JP6452005B2 - 構造化された励起光線により分子の位置を決定する方法および装置 - Google Patents
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Description
2 試料
3 関心のある構造
4 分子
5 蛍光状態にある個々の分子
6 極小値
7 距離
8 領域
9 推移
10 推移
11 推移
12 推移
13 分布
14 走査方向
15 走査方向
16 ステップ
17 ステップ
18 ステップ
19 ステップ
20 ステップ
21 装置
22 励起光源
23 励起光
24 光成形光学系
25 対物レンズ
26 走査装置
27 蛍光
28 ビームスプリッタ
29 光センサアレイ
30 ポイントセンサ
31 ビームスプリッタ
32 励起の弱い領域
XN X方向の極小値の位置
XM X方向の個々の分子の位置
IF 個々の分子からの蛍光の強度
ΣΙ 個々の分子からの蛍光の強度の合計
Claims (23)
- 試料(2)中の物質の個々の分子(5)の位置(XM)を決定する方法であって、
前記物質の前記個々の分子(5)が、励起光(23)で蛍光(27)発光を励起可能である蛍光状態にあり、
前記試料(2)の関心のある領域(1)における前記物質の前記個々の分子(5)間の間隔が、最小値を維持し、かつ
方法が、
前記物質の前記個々の分子(5)を、前記励起光(23)で蛍光(27)発光するよう励起させるステップであって、前記励起光(23)の強度分布が、少なくとも1つの極小値(6)を有するステップと、
前記試料(2)の前記関心のある領域(1)における前記少なくとも1つの極小値(6)のさまざまな位置(XN)について、励起された前記物質の前記個々の分子(5)からの前記蛍光(27)を検知するステップと
を有し、
前記試料(2)の前記関心のある領域(1)における前記物質の前記個々の分子(5)間の間隔の最小値が、d=λ/[(2nsinα)√(1+I/Is)]であり、このとき
λが、前記励起光の波長であり、
nが、前記少なくとも1つの極小値が形成される光学材料の屈折率であり、
αが、前記試料に励起光を向ける前記光学装置の半開口角であり、
Iが、前記試料(2)における前記励起光(23)の最大強度であり、
Isが、前記物質に依存する前記励起光の蛍光励起飽和強度であることと、
前記励起光(23)の前記強度分布の前記極小値(6)の位置では、個々の分子(5)からの前記蛍光(27)の前記強度が、最大で、前記試料(2)における前記励起光(23)の前記最大強度の位置における半分の大きさであることと、
励起された前記物質の前記個々の分子(5)からの前記蛍光(27)が検知される、前記少なくとも1つの極小値(6)の最も近接する位置(XN)間の間隔(7)が、前記最小値dの半分以下であることと、
前記物質の前記個々の分子(5)の位置(XM)を、前記試料(2)の前記関心のある領域(1)における、前記それぞれの分子(5)からの、複数の連続した極小値(6)の位置(XN)上の蛍光(27)の強度(I)の推移から導き出すことと、
極小値を有する関数(9)を、前記それぞれの分子(5)からの、複数の連続した極小値(6)の位置(XN)上の蛍光(27)の強度(I)の推移にフィットさせることと、および前記それぞれの分子(5)の位置(XM)を、フィットさせた前記関数(9)の極小値の位置とすることと、を特徴とする方法。 - 前記関数(9)が、二次関数であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 試料(2)中の物質の個々の分子(5)の位置(XM)を決定する方法であって、
前記物質の前記個々の分子(5)が、励起光(23)で蛍光(27)発光を励起可能である蛍光状態にあり、
前記試料(2)の関心のある領域(1)における前記物質の前記個々の分子(5)間の間隔が、最小値を維持し、かつ
方法が、
前記物質の前記個々の分子(5)を、前記励起光(23)で蛍光(27)発光するよう励起させるステップであって、前記励起光(23)の強度分布が、少なくとも1つの極小値(6)を有するステップと、
前記試料(2)の前記関心のある領域(1)における前記少なくとも1つの極小値(6)のさまざまな位置(XN)について、励起された前記物質の前記個々の分子(5)からの前記蛍光(27)を検知するステップと
を有し、
前記試料(2)の前記関心のある領域(1)における前記物質の前記個々の分子(5)間の間隔の最小値が、d=λ/[(2nsinα)√(1+I/Is)]であり、このとき
λが、前記励起光の波長であり、
nが、前記少なくとも1つの極小値が形成される光学材料の屈折率であり、
αが、前記試料に励起光を向ける前記光学装置の半開口角であり、
Iが、前記試料(2)における前記励起光(23)の最大強度であり、
Isが、前記物質に依存する前記励起光の蛍光励起飽和強度であることと、
前記励起光(23)の前記強度分布の前記極小値(6)の位置では、個々の分子(5)からの前記蛍光(27)の前記強度が、最大で、前記試料(2)における前記励起光(23)の前記最大強度の位置における半分の大きさであることと、
励起された前記物質の前記個々の分子(5)からの前記蛍光(27)が検知される、前記少なくとも1つの極小値(6)の最も近接する位置(XN)間の間隔(7)が、前記最小値dの半分以下であることと、
前記物質の前記個々の分子(5)の位置(XM)を、前記試料(2)の前記関心のある領域(1)における、前記それぞれの分子(5)からの、複数の連続した極小値(6)の位置(XN)上の蛍光(27)の強度(I)の推移から導き出すことと、
前記それぞれの分子(5)からの蛍光(27)の強度(I)が、さまざまな方向で隣接する極小値(6)の位置(XN)上の蛍光(27)の強度(I)よりも小さい極小値(6)の位置(XN)を、前記それぞれの分子(5)の位置(XM)とすることと、を特徴とする方法。 - 励起された前記物質の前記個々の分子(5)からの前記蛍光(27)が検知される、前記少なくとも1つの極小値(6)の最も近接する位置(XN)間の前記間隔(7)が、前記それぞれの分子(5)が最小強度で蛍光(27)発光のみ励起される前記極小値(6)の周囲の励起の弱い領域(32)より大きくないことを特徴とする、請求項1〜3のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの極小値(6)に隣接する前記励起光(23)の前記強度を、前記励起光(23)で励起された前記個々の分子(5)から発せられる前記蛍光(27)の前記強度(I)において飽和に達するほど高く調整することを特徴とする、請求項1〜4のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記物質の前記分子(4)が、調整信号によって、前記調整信号の強度に伴って上昇する遷移確率で、
その蛍光状態から非蛍光状態に、または
非蛍光状態からその蛍光状態に
移行可能であることと、
すべての分子(4)を、その状態とは無関係に観察すると、前記試料(2)の前記関心のある領域(1)において最も近接する前記物質の分子(4)間の間隔が、最小値dより小さいことと、
蛍光状態にある前記物質の前記個々の分子(5)間の間隔を、前記調整信号で調整することと
を特徴とする、請求項1〜5のうちいずれか一項に記載の方法。 - 前記物質の前記分子(4)が、前記調整信号によるその移行の方向に対し、
帰還信号の作用下で、および/または
自発的に、
また別の遷移確率で、その元の状態に戻ることと、
蛍光状態にあるそのつど他の個々の分子(5)について、くり返し、または連続的に、前記最小値dを有する間隔を、前記調整信号、および場合によっては前記帰還信号によって調整することと、
そのつど、蛍光状態にある前記個々の分子(5)の前記位置を決定し、前記試料(2)中の前記物質の分布のイメージングを得ることと
を特徴とする、請求項6に記載の方法。 - 前記試料(2)に、継続的または間欠的に、前記調整信号、および場合によっては前記帰還信号を加えることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 前記調整信号が調整光であることを特徴とする、請求項6〜8のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記物質の前記分子(4)を、前記調整光によって、その蛍光状態からその非蛍光状態に移行させることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記調整光が、前記励起光(23)と同じ波長を有することを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの極小値(6)が点状の極小値であり、前記試料(2)の前記関心のある領域(1)におけるその位置が、前記試料(2)の全延伸方向で変化することと、前記物質の前記個々の分子(5)の前記位置(XM)を、前記試料(2)の前記関心のある領域(1)における、前記それぞれの分子(5)からの、複数の連続した極小値(6)の位置(XN)上の蛍光(27)の強度(I)の推移から導き出すこととを特徴とする、請求項1〜11のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの極小値(6)を取り囲む検知範囲からの前記蛍光(27)を、前記極小値(6)と共焦点に配置されたポイント検出器(30)で検出することを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの極小値(6)が、線または面に沿って広がることと、前記試料(2)の前記関心のある領域(1)におけるその位置(XN)が、前記線または面に対して横向きの走査方向(14、15)で変化することと、前記物質の前記個々の分子(5)の前記位置(XM)を、前記走査方向(14、15)で、前記試料(2)の前記関心のある領域(1)における、前記それぞれの分子(5)からの、複数の連続した極小値(6)の位置(XN)上の蛍光(27)の強度(I)の推移から導き出すこととを特徴とする、請求項1〜11のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記線または面を、前記試料(2)に対してさまざまな方向に合わせて、前記物質の前記個々の分子(5)の位置(XM)をさまざまな空間方向で決定することを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記励起光の前記強度分布が、前記試料(2)の前記関心のある領域(1)におけるその位置が一緒に変化する複数の極小値(6)を有し、前記物質の前記励起された個々の分子(5)からの前記蛍光(27)を、別々に検知することを特徴とする、請求項1〜15のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛍光(27)を、前記試料(2)に対して静止している光センサアレイ(29)で検知することを特徴とする、請求項1〜16のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記光センサアレイ(29)からのフレームを連続的に読み取り、前記試料(2)中の前記少なくとも1つの極小値(6)のそれぞれの位置に分類することを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの極小値(6)が、前記試料(2)中で継続的にシフトすることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 前記試料(2)の前記関心のある領域(1)における前記物質の前記個々の分子(5)間の前記間隔が、前記蛍光(27)の波長における回折限界より大きいことと、前記蛍光状態にある前記物質の前記個々の分子(5)の前記位置(XM)を、追加的に、前記光センサアレイ(29)の上方で前記それぞれの分子(5)から全体として検知される蛍光(ΣΙ)の分布から決定することとを特徴とする、請求項17〜19のうちいずれか一項に記載の方法。
- 励起光(23)であって、
蛍光状態にある物質の分子(4)を蛍光発光するよう励起可能であり、かつ
前記物質の前記分子(4)を、その蛍光状態から非蛍光状態に移行可能である
励起光(23)を放出する励起光源(22)と、
前記励起光を、ある強度分布で前記試料(2)に向ける光学装置と、
前記励起光で励起された前記物質の前記分子(5)から発せられる前記蛍光(27)を検知する検出装置と
を有する、請求項1〜21のうちいずれか一項に記載の方法を実施する装置であって、
光成形光学系(24)が、前記試料(2)において、少なくとも1つの極小値(6)を有する励起光(23)の強度分布を形成し、前記励起光(23)の前記強度分布の前記極小値(6)の位置では、個々の分子(5)からの前記蛍光(27)の前記強度が、最大で、前記試料(2)における前記励起光(23)の前記最大強度の位置における半分の大きさであることと、
前記少なくとも1つの極小値(6)を前記試料(2)中のさまざまな位置(XN)に位置決め可能である走査装置(26)が設けられていることと、
前記検出装置が、前記少なくとも1つの極小値を取り囲む検知範囲から発せられる前記蛍光(27)を、前記試料(2)の別の領域から発せられる蛍光から分離可能に検出することと、
前記検出装置が、前記検知範囲からの前記蛍光(27)を検出する、前記少なくとも1つの極小値(6)の最も近接する位置(XN)間の間隔(7)が、λ/[(4nsinα)√(1+I/Is)]より大きくなく、このとき
λが、前記励起光の波長であり、
nが、前記少なくとも1つの極小値が形成される前記光学材料の屈折率であり、
αが、前記試料に励起光を向ける前記光学装置の半開口角であり、
Iが、前記試料(2)における前記励起光(23)の最大強度であり、
Isが、前記物質に依存する前記励起光の蛍光励起飽和強度であることと
を特徴とする装置。 - 前記光成形光学系(24)が、極小値(6)から成るグリッドを含めて前記試料中の前記励起光(23)の前記強度分布を形成することと、
前記走査装置(26)が、前記強度分布を、前記試料(2)に対してシフトして、前記蛍光状態にある前記物質の前記分子(4)が、最小強度で蛍光(27)発光のみを励起されるゼロ点(6)の周囲にある励起の弱い領域(32)を完全に含めて、前記試料(2)の関心のある領域(1)をスキャンすることと
を特徴とする、請求項21に記載の装置。 - 前記検出装置が、前記試料に対して静止している画像センサアレイ(29)を有することを特徴とする、請求項21または22に記載の装置。
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