que foi relatado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G. A. e Young, F.E., Gene, 1977, 1:153-167). Alternativamente, também pode ser usado um método de preparar células receptoras de DNA em protoplastos ou esferoplastos, que podem absorver facilmente DNA recombinante, após introduzir um DNA recombinante nas células receptoras de DNA, que são conhecidas por serem aplicáveis em Bacillus subtilis, actinomicetos e leveduras (Chang, S. e Choen, S.N., 1979, Mol. Gen. Genet., 168:111-115; Bibb, M.J., Ward, J.M. e Hopwood, O.A., 1978, Nature, 274:398-400; Hinnen, UM., Hicks, J.B. e Fink, G.R., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 75:1929-1933). Adicionalmente, o método pelo pulso elétrico relatado para bactérias corineformes (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2-207791) também pode ser usado.

[000166] Um aumento na atividade de uma proteína pode ser confirmado medindo a atividade da proteína.

[000167] Um aumento na atividade de uma proteína também pode ser confirmado confirmando um aumento na expressão de um gene que codifica a proteína. Um aumento na expressão de um gene pode ser confirmado confirmando um aumento na quantidade de transcrição do gene, ou confirmando um aumento na quantidade de uma proteína expressa a partir do gene.

[000168] Um aumento da quantidade de transcrição de um gene pode ser confirmado comparando a quantidade de RNAm transcrito a partir do gene com aquele observado em uma cepa não modificada, tal como uma cepa tipo selvagem ou cepa parental. Exemplos do método para avaliar a quantidade de RNAm incluem hibridização Northern, RT-PCR, dentre outros (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Terceira Edição, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (Estados Unidos), 2001). A quantidade de RNAm pode aumentar, por exemplo, 1,5 vez ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, comparada com aquela de uma cepa não modificada.

[000169] Um aumento na quantidade de uma proteína pode ser confirmado por Western blotting usando anticorpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (Estados Unidos), 2001). A quantidade da proteína pode aumentar, por exemplo, 1,5 vez ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, comparado com aquela de uma cepa não modificada.

[000170] Os métodos anteriormente mencionados para aumentar a atividade de uma proteína podem ser aplicados para a melhoria da atividade de uma proteína arbitrária tais como enzimas de biossíntese de L-aminoácido, e melhoria da expressão de um gene arbitrário tal como genes que codificam estas proteínas arbitrárias.

<2> Método para produzir L-aminoácido da presente invenção

[000171] O método da presente invenção é um método para produzir um L-aminoácido compreendendo cultivar a bactéria da presente invenção em um meio para produzir e acumular o L-aminoácido no meio ou células da bactéria, e coletar o L-aminoácido do meio ou as células. Na presente invenção, um único tipo de L-aminoácido pode ser produzido, ou dois ou mais tipos de L-aminoácidos podem ser produzidos.

[000172] O meio a ser usado não é particularmente limitado, contanto que a bactéria da presente invenção possa proliferar no mesmo, e um L- aminoácido objetivo possa ser produzido. Como o meio, por exemplo, um meio comum usado para cultivo de micro-organismos, tais como bactérias, pode ser usado. O meio pode conter fonte de carbono, fonte de nitrogênio, fonte de fósforo, e fonte de enxofre, bem como componentes selecionados de vários outros componentes orgânicos e componentes inorgânicos, da maneira exigida. Os tipos e concentrações dos componentes do meio podem ser apropriadamente ajustados de acordo com várias condições, tais como o tipo da bactéria a ser usada, e o tipo do L-aminoácido a ser produzido.

[000173] A fonte de carbono não é particularmente limitada, contanto que a bactéria da presente invenção possa utilizar a fonte de carbono escolhida e produzir um L-aminoácido. Exemplos específicos da fonte de carbono incluem, por exemplo, sacarídeos tais como glicose, frutose, sacarose, lactose, galactose, xilose, arabinose, melaço negro, hidrolisados de amido, e hidrolisados de biomassa, ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido succínico, e ácido málico, álcoois tais como glicerol, glicerol bruto e etanol, e ácidos graxos. Como a fonte de carbono, um único tipo de fonte de carbono pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de carbono podem ser usados em combinação.

[000174] A concentração da fonte de carbono no meio não é particularmente limitada, contanto que a bactéria da presente invenção possa proliferar, e um L-aminoácido seja produzido. É preferível tornar a concentração da fonte de carbono no meio o mais elevada possível, em uma faixa tal que a produção de L-aminoácido não seja inibida. A concentração inicial da fonte de carbono no meio pode estar em geral na faixa de 5 a 30 % (P/V), preferivelmente 10 a 20 % (P/V). Adicionalmente, de acordo com o consumo da fonte de carbono que acompanha o progresso da fermentação, a fonte de carbono pode ser adicionada de maneira suplementar.

[000175] Exemplos específicos da fonte de nitrogênio incluem, por exemplo, sais de amônio tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, e fosfato de amônio, fontes de nitrogênio orgânico tais como peptona, extrato de levedura, extrato de carne, e produtos de decomposição da proteína da soja, amônia e uréia. O gás amônia ou amônia aquosa usados para ajustar o pH também podem ser usados como a fonte de nitrogênio. Como a fonte de nitrogênio, um único tipo de fonte de nitrogênio pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de nitrogênio podem ser usados em combinação.

[000176] Exemplos específicos da fonte de fosfato incluem, por exemplo, sais de ácido fosfórico tais como di-hidrogenofosfato de potássio e hidrogenofosfato de dipotássio, e polímeros de ácido fosfórico tal como ácido pirofosfórico. Como a fonte de fosfato, um único tipo de fonte de fosfato pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de fosfato podem ser usados em combinação.

[000177] Exemplos específicos da fonte de enxofre incluem, por exemplo, compostos de enxofre inorgânico tais como sulfatos, tiossulfatos, e sulfitos, e aminoácidos contendo enxofre tais como cisteína, cistina, e glutationa. Como a fonte de enxofre, um único tipo de fonte de enxofre pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de enxofre podem ser usados em combinação.

[000178] Exemplos específicos de vários outros componentes orgânicos e componentes inorgânicos incluem, por exemplo, sais inorgânicos tais como cloreto de sódio e cloreto de potássio; metais traço tais como ferro, manganês, magnésio e cálcio; vitaminas tais como vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, ácido nicotínico, nicotinamida, e vitamina B12; aminoácidos; ácidos nucléicos; e componentes orgânicos contendo estes, tais como peptona, casaminoácido, extrato de levedura, e produto de decomposição da proteína da soja. Como vários outros componentes orgânicos e componentes inorgânicos, um único tipo de componente pode ser usado, ou dois ou mais tipos de componentes podem ser usados em combinação.

[000179] Adicionalmente, quando um mutante auxotrófico que exige um aminoácido ou similares para crescimento deste é usado, é preferível suplementar um nutriente exigido no meio. Por exemplo, em muitas das bactérias produtoras de L-lisina, a via biossintética da L-lisina é melhorada e a capacidade de degradar L-lisina é atenuada. Portanto, quando uma bactéria produtora de L-lisina como esta é cultivada, por exemplo, um ou mais tipos de aminoácidos selecionados de L-treonina, L-homoserina, L-isoleucina, e L- metionina são preferivelmente adicionados ao meio.

[000180] Adicionalmente, também é preferível adicionar uma quantidade apropriada de um antiespuma comercialmente disponível ao meio, a fim de suprimir a formação de espuma durante o cultivo.

[000181] As condições de cultivo não são particularmente limitadas, contanto que a bactéria da presente invenção possa proliferar, e um L- aminoácido seja produzido. O cultivo pode ser realizado, por exemplo, em condições comuns usadas para cultivar micro-organismos, tais como bactérias. As condições de cultivo podem ser ajustadas de maneira apropriada, de acordo com várias condições, tal como o tipo de bactéria a ser usada, e o tipo de L-aminoácido a ser produzido.

[000182] O cultivo pode ser realizado usando um meio líquido. Para o cultivo, a bactéria da presente invenção cultivada em um meio sólido, tal como meio com ágar, pode ser inoculada diretamente em um meio líquido, ou a bactéria da presente invenção cultivada em um meio líquido como cultivo de semeio pode ser inoculada em um meio líquido para o cultivo principal. Isto é, o cultivo pode ser realizado como cultivo de semente separado e cultivo principal. A quantidade da bactéria da presente invenção contida no meio no momento do início da cultura não é particularmente limitada. Por exemplo, o cultivo de semente que apresenta OD660 de 4 a 8 pode ser adicionado ao meio para cultivo principal em uma quantidade de 0,1 a 30 % de massa, preferivelmente 1 a 10 % de massa, no momento do início da cultura.

[000183] O cultivo pode ser realizado como cultivo em lotes, cultivo em lote alimentado, cultivo contínuo, ou uma combinação destes. Adicionalmente, quando o cultivo é realizado como cultivo de semente separado e cultivo principal, as condições de cultivo do cultivo de semente e do cultivo principal podem ser as mesmas ou diferentes. Por exemplo, tanto o cultivo de semente quanto o cultivo principal podem ser realizados como cultivo em lotes. Alternativamente, por exemplo, o cultivo de semente pode ser realizado como cultivo em lotes, e o cultivo principal pode ser realizado como cultivo em lote alimentado ou cultivo contínuo.

[000184] O cultivo pode ser, por exemplo, realizado aerobicamente. Por exemplo, o cultivo pode ser realizado como cultivo de aeração ou cultivo de agitação. A concentração de oxigênio pode ser controlada para ser, por exemplo, 5 a 50%, preferivelmente cerca de 10%, da concentração de oxigênio saturado. pH do meio pode ser, por exemplo, 3 a 10, preferivelmente 4,0 a 9,5. O pH do meio pode ser ajustado da maneira exigida durante o cultivo. O pH do meio pode ser ajustado usando várias substâncias alcalinas e acídicas, tais como gás amônia, amônia aquosa, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, carbonato de magnésio, hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio, e hidróxido de magnésio. A temperatura de cultivo pode ser, por exemplo, 20 a 45°C, preferivelmente 25 a 37°C. O tempo de cultivo pode ser, por exemplo, 1 hora ou mais, 4 horas ou mais, 10 horas ou mais, ou 15 horas ou mais, e pode ser 168 horas ou menos, 120 horas ou menos, 90 horas ou menos, ou 72 horas ou menos. Especificamente, o período de cultivo pode ser, por exemplo, 10 a 120 horas. O cultivo pode ser contínuo, por exemplo, até a fonte de carbono contida no meio ser consumida, ou até a atividade da bactéria da presente invenção ser perdida. Cultivando a bactéria da presente invenção em tais condições, um L-aminoácido é acumulado nas células e/ou no meio.

[000185] Além do mais, quando ácido L-glutâmico é produzido, o cultivo pode ser realizado precipitando ao mesmo tempo o ácido L-glutâmico no meio, usando um meio líquido ajustado para satisfazer uma condição na qual ácido L-glutâmico precipita. Exemplos da condição na qual ácido L- glutâmico precipita incluem, por exemplo, pH de 5,0 a 3,0, preferivelmente pH 4,9 a 3,5, mais preferivelmente pH 4,9 a 4,0, particularmente preferível cerca de pH 4,7 (Patente Europeia submetida à inspeção pública 1078989). O período total ou um período parcial do cultivo pode ser realizado no pH anteriormente mencionado. O "período parcial" pode ser, por exemplo, 50 % ou mais, 70 % ou mais, 80 % ou mais, 90 % ou mais, 95 % ou mais, ou 99 % ou mais do período total do cultivo.

[000186] Quando um aminoácido básico tal como L-lisina é produzido, pode ser empregado um método em que o aminoácido básico seja produzido por fermentação, usando íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato como os principais contra-íons para o aminoácido básico (Patente Japonesa submetida à inspeção pública (Kokai) No. 2002-65287, Pedido de patente publicado U.S. 20020025564, EP 1813677 A). Por um método como este, um aminoácido básico pode ser produzido, reduzindo ao mesmo tempo a(s) quantidade(s) de íons de sulfato e/ou íons de cloreto a serem usados, os quais foram usados convencionalmente como contra-íons para um aminoácido básico.

[000187] A produção do L-aminoácido pode ser confirmada por métodos conhecidos que são usados para a detecção ou identificação de compostos. Exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, HPLC, LC/MS, GC/MS, e NMR. Estes métodos podem ser usados em uma combinação apropriada.

[000188] O L-aminoácido produzido pode ser coletado por métodos conhecidos e usados para a separação e purificação de compostos. Exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, o método de resina de troca iônica, método de tratamento de membrana, método de precipitação e método de cristalização. Estes métodos podem ser usados em uma combinação apropriada. Quando o L-aminoácido acumula nas células, as células podem ser interrompidas, por exemplo, com ondas ultrassônicas ou similares, e a seguir o L-aminoácido pode ser coletado pelo método de resina de troca iônica ou similares, a partir do sobrenadante obtido removendo as células da suspensão de células rompidas por centrifugação. O L-aminoácido a ser coletado pode ser um composto livre, um sal deste, ou uma mistura destes. Exemplos do sal incluem, por exemplo, sulfato, cloridrato, carbonato, sal de amônio, sal de sódio e sal de potássio. L-lisina pode ser, por exemplo, L-lisina em uma forma livre, o sal cloridrato de L-lisina, o sal carbonato de L-lisina, ou uma mistura destes. Adicionalmente, ácido L-glutâmico pode ser, por exemplo, ácido L-glutâmico em uma forma livre, L-glutamato monossódico (MSG), L-glutamato (MSG) de monoamônio, ou uma mistura destes.

[000189] Adicionalmente, quando o L-aminoácido precipita no meio, pode ser coletado por centrifugação, filtração ou similares. L-Aminoácido precipitado no meio e L-aminoácido dissolvido no meio pode ser isolado junto, após o L-aminoácido dissolvido no meio ser cristalizado.

[000190] O L-aminoácido coletado pode conter, por exemplo, células bacterianas, componentes do meio, umidade, e metabólitos do subproduto da bactéria, além do L-aminoácido. A pureza do L-aminoácido coletado pode ser, por exemplo, 30 % (p/p) ou mais, 50 % (p/p) ou mais, 70 % (p/p) ou mais, 80 % (p/p) ou mais, 90 % (p/p) ou mais, ou 95 % (p/p) ou mais (JP1214636B, USP5,431,933, USP4,956,471, USP4,777,051, USP4,946,654, USP5,840,358, USP6,238,714, US2005/0025878).

[000191] Uma forma de realização do método da presente invenção pode ser um método para a produção de L-lisina compreendendo: a cultura de Escherichia coli, tendo a capacidade de produção de L-lisina num meio para produzir e acumular a L-lisina nas células de Escherichia coli ou de forma; e recolher a L-lisina a partir do meio ou células, em que a expressão de um gene do operon acpP-fabF foi atenuada na Escherichia coli, modificando uma sequência de controle da expressão do gene. Uma forma de realização do método da presente invenção também pode ser um método para a produção de L-lisina, que compreende: a cultura de Escherichia coli, tendo a capacidade de produção de L-lisina num meio para produzir e acumular a L-lisina na forma ou células de Escherichia coli ; e recolher a L-lisina a partir do meio ou células, em que a citosina na posição -34 a montante do local de iniciação da tradução do gene acpP foi substituída por outra base na Escherichia coli. Uma forma de realização do método da presente invenção também pode ser um método para a produção de L-lisina, que compreende: a cultura de Escherichia coli, tendo a capacidade de produção de L-lisina num meio para produzir e acumular a L-lisina na forma ou células de Escherichia coli ; e recolher a L-lisina a partir do meio ou células, em que a citosina na posição - 34 a montante do local de iniciação da tradução do gene acpP foi substituído com adenina na Escherichia coli. As descrições acima referidas relativas a bactéria do presente invento e o método da presente invenção pode ser aplicada mutatis mutandis a estes modos de realização.

Exemplos

[000192] Daqui por diante, a presente invenção será mais especificamente explicada com referência a exemplos.

Exemplo 1: Construção de bactéria produtora de L-lisina que exibe expressão reduzida de genes acpP e fabF (1)

[000193] Como a bactéria produtora de L-lisina, a cepa de E. coli WC196ΔcadAΔldc (FERM BP-11027, WO2010/061890, daqui por diante também referida como cepa WC196LC) foi usada. Uma mutação pontual foi introduzida a montante do operon acpP-fabF que consiste nos genes acpP e fabF da cepa usando o método denominado "integração direcionada por Red", que foi primeiro desenvolvida por Datsenko e Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 2000, vol. 97, No. 12, pp.6640-6645). De acordo com este método, uma cepa introduzida por mutação pode ser construída em uma etapa usando um produto de PCR obtido pelo uso de oligonucleotídeos sintéticos, em que uma sequência que corresponde a um gene alvo é determinada no lado da extremidade 5', e uma sequência que corresponde a um gene de resistência a antibiótico é determinada no lado da extremidade 3'. O procedimento é mostrado a seguir.

[000194] PCR foi realizado usando o DNA cromossômico da cepa Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) como o molde, e os oligonucleotídeos sintéticos mostrados como SEQ ID NOS: 1 e 2 como os oligonucleotídeos iniciadores. O oligonucleotídeo iniciador de SEQ ID NO: 1 apresenta uma sequência que corresponde à sequência em torno do sítio BglII do plasmídeo pMW118(XattL-Kmr-XattR) (WO2006/093322) na extremidade 5’ do oligonucleotídeo iniciador, e uma sequência que corresponde a uma parte da sequência a montante do gene acpP na extremidade 3’ do oligonucleotídeo iniciador. O oligonucleotídeo iniciador de SEQ ID NO: 2 apresenta uma sequência que corresponde à sequência em torno do sítio BglII do plasmídeo pMW118(XattL-Kmr-XattR) (WO2006/093322) na extremidade 5’ do oligonucleotídeo iniciador, e uma sequência que corresponde a uma parte da sequência a jusante do gene fabF na extremidade 3’ do oligonucleotídeo iniciador. O fragmento de DNA obtido foi ligado com o vetor pMW118(XattL-Kmr-XattR) tratado com a enzima de restrição BglII usando o estojo de clonagem In-Fusion HD (TAKARA BIO). A cepa E. coli JM109 foi transformada usando a mistura de reação In-Fusion. Um transformante foi selecionado em um meio com L-ágar meio contendo 50 mg/L de canamicina. Um plasmídeo foi extraído do transformante, e a inserção do fragmento alvo foi confirmada. Este plasmídeo foi determinado pMW118(XattL-Kmr-XattR)-acpP-fabF.

[000195] Usando pMW118(XattL-Kmr-XattR)-acpP-fabF como o molde, os oligonucleotídeos sintéticos mostrados como SEQ ID NOS: 3 e 4 como os oligonucleotídeos iniciadores, e o estojo de mutagênese sítio-direcionada QuikChange (Agilent Technologies), um plasmídeo introduzido com uma mutação pontual foi construído. Esta mutação substitui a citosina localizada 34 bases a montante do sítio de iniciação de tradução do gene acpP por adenina. Este plasmídeo foi determinado pMW118(XattL-Kmr-XattR)-acpP*-fabF.

[000196] A PCR foi realizada usando pMW118(XattL-Kmr-XattR)- acpP*-fabF como o molde, e os oligonucleotídeos sintéticos mostrados como SEQ ID NOS: 5 e 6 como os oligonucleotídeos iniciadores. A cepa WC196LCacpP* foi construída a partir da cepa E. coli WC196LC usando o fragmento de DNA obtido de acordo com o método X-Red descrito no pedido de patente publicado U.S. 2006/0160191 e WO2005/010175. Na cepa WC196LCacpP*, a citosina localizada 34 bases a montante do sítio de iniciação de tradução do gene acpP é substituída por adenina. No método X- red, um recombinante resistente à canamicina foi obtido realizando cultivo em placa em um meio L-ágar meio contendo 50 mg/L de canamicina a 37 °C, e selecionando um recombinante resistente à canamicina.

[000197] A cepa WC196LCacpP* foi transformada com o plasmídeo pCABD2 (Patente U.S. 6.040.160), e um transformante foi selecionado no meio L-ágar contendo 20 mg/L de estreptomicina, para obter a cepa WC196LCacpP*/pCABD2. O plasmídeo pCABD2 contém um gene mutante dapA derivado de Escherichia coli, e que codifica uma di-hidrodipicolinato sintase (DDPS) com uma mutação por dessensibilização para inibição por retroalimentação por L-lisina, um gene mutante lysC derivado de Escherichia coli, e que codifica uma aspartoquinase III com uma mutação por dessensibilização para inibição por retroalimentação por L-lisina, o gene dapB derivado de Escherichia coli e que codifica di-hidrodipicolinato redutase, e o gene ddh derivado de Brevibacterium lactofermentum e que codifica diaminopimelato desidrogenase.

Exemplo 2: Cultivo para produção de L-Lisina

[000198] O cultivo para a produção de L-Lisina foi realizado usando a cepa WC196LCacpP*/pCABD2 preparada. A cepa foi cultivada no meio L contendo 20 mg/L de estreptomicina a 37 °C, até OD600 se tornar cerca de 0,6, e uma solução de glicerol a 40 % em um volume igual ao volume do meio de cultivo foi adicionada, e a mistura foi agitada. A seguir, a mistura foi dividida em volumes apropriados, e armazenada a -80°C como estoque de glicerol.

[000199] O estoque de glicerol da cepa WC196LCacpP*/pCABD2 foi aplicado de maneira uniforme ao meio L-ágar contendo 20 mg/L de estreptomicina, e cultivado a 37 °C por 24 horas. A cepa WC196LC/pCABD2, que é uma cepa controle obtida introduzindo pCABD2 na cepa WC196LC, foi cultivada de maneira similar no meio de L-agar meio contendo 20 mg/L de estreptomicina. As células crescidas foram suspensas em 3,0 mL do meio de produção de L-lisina (meio MS-Glc) mostrado na tabela 1, e a suspensão obtida foi diluída com o mesmo meio, de maneira tal que OD600 da suspensão se tornou 15. A suspensão diluída obtida em um volume de 1,0 mL foi inoculada em 19 mL do meio de produção de L-lisina contendo 20 mg/L de estreptomicina e contido em um frasco Sakaguchi de volume de 500 mL, e o cultivo foi realizado a 37 °C usando um aparelho de cultivo por agitação recíproco. Quarenta e oito horas após o início do cultivo, as quantidades de glicose residual e L-lisina produzida foram quantificadas. [Tabela 1]

[000200] O meio foi ajustado em pH 7,0 com KOH, e autoclavado a 115°C por 10 minutos, com a observação de que glicose e MgSOi^7H2O foram autoclavados separadamente dos outros componentes. CaCO3 foi adicionado após esterilização com ar quente.

[000201] As concentrações de glicose residual e concentrações de acúmulo de L-lisina obtidas após 48 horas do cultivo são mostradas na tabela 2. Da maneira comparada com a cepa controle WC196LC/pCABD2, o rendimento de L-lisina foi muito melhor com a cepa WC196LCacpP*/pCABD2, em que a expressão dos genes acpP e fabF foi reduzida. [Tabela 2] Tabela 2: Concentração residual de glicose e concentração do acúmulo de L-lisina obtidas após 48 horas de cultivo

Exemplo 3: Verificação de quantidade de expressão de gene acpP por RT-PCR

[000202] A cepa WC196LCacpP*/pCABD2 e a cepa WC196LC/pCABD2 foram cada qual cultivadas sob a mesma condição descrita no exemplo 2, e o caldo de cultivo foi amostrado após 17 horas do cultivo. RNA foi extraído do caldo de cultivo usando o reagente de bactérias RNAprotect (Qiagen) e o estojo RNeasy Mini_(Qiagen). A PCR por transcrição reversa foi realizada usando o RNA obtido como o molde, e usando estojo de reagente PrimeScript RT (Takara Bio). A PCR qiantitativa foi realizada usando o DNAc obtido como o molde, e os oligonucleotídeos sintéticos mostrados como SEQ ID NOS: 13 e 14 e os oligonucleotídeos sintéticos mostrados como SEQ ID NOS: 15 e 16 como os oligonucleotídeos iniciadores, e usando a mistura principal Power SYBR Green PCR (Applied Biosystems). Os oligonucleotídeos mostrados como SEQ ID NOS: 13 e 14 correspondem cada qual à sequência de nucleotídeos do gene acpP. Os oligonucleotídeos mostrados como SEQ ID NOS: 15 e 16 correspondem cada qual à sequência interna de ORF de rrsA (RNAr 16S). A quantidade de mRNA do gene acpP foi calculada usando rrsA (16s rRNA) como padrão interno.

[000203] As quantidades de RNAm de gene acpP obtido após 17 horas do cultivo foram mostradas na tabela 3. Os dados foram mostrados como o valor relativo à quantidade de RNAm de gene acpP, observada na cepa WC196LC/pCABD2 ajustada como 1. Da maneira comparada com a cepa controle WC196LC/pCABD2, a quantidade de RNAm de gene acpP foi altamente diminuída na cepa WC196LCacpP*/pCABD2. [Tabela 3] Tabela 3: Quantidade de RNAm de gene acpP obtido após 17 horas de cultivo

Exemplo 4: Construção de bactéria produtora de L-lisina que mostra a expressão de genes reduzida acpP e fabF (2)

[000204] À medida que a bactéria produtora de L-lisina, a cepa WC196LC é usada. A região a montante do operon acpP-fabF consistindo dos genes acpP e fabF da cepa é substituída com Promotor PTac84 (Pedido de Patente Russa de N ° 2006/134574) ou o promotor lac, utilizando o método de "integração induzida por vermelho". A região a ser substituída pode ser uma parte ou a totalidade da região de -200 a -1 a montante do local de iniciação da transcrição do operon acpP-fabF. Por exemplo, a região de -100 a -1, -1 a - 50, -30 a -1, ou a de -30 a -10 a montante do local de iniciação da transcrição do operon acpP-fabF pode ser substituída.

[000205] Daqui por diante, uma cepa obtida a partir da cepa WC196LC por substituição da região a montante do operon acpP-fabF com Promotor PTac84 é designada cepa WC196LC Ptac84acpP , e uma cepa obtida a partir da cepa WC196LC por substituição da região a montante do operon acpP- fabF com lac promotor é designada cepa WC196LC Piac acpP.

[000206] A cepa WC196LC Ptac84acpP e a cepa WC196LC Piac acpP são transformadas com o plasmídeo pCABD2, e os transformantes são selecionados no meio de L-agar contendo 20 mg / L de estreptomicina, para obter WC196LC Ptac84acpP / cepa pCABD2 cepa e WC196LC Piac acpP / cepa pCABD2 . Exemplo 5: Cultura de produção de L-Lisina (2)

[000207] Cultura de produção de L-lisina é realizada de acordo com o método descrito no Exemplo 2, utilizando a cepa WC196LC Ptac84acpP / pCABD2 e a cepa WC196LC Plac acpP / pCABD2, que são obtidos no Exemplo 4, e a cepa WC196LC / pCABD2 como uma cepa de controlo. Exemplo 6: verificação da quantidade de gene acpP por RT-PCR a expressão (2)

[000208] A cepa WC196LC Ptac84acpP / pCABD2 e a cepa WC196LC Plac acpP / pCABD2, que são obtidos no Exemplo 4, e a cepa WC196LC / pCABD2 são cada cultivadas sob a condição descrita no Exemplo 2, e a quantidade de mRNA do gene acpP é calculada pela utilizando o método descrito no Exemplo 3. Exemplo 7: Construção de bactéria produtora de L-treonina mostrando redução da expressão de genes e acpP fabF

[000209] À medida que a bactéria produtora de L-treonina, a cepa E. coli TDH-6 (Patente Japonesa Laid-open (Kokai) No. 2001-346.578) é usada. A cepa de TDH-6 pode ser obtida a partir da cepa E. coli TDH-6 / pVIC40 (VKPM B-3996) por cura do plasmídeo pVIC40 (Patente Japonesa Laid-open (Kokai) No. 2001-346.578). A citosina localizada 34 bases a montante do local de iniciação da tradução do gene da cepa acpP TDH-6 é substituída com adenina, utilizando o método descrito no Exemplo 1.

[000210] Alternativamente, a região a montante do operon acpP-fabF da cepa TDH-6 é substituída com Promotor PTac84 ou promotor lac, utilizando o método descrito no Exemplo 4. A região a ser substituída pode ser uma parte ou a totalidade da região de -200 a -1 a montante do local de iniciação da transcrição do operon acpP-fabF. Por exemplo, a região de -100 a -1, -1 a -50, -30 a -1, ou a de -30 a -10 a montante do local de iniciação da transcrição do operon acpP-fabF pode ser substituída.

[000211] Daqui por diante, uma cepa obtida a partir da cepa de TDH-6, substituindo o citosina localizada 34 bases a montante do local de iniciação da tradução do gene acpP com adenina é designada TDH-6acpP *, uma cepa obtida a partir da cepa de TDH-6, substituindo a região a montante do operon acpP-fabF com Promotor PTac84 é designada cepa TDH-6 Ptac84acpP, e uma cepa obtida a partir da cepa de TDH-6 através da substituição da região a montante do operon acpP-fabF com promotor lac é designado cepa TDH-6 Plac acpP.

[000212] A cepa TDH-6acpP *, a cepa TDH-6 Ptac84acpP, e a cepa TDH-6 Plac acpP são transformadas com o plasmídeo pVIC40 (Patente dos EUA No. 5.705.371), para se obter cepa TDH-6acpP * / pVIC40 , TDH-6 Ptac84acpP / pVIC40 tensão, e TDH-6 Plac acpP / pVIC40 tensão, respectivamente.

[000213] A cepa TDH-6acpP *, a cepa TDH-6 Ptac84acpP, e a cepa TDH-6 Plac acpP são transformadas com o plasmídeo pVIC40 (Patente dos EUA No. 5.705.371), para se obter cepa TDH-6acpP * / pVIC40 , TDH-6 Ptac84acpP / pVIC40 tensão, e TDH-6 Plac acpP / pVIC40 tensão, respectivamente.

Exemplo 8: Cultura de produção de L-treonina

[000214] Cultura de produção de L-treonina é realizada de acordo com o método descrito na patente US No. 7.915.018 usando a cepa TDH-6acpP * / pVIC40, o Ptac84acpP / cepa pVIC40 TDH-6, e a cepa TDH-6 Plac acpP / pVIC40, que são obtidas no Exemplo 7, e a cepa TDH-6 / pVIC40 como uma cepa de controle. Exemplo 9: Verificação da quantidade de expressão do gene acpP por RT- PCR (3)

[000215] Cultura de produção de L-treonina é realizada de acordo com o método descrito na patente US No. 7.915.018 usando a cepa TDH-6acpP * / pVIC40, o Ptac84acpP / cepa pVIC40 TDH-6, e a TDH-6 Plac acpP / cepa pVIC40, que são obtidos no Exemplo 7, e o TDH-6 / cepa pVIC40 como uma cepa de controle, e a quantidade de mRNA do gene acpP é calculada através da utilização do caldo de cultura de acordo com o método descrito no Exemplo 3. Aplicabilidade Industrial

[000216] De acordo com a presente invenção, capacidades de produção de L-aminoácidos de bactérias pode ser melhorada, e L-aminoácidos podem ser produzidos de forma eficiente. <Explicação da Listagem de sequências> SEQ ID NOS: 1 a 6, Oligonucleotídeos iniciadores SEQ ID NO: 7, Sequência de nucleotídeos de operon acpP-fabF e sequência a montante desta de E. coli MG1655 SEQ ID NO: 8, sequência de aminoácido de proteína acpP de E. coli MG1655 SEQ ID NO: 9, sequência de aminoácido de proteína FabF de E. coli MG1655 SEQ ID NO: 10: Sequência de nucleotídeos de operon acpP-fabF e sequência a montante deata de Pantoea ananatis AJ13355 SEQ ID NO: 11: sequência aminoácido de proteína acpP de Pantoea ananatis AJ13355 SEQ ID NO: 12: sequência aminoácido de proteína FabF de Pantoea ananatis AJ13355 SEQ ID NOS: 13 to 16, Oligonucleotídeos iniciadores

Claims

1. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e com uma capacidade de produzir L-aminoácido em um meio para produzir e acumular um L-aminoácido no meio ou células da bactéria; e coletar o L-aminoácido do meio ou células, em que a bactéria foi modificada de maneira tal que o operon acpP-fabF seja atenuado em comparação com uma cepa não modificada, em que o operon acpP-fabF é atenuado atenuando a expressão de um gene do operon acpP-fabF, em que a expressão do gene do operon acpP-fabF é atenuada modificando uma sequência de controle de expressão do gene.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene do operon acpP-fabF consiste no gene acpP e/ou o gene fabF.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o gene do operon acpP-fabF consiste no gene acpP e no gene fabF.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene do operon acpP-fabF é atenuada substituindo a citosina na posição -34 a montante a partir do sítio de iniciação de tradução do gene acpP por uma outra base, em que a posição - 34 à montante do sítio de iniciação da tradução do gene acpP é uma posição correspondente à posição 177 da sequência de nucleotídeos mostrada como SEQ ID NO: 7.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene do operon acpP-fabF é atenuada substituindo a citosina na posição -34 a montante a partir do sítio de iniciação de tradução do gene acpP por adenina.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia, Pantoea ou Enterobacter.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Escherichia coli.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a cepa não modificada é a cepa Escherichia coli K-12 tipo selvagem.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a cepa não modificada possui a sequência de nucleotídeos do operon acpP-fabF, incluindo 210 pb à montante deste, mostrado como SEQ ID NO: 7.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é L-lisina.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a quantidade de expressão do gene acpP não é reduzida a 0%.

12. Método para a produção de L-lisina, caracterizado pelo fato de que compreende: a cultura de Escherichia coli, com capacidade de produção de L-lisina num meio para produzir e acumular a L-lisina na células de Escherichia coli ou de forma; e coleta de L-lisina a partir do meio ou células, em que a expressão de um gene do operão acpP-fabF foi atenuada na Escherichia coli em comparação a uma cepa não modificada, modificando uma sequência de controle da expressão do gene.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a cepa não modificada é a cepa selvagem K-12.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a cepa não modificada possui a sequência de nucleotídeos do operon acpP-fabF (incluindo 210 pb à montante deste) mostrada como SEQ ID NO: 7.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a quantidade de expressão do gene acpP não é reduzida para 0%.

16. Método para a produção de L-lisina, caracterizado pelo fato de que compreende: a cultura de Escherichia coli, com capacidade de produção de L- lisina num meio para produzir e acumular a L-lisina na células de Escherichia coli ou de forma; e coleta de L-lisina a partir do meio ou células, em que a citosina na posição -34 a montante do local de iniciação da tradução do gene acpP foi substituída com uma outra base na Escherichia coli, em que a posição -34 à montante do sítio de iniciação da tradução do gene acpP é uma posição correspondente à posição 177 da sequência de nucleotídeos mostrada como SEQ ID NO: 7.

17. Método para a produção de L-lisina, caracterizado pelo fato de que compreende: a cultura de Escherichia coli, com capacidade de produção de L- lisina num meio para produzir e acumular a L-lisina na células de Escherichia coli ou de forma; e coleta de L-lisina a partir do meio ou células, em que a citosina na posição -34 a montante do local de iniciação da tradução do gene acpP foi substituída com adenina na Escherichia coli, em que a posição -34 à montante do sítio de iniciação da tradução do gene acpP é uma posição correspondente à posição 177 da sequência de nucleotídeos mostrada como SEQ ID NO: 7.