JPH02207791A - 微生物の形質転換法 - Google Patents
微生物の形質転換法Info
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- JPH02207791A JPH02207791A JP1028088A JP2808889A JPH02207791A JP H02207791 A JPH02207791 A JP H02207791A JP 1028088 A JP1028088 A JP 1028088A JP 2808889 A JP2808889 A JP 2808889A JP H02207791 A JPH02207791 A JP H02207791A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野〉
本発明は、アミノ酸などの有用物質の発酵生産に用いら
れているブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムに
プラスミドのようなりＮＡを取り込ませることにより、
その遺伝形質を変換する形質転換法に関するものである
。
れているブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムに
プラスミドのようなりＮＡを取り込ませることにより、
その遺伝形質を変換する形質転換法に関するものである
。
〈従来の技術〉
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの形質転換
法として、従来はＤＮＡを取り込ませる細胞の細胞壁を
細胞壁融解酵素リゾチームにより除去してプロトプラス
ト化し、プロトプラストとＤＮＡの共存下にポリエチレ
ングリコールを加えることにより、プロトプラストにＤ
ＮＡを取り込ませ、その後プロトプラストを適当な薬剤
を含む再生培地上で再生させる事により形質転換体を取
得する、プロトプラスト法が用いられていた。
法として、従来はＤＮＡを取り込ませる細胞の細胞壁を
細胞壁融解酵素リゾチームにより除去してプロトプラス
ト化し、プロトプラストとＤＮＡの共存下にポリエチレ
ングリコールを加えることにより、プロトプラストにＤ
ＮＡを取り込ませ、その後プロトプラストを適当な薬剤
を含む再生培地上で再生させる事により形質転換体を取
得する、プロトプラスト法が用いられていた。
（昭６１−１４９０８２、昭５７−１８６４９２等があ
る）〈発明が解決しようとしている問題点〉従来用いら
れていたプロトプラスト法には、菌株ごとのプロトプラ
スト化及び再生の最適条件が変動すること、プロトプラ
スト化及び再生を含めると全操作に１週間以上を要する
こと、及び操作が煩雑であることなどの問題点がある。
る）〈発明が解決しようとしている問題点〉従来用いら
れていたプロトプラスト法には、菌株ごとのプロトプラ
スト化及び再生の最適条件が変動すること、プロトプラ
スト化及び再生を含めると全操作に１週間以上を要する
こと、及び操作が煩雑であることなどの問題点がある。
本発明はこれら問題点を解決し、更にプロトプラスト法
よりはるかに高い形質転換効率で形質転換が行える形質
転換法である。
よりはるかに高い形質転換効率で形質転換が行える形質
転換法である。
〈発明が解決しようとしている手段）
本発明者らは、上記問題点を解決する手段として、プロ
トプラスト法に代わる形質転換法として電気パルスを用
いたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの形質
転換法を開発した。
トプラスト法に代わる形質転換法として電気パルスを用
いたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの形質
転換法を開発した。
電気パルスを用いた形質転換法の原理は、受容菌とＤＮ
Ａの混在下で高電圧パルスをかけることにより、受容菌
の細胞膜及び細胞壁の透過性を一時的に高め、外来ＤＮ
Ａ分子を導入するものである。この方法によれば、細胞
壁除去などの操作無しに導入が可能で、従来法に比べ、
極めて簡便である。また、全操作が約２〜５日と極めて
迅速である。更に、導入効率に関して、１ｏｐｇ〜ｌｎ
ｇのＤＮＡを用いて、最高でμｇＤＮＡ当り約１０８個
の形質転換体が得られ、従来法の約１０００倍の効率で
の導入が可能である。また、同一の条件で多くの変異株
の形質転換が可能であり、高い一般性も持っている。
Ａの混在下で高電圧パルスをかけることにより、受容菌
の細胞膜及び細胞壁の透過性を一時的に高め、外来ＤＮ
Ａ分子を導入するものである。この方法によれば、細胞
壁除去などの操作無しに導入が可能で、従来法に比べ、
極めて簡便である。また、全操作が約２〜５日と極めて
迅速である。更に、導入効率に関して、１ｏｐｇ〜ｌｎ
ｇのＤＮＡを用いて、最高でμｇＤＮＡ当り約１０８個
の形質転換体が得られ、従来法の約１０００倍の効率で
の導入が可能である。また、同一の条件で多くの変異株
の形質転換が可能であり、高い一般性も持っている。
〈実施例）
以下、実施例に基づき、本発明の詳細な説明する。
実施例 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡ
Ｊ１５１１株のｐＡＪ４３による形質転換（１）プラス
ミドＤＮＡの調製 導入するプラスミドＤＮＡとして、ｐＡＪ６５５ （昭
５８−１９２９００参照）由来のＰＡＪ４３を用いた。
Ｊ１５１１株のｐＡＪ４３による形質転換（１）プラス
ミドＤＮＡの調製 導入するプラスミドＤＮＡとして、ｐＡＪ６５５ （昭
５８−１９２９００参照）由来のＰＡＪ４３を用いた。
このプラスミドは宿主にクロラムフェニコール耐性を付
与する。プラスミドＤＮＡは常法に従って調製した後、
セシウムクロライド−エチジウムブロマイド密度勾配超
遠心にて精製した。
与する。プラスミドＤＮＡは常法に従って調製した後、
セシウムクロライド−エチジウムブロマイド密度勾配超
遠心にて精製した。
（２） ＤＮＡ受容菌の調製
ＤＮＡ受容菌にはブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムＡＪ１５１１株を用いた。受容菌の培養に用いる
培地は微生物が増殖できる培地であればよく、例えば栄
養培地Ｍ−ＣＭ２Ｇ（グルコース５ｇ、ポリペプトン１
０ｇ、酵母エキス１０ ｇ、 ＮａＣ４２５ｇ、ＤＬ−
メチオニン０．２ ｇを純水１１に含み、ｐＨ７，２に
調製した培地）などが用いられる。この培地に微生物を
接種し、３１．５°Ｃにて振盪培養した。比色計によっ
て６６０ｒ＋ｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、対数
増殖中期（ＯＤ＝０．５〜０．８）に細胞を集菌し、蒸
留水にて３回洗浄したものを使用した。
ンタムＡＪ１５１１株を用いた。受容菌の培養に用いる
培地は微生物が増殖できる培地であればよく、例えば栄
養培地Ｍ−ＣＭ２Ｇ（グルコース５ｇ、ポリペプトン１
０ｇ、酵母エキス１０ ｇ、 ＮａＣ４２５ｇ、ＤＬ−
メチオニン０．２ ｇを純水１１に含み、ｐＨ７，２に
調製した培地）などが用いられる。この培地に微生物を
接種し、３１．５°Ｃにて振盪培養した。比色計によっ
て６６０ｒ＋ｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、対数
増殖中期（ＯＤ＝０．５〜０．８）に細胞を集菌し、蒸
留水にて３回洗浄したものを使用した。
（３）電気パルスの印加
電気パルス発生装置として島津製細胞融合装置５Ｓ）Ｉ
−１型、及び付属のハイパワーユニッ） ｌ（Ｐ［Ｉ−
１型を用いた。遺伝子導入チャンバーとしては、付属の
ＦＴＣ−１１型及びＰＴＣ−１２型を用いた。これらに
より、０〜５６ｋｖ／ｃ１１の電場強度、０〜５００μ
５８Ｃのパルス持続時間の直流、矩形の電気パルスを発
生することができる。
−１型、及び付属のハイパワーユニッ） ｌ（Ｐ［Ｉ−
１型を用いた。遺伝子導入チャンバーとしては、付属の
ＦＴＣ−１１型及びＰＴＣ−１２型を用いた。これらに
より、０〜５６ｋｖ／ｃ１１の電場強度、０〜５００μ
５８Ｃのパルス持続時間の直流、矩形の電気パルスを発
生することができる。
調製した受容菌体と導入するＤＮＡ溶液を混合後、チャ
ンバーに入れた。菌濃度はｌ×１０９〜５ Ｘ １０
ｌ０ｃｆｕ／ ｍｌ、 ＤＮＡ濃度はｌｎｇ／ｍｆ〜１
μｇ／ｍｌとなるよう調製した。この溶液に、電場強度
６〜２０ｋＶ／ｃｍ、パルス持続時間１００〜５００μ
ｓｅｃの電気パルスを印加した。パルス印加は４°Ｃに
て行った。パルス印加後、栄養培地に懸濁し、３１．５
°Ｃにて０−１６時間培養した後形質転換体の選択を行
った。
ンバーに入れた。菌濃度はｌ×１０９〜５ Ｘ １０
ｌ０ｃｆｕ／ ｍｌ、 ＤＮＡ濃度はｌｎｇ／ｍｆ〜１
μｇ／ｍｌとなるよう調製した。この溶液に、電場強度
６〜２０ｋＶ／ｃｍ、パルス持続時間１００〜５００μ
ｓｅｃの電気パルスを印加した。パルス印加は４°Ｃに
て行った。パルス印加後、栄養培地に懸濁し、３１．５
°Ｃにて０−１６時間培養した後形質転換体の選択を行
った。
（４）形質転換体の選択
形質転換体は供与ＤＮＡに由来する遺伝子が、菌に付与
する形質について選択することによって取得できた。形
質転換体の選択は適当な薬剤を含む栄養培地、または最
小培地のプレートにて行った。ＡＪ１５１１株をｐＡＪ
４３で形質転換する場合、パルス印加後、栄養培地にて
培養した菌体を５〜１０μｇ／ｍβのクロラムフェニコ
ールを含むＭ−ＣＭ２Ｇ培地プレート（寒天１．５％を
含む）に塗布し、３１．５°Ｃにて１〜２日培養して形
質転換体を取得した。クロラムフェニコールに自然突然
変異で耐性となる株の出現頻度は１０−７以下であるの
で形質転換体の取得には問題とならなかった。
する形質について選択することによって取得できた。形
質転換体の選択は適当な薬剤を含む栄養培地、または最
小培地のプレートにて行った。ＡＪ１５１１株をｐＡＪ
４３で形質転換する場合、パルス印加後、栄養培地にて
培養した菌体を５〜１０μｇ／ｍβのクロラムフェニコ
ールを含むＭ−ＣＭ２Ｇ培地プレート（寒天１．５％を
含む）に塗布し、３１．５°Ｃにて１〜２日培養して形
質転換体を取得した。クロラムフェニコールに自然突然
変異で耐性となる株の出現頻度は１０−７以下であるの
で形質転換体の取得には問題とならなかった。
上記の方法でμｇＤＮＡ当り１０７〜１０８個の頻度で
形質転換体を取得することができた。
形質転換体を取得することができた。
Claims (1)
- ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムに属する微
生物にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を取り込ませるに当
たり、培養細胞とＤＮＡとを溶液中に共存させた状態で
直流の矩形波電気パルスを加える。これにより、細胞に
ＤＮＡを取り込ませ、供与ＤＮＡ由来の遺伝形質を獲得
した株を取得する事を特徴としたブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムに属する微生物の形質転換法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1028088A JPH02207791A (ja) | 1989-02-07 | 1989-02-07 | 微生物の形質転換法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1028088A JPH02207791A (ja) | 1989-02-07 | 1989-02-07 | 微生物の形質転換法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02207791A true JPH02207791A (ja) | 1990-08-17 |
Family
ID=12239029
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1028088A Pending JPH02207791A (ja) | 1989-02-07 | 1989-02-07 | 微生物の形質転換法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02207791A (ja) |
Cited By (60)
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