CN107893089B - 用于生产l-氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于生产L‑氨基酸，如L‑谷氨酸的方法。通过在培养基中培养具有L‑氨基酸生产能力的细菌，并且从培养基或细菌细胞收集L‑氨基酸生产L‑氨基酸，所述具有L‑氨基酸生产能力的细菌经修饰而提高C4二羧酸摄取载体，如DctA、DcuA和DcuB的活性。

Description

用于生产L-氨基酸的方法
技术领域
本发明涉及通过使用细菌发酵生产L-氨基酸，如L-谷氨酸的方法。L-氨基酸在工业上可用作调味品的原料等。
背景技术
L-氨基酸在工业上通过例如使用微生物，如具有L-氨基酸生产能力的细菌进行发酵来生产(非专利文献1)。作为此类微生物，例如，已经使用从自然界分离的菌株和其突变菌株。此外，通过使用重组DNA技术，可以改善微生物的L-氨基酸生产能力。例如，作为改善细菌的L-谷氨酸生产能力的方法，已知增强磷酸酮醇酶活性(专利文献1)以及利用突变体yggB基因(专利文献2)。
已经在细菌中发现了各种C4-二羧酸摄取载体。细菌可以通过那些C4-二羧酸摄取载体摄取和代谢C4-二羧酸。例如，已知由dctA基因、dcuA基因和dcuB基因编码的蛋白质都具有对于诸如天冬氨酸的C4-二羧酸的摄取能力(非专利文献2-3)。还已知由dctA基因编码的蛋白质也具有L-谷氨酸的摄取能力(非专利文献4)。
此外，已经报道了使用具有增强的dctA基因表达的棒状杆菌细菌生产L-氨基酸的方法(专利文献3)。此文献公开了使用相同的细菌生产L-赖氨酸的实例。相比之下，虽然本文中也将除L-赖氨酸以外的L-氨基酸，如L-谷氨酸作为L-氨基酸例示，但还未证明是否可以使用相同的细菌生产除L-赖氨酸以外的L-氨基酸，如L-谷氨酸。
此外，已知由yggB基因编码的蛋白质具有L-谷氨酸的排出能力(专利文献2和非专利文献5)。
现有技术参考文献
专利文献
专利文献1:WO2006/016705
专利文献2:WO2006/070944
专利文献3:US2002-0106759
非专利文献
专利文献1:Akashi,K.et al.,Amino Acid Fermentation.Japan ScientificSocieties Press,p.195to 215,1986.
专利文献2:Karinou E.et al.,The Escherichia coli SLC26 homologue YchM(DauA)is a C4-dicarboxylic acid transporter.Mol Microbiol.2013Feb；87(3):623-40.
专利文献3:Janausch IG.et al.,C4-dicarboxylate carriers and sensors inbacteria.Biochim Biophys Acta.2002Jan 17；1553(1-2):39-56.
专利文献4:Youn et al.,Characterization of the DicarboxylateTransporter DctA in谷氨酸棒杆菌.Journal Of Bacteriology.2009 Sept.5480-5488.
专利文献5:Nakamura et al.,Mutations of the Corynebacterium glutamicumNCgl1221Gene,Encoding a Mechanosensitive Channel Homolog,Induce l-GlutamicAcid Production.Applied And Environmental Microbiology.2007 July 4491-4498.
发明内容
本发明要实现的目的
本发明的目的是开发用于改善细菌的L-氨基酸生产能力的新技术，从而提供有效生产L-氨基酸的方法。
实现目的的手段
为了实现上述目的，本发明的发明人进行了各种研究。因此，他们发现了细菌的L-氨基酸产生能力可以通过修饰细菌而提高编码C4-二羧酸摄取载体的dctA基因、dcuA基因或dcuB基因的表达来改善，并且完成了本发明。
因此，例如可以如下体现本发明：
[1].一种用于生产L-氨基酸的方法，所述方法包括：
在培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的细菌以在所述培养基和/或所述细菌的细胞中积累L-氨基酸；并且
从所述培养基和/或所述细胞收集所述L-氨基酸，
其中所述细菌经修饰而与未修饰的菌株相比C4-二羧酸摄取载体的活性增加了，
其中所述C4-二羧酸摄取载体由一种或多种选自以下的蛋白质组成：由dctA基因、dcuA基因、和dcuB基因编码的蛋白质，并且
其中所述L-氨基酸是除L-天冬氨酸以外的L-氨基酸，
条件是当所述C4-二羧酸摄取载体是由dctA基因编码的蛋白质时，所述L-氨基酸是L-谷氨酸。
[2].上文提及的方法，其中所述dctA基因是编码下述(a)、(b)或(c)中限定的蛋白质的基因：
(a)包含SEQ ID NO:16或18的氨基酸序列的蛋白质；
(b)蛋白质，所述蛋白质包含SEQ ID NO:16或18的氨基酸序列，在该氨基酸序列中1至10个氨基酸残基的取代、缺失、***、和/或添加，并且所述蛋白质具有L-天冬氨酸-摄取活性；
(c)蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:16或18的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，并且具有天冬氨酸摄取活性。
[3].上文提及的方法，其中所述dcuA基因是编码下述(a)、(b)或(c)中限定的蛋白质的基因：
(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的蛋白质；
(b)蛋白质，所述蛋白质包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，在该氨基酸序列中1至10个氨基酸残基的取代、缺失、***、和/或添加，并且所述蛋白质具有天冬氨酸-摄取活性；
(c)蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，并且具有天冬氨酸-摄取活性。
[4].上文提及的方法，其中所述dcuB基因是编码下述(a)、(b)或(c)中限定的蛋白质的基因：
(a)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的蛋白质；
(b)蛋白质，所述蛋白质包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，在该氨基酸序列中1至10个氨基酸残基的取代、缺失、***、和/或添加，并且所述蛋白质具有天冬氨酸-摄取活性；
(c)蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，并且具有天冬氨酸-摄取活性。
[5].上文提及的方法，其中通过增加编码所述C4-二羧酸摄取载体的基因的表达来增加所述C4-二羧酸摄取载体的活性。
[6].上文提及的方法，其中通过增加所述基因的拷贝数和/或修饰所述基因的表达控制序列来增加所述基因的表达。
[7].上文提及的方法，其中所述细菌经进一步修饰而与未修饰的菌株相比磷酸酮醇酶的活性增加了。
[8].上文提及的方法，其中所述磷酸酮醇酶由D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶和/或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶组成。
[9].上文提及的方法，其中通过增加编码所述磷酸酮醇酶的基因的表达来增加所述磷酸酮醇酶的活性。
[10].上文提及的方法，其中所述细菌是棒状杆菌或者属于肠杆菌科的细菌。
[11].上文提及的方法，其中所述细菌是属于棒杆菌属的细菌。
[12].上文提及的方法，其中所述细菌是谷氨酸棒杆菌。
[13].上文提及的方法，其中所述细菌是属于泛菌属或埃希氏菌属的细菌。
[14].上文提及的方法，其中所述细菌是菠萝泛菌或大肠杆菌。
[15].上文提及的方法，其中所述L-氨基酸由谷氨酸家族的L-氨基酸和/或天冬氨酸家族的L-氨基酸组成。
[16].上文提及的方法，其中所述谷氨酸家族的L-氨基酸由选自L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、和L-鸟氨酸的一种或多种L-氨基酸组成。
[17].上文提及的方法，其中所述谷氨酸家族的L-氨基酸是L-谷氨酸。
[18].上文提及的方法，其中所述L-谷氨酸是L-谷氨酸单铵或L-谷氨酸单钠。
[19].上文提及的方法，其中所述天冬氨酸家族的L-氨基酸由选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、和L-甲硫氨酸的一种或多种L-氨基酸组成。
[20].上文提及的方法，
其中所述L-氨基酸是谷氨酸家族的L-氨基酸，并且
其中所述细菌经进一步修饰而与未修饰的菌株相比α-酮戊二酸脱氢酶和/或琥珀酸脱氢酶的活性降低了。
[21].上文提及的方法，
其中所述细菌是棒状杆菌，并且
其中所述细菌经进一步修饰而含有突变体yggB基因。
[22].上文提及的方法，其中所述突变体yggB基因是具有突变的yggB基因，所述突变改善所述棒状杆菌细菌的L-谷氨酸生产能力。
[23].上文提及的方法，其中所述突变体yggB基因是具有下述(1)、(2)、或(3)中限定的突变的yggB基因：
(1)编码野生型YggB蛋白的419至533位处的氨基酸残基的区域中的突变，
(2)编码野生型YggB蛋白的跨膜区的区域中的突变，和
(3)所述突变的组合。
[24].上文提及的方法，其中所述野生型YggB蛋白是下述(a)、(b)、或(c)中限定的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的蛋白质；
(b)蛋白质，所述蛋白质包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，在该氨基酸序列中1至10个氨基酸残基的取代、缺失、***和/或添加，并且所述蛋白质具有其在棒状杆菌中的表达增加而改善所述棒状杆菌的L-谷氨酸生产能力的特性；
(c)蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有90％以上的同一性的氨基酸序列，并且具有其在所述棒状杆菌细菌的表达增加而改善所述棒状杆菌的L-谷氨酸生产能力的特性。
根据本发明，可以改善细菌的L-氨基酸生产能力，并且可以有效生产L-氨基酸。
附图说明
[图1]图显示了使用具有增强的C4-二羧酸摄取载体基因(Cg-dctA、Ec-dctA、Ec-dcuA或Ec-dcuB)表达的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)菌株的谷氨酸生产培养结果。(A)谷氨酸(Glu)的积累量，(B)天冬氨酸(Asp)的积累量。
具体实施方式
下文中，详细解释了本发明。
本发明的方法是生产L-氨基酸的方法，其包括在培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的细菌以在培养基和/或细菌细胞中积累L-氨基酸，并从培养基和/或细菌细胞中收集L-氨基酸，其中细菌经修饰而增加了C4-二羧酸摄取载体的活性。用于该方法的细菌也称为“本发明的细菌”。
<1>本发明的细菌
本发明的细菌是具有L-氨基酸生产能力的细菌，其经修饰而增加了C4-二羧酸摄取载体的活性。
<1-1>具有L-氨基酸生产能力的细菌
在本发明中，术语“具有L-氨基酸生产能力的细菌”是指具有在培养基和/或细胞的细胞中以下述的程度产生并累积目的L-氨基酸的能力，使得当细菌在培养基中培养时可以收集L-氨基酸的细菌。具有L-氨基酸生产能力的细菌可以是能够以比非修饰菌株可获得的量更大的量在培养基和/或细菌的细菌的细胞中积累目的L-氨基酸的细菌。术语“非修饰菌株”是指未被修饰以使得C4-二羧酸摄取载体的活性增加了的对照菌株。也就是说，未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。具有L-氨基酸生产能力的细菌可以是能够在培养基中以优选0.5g/L以上，更优选1.0g/L以上的量积累目标L-氨基酸的细菌。
本发明中生产的L-氨基酸是L-天冬氨酸以外的L-氨基酸。L-天冬氨酸以外的L-氨基酸的实例包括碱性氨基酸，如L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-瓜氨酸；脂肪族氨基酸，如L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和甘氨酸；作为羟基-单氨基羧酸的氨基酸，如L-苏氨酸和L-丝氨酸；环状氨基酸，如L-脯氨酸；芳香族氨基酸，如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸；含硫氨基酸，如L-半胱氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸；酸性氨基酸，如L-谷氨酸；和侧链具有酰胺基的氨基酸，如L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺。除L-天冬氨酸之外的L-氨基酸的具体实例包括谷氨酸家族的L-氨基酸和天冬氨酸家族的L-氨基酸。术语“谷氨酸家族的L-氨基酸”共同指通过L-谷氨酸作为中间体生物合成的L-谷氨酸和L-氨基酸。通过L-谷氨酸作为中间体生物合成的L-氨基酸的实例包括L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-鸟氨酸。术语“天冬氨酸家族的L-氨基酸”共同指通过L-天冬氨酸作为中间体生物合成的L-氨基酸，并且不包括L-天冬氨酸本身。通过L-天冬氨酸作为中间体生物合成的L-氨基酸的实例包括L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸。L-天冬氨酸以外的L-氨基酸的更具体的实例包括L-谷氨酸。例如，至少当C4-二羧酸摄取载体是由dctA基因编码的蛋白质时，L-氨基酸可以是L-谷氨酸。本发明的细菌可以具有产生一种L-氨基酸或两种或更多种L-氨基酸的能力。
在本发明中，除非另有说明，术语“氨基酸”是指L-氨基酸。在本发明中，除非另有说明，术语“L-氨基酸”是指游离形式的L-氨基酸、其盐或其混合物。稍后将描述盐的实例。
细菌的实例包括属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和棒状杆菌细菌(coryneform bacteria)的细菌。
属于肠杆菌科的细菌的实例包括属于埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、发光杆菌(Photorhabdus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、摩根菌属(Morganella)等的细菌。具体来说，可以使用根据NCBI(国家生物技术信息中心)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)中使用的分类法分类为肠杆菌科的细菌。
埃希氏菌属细菌没有特别限制，并且其实例包括根据微生物领域技术人员已知的分类法分类为埃希氏菌属的那些。埃希氏菌属细菌的实例包括例如Neidhardt et al.(Backmann B.J.,1996,Derivations and Genotypes of some mutant derivatives ofEscherichia coli K-12,第2460-2488页，表1，于F.D.Neidhardt(编),Escherichia coliand Salmonella Cellular and Molecular Biology/第二版,American Society forMicrobiology Press,Washington,D.C.)的工作中描述的那些。埃希氏菌属细菌的实例包括例如大肠杆菌。大肠杆菌的具体实例包括例如大肠杆菌K-12菌株如W3110菌株(ATCC27325)和MG1655菌株(ATCC 47076)；大肠杆菌K5菌株(ATCC 23506)；大肠杆菌B菌株如BL21(DE3)菌株；及其衍生菌株。
肠杆菌属细菌没有特别限制，并且实例包括根据微生物领域技术人员已知的分类法分类为肠杆菌属的那些。肠杆菌属细菌的实例包括例如成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。成团肠杆菌的具体实例包括例如成团肠杆菌ATCC 12287菌株。产气肠杆菌的具体实例包括例如产气肠杆菌ATCC 13048菌株、NBRC 12010菌株(Biotechnol.Bioeng.,2007,Mar.27；98(2):340-348)和AJ110637菌株(FERM BP-10955)。肠杆菌属细菌的实例还包括例如欧洲专利申请公开(EP-A)No.0952221中描述的菌株。此外，成团肠杆菌还包括分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)的一些菌株。
泛菌细菌没有特别限制，并且实例包括根据微生物领域的技术人员已知的分类法分类为泛菌属的那些。泛菌属细菌的实例包括例如菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)、成团泛菌和柠檬泛菌(Pantoea citrea)。菠萝泛菌的具体实例包括例如菠萝泛菌LMG20103菌株、AJ13355菌株(FERM BP-6614)、AJ13356菌株(FERM BP-6615)、AJ13601菌株(FERM BP-7207)、SC17菌株(FERM BP-11091)、SC17(0)菌株(VKPM B-9246)和SC17sucA菌株(FERM BP-8646)。一些肠杆菌属细菌和欧文氏菌属细菌被重新分类为泛菌属(Int.J.Syst.Bacteriol.,39,337-345(1989)；Int.J.Syst.Bacteriol.,43,162-173(1993))。例如，根据16S rRNA等的核苷酸序列分析，最近将一些成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)菌株重新分类成成团泛菌、菠萝泛菌、斯氏泛菌，等等(Int.J.Syst.Bacteriol.,39,337-345(1989))。在本发明中，泛菌属细菌包括如上所述重新分类为泛菌属的那些。
欧文氏菌属细菌的实例包括解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)和胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)。克雷伯氏菌属细菌的实例包括植物克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。
棒状杆菌细菌的实例包括属于棒状杆菌属、短杆菌属(Brevibacterium)、微杆菌属(Microbacterium)等的细菌。
棒状杆菌细菌的具体实例包括以下物种。
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
解烷棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)
美棒杆菌(Corynebacterium callunae)
钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)
栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)
嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(Corynebacteriumeficiens)
力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)
散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)(谷氨酸棒杆菌)
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)(谷氨酸棒杆菌)
Brevibacterium immariophilum
乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒杆菌)
玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)
解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)
硫殖短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)
产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)(停滞棒杆菌(Corynebacteriumstationis))
白色短杆菌(Brevibacterium album)
赌状短杆菌(Brevibacterium cerinum)
嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)
棒状杆菌细菌的具体实例包括以下菌株。
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870
醋谷棒杆菌ATCC 15806
解烷棒杆菌ATCC 21511
美棒杆菌ATCC 15991
钝齿棒杆菌AS1.542
谷氨酸棒杆菌ATCC 13020、ATCC 13032、ATCC 13060、ATCC 13869、FERM BP-734
百合棒杆菌ATCC 15990
栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965
Corynebacterium eficiens(嗜热产氨棒杆菌)AJ12340(FERM BP-1539)
力士棒杆菌ATCC 13868
散枝短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC 14020
黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC 13826、ATCC 14067、AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC 13869
玫瑰色短杆菌ATCC 13825
解糖短杆菌ATCC 14066
硫殖短杆菌ATCC 19240
产氨棒杆菌(停滞棒杆菌)ATCC 6871、ATCC 6872
白色短杆菌ATCC 15111
赌状短杆菌ATCC 15112
嗜氨微杆菌ATCC 15354
棒状杆菌属细菌包括以前分类为短杆菌属(Brevibacterium)，但目前已被结合到棒状杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991))。此外，停滞棒杆菌包括以前分类为产氨棒杆菌的细菌，但是目前根据16S rRNA等的核苷酸序列分析将其重新分类为停滞棒杆菌的细菌(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,60,874-879(2010))。
这些菌株可从例如美国典型培养物保藏中心(地址：12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States ofAmerica)获得。也就是说，对各菌株给予登录号，并且可以通过使用这些登录号订购菌株(参见http://www.atcc.org/)。菌株的登录号列在美国典型培养物保藏中心的目录中。这些菌株也可以从例如保藏菌株的保藏库获得。
本发明的细菌可以是内在具有L-氨基酸生产能力的细菌，并且可以是修饰成使得它具有L-氨基酸生产能力的细菌。具有L-氨基酸生产能力的细菌可以通过向如上文提及的此类细菌赋予L-氨基酸生产能力，或通过增强如上文提及的此类细菌的L-氨基酸生产能力来获得。
为了赋予或增强L-氨基酸生产能力，可以使用通常用于育种棒状杆菌细菌、埃希氏菌属细菌等的氨基酸生产菌株的方法(参见"Amino Acid Fermentation",GakkaiShuppan Center(Ltd.),第1版,1986年5月30日出版,第77-100页)。此类方法的实例包括例如获得营养缺陷型突变菌株、获得L-氨基酸类似物抗性菌株、获得代谢调节突变菌株、以及构建其中L-氨基酸生物合成酶的活性增强了的重组菌株。在L-氨基酸生产细菌的育种中，可以单独赋予上述性质如营养缺陷型、类似物抗性和代谢调节突变之一，或者可以组合赋予两种或三种以上的此类性质。此外，在L-氨基酸生产细菌的育种中，可以单独增强L-氨基酸生物合成酶之一的活性，或者可以组合增强此类酶中的两种或三种以上的活性。此外，赋予诸如营养缺陷型、类似物抗性和代谢调节突变等特性可以与增强生物合成酶的活性组合。
具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷突变菌株、类似物抗性菌株或代谢调节突变菌株可以通过对亲本菌株或野生型菌株进行通常的诱变处理，然后选择表现出自养、类似物抗性或代谢调节突变，并且具有来自获得的突变菌株的L-氨基酸产生能力的菌株来获得。通常的诱变处理的实例包括X射线或紫外线的照射和用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)处理。
也可以通过增强参与目标L-氨基酸的生物合成的酶的活性来赋予或增强L-氨基酸生产能力。可以通过例如修饰细菌而增强编码该酶的基因的表达来提高酶活性。增强基因表达的方法描述于WO00/18935、EP1010755A等中。稍后将描述增强酶活性的详细步骤。
此外，还可以通过降低酶的活性来赋予或增强L-氨基酸生产能力，所述酶催化从目标L-氨基酸的生物合成途径分支以产生除目标L-氨基酸之外的化合物的反应。本文中提及的“催化从目标L-氨基酸的生物合成途径分支以产生除目标L-氨基酸之外的化合物的反应的酶”包括参与目的氨基酸分解的酶。稍后将描述用于降低酶活性的方法。
以下，具体举出L-氨基酸生产细菌及用于赋予或增强L-氨基酸生产能力的方法。L-氨基酸生产细菌的所有性质以及用于赋予或增强L-氨基酸生产能力的修饰可以独立地或以任何适当的组合使用。
<L-谷氨酸生产细菌>
用于赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法的实例包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有一种或多种选自L-谷氨酸生物合成酶的酶的增加的一种或多种活性。此类酶的实例包括但不特别限于谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合酶(gltBD)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、乌头酸水合酶(acnA，acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、柠檬酸甲酯合酶(prpC)、丙酮酸羧化酶(pyc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF，lpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA,pgmI)、磷酸甘油酸酯激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、磷酸丙糖异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、葡萄糖磷酸异构酶(pgi)、6-磷酸葡萄糖酸脱水酶(edd)、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶(eda)和转氢酶。在酶的名称之后，括号中显示编码酶的基因的实例(其在下文中应当适用于相同的情形)。优选增强选自下组的一种或多种酶的一种或多种活性：例如谷氨酸脱氢酶，柠檬酸合酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和柠檬酸甲酯合酶等等。
属于肠杆菌科的菌株经修饰而增加柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达的实例包括EP1078989A、EP955368A和EP952221A中公开的那些。此外，属于肠杆菌科的菌株经修饰而增加Entner-Doudoroff途径的基因(edd，eda)的表达的实例包括EP1352966B中公开的那些。经修饰而增加谷氨酸合成酶基因(gltBD)的表达的棒状杆菌细菌的实例包括WO99/07853中公开的那些。
用于赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法的实例还包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有选自下述酶的一种或多种酶的降低的一种或多种活性，所述酶催化从L-谷氨酸的生物合成途径分支以产生除L-谷氨酸以外的化合物的反应。此类酶的实例包括但不特别限于异柠檬酸裂合酶(aceA)、α-酮戊二酸脱氢酶(sucA，odhA)、乙酰乳酸合酶(ilvI)、甲酸乙酰转移酶(pfl)、乳酸脱氢酶(ldh)、醇脱氢酶(adh)、谷氨酸脱羧酶(gadAB)和琥珀酸脱氢酶(sdhABCD)。在这些酶中，优选减少或缺失例如α-酮戊二酸脱氢酶活性。
具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性或α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的埃希氏菌属细菌及其获得方法描述于美国专利号5,378,616和5,573,945中。此外，美国专利号6,197,559、6,682,912、6,331,419和8,129,151以及WO2008/075483中公开了减少或缺失肠杆菌科细菌如泛菌属细菌、肠杆菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌和欧文氏菌属细菌的α-酮戊二酸脱氢酶活性的方法。具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性或α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的埃希氏菌属细菌的具体实例包括以下菌株。
大肠杆菌W3110sucA::Kmr
大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)
大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)
大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)
大肠杆菌W3110sucA::Kmr是通过破坏编码大肠杆菌W3110的α-酮戊二酸脱氢酶的sucA基因获得的菌株。此菌株是α-酮戊二酸脱氢酶活性完全缺陷的。
WO2008/075483中公开了降低或消除了α-酮戊二酸脱氢酶活性的棒状杆菌细菌及那些的获得方法。降低或消除了α-酮戊二酸脱氢酶活性的棒状杆菌细菌的具体实例包括例如以下菌株。
谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)L30-2菌株(日本专利公开(Kokai)号2006-340603)
谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)ΔS菌株(WO95/34672)
谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)AJ12821(FERM BP-4172,French Patent号9401748)
谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ12822(FERM BP-4173，法国专利号9401748)
谷氨酸棒杆菌AJ12823(FERM BP-4174，法国专利号9401748)
L-谷氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括泛菌细菌，例如菠萝泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)、菠萝泛菌SC17菌株(FERM BP-11091)和菠萝泛菌SC17(0)菌株(VKPM B-9246)。AJ13355菌株是以下述菌株从日本静冈县岩田市的土壤中分离的菌株，所述菌株可以在含有L-谷氨酸和碳源的低pH培养基中增殖。SC17菌株是作为来自AJ13355菌株(美国专利号6,596,517)的低粘液产生突变菌株选择的菌株。SC17菌株于2009年2月4日保藏在国立先进工业科技研究院国际专利生物体保藏中心(National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology,International Patent OrganismDepository)独立行政机构(现为独立行政机关，国家技术与评价研究所，国际专利生物体保藏中心(National Institute of Technology and Evaluation,International PatentOrganism Depositary)，#120,2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba-ken，292-0818，Japan)，并分配了FERM BP-11091的登录号。AJ13355菌株于于1998年2月19日保藏在工业科学和技术局国立生物科学与人类技术研究所(National Institute of Bioscienceand Human Technology,Agency of Industrial Science and Technology)(目前为独立行政机构，国家技术与评估研究所，国际专利生物体保藏中心，#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)，并且分配FERM P-16644的登录号。然后，1999年1月11日，根据布达佩斯条约的规定，保藏物已转为国际保藏物，并分配了FERM BP-6614的登录号。
此外，L-谷氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性或α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的泛菌属细菌。此类菌株的实例包括作为AJ13355菌株的α-酮戊二酸脱氢酶E1亚基(sucA)基因缺陷菌株的AJ13356菌株(美国专利号6,331,419)和SC17sucA菌株(美国专利号6,596,517)，其是SC17菌株的sucA基因缺陷型菌株。AJ13356菌株于1998年2月19日保藏在工业科学和技术局国立生物科学与人类技术研究所(目前，独立行政机构，国家技术与评估研究所，国际专利生物体保藏中心，#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)，并且分配FERM P-16645的登录号。然后，1999年1月11日，根据布达佩斯条约的规定，保藏物已转为国际保藏物，并分配了FERM BP-6616的登录号。对SC17sucA菌株分配了私有号AJ417，并于2004年2月26日在登录号FERM BP-8646下保藏在独立行政机构，国立先进工业科学技术研究所，国际专利生物体保藏中心(International Patent Organism Depositary)(现为独立行政机构，国家技术与评估研究所，国际专利生物体保藏中心，#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)。
AJ13355菌株在其分离时鉴定为成团肠杆菌，但是最近根据16S rRNA的核苷酸测序等将其重新分类为菠萝泛菌。因此，尽管AJ13355和AJ13356菌株作为成团肠杆菌保藏在上述保藏中心，但在本说明书中它们称为菠萝泛菌。
此外，L-谷氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括泛菌属细菌，如菠萝泛菌SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株、菠萝泛菌AJ13601菌株、菠萝泛菌NP106菌株和菠萝泛菌NA1菌株。通过将含有柠檬酸合酶基因(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)和源自大肠杆菌的谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)的质粒RSFCPG，和含有源自乳发酵短杆菌的柠檬酸合酶基因(gltA)的质粒pSTVCB导入SC17sucA菌株中获得SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株。AJ13601菌株是作为下述菌株自SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株选择的菌株，所述菌株在低pH下对高浓度的L-谷氨酸具有抗性。通过消除RSFCPG和pSTVCB质粒从AJ13601菌株获得NP106菌株。从NP106菌株通过将质粒RSFPPG导入其中获得NA1菌株(WO2010/027045)。质粒RSFPPG具有对应于质粒RSFCPG的结构，除了其gltA基因已被柠檬酸甲酯合酶基因(prpC)替代，因此含有prpC基因、ppc基因和gdhA基因(WO2008/020654)。AJ13601菌株于1999年8月18日保藏在工业科学和技术局国立生物科学与人类技术研究所(现为独立行政机构，国家技术与评估研究所，国际专利生物体保藏中心，#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)，并且分配登录号FERM P-17516。然后，2000年7月6日，按照布达佩斯条约的规定，保藏物转为国际保藏物，并分配了登录号FERM BP-7207。
L-谷氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括降低或缺失了α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)活性和琥珀酸脱氢酶(sdh)活性二者的菌株(日本专利公开(Kokai)号2010-041920)。此类菌株的具体实例包括例如菠萝泛菌NA1菌株的sucAsdhA双重缺陷菌株和谷氨酸棒杆菌ATCC 14067菌株的odhAsdhA双重缺陷菌株，即谷氨酸棒杆菌8L3GΔSDH菌株(日本专利公开(Kokai)号2010-041920)。
L-谷氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例也包括营养缺陷型突变菌株。营养缺陷突变菌株的具体实例包括例如大肠杆菌VL334thrC+(VKPM B-8961，EP1172433)。大肠杆菌VL334(VKPM B-1641)是在thrC和ilvA基因中具有突变的L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株(美国专利号4,278,765)。大肠杆菌VL334thrC+是通过将thrC基因的野生型等位基因导入VL334菌株而获得的L-异亮氨酸-营养缺陷型L-谷氨酸生产细菌。使用在野生型大肠杆菌K-12株(VKPM B-7)细胞上培养的噬菌体P1，通过一般转导方法引入thrC基因的野生型等位基因。
L-谷氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例也包括对天冬氨酸类似物具有抗性的菌株。此类菌株也可能缺乏α-酮戊二酸脱氢酶活性。具有对天冬氨酸类似物的抗性并且缺乏α-酮戊二酸脱氢酶活性的菌株的具体实例包括例如大肠杆菌AJ13199(FERMBP-5807，美国专利号5,908,768)、大肠杆菌FFRM P-12379(其另外具有降低的L-谷氨酸分解能力)(美国专利号5,393,671)和大肠杆菌AJ13138(FERM BP-5565，美国专利号6,110,714)。
用于赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法的实例还包括例如增强诸如yhfK基因(WO2005/085419)或ybjL基因(WO2008/133161)的L-谷氨酸分泌基因表达的方法。
此外，用于对棒状杆菌细菌或在棒状杆菌细菌中赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法的实例还包括赋予对有机酸类似物、呼吸抑制剂等的抗性的方法，以及赋予对细胞壁合成抑制剂的敏感性的方法。这些方法的具体实例包括例如赋予单氟乙酸抗性的方法(日本专利公开(Kokai)号50-113209)、赋予腺嘌呤抗性或胸腺嘧啶抗性的方法(日本专利公开(Kokai)号57-065198)、减弱脲酶的方法(日本专利公开(Kokai)号52-038088)、赋予丙二酸抗性的方法(日本专利公开(Kokai)号52-038088)、赋予对苯并吡喃酮或萘醌的抗性的方法(日本专利公开(Kokai)号56-1889)、赋予HOQNO抗性的方法(日本专利公开(Kokai)号56-140895)、赋予α-酮丙二酸抗性的方法(日本专利公开(Kokai)号57-2689)、赋予胍抗性的方法(日本专利公开(Kokai)号56-35981)、赋予对青霉素的敏感性的方法(日本专利公开(Kokai)号4-88994)等。
此类抗性或敏感性细菌的具体实例包括以下菌株。
谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ3949(FERM BP-2632,日本专利公开(Kokai)号50-113209)
谷氨酸棒杆菌AJ11628(FERM P-5736,日本专利公开(Kokai)号57-065198)
谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11355(FERM P-5007,日本专利公开(Kokai)号56-1889)
谷氨酸棒杆菌AJ11368(FERM P-5020,日本专利公开(Kokai)号56-1889)
谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11217(FERM P-4318,日本专利公开(Kokai)号57-2869)
谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERM P-4319,日本专利公开(Kokai)号57-2869)
谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11564(FERM BP-5472,日本专利公开(Kokai)号56-140895)
谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11439(FERM BP-5136,日本专利公开(Kokai)号56-35981)
谷氨酸棒杆菌H7684(FERM BP-3004,日本专利公开(Kokai)号04-88994)
谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)AJ11426(FERM P-5123,日本专利公开(Kokai)号56-048890)
谷氨酸棒杆菌AJ11440(FERM P-5137,日本专利公开(Kokai)号56-048890)
谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)AJ11796(FERM P-6402,日本专利公开(Kokai)号58-158192)
此外，用于对棒状杆菌细菌或在棒状杆菌细菌中赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法的实例还包括增强yggB基因表达的方法和引入在编码区具有突变的突变体yggB基因的方法(WO2006/070944)。也就是说，本发明的细菌可以经修饰而增加了yggB基因的表达，或者可以经修饰而包含(具有)突变体yggB基因。
yggB基因是编码机械敏感通道的基因。yggB基因的实例包括棒状杆菌细菌的yggB基因。棒状杆菌细菌的yggB基因的具体实例包括例如谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14967和栖糖蜜棒杆菌ATCC17965(WO2006/070944)的yggB基因。谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的yggB基因对应于在NCBI数据库中作为Genbank登录号NC_003450登记的基因组序列中的核苷酸号1,336,091至1,337,692的序列互补的序列，并且也称为NCgl1221。由谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的yggB基因编码的YggB蛋白登记为GenBank登录号NP_600492。此外，谷氨酸棒杆菌2256(ATCC 13869)的yggB基因的核苷酸序列和由该基因编码的YggB蛋白的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:9和10中。
在本发明中，具有后述“特定突变”的yggB基因也称为“突变体yggB基因”，并且由此编码的蛋白质也称为“突变体YggB蛋白”。此外，在本发明中，将没有后述“特定突变”的yggB基因也称为“野生型yggB基因”，并且由此编码的蛋白质也称为“野生型YggB蛋白”。顺便提及，对于YggB蛋白质，由yggB基因中的“特定突变”引起的氨基酸序列的变化也称为“特定突变”。本文提及的术语“野生型”用于方便区分“野生型”yggB基因或YggB蛋白与“突变体”yggB基因或YggB蛋白，并且“野生型”yggB基因或YggB蛋白不限于作为天然物质获得的，只要它没有“特定突变”即可。野生型YggB蛋白的实例包括上文例举的YggB蛋白，如具有SEQID NO:10的氨基酸序列的YggB蛋白。野生型YggB蛋白的实例还包括上文例举的YggB蛋白的保守变体(其初始功能得到保持的变体)，条件是保守变体没有“特定突变”。关于YggB蛋白质的“初始功能”可以是例如作为机械敏感性通道的功能或其在棒状杆菌细菌中的增加的表达提供棒状杆菌细菌的L-谷氨酸生产能力改善的性质。
“特定突变”没有特别限制，只要它改变YggB蛋白质的氨基酸序列，如上文描述的YggB蛋白质，从而改善棒状杆菌细菌的L-谷氨酸生产能力。“特定突变”的实例包括C端侧的突变和跨膜区中的突变。“特定突变”也可以是这些的组合。
(1)C端侧的突变
在C端侧的突变是引入编码野生型YggB蛋白质的位置419-533的氨基酸残基的野生型yggB基因区域中的突变。C端侧的突变可以在该区域的一个或多个位点引入。由C端侧的突变诱导的氨基酸序列的变化的类型没有特别限定。C端侧的突变可以是引起氨基酸取代(错义突变)、***氨基酸残基、缺失氨基酸残基、引入终止密码子(无义突变)、移码突变或这些的组合的突变。C端侧的突变优选为例如***核苷酸序列，如***序列(因此也称为“IS”)或转座子的突变。
(1-1)***核苷酸序列
C端侧突变的实例包括例如编码野生型YggB蛋白的位置419处缬氨酸残基的位点处***核苷酸序列的突变(2A-1型突变)。2A-1型突变可以是例如引起野生型YggB蛋白的位置419至533的部分或全部氨基酸残基的缺失或取代的突变。具有2A-1型突变的突变体yggB基因的具体实例包括例如下述yggB基因，其包含***SEQ ID NO:9中第1255位处“G”的下一处的IS，从而编码具有423个氨基酸残基的全长的突变体YggB蛋白质，其比初始野生型YggB蛋白(SEQ ID NO:10)短。此突变体yggB基因(V419::IS)的核苷酸序列和由该基因编码的突变体YggB蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:11和12。在SEQ ID NO:11中，位置1至1269对应于该突变体YggB蛋白(V419::IS)的CDS。具有突变体yggB基因(V419::IS)的L-谷氨酸生产细菌的具体实例包括例如谷氨酸棒杆菌2256ΔsucAΔldhAyggB*菌株(WO2014/185430)。
(1-2)取代脯氨酸残基
C端侧的突变的实例还包括例如将存在于野生型YggB蛋白质的位置419至533处的脯氨酸残基替换为另一种氨基酸残基的突变。此类脯氨酸残基的实例包括野生型YggB蛋白的位置424、437、453、457、462、469、484、489、497、515、529、和533处的脯氨酸残基。特别优选的是将位置424和/或437的脯氨酸残基替换为其它氨基酸残基。“其它氨基酸”只要是脯氨酸以外的天然氨基酸即可，没有特别限定。“其它氨基酸”的实例包括Lys、Glu、Thr、Val、Leu、Ile、Ser、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、Met、Phe、Trp、Tyr、Gly、Ala、和His。例如，位置424处的脯氨酸残基可以优选被疏水性氨基酸(Ala、Gly、Val、Leu、或Ile)的残基，更优选地支链氨基酸(Leu、Val或Ile)的残基替换。此外，例如，位置437处的脯氨酸残基可以优选用侧链中具有羟基的氨基酸(Thr，Ser或Tyr)的残基，更优选用Ser残基替换。
(2)跨膜区中的突变
YggB蛋白估计有五个跨膜区。跨膜区对应于野生型YggB蛋白的位置1至23(第一跨膜区)、位置25至47(第二跨膜区)、位置62至84(第三跨膜区)、位置86至108(第四跨膜区)和位置110至132(第五跨膜区)的氨基酸残基。跨膜区中的突变是编码野生型yggB基因的这些跨膜区的区域中的突变。可以将跨膜区中的突变引入到该区域中的一个或多个位点中。跨膜区中的突变优选是诱导一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、添加、***或倒位，但不包括任何移码突变或无义突变的突变。术语“一个或几个”表示的数字优选为1-20，更优选为1-10，进一步优选为1-5，特别优选为1-3。跨膜区中的突变的实例包括在野生型YggB蛋白中，在位置14处的亮氨酸残基与位置15处的色氨酸残基之间***一个或几个氨基酸残基，如Cys-Ser-Leu；将位置100处的丙氨酸残基替换为另一种氨基酸残基，如侧链中具有羟基的氨基酸(即Thr、Ser或Tyr)的残基，优选Thr残基的突变；将位置111处的丙氨酸残基替换为另一种氨基酸残基，如侧链中具有羟基的氨基酸残基(即Thr、Ser或Tyr)，优选Thr残基的突变。
在本发明中，除非另有说明，“野生型YggB蛋白的位置X处的氨基酸残基”是指与SEQ ID NO:10中的位置X的氨基酸残基相对应的氨基酸残基。氨基酸序列中的“位置X”是从氨基酸序列的N末端计数的第X位，并且N末端的氨基酸残基为位置1的氨基酸残基。也就是说，氨基酸残基的前述位置表示相对位置，并且其绝对位置可以由于一个或多个氨基酸残基的缺失、***、添加等而移动。例如，“野生型YggB蛋白质的位置419处的氨基酸残基”是指与SEQ ID NO:10中的位置419的氨基酸残基相对应的氨基酸残基，并且当一个氨基酸残基在位置419的N端侧的位置处缺失时，从N末端起的第418个氨基酸残基是“野生型YggB蛋白质位置419处的氨基酸残基”。此外，当在位置419的N端侧的位置***一个氨基酸残基时，从N末端起的第420个氨基酸残基是“野生型YggB蛋白质的位置419处的氨基酸残基”。具体地，例如，谷氨酸棒杆菌ATCC14967的YggB蛋白的位置419至529的氨基酸残基对应于野生型YggB蛋白的位置419至533的氨基酸残基。
任意YggB蛋白的氨基酸序列中哪个氨基酸残基是“与SEQ ID NO:10中的位置X的氨基酸残基对应的氨基酸残基”可以通过任意YggB蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:10的氨基酸序列之间的比对确定。比对可以通过例如使用已知的基因分析软件进行。此类软件的具体实例包括Hitachi Solutions生产的DNASIS、Genetyx生产的GENETYX等(ElizabethC.Tyler et al.,Computers and Biomedical Research,24(1)72-96,1991；Barton GJ etal.,Journal of Molecular Biology,198(2),327-37,1987)。
可以通过修饰野生型yggB基因以具有上述“特定突变”来获得突变体yggB基因。DNA的修饰可以通过已知的方法进行。例如，可以通过位点特定突变方法将目标突变引入DNA的目标位点。位点特异性突变方法的具体实例包括例如使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,于PCR Technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton Press,1989；Carter P.,Meth.InEnzymol.,154,382,1987)和使用噬菌体的方法(Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.inEnzymol.,154,350,1987；Kunkel,T.A.et al.,Meth.in Enzymol.,154,367,1987)。此外，也可以通过化学合成获得突变体yggB基因。
使得细菌具有突变体yggB基因的对细菌的修饰可以通过将突变体yggB基因导入细菌来获得。使得细菌具有突变体yggB基因的对细菌的修饰也可以通过天然突变或用诱变剂处理将突变引入细菌的yggB基因中来获得。
赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法对于赋予或增强生产通过L-谷氨酸作为中间体生物合成的L-氨基酸，如L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的能力也是有效的。因此，具有生产通过L-谷氨酸生物合成的任何这些L-氨基酸的能力的细菌可以根据需要具有由如上提及的L-谷氨酸生产细菌所拥有的此类性质。例如，可以修饰具有通过L-谷氨酸生物合成的任何这些L-氨基酸的能力的细菌，使得α-酮戊二酸脱氢酶和/或琥珀酸脱氢酶的活性降低。
<L-谷氨酰胺生产菌>
用于赋予或增强L-谷氨酰胺生产能力的方法的实例包括例如修饰细菌的方法，使得从L-谷氨酰胺生物合成酶中选择的一种或多种酶的一种或多种活性增强。此类酶的实例包括但不限于谷氨酸脱氢酶(gdhA)和谷氨酰胺合成酶(glnA)。谷氨酰胺合成酶活性也可以通过破坏谷氨酰胺腺苷酰基转移酶基因(glnE)或破坏PII对照蛋白基因(glnB)而增强(EP1229121)。
用于赋予或增强L-谷氨酰胺生产能力的方法的实例还包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得降低一种或多种酶的一种或多种活性，所述酶催化从L-谷氨酰胺的生物合成途径分支的反应以产生除L-谷氨酰胺以外的化合物。此类酶的实例包括但不特别限于谷氨酰胺酶。
L-谷氨酰胺生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括例如谷氨酸脱氢酶(gdhA)和/或谷氨酰胺合成酶(glnA)(EP1229121，EP1424398)的一种或多种活性增强了的棒状杆菌细菌，和谷氨酰胺酶活性(日本专利公开(Kokai)号2004-187684))降低了的棒状杆菌细菌。L-谷氨酰胺生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例包括下述菌株，其属于埃希氏菌属，并且具有突变体谷氨酰胺合成酶，其中谷氨酰胺合成酶的位置397的酪氨酸残基已经用另一种氨基酸残基替换(US2003/0148474A)。
用于对棒状杆菌细菌或在棒状杆菌细菌中赋予或增强L-谷氨酰胺生产能力的方法的实例还包括赋予6-重氮-5-氧代-正亮氨酸抗性的方法(日本专利公开(Kokai)号3-232497)、赋予嘌呤类似物抗性和甲硫氨酸亚砜抗性的方法(日本专利公开(Kokai)号61-202694)和赋予α-酮丙二酸抗性的方法(日本专利公开(Kokai)号56-151495)。具有L-谷氨酰胺生产能力的棒状杆菌细菌的具体实例包括例如以下菌株。
谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11573(FERM P-5492,日本专利公开(Kokai)号56-151495)
谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11576(FERM BP-10381,日本专利公开(Kokai)号56-151495)
谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ12212(FERM P-8123,日本专利公开(Kokai)号61-202694)
<L-脯氨酸生产细菌>
用于赋予或增强L-脯氨酸生产能力的方法的实例包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有增加的选自L-脯氨酸生物合成酶的一种或多种酶的一种或多种活性。此类酶的实例包括谷氨酸-5-激酶(proB)、γ-谷氨酰磷酸还原酶和脯氨酸-5-羧酸还原酶(putA)。为了增强此类酶的活性，例如，可以优选使用编码针对L-脯氨酸的反馈抑制脱敏的谷氨酸激酶的proB基因(德国专利号3127361)。
用于赋予或增强L-脯氨酸生产能力的方法的实例还包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有降低的参与L-脯氨酸分解的酶的活性。此类酶的实例包括脯氨酸脱氢酶和鸟氨酸氨基转移酶。
L-脯氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括例如大肠杆菌NRRL B-12403和NRRL B-12404(英国专利号2075056)、大肠杆菌VKPM B-8012(俄罗斯专利申请号2000124295)、德国专利3127361中所述的大肠杆菌质粒突变体菌株、由BloomF.R.et al.(The 15th Miami winter symposium,1983,p.34)所述的大肠杆菌质粒突变体菌株、作为3,4-脱羟脯氨酸和氮杂环丁烷-2-羧酸酯(azetidine-2-carboxylate)抗性菌株的大肠杆菌702菌株(VKPM B-8011)和大肠杆菌702ilvA菌株(VKPM B-8012)，其是702菌株的ilvA基因缺陷菌株(EP1172433)。
<L-苏氨酸生产细菌>
用于赋予或增强L-苏氨酸生产能力的方法的实例包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有增加的选自L-苏氨酸生物合成酶的一种或多种酶的一种或多种活性。此类酶的实例包括但不特别限于天冬氨酸激酶III(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、天冬氨酸激酶I(thrA)、高丝氨酸激酶(thrB)、苏氨酸合成酶(thrC)和天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)(aspC)。在这些酶中，优选增强选自天冬氨酸激酶III、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸激酶I、高丝氨酸激酶、天冬氨酸氨基转移酶和苏氨酸合酶的一种或多种酶的一种或多种活性。可以将编码L-苏氨酸生物合成酶的任何基因导入具有降低的苏氨酸分解能力的细菌。抑制了苏氨酸分解的此类菌株的实例包括例如缺乏苏氨酸脱氢酶活性的大肠杆菌TDH6株(日本专利公开(Kokai)号2001-346578)。
L-苏氨酸生物合成酶的活性受到终产物L-苏氨酸的抑制。因此，为了构建L-苏氨酸生产菌株，优选修饰L-苏氨酸生物合成酶的基因，使酶对L-苏氨酸的反馈抑制脱敏。上述thrA、thrB和thrC基因构成了形成衰减子结构的苏氨酸操纵子。苏氨酸操纵子的表达在培养肉汤中被异亮氨酸和苏氨酸抑制，并且也通过减弱阻抑。因此，通过除去衰减区域中的前导序列或衰减子增强苏氨酸操纵子的表达(Lynn,S.P.,Burton,W.S.,Donohue,T.J.,Gould,R.M.,Gumport,R.L,and Gardner,J.F.,J.Mol.Biol.194:59-69(1987)；WO02/26993；WO2005/049808；和WO2003/097839)。
苏氨酸操纵子的天然启动子存在于苏氨酸操纵子的上游，并且可以用非天然启动子替换(WO98/04715)。此外，苏氨酸操纵子可以构建成使得苏氨酸生物合成基因在λ噬菌体的阻遏物和启动子的控制下表达(EP0593792B)。此外，通过选择对作为L-苏氨酸类似物的α-氨基-β-羟基异戊酸(AHV)具有抗性的菌株，也可以获得经修饰而对L-苏氨酸的反馈抑制脱敏的细菌。
优选地，如上文所述的经修饰而对L-苏氨酸的反馈抑制脱敏的苏氨酸操纵子的表达量通过增加其拷贝数或通过将其连接到有力的启动子来在宿主中增加。通过将含有苏氨酸操纵子的质粒引入宿主可以增加拷贝数。通过使用转座子、Mu-噬菌体等将苏氨酸操纵子转移到宿主的基因组也可以增加拷贝数。
用于赋予或增强L-苏氨酸生产能力的方法的实例还包括例如对宿主赋予L-苏氨酸抗性的方法、以及对宿主赋予L-高丝氨酸抗性的方法。可以通过例如增强赋予L-苏氨酸抗性的基因或赋予L-高丝氨酸抗性的基因的表达来赋予此类抗性。赋予上述抗性的基因的实例包括rhtA基因(Res.Microbiol.154:123-135(2003))、rhtB基因(EP0994190A)、rhtC基因(EP1013765A)、yfiK基因和yeaS基因(EP1016710A)。关于对宿主赋予L-苏氨酸抗性的方法，可参考EP0994190A和WO90/04636中描述的方法。
L-苏氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括例如大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996，美国专利号5,175,107和5,705,371)、大肠杆菌472T23/pYN7(ATCC 98081，美国专利号5,631,157)、大肠杆菌NRRL-21593(美国专利号5,939,307)、大肠杆菌FERM BP-3756(美国专利号5,474,918)、大肠杆菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利号5,376,538)、大肠杆菌MG442(Gusyatiner et al.,Genetika(于俄罗斯),14,947-956(1978))、大肠杆菌VL643和VL2055(EP1149911A)、和大肠杆菌VKPM B-5318(EP0593792B).
VKPM B-3996菌株是通过将质粒pVIC40引入TDH-6菌株而获得的菌株。TDH-6株具有蔗糖同化能力，缺乏thrC基因，并且其ilvA基因具有渗漏突变(leaky mutation)。TDH-6菌株在rhtA基因中也具有突变，其赋予对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性。质粒pVIC40是将thrA*BC操纵子***RSR1010衍生的载体中获得的质粒，所述thrA*BC操纵子含有编码对苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶I的突变体thrA基因和野生型thrBC基因(美国专利号5,705,371)。该突变体thrA基因编码天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶I，其对苏氨酸的反馈抑制基本上脱敏。B-3996菌株在登录号RIA 1867下于1987年11月19日保藏于All-Union Scientific Center of Antibiotics(Nagatinskaya Street 3-A，117105Moscow，Russia)。该菌株也于1987年4月7日在登录号VKPM B-3996下保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms)(VKPM,FGUP GosNII Genetika,1Dorozhny proezd.,1Moscow 117545,Russia)，。
VKPM B-5318菌株对于异亮氨酸是原养型的，并且含有质粒pPRT614，其对应于质粒pVIC40，其中苏氨酸操纵子的调节区被温度敏感的λ噬菌体Cl阻遏物和PR启动子替换。VKPM B-5318菌株于1990年5月3日在登录号VKPM B-5318下保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM,FGUP GosNII Genetika,1Dorozhny proezd.,1Moscow 117545,Russia)。
已经阐明了编码大肠杆菌的天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因(核苷酸号337至2799，GenBank登录号NC_000913.2，gi:49175990)。thrA基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrL和thrB基因之间。已经阐明了编码大肠杆菌高丝氨酸激酶的thrB基因(核苷酸号2801至3733，GenBank登录号NC_000913.2，gi:49175990)。thrB基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrA和thrC基因之间。已经阐明了编码大肠杆菌的苏氨酸合酶的thrC基因(核苷酸号3734至5020，GenBank登录号NC_000913.2，gi:49175990)。thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrB基因和yaaX可读框之间。可以从存在于苏氨酸生产大肠杆菌菌株VKPMB-3996(美国专利号5,705,371)中的公知质粒pVIC40中获得thrA*BC操纵子，其含有编码对苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶I的突变体thrA基因和野生型thrBC基因。
大肠杆菌的rhtA基因位于接近glnHPQ操纵子的大肠杆菌染色体上18min，所述glnHPQ操纵子编码谷氨酰胺转运***的组分。rhtA基因与ORF1(ybiF基因，核苷酸号764-1651，GenBank登录号AAA218541，gi:440181)相同，并且位于pexB和ompX基因之间。表达由ORF1编码的蛋白质的单位已经称为rhtA基因(rht：对高丝氨酸和苏氨酸的抗性)。还已经揭示了，赋予对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性的rhtA23突变是相对于ATG起始密码子的位置-1处的A-对-G取代(ABSTRACTS of the 17th International Congress ofBiochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of theAmerican Society for Biochemistry and Molecular Biology,San Francisco,California,1997年8月24-29日,摘要No.457；EP1013765A)。
已经阐明了大肠杆菌的asd基因(核苷酸号3572511至3571408，GenBank登录号NC_000913.1，gi:16131307)，并且可以通过PCR(White,T.J.,et al.,Trends Genet,5:185-189,1989)，利用基于该基因的核苷酸序列制备的引物获得。其它微生物的asd基因也可以以类似的方式获得。
也已经阐明了大肠杆菌的aspC基因(核苷酸号983742至984932，GenBank登录号NC_000913.1，gi:16128895)，并且可以利用基于该基因的核苷酸序列制备的引物通过PCR获得。也可以以类似的方式获得其它微生物的aspC基因。
此外，具有L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌细菌的实例包括例如嗜乙酰乙酸棒杆菌AJ12318(FERM BP-1172，美国专利号5,188,949)。
<L-赖氨酸生产细菌>
用于赋予或增强L-赖氨酸生产能力的方法的实例包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有增加的选自L-赖氨酸生物合成酶的一种或多种酶的一种或多种活性。此类酶的实例包括但不限于二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)(dapA)、天冬氨酸激酶III(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dihydrodipicolinate reductase)(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国专利号6,040,160)、磷酸烯醇丙酮酸羧酸酶(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)(aspC)、二氨基庚二酸差向异构酶(dapF)、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(tetrahydrodipicolinate succinylase)(dapD)、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶(succinyldiaminopimelate deacylase)(dapE)和天冬氨酸酶(aspA)(EP1253195A)。优选的是增强选自例如二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、二氨基庚二酸差向异构酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的一种或多种酶的一种或多种活性。此外，L-赖氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株可以表达升高水平的涉及能量效率的基因(cyo)(EP1170376A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利号5,830,716)、ybjE基因(WO2005/073390)或这些的组合。由于天冬氨酸激酶III(lysC)受L-赖氨酸的反馈抑制，可以使用编码对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶III的突变体lysC基因(美国专利号5,932,453)来增强该酶的活性。对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶III的实例包括下述天冬氨酸激酶III，其源自大肠杆菌并且具有一个或多个突变，所述突变选自用异亮氨酸残基替换318位甲硫氨酸残基的突变；用天冬氨酸残基替换323位甘氨酸残基的突变；以及用异亮氨酸残基替换352位苏氨酸残基的突变(美国专利号5,661,012和6,040,160)。此外，由于二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)受L-赖氨酸的反馈抑制，可以使用编码对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的二氢吡啶二羧酸合酶的突变体dapA基因来增强此酶的活性。对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的二氢吡啶二羧酸合酶的实例包括下述二氢吡啶二羧酸合酶，其源自大肠杆菌并且具有用酪氨酸残基替换118位组氨酸残基的突变(美国专利号6,040,160)。
用于赋予或增强L-赖氨酸生产能力的方法的实例还包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有一种或多种酶的降低的一种或多种活性，所述酶选自催化从L-赖氨酸的生物合成途径分支的反应以产生除L-赖氨酸以外的化合物。此类酶的实例包括但不特别限于高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(美国专利号5,827,698)和苹果酸酶(WO2005/010175)。
此外，用于对棒状杆菌细菌或在棒状杆菌细菌中赋予或增强L-赖氨酸生产能力的方法的实例还包括修饰细菌以使赖氨酸排出***(lysE)的活性增加的方法(WO97/23597)。谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的lysE基因对应于与NCBI数据库中作为Genbank登录号NC_006958(VERSION NC_006958.1GI：62388892)登记的基因组序列中的核苷酸号1,329,712至1,330,413的序列互补的序列。谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的LysE蛋白登记为GenBank登录号YP_225551(YP_225551.1GI：62390149)。
L-赖氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变体菌株。L-赖氨酸类似物抑制细菌如肠杆菌科的细菌和棒状杆菌细菌的生长，但是当L-赖氨酸存在于培养基中时，这种抑制被完全或部分释放。这些L-赖氨酸类似物的实例包括但不特别限于氧代赖氨酸、赖氨酸异羟肟酸盐(lysine hydroxamate)、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸和α-氯代己内酰胺。对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变体株可以通过使细菌进行常规的人工诱变处理来获得。
L-赖氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185，美国专利号4,346,170)和大肠杆菌VL611。在这些菌株中，天冬氨酸激酶对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏。
L-赖氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例还包括大肠杆菌WC196菌株。通过对源自大肠杆菌K-12(美国专利号5,827,698)的W3110菌株赋予AEC抗性来培育WC196菌株。WC196菌株称为大肠杆菌AJ13069，并且于1994年12月6日保藏在工业科学和技术局国立生物科学与人类技术研究所(现为独立行政机构，国家技术与评估研究所，国际专利生物体保藏中心，#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)，并且分配登录号FERM P-14690。然后，1995年9月29日，根据布达佩斯条约的规定，保藏物已转为国际保藏物，并分配了登录号FERM BP-5252(美国专利号5,827,698)。
L-赖氨酸生产细菌的优选实例包括大肠杆菌WC196ΔcadAΔldc和大肠杆菌WC196ΔcadAΔldc/pCABD2(WO2010/061890)。大肠杆菌WC196ΔcadAΔldc是通过破坏编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因从WC196株构建的菌株。通过将含有赖氨酸生物合成酶基因的质粒pCABD2(美国专利号6,040,160)引入WC196ΔcadAΔldc菌株构建WC196ΔcadAΔldc/pCABD2菌株。称为AJ110692的WC196ΔcadAΔldc菌株于2008年10月7日作为国际保藏物保藏在独立行政机构国立先进工业科学技术研究所，国际专利生物体保藏中心(International Patent Organism Depositary)(目前为独立行政机构，国家技术与评价研究所，国际专利生物体保藏中心，#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)，并分配了FERM BP-11027的登录号。质粒pCABD2含有源自大肠杆菌并且编码具有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变(H118Y)的二氢吡啶二羧酸合酶(DDPS)的突变体dapA基因、源自大肠杆菌并且编码具有对L-赖氨酸的反馈抑制脱敏的突变(T352I)的天冬氨酸激酶III的突变体lysC基因、和源自乳发酵短杆菌并且编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因。
L-赖氨酸生产细菌的优选实例还包括大肠杆菌AJIK01(NITE BP-01520)。AJIK01菌株称为大肠杆菌AJ111046，并且于2013年1月29日保藏在独立行政机构NationalInstitute of Technology and Evaluation,International Patent OrganismDepositary(#122,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)。然后，于2014年5月15日根据布达佩斯条约转为国际保藏物，并分配了NITE BP-01520的登录号。
具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌细菌的实例包括例如AEC抗性突变体菌株(谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌AJ11082)(NRRL B-11470)菌株等，日本专利公开(Kokoku)号56-1914,56-1915,57-14157,57-14158,57-30474,58-10075,59-4993,61-35840,62-24074,62-36673,5-11958,7-112437和7-112438)；需要氨基酸如L-高丝氨酸用于其生长的突变体菌株(日本专利公开号48-28078和56-6499)；显示对AEC的抗性并进一步需要L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸的氨基酸的突变体菌株(美国专利号3,708,395和3,825,472)；对DL-α-氨基-ε-己内酰胺，α-氨基-月桂基内酰胺、天冬氨酸类似物、磺胺药物、醌型和N-月桂酰基亮氨酸具有抗性的突变体菌株；显示对草酰乙酸脱羧酶抑制剂或呼吸链酶抑制剂的抗性的突变体菌株(日本专利公开(Kokai)号50-53588,50-31093,52-102498,53-9394,53-86089,55-9783,55-9759,56-32995,56-39778，日本专利公开号53-43591和53-1833)；需要肌醇或乙酸的突变体菌株(日本专利公开(Kokai)号55-9784和56-8692)；对氟丙酮酸或34℃以上的温度易感的突变体菌株(日本专利公开(Kokai)号55-9783和53-86090)；和显示对乙二醇的抗性的突变体菌株(美国专利号4,411,997)。
<L-精氨酸生产菌>
用于赋予或增强L-精氨酸生产能力的方法的实例包括例如修饰细菌方法，所述修饰使得细菌具有增加的选自L-精氨酸生物合成酶的一种或多种酶的一种或多种活性。此类酶的实例包括但不特别限于N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶(argF，argI)、精氨酸琥珀酸合成酶(argG)，精氨基琥珀酸裂合酶(argH)，鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)和氨基甲酰磷酸合成酶(argininosuccinate synthetase)(carAB)。作为N-乙酰谷氨酸合酶基因(argA)，例如，可以优选使用编码突变体N-乙酰谷氨酸合酶的基因，所述突变体N-乙酰谷氨酸合酶通过取代对应于野生型酶的位置15-19的氨基酸残基而脱敏(EP1170361A)。
L-精氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括例如大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925，US2002/058315A1)，其引入了编码突变体N-乙酰谷氨酸合酶的argA基因的衍生菌株(俄罗斯专利申请号2001112869，EP1170361A1)，源自237菌株并具有改善的乙酸同化能力的大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926，EP1170358A1)和大肠杆菌382ilvA+菌株，其是通过对其导入来自大肠杆菌K-12菌株的野生型ilvA基因而从382菌株获得的菌株。大肠杆菌菌株237以登录号VKPM B-7925于2000年4月10日保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM,FGUP GosNII Genetika,1Dorozhny proezd.,1Moscow 117545,Russia)，并且根据布达佩斯条约的规定，于2001年5月18日，保藏物已转为国际保藏物。大肠杆菌382菌株于2000年4月10日以登录号VKPM B-7926保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM,FGUP GosNII Genetika,1Dorozhny proezd.,1Moscow 117545,Russia)。
L-精氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括对氨基酸类似物具有抗性的菌株等等。此类菌株的实例包括对α-甲基甲硫氨酸、对氟苯丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸异羟肟酸盐、S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸、α-甲基丝氨酸、β-2-噻吩丙氨酸或磺胺脒的抗性的大肠杆菌突变体菌株(日本专利公开(Kokai)号56-106598)。
L-精氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括棒状杆菌细菌，如ArgR(其是精氨酸阻遏物)缺陷型菌株(US2002-0045223A)，以及谷氨酰胺合成酶活性增加的菌株(US2005-0014236A)。
L-精氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括棒状杆菌细菌的突变体菌株、对氨基酸类似物具有抗性的突变体菌株等。此类菌株的实例包括例如对2-噻唑丙氨酸具有抗性并且对L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸或L-色氨酸具有营养缺陷型的菌株(日本专利公开(Kokai)号54-44096)；对酮丙二酸、氟丙二酸或一氟乙酸有抗性的菌株(日本专利公开(Kokai)号57-18989)；对精氨醇(argininol)有抗性的菌株(日本专利公开号62-24075)；对X-胍有抗性的菌株(X代表脂族链或其衍生物，日本专利公开(Kokai)号2-186995)；和对精氨酸异肟酸酯和6-氮尿嘧啶有抗性的菌株(日本专利公开(Kokai)57-150381)。具有L-精氨酸生产能力的棒状杆菌细菌的具体实例包括以下菌株。
谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11169(FERM BP-6892)
谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)AJ12092(FERM BP-6906)
谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11336(FERM BP-6893)
谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11345(FERM BP-6894)
谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)AJ12430(FERM BP-2228)
<L-瓜氨酸生产细菌和L-鸟氨酸生产细菌>
L-瓜氨酸和L-鸟氨酸是L-精氨酸生物合成途径的中间体。因此，用于赋予或增强L-瓜氨酸和/或L-鸟氨酸的能力的方法的实例包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有增加的选自L-精氨酸生物合成酶的一种或多种酶的一种或多种活性。此类酶的实例包括但不限于N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶(argF，argI)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)和氨基甲酰磷酸合成酶(carAB)，用于L-瓜氨酸。此外，此类酶的实例包括但不特别限于N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)和鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)，用于L-鸟氨酸。
通过降低由argG基因编码的精氨酸琥珀酸合成酶的活性，可以容易地从L-精氨酸细菌如大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)中获得L-瓜氨酸生产细菌。此外，通过降低由argF和argI基因编码的鸟氨酸氨基甲酰转移酶的活性，可以容易地从例如L-精氨酸细菌，如大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)获得L-鸟氨酸生产细菌。
用于L-瓜氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括例如属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌菌株237/pMADS11、237/pMADS12、和237/pMADS13，其具有突变体N-乙酰谷氨酸合酶(俄罗斯专利号2,215,783，美国专利号6,790,647和EP1170361B1)、大肠杆菌菌株333(VKPM B-8084)和374(VKPM B-8086)，其具有对反馈抑制有抗性的氨基甲酰磷酸合成酶(俄罗斯专利号2,264,459)，具有增加的α-酮戊二酸合酶活性并且具有修饰的铁氧还蛋白NADP+还原酶、丙酮酸合酶和/或α-酮戊二酸脱氢酶活性的大肠杆菌菌株(EP2133417A)；和具有降低的琥珀酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶活性的菠萝泛菌NA1sucAsdhA菌株(US2009-286290A1)。
<L-组氨酸生产细菌>
用于赋予或增强L-组氨酸生产能力的方法的实例包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有增加的选自L-组氨酸生物合成酶的一种或多种酶的一种或多种活性。此类酶的实例包括但不特别限于ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)、磷酸核糖基AMP环水解酶(cyclohydrolase)(hisI)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶(hisI)、磷酸核糖基亚氨甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸异构酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazolecarboxamide ribotide isomerase，hisA)、氨基转移酶(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶(hisC)、组氨醇磷酸酶(hisB)和组氨醇脱氢酶(hisD)。
在这些酶中，已知由hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成酶被L-组氨酸抑制。因此，通过例如对ATP磷酸核糖转移酶(hisG)的基因引入赋予对反馈抑制的抗性的突变，可以赋予或增强生产L-组氨酸的能力(俄罗斯专利2,003,677和2,119,536)。
L-组氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括例如属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌24菌株(VKPM B-5945，RU2003677)、大肠杆菌NRRL B-12116至B-12121(美国专利号4,388,405)、大肠杆菌H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676，美国专利号6,344,347)、大肠杆菌H-9341(FERM BP-6674，EP1085087)、大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利号6,258,554)、大肠杆菌FERM P-5038和FERM P-5048(其已经引入有携带编码L-组氨酸-生物合成酶的DNA的载体)(日本专利公开(Kokai)号56-005099)、引入有氨基酸转运基因的大肠杆菌菌株(EP1016710A)和已被赋予对磺胺脒、DL-1,2,4-***-3-丙氨酸和链霉素的抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，俄罗斯专利号2119536)。
<L-半胱氨酸生产细菌>
用于赋予或增强L-半胱氨酸生产能力的方法的实例包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有增加的选自L-半胱氨酸生物合成酶的一种或多种酶的一种或多种活性。此类酶的实例包括但不特别限于丝氨酸乙酰转移酶(cysE)和3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA)。丝氨酸乙酰转移酶活性可以通过例如将编码对半胱氨酸反馈抑制有抗性的突变体丝氨酸乙酰转移酶的突变体cysE基因导入细菌来增强。此类突变体丝氨酸乙酰转移酶例如在日本专利公开(Kokai)号11-155571和US2005-0112731A中公开。此外，可以通过例如将编码对丝氨酸的反馈抑制具有抗性的突变体3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变体serA基因导入细菌来提高3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。此类突变体3-磷酸甘油酸脱氢酶公开在例如美国专利号6,180,373中。
此外，用于赋予或增强L-半胱氨酸生产能力的方法的实例还包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有降低的一种或多种酶的一种或多种活性，所述酶选自催化从L-半胱氨酸的生物合成途径分支的反应产生除L-半胱氨酸以外的化合物的酶。此类酶的实例包括例如涉及L-半胱氨酸分解的酶。涉及L-半胱氨酸分解的酶的实例包括但不限于胱硫醚-β-裂合酶(metC，日本专利公开(Kokai)号11-155571；Chandra et al.,Biochemistry,21(1982)3064-3069)、色氨酸酶(tnaA，日本专利公开(Kokai)号2003-169668；AustinNewton et al.,J.Biol.Chem.,240(1965)1211-1218)、O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(sulfhydrylase)B(cysM，日本专利公开(Kokai)号2005-245311)、malY基因产物(日本专利公开(Kokai)号2005-245311)、菠萝泛菌的d0191基因产物(日本专利(Kokai)号2009-232844)和半胱氨酸脱巯基酶(desulfhydrase)(aecD，日本专利公开(Kokai)号2002-233384)。
此外，用于赋予或增强L-半胱氨酸生产能力的方法的实例还包括例如增强L-半胱氨酸排出***的方法，以及增强硫酸盐/硫代硫酸盐转运***的方法。L-半胱氨酸排出***的蛋白质的实例包括由ydeD基因编码的蛋白质(日本专利公开(Kokai)号2002-233384)、由yfiK基因编码的蛋白质(日本专利公开(Kokai)号2004-49237)、由emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr和cusA基因编码的蛋白质(日本专利公开(Kokai)号2005-287333)和由yeaS基因编码的蛋白质(日本专利公开(Kokai)号2010-187552)。硫酸盐/硫代硫酸盐转运***的蛋白质的实例包括由cysPTWAM基因簇编码的蛋白质。
L-半胱氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括例如用编码反馈抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15(美国专利号6,218,168，俄罗斯专利申请2003121601)、具有编码适合细胞毒性物质分泌的蛋白质的过表达基因的大肠杆菌W3110(美国专利号5,972,663)、具有降低的半胱氨酸脱巯基酶(desulfohydrase)活性的大肠杆菌菌株(日本专利公开(Kokai)号11-155571)和具有由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正转录调节物的增加活性的大肠杆菌W3110(WO01/27307A1)。
此外，具有L-半胱氨酸生产能力的棒状杆菌细菌的实例包括具有对L-半胱氨酸反馈抑制脱敏，从而显示增强的胞内丝氨酸乙酰转移酶活性的丝氨酸乙酰转移酶的棒状杆菌细菌(日本专利公开(Kokai)号2002-233384)。
<L-丝氨酸生产细菌>
用于赋予或增强L-丝氨酸生产能力的方法的实例包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有增加的选自L-丝氨酸生物合成酶的一种或多种酶的一种或多种活性。此类酶的实例包括但不特别限于3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA)、磷酸丝氨酸转氨酶(serC)和磷酸丝氨酸磷酸酶(serB)(日本专利公开(Kokai)号11-253187)。3-磷酸甘油酸脱氢酶活性可以通过例如将编码具有对L-丝氨酸反馈抑制有抗性的突变体3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变体serA基因导入细菌来增加。突变体3-磷酸甘油酸脱氢酶公开在例如美国专利号6,180,373中。
L-丝氨酸生产细菌和用于衍生的L-丝氨酸生产菌的实例包括例如对重氮丝氨酸或β-(2-噻吩基)-DL-丙氨酸有抗性并且缺乏L-丝氨酸分解能力的棒状杆菌细菌(日本专利公开(Kokai)号10-248588)。此类棒状杆菌细菌的具体实例包括例如对重氮丝氨酸有抗性并且L-丝氨酸分解能力缺陷的谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ13324(FERM P-16128)和谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ13325(FERM P-16129)，其对β-(2-噻吩基)-DL-丙氨酸有抗性并且缺乏L-丝氨酸分解能力(日本专利公开(Kokai)号10-248588)。
<L-甲硫氨酸生产细菌>
L-甲硫氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例包括L-苏氨酸营养缺陷型菌株和对正亮氨酸有抗性的突变体菌株(日本专利公开(Kokai)号2000-139471)。L-甲硫氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括含有对L-甲硫氨酸的反馈抑制有抗性的突变体高丝氨酸转琥珀酰基酶(transsuccinylase)的菌株(日本专利公开(Kokai)号2000-139471，US2009-0029424A)。由于L-甲硫氨酸通过L-半胱氨酸作为中间体进行生物合成，通过改善L-半胱氨酸生产能力也可以改善L-甲硫氨酸生产能力(日本专利公开(Kokai)号2000-139471,US2008-0311632A)。
L-甲硫氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括例如大肠杆菌AJ11539(NRRL B-12399)、大肠杆菌AJ11540(NRRL B-12400)、大肠杆菌AJ11541(NRRL B-12401)、大肠杆菌AJ11542(NRRL B-12402，英国专利号2075055)、大肠杆菌218菌株(VKPMB-8125，俄罗斯专利号2209248)和73菌株(VKPM B-8126，俄罗斯专利号2215782)(其对于作为L-甲硫氨酸的类似物的正亮氨酸具有抗性)和大肠杆菌AJ13425(FERMP-16808，日本专利公开(Kokai)号2000-139471)。AJ13425菌株是源自大肠杆菌W3110的L-苏氨酸营养缺陷型菌株，其中甲硫氨酸阻遏物被缺失，胞内S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性减弱，并且细胞内高丝氨酸转琥珀酰基酶活性、胱硫醚γ-合酶活性和天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶II活性增强。
<L-亮氨酸生产细菌>
用于赋予或增强L-亮氨酸生产能力的方法的实例包括例如修饰细菌的方法，使得细菌具有增加的选自L-亮氨酸生物合成酶的一种或多种酶的一种或多种活性。此类酶的实例包括但不特别限于由leuABCD操纵子的基因编码的酶。此外，为了增强此类酶的活性，例如，可以优选使用编码对由L-亮氨酸反馈抑制脱敏的马来酸异丙酯合酶的突变体leuA基因(美国专利号6,403,342)。
L-亮氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括例如属于埃希氏菌属的菌株，如对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，57株(VKPM B-7386，美国专利号6,124,121))、对亮氨酸类似物如β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸和5,5,5-三氟色氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(日本专利公开(Kokoku)号62-34397和日本专利公开(Kokai)号8-70879)、通过WO96/06926中描述的基因工程技术获得的大肠杆菌菌株和大肠杆菌H-9068(日本专利公开(Kokai)号8-70879)。
具有L-亮氨酸生产能力的棒状杆菌细菌的实例包括例如对2-噻唑丙氨酸和β-羟基亮氨酸具有抗性和异亮氨酸和甲硫氨酸营养缺陷型的谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)AJ3718(FERM P-2516)。
<L-异亮氨酸生产细菌>
用于赋予或增强L-异亮氨酸生产能力的方法的实例包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有增加的选自L-异亮氨酸生物合成酶的一种或多种酶的一种或多种活性。此类酶的实例包括但不特别限于苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合酶(日本专利公开(Kokai)号2-458，EP0356739A，美国专利号5,998,178)。
L-异亮氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括例如埃希氏菌属细菌，如具有对6-二甲基氨基嘌呤具有抗性的突变体菌株(日本专利公开(Kokai)号5-304969)、具有对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸异羟肟酸的抗性的突变体菌株，以及对此类异亮氨酸类似物具有抗性并且还具有对DL-乙硫氨酸和/或精氨酸异羟肟酸的抗性的突变株(日本专利公开(Kokai)号5-130882)。
具有L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌细菌的实例包括例如其中扩增了编码支链氨基酸排出蛋白的brnE基因的棒状杆菌细菌(日本专利公开(Kokai)号2001-169788)、通过与L-赖氨酸生产细菌的原生质体融合赋予L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌细菌(日本专利公开(Kokai)号62-74293))、其中高丝氨酸脱氢酶增强的棒状杆菌细菌(日本专利公开(Kokai)号62-91193)、苏氨酸异羟肟酸抗性菌株(日本专利公开(Kokai)号62-195293)、α-酮丙二酸抗性菌株(日本专利公开(Kokai)号61-15695)、甲基赖氨酸抗性菌株(日本专利公开(Kokai)号61-15696)和谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ12149(FERM BP-759，美国专利号4,656,135)。
<L-缬氨酸生产菌>
用于赋予或增强L-缬氨酸生产能力的方法的实例包括例如修饰细菌的方法，使得细菌具有增加的选自L-缬氨酸生物合成酶的一种或多种酶的一种或多种活性。此类酶的实例包括但不特别限于由ilvGMEDA操纵子的基因和由ilvBNC操纵子编码的酶编码的酶。ilvBN基因编码乙酰羟酸合酶，ilvC基因编码异构还原酶(WO00/50624)。ilvGMEDA操纵子和ilvBNC操纵子的表达被L-缬氨酸，L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸抑制(减毒)。因此，为了提高这种酶的活性，优选通过除去或改变衰减所需的区域来释放所产生的L-缬氨酸的表达抑制。此外，由ilvA基因编码的苏氨酸脱氨酶是催化L-苏氨酸的脱氨基反应的酶，得到2-酮丁酸，这是L-异亮氨酸生物合成***的限速步骤。因此，对于L-缬氨酸生产，优选ilvA基因例如被破坏，因此苏氨酸脱氨酶活性降低。
用于赋予或增强L-缬氨酸生产能力的方法的实例还包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有降低的一种或多种酶的一种或多种活性，所述酶选自催化从L-缬氨酸的生物合成途径分支的反应以产生除L-缬氨酸以外的化合物的酶。此类酶的实例包括但不特别限于参与L-亮氨酸合成的苏氨酸脱水酶，以及参与D-泛酸合成的酶(WO00/50624)。
L-缬氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括例如经修饰而过表达ilvGMEDA操纵子的大肠杆菌菌株(美国专利号5,998,178)。
L-缬氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括在氨基酰基t-RNA合成酶中具有突变的突变体菌株(美国专利号5,658,766)。此类菌株的实例包括例如在编码异亮氨酸t-RNA合成酶的ileS基因中具有突变的大肠杆菌VL1970。大肠杆菌VL1970于1988年6月24日以保藏号VKPM B-4411保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM,FGUPGosNII Genetika,1 Dorozhny Proezd,1 Moscow 117545,Russia)。L-缬氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括需要硫辛酸用于生长和/或缺乏H+-ATP酶的突变体菌株(WO96/06926)。
L-缬氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例还包括对氨基酸类似物具有抗性的菌株等。此类菌株的实例包括例如对于L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸是营养缺陷型，并且对D-核糖、嘌呤核糖核苷或嘧啶核糖核苷有抗性，并且具有产生L-缬氨酸的能力的棒状杆菌细菌菌株(FERM P-1841，FERM P-29)(日本专利公开号53-025034)、对聚酮化合物有抗性的棒状杆菌细菌菌株(FERM P-1763，FERM P-1764)(日本专利公开号06-065314)和在含有乙酸作为唯一碳源的培养基中对L-缬氨酸有抗性并且在含有葡萄糖作为唯一碳源的培养基中对丙酮酸类似物(氟丙酮酸等)敏感的棒状杆菌细菌菌株(FERM BP-3006，BP-3007)(日本专利号3006929)。
<L-丙氨酸生产细菌>
L-丙氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的实例包括缺乏H+-ATP酶的棒状杆菌细菌(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2001Nov.,57(4):534-40)和其中天冬氨酸β-脱羧酶活性增强的棒状杆菌细菌(日本专利公开(Kokai)号07-163383)。
<L-色氨酸生产细菌、L-苯丙氨酸生产细菌和L-酪氨酸生产细菌>
用于赋予或增强L-色氨酸生产能力、L-苯丙氨酸生产能力和/或L-酪氨酸生产能力的方法的实例包括例如修饰细菌以使细菌具有增加的一种或多种选自下组的酶的一种或多种活性的方法：L-色氨酸、L-苯丙氨酸和/或L-酪氨酸生物合成酶。
这些芳香族氨基酸的生物合成***共有的酶的实例包括但不特别限于3-脱氧-D-***糖庚糖酮酸-7-磷酸合酶(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphatesynthase,aroG)、3-脱水奎宁合酶(3-dehydroquinate synthase,aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(aroA)和分支酸合酶(chorismate synthase,aroC)(EP763127B)。编码这些酶的基因的表达由酪氨酸阻遏物(tyrR)控制，并且可以通过缺失tyrR基因来增强这些酶的活性(EP763127B)。
L-色氨酸生物合成酶的实例包括但不特别限于邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、色氨酸合酶(trpAB)和磷酸甘油酸脱氢酶(serA)。例如，通过引入含有色氨酸操纵子的DNA，可以赋予或增强L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由分别由trpA和trpB基因编码的α和β亚基组成。由于邻氨基苯甲酸合酶受到L-色氨酸的反馈抑制，因此可以使用引入有对反馈抑制脱敏的突变的该酶的基因来增强该酶的活性。由于磷酸甘油酸脱氢酶受L-丝氨酸的反馈抑制，可以使用引入有对反馈抑制脱敏的突变的此酶的基因来提高该酶的活性。此外，通过增加由马来酸合酶基因(aceB)、异柠檬酸裂合酶基因(aceA)和异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶基因(aceK)组成的操纵子(ace操纵子)的表达，可以赋予或增强L-色氨酸生产能力(WO2005/103275)。
L-苯丙氨酸生物合成酶的实例包括但不特别限于分支酸变位酶和预苯酸脱水酶。分支酸变位酶和预苯酸脱水酶由pheA基因作为双功能酶编码。由于分支酸变位酶和预苯酸脱水酶受L-苯丙氨酸的反馈抑制，编码这些引入了对反馈抑制脱敏的突变的酶的基因可用于增强这些酶的活性。
L-酪氨酸生物合成酶的实例包括但不特别限于分支酸变位酶和预苯酸脱水酶。分支酸变位酶和预苯酸脱水酶由tyrA基因作为双功能酶编码。由于分支酸变位酶和预苯酸脱水酶受L-酪氨酸的反馈抑制，编码这些引入了对反馈抑制脱敏的突变的酶的基因可用于增强这些酶的活性。
可以修饰L-色氨酸、L-苯丙氨酸和/或L-酪氨酸生产细菌，使得除目标芳香族氨基酸以外的芳香族氨基酸的生物合成降低。此外，可以修饰L-色氨酸、L-苯丙氨酸和/或L-酪氨酸生产细菌，从而增强了副产物摄取***。副产物的实例包括除目标芳族氨基酸以外的芳族氨基酸。编码此类副产物摄取***的基因的实例包括例如tnaB和mtr(其是编码L-色氨酸摄取***的基因)、pheP(其是编码L-苯丙氨酸摄取***的基因)、以及tyrP(其是编码L-酪氨酸摄取***的基因)(EP1484410)。
L-色氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括例如大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)(其具有编码部分失活的色氨酰-tRNA合成酶的突变体trpS基因)(美国专利号5,756,345)、大肠杆菌SV164(其具有编码对色氨酸反馈抑制脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的trpE等位基因)、大肠杆菌SV164(pGH5)(其具有编码对丝氨酸的反馈抑制脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码对由色氨酸反馈抑制脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的trpE等位基因)(美国专利号6,180,373)、引入有色氨酸操纵子的菌株，所述色氨酸操纵子含有编码对色氨酸的反馈抑制脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的trpE等位基因(日本专利公开(Kokai)号57-71397和62-244382，美国专利号4,371,614)、大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-122 64)(其是色氨酸酶缺陷的)(美国专利号4,371,614)、大肠杆菌AGX17/pGX50,pACKG4-pps(其具有增加的磷酸烯醇丙酮酸生产能力)(WO97/08333，美国专利号6,319,696)和属于埃希氏菌属且具有增加的由yedA或yddG基因编码的蛋白质的活性的菌株(US2003-0148473A1和US2003-0157667A1)。
具有L-色氨酸生产能力的棒状杆菌细菌的实例包括例如对磺胺脒有抗性的谷氨酸棒杆菌AJ12118(FERM BP-478，日本专利号1681002)、引入有色氨酸操纵子的菌株(日本专利公开(Kokai)号63-240794)和引入有源自棒状杆菌细菌的编码莽草酸激酶的基因的菌株(日本专利号1994749)。
L-苯丙氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例包括例如大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)(其缺乏分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶以及酪氨酸阻遏物)(WO03/044191)、大肠杆菌HW1089(ATCC 55371)(其含有编码对反馈抑制脱敏的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的突变体pheA34基因)(美国专利号5,354,672)、大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)、大肠杆菌NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146和NRRL B-12147(美国专利号4,407,952)。L-苯丙氨酸生产细菌和用于衍生它们的亲本菌株的具体实例还包括例如大肠杆菌K-12<W3110(tyrA)/pPHAB>(FERM BP-3566)、大肠杆菌K-12<W3110(tyrA)/pPHAD>(FERM BP-12659)、大肠杆菌K-12<W3110(tyrA)/pPHATerm>(FERM BP-12662)、和大肠杆菌K-12AJ12604<W3110(tyrA)/pBR-aroG4,pACMAB>(FERM BP-3579)，其含有编码对反馈抑制脱敏的分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的基因(EP488424B1)。L-苯丙氨酸生产细菌及用于衍生它们的亲本菌株的具体实例还包括例如属于埃希氏菌属且具有增加的由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活性的菌株(US2003-0148473A，US2003-0157667A，WO03/044192)。
具有L-苯丙氨酸生产能力的棒状杆菌细菌的实例包括例如谷氨酸棒杆菌菌株BPS-13(FERM BP-1777)、K77(FERM BP-2062)和K78(FERM BP-2063)(EP331145A，日本专利公开(Kokai)号02-303495)(其中磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或丙酮酸激酶活性降低)以及酪氨酸营养缺陷型菌株(日本专利公开(Kokai)号05-049489)。
具有L-酪氨酸生产能力的棒状杆菌细菌的实例包括例如谷氨酸棒杆菌AJ11655(FERM P-5836，日本专利公开号2-6517)和谷氨酸棒杆菌(乳发酵短杆菌)AJ12081(FERM P-7249，日本专利公开(Kokai)号60-70093)。
此外，用于赋予或增强L-氨基酸生产能力的方法的实例包括例如修饰细菌的方法，所述修饰使得细菌具有增加的从细菌细胞分泌L-氨基酸的活性。用于分泌L-氨基酸的这种活性可以通过例如增加编码负责L-氨基酸分泌的蛋白质的基因的表达来增加。编码负责各种氨基酸分泌的蛋白质的基因的实例包括例如b2682基因(ygaZ)、b2683基因(ygaH)、b1242基因(ychE)和b3434基因(yhgN)(日本专利公开(Kokai)号2002-300874)。
此外，用于赋予或增强L-氨基酸生产能力的方法的实例还包括例如修饰细菌，使得细菌具有增加的选自下组的一种或多种蛋白质的一种或多种活性的方法：参与糖代谢的蛋白质和参与能量代谢的蛋白质。
参与糖代谢的蛋白质的实例包括参与糖摄取的蛋白质和糖酵解***酶。编码参与糖代谢的蛋白质的基因的实例包括葡萄糖-6-磷酸异构酶基因(pgi，WO01/02542)、丙酮酸羧化酶基因(pyc,WO99/18228,EP1092776A)、葡糖磷酸变位酶基因(pgm，WO03/04598)、果糖二磷酸醛缩酶基因(pfkB，fbp，WO03/04664)、转醛醇酶基因(talB，WO03/008611)、延胡索酸酶基因(fum，WO01/02545)、非PTS蔗糖摄取基因(csc，EP1149911A)和蔗糖同化基因scrAB操纵子，美国专利号7,179,623)。
编码参与能量代谢的蛋白质的基因的实例包括转氢酶基因(pntAB，美国专利号5,830,716)和细胞色素bo型氧化酶基因(cyoB，EP1070376A)。
此外，用于赋予或增强生产有用物质如L-氨基酸的能力的方法的实例包括例如修饰细菌以使磷酸酮醇酶的活性增加的方法(WO2006/016705)。因此，本发明的细菌可以被修饰，使得磷酸酮醇酶的活性增加。该方法对于赋予或增强产生谷氨酸家族的L-氨基酸，例如L-谷氨酸的能力尤其有效。磷酸酮醇酶的实例包括D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶和果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶。可以增强D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶活性和果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性中的任一种，或者可以增强二者。
术语“D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶活性”是指消耗磷酸以释放一分子H2O将木酮糖-5-磷酸转化成甘油醛-3-磷酸盐和乙酰磷酸盐的活性。该活性可以通过Goldberg,M.等人(Methods Enzymol.,9,515-520,1996)描述的方法或由L.Meile(J.Bacteriol.,183:2929-2936,2001)描述的方法测量。D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶的实例包括属于醋杆菌属(Acetobacter)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、硫杆菌属(Thiobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、甲基球菌属(Methylococcus)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)和纤维杆菌属(Fibrobacter)的细菌和属于假丝酵母属、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、毕赤酵母属、耶氏酵母属、汉逊酵母(Hansenula)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、毛孢子菌属(Trichosporon)和Wingea的酵母。在WO 2006/016705中公开了D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶的具体实例和编码它们的基因。
术语“果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性”是指通过消耗磷酸释放一分子H2O而将果糖-6-磷酸转化为赤藓糖-4-磷酸盐和乙酰磷酸盐的活性。该活性可以通过Racker,E.(MethodsEnzymol.,5,276-280,1962)描述的方法或由L.Meile(J.Bacteriol.,183:2929-2936,2001)描述的方法来测量。果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶的实例包括属于醋杆菌属、双歧杆菌属、绿菌属(Chlorobium)、布鲁杆菌属(Brucella)、甲基球菌和加德纳菌属(Gardnerella)的细菌，以及属于红酵母属、假丝酵母属和酵母属的酵母。在WO2006/016705中公开了果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶及其编码基因的具体实例。
D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶活性和果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶活性两者也可以通过单一酶(即D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶/果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶)保留。
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)JCM1217的磷酸酮醇酶基因(xfp基因)的核苷酸序列和由该基因编码的磷酸酮醇酶(Xfp蛋白质)的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:13和14。
用于育种L-氨基酸生产细菌的基因和蛋白质可以分别具有例如已知基因和蛋白质的核苷酸序列和氨基酸序列，如上面列举的那些。此外，用于育种L-氨基酸生产细菌的基因和蛋白质可以分别是已知基因和蛋白质的保守变体，例如上面列举的那些。具体地说，例如，用于育种L-氨基酸生产细菌的基因各自可以是编码蛋白质的基因，所述蛋白质具有已知蛋白质的氨基酸序列，但是包括一个或几个位置处一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、***或添加，只要保持其初始功能即可。对于基因和蛋白质的保守变体，关于后面提到的C4-二羧酸摄取载体基因和C4-二羧酸摄取载体的保守变体的描述加以必要的变更可以适用。
<1-2>增强C4-二羧酸摄取载体活性
已经修饰了本发明的细菌，使得C4-二羧酸摄取载体的活性增加。本发明的细菌经特异性修饰，从而与未修饰菌株相比，C4-二羧酸摄取载体的活性增加。本发明的细菌可以通过修饰具有L-氨基酸生产能力的细菌使得C4-二羧酸摄取载体的活性增加而获得。本发明的细菌也可以通过如下获得：修饰细菌，使得C4-二羧酸摄取载体的活性增加，然后赋予或增强L-氨基酸生产能力。本发明的细菌也可以是经修饰而增加C4-二羧酸摄取载体的活性来获得L-氨基酸生产能力的细菌。根据需要，本发明的细菌可以具有如上所述的由L-氨基酸生产细菌所具有，并且经修饰而使C4-二羧酸摄取载体的活性增加的此类性质。例如，可以对本发明的细菌进行修饰，使得磷酸酮醇酶的活性增加。构成本发明的细菌的修饰可以任意的顺序进行。
通过修饰细菌使得C4-二羧酸摄取载体的活性增加，可以改善细菌的L-氨基酸生产能力，也就是说，可以增加通过使用细菌产生L-氨基酸。特别地，预期通过修饰细菌以使C4-二羧酸摄取载体的活性增加，在L-天冬氨酸生产条件下，可以改善L-天冬氨酸作为副产物生产的条件下细菌的L-氨基酸生成能力，也就是说，可以提高通过使用细菌生产L-氨基酸。“增加L-氨基酸的生产”的实例包括培养基中L-氨基酸的累积量的改善(增加)。也就是说，由于C4-二羧酸摄取载体如DctA蛋白的活性增加，更具体地，由于C4-二羧酸摄取载体基因如dctA基因的表达增加，例如，可以改善(增加)培养基中L-氨基酸如L-谷氨酸的积累量。此外，特别地，预期通过修饰细菌使得C4-二羧酸摄取载体的活性增加，可以减少L-天冬氨酸的副产物。
以下，对C4-二羧酸摄取载体和编码它们的基因进行说明。
术语“C4-二羧酸摄取载体”是指具有C4-二羧酸摄取活性的蛋白质。术语“C4-二羧酸摄取活性”是指从细胞外到细胞内摄取C4-二羧酸(具有4个碳原子的羧酸)的活性。C4-二羧酸的实例包括天冬氨酸。编码C4-二羧酸摄取载体的基因也称为“C4-二羧酸摄取载体基因”。
C4-二羧酸摄取载体基因的实例包括dctA基因、dcuA基因和dcuB基因。由dctA基因、dcuA基因和dcuB基因编码的蛋白质也分别称为“DctA蛋白”、“DcuA蛋白”和“DcuB蛋白”。所有这些蛋白质都具有天冬氨酸摄取活性。在本发明中，可以增加一种C4-二羧酸摄取载体的活性，或者可以增加两种以上的C4-二羧酸摄取载体的活性。也就是说，活性增加的C4-二羧酸摄取载体可以具体由选自DctA蛋白质、DcuA蛋白质和DcuB蛋白质的一种或多种蛋白质组成。可以通过例如增加C4-二羧酸摄取载体基因的表达来增加C4-二羧酸摄取载体的活性。也就是说，表述“C4-二羧酸摄取载体的活性增加”可以意味着例如，C4-二羧酸摄取载体基因的表达增加。表述“C4-二羧酸摄取载体的活性增加”也可以意味着特别地，例如增加选自dctA基因、dcuA基因和dcuB基因的一种或多种基因的表达。
C4-二羧酸摄取载体基因的实例包括各种生物体的基因，如属于肠杆菌科的细菌和棒状杆菌细菌。源自各种生物体的C4-二羧酸摄取载体基因的核苷酸序列和由其编码的C4-二羧酸摄取载体的氨基酸序列可以从例如NCBI等公共数据库获得。dctA基因的具体实例包括例如谷氨酸棒杆菌的dctA基因(NCgl2506)和大肠杆菌的dctA基因。dcuA基因的具体实例包括例如大肠杆菌的dcuA基因。dcuB基因的具体实例包括例如大肠杆菌的dcuB基因。谷氨酸棒杆菌2256(ATCC 13869)的dctA基因(NCgl2506)的核苷酸序列和由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:15和16中。大肠杆菌K-12MG1655的dctA基因(NCBI GeneID:948039)和由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列分别示于SEQID NO:17和18中。大肠杆菌K-12MG1655的dcuA基因(NCBI GeneID:948659)和由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO:19和20中。大肠杆菌K-12MG1655的dcuB基因(NCBI GeneID:948641)和由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO:21和22。也就是说，C4-二羧酸摄取载体基因可以是例如具有上述例示的任何C4-二羧酸摄取载体基因的核苷酸序列的基因，如以SEQ ID NO:15、17、19或21所示的核苷酸序列。此外，C4-二羧酸摄取载体可以是例如具有上述例示的任何C4-二羧酸摄取载体的氨基酸序列的蛋白质，如以SEQ ID NO:16、18、20或22所示的氨基酸序列。表述“基因或蛋白质具有核苷酸或氨基酸序列”是指除非另有说明，基因或蛋白质包含核苷酸或氨基酸序列，以及还包括基因或蛋白质由核苷酸或氨基酸序列组成的情况。
C4-二羧酸摄取载体基因可以是上述例示的任何C4-二羧酸摄取载体基因的变体(例如具有如SEQ ID NO:15、17、19或21所示的核苷酸序列的基因)只要保持其原来的功能即可。类似地，C4-二羧酸摄取载体可以是上面列举的任何C4-二羧酸摄取载体的变体(例如，具有以SEQ ID NO:16、18、20或22所示氨基酸序列的蛋白质)，只要保持其原来的功能即可。保持其初始功能的此类变体也称为“保守变体”。术语“dctA基因”、“dcuA基因”和“dcuB基因”不仅分别包括上文例示的dctA基因、dcuA基因和dcuB基因，还包括其保守变体。类似地，术语“DctA蛋白”、“DcuA蛋白”和“DcuB蛋白”不仅分别包括上面列举的DctA蛋白、DcuA蛋白和DcuB蛋白，还包括其保守变体。保守变体的实例包括例如上述例示的C4-二羧酸摄取载体基因和C4-二羧酸摄取载体的同源物和人工修饰形式。
表述“保持初始功能”是指基因或蛋白质的变体具有对应于初始基因或蛋白质的功能(如活性或性质)的功能(如活性或性质)。用于基因的表述“保持初始功能”是指基因的变体编码保持初始功能的蛋白质。也就是说，用于C4-二羧酸摄取载体基因的表述“保持初始功能”是指该基因的变体编码具有C4-二羧酸摄取活性的蛋白质，如天冬氨酸摄取活性。此外，用于C4-二羧酸摄取载体的表述“保持初始功能”是指蛋白质的变体具有C4-二羧酸摄取活性，如天冬氨酸摄取活性。
蛋白质的C4-二羧酸摄取活性可以通过例如用C4-二羧酸温育表达蛋白质的细菌细胞并测量C4-二羧酸对细胞的蛋白质依赖性摄取来测量。
下面将说明保守变体的实例。
C4-二羧酸摄取载体基因的同源物或C4-二羧酸摄取载体的同源物可以从公共数据库中容易地获得，例如通过使用上文例示的C4-二羧酸摄取载体基因的任何核苷酸序列或上文例示的任何氨基酸序列作为查询序列进行BLAST搜索或FASTA搜索进行。此外，可以通过例如使用各种生物体的染色体作为模板的PCR获得C4-二羧酸摄取载体基因的同源物，并且基于这些已知的C4-二羧酸摄取载体基因的任何核苷酸序列作为引物制备寡核苷酸酸。
C4-二羧酸摄取载体基因可以是编码蛋白质的基因，所述蛋白质具有任何上述氨基酸序列(例如SEQ ID NO:16、18、20或22所示的氨基酸序列)，但包括一个或几个位置处的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、***和/或添加，只要保持初始功能即可。例如，可以延长或缩短编码的蛋白质的N末端和/或C末端。尽管上文提及的术语“一个或几个”所指的数字可以根据蛋白质的三维结构中的氨基酸残基的位置或氨基酸残基的类型而不同，具体地，例如它是1至50、1至40或1至30，优选1至20、更优选1至10、还更优选1至5、特别优选1至3。
上述取代、缺失、***和/或添加一个或几个氨基酸残基是保持蛋白质正常功能的保守突变。保守突变的典型实例是保守取代。保守取代是下述突变，其中如果取代位点是芳香族氨基酸，则在Phe、Trp和Tyr之间相互取代；如果它是疏水性氨基酸，则在Leu、Ile和Val中相互取代；如果它是极性氨基酸，则Gln和Asn之间相互取代；如果它是碱性氨基酸，则在Lys、Arg和His中相互取代；如果它是酸性氨基酸，则在Asp和Glu之间相互取代；并且如果它是具有羟基的氨基酸，则在Ser和Thr之间相互取代。作为被视为保守取代的取代，具体而言，可以举出：从Ala向Ser或Thr的取代、从Arg向Gln、His或Lys的取代、从Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代、从Asp向Asn、Glu或Gln的取代、从Cys向Ser或Ala的取代、从Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代、从Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代、从Gly向Pro的取代、从His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的取代、从Ile向Leu、Met、Val或Phe的取代、从Leu向Ile、Met、Val或Phe的取代、从Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的取代、从Met向Ile、Leu、Val或Phe的取代、从Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代、从Ser向Thr或Ala的取代、从Thr向Ser或Ala的取代、从Trp向Phe或Tyr的取代、从Tyr向His、Phe或Trp的取代及从Val向Met、Ile或Leu的取代。另外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、***、或添加也包含因基于基因来源的生物体的个体差、种类的不同的情况等天然产生的突变(突变体或变体)。
C4-二羧酸摄取载体基因可以是编码具有与任何前述氨基酸序列的总氨基酸序列显示例如50％以上、65％以上、80％以上、优选90％以上、更优选为95％以上，仍更优选97％以上，特别优选为99％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质的基因，只要保持初始功能即可。在本说明书中，“同源性”是指“同一性”。
C4-二羧酸摄取载体也可以为在严格的条件下与可由任何前述核苷酸序列(例如以SEQ ID NO:15、17、19、或21所示的核苷酸序列)制备的探针，例如与任何上述核苷酸序列的部分或整个序列互补的序列杂交的DNA，只要保持初始功能。术语“严格的条件”是指可形成所谓的特异性杂交且未形成非特异性杂交的条件。若示出一个例子，则可以举出：同源性较高的DNA彼此，例如具有50％、65％、或80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、更优选97％以上、特别优选99％以上的同源性的DNA彼此杂交，同源性比其低的DNA彼此不杂交的条件、或者通常的Southern杂交的清洗的条件，即在相当于60℃、1×SSC、0.1％SDS、优选60℃、0.1×SSC、0.1％SDS、更优选68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度及温度下清洗1次、优选2～3次的条件。
如上所述，用于上述杂交的探针可以为基因的互补序列的一部分。如上所述的探针可以通过以基于公知的基因序列制作的寡核苷酸为引物，以含有任何前述基因的DNA片段为模板的PCR来制作。例如，可以使用具有约300bp长度的DNA片段作为探针。特别地，在使用300bp左右的长度的DNA片段作为探针的情况下，作为杂交的清洗的条件，可以举出50℃、2×SSC、0.1％SDS。
此外，由于密码子的简并性因宿主而异，C4-二羧酸摄取载体基因中的任意密码子可以用相应的等价密码子替换。也就是说，C4-二羧酸摄取载体基因可以是由于遗传密码的简并性而在上面例举的任何C4-二羧酸摄取载体基因的变体。例如，C4-二羧酸摄取载体基因可以是经修饰的基因，使得其具有根据要使用的宿主中密码子频率的最佳密码子。
可以通过例如使用数学算法测定两种序列间的序列同一性的百分比。此类数学算法的非限制性实例包括Myers和Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法、Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的用于搜索同源性的方法、和Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264的算法的修改形式，诸如记载于Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877的算法。
通过使用基于此类数学算法的程序，可以实施用于测定序列同一性的序列比较(即比对)。程序可以由计算机适当执行。此类程序的实例包括但不限于PC/Gene程序(可购自Intelligenetics,Mountain View,Calif.)的CLUSTAL、ALIGN程序(Version 2.0)、和Wisconsin遗传学软件包，第8版(可购自Genetics Computer Group(GCG),575ScienceDrive,Madison,Wis.,USA)的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和TFASTA。可以例如通过使用初始参数实施使用这些程序的比对。CLUSTAL程序充分记载于Higgins et al.(1988)Gene73:237-244(1988),Higgins et al.(1989)CABIOS 5:151-153,Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90,Huang et al.(1992)CABIOS 8:155-65及Pearson etal.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331。
为了获得与靶核苷酸序列同源的核苷酸序列，特别地，例如可以通过使用具有得分100和字长度12的BLASTN程序实施BLAST核苷酸搜索。为了获得与靶蛋白同源的氨基酸序列，特别地，例如可以通过使用具有得分50和字长度3的BLASTX程序实施BLAST蛋白质搜索。关于BLAST核苷酸搜索和BLAST蛋白质搜索，参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。另外，为了比较目的，可以使用缺口BLAST(BLAST 2.0)以获得包含缺口的比对。另外，可以使用PSI-BLAST以实施用于检测序列间的远离关系的重复搜索。关于缺口BLAST和PSI-BLAST，参见Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389。在使用BLAST、缺口BLAST、或PSI-BLAST时，可以使用每种程序(例如对于核苷酸序列为BLASTN，并且对于氨基酸序列为BLASTX)的初始参数。也可以手动实施比对。
两种序列间的序列同一性以在比对两种序列，使得彼此最大符合时两种序列中匹配的残基的比率计算。
关于基因和蛋白质的保守变体的上述描述可以加以必要的修改适用于任意蛋白质的变体，如L-氨基酸生物合成***酶和编码它们的基因。
<1-3>提高蛋白质活性的方法
以下，说明增加C4-二羧酸摄取载体等蛋白质的活性的方法。
表述“蛋白质的活性增加”表示与非修饰菌株相比，蛋白质的活性增加。具体地说，表述“蛋白质的活性增加”是指与未修饰菌株相比，每个细胞的蛋白质的活性增加。本文使用的术语“非修饰菌株”是指未经修饰而增加目标蛋白的活性的对照菌株。未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。非修饰菌株的具体实例包括细菌物种的各自类型菌株。未修饰菌株的具体实例还包括上文关于细菌描述示例的菌株。也就是说，在一个实施方案中，与一类菌株，即本发明的细菌所属物种的类型菌株相比，可以增加蛋白质的活性。在另一个实施方案中，与谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株相比，蛋白质的活性也可以增加。在另一个实施方案中，与谷氨酸棒杆菌2256菌株(ATCC 13869)相比，蛋白质的活性也可以增加。在另一个实施方案中，与大肠杆菌K-12 MG1655株相比，蛋白质的活性也可以增加。在另一个实施方案中，与菠萝泛菌AJ13355菌株相比，蛋白质的活性也可以增加。“蛋白质的活性增加”的状态也可以表示为“蛋白质的活性增强”。更具体地，表述“蛋白质的活性增加”可以意味着与非修饰菌株相比，每个细胞的蛋白质的分子数目增加，和/或蛋白质的每个分子的功能增加。也就是说，表述“蛋白质的活性增加”中的术语“活性”不限于蛋白质的催化活性，而是也可以指编码蛋白质的基因的转录量(即，mRNA的量)蛋白质或蛋白质的翻译量(即蛋白质的量)。此外，“蛋白质的活性增加”的状态不仅包括目标蛋白质的活性在固有具有目标蛋白质的活性的菌株中增加的状态，而且还包括在对不固有地具有目标蛋白质活性的菌株赋予目标蛋白质的活性的状态。此外，只要蛋白质的活性最终增加，可以减弱和/或消除宿主中固有地含有的目标蛋白质的活性，然后可以对宿主赋予适当类型的目标蛋白质。
蛋白质的活性增加的程度没有特别限制，只要与非修饰菌株相比蛋白质的活性增加即可。蛋白质的活性可以增加到例如非修饰菌株的1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。此外，当未修饰的菌株不具有目标蛋白质的活性时，由于引入编码蛋白质的基因而产生蛋白质就足够了，例如蛋白质可以在可测量到其活性的程度上产生。
用于增加蛋白质活性的修饰可以通过例如增加编码蛋白质的基因的表达来实现。表达“基因表达增加”是指与未修饰菌株如野生型菌株和亲本菌株相比，基因的表达增加。具体而言，表述“基因表达增加”是指与未修饰菌株相比，每个细胞的基因的表达量增加。更具体地，表述“基因表达增加”可以意味着基因的转录量(即mRNA的量)增加，和/或基因的翻译量(即从基因表达的蛋白质的量)增加。“基因的表达增加”的状态也可以称为“基因的表达增强”。基因的表达可以增加到例如非修饰菌株的1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。此外，“基因表达增加”的状态不仅包括在固有地表达目标基因的菌株中目标基因的表达量增加的状态，而且还包括将基因导入到不固有地表达目标基因的菌株中并且在其中表达的状态。也就是说，措辞“基因的表达增加”也可以意味着例如将目标基因导入不具有该基因的菌株中，并且在其中表达。
可以通过例如增加基因的拷贝数来增加基因的表达。
可以通过将基因导入宿主的染色体增加基因的拷贝数。可以通过例如使用同源重组(Miller,J.H.,Experiments in Molecular Genetics,1972,Cold Spring HarborLaboratory)将基因导入染色体中。使用同源重组的基因转移方法的实例包括例如使用线性DNA的方法，例如Red驱动的整合(Datsenko,K.A.,and Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-6645(2000))，使用含有温度敏感性复制起点的质粒的方法，使用能够接合转移的质粒的方法，使用不具有在宿主中发挥功能的复制起点的***载体的方法，以及使用噬菌体的转导方法。可以仅引入一个拷贝或两个以上的基因拷贝。例如，通过使用在染色体上以多个拷贝存在的序列作为靶标进行同源重组，可将多个拷贝的基因导入染色体。以多个拷贝存在于染色体上的此类序列的实例包括重复DNA和位于转座子两端的反向重复序列。或者，可以通过使用染色体上适当的序列，如对于生产目标物质不必需的基因作为靶标来进行同源重组。此外，也可以使用转座子或Mini-Mu(日本专利公开(Kokai)号2-109985，美国专利号5,882,888，EP805867B1)将基因随机引入染色体。
可以使用具有与全基因或其一部分互补的序列的探针通过Southern杂交，使用基于该基因序列制备的引物进行PCR，等等确认靶基因对染色体的导入。
此外，还可以通过将含有该基因的载体引入宿主中来增加基因的拷贝数。例如，可以通过将含有靶基因的DNA片段与在宿主中发挥功能的载体连接来构建基因的表达载体，并用表达载体转化宿主来增加基因的拷贝数。含有靶基因的DNA片段可以通过例如使用具有目标基因的微生物的基因组DNA作为模板的PCR获得。作为载体，可以使用在宿主细胞中自主复制的载体。载体优选为多拷贝载体。此外，载体优选具有用于选择转化体的抗生素抗性基因等标志物。此外，载体可以具有用于表达引入的基因的启动子和/或终止子。载体可以是例如源自细菌质粒的载体、源自酵母质粒的载体、源自噬菌体的载体、粘粒、噬菌粒等。在肠杆菌科细菌如大肠杆菌中自主复制的载体的具体实例包括，例如pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29(所有这些可购自Takara Bio)、pACYC184、pMW219(NIPPON GENE)、pTrc99A(Pharmacia)、pPROK系列载体(Clontech)、pKK233-2(Clontech)、pET系列载体(Novagen)、pQE系列载体(QIAGEN)、pCold TF DNA(Takara Bio)、pACYC系列载体、和宽宿主谱载体RSF1010。在棒状杆菌细菌中可自主复制的载体的具体实例包括例如pHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；pAM330(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；通过改善这些并且具有药物抗性基因获得的质粒；质粒pCRY30(日本专利公开(Kokai)号3-210184)；质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、和pCRY3KX(日本专利公开(Kokai)号2-72876和美国专利号5,185,262)；质粒pCRY2和pCRY3(日本专利公开(Kokai)号1-191686)；pAJ655、pAJ611、和pAJ1844(日本专利公开(Kokai)号58-192900)；pCG1(日本专利公开(Kokai)号57-134500)；pCG2(日本专利公开(Kokai)号58-35197)；pCG4和pCG11(日本专利公开(Kokai)号57-183799)；pVK7(日本专利公开(Kokai)号10-215883)；pVK9(US2006-0141588)；pVC7(日本专利公开(Kokai)号9-070291)；pVS7(WO2013/069634)。
当引入基因时，该基因被宿主以可表达方式含有是足够的。具体地说，基因被宿主含有以使其在宿主中发挥功能的启动子的控制下表达是足够的。启动子没有特别限制，只要其在宿主中发挥功能。术语“在宿主中发挥功能的启动子”是指在宿主中显示启动子活性的启动子。启动子可以是源自宿主的启动子，或异源启动子。启动子可以是待引入的基因的天然启动子或另一基因的启动子。作为启动子，例如还可以使用如下所述的此类更强的启动子。
用于终止基因转录的终止子可以位于基因的下游。终止子没有特别限制，只要它在宿主中发挥功能。终止子可以是源自宿主的终止子，或异源终止子。终止子可以是待引入的基因的天然终止子，或另一基因的终止子。终止子的具体实例包括例如T7终止子、T4终止子、fd噬菌体终止子、tet终止子和trpA终止子。
可用于各种微生物的载体、启动子和终止子详细公开于"FundamentalMicrobiology Vol.8,Genetic Engineering,KYORITSU SHUPPAN CO.,LTD,1987"中，并且可以使用那些。
此外，当引入两个以上基因时，基因各自被宿主以可表达方式含有是足够的。例如，所有基因可以由单个表达载体或染色体携带。此外，基因可以由两个以上表达载体分开携带，或者由单个或两个以上表达载体和染色体分开携带。还可以引入由两个以上基因构成的操纵子。“引入两个以上的基因”的情况包括例如引入编码两种以上蛋白质(如酶)的相应基因的情况、引入编码构成单个蛋白质复合物(例如酶复合物)的两个以上亚基的相应基因，以及上述情况的组合。
要引入的基因没有特别限制，只要其编码在宿主中发挥功能的蛋白质即可。要引入的基因可以是源自宿主的基因，或者可以是异源基因。可以通过例如使用基于该基因的核苷酸序列设计的引物，并且使用具有该基因的生物体的基因组DNA，携带该基因的质粒等作为模板的PCR来获得要引入的基因。要引入的基因也可以例如基于该基因的核苷酸序列而完全合成(Gene,60(1),115-127(1987))。所获得的基因可以原样使用，或根据需要进行修饰后使用。基因可以通过已知技术进行修饰。例如，可以通过位点特异性突变方法将目标突变引入DNA的目标位点。也就是说，可以通过位点特异性突变方法修饰基因的编码区域，使得编码的蛋白质的特定位点包括氨基酸残基的取代、缺失、***和/或添加。位点特异性突变方法的实例包括使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,于PCR Technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton Press(1989)；Carter,P.,Meth.于Enzymol.,154,382(1987))和利用噬菌体的方法(Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.于Enzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et al.,Meth.于Enzymol.,154,367(1987))。
顺便提及，当蛋白质用作由多个亚基组成的复合物发挥功能时，可以修饰多个亚基的部分或全部，只要蛋白质的活性最终增加即可。也就是说，例如，通过增加基因的表达来增加蛋白质的活性时，可以增强编码亚基的多个基因的部分或全部的表达。通常优选增强编码亚基的所有多个基因的表达。此外，构成复合物的亚基可以源自单种生物体或两种或更多种生物体，只要该复合物具有目标蛋白质的功能即可。也就是说，例如，可以将编码多个亚基的相同生物体的基因导入宿主，或者可以将编码多个亚基的不同生物体的基因引入宿主中。
此外，通过改善基因的转录效率，可以增加基因的表达。此外，还可以通过改善基因的翻译效率来增加基因的表达。基因的转录效率和基因的翻译效率可以通过例如修饰基因的表达调控序列来改善。术语“表达控制序列”统称为影响基因表达的位点。表达调控序列的实例包括例如启动子、Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合位点(RBS))和RBS与起始密码子之间的间隔区。可以通过使用启动子搜索载体或基因分析软件如GENETYX鉴定表达控制序列。这些表达调控序列可以通过例如使用温度敏感载体的方法或Red驱动整合法(WO2005/010175)进行修饰。
通过例如用较强的启动子替换染色体上基因的启动子，可以改善基因的转录效率。术语“较强的启动子”是指与基因的固有存在的野生型启动子相比，提供了基因的改进转录的启动子。较强启动子的实例包括例如已知的高表达启动子如T7启动子、trp启动子、lac启动子、thr启动子、tac启动子、trc启动子、tet启动子、araBAD启动子、rpoH启动子、msrA启动子、Pm1启动子(源自双歧杆菌属)、PR启动子和PL启动子。可用于棒状杆菌细菌的较强启动子的实例包括例如人工修饰的P54-6启动子(Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,674-679(2000))、在棒状杆菌细菌中用乙酸、乙醇、丙酮酸等可诱导的pta、aceA、aceB、adh和amyE启动子，或cspB、SOD和tuf(EF-Tu)启动子(其是能够在棒状杆菌细菌中提供大表达量的有力启动子)(Journal of Biotechnology,104(2003)311-323；Appl.Environ.Microbiol.,2005Dec；71(12):8587-96)，以及lac启动子、tac启动子和trc启动子。此外，作为较强的启动子，也可以通过使用各种报告基因获得高活性型的现有启动子。例如，通过使启动子区域中的-35和-10区域更接近共有序列，可以增强启动子的活性(WO00/18935)。高活性型启动子的实例包括各种tac样启动子(Katashkina JI等人，俄罗斯联邦专利申请号2006134574)和pnlp8启动子(WO2010/027045)。Goldstein et al.(Prokaryotic Promoters in Biotechnology,Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))等文章中描述了用于评估启动子的强度的方法和强启动子的实例。
基因的翻译效率可以通过例如用较强的SD序列替换染色体上的基因的Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合位点(RBS))来改善。“较强的SD序列”是指与基因的固有存在的野生型SD序列相比提供了mRNA的改进翻译的SD序列。较强的SD序列的实例包括例如源自噬菌体T7的基因10的RBS(Olins P.O.et al,Gene,1988,73,227-235)。此外，已知在RBS和起始密码子之间的间隔区域中，特别是在起始密码子(5'-UTR)的紧邻上游的序列中的几个核苷酸的取代、***或缺失显著影响mRNA的稳定性和翻译效率，因此，也可以通过改变它们来改善基因的翻译效率。
基因的翻译效率也可以通过例如修饰密码子来改善。例如，通过用更经常使用的同义密码子替换基因中存在的稀有密码子，可以提高基因的翻译效率。也就是说，可以修饰要引入的基因，例如，以便根据在待使用的宿主中观察到的密码子的频率包含最佳密码子。密码子可以通过例如位点特定突变方法替换。或者，可以完全合成其中替换目标密码子的基因片段。“密码子选择数据库”(http://www.kazusa.or.jp/codon；Nakamura,Y.et al,Nucl.Acids Res.,28,292(2000))中公开了各种生物体中的密码子的频率。
此外，还可以通过扩增增加基因表达的调节剂，或者减少或减弱降低基因表达的调节剂来增加基因的表达。
用于增加如上文提及的基因表达的此类方法可以独立使用或以任意组合使用。
此外，增加蛋白质活性的修饰也可以通过例如提高酶的比活性来实现。比活性的增强还包括对反馈抑制的脱敏。也就是说，当蛋白质受到代谢物的反馈抑制时，可以通过使细菌含有编码已经对反馈抑制脱敏的突变蛋白的基因来增加蛋白质的活性。在本发明中，除非另有说明，术语“对反馈抑制的脱敏”包括反馈抑制的完全消除和反馈抑制的减弱。此外，“对反馈抑制脱敏”的状态，即反馈抑制被消除或减弱的状态，也可以称为“耐受反馈抑制”。可以通过例如搜索各种生物体来获得显示增强的比活性的蛋白质。此外，通过在现有蛋白质中引入突变，也可以获得高活性型的现有蛋白质。要引入的突变可以是例如在蛋白质的一个或几个位置上的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、***或添加。可以通过例如如上文提及的此类位点特定突变方法引入突变。突变也可以通过例如诱变处理来引入。诱变处理的实例包括X射线照射、紫外线照射和N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)等突变剂的处理。此外，可以通过用羟胺在体外直接处理DNA来诱导随机突变。可以独立地使用比活性的增强，或者可以与如上文所述的用于增强基因表达的此类方法以任意组合使用。
转化方法没有特别限定，并且可以使用常规已知的方法。可以使用例如用氯化钙处理受体细胞以增加其对DNA的通透性的方法，其已经报告用于大肠杆菌K-12菌株(Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,1970,53,159-162)，以及从生长阶段的细胞中制备感受态细胞，随后用DNA转化的方法，其已经报告用于枯草芽孢杆菌(Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E.,Gene,1977,1:153-167)。或者，还可以使用将DNA受体细胞制成原生质体或原生质球(其可以容易地摄取重组DNA)，然后将重组DNA引入DNA受体细胞中的方法，已知其适用于枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母(Chang,S.and Choen,S.N.,1979,Mol.Gen.Genet.,168:111-115；Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,1978,Nature,274:398-400；Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:1929-1933)。此外，还可以使用针对棒状杆菌细菌报告的电脉冲方法(日本专利公开(Kokai)号2-207791)。
可以通过测定蛋白质的活性来确认蛋白质的活性的增加。
通过确认编码蛋白质的基因的表达增加也可以确认蛋白质的活性的增加。可以通过确认基因的转录量的增加或通过确认从该基因表达的蛋白质的量的增加来确认基因表达的增加。
可以通过比较从基因转录的mRNA与非修饰株如野生型菌株或亲本菌株的mRNA的量来确认基因的转录量的增加。用于评估mRNA量的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR等(Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。mRNA的量可以增加到例如非修饰株的mRNA量的1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。
通过使用抗体的Western印迹法(Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)可以确认蛋白质量的增加。蛋白质的量(如每个细胞的蛋白质的分子数)可以增加到例如非修饰菌株的蛋白质量的1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。
除增强C4二羧酸摄取载体活性以外，用于提高蛋白质活性的上述方法可用于增强任意蛋白质如L-氨基酸生物合成酶的活性，以及增强任意基因如编码那些任意蛋白质的基因的表达。
<1-4>降低蛋白质活性的方法
以下，说明降低蛋白质活性的方法。
表述“蛋白质的活性降低”是指与未修饰的菌株相比，蛋白质的活性降低。具体地说，表述“蛋白质的活性降低”是指与未修饰的菌株相比，每个细胞的蛋白质的活性降低。本文使用的术语“非修饰菌株”是指未被修饰以使得目标蛋白的活性降低的对照菌株。未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。非修饰菌株的具体实例包括细菌种类的各自菌株。未修饰菌株的具体实例还包括上文关于细菌描述示例的菌株。也就是说，在一个实施方案中，与类型菌株，即本发明的细菌所属物种的类型菌株相比，蛋白质的活性可以降低。在另一个实施方案中，与谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株相比，蛋白质的活性也可以降低。在另一个实施方案中，与谷氨酸棒杆菌2256菌株(ATCC 13869)相比，蛋白质的活性也可以降低。在另一个实施方案中，与大肠杆菌K-12 MG1655株相比，蛋白质的活性也可以降低。在另一个实施方案中，与菠萝泛菌AJ13355菌株相比，蛋白质的活性也可以降低。“蛋白质的活性降低”的状态也包括蛋白质的活性完全消失的状态。更具体地，表述“蛋白质的活性降低”可以意味着与非修饰的菌株相比，每个细胞的蛋白质的分子数目减少，和/或蛋白质的每个分子的功能降低。也就是说，表述“蛋白质的活性降低”中的术语“活性”不限于蛋白质的催化活性，而是也可以指编码蛋白质的基因的转录量(即mRNA的量)或蛋白质的翻译量(即蛋白质的量)。“每个细胞的蛋白质分子的数目减少”的状态也包括蛋白质完全不存在的状态。“蛋白质的每个分子的功能降低”的状态也包括每个蛋白质分子的功能完全消失的状态。蛋白质活性降低的程度没有特别限制，只要与非修饰菌株相比活性降低即可。蛋白质的活性可以降低至未修饰菌株的活性的例如50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少或0％。
用于降低蛋白质活性的修饰可以通过例如降低编码蛋白质的基因的表达来实现。表述“基因表达减少”是指与未修饰的菌株如野生型菌株和亲本菌株相比，基因的表达降低。具体而言，表述“基因的表达减少”是指与未修饰的菌株相比，每个细胞的基因的表达降低。更具体地，表述“基因表达减少”可以意味着基因的转录量(即mRNA的量)减少，和/或基因的翻译量(即从基因表达的蛋白质的量)减少。“基因表达减少”的状态也包括完全不表达基因的状态。“基因表达减少”的状态也称为“基因的表达减弱”。基因的表达可以降低至未修饰菌株的表达的例如50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少或0％。
基因表达的减少可以是由于例如转录效率的降低、翻译效率的降低或它们的组合。通过修饰基因的表达控制序列，例如启动子、Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合位点(RBS))、以及基因的RBS和起始密码子之间的间隔区可以减少基因的表达。当修饰表达控制序列时，优选修饰表达控制序列的一个或多个核苷酸，更优选两个或更多个核苷酸，特别优选三个或更多个核苷酸。例如，通过用较弱的启动子替换染色体上基因的启动子，可以降低基因的转录效率。术语“较弱启动子”是指与基因的固有存在的野生型启动子相比，提供基因的减弱转录的启动子。较弱启动子的实例包括例如诱导型启动子。也就是说，诱导型启动子可以在非诱导条件下起作为较弱的启动子作用，例如不存在相应的诱导物的情况下。此外，可以缺失表达控制序列的部分或全部。基因的表达也可以通过例如操纵负责表达控制的因子来降低。负责表达控制的因子的实例包括负责转录或翻译控制的低分子(诱导剂、抑制剂等)、负责转录或翻译控制的蛋白质(转录因子等)、负责转录或翻译控制的核酸(siRNA等等)，等等。此外，还可以通过例如引入将基因表达降低到基因的编码区的突变来降低基因的表达。例如，可以通过用宿主中不常使用的同义密码子替换基因的编码区中的密码子来减少基因的表达。此外，例如，如下所述，由于基因的破坏可以降低基因表达。
用于降低蛋白质活性的修饰也可以通过例如破坏编码蛋白质的基因来实现。表达“将基因破坏”意味着基因被修饰而不产生能通常发挥功能的蛋白质。“不产生通常发挥功能的蛋白质”的状态包括蛋白质完全不从基因产生的状态，以及每分子的功能(如活性或性质)被降低或消除的蛋白质从基因产生。
可以通过例如缺失染色体上的基因来实现基因的破坏。术语“基因的缺失”是指缺失基因的编码区的部分或全部区域。此外，可以缺失整个基因，包括染色体上的基因编码区上游和下游的序列。要缺失的区域可以是任何区域，诸如N端区域(编码蛋白质的N端区域的区域)、内部区域或C端区域(编码蛋白质的C端区域的区域)，只要能降低蛋白质的活性即可。较长的区域的缺失通常可以更可靠地使基因失活。要缺失的区域可以是例如基因的编码区的总长度的10％以上，20％以上，30％以上，40％以上，50％以上，60％以上，70％以上，80％以上，90％以上，或95％以上。此外，优选地，从要缺失的区域的上游和下游的序列的阅读框是不相同的。阅读框的不一致可以导致要缺失的区域下游的移码。
基因的破坏也可以通过例如对染色体上基因的编码区引入氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)、一个或两个核苷酸残基的添加或缺失(移码突变)等等的突变获得(Journal of Biological Chemistry,272:8611-8617(1997)；Proceedings of theNational Academy of Sciences,USA,95 5511-5515(1998)；Journal of BiologicalChemistry,26 116,20833-20839(1991))。
基因的破坏也可以通过例如将另一个核苷酸序列***到染色体上的基因的编码区中来实现。***位点可以位于该基因的任何区域中，并且较长核苷酸序列的***通常可以更可靠地使基因失活。优选地，***位点上游和下游的序列的阅读框是不相同的。阅读框不一致可以导致要缺失的区域下游的移码。其它核苷酸序列没有特别限定，只要选择减少或消除编码的蛋白质的活性的序列，并且其实例包括标志物基因，如抗生素抗性基因，以及可用于生产目标物质的基因。
特别地，可以进行基因的破坏，使得编码的蛋白质的氨基酸序列被缺失。换句话说，降低蛋白质活性的修饰可以通过例如缺失蛋白质的氨基酸序列来实现，特别是修饰基因以编码缺失氨基酸序列的蛋白质。术语“蛋白质的氨基酸序列的缺失”是指蛋白质的氨基酸序列的部分或全部区域的缺失。此外，术语“蛋白质的氨基酸序列的缺失”是指初始氨基酸序列在蛋白质中消失，还包括将初始氨基酸序列改变为另一个氨基酸序列的情况。也就是说，例如，通过移码改变为另一个氨基酸序列的区域可以被认为是缺失区域。当蛋白质的氨基酸序列缺失时，蛋白质的总长度通常缩短，但是也可以存在蛋白质的总长度不变或延长的情况。例如，通过缺失基因的编码区域的部分或全部区域，可以在编码的蛋白质中缺失由缺失区域编码的区域。此外，例如，通过在基因的编码区域引入终止密码子，可以在编码的蛋白质中缺失导入位点的下游区域编码的区域。此外，例如，通过在基因的编码区域中的移码，可以在编码的蛋白质中缺失由移码区域编码的区域。关于缺失基因时要缺失的区域的位置和长度的上述描述可以加以必要修改适用于在蛋白质的氨基酸序列的缺失中要缺失的区域的位置和长度。
如上所述的染色体上基因的此类修饰可以通过如下获得，例如制备破坏型基因，所述破坏型基因经修饰而使得其不能产生通常发挥功能的蛋白质，并用含有破坏型基因的重组DNA转化宿主，以引起破坏型基因与染色体上野生型基因之间的同源重组，从而用破坏型基因替换染色体上的野生型基因。在该方法中，如果根据宿主的特征选择的标志物基因如营养缺陷型被包括在重组DNA中，则操作变得更容易。破坏型基因的实例包括缺失编码区的部分或全部区域的基因、包含错义突变的基因、包含无义突变的基因、包含移码突变的基因、以及引入了***序列如转座子或标志物基因的基因。由破坏型基因编码的蛋白质即便产生也具有与野生型蛋白质不同的构象，因此其功能减少或消除。已经建立了基于使用同源重组的基因取代的此类基因破坏，并且存在使用线性DNA的方法，如称为“Red驱动整合”的方法(Datsenko,K.A,and Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-6645(2000))，以及与源自λ噬菌体的切除***组合利用Red驱动整合的方法(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.,J.Bacteriol.,184:5200-5203(2002))(参见WO2005/010175)、使用具有温度敏感复制起点的质粒的方法、使用能够接合转移的质粒的方法、使用不具有在宿主中发挥功能的复制起点的***载体的方法(美国专利No.6,303,383，日本专利公开(Kokai)号5-007491)等等。
降低蛋白质活性的修饰也可以通过例如诱变处理来实现。诱变处理的实例包括X射线或紫外线的照射和用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)等突变剂进行处理。
如上文提及的用于降低蛋白质的活性的此类方法可以独立地或以任意组合使用。
当蛋白质作为由多个亚基组成的复合物发挥功能时，可以修饰多个亚基的部分或全部，只要蛋白质的活性最终降低即可。也就是说，例如，编码各个亚基的多个基因的一部分或全部可以被破坏，等等。此外，当存在蛋白质的多种同功酶时，可以减少多种同功酶的部分或全部活性，只要蛋白质的活性最终降低即可。也就是说，例如，编码各个同功酶的多个基因的部分或全部可以被破坏，等等。
可以通过测定蛋白质的活性来确认蛋白质活性的降低。
也可以通过确认编码蛋白质的基因的表达的降低来确认蛋白质的活性的降低。可以通过确认基因的转录量的减少或从该基因表达的蛋白质量的减少来确认基因表达的降低。
可以通过比较从基因转录的mRNA量与未修饰菌株的mRNA量来确认基因的转录量的降低。用于评估mRNA量的方法的实例包括Northern杂交、RT-PCR等(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。mRNA的量优选降低至未修饰菌株的量的例如50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少或0％。
可以通过使用抗体的Western印迹法(Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor(USA)2001)来确认蛋白质量的减少。蛋白质量(如每个细胞的蛋白质的分子数)优选降低至未修饰的菌株的例如50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。
可以通过根据用于破坏的手段确定基因的部分或全部的核苷酸序列、基因的限制酶图谱、全长等来确认基因的破坏。
用于降低如上文提及的蛋白质活性的上述方法可以适用于降低任意蛋白质，如催化从目标L-氨基酸的生物合成途径分支的反应以产生除目标L-氨基酸以外的化合物的酶的活性，以及降低任意基因如编码那些任意蛋白质的基因的表达。
<2>生产本发明的L-氨基酸的方法
本发明的方法是生产L-氨基酸的方法，其包括在培养基中培养本发明的细菌以在培养基和/或细菌的细胞中积累L-氨基酸，并自培养基和/或细菌的细胞收集L-氨基酸。本发明中生产的L-氨基酸是L-天冬氨酸以外的L-氨基酸。在本发明中，可以生产一种L-氨基酸，并且可以生产两种以上的L-氨基酸。
使用的培养基没有特别限制，只要本发明的细菌能在其中增殖，并且可以生产目标L-氨基酸。作为培养基，例如可以使用用于培养细菌如棒状杆菌细菌和肠杆菌科细菌的常见培养基。作为培养基，例如可以使用含有碳源、氮源、磷源和硫源的介质，以及根据需要选自其它各种有机成分和无机成分的成分的培养基。培养基成分的类型和浓度可以根据各种条件，如待使用的细菌的类型来适当确定。
碳源的具体实例包括糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、***糖、赤糖糊(blackstrap molasses)、淀粉的水解产物和生物质的水解产物，有机酸，如乙酸、延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸，醇如甘油、粗甘油和乙醇，以及脂族酸。作为碳源，可以优选使用植物来源的材料。植物的实例包括例如玉米、稻、小麦、大豆、甘蔗、甜菜和棉。植物来源的材料的实例包括例如根、茎、树干、枝、叶、花和种子等器官，包括它们的植物体以及这些植物器官的分解产物。植物来源的材料在其使用时的形式没有特别限制，并且它们可以以任何形式，如未加工的产品、果汁、研磨产物和纯化产物使用。戊糖如木糖、己糖如葡萄糖、或它们的混合物可以从例如植物生物质获得并使用。具体地说，这些糖可以通过对植物生物质进行处理，如蒸汽处理、用浓酸水解、用稀酸水解、用酶如纤维素酶进行水解、和碱处理而得到。由于半纤维素通常比纤维素更易水解，植物生物质中的半纤维素可以预先水解以释放戊糖，然后纤维素可被水解以产生己糖。此外，可以通过从己糖转化来提供木糖，例如通过对本发明的细菌赋予将己糖如葡萄糖转化为木糖的途径进行。作为碳源，可以使用单种碳源，或者可以组合使用2种以上的碳源。
氮源的具体实例包括例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐；胨、酵母提取物、肉提取物、大豆蛋白质分解物等有机氮源；氨、脲。可以将pH调节中所使用的氨气或氨水用作氮源。作为氮源，可以使用1种氮源，也可以组合使用2种或其以上的氮源。
磷酸源的具体实例包括例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐；焦磷酸等磷酸聚合物。作为磷酸源，可以使用1种磷酸源，也可以组合使用2种或其以上的磷酸源。
硫源的具体实例包括例如硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等无机硫化合物；半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸。作为硫源，可以使用1种硫源，也可以组合使用2种或其以上的硫源。
其它的各种有机成分及无机成分的实例包括例如氯化钠、氯化钾等无机盐类；铁、锰、镁、钙等微量金属类；维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酸酰胺、维生素B12等维生素类；氨基酸类；核酸类；含有这些的胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白质分解物等有机成分。作为其它的各种有机成分及无机成分，可以使用1种成分，也可以组合使用2种或其以上的成分。
此外，当使用需要氨基酸等实现其生长的营养缺陷型突变体时，优选向培养基提供需要的营养物。
此外，还优选例如限制培养基中生物素的量，或向培养基中加入表面活性剂或青霉素。
培养条件没有特别限制，只要本发明的细菌可以增殖，并且可以生产目标L-氨基酸。培养可以例如在用于培养细菌如棒状杆菌细菌和肠杆菌科细菌的常规条件下进行。培养条件可以根据所使用的细菌的类型等各种条件适当设置。
培养可以通过使用液体培养基进行。在培养时，可以在固体培养基如琼脂培养基上培养的本发明细菌可以直接接种到液体培养基中，或者可以将液体培养基中培养的本发明细菌作为种子培养物接种到液体培养基用于主培养。也就是说，培养可以作为种子培养和主培养分开进行。在此类情况下，种子培养和主培养的培养条件可以相同或可以不同。在培养开始时在培养基中包含的本发明细菌的量没有特别限制。主培养可以通过例如以1-50％(v/v)的量将种子培养液接种至主培养培养基进行。
培养可以以分批培养、补料分批培养、连续培养或这些的组合进行。在培养开始时使用的培养基也称为“起始培养基”。在补料分批培养或连续培养中供应到培养***(发酵罐)的培养基也称为“补料培养基”。此外，为了在补料分批培养或连续培养中向培养***供给补料培养物也称为“补料”。此外，作为种子培养和主培养分别进行培养时，例如可以以分批培养的方式进行种子培养和主栽培养。或者，例如，种子培养可以作为分批培养进行，并且主培养可以作为补料分批培养或连续培养进行。
在本发明中，培养基成分各自可以包含在起始培养基、补料培养基或二者中。包含在起始培养基中的组分的类型可以与补料培养基中包含的组分的类型相同或不同。包含在起始培养基中的每种组分的浓度可以与补料培养基中所含组分的浓度相同或不同。此外，可以使用含有不同类型和/或不同浓度组分的两种以上的补料培养基。例如，当培养基间歇补料多次时，包含在补料培养基中的组分的类型和/或浓度对于每次补料可以相同或不同。
培养基中碳源的浓度没有特别限制，只要本发明的细菌能够增殖并产生L-氨基酸即可。培养基中碳源的浓度可以在不抑制L-氨基酸的产生的范围内尽可能高。作为初始浓度(起始培养基中的浓度)，培养基中碳源的浓度可以为例如1-30％(w/v)，优选为3-10％(w/v)。此外，可以根据需要将碳源另外供给到培养基。例如，碳源可以随发酵过程与碳源消耗成比例另外供给培养。
培养可以在例如需氧条件下进行。术语“需氧条件”是指液体培养基中的溶解氧浓度不低于用氧膜膜电极检测的检测极限的0.33ppm的条件，或者优选为液体培养基中的溶解氧浓度不低于1.5ppm的条件。氧浓度可以控制为例如饱和氧浓度的5至50％，优选约10％。具体而言，需氧条件下的培养可以通过通气培养、振荡培养、搅拌培养、或其组合进行。培养基的pH可以是例如3至10，优选4.0至9.5。在培养过程中，可以根据需要调节培养基的pH值。可以通过使用氨气、氨水、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁等各种碱性和酸性物质来调节培养基的pH。培养温度可以是例如20-45℃，优选25-37℃。培养期可以是例如10-120小时。培养可以继续进行，例如，直到培养基中所含的碳源被消耗，或直到本发明的细菌失去活性为止。通过在上述条件下培养本发明的细菌，L-氨基酸在培养基和/或细菌的细胞中积累。
此外，当生产L-谷氨酸时，可以通过使用调节为满足L-谷氨酸沉淀的条件的液体培养基，同时在培养基中沉淀L-谷氨酸来进行培养。沉淀L-谷氨酸的条件的实例包括例如pH 5.0-4.0，优选为pH 4.5-4.0，更优选为4.3-4.0，特别优选为pH4.0左右(EP1078989A)。
通过用于检测或鉴定化合物的已知方法可以确认L-氨基酸的生产。此类方法的实例包括例如HPLC、LC/MS、GC/MS和NMR。这些方法可以独立使用，也可以适当组合使用。
生产的L-氨基酸可以通过用于分离和纯化化合物的已知方法从发酵液中收集。此类方法的实例包括例如离子交换树脂法(Nagai,H.et al.,Separation Science andTechnology,39(16),3691-3710)、沉淀、膜分离(日本专利公开(Kokai)号9-164323和日本专利公开(Kokai)号9-173792)和结晶(WO2008/078448和WO2008/078646)。这些方法可以独立使用，也可以适当组合使用。当L-氨基酸积聚在细菌的细胞中时，例如可以用超声波等破坏细胞，可以通过离心从细胞破碎的悬浮液中除去细胞而获得上清液，L-氨基酸可以通过离子交换树脂法等从上清液中收集。要收集的L-氨基酸可以是游离化合物、其盐或其混合物。盐的实例包括例如硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐和钾盐。当产生L-谷氨酸时，要收集的L-谷氨酸可以具体为例如游离L-谷氨酸、L-谷氨酸钠(L-谷氨酸单钠盐，MSG)，L-谷氨酸铵(L-谷氨酸单铵盐)或这些的混合物。例如，通过向发酵液中加入酸以使其中所含的L-谷氨酸铵结晶，然后通过向晶体中加入等摩尔的氢氧化钠，可以获得L-谷氨酸单钠盐(MSG)。此外，可以在结晶之前和/或之后使用活性炭进行脱色(参见Tetsuya KAWAKITA,"Industrial Crystallization for Monosodium L-Glutamate.",Bulletin of theSociety of Sea Water Science,Japan,Vol.56:5)。L-谷氨酸单钠盐晶体可以用作例如鲜味调味料(umami seasoning)。L-谷氨酸单钠盐晶体也可以与核酸如鸟苷酸钠和肌苷酸钠(其也具有鲜味)一起使用。
当L-氨基酸在培养基中沉淀时，可通过离心，过滤等收集。在培养基中溶解的L-氨基酸结晶后，也可以将溶解在培养基中的L-氨基酸与培养基中沉淀的L-氨基酸一起分离。
除了L-氨基酸之外，收集的L-氨基酸可以含有细菌细胞、培养基成分、水分和细菌的副产物代谢物等成分。收集的L-氨基酸也可以以期望的程度纯化。收集的L-氨基酸的纯度可以是例如50％(w/w)或更高，优选85％(w/w)或更高，特别优选95％(w/w)或更高(JP1214636B,USP5,431,933,USP4,956,471,USP4,777,051,USP4,946,654,USP5,840,358,USP6,238,714,和US2005/0025878)。
实施例
以下，参照实施例对本发明进行更具体的说明。然而，本发明不限于这些实施例。
实施例：使用具有增强的C4-二羧酸摄取载体基因表达的谷氨酸棒杆菌菌株的谷氨酸生产培养
在本实施例中，通过使用谷氨酸棒杆菌的谷氨酸生产菌株进行谷氨酸生产，所述谷氨酸生产菌株导入了编码具有天冬氨酸摄取能力的C4二羧酸摄取载体的基因(Cg-dctA,Ec-dctA,Ec-dcuA,或Ec-dcuB)，并且评估了C4-二羧酸摄取载体基因的增强表达对谷氨酸生产的影响。
(1)材料
本实施例中使用的材料如下。
表1<使用的引物>
Figure BDA0001425805400000621
<使用的质粒>
pVK9(KmR；US2006-0141588)
pVK9-Cg-dctA(KmR；本申请)
pVK9-Ec-dctA(KmR；本申请)
pVK9-Ec-dcuA(KmR；本申请)
pVK9-Ec-dcuB(KmR；本申请)
<使用的菌株>
谷氨酸棒杆菌2256ΔsucAΔldhA yggB*(WO2014/185430)
谷氨酸棒杆菌2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9(本申请)
谷氨酸棒杆菌2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-Cg-dctA(本申请)
谷氨酸棒杆菌2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-Ec-dctA(本申请)
谷氨酸棒杆菌2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-Ec-dcuA(本申请)
谷氨酸棒杆菌2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-Ec-dcuB(本申请)
(2)质粒和菌株的构建
通过使用谷氨酸棒杆菌2256菌株(ATCC 13869)的基因组DNA作为模板，以及引物1和2进行PCR，扩增含有谷氨酸棒杆菌的dctA基因的DNA片段(Cg-dctA)。通过使用ClontechIn-fusion HD克隆试剂盒(TaKaRa Inc.)将得到的DNA片段和用BamHI和PstI消化的pVK9(US2006-0141588)相互连接，构建pVK9-Cg-dctA，其为Cg-dctA的表达质粒。
以相同的方式，通过使用大肠杆菌K-12 MG1655株(ATCC 47076)的基因组DNA作为模板，与引物3和4组合进行PCR以扩增含有大肠杆菌的dctA基因的DNA片段(Ec-dctA)，与引物5和6组合进行PCR以扩增含有大肠杆菌的dcuA基因的DNA片段(Ec-dcuA)，以及与引物7和8组合进行PCR以扩增含有大肠杆菌的dcuB基因的DNA片段(Ec-dcuB)，将得到的DNA片段各自与pVK9连接，构建pVK9-Ec-dctA、pVK9-Ec-dcuA、和pVK9-Ec-dcuB，其是那些基因的表达质粒。
将构建的质粒各自导入谷氨酸棒杆菌2256ΔsucAΔldhA yggB*菌株(WO2014/185430)，以构建具有增强的各种C4-二羧酸摄取载体基因表达的菌株。2256ΔsucAΔldhAyggB*菌株是源于谷氨酸棒杆菌2256菌株(ATCC 13869)的谷氨酸生产菌株。2256ΔsucAΔldhA yggB*菌株是ldhA和sucA基因缺陷的，并且在yggB基因中具有IS突变(V419::IS)。该突变体yggB基因(V419::IS)的核苷酸序列和由该基因编码的突变体YggB蛋白(V419::IS)的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:11和12中。
(3)谷氨酸生产培养
通过使用每种菌株进行谷氨酸生产培养。使用的培养基的组成示于表2。
表2：培养基组成
Figure BDA0001425805400000641
制备用KOH调节至pH8.0的上述组成的培养基，并通过高压灭菌器(115℃，10分钟)灭菌。对无菌培养基添加通过干燥加热(180℃，6小时)灭菌的CaCO3，终浓度为50g/L，并用于培养。
将每种菌株接种到大试管中含有的含有50g/L CaCO3的5mL培养基中，并且使用箱式振荡器(ABLE ML-190)在31.5℃以120rpm振荡培养。在培养开始后18小时，对培养液进行取样。通过分别使用Biotech-analyzer AS-310(SAKURA SI)和氨基酸分析仪L-8800A(HITACHI)对培养肉汤中谷氨酸和天冬氨酸的浓度进行定量。
图1中显示了结果。通过增强的Cg-dctA、Ec-dctA、Ec-dcuA或Ec-dcuB的表达改善谷氨酸(Glu)的积累。此外，通过增强的Cg-dctA、Ec-dctA、Ec-dcuA或Ec-dcuB的表达来降低天冬氨酸的副产物。
如上所述，虽然已经报道了使用具有增强的dctA基因表达的棒状杆菌细菌生产L-氨基酸的方法并且例示L-谷氨酸作为L-氨基酸，但是还没有证明是否可以使用相同的细菌生产L-谷氨酸(专利文献3)。相反，考虑到由dctA基因编码的蛋白质具有L-谷氨酸的摄取能力的事实(非专利文献4)，熟练技术人员应该预测dctA基因的增强表达促进L-谷氨酸对细胞的摄取，由此，培养基中的L-谷氨酸的累积量降低。也就是说，熟练技术人员不能预测通过增强的dctA基因的表达来改善L-谷氨酸的生产，因此专利文献3基本上没有公开使用具有增强的dctA基因表达的棒状杆菌细菌生产L-谷氨酸的方法。另外，由于相同的原因，难以增强dctA基因的表达以生产L-谷氨酸。
此外，虽然由dctA基因编码的蛋白质对L-谷氨酸具有摄取能力(非专利文献4)，但是由yggB基因编码的蛋白质具有L-谷氨酸的排出能力(非专利文献5)。熟练技术人员不能预测组合使用具有此类相反功能的dctA基因和yggB基因可用于生产L-谷氨酸，因此也难以将dctA基因和突变体yggB基因组合用于生产L-谷氨酸。
序列表的说明
SEQ ID NO：
1-8:引物
9:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC 13869)的yggB基因的核苷酸序列
10:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC 13869)的YggB蛋白的氨基酸序列
11:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC 13869)的突变体yggB基因(V419::IS)的核苷酸序列
12:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC 13869)的突变体yggB基因(V419::IS)编码的氨基酸序列
13:长双歧杆菌JCM1217的xfp基因的核苷酸序列
14:长双歧杆菌JCM1217的Xfp蛋白的氨基酸序列
15:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC 13869)的dctA基因的核苷酸序列
16:谷氨酸棒杆菌2256(ATCC 13869)的DctA蛋白的氨基酸序列
17:大肠杆菌K-12 MG1655的dctA基因的核苷酸序列
18:大肠杆菌K-12 MG1655的DctA蛋白的氨基酸序列
19:大肠杆菌K-12 MG1655的dcuA基因的核苷酸序列
20:大肠杆菌K-12 MG1655的DcuA蛋白的氨基酸序列
21:大肠杆菌K-12 MG1655的dcuB基因的核苷酸序列
22:大肠杆菌K-12 MG1655的DcuB蛋白的氨基酸序列
序列表
<110> 味之素株式会社
<120> 用于生产L-氨基酸的方法
<130> D935-17308
<150> JP2016-195818
<151> 2016-10-03
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
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<210> 2
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 8
cggtacccgg ggatcttata agaacccgta catcgcggcg 40
<210> 9
<211> 1602
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 9
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accggttttg atgtagcaat tatcctggtc ttggcgtttt tgattccacg tatcggccga 120
ctggccatgc gtattatcaa gcagcgagtg gagtctgcag ccgatgcgga caccactaag 180
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gcctcggcga tcaatgcagg caatccagag aaggaacttg attccgatgt gctggaacaa 1080
gaactctcca gcgaagaacc ggaagaaaca gcaaaaccag atcactctct ccgaggcttc 1140
ttccgcactg attactaccc aaatcggtgg cagaagatcc tgtcgtttgg cggacgtgtc 1200
cgcatgagca cttccctgtt gttgggtgcg ctgctcttgc tgtcactatt taaggtcatg 1260
actgtggaac caagtgagaa ttggcaaaac tccagtggat ggctgtcacc aagcactgcc 1320
acctcaactg cggtgaccac ctccgaaact tccgcgccag caagcacgcc ttcgatgaca 1380
gtgcccacta cggtggagga gaccccaacg atggaatcta gcgtcgaaac gcagcaggaa 1440
acctcaaccc ctgcaaccgc aacgccccag cgagccgaca ccatcgaacc gaccgaggaa 1500
gccacgtcgc aggaggaaac gactgcatcg cagacgcagt ctccagcagt ggaagcacca 1560
accgcggtcc aagaaacagt tgcgccgacg tccacccctt ag 1602
<210> 10
<211> 533
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 10
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln
35 40 45
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln
100 105 110
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val
385 390 395 400
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser
420 425 430
Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser
435 440 445
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450 455 460
Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu
465 470 475 480
Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu
485 490 495
Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr
500 505 510
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530
<210> 11
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<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1269)
<400> 11
atg att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg tgg aat 48
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
tgg att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc ttg gcg 96
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
ttt ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc aag cag 144
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln
35 40 45
cga gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag ctc gcg 192
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
ttc gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt ttc atg 240
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
ctt gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg ggc gct 288
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
gcg att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt gcg cag 336
Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln
100 105 110
tcg att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg gaa aag 384
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
caa ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc atc gtt 432
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
gtt gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa att cgc 480
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
acg att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg aaa gtg 528
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
tgc atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt att ccg 576
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
atc ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg cgc tct 624
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
gaa gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca ccg gaa 672
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
atc ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca ccg cca 720
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
acg gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc gtg caa 768
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
gtc acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc aca gaa 816
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
atc atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act aca tcg 864
Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
gga acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca aag acc 912
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
tcg ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag ccg gag 960
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
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gct gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac gat gca 1008
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
gac aat gca gac gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag aag gaa 1056
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
ctt gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa 1104
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
gaa aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc act gat 1152
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
tac tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc 1200
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val
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cgc atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg tca cta 1248
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
ttt aag ggg ctc ttc ctg ttt tagagtgcat tgatcttatg gaccaactgc 1299
Phe Lys Gly Leu Phe Leu Phe
420
cctgaatgga taaggcaccg cagaatgtag tggttcaaat tacggaaacc tagagcaatc 1359
ccacgcaaat gctccaaccg tccgttgatc gcttcgaccg gaccgttgga gacaccaaca 1419
tcgaaatacg ccaacacatc accaagtcgt ttaaacaaac tacgacccaa ctgcgcgagt 1479
tccttattcg gccccttcaa cacccgaagc tgatcaataa tggtccgcat tttcttcttc 1539
gcttcacgct tattacccat ctgataacaa tcaataatcg cctgatacgc aagccacgca 1599
agctttaaca ccccgtagtc tttgtcatac gcccacaact gctccaagct ttcttgctga 1659
cgaggactca accacttgtg cgtggtcaac aaggtcttcc ggtttttata caacggatcc 1719
tggcttaaac cacgacgctg gtatttctcc cgctggaggc gttgccggca ggcggtgagc 1779
ttgtcaccag caagccgcac aacatggaat ggatccatca cgcgacgagc agaaggaatg 1839
agttctttac ttgctgtggc gtagccttgg aacccatcca tggacacgat ccgtatctga 1899
ttgcggaact gttcaccgcg ggaaccaagc caggaccgta aagcatcagc actacgacct 1959
gggacgacat ctaataaccg ggcaggacac cgtgagtcat accgatgccc ggtcatatcg 2019
acaatcacgg tgacaaaccc atcaccatgc ttagccctat tatgtgacca cttatgctca 2079
tccaccccaa tgacatacac tccatcaaga tggtgaggat cgttatagac cagctcacgg 2139
cacatatcga gggctagttg gcaggttaaa tcccacccta gcccaagtgc tttcgcggtt 2199
gcgtgaacac tcatccggtc aatagcaagg cgttgcaaaa tccagcgggt gacccggtgg 2259
gtgacctttt taccgtggtc agcgcagctt agttctgctt ggaaatactt ttgcttacat 2319
gtcgggttgg tgcagcggta gcgaggtaga cggataaaca gtttggtggg aaacccgacg 2379
atgggtaaat caatgagcat ccggtgggtg tgatgacgaa acaccccagg ttgggagcat 2439
tctgggcagg tggaggtata gtcgagtgcg tctgcttcga tcagggtgta atcacctgca 2499
tcggaagcgc cggtgatggt gagtcctagt tccgcagtgc ggcagatggt gtcagcgatg 2559
atgttgccgg tagacttcat gggtagagcc ttttgttggt gtttggttag cttagatacc 2619
taaaccttaa ccctgacaaa aggctcgttt attttcgggt ctacaccgct agcccaggtt 2679
ctgtgatgta ccccaaaacc ggaagggcca tttaaggtca tgactgtgga accaagtgag 2739
aattggcaaa actccagtgg atggctgtca ccaagcactg ccacctcaac tgcggtgacc 2799
acctccgaaa cttccgcgcc agcaagcacg ccttcgatga cagtgcccac tacggtggag 2859
gagaccccaa cgatggaatc tagcgtcgaa acgcagcagg aaacctcaac ccctgcaacc 2919
gcaacgcccc agcgagccga caccatcgaa ccgaccgagg aagccacgtc gcaggaggaa 2979
acgactgcat cgcagacgca gtctccagca gtggaagcac caaccgcggt ccaagaaaca 3039
gttgcgccga cgtccacccc ttag 3063
<210> 12
<211> 423
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 12
Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala
20 25 30
Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln
35 40 45
Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala
50 55 60
Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met
65 70 75 80
Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln
100 105 110
Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys
115 120 125
Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val
130 135 140
Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg
145 150 155 160
Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val
165 170 175
Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro
180 185 190
Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser
195 200 205
Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu
210 215 220
Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro
225 230 235 240
Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln
245 250 255
Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu
260 265 270
Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser
275 280 285
Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr
290 295 300
Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala
325 330 335
Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu
340 345 350
Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu
355 360 365
Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp
370 375 380
Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val
385 390 395 400
Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu
405 410 415
Phe Lys Gly Leu Phe Leu Phe
420
<210> 13
<211> 2478
<212> DNA
<213> 长双歧杆菌
<400> 13
atgacgagtc ctgttattgg caccccttgg aagaagctca acgctccggt ttccgaggaa 60
gccctcgaag gcgttgacaa gtactggcgc gttgccaact acctttccat cggccagatt 120
tatctgcgtt ccaacccgct gatgaaggag cccttcaccc gcgaagatgt gaagcaccgt 180
ctggtgggcc actggggcac tacccctggc ctgaacttcc tcatcggcca catcaaccgt 240
ttcattgctg accacggcca gaacaccgtg atcatcatgg gcccgggcca cggtggcccg 300
gccggtacct cccagtccta cctggacggc acctacaccg agaccttccc gaagatcacc 360
aaggacgaag ctggtctgca gaagttcttc cgtcagttct cttacccggg cggcattccg 420
tcccacttcg ctccggagac cccgggctcc atccacgagg gtggtgagct gggttacgct 480
ctgtcccacg cttacggcgc catcatggac aacccgagcc tgtttgtccc ggccatcgtc 540
ggcgacggcg aggctgagac cggcccgctg gctaccggct ggcagtccaa caagctcgtg 600
aacccgcgca ccgacggtat cgtgctgccg atcctgcacc tcaacggcta caagatcgcc 660
aacccgacca tcctgtcccg catctccgac gaagagctcc acgagttctt ccacggcatg 720
ggttacgagc cctacgagtt cgtcgctggc ttcgatgatg aggaccacat gtccatccac 780
cgtcgcttcg ccgagctgtg ggagaccatc tgggacgaga tctgcgacat caaggccacc 840
gctcagaccg acaacgtgca ccgtccgttc tacccgatgc tgatcttccg caccccgaag 900
ggctggacct gcccgaagta catcgacggc aagaagaccg agggctcctg gcgttcccac 960
caggtgccgc tggcttccgc ccgcgacacc gaggcccact tcgaggttct caagaactgg 1020
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cttgccttca tgccgaaggg cgagctgcgt atcggtgcca acccgaacgc caacggtggt 1140
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tacgagtcct tcgtccacgt gatcgactcc atgctgaacc agcacgccaa gtggcttgag 1560
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gtcctgctga acaagtgctt ccacaacgac cacgtcatcg gcatctactt cgccaccgat 1740
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aagctgaagg aactgggcat caagttcaag gttgtgaacg ttgccgacct gctctccctg 2040
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tgggtgtact ccggcgtgaa caccgacaag aagggtgccg tcaccgctac cgccgctacc 2460
gctggcgaca acgagtga 2478
<210> 14
<211> 825
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌
<400> 14
Met Thr Ser Pro Val Ile Gly Thr Pro Trp Lys Lys Leu Asn Ala Pro
1 5 10 15
Val Ser Glu Glu Ala Leu Glu Gly Val Asp Lys Tyr Trp Arg Val Ala
20 25 30
Asn Tyr Leu Ser Ile Gly Gln Ile Tyr Leu Arg Ser Asn Pro Leu Met
35 40 45
Lys Glu Pro Phe Thr Arg Glu Asp Val Lys His Arg Leu Val Gly His
50 55 60
Trp Gly Thr Thr Pro Gly Leu Asn Phe Leu Ile Gly His Ile Asn Arg
65 70 75 80
Phe Ile Ala Asp His Gly Gln Asn Thr Val Ile Ile Met Gly Pro Gly
85 90 95
His Gly Gly Pro Ala Gly Thr Ser Gln Ser Tyr Leu Asp Gly Thr Tyr
100 105 110
Thr Glu Thr Phe Pro Lys Ile Thr Lys Asp Glu Ala Gly Leu Gln Lys
115 120 125
Phe Phe Arg Gln Phe Ser Tyr Pro Gly Gly Ile Pro Ser His Phe Ala
130 135 140
Pro Glu Thr Pro Gly Ser Ile His Glu Gly Gly Glu Leu Gly Tyr Ala
145 150 155 160
Leu Ser His Ala Tyr Gly Ala Ile Met Asp Asn Pro Ser Leu Phe Val
165 170 175
Pro Ala Ile Val Gly Asp Gly Glu Ala Glu Thr Gly Pro Leu Ala Thr
180 185 190
Gly Trp Gln Ser Asn Lys Leu Val Asn Pro Arg Thr Asp Gly Ile Val
195 200 205
Leu Pro Ile Leu His Leu Asn Gly Tyr Lys Ile Ala Asn Pro Thr Ile
210 215 220
Leu Ser Arg Ile Ser Asp Glu Glu Leu His Glu Phe Phe His Gly Met
225 230 235 240
Gly Tyr Glu Pro Tyr Glu Phe Val Ala Gly Phe Asp Asp Glu Asp His
245 250 255
Met Ser Ile His Arg Arg Phe Ala Glu Leu Trp Glu Thr Ile Trp Asp
260 265 270
Glu Ile Cys Asp Ile Lys Ala Thr Ala Gln Thr Asp Asn Val His Arg
275 280 285
Pro Phe Tyr Pro Met Leu Ile Phe Arg Thr Pro Lys Gly Trp Thr Cys
290 295 300
Pro Lys Tyr Ile Asp Gly Lys Lys Thr Glu Gly Ser Trp Arg Ser His
305 310 315 320
Gln Val Pro Leu Ala Ser Ala Arg Asp Thr Glu Ala His Phe Glu Val
325 330 335
Leu Lys Asn Trp Leu Glu Ser Tyr Lys Pro Glu Glu Leu Phe Asp Ala
340 345 350
Asn Gly Ala Val Lys Asp Asp Val Leu Ala Phe Met Pro Lys Gly Glu
355 360 365
Leu Arg Ile Gly Ala Asn Pro Asn Ala Asn Gly Gly Val Ile Arg Asn
370 375 380
Asp Leu Lys Leu Pro Asn Leu Glu Asp Tyr Glu Val Lys Glu Val Ala
385 390 395 400
Glu Tyr Gly His Gly Trp Gly Gln Leu Glu Ala Thr Arg Thr Leu Gly
405 410 415
Ala Tyr Thr Arg Asp Ile Ile Lys Asn Asn Pro Arg Asp Phe Arg Ile
420 425 430
Phe Gly Pro Asp Glu Thr Ala Ser Asn Arg Leu Gln Ala Ser Tyr Glu
435 440 445
Val Thr Asn Lys Gln Trp Asp Ala Gly Tyr Ile Ser Asp Glu Val Asp
450 455 460
Glu His Met His Val Ser Gly Gln Val Val Glu Gln Leu Ser Glu His
465 470 475 480
Gln Met Glu Gly Phe Leu Glu Ala Tyr Leu Leu Thr Gly Arg His Gly
485 490 495
Ile Trp Ser Ser Tyr Glu Ser Phe Val His Val Ile Asp Ser Met Leu
500 505 510
Asn Gln His Ala Lys Trp Leu Glu Ala Thr Val Arg Glu Ile Pro Trp
515 520 525
Arg Lys Pro Ile Ala Ser Met Asn Leu Leu Val Ser Ser His Val Trp
530 535 540
Arg Gln Asp His Asn Gly Phe Ser His Gln Asp Pro Gly Val Thr Ser
545 550 555 560
Val Leu Leu Asn Lys Cys Phe His Asn Asp His Val Ile Gly Ile Tyr
565 570 575
Phe Ala Thr Asp Ala Asn Met Leu Leu Ala Ile Ala Glu Lys Cys Tyr
580 585 590
Lys Ser Thr Asn Lys Ile Asn Ala Ile Ile Ala Gly Lys Gln Pro Ala
595 600 605
Ala Thr Trp Leu Thr Leu Asp Glu Ala Arg Ala Glu Leu Glu Lys Gly
610 615 620
Ala Ala Ala Trp Asp Trp Ala Ser Thr Ala Lys Asn Asn Asp Glu Ala
625 630 635 640
Glu Val Val Leu Ala Ala Ala Gly Asp Val Pro Thr Gln Glu Ile Met
645 650 655
Ala Ala Ser Asp Lys Leu Lys Glu Leu Gly Ile Lys Phe Lys Val Val
660 665 670
Asn Val Ala Asp Leu Leu Ser Leu Gln Ser Ala Lys Glu Asn Asp Glu
675 680 685
Ala Leu Thr Asp Glu Glu Phe Ala Asp Ile Phe Thr Ala Asp Lys Pro
690 695 700
Val Leu Phe Ala Tyr His Ser Tyr Ala His Asp Val Arg Gly Leu Ile
705 710 715 720
Tyr Asp Arg Pro Asn His Asp Asn Phe Asn Val His Gly Tyr Glu Glu
725 730 735
Glu Gly Ser Thr Thr Thr Pro Tyr Asp Met Val Arg Val Asn Arg Ile
740 745 750
Asp Arg Tyr Glu Leu Thr Ala Glu Ala Leu Arg Met Ile Asp Ala Asp
755 760 765
Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Asp Glu Leu Glu Lys Phe Arg Asp Glu Ala
770 775 780
Phe Gln Phe Ala Val Asp Asn Gly Tyr Asp His Pro Asp Tyr Thr Asp
785 790 795 800
Trp Val Tyr Ser Gly Val Asn Thr Asp Lys Lys Gly Ala Val Thr Ala
805 810 815
Thr Ala Ala Thr Ala Gly Asp Asn Glu
820 825
<210> 15
<211> 1341
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 15
atggattcaa acacagaatc ttcaagtgtt gaggtcaaaa acgaacacat taaagttcaa 60
aagccgccga agaaggaccg cactcactgg ctctacattg cggtcattat cgcattgatt 120
ggcggtatta ccctaggcct gatttcaccg gagttgggca aagaattcaa gattttgggc 180
accatgtttg tgtccttgat caagatgatt atcgctccag ttattttctg caccatcgtc 240
atcggaatcg gttcagtcaa ggcagcggca acagtcggac gcgctggtgg catcgccctt 300
gcgtacttca tcacgatgtc cacattcgca ctcgcagttg gcctgctagt cggtaacttc 360
atccagccag gtagcggact gaacatctca gttgatgaag aatcttcatt cgcatccaca 420
gagagcagcc ctgaaggact cttgggattc atccactcga tcatccctga aacgttcttc 480
tctgcattta ctgatggttc ggtgctgcag gtactgttca tcgccatcct cgtgggcttt 540
gcagctcagt cgatgggtga aaagggacag cccatccttg atttcgtatc ccatctgcag 600
aagctcatct tcaagatttt gaactggatt ctgtggctcg ccccagtcgg tgcattcggt 660
gcaatggccg gcgtcgttgg cgaaacaggc tttgatgccg ttgttcagct cggtattttg 720
atcctcgcct tttacgtcac ctgcgtgatc ttcatctttg gcgtgctggg cgccgtactg 780
aaggtgttca ccggcgtgaa tatcttcaag ctggtcaagt accttgccaa ggaattcctg 840
ctgatctttg ctacctcatc ctctgaatct gccttgccaa acctcatgcg caagatggaa 900
cacatcggtg tggctaaacc aaccgtcgga atcgtggtcc caaccggcta ttccttcaac 960
ttggacggca ccgcaattta cctcaccatg gcatctatct tcattgccga cgcgatgaat 1020
atgccgatga gcctcggcga gcaggtcggt ctgcttgtct tcatgatcat cgcatccaag 1080
ggcgctgctg gtgtctcggg tgccggtatt gcaacgttgg ctgccggatt gtcttcacac 1140
cgcccagaac ttctgcacgg cgttgacgtg attgtgggca tcgataaatt catgtctgaa 1200
gcccgcgcac taaccaactt cgccggaaac tccgtggcaa cactgctggt cggcaagtgg 1260
actggcaccg tggacatgaa ccaagtccat gacgttttga atggaaaatc tccatttgtg 1320
gagttagaag aagaccacta g 1341
<210> 16
<211> 446
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 16
Met Asp Ser Asn Thr Glu Ser Ser Ser Val Glu Val Lys Asn Glu His
1 5 10 15
Ile Lys Val Gln Lys Pro Pro Lys Lys Asp Arg Thr His Trp Leu Tyr
20 25 30
Ile Ala Val Ile Ile Ala Leu Ile Gly Gly Ile Thr Leu Gly Leu Ile
35 40 45
Ser Pro Glu Leu Gly Lys Glu Phe Lys Ile Leu Gly Thr Met Phe Val
50 55 60
Ser Leu Ile Lys Met Ile Ile Ala Pro Val Ile Phe Cys Thr Ile Val
65 70 75 80
Ile Gly Ile Gly Ser Val Lys Ala Ala Ala Thr Val Gly Arg Ala Gly
85 90 95
Gly Ile Ala Leu Ala Tyr Phe Ile Thr Met Ser Thr Phe Ala Leu Ala
100 105 110
Val Gly Leu Leu Val Gly Asn Phe Ile Gln Pro Gly Ser Gly Leu Asn
115 120 125
Ile Ser Val Asp Glu Glu Ser Ser Phe Ala Ser Thr Glu Ser Ser Pro
130 135 140
Glu Gly Leu Leu Gly Phe Ile His Ser Ile Ile Pro Glu Thr Phe Phe
145 150 155 160
Ser Ala Phe Thr Asp Gly Ser Val Leu Gln Val Leu Phe Ile Ala Ile
165 170 175
Leu Val Gly Phe Ala Ala Gln Ser Met Gly Glu Lys Gly Gln Pro Ile
180 185 190
Leu Asp Phe Val Ser His Leu Gln Lys Leu Ile Phe Lys Ile Leu Asn
195 200 205
Trp Ile Leu Trp Leu Ala Pro Val Gly Ala Phe Gly Ala Met Ala Gly
210 215 220
Val Val Gly Glu Thr Gly Phe Asp Ala Val Val Gln Leu Gly Ile Leu
225 230 235 240
Ile Leu Ala Phe Tyr Val Thr Cys Val Ile Phe Ile Phe Gly Val Leu
245 250 255
Gly Ala Val Leu Lys Val Phe Thr Gly Val Asn Ile Phe Lys Leu Val
260 265 270
Lys Tyr Leu Ala Lys Glu Phe Leu Leu Ile Phe Ala Thr Ser Ser Ser
275 280 285
Glu Ser Ala Leu Pro Asn Leu Met Arg Lys Met Glu His Ile Gly Val
290 295 300
Ala Lys Pro Thr Val Gly Ile Val Val Pro Thr Gly Tyr Ser Phe Asn
305 310 315 320
Leu Asp Gly Thr Ala Ile Tyr Leu Thr Met Ala Ser Ile Phe Ile Ala
325 330 335
Asp Ala Met Asn Met Pro Met Ser Leu Gly Glu Gln Val Gly Leu Leu
340 345 350
Val Phe Met Ile Ile Ala Ser Lys Gly Ala Ala Gly Val Ser Gly Ala
355 360 365
Gly Ile Ala Thr Leu Ala Ala Gly Leu Ser Ser His Arg Pro Glu Leu
370 375 380
Leu His Gly Val Asp Val Ile Val Gly Ile Asp Lys Phe Met Ser Glu
385 390 395 400
Ala Arg Ala Leu Thr Asn Phe Ala Gly Asn Ser Val Ala Thr Leu Leu
405 410 415
Val Gly Lys Trp Thr Gly Thr Val Asp Met Asn Gln Val His Asp Val
420 425 430
Leu Asn Gly Lys Ser Pro Phe Val Glu Leu Glu Glu Asp His
435 440 445
<210> 17
<211> 1287
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 17
atgaaaacct ctctgtttaa aagcctttac tttcaggtcc tgacagcgat agccattggt 60
attctccttg gccatttcta tcctgaaata ggcgagcaaa tgaaaccgct tggcgacggc 120
ttcgttaagc tcattaagat gatcatcgct cctgtcatct tttgtaccgt cgtaacgggc 180
attgcgggca tggaaagcat gaaggcggtc ggtcgtaccg gcgcagtcgc actgctttac 240
tttgaaattg tcagtaccat cgcgctgatt attggtctta tcatcgttaa cgtcgtgcag 300
cctggtgccg gaatgaacgt cgatccggca acgcttgatg cgaaagcggt agcggtttac 360
gccgatcagg cgaaagacca gggcattgtc gccttcatta tggatgtcat cccggcgagc 420
gtcattggcg catttgccag cggtaacatt ctgcaggtgc tgctgtttgc cgtactgttt 480
ggttttgcgc tccaccgtct gggcagcaaa ggccaactga tttttaacgt catcgaaagt 540
ttctcgcagg tcatcttcgg catcatcaat atgatcatgc gtctggcacc tattggtgcg 600
ttcggggcaa tggcgtttac catcggtaaa tacggcgtcg gcacactggt gcaactgggg 660
cagctgatta tctgtttcta cattacctgt atcctgtttg tggtgctggt attgggttca 720
atcgctaaag cgactggttt cagtatcttc aaatttatcc gctacatccg tgaagaactg 780
ctgattgtac tggggacttc atcttccgag tcggcgctgc cgcgtatgct cgacaagatg 840
gagaaactcg gctgccgtaa atcggtggtg gggctggtca tcccgacagg ctactcgttt 900
aaccttgatg gcacatcgat atacctgaca atggcggcgg tgtttatcgc ccaggccact 960
aacagtcaga tggatatcgt ccaccaaatc acgctgttaa tcgtgttgct gctttcttct 1020
aaaggggcgg caggggtaac gggtagtggc tttatcgtgc tggcggcgac gctctctgcg 1080
gtgggccatt tgccggtagc gggtctggcg ctgatcctcg gtatcgaccg ctttatgtca 1140
gaagctcgtg cgctgactaa cctggtcggt aacggcgtag cgaccattgt cgttgctaag 1200
tgggtgaaag aactggacca caaaaaactg gacgatgtgc tgaataatcg tgcgccggat 1260
ggcaaaacgc acgaattatc ctcttaa 1287
<210> 18
<211> 428
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 18
Met Lys Thr Ser Leu Phe Lys Ser Leu Tyr Phe Gln Val Leu Thr Ala
1 5 10 15
Ile Ala Ile Gly Ile Leu Leu Gly His Phe Tyr Pro Glu Ile Gly Glu
20 25 30
Gln Met Lys Pro Leu Gly Asp Gly Phe Val Lys Leu Ile Lys Met Ile
35 40 45
Ile Ala Pro Val Ile Phe Cys Thr Val Val Thr Gly Ile Ala Gly Met
50 55 60
Glu Ser Met Lys Ala Val Gly Arg Thr Gly Ala Val Ala Leu Leu Tyr
65 70 75 80
Phe Glu Ile Val Ser Thr Ile Ala Leu Ile Ile Gly Leu Ile Ile Val
85 90 95
Asn Val Val Gln Pro Gly Ala Gly Met Asn Val Asp Pro Ala Thr Leu
100 105 110
Asp Ala Lys Ala Val Ala Val Tyr Ala Asp Gln Ala Lys Asp Gln Gly
115 120 125
Ile Val Ala Phe Ile Met Asp Val Ile Pro Ala Ser Val Ile Gly Ala
130 135 140
Phe Ala Ser Gly Asn Ile Leu Gln Val Leu Leu Phe Ala Val Leu Phe
145 150 155 160
Gly Phe Ala Leu His Arg Leu Gly Ser Lys Gly Gln Leu Ile Phe Asn
165 170 175
Val Ile Glu Ser Phe Ser Gln Val Ile Phe Gly Ile Ile Asn Met Ile
180 185 190
Met Arg Leu Ala Pro Ile Gly Ala Phe Gly Ala Met Ala Phe Thr Ile
195 200 205
Gly Lys Tyr Gly Val Gly Thr Leu Val Gln Leu Gly Gln Leu Ile Ile
210 215 220
Cys Phe Tyr Ile Thr Cys Ile Leu Phe Val Val Leu Val Leu Gly Ser
225 230 235 240
Ile Ala Lys Ala Thr Gly Phe Ser Ile Phe Lys Phe Ile Arg Tyr Ile
245 250 255
Arg Glu Glu Leu Leu Ile Val Leu Gly Thr Ser Ser Ser Glu Ser Ala
260 265 270
Leu Pro Arg Met Leu Asp Lys Met Glu Lys Leu Gly Cys Arg Lys Ser
275 280 285
Val Val Gly Leu Val Ile Pro Thr Gly Tyr Ser Phe Asn Leu Asp Gly
290 295 300
Thr Ser Ile Tyr Leu Thr Met Ala Ala Val Phe Ile Ala Gln Ala Thr
305 310 315 320
Asn Ser Gln Met Asp Ile Val His Gln Ile Thr Leu Leu Ile Val Leu
325 330 335
Leu Leu Ser Ser Lys Gly Ala Ala Gly Val Thr Gly Ser Gly Phe Ile
340 345 350
Val Leu Ala Ala Thr Leu Ser Ala Val Gly His Leu Pro Val Ala Gly
355 360 365
Leu Ala Leu Ile Leu Gly Ile Asp Arg Phe Met Ser Glu Ala Arg Ala
370 375 380
Leu Thr Asn Leu Val Gly Asn Gly Val Ala Thr Ile Val Val Ala Lys
385 390 395 400
Trp Val Lys Glu Leu Asp His Lys Lys Leu Asp Asp Val Leu Asn Asn
405 410 415
Arg Ala Pro Asp Gly Lys Thr His Glu Leu Ser Ser
420 425
<210> 19
<211> 1302
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 19
atgctagttg tagaactcat catagttttg ctggcgatct tcttgggcgc cagattgggg 60
ggaataggta ttggttttgc aggcggattg ggggtgctgg ttcttgccgc tattggcgtt 120
aaacccggta acatcccgtt cgatgtcatc tccattatca tggcggttat cgccgctatt 180
tctgccatgc aggttgctgg cggtctggac tatctggttc atcagacaga aaagctgctg 240
cgccgtaacc cgaaatacat cacgatcctc gcaccgatcg tgacctattt cctgactatc 300
tttgctggta ctggcaacat ctctctggcg acactgccag ttatcgctga agttgcgaag 360
gaacaaggcg ttaaaccttg ccgtccgctg tctactgcag tggtatccgc gcagattgcg 420
atcaccgcat cgccaatctc agcggcagtg gtttacatgt cttccgtgat ggaaggtcat 480
ggcatcagct acctccatct gctctccgtg gtcatcccgt ccaccctgct ggcggttctg 540
gtgatgtcct tcctggtcac tatgctgttc aactccaaac tctctgacga tccgatttat 600
cgcaagcgtc tggaagaggg cctggttgaa ctgcgcggtg aaaagcagat tgaaatcaaa 660
tccggtgcaa aaacgtccgt ctggctgttc ctgctgggcg tagttggcgt ggttatctat 720
gcaatcatca acagcccaag catgggtctg gttgaaaaac cgctgatgaa caccaccaac 780
gcaatcctga tcatcatgct cagcgttgca actctgacca ccgttatctg taaagtcgat 840
accgacaaca tcctcaactc cagcaccttc aaagcaggta tgagcgcctg tatttgtatc 900
ctgggtgttg cgtggctggg cgatactttc gtttccaaca acatcgactg gatcaaagat 960
accgctggtg aagtgattca gggtcatccg tggctgctgg ccgtcatctt cttctttgct 1020
tctgctctgc tgtactctca ggctgcaacc gcaaaagcac tgatgccgat ggctctggca 1080
ctgaacgttt caccgctgac cgctgttgct tctttcgctg cggtgtctgg tctgttcatt 1140
ctgccgacct acccgacgct ggttgctgcg gtacagatgg atgacacggg tactacccgt 1200
atcggtaaat tcgtcttcaa ccatccgttc ttcatcccgg gtactctggg tgttgccctg 1260
gccgtttgct tcggcttcgt gctgggtagc ttcatgctgt aa 1302
<210> 20
<211> 433
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 20
Met Leu Val Val Glu Leu Ile Ile Val Leu Leu Ala Ile Phe Leu Gly
1 5 10 15
Ala Arg Leu Gly Gly Ile Gly Ile Gly Phe Ala Gly Gly Leu Gly Val
20 25 30
Leu Val Leu Ala Ala Ile Gly Val Lys Pro Gly Asn Ile Pro Phe Asp
35 40 45
Val Ile Ser Ile Ile Met Ala Val Ile Ala Ala Ile Ser Ala Met Gln
50 55 60
Val Ala Gly Gly Leu Asp Tyr Leu Val His Gln Thr Glu Lys Leu Leu
65 70 75 80
Arg Arg Asn Pro Lys Tyr Ile Thr Ile Leu Ala Pro Ile Val Thr Tyr
85 90 95
Phe Leu Thr Ile Phe Ala Gly Thr Gly Asn Ile Ser Leu Ala Thr Leu
100 105 110
Pro Val Ile Ala Glu Val Ala Lys Glu Gln Gly Val Lys Pro Cys Arg
115 120 125
Pro Leu Ser Thr Ala Val Val Ser Ala Gln Ile Ala Ile Thr Ala Ser
130 135 140
Pro Ile Ser Ala Ala Val Val Tyr Met Ser Ser Val Met Glu Gly His
145 150 155 160
Gly Ile Ser Tyr Leu His Leu Leu Ser Val Val Ile Pro Ser Thr Leu
165 170 175
Leu Ala Val Leu Val Met Ser Phe Leu Val Thr Met Leu Phe Asn Ser
180 185 190
Lys Leu Ser Asp Asp Pro Ile Tyr Arg Lys Arg Leu Glu Glu Gly Leu
195 200 205
Val Glu Leu Arg Gly Glu Lys Gln Ile Glu Ile Lys Ser Gly Ala Lys
210 215 220
Thr Ser Val Trp Leu Phe Leu Leu Gly Val Val Gly Val Val Ile Tyr
225 230 235 240
Ala Ile Ile Asn Ser Pro Ser Met Gly Leu Val Glu Lys Pro Leu Met
245 250 255
Asn Thr Thr Asn Ala Ile Leu Ile Ile Met Leu Ser Val Ala Thr Leu
260 265 270
Thr Thr Val Ile Cys Lys Val Asp Thr Asp Asn Ile Leu Asn Ser Ser
275 280 285
Thr Phe Lys Ala Gly Met Ser Ala Cys Ile Cys Ile Leu Gly Val Ala
290 295 300
Trp Leu Gly Asp Thr Phe Val Ser Asn Asn Ile Asp Trp Ile Lys Asp
305 310 315 320
Thr Ala Gly Glu Val Ile Gln Gly His Pro Trp Leu Leu Ala Val Ile
325 330 335
Phe Phe Phe Ala Ser Ala Leu Leu Tyr Ser Gln Ala Ala Thr Ala Lys
340 345 350
Ala Leu Met Pro Met Ala Leu Ala Leu Asn Val Ser Pro Leu Thr Ala
355 360 365
Val Ala Ser Phe Ala Ala Val Ser Gly Leu Phe Ile Leu Pro Thr Tyr
370 375 380
Pro Thr Leu Val Ala Ala Val Gln Met Asp Asp Thr Gly Thr Thr Arg
385 390 395 400
Ile Gly Lys Phe Val Phe Asn His Pro Phe Phe Ile Pro Gly Thr Leu
405 410 415
Gly Val Ala Leu Ala Val Cys Phe Gly Phe Val Leu Gly Ser Phe Met
420 425 430
Leu
<210> 21
<211> 1341
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 21
atgttattta ctatccaact tatcataata ctgatatgtc tgttttatgg tgccagaaag 60
ggtggtatcg cgctgggttt attaggcggt atcggtctgg tcattctggt cttcgtcttc 120
caccttcagc caggtaaacc accagttgat gtcatgctgg ttatcattgc ggtggtggcg 180
gcatcggcga ccttgcaagc ttcgggcggt cttgatgtca tgctgcaaat tgccgagaag 240
ctgctgcgcc gcaacccgaa atatgtctca attgtcgcgc cgtttgtgac ctgtacactg 300
accattcttt gcggtacggg tcatgtggtt tacaccattc tgccgatcat ctacgacgtc 360
gccattaaga acaacatccg tccggaacgt ccgatggcgg caagttctat cggtgcacag 420
atggggatta tcgccagtcc ggtgtcggtt gcggtcgtgt ctctggttgc gatgctgggt 480
aatgtcacct ttgatggtcg ccatcttgag ttcctcgatc tgctggcaat caccattcca 540
tcgacgttaa tcggtatcct ggcgatcggt atcttcagct ggttccgcgg taaagatctg 600
gataaagacg aagagttcca gaaattcatc tccgtaccgg aaaaccgtga gtatgtttac 660
ggtgataccg cgacgctgct ggataaaaaa ctgccgaaaa gcaactggct ggcaatgtgg 720
attttcctcg gggcaatcgc tgtagtcgcc cttcttggtg ctgattcgga cctgcgtcca 780
tccttcggcg gcaaaccgct gtcgatggta ctggttattc agatgtttat gctgctgacc 840
ggggcgctga ttattatcct gaccaaaacc aatcccgcgt ctatctcaaa aaacgaagtc 900
ttccgttccg gtatgatcgc catcgtggcg gtgtacggta tcgcatggat ggcagaaacc 960
atgttcggtg cgcatatgtc tgaaattcag ggcgtactgg gtgaaatggt gaaagagtat 1020
ccgtgggcct atgccattgt tctgctgctg gtttccaagt ttgtaaactc tcaggctgcg 1080
gcgctggcgg cgattgttcc ggtcgcgctg gcgatcggcg ttgatccggc atacatcgtg 1140
gcttcagcac cggcttgcta cggttattac atcctgccga cttatccgag cgatctggca 1200
gcgattcagt ttgaccgttc cggcaccacc cacatcggtc gcttcgtcat caaccacagc 1260
tttattctgc cggggttgat tggtgtgagc gtatcgtgcg tcttcggctg gatcttcgcc 1320
gcgatgtacg ggttcttata a 1341
<210> 22
<211> 446
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 22
Met Leu Phe Thr Ile Gln Leu Ile Ile Ile Leu Ile Cys Leu Phe Tyr
1 5 10 15
Gly Ala Arg Lys Gly Gly Ile Ala Leu Gly Leu Leu Gly Gly Ile Gly
20 25 30
Leu Val Ile Leu Val Phe Val Phe His Leu Gln Pro Gly Lys Pro Pro
35 40 45
Val Asp Val Met Leu Val Ile Ile Ala Val Val Ala Ala Ser Ala Thr
50 55 60
Leu Gln Ala Ser Gly Gly Leu Asp Val Met Leu Gln Ile Ala Glu Lys
65 70 75 80
Leu Leu Arg Arg Asn Pro Lys Tyr Val Ser Ile Val Ala Pro Phe Val
85 90 95
Thr Cys Thr Leu Thr Ile Leu Cys Gly Thr Gly His Val Val Tyr Thr
100 105 110
Ile Leu Pro Ile Ile Tyr Asp Val Ala Ile Lys Asn Asn Ile Arg Pro
115 120 125
Glu Arg Pro Met Ala Ala Ser Ser Ile Gly Ala Gln Met Gly Ile Ile
130 135 140
Ala Ser Pro Val Ser Val Ala Val Val Ser Leu Val Ala Met Leu Gly
145 150 155 160
Asn Val Thr Phe Asp Gly Arg His Leu Glu Phe Leu Asp Leu Leu Ala
165 170 175
Ile Thr Ile Pro Ser Thr Leu Ile Gly Ile Leu Ala Ile Gly Ile Phe
180 185 190
Ser Trp Phe Arg Gly Lys Asp Leu Asp Lys Asp Glu Glu Phe Gln Lys
195 200 205
Phe Ile Ser Val Pro Glu Asn Arg Glu Tyr Val Tyr Gly Asp Thr Ala
210 215 220
Thr Leu Leu Asp Lys Lys Leu Pro Lys Ser Asn Trp Leu Ala Met Trp
225 230 235 240
Ile Phe Leu Gly Ala Ile Ala Val Val Ala Leu Leu Gly Ala Asp Ser
245 250 255
Asp Leu Arg Pro Ser Phe Gly Gly Lys Pro Leu Ser Met Val Leu Val
260 265 270
Ile Gln Met Phe Met Leu Leu Thr Gly Ala Leu Ile Ile Ile Leu Thr
275 280 285
Lys Thr Asn Pro Ala Ser Ile Ser Lys Asn Glu Val Phe Arg Ser Gly
290 295 300
Met Ile Ala Ile Val Ala Val Tyr Gly Ile Ala Trp Met Ala Glu Thr
305 310 315 320
Met Phe Gly Ala His Met Ser Glu Ile Gln Gly Val Leu Gly Glu Met
325 330 335
Val Lys Glu Tyr Pro Trp Ala Tyr Ala Ile Val Leu Leu Leu Val Ser
340 345 350
Lys Phe Val Asn Ser Gln Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ile Val Pro Val
355 360 365
Ala Leu Ala Ile Gly Val Asp Pro Ala Tyr Ile Val Ala Ser Ala Pro
370 375 380
Ala Cys Tyr Gly Tyr Tyr Ile Leu Pro Thr Tyr Pro Ser Asp Leu Ala
385 390 395 400
Ala Ile Gln Phe Asp Arg Ser Gly Thr Thr His Ile Gly Arg Phe Val
405 410 415
Ile Asn His Ser Phe Ile Leu Pro Gly Leu Ile Gly Val Ser Val Ser
420 425 430
Cys Val Phe Gly Trp Ile Phe Ala Ala Met Tyr Gly Phe Leu
435 440 445

Claims (15)

1.一种用于生产L-氨基酸的方法，所述方法包括：
在培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的细菌以在所述培养基中积累L-氨基酸；并且
从所述培养基收集所述L-氨基酸，
其中所述细菌经修饰而与未修饰的菌株相比C4-二羧酸摄取载体的活性增加了，
其中所述C4-二羧酸摄取载体由一种或多种选自以下的蛋白质组成：由dctA基因、dcuA基因、和dcuB基因编码的蛋白质，
其中所述L-氨基酸是L-谷氨酸，
其中所述细菌是棒状杆菌coryneform bacterium，并且
其中所述细菌经进一步修饰而含有突变体yggB基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述dctA基因是编码由SEQ ID NO: 16或18的氨基酸序列组成的蛋白质的基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述dcuA基因是编码由SEQ ID NO: 20的氨基酸序列组成的蛋白质的基因。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述dcuB基因是编码由SEQ ID NO: 22的氨基酸序列组成的蛋白质的基因。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过增加编码所述C4-二羧酸摄取载体的基因的表达来增加所述C4-二羧酸摄取载体的活性。
6.根据权利要求5所述的方法，其中通过增加所述基因的拷贝数和/或修饰所述基因的表达控制序列来增加所述基因的表达。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌经进一步修饰而与未修饰的菌株相比磷酸酮醇酶的活性增加了。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述磷酸酮醇酶由D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶和/或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶组成。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中通过增加编码所述磷酸酮醇酶的基因的表达来增加所述磷酸酮醇酶的活性。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细菌是属于棒杆菌属的细菌。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述细菌是谷氨酸棒杆菌。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述L-谷氨酸以L-谷氨酸单铵或L-谷氨酸单钠的形式收集。
13.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细菌经进一步修饰而与未修饰的菌株相比α-酮戊二酸脱氢酶和/或琥珀酸脱氢酶的活性降低了。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述突变体yggB基因是具有突变的yggB基因，所述突变改善所述棒状杆菌细菌的L-谷氨酸生产能力。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述突变体yggB基因是具有下述(1)、(2)、或(3)中限定的突变的yggB基因：
(1) 编码野生型YggB蛋白的419至533位处的氨基酸残基的区域中的突变，
(2) 编码野生型YggB蛋白的跨膜区的区域中的突变，和
(3) 所述突变的组合，
其中所述野生型YggB蛋白是由SEQ ID NO: 10的氨基酸序列组成的蛋白质。
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