DE102022119304A1

DE102022119304A1 - Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur lokalisierung vereinzelter emitter in einer probe

Info

Publication number: DE102022119304A1
Application number: DE102022119304.7A
Authority: DE
Inventors: Andreas SCHÖNLE; Roman Schmidt; Lars KASTRUP
Original assignee: Abberior Instruments GmbH
Current assignee: Abberior Instruments GmbH
Priority date: 2022-08-02
Filing date: 2022-08-02
Publication date: 2024-02-08

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lokalisierung vereinzelter Emitter (E) in einer Probe (2), umfassend eine Vorlokalisierung und eine anschließende Hauptlokalisierung mit den Schritten Beleuchten der Probe (2) mit einer ein lokales Minimum (M) aufweisenden Intensitätsverteilung (I) des oder eines anderen Beleuchtungslichts an Beleuchtungspositionen (10), die um die in der Vorlokalisierung geschätzte Position (S) des Emitters (E) angeordnet sind, Erfassen der Lichtemissionen des Emitters (E) für die Beleuchtungspositionen (10) und Bestimmen der Position (S) des Emitters (E) in der Probe (2) aus den für die Beleuchtungspositionen (10) erfassten Lichtemissionen, wobei die Beleuchtungspositionen (10) für die Hauptlokalisierung vor dem Beleuchten der Probe (2) festgelegt werden, wobei eine maximale Ausdehnung (L) eines Beleuchtungsmusters (11) der Beleuchtungspositionen (10) abhängig von einer Positionsunsicherheit (σr) der geschätzten Position (S) eingestellt oder festgelegt wird. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Lichtmikroskop (1) zur Durchführung des Verfahrens, ein Computerprogramm und die Verwendung eines Faserbündels (19) für das Verfahren.

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Vorrichtung und ein Computerprogramm zur Lokalisierung vereinzelter Emitter in einer Probe nach dem MINFLUX-Prinzip sowie die Verwendung eines Faserbündels in dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Stand der Technik
Unter dem Begriff „MINFLUX-Mikroskopie“ bzw. „MINFLUX-Verfahren“ werden bestimmte Lokalisierungs- und Trackingverfahren für vereinzelte Emitter zusammengefasst, bei denen am Fokus in der Probe eine Lichtverteilung von Beleuchtungslicht, das die Lichtemission des Emitters induziert oder moduliert, erzeugt wird, wobei die Lichtverteilung ein lokales Minimum aufweist, und bei denen die Position eines vereinzelten Emitters durch Erfassen von Lichtemissionen des Emitters bestimmt wird, wobei ausgenutzt wird, dass von dem Emitter umso weniger Licht emittiert wird, je geringer der Abstand zwischen dem Emitter und dem Minimum der Lichtverteilung ist. Aufgrund der letztgenannten Tatsache sind MINFLUX-Verfahren, insbesondere im Vergleich zu sogenannten PALM/STORM-Lokalisierungsverfahren, besonders photoneneffizient. Zusätzlich ergibt sich bei bestimmten Ausführungen des Verfahrens auch der Vorteil, dass die zu lokalisierenden oder zu verfolgenden Emitter im Vergleich zu anderen Lokalisierungsmethoden mit relativ wenig Licht beaufschlagt werden und daher weniger gebleicht werden.
Bei den vereinzelten lichtemittierenden Emittern handelt es sich insbesondere um Fluorophore und das Beleuchtungslicht ist insbesondere Anregungslicht, welches die Fluorophore anregt, woraufhin diese Fluoreszenzlicht aussenden. Alternativ kann es sich bei den lichtemittierenden Emittern z.B. auch um lichtstreuende Partikel, wie etwa Gold-Nanopartikel handeln.
Die Lichtverteilung mit dem lokalen Minimum kann insbesondere 2D-donutförmig oder 3D-donutförmig sein.
Ein Verfahren der oben beschriebenen Art wurde in der Patentanmeldung DE 10 2011 055 367 A1 für das Einzelmolekül-Tracking beschrieben. Gemäß der dort offenbarten Methode wird die Position eines einzelnen Fluorophors über die Zeit verfolgt, indem eine Anregungslichtverteilung mit lokalem Minimum dem Fluorophor so nachgeführt wird, dass die Fluoreszenzemissionsrate minimal ist.
Die Patentanmeldung DE 10 2013 114 860 A1 beschreibt insbesondere ein Lokalisationsverfahren, bei dem die Probe an Rasterpunkten mit dem lokalen Minimum einer Anregungslichtverteilung abgetastet wird, um einzelne Fluorophore zu lokalisieren.
Der Begriff „MlNFLUX“ wird zum ersten Mal in der Publikation „Balzarotti F, Eilers Y, Gwosch KC, Gynna AH, Westphal V, Stefani FD, Elf J, Hell SW. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 2017 Feb 10;355(6325):606-612" verwendet. Bei der dort beschriebenen Methode wird das MINFLUX-Prinzip konkret umgesetzt, indem ein einzelner Fluorophor zunächst durch Abtasten mit einer ersten gaußförmigen Anregungslichtverteilung vorlokalisiert wird und anschließend eine zweite donutförmige Anregungslichtverteilung an Punkten platziert wird, die ein symmetrisches Muster von Beleuchtungspositionen um die in der Vorlokalisierung geschätzte Position des Fluorophors bilden. Aus den für die einzelnen Beleuchtungspositionen registrierten Photonenzahlen wird dann mit einem maximum-likelihood-Schätzer die Position des Fluorophors auf wenige Nanometer genau bestimmt.
Weitere Varianten und Ausführungsformen einer MINFLUX-Lokalisierung sind in den Patentanmeldungen DE 10 2016 119 262 A1 , DE 10 2016 119 263 A1 und DE 10 2016 119 264 A1 beschrieben.
Die Publikation „Gwosch KC, Pape JK, Balzarotti F, Hoess P, Ellenberg J, Ries J, Hell SW. MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolution in cells. Nat Methods. 2020 Feb;17(2):217-224“ beschreibt iterative 2D- und 3D-MINFLUX-Lokalisierungsverfahren. Dabei wird die Probe in mehreren Iterationsschritten an Beleuchtungspositionen mit dem Minimum einer donutförmigen Anregungslichtverteilung beleuchtet, wobei die Beleuchtungspositionen ein um die im jeweils vorhergehenden Schritt geschätzte Position des Fluorophors zentriertes symmetrisches Beleuchtungsmuster bilden, und wobei die Beleuchtungspositionen in jedem Iterationsschritt enger um die aktuell geschätzte Position des Fluorophors platziert werden. Hierdurch lässt sich in wenigen Schritten eine sehr hohe Positionsgenauigkeit erreichen.
Eine weiteres iteratives MINFLUX-Lokalisations- und Tracking-Verfahren unter Verwendung eines abgewandelten Positionsschätzers und auf Basis eines kommerziellen Mikroskop-Aufbaus ist in „Schmidt R, Weihs T, Wurm CA, Jansen I, Rehman J, Sahl SJ, Hell SW. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nat Commun. 2021 Mar 5;12(1):1478“ beschrieben.
Das Licht, welches die Lichtemission der Emitter induziert oder moduliert, kann z.B. auch STED (stimulated emission depletition)-Licht sein. So beschreiben die Patentanmeldungen DE 10 2017 104 736 A1 und EP 3 372 989 A1 MINFLUX-artige Verfahren, die auf einer Überlagerung einer Anregungslichtverteilung mit lokalem Maximum mit einer STED-Lichtverteilung mit lokalem Minimum beruhen. Die Probe wird durch Verlagerung der STED-Verteilung mit dem STED-Minimum abgetastet und aus den gemessenen Werten der Fluoreszenzintensität bei verschiedenen Positionen der STED-Intensitätsverteilung wird die Position des Fluorophors bestimmt. Hierbei emittiert der Fluorophor im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen MINFLUX-Verfahren mit abnehmendem Abstand von dem lokalen Minimum mehr Licht.
Die oben beschriebenen iterativen MINFLUX-Verfahren liefern zuverlässig eine sehr hohe Positionsgenauigkeit, haben jedoch den Nachteil, dass leistungsfähige Prozessoren und Steuergeräte erforderlich sind, die eine rechenaufwändige Live-Positionsschätzung mit der Rückkopplungskontrolle von Strahlablenkungseinheiten wie elektrooptischen Deflektoren kombinieren.
Die Patentanmeldung WO 2020/128106 A1 sowie die Publikation „Masullo LA, Steiner F, Zähringer J, Lopez LF, Bohlen J, Richter L, Cole F, Tinnefeld P, Stefani FD. Pulsed Interleaved MINFLUX. Nano Letters 2021, 21 (1), 840-846“ beschreiben unter anderem Ausführungsformen von MINFLUX-Lokalisierungsverfahren, bei denen die Positionen, an denen die Probe mit dem Minimum der Anregungslichtverteilung beleuchtet wird, durch Anordnungen von Lichtleitfasern fest vorgegeben sind, wobei das Anregungslicht durch einen Pulslaser erzeugt wird, und wobei einzelne Anregungslichtpulse zeitlich versetzt durch die verschiedenen Faserenden der Lichtleitfasern ausgegeben werden.
Die Veröffentlichung „Masullo LA, Lopez LF, Stefani FD. A common framework for singlemolecule localization using sequential structured illumination. Biophysical Reports 2022 2(1), 100036“ beschreibt eine als RASTMIN bezeichnete Variante der MINFLUX-Technik, bei dem ein kleiner Bereich innerhalb eines mikroskopischen Sichtfeldes, das einen einzelnen Emitter enthält, in einem kartesischen Raster mit dem Minimum einer donutförmigen Anregungslichtverteilung abgetastet wird, wobei aus den erfassten Lichtintensitäten die Position des Emitters bestimmt wird.
In der Publikation „Slenders E, Vicidomini G. ISM-FLUX: single-step MINFLUX with an array detector. bioRxiv; 2022. DOI: 10.1101/2022.04.19.488747“ ist ein MINFLUX-Verfahren beschrieben, bei dem das von einem einzelnen Fluorophor emittierte Licht mittels eines Array-Detektors positionsabhängig erfasst wird, um in einem einzigen Lokalisationsschritt nicht-iterativ, ohne Repositionierung des Beleuchtungsmusters und ohne Vorlokalisation die Position des Fluorophors zu bestimmen.
Eine Positionsbestimmung ohne Vorlokalisierung hat jedoch den Nachteil, dass eine Fotoaktivierung notwendig ist, um vereinzelte lichtemittierende Fluorophore im Bildfeld zu erhalten. Dies beschränkt die Anwendbarkeit des Verfahrens, da nicht alle Fluorophore fotoaktivierbar sind.
Aufgabe der Erfindung
Ausgehend von den oben beschriebenen Nachteilen des Standes der Technik besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein photoneneffizientes, rechen- bzw. steuerungstechnisch einfaches und universell anwendbares Lokalisationsverfahren für vereinzelte Emitter zur Verfügung zu stellen.
Lösung
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche 1, 30, 33 und 34 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen 2 bis 29 und 31 bis 32 angegeben und werden im Folgenden beschrieben.
Beschreibung der Erfindung
Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lokalisierung vereinzelter Emitter in einer Probe, umfassend eine Vorlokalisierung mit den Schritten

- Beleuchten der Probe mit Beleuchtungslicht, wobei das Beleuchtungslicht Lichtemissionen eines vereinzelten Emitters in der Probe induziert oder moduliert;
- Erfassen der Lichtemissionen des Emitters;
- Schätzen der Position des Emitters in der Probe aus den erfassten Lichtemissionen;

- Beleuchten der Probe mit einer in mindestens einer Raumrichtung ein lokales Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung des oder eines anderen Beleuchtungslichts an Beleuchtungspositionen, die um die in der Vorlokalisierung geschätzte Position des Emitters angeordnet sind;
- Erfassen der Lichtemissionen des Emitters für die jeweiligen Beleuchtungspositionen;
- Bestimmen der Position des Emitters in der Probe aus den für die Beleuchtungspositionen erfassten Lichtemissionen.

Erfindungsgemäß werden die Beleuchtungspositionen für die Hauptlokalisierung vor dem Beleuchten der Probe mit der Intensitätsverteilung festgelegt, wobei die Beleuchtungspositionen ein Beleuchtungsmuster bilden, das eine maximale Ausdehnung aufweist, wobei die maximale Ausdehnung abhängig von einer Positionsunsicherheit der in der Vorlokalisierung geschätzten Position eingestellt oder festgelegt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Beleuchtungspositionen für die Hauptlokalisierung (insbesondere zu Beginn der Hauptlokalisierung) festgelegt. Mit anderen Worten: Die Beleuchtungspositionen sind insbesondere veränderbar, aber das Beleuchtungsmuster der Beleuchtungspositionen wird während der Hauptlokalisierung nicht mehr verändert. Während der Hauptlokalisierung bleiben die Beleuchtungspositionen relativ zu der Probe ortsfest. Insbesondere wird außerdem nur eine einzige Hauptlokalisierung durchgeführt, um den Emitter zu lokalisieren. Die Festlegung der Beleuchtungspositionen hat gegenüber aus dem Stand der Technik bekannten iterativen MINFLUX-Verfahren, bei denen das Beleuchtungsmuster in jedem Iterationsschritt angepasst wird, den Vorteil, dass die Steuerung des Lichtmikroskops ohne die sonst erforderliche Rückkopplungsschleife auskommt, und somit einfacher ausgelegt werden kann.
Unter dem Begriff Emitter sind Moleküle, Molekülkomplexe oder Partikel zu verstehen, die bei Beleuchtung mit dem Beleuchtungslicht Licht emittieren. Bei dem emittierten Licht kann es sich insbesondere um Fluoreszenzlicht, Rayleigh-Streulicht oder RAMAN-Streulicht handeln. Ein Emitter kann dabei insbesondere bei einer beugungsbegrenzten Abbildung mit einem Lichtmikroskop als Punktlichtquelle betrachtet werden, hat also insbesondere eine Ausdehnung im Bereich der Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie oder darunter. Die Emitter können z.B. einzelne Fluorophore (Fluoreszenzfarbstoffe), mit einem oder mehreren Fluorophoren markierte Moleküle oder Molekülkomplexe oder sogenannte quantum dots sein. Die Fluoreszenzfarbstoffe können durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen an die Moleküle gebunden sein. Biologische Makromoleküle wie Proteine werden z.B. häufig durch Bindung an Antikörper nachgewiesen, die wiederum kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen verknüpft sind. Weiterhin kann ein Emitter im Sinne der Erfindung z.B. auch ein lichtstreuendes Nanopartikel, etwa ein Gold-Nanopartikel, sein.
Mit vereinzelten Emittern sind Emitter gemeint, die optisch trennbar bzw. optisch auflösbar sind. Das kann bedeuten, dass die Emitter einen Abstand zueinander aufweisen, der oberhalb der Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie liegt. Alternativ ist es aber auch möglich, dass die Lichtemissionen eines Emitters während eines Zeitintervalls registriert werden, in welchem ein benachbarter Emitter kein Licht emittiert, z.B. weil es sich (im Fall von Fluorophoren) in einem Dunkelzustand befindet. Auf diese Weise können z.B. Emitter, die einen Abstand unterhalb der Beugungsgrenze haben, aber asynchron blinken, lichtmikroskopisch aufgelöst werden. Dies ist beispielsweise aus stochastischen Lokalisationsmethoden wie PALM/STORM bekannt. Schließlich ist es auch möglich, Emitter, die einen Abstand unterhalb der Beugungsgrenze aufweisen, aber Licht unterschiedlicher Wellenlängen emittieren durch spektrale Trennung des emittierten Lichts lichtmikroskopisch aufzulösen oder zwei Emitter mit unterschiedlichen Anregungsspektren mit unterschiedlichen Wellenlängen anzuregen, um die Emitter optisch zu trennen. Ebenso können Emitter, die eine unterschiedliche Emissionslebensdauer aufweisen, über die Messung der Lebensdauer (z.B. durch zeitaufgelöste Einzelphotonenzählung) voneinander unterschieden und somit getrennt detektiert werden. Sämtliche dieser Ausführungsbeispiele fallen unter den Begriff „vereinzelte Emitter“. Eine Probe mit vereinzelten Emittern kann insbesondere dadurch erhalten werden, dass die Bedingungen einer Markierung der Probe mit Fluoreszenzfarbstoffen derart angepasst werden, dass sich eine gewünschte Markierungsdichte von Einzelmolekülen in der Probe ergibt, durch gezieltes Fotoaktivieren von Fluoreszenzfarbstoffen und/oder durch Einstellung der physikochemischen Eigenschaften der Probenumgebung (z.B. durch Reduktionsmittel, Oxidationsmittel und bestimmte Enzyme in der Probe), so dass eine bestimmte Blinkrate der Fluoreszenzfarbstoffe erreicht wird.
Die zu lokalisierenden Emitter sind insbesondere während des Lokalisierungsverfahrens bezüglich der Zeitskala des Experiments stationär in der Probe angeordnet. In diesem Fall ist das erfindungsgemäße Verfahren also kein Tracking-Verfahren zur Positionsverfolgung eines sich in der Probe bewegenden Emitters. Bei Verwendung einer ausreichend schnellen Vorlokalisationsmethode kann das Verfahren aber auch als Tracking-Verfahren zur Positionsverfolgung eines sich in der Probe bewegenden Emitters ausgestaltet sein.
Das Beleuchten der Probe mit dem Beleuchtungslicht erfolgt insbesondere mittels eines Lichtmikroskops, und zwar weiter insbesondere durch ein Objektiv des Lichtmikroskops. Dabei wird das Beleuchtungslicht insbesondere in die Probe fokussiert, weiter insbesondere während der Hauptlokalisierung und optional auch während der Vorlokalisierung.
Bei dem Beleuchtungslicht handelt es sich insbesondere um Anregungslicht, welches die Emitter zur Fluoreszenz anregt. Die Anregung zur Fluoreszenz ist dabei ein Beispiel für das Induzieren der Lichtemission durch das Beleuchtungslicht. Alternativ kann das Beleuchtungslicht die Lichtemission auch modulieren, z.B. hemmen. Beispiele hierfür sind insbesondere STED-Licht, welches den angeregten Zustand von Fluorophoren durch stimulierte Emission entvölkert und Schaltlicht, welches z.B. Fluorophore von dem angeregten Zustand in einen Dunkelzustand, etwa einen Triplett-Zustand, überführen kann. Beleuchtungslicht, das die Lichtemission moduliert, wird dabei insbesondere in der Hauptlokalisierung verwendet, weiter insbesondere in Kombination mit Anregungslicht. In der Vorlokalisierung wird insbesondere nur Anregungslicht als Beleuchtungslicht verwendet.
Bei der Hauptlokalisierung wird die Probe mit einer Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts beleuchtet, die ein lokales Minimum aufweist. Das lokale Minimum befindet sich dabei insbesondere am geometrischen Fokus des Beleuchtungslichts in der Probe und ist idealerweise als Intensitätsnullstelle ausgebildet. Das lokale Minimum ist in mindestens einer Raumrichtung von Intensitätsanstiegsbereichen umgeben und kann punktförmig sein, also in zwei oder drei Raumrichtungen von Intensitätsanstiegsbereichen umgeben sein. Insbesondere kann es sich bei der Intensitätsverteilung um einen 2D-Donut oder einen 3D-Donut (auch als bottle beam bezeichnet) handeln. Alternativ kann das lokale Minimum entlang einer Linie oder einer Ebene erstreckt sein, also entlang einer ersten Raumrichtung erstreckt und in einer weiteren zweiten Raumrichtung (die insbesondere senkrecht zu der ersten Raumrichtung ist) von Intensitätsanstiegsbereichen umgeben sein. Eine Intensitätsverteilung mit einer entlang einer Ebene erstreckten Nullstelle kann z.B. durch Modulation eines linear polarisierten Lichtstrahls mit einem segmentierten Phasenmuster mit einem Phasensprung von π erzeugt werden. Zur Phasenmodulation des Beleuchtungslichts kann in allen oben beschriebenen Fällen z.B. eine Phasenplatte oder ein sogenannter spatial light modulator (SLM) verwendet werden. Entsprechende Methoden sind aus dem Stand der Technik zur STED- und MINFLUX-Mikroskopie bekannt. Durch die Intensitätsverteilung mit dem lokalen Minimum kann die Positionsbestimmung bei der Hauptlokalisierung nach dem MINFLUX-Prinzip erfolgen, d.h. es wird ausgenutzt, dass die Lichtemissionen eines vereinzelten Emitters umso geringer sind je dichter sich der Emitter an dem lokalen Minimum befindet.
Die Beleuchtungspositionen sind die Positionen, an denen sich das lokale Minimum des Beleuchtungslichts befindet. An diesen Positionen wird das lokale Minimum während der Hauptlokalisierung, insbesondere nacheinander, angeordnet und die entsprechenden Lichtemissionen werden erfasst. Wenn das lokale Minimum in einer zeitlichen Abfolge an den Beleuchtungspositionen positioniert wird, kann dabei eine feste Abfolge der Beleuchtungspositionen einmal oder mehrfach durchlaufen werden. Alternativ ist auch eine veränderliche oder sogar zufällige Abfolge der Beleuchtungspositionen möglich. Die Verlagerung des lokalen Minimums relativ zu der Probe kann schrittweise oder kontinuierlich erfolgen. Bei einer kontinuierlichen Bewegung kann die Zuordnung der erfassten Lichtemissionen zu einer Beleuchtungsposition in ähnlicher Weise wie beim kontinuierlichen Scannen in der Rastermikroskopie z.B. durch Definieren entsprechender Zeitintervalle (sogenannter dwell times) und Zuweisen der Lichtemissionen zu einer mittleren Beleuchtungsposition während des entsprechenden Zeitintervalls erfolgen. Das Verlagern des lokalen Intensitätsminimums relativ zu der Probe kann insbesondere durch Strahlverlagerung (z.B. elektrooptisch oder mittels eines galvanometrischen Scanners), Probenverlagerung (z.B. mittels eines mit einem piezoelektrischen Aktuator verfahrbaren Probenhalters) oder durch Ansteuerung bestimmter Punktlichtquellen wie Faserenden einer Lichtleitfaser realisiert werden.
Für eine eindimensionale Lokalisierung des Emitters sind mindestens zwei voneinander beabstandete Beleuchtungspositionen erforderlich. Für eine zweidimensionale Lokalisierung des Emitters werden mindestens drei Beleuchtungspositionen in einer zur optischen Achse des Beleuchtungslichts senkrechten Ebene (Fokusebene) benötigt und eine dreidimensionale Lokalisierung erfordert mindestens vier Beleuchtungspositionen, von denen mindestens zwei Beleuchtungspositionen entlang der optischen Achse beabstandet sind (also nicht beide in der Fokusebene liegen). Es können aber auch deutlich mehr Beleuchtungspositionen verwendet werden, wie dies z.B. aus der sogenannten RASTMIN-Technik bekannt ist.
Die Lichtemissionen des Emitters werden mittels eines Detektors erfasst, z.B. mittels eines Punktdetektors (etwa einer avalanche-Photodiode, APD, eines Photomultipliers oder eines sogenannten Hybriddetektors) oder eines Flächendetektors mit mehreren Detektorelementen oder Pixeln (z.B. einer CCD- oder CMOS-Kamera oder einem APD-Array). Im Fall eines Flächendetektors können die einzelnen Detektorelemente separat auslesbar sein. Bei der Erfassung der Lichtemissionen können insbesondere einzelne emittierte Photonen registriert werden, insbesondere zeitaufgelöst. Dazu kann eine Auswerteelektronik (z.B. ein sogenanntes TCSPC-Modul) vorgesehen sein. APDs mit der Möglichkeit der Einzelphotonenzählung werden auch als SPADs (single photon avalanche photodiodes) bezeichnet. Wenn einzelne Photonen registriert werden, kann z.B. eine Photonenrate berechnet werden, welche als Maß für die Lichtemission des Emitters dient.
Für die Erfassung der Lichtemissionen in der Vorlokalisierung und der Hauptlokalisierung kann derselbe Detektor verwendet werden oder es können verschiedene Detektoren zum Einsatz kommen, z.B. eine Kamera für die Vorlokalisierung und ein Punktdetektor oder ein Array von Photodioden für die Hauptlokalisierung.
Das Schätzen der Position des Emitters in der Vorlokalisierung kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Wenn z.B. bei der Vorlokalisierung ein Detektor mit mehreren Detektorelementen zur positionsabhängigen Erfassung der Lichtemissionen in der Detektionsebene verwendet wird, kann die Positionsschätzung durch Ermitteln eines zweidimensionalen Intensitätshistogramms und Bestimmen des Zentroids dieses Histogramms oder durch eine Momentbestimmung (insbesondere des ersten Moments der Verteilung von Lichtintensitäten) erfolgen. Wenn die Probe bei der Vorlokalisierung mit einem (z.B. gaußförmigen) Fokus des Beleuchtungslichts abgetastet wird, kann die Position auf Basis der Scanposition bestimmt werden, für die sich eine maximale Lichtemission ergibt.
Für die Positionsbestimmung nach dem MINFLUX-Prinzip in der Hauptlokalisierung wird insbesondere ein Positionsschätzer verwendet. Dabei können z.B. aus dem Stand der Technik bekannte Schätzer zur Anwendung kommen (siehe z.B. „Balzarotti F, Eilers Y, Gwosch KC, Gynna AH, Westphal V, Stefani FD, Elf J, Hell SW. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 2017 Feb 10;355(6325):606-612“).
Die maximale Ausdehnung (die insbesondere bei einem polygonförmigen Beleuchtungsmuster durch den Durchmesser eines Kreises und bei einem kartesischen Raster durch die Länge und/oder Breite des Rasterbereichs definiert ist)wird insbesondere möglichst klein gewählt, da die Lokalisierungsgenauigkeit der in der Hauptlokalisierung bestimmten Position von dieser maximalen Ausdehnung abhängt. Gleichzeitig muss die maximale Ausdehnung aber groß genug gewählt werden, um sicherzustellen, dass sich der zu lokalisierende Emitter mit hoher Wahrscheinlichkeit in einem Fangbereich des Lokalisationsverfahrens befindet. Der Fangbereich ist der Bereich, in dem sich der Emitter befinden muss, um mit dem Verfahren eindeutig lokalisiert werden zu können. Das bedeutet insbesondere, dass ein für das entsprechende Lokalisationsverfahren verwendbarer maximum-likelihood- Positionsschätzer ein eindeutiges Maximum aufweist, wenn sich der Emitter in dem Fangbereich befindet.. Die Größe des Fangbereichs kann insbesondere auch von der verwendeten Art der Detektion von Emissionslicht abhängen. So kann der Fangbereich z.B. durch einen Detektor mit mehreren in einer Detektionsebene angeordneten Detektorelementen vergrößert werden.
Dadurch dass erfindungsgemäß die Positionsunsicherheit bei der Wahl der maximalen Ausdehnung des Beleuchtungsmusters berücksichtigt wird, kann der Emitter in der Hauptlokalisierung mit hoher Wahrscheinlichkeit in einem einzigen Schritt (also im Gegensatz zum Stand der Technik nicht-iterativ) mit für diesen Schritt oder insgesamt fest vorgegebenen Beleuchtungspositionen mit ausreichender Genauigkeit lokalisiert werden. Dies erlaubt im Vergleich zu iterativen MINFLUX-Methoden des Standes der Technik eine sehr viel einfachere Steuerelektronik ohne Rückkopplungsschleifen. Insbesondere führt eine höhere Positionsunsicherheit der geschätzten Position bei der Vorlokalisation zu einer größeren maximalen Ausdehnung des Beleuchtungsmusters.
Gemäß einer Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren mehrmals für unterschiedliche Emitter durchgeführt, wobei die Position der Emitter nacheinander bestimmt wird, und wobei aus den bestimmten Positionen ein Bild von Strukturen der Probe erstellt wird.
Gemäß einer Ausführungsform ist das Beleuchtungslicht Anregungslicht, das die Lichtemissionen des Emitters induziert. Die Probe wird dabei also wie bei dem ursprünglich beschriebenen MINFLUX-Verfahren mit einer Intensitätsverteilung von Anregungslicht mit einem lokalen Minimum, insbesondere einer Nullstelle, beleuchtet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die Beleuchtungspositionen auf einem Abtastkreis oder einer Abtastkugel um die geschätzte Position des Emitters angeordnet, wobei die maximale Ausdehnung dem Durchmesser des Abtastkreises oder der Abtastkugel entspricht. Dabei lässt sich durch eine Anordnung auf einem Abtastkreis mit geeignetem Durchmesser eine 2D-MINFLUX-Lokalisierung realisieren, wobei die Positionsgenauigkeit der Lokalisierung von dem Durchmesser abhängt. Für eine 3D-Lokalisierung können insbesondere Beleuchtungspunkte auf einer Abtastkugel verwendet werden. Alternativ können die Beleuchtungspositionen im 3D-Fall auch auf einem Abtastellipsoid angeordnet sein, wobei die maximale Ausdehnung dann durch die Länge der längeren Hauptachse des Ellipsoids definiert ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das Beleuchtungsmuster ein Raster, insbesondere ein kartesisches Raster oder ein hexagonales Raster. Der Begriff Raster beschreibt dabei eine zwei- oder dreidimensionale regelmäßige Anordnung von Beleuchtungspunkten, die einen Bereich der Probe abdeckt. Dabei weisen insbesondere benachbarte Beleuchtungspunkte die gleichen Abstände zueinander auf. Ein kartesisches Raster von Beleuchtungspunkten wird z.B. bei der sogenannten RASTMIN-Technik verwendet.
Gemäß einer Ausführungsform wird die Positionsunsicherheit aus den erfassten Lichtintensitäten bestimmt, wobei die maximale Ausdehnung des Beleuchtungsmusters entsprechend der bestimmten Positionsunsicherheit eingestellt wird. Die Positionsunsicherheit wird dabei, insbesondere automatisch, mittels einer an das Lichtmikroskop gekoppelten oder in dieses integrierten Recheneinheit bestimmt. Insbesondere wird dabei die Positionsunsicherheit aus einer in der Vorlokalisierung registrierten Anzahl von von dem Emitter emittierten Photonen bestimmt. Bei kamerabasierten Lokalisationsverfahren (beispielsweise PALM/STORM und verwandte Methoden) ist die Positionsunsicherheit umso geringer je mehr Photonen von einem Emitter detektiert wurden. Wird diese Positionsunsicherheit etwa als Standardabweichung einer Ortskoordinate ausgedrückt, ist sie umgekehrt proportional zur Quadratwurzel der Gesamtphotonenzahl. Weiterhin hängt die Positionsunsicherheit bei kamerabasierten Methoden auch von der Pixelgröße, vom Hintergrund und von der Breite der Punktspreizfunktion ab. Als untere Grenze der Positionsunsicherheit kann das sogenannte Cramer-Rao lower bound verwendet werden, also die bestmögliche Lokalisierungspräzision mit jedem erwartungstreuen Positionsschätzer.
Durch Bestimmen der Positionsunsicherheit kann die maximale Ausdehnung auf besonders gut optimierte Werte eingestellt werden, um in einem einzigen Lokalisationsschritt kombiniert mit der Information der Vorlokalisation eine möglichst genaue Positionsschätzung zu erzielen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die maximale Ausdehnung des Beleuchtungsmusters auf einen vorgegebenen Wert festgelegt, wobei die Vorlokalisierung so durchgeführt wird, dass sich ein Wert der Positionsunsicherheit ergibt, dem der vorgegebene Wert der maximalen Ausdehnung zugeordnet ist. Der vorgegebene Wert der maximalen Ausdehnung kann apparativ fixiert sein, z.B. durch Verwendung einer Lichtleitfaser mit mehreren in einem Muster angeordneten Faserenden. Alternativ kann der Wert der maximalen Ausdehnung grundsätzlich veränderbar sein, aber für jeweils eine Hauptlokalisierung oder eine Gruppe von Hauptlokalisierungen festgelegt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die Schritte der Vorlokalisierung wiederholt oder wird ein Zeitintervall, während dem die Vorlokalisierung durchgeführt wird, angepasst, bis die Positionsunsicherheit der geschätzten Position einen vorgegebenen oder vorgebbaren Grenzwert unterschreitet. Insbesondere wird dabei die Vorlokalisierung durchgeführt, bis der Emitter eine vorgegebene Anzahl von Photonen emittiert hat.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die maximale Ausdehnung des Beleuchtungsmusters gemäß der Bedingung L = a · σ_r eingestellt oder festgelegt, wobei L die maximale Ausdehnung bezeichnet, wobei σ_r die Positionsunsicherheit der in der Vorlokalisierung geschätzten Position bezeichnet, und wobei a einen Proportionalitätsfaktor bezeichnet. Insbesondere ist die Positionsunsicherheit eine Standardabweichung oder eine Varianz einer Lokalisierungsverteilung des Emitters. Insbesondere ist der Proportionalitätsfaktor a größer als Null.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist der Proportionalitätsfaktor a einen Wert im Bereich von 1 bis 3 auf. Das heißt, der Proportionalitätsfaktor beträgt insbesondere das Ein- bis Dreifache der Standardabweichung der Lokalisierungsverteilung.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform beträgt die Positionsunsicherheit der in der Vorlokalisierung geschätzten Position 50 nm oder weniger, insbesondere 20 nm oder weniger, weiter insbesondere 10 nm oder weniger.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform beträgt die maximale Ausdehnung des Beleuchtungsmusters 100 nm oder weniger, insbesondere 50 nm oder weniger.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist die in der Vorlokalisierung geschätzte Position eine größere Positionsunsicherheit auf als die in der Hauptlokalisation bestimmte Position des Emitters.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das Schätzen der Position des Emitters in der Vorlokalisierung mit einem nichtiterativen Verfahren durchgeführt. Die Position wird also innerhalb einer Vorlokalisierung nach dem Belichten mit dem Beleuchtungslicht und dem Erfassen der Lichtemissionen nur einmal geschätzt. Das bedeutet insbesondere, dass nicht, wie z.B. bei im Stand der Technik beschriebenen iterativen MINFLUX-Verfahren nach einer ersten Positionsschätzung die Beleuchtung der Probe mit einem angepassten Beleuchtungsmuster wiederholt wird, um die Positionsschätzung zu verfeinern. Dies verringert den Rechenaufwand und erhöht die Geschwindigkeit des Verfahrens.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Probe in der Vorlokalisierung mit einem Fokus oder einem Intensitätsminimum des Beleuchtungslichts abgetastet, wobei insbesondere ein Abtastbild der Probe erstellt wird. Ein Abtastbild ist dabei ein Bild mit Pixeln, wobei jedem Pixel eine für eine bestimmte Position des Fokus oder des Minimums erfasste Lichtintensität zugeordnet ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird in der Vorlokalisierung ein Weitfeldbild der Probe erzeugt. Ein Weitfeldbild ist ein Bild, das durch eine im Wesentlichen homogene Beleuchtung der Probe mit dem Beleuchtungslicht und insbesondere eine Erfassung der Lichtemissionen von Emittern in der Probe mit einem Detektor mit mehreren Detektorelementen, etwa einer Kamera, erhalten wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden in der Vorlokalisierung die Positionen mehrerer Emitter geschätzt, wobei ein erster Emitter aus den mehreren Emittern ausgewählt wird, und wobei die Position des ersten Emitters in der Hauptlokalisierung bestimmt wird. Dazu kann z.B. ein Detektor mit mehreren Detektorelementen, z.B. eine Kamera, verwendet werden. Insbesondere werden dabei die Positionen der mehreren Emitter mit einem stochastischen Lokalisationsverfahren geschätzt. Unter dem Begriff „stochastisches Lokalisationsverfahren“ ist dabei ein Verfahren gemeint, bei dem aus einer Mehrzahl von Lokalisierungen vereinzelter Partikel in der Probe eine Lokalisierungskarte der Partikel mit einer Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze (sog. Abbe-Grenze, die durch die Wellenlänge des Lichts und die numerische Apertur des Objektivs bestimmt wird) erstellt wird, wobei die Partikel oder mit den Partikeln gekoppelte Emitter stochastisch zwischen einem emittierenden Zustand und einem nicht-emittierenden Zustand wechseln. Dabei werden die Bedingungen insbesondere so eingestellt, dass diejenigen Partikel oder Emitter, die sich jeweils in einer Lokalisierung in dem emittierenden Zustand befinden, einen Abstand oberhalb der Beugungsgrenze aufweisen. Der stochastische Übergang zwischen dem nicht-emittierenden Zustand und dem emittierenden Zustand kann z.B., wie aus der sogenannten PALM-Technik (photoactivated localization microscopy) bekannt, durch Beleuchten der Probe mit Aktivierungslicht hervorgerufen werden. Alternativ können auch die chemischen Bedingungen in der Probe so eingestellt werden, dass die Partikel bzw. Emitter mit einer gewünschten Frequenz blinken, d.h. spontan zwischen dem emittierenden und dem nicht-emittierenden Zustand wechseln. Dies wird beispielsweise bei der sogenannten dSTORM-Technik (direct stochastic optical reconstruction microscopy) und bei der SOFI-Technik (superresolution optical fluctuation imaging) ausgenutzt, wobei bei der letztgenannten Technik insbesondere bei der Datenauswertung eine Autokorrelationsfunktion verwendet wird, um einzelne Emitter voneinander zu trennen. Insbesondere wird der erste Emitter automatisch aus den mehreren Emittern ausgewählt. Alternativ ist auch eine manuelle Auswahl durch einen Benutzer des Lichtmikroskops möglich. Die Auswahl kann zufällig sein oder nach einem vorgegebenen Kriterium erfolgen. Ein solches Kriterium kann insbesondere die Anzahl der für den jeweiligen Emitter erfassten und registrierten Photonen sein, welche unter anderem die Positionsunsicherheit bestimmt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird für den Emitter eine Gesamtphotonenzahl von zu registrierenden Photonen festgelegt, wobei die Gesamtphotonenzahl in eine erste Photonenzahl und eine zweite Photonenzahl aufgeteilt wird, und wobei die Position des Emitters in der Vorlokalisierung geschätzt wird, wenn die in der Vorlokalisierung erfassten Lichtemissionen die erste Photonenzahl erreichen.
Auf diese Weise kann die Position eines Emitters auf besonders photoneneffiziente Weise unter Ausnutzung bestimmter Vorteile der Vorlokalisierung mit hoher Positionsgenauigkeit bestimmt werden. Beispielsweise kann die Vorlokalisierung besonders schnell sein, so dass durch die Aufteilung des Photonenbudgets eine gewünschte Kombination aus Geschwindigkeit und Genauigkeit erreicht werden kann.
Je nach Anwendung, insbesondere je nach Anforderungen an die Messgeschwindigkeit und Positionsgenauigkeit, kann die Gesamtphotonenzahl etwa im Bereich von 40 bis 1000 Photonen liegen. Die erste Photonenzahl steht insbesondere zu der zweiten Photonenzahl in einem Verhältnis von 1:10 bis 10: 1, weiter insbesondere 1:5 bis 5:1, weiter insbesondere 1:2 bis 2:1.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Position des Emitters in der Hauptlokalisierung bestimmt, wenn die in der Hauptlokalisierung erfassten Lichtemissionen die zweite Photonenzahl erreichen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die Lichtemissionen des Emitters bei der Vorlokalisierung mit einem eine Vielzahl an Detektorelementen aufweisenden Detektor, insbesondere einer Kamera oder einem Array von Photodioden, erfasst. Dabei erfassen die Detektorelemente die Lichtemissionen insbesondere positionsabhängig in einer Detektionsebene. Die Detektionsebene ist insbesondere konfokal zu einer Fokusebene in der Probe, die einen geometrischen Fokus des Beleuchtungslichts enthält, d.h. die Detektionsebene ist eine Bildebene bezüglich der Fokusebene in der Probe. Insbesondere sind die Detektorelemente des Detektors einzeln auslesbar.
Die Detektion der Lichtemissionen mit dem eine Vielzahl an Detektorelementen aufweisenden Detektor während der Vorlokalisierung ermöglicht eine relativ schnelle Positionsschätzung mit ausreichender (und durch die detektierte Photonenzahl anpassbarer) Genauigkeit, um anschließend in einem einzigen Schritt mit einer festen maximalen Ausdehnung des Beleuchtungsmusters eine Hauptlokalisierung durchzuführen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die während der Vorlokalisierung geschätzte Position des Emitters mit einem Positionsschätzer, z.B. einem least-mean-square-Schätzer oder einem maximum-likelihood-Schätzer, auf Basis der von den Detektorelementen erfassten Lichtemissionen ermittelt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die während der Vorlokalisierung geschätzte Position des Emitters durch eine Momentbestimmung, insbesondere durch Bestimmung des ersten Moments (insbesondere eines gewichteten Mittels) einer Lichtintensitätsverteilung, auf Basis der von den Detektorelementen erfassten Lichtemissionen ermittelt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine Funktion an aus den von den Detektorelementen erfassten Lichtemissionen erhaltene Daten angepasst, wobei die während der Vorlokalisierung geschätzte Position aus der angepassten Funktion ermittelt wird. Beispielsweise kann ein Funktionsfit der Daten an eine zweidimensionale Gauß-Funktion durchgeführt werden, wobei die Position des Maximums und die Breite der Gauß-Funktion angepasst werden, bis die Abweichung der Daten von der Funktion ein Minimum erreicht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Zentroid einer von den Detektorelementen erfassten Verteilung von Lichtemissionen (also insbesondere einer räumlichen Verteilung in der Detektionsebene) bestimmt, wobei auf Basis des Zentroids die Position des Emitters geschätzt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die Lichtemissionen des Emitters bei der Hauptlokalisierung mit einem eine Vielzahl an Detektorelementen aufweisenden Detektor, insbesondere einem Array von Photodioden, erfasst. Dabei erfassen die Detektorelemente insbesondere die Lichtemissionen positionsabhängig in einer Detektionsebene. Insbesondere ist die Detektionsebene konfokal zu einer Fokusebene in der Probe, die einen geometrischen Fokus des Beleuchtungslichts enthält, d.h. die Detektorelemente sind in einer der Fokusebene zugeordneten Bildebene angeordnet. Insbesondere sind die Detektorelemente des Detektors einzeln auslesbar.
Dies hat den Vorteil, dass der Fangbereich der Lokalisierung (also der Bereich, in dem sich ein zu lokalisierender Emitter befinden muss, damit dieses mit dem oben beschriebenen MINFLUX-Verfahren eindeutig lokalisierbar ist) durch die zusätzliche Information der positionsaufgelösten Detektion erweitert ist. Auf diese Weise ist auch dann die Lokalisierung des Emitters mit einem nicht-iterativen Verfahren möglich, wenn die tatsächliche Position des Emitters außerhalb des Beleuchtungsmusters liegt. Dies ermöglicht die Lokalisierung in einem einzigen Hauptlokalisierungs-Schritt mit festgelegten Beleuchtungspositionen. Das Verfahren ist somit insbesondere auf einem einfacheren Lichtmikroskop mit Steuerelektronik ohne Rückkopplungsschleifen implementierbar.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden einzelne von dem Emitter emittierte und von den Detektorelementen des in der Vorlokalisierung und/oder der Hauptlokalisierung verwendeten Detektors erfasste Photonen registriert. Dazu kann z.B. eine elektronische Auswerteeinheit wie ein sogenanntes TCSPC (time correlated single photon counting) - Modul verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform werden die Lichtemissionen während der Vorlokalisierung mit einem eine Vielzahl an Detektorelementen aufweisenden Detektor erfasst, wobei die Lichtemissionen während der Hauptlokalisierung mit einem Punktdetektor (z.B. einer avalanche-Photodiode (APD), einem Photomultiplier oder einem Hybriddetektor) erfasst werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die Lichtemissionen während der Vorlokalisierung mit einem Punktdetektor erfasst, wobei die Lichtemissionen während der Hauptlokalisierung mit einem eine Vielzahl an Detektorelementen aufweisenden Detektor erfasst werden. Insbesondere sind dabei die Detektorelemente einzeln auslesbar, weiter insbesondere wobei die Detektorelemente dazu ausgebildet sind, einzelne von dem Emitter emittierte und von den Detektorelementen erfasste Photonen zu registrieren, weiter insbesondere wobei der Detektor mit der Vielzahl an Detektorelementen ein Array von Photodioden ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die Lichtemissionen während der Vorlokalisierung mit einem ersten Detektor erfasst, der eine Vielzahl an Detektorelementen aufweist, wobei die Lichtemissionen während der Hauptlokalisierung mit einem zweiten Detektor erfasst werden, der eine Vielzahl an Detektorelementen aufweist. Insbesondere handelt es sich bei dem ersten Detektor um eine Kamera und/oder es handelt sich bei dem zweiten Detektor um einen Detektor mit einzeln auslesbaren Detektorelementen, weiter insbesondere wobei die Detektorelemente dazu ausgebildet sind, einzelne von dem Emitter emittierte und von den Detektorelementen detektierte Photonen zu registrieren, weiter insbesondere wobei der zweite Detektor ein Array von Photodioden (z.B. ein SPAD-Array) ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Anordnung der Beleuchtungspositionen durch mindestens eine Lichtquelle und/oder durch eine Beleuchtungsoptik während der Lokalisierung des Emitters, insbesondere während der Hauptlokalisierung, fest vorgegeben. „Fest vorgegeben“ bedeutet dabei insbesondere, dass die relative Positionierung der Beleuchtungspositionen zueinander festgelegt ist, jedoch eine Verlagerung des von den Beleuchtungspositionen gebildeten Beleuchtungsmusters gegenüber der Probe möglich ist.
Dies hat insbesondere den Vorteil, dass die Probe ohne schnelle Strahlablenkungs-Vorrichtungen, wie z.B. elektrooptische Deflektoren, an den Beleuchtungspositionen mit dem lokalen Minimum der Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts beleuchtet werden kann. Dadurch lässt sich ein weniger komplexes und günstigeres MINFLUX-Mikroskop realisieren. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders gut für die Verwendung eines fest vorgegebenen Beleuchtungsmusters, da die Positionsbestimmung nach dem MINFLUX-Prinzip nicht-iterativ erfolgt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Probe an den Beleuchtungspositionen über jeweilige Punktlichtquellen mit dem Beleuchtungslicht beleuchtet. Die Punktlichtquellen können über separate Lichtquellen (z.B. Laser) realisiert werden, oder das Licht einer Lichtquelle kann aufgeteilt werden, um die Punktlichtquellen zu bilden, z.B. über eine Anordnung von Strahlteilern, über, insbesondere einzeln ansteuerbare und bewegbare, Mikrospiegel oder durch Einkoppeln des Lichts einer Lichtquelle in mehrere Lichtleitfasern.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die Punktlichtquellen durch jeweilige Faserenden von Lichtleitfasern gebildet, aus denen das Beleuchtungslicht austritt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind mindestens zwei Gruppen von Lichtleitfasern vorgesehen, wobei in der Hauptlokalisierung abhängig von der Positionsunsicherheit der in der Vorlokalisierung geschätzten Position eine der Gruppen ausgewählt wird, und wobei die Probe in der Hauptlokalisierung mittels der ausgewählten Gruppe von Lichtleitfasern an den Beleuchtungspositionen beleuchtet wird, so dass die maximale Ausdehnung des Beleuchtungsmusters durch die Auswahl der Gruppe eingestellt wird. Beispielsweise können die Gruppen von Lichtleitfasern konzentrisch um einen gemeinsamen Mittelpunkt eines Faserbündels angeordnet sein.
Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass ohne Strahlablenkungseinheiten, wie z.B. elektrooptische Deflektoren, die maximale Ausdehnung ohne eine Verstellung optischer Komponenten (z.B. einer verstellbaren Teleskopoptik) auf einfache Weise verändert werden kann.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die Punktlichtquellen durch Reflexion eines Eingangslichtstrahls an einem oder mehreren Mikrospiegeln einer Mikrospiegelanordnung gebildet. Solche Mikrospiegelanordnungen, z.B. sogenannte digital mirror devices, DMD , ermöglichen eine sehr flexible Aufteilung und gezielte Ablenkung eines Eingangslichtstrahls. Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die Beleuchtungspositionen, insbesondere das Beleuchtungsmuster, zwischen verschiedenen Hauptlokalisierungen einstellbar. Die Verstellung kann insbesondere durch Einstellung eines Vergrößerungsfaktors erfolgen, weiter insbesondere durch Auswahl oder Wechsel eines Objektivs oder durch Einstellung einer Zoom-Optik. Weiterhin ist es insbesondere möglich, die Verstellung durch Einstellung einer Mikrospiegelanordnung oder durch selektive Verwendung unterschiedlicher Lichtleitfasern, insbesondere eines Faserbündels, zu realisieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Probe mittels Lichtpulsen des Beleuchtungslichts beleuchtet, insbesondere wobei aufeinanderfolgende Lichtpulse unterschiedlichen Beleuchtungspositionen zugeordnet sind. Die letztgenannte Ausführungsform kann auch als pulse-interleaved-Beleuchtung bezeichnet werden. Bei dieser Variante des Verfahrens wird die Probe insbesondere an den Beleuchtungspositionen eines Beleuchtungsmusters durch ein jeweiliges Faserende einer Lichtleitfaser beleuchtet. Dabei kann der Laserstrahl eines Pulslasers auf verschiedene unterschiedlich lange Lichtleitfasern aufgeteilt werden, um die gewünschte zeitliche Verzögerung der Lichtpulse zu erreichen. Dabei kann der Laserstrahl vor der Einkopplung in die Lichtleitfasern, z.B. mittels Strahlteilern, aufgeteilt werden. Während der Hauptlokalisierung erfolgt dann die Beleuchtung der Probe an den Beleuchtungspositionen insbesondere wiederholt, d.h. die Pulssequenz wird mehrfach durchlaufen, um eine ausreichende Anzahl von emittierten Photonen zu erhalten. Der Begriff „Lichtpulse“ bezeichnet dabei Lichtmengen, die sich in bestimmten Zeitintervallen von einer Lichtquelle ausbreiten, während zwischen den Zeitintervallen kein Licht von der Lichtquelle ausgesendet wird. Die Lichtpulse können dabei periodisch oder aperiodisch sein, d.h. in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen auftreten. Weiterhin ist der im Kontext dieser Offenbarung verwendete Begriff „Lichtpuls“ nicht auf eine bestimmte Zeitskala eingeschränkt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist die Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts mindestens drei um das lokale Minimum herum angeordnete lokale Maxima auf, wobei sich eine Winkellage der Maxima entlang einer durch eine Ausbreitungsrichtung des Beleuchtungslichts definierten optischen Achse ändert. Die Winkellage bezieht sich dabei auf eine Lage in einer zu der optischen Achse senkrechten Ebene. Eine solche, auch als „Trenut“ bezeichnete Intensitätsverteilung kann insbesondere durch Phasenmodulation des Beleuchtungslichts mit einer Kombination einer Vortex-Phase und einer Trefoil-Phase in einer zu der Pupille des Objektivs konjugierten Ebene erzeugt werden, insbesondere mit einem sogenannten spatial light modulator (SLM), der einzeln ansteuerbare Pixel aufweist. Der Phasenhub der Trefoil-Phase kann dabei z.B. 10% bis 200%, insbesondere 20% bis 150%, weiter insbesondere 30% bis 120%, weiter insbesondere 80% bis 110%, weiter insbesondere 100%, des Phasenhubs der Vortexphase, betragen. Das Verhältnis der Phasenhübe beeinflusst insbesondere die laterale Lage der Maxima und den Abstand der Maxima entlang der optischen Achse - je größer der Phasenhub der Trefoil-Phase ist, desto weiter verlagern sich die Maxima nach außen und desto größer wird die Länge der Maxima in einer axialen Richtung (parallel zu der optischen Achse).
Mittels der Trenut-Intensitätsverteilung lässt sich vorteilhafterweise durch eine Belichtung mit der Intensitätsverteilung in einer einzigen Fokusebene Tiefeninformation über die Lage des Emitters gewinnen. In einem gewissen Bereich steigt dabei die Genauigkeit der axialen Positionsbestimmung mit der maximalen Ausdehnung eines Beleuchtungsmusters, bei dem die Probe an den Beleuchtungspositionen mit der Trenut-Intensitätsverteilung belichtet wird. Man erhält dann durch eine iterative Verkleinerung des Beleuchtungsmusters keine zusätzliche axiale Information. Daher lässt sich diese Intensitätsverteilung besonders vorteilhaft in dem nicht- iterativen einschrittigen erfindungsgemäßen Verfahren einsetzen.
Insbesondere sind die drei oder mehr Maxima der Intensitätsverteilung gleichmäßig um das lokale Minimum herum verteilt. Insbesondere ändern sich die Winkellagen der drei oder mehr Maxima entlang der optischen Achse über einen vorgesehenen axialen Erfassungsbereich (entlang der optischen Achse) um einen Betrag, der 180° geteilt durch die Anzahl der Maxima entspricht. Insbesondere ist die Anzahl der Beleuchtungspunkte auf die Anzahl und Lage der Maxima abgestimmt. Dadurch kann der Emitter mit einer Intensität beleuchtet werden, die eine Funktion der axialen Lage des Emitters mit einem maximalen Wertebereich ist. Insbesondere ist die Anzahl der Beleuchtungspunkte doppelt so groß wie die Anzahl der Maxima.
Insbesondere werden bei der Bestimmung der Position des Emitters die Lichtemissionen für mindestens zwei Teilmengen der Beleuchtungspunkte des Beleuchtungsmusters separat ausgewertet. Für die zwei Teilmengen wird jeweils ein Schätzwert ermittelt, z.B. durch Bilden einer mit den für die jeweiligen Beleuchtungspunkten erfassten Photonenzahlen gewichteten Vektorsumme, wobei die summierten Vektoren die Beleuchtungspositionen der jeweiligen Teilmenge des Beleuchtungsmusters angeben. Anschließend kann z.B. die Differenz zwischen den Schätzwerten gebildet werden. Diese Differenz kann insbesondere als unkalibrierter Schätzer (also als Schätzer mit einem von der tatsächlichen Position des Emitters abhängigen systematischen Fehler) für die laterale Position des Emitters in der Fokusebene verwendet werden. Eine Kalibrierung des Schätzers (also eine Korrektur des systematischen Fehlers) kann z.B. mithilfe von Simulationen durchgeführt werden. Die oben beschriebene Differenzbildung erlaubt insbesondere bei Verwendung der Intensitätsverteilung mit den drei oder mehr Maxima, deren Winkellage sich entlang der optischen Achse ändert (Trenut-Verteilung), eine besonders präzise Positionsbestimmung. Weiterhin lässt sich auf diese Weise auch mit anderen Intensitätsverteilungen (z.B. einem 2D-Donut) der Fangbereich vergrößern. Als unkalibrierter Schätzer für die axiale Position kann bei Verwendung einer Trenut-Verteilung insbesondere die Differenz der für die zwei Teilmengen erfassten Lichtemissionen (hier Photonenzahlen) verwendet werden.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft ein Lichtmikroskop zur Lokalisierung vereinzelter Emitter in einer Probe, insbesondere nach dem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt, umfassend

- mindestens eine Lichtquelle und/oder eine Beleuchtungsoptik, die dazu ausgebildet ist, die Probe mit Beleuchtungslicht zu beleuchten, wobei das Beleuchtungslicht Lichtemissionen eines Emitters in der Probe induziert oder moduliert,
- einen Lichtmodulator, der dazu ausgebildet ist, in der Probe eine ein lokales Minimum aufweisende Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts oder eines anderen Beleuchtungslichts zu erzeugen,
- mindestens einen Detektor, der dazu ausgebildet ist, Lichtemissionen des Emitters zu erfassen,
- eine Recheneinheit, die dazu ausgebildet ist, aus erfassten Lichtemissionen eine Position des Emitters in der Probe zu schätzen und/oder zu bestimmen, und
- eine Steuereinheit, die dazu ausgebildet ist, während einer Vorlokalisierung die Lichtquelle und/oder die Beleuchtungsoptik des Lichtmikroskops so zu steuern, dass die Lichtquelle und/oder die Beleuchtungsoptik die Probe mit dem Beleuchtungslicht beleuchtet, den Detektor so zu steuern, dass der Detektor die Lichtemissionen des Emitters erfasst und die Recheneinheit so zu steuern, dass die Recheneinheit die Position des Emitters in der Probe aus den von dem Detektor erfassten Lichtemissionen schätzt, und während einer anschließenden Hauptlokalisierung die Lichtquelle und/oder die Beleuchtungsoptik und/oder den Lichtmodulator so zu steuern, dass die Lichtquelle und/oder die Beleuchtungsoptik die Probe mit einer ein lokales Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung des oder eines anderen Beleuchtungslichts an für die Hauptlokalisierung vor dem Beleuchten der Probe mit der Intensitätsverteilung festgelegten Beleuchtungspositionen beleuchtet, wobei die Beleuchtungspositionen um die in der Vorlokalisierung geschätzte Position des Emitters angeordnet sind, wobei die Beleuchtungspositionen ein Beleuchtungsmuster bilden, das eine maximale Ausdehnung aufweist, die abhängig von einer Positionsunsicherheit der in der Vorlokalisierung geschätzten Position eingestellt oder festgelegt ist, den Detektor oder einen weiteren Detektor so zu steuern, dass der Detektor oder der weitere Detektor die Lichtemissionen des Emitters jeweils für die Beleuchtungspositionen erfasst, und wobei die Recheneinheit dazu ausgebildet ist, die Position des Emitters in der Probe aus den für die Beleuchtungspositionen erfassten Lichtemissionen zu bestimmen.

Gemäß einer Ausführungsform des Lichtmikroskops ist die Steuereinheit dazu ausgebildet, die maximale Ausdehnung des Beleuchtungsmusters abhängig von der Positionsunsicherheit der in der Vorlokalisierung geschätzten Position einzustellen oder festzulegen.
Die Lichtquelle weist insbesondere einen oder mehrere Laser auf.
Bei dem Lichtmodulator handelt es sich insbesondere um eine Phasenplatte oder einen sogenannten spatial light modulator mit einzeln ansteuerbaren Pixeln. Insbesondere ist der Lichtmodulator dazu ausgebildet, eine Phasenverteilung des Beleuchtungslichts, insbesondere in einer zur Pupille des Objektivs konjugierten Ebene (d.h. einer Fourier-Ebene bezüglich der Bildebene) zu modulieren, so dass sich am Fokus in der Probe die Intensitätsverteilung mit dem lokalen Minimum ergibt.
Gemäß einer Ausführungsform des Lichtmikroskops weist der Detektor eine Vielzahl von Detektorelementen auf. Insbesondere sind die Detektorelemente einzeln auslesbar. Insbesondere ist der Detektor oder eine mit dem Detektor gekoppelte Auswerteelektronik dazu ausgebildet, einzelne von dem Emitter emittierte und von den Detektorelementen erfasste Photonen zu registrieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop einen ersten Detektor auf, der dazu ausgebildet ist, die Lichtemissionen des Emitters während der Vorlokalisierung zu erfassen, wobei das Lichtmikroskop einen weiteren zweiten Detektor aufweist, der dazu ausgebildet ist, die Lichtemissionen des Emitters während der Hauptlokalisierung zu erfassen. Insbesondere weisen sowohl der erste Detektor als auch der zweite Detektor eine Vielzahl an Detektorelementen auf, wobei weiter insbesondere die Detektorelemente des zweiten Detektors einzeln auslesbar sind, und/oder wobei weiter insbesondere der zweite Detektor dazu ausgebildet ist, einzelne von dem Emitter emittierte und von den Detektorelementen des zweiten Detektors erfasste Photonen zu registrieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist die Lichtquelle eine Mehrzahl an Lichtleitfasern auf, wobei die Lichtleitfasern jeweilige Faserenden aufweisen, und wobei die Lichtleitfasern dazu ausgebildet sind, die Probe über die Faserenden an den Beleuchtungspositionen mit in die Lichtleitfasern eingekoppeltem Beleuchtungslicht zu beleuchten.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform bilden die Lichtleitfasern ein Faserbündel.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die Lichtleitfasern in einer zu einer Längserstreckungsrichtung des Faserbündels senkrechten Ebene symmetrisch um ein Zentrum des Faserbündels angeordnet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform gibt die Lichtquelle oder eine Beleuchtungsoptik des Lichtmikroskops die Anordnung der Beleuchtungspositionen während der Lokalisierung des Emitters, insbesondere während der Hauptlokalisierung, fest vor. Das heißt insbesondere, dass die relative Positionierung der Beleuchtungspositionen zueinander festgelegt ist, jedoch eine Verlagerung des von den Beleuchtungspositionen gebildeten Beleuchtungsmusters gegenüber der Probe möglich ist. Insbesondere zu diesem Zweck kann das Lichtmikroskop z.B. einen galvanometrischen Scanner aufweisen, der dazu ausgebildet ist, einen Beleuchtungslichtstrahl des Beleuchtungslichts relativ zu der Probe zu verlagern.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop eine Mehrzahl an Punktlichtquellen auf, wobei die Punktlichtquellen dazu ausgebildet sind, die Probe an jeweiligen Beleuchtungspositionen mit dem Beleuchtungslicht zu beleuchten. Insbesondere weist das Lichtmikroskop eine Mehrzahl an Lichtquellen, z.B. Lasern, auf, wobei die Lichtquellen jeweils Punktlichtquellen bilden. Insbesondere weist das Lichtmikroskop mindestens einen Strahlteiler oder eine Anordnung von, insbesondere einzeln ansteuerbaren und beweglichen, Mikrospiegeln, auf, der bzw. die dazu ausgebildet ist, das Licht der Lichtquelle zur Bildung der Punktlichtquellen aufzuteilen. Insbesondere bilden alternativ dazu die Faserenden der Lichtleitfasern die Punktlichtquellen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop zumindest eine erste Gruppe von Lichtleitfasern und eine zweite Gruppe von Lichtleitfasern auf, wobei die Steuereinheit dazu ausgebildet ist, in der Hauptlokalisierung abhängig von der Positionsunsicherheit der in der Vorlokalisierung geschätzten Position die erste Gruppe oder die zweite Gruppe auszuwählen und die Lichtquelle so zu steuern, dass die Probe in der Hauptlokalisierung entsprechend der Auswahl entweder mittels der ersten Gruppe von Lichtleitfasern an ersten Beleuchtungspositionen beleuchtet wird, die ein erstes Beleuchtungsmuster bilden, das eine erste maximale Ausdehnung aufweist oder mittels der zweiten Gruppe von Lichtleitfasern an zweiten Beleuchtungspositionen beleuchtet wird, die ein zweites Beleuchtungsmuster bilden, das eine zweite maximale Ausdehnung aufweist, die sich von der ersten maximalen Ausdehnung unterscheidet. Beispielsweise können die erste und die zweite Gruppe von Lichtleitfasern konzentrisch um einen gemeinsamen Mittelpunkt eines Faserbündels angeordnet sein.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop eine erste Gruppe von Lichtleitfasern und eine zweite Gruppe von Lichtleitfasern auf, wobei die Lichtleitfasern der ersten Gruppe in einer zu einer Längserstreckungsrichtung des Faserbündels senkrechten Ebene einen ersten Abstand von einem Zentrum des Faserbündels aufweisen, und wobei die Lichtleitfasern der zweiten Gruppe einen zweiten Abstand von dem Zentrum aufweisen, der sich von dem ersten Abstand unterscheidet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Lichtmikroskop eine Mikrospiegelanordnung mit mehreren Spiegeln auf, wobei die Punktlichtquellen durch Reflexion eines Eingangslichtstrahls an einem oder mehreren der Spiegel gebildet werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Steuereinheit des Lichtmikroskops dazu ausgebildet, einen Objektivrevolver, eine Zoom-Optik, die Mikrospiegelanordnung oder die Lichtleitfasern so zu steuern, dass die Beleuchtungspositionen, insbesondere das Beleuchtungsmuster, zwischen verschiedenen Hauptlokalisierungen einstellbar sind bzw. ist, insbesondere durch Einstellung eines Vergrößerungsfaktors.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist die Lichtquelle einen Pulslaser auf, der dazu ausgebildet ist, die Probe mittels Lichtpulsen des Beleuchtungslichts zu beleuchten, insbesondere wobei aufeinanderfolgende Lichtpulse unterschiedlichen Beleuchtungspositionen zugeordnet sind. Dabei ist das Lichtmikroskop insbesondere so konfiguriert, dass die Lichtpulse in unterschiedlich lange Lichtleitfasern eingekoppelt werden, wobei die Lichtleitfasern dazu ausgebildet sind, die Probe an jeweiligen Beleuchtungspositionen zu beleuchten. Der Begriff Pulslaser umfasst dabei insbesondere auch Vorrichtungen, bei denen eine kontinuierliche Laserlichtquelle mit einer Pulserzeugungsvorrichtung (z. B. auf Basis eines AOM) kombiniert ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weisen zumindest ein Teil der Lichtleitfasern unterschiedliche Längen auf. Dabei können insbesondere alle Lichtleitfasern unterschiedliche Längen aufweisen. Falls mehrere Gruppen von Lichtleitfasern vorgesehen sind, können insbesondere die Lichtleitfasern einer jeweiligen Gruppe unterschiedliche Längen aufweisen. Wenn Laserpulse in die Lichtleitfasern eines solchen Faserbündels eingekoppelt werden, kann auf einfache Weise eine pulse-interleaved-Beleuchtung an den Beleuchtungspositionen realisiert werden.
Ein dritter Aspekt der Erfindung betrifft ein Computerprogramm umfassend Befehle, die das Lichtmikroskop nach dem zweiten Aspekt dazu veranlassen, das Verfahren nach dem ersten Aspekt durchzuführen.
Ein vierter Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Faserbündels mit einer Mehrzahl an Lichtleitfasern in einem Verfahren nach dem ersten Aspekt, wobei die Probe über jeweilige Faserenden der Lichtleitfasern an den Beleuchtungspositionen mit dem Beleuchtungslicht beleuchtet wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die Lichtleitfasern in einer zu einer Längserstreckungsrichtung des Faserbündels senkrechten Ebene symmetrisch um ein Zentrum des Faserbündels angeordnet.
Gemäß einer Ausführungsform des vierten Aspekts weist das Faserbündel eine erste Gruppe von Lichtleitfasern und eine zweite Gruppe von Lichtleitfasern auf, wobei die Lichtleitfasern der ersten Gruppe in einer zu einer Längserstreckungsrichtung des Faserbündels senkrechten Ebene einen ersten Abstand von einem Zentrum des Faserbündels aufweisen, und wobei die Lichtleitfasern der zweiten Gruppe einen zweiten Abstand von dem Zentrum aufweisen, der sich von dem ersten Abstand unterscheidet. Die Gruppen von Lichtleitfasern sind insbesondere konzentrisch um das Zentrum angeordnet. Durch solche Anordnungen ist es möglich, das Beleuchtungslicht selektiv in die Gruppen von Lichtleitfasern einzukoppeln, und somit die maximale Ausdehnung des Beleuchtungsmusters einzustellen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des vierten Aspekts weisen zumindest ein Teil der Lichtleitfasern unterschiedliche Längen auf. Dabei können insbesondere alle Lichtleitfasern unterschiedliche Längen aufweisen. Falls mehrere Gruppen von Lichtleitfasern vorgesehen sind, können insbesondere die Lichtleitfasern einer jeweiligen Gruppe unterschiedliche Längen aufweisen. Wenn Laserpulse in die Lichtleitfasern eines solchen Faserbündels eingekoppelt werden, kann auf einfache Weise eine pulse-interleaved-Beleuchtung an den Beleuchtungspositionen realisiert werden.
Weitere Merkmale des Lichtmikroskops nach dem zweiten Aspekt, des Computerprogramms gemäß dem dritten Aspekt ergeben und der Verwendung nach dem vierten Aspekt ergeben sich aus den oben beschriebenen Merkmalen des Verfahrens nach dem ersten Aspekt.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen und den zugehörigen Erläuterungen zu den Zeichnungen. Die beschriebenen Vorteile von Merkmalen und / oder Merkmalskombinationen der Erfindung sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen.
Hinsichtlich des Offenbarungsgehalts (aber nicht des Schutzbereichs) der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents gilt Folgendes: Weitere Merkmale sind den Zeichnungen - insbesondere den dargestellten relativen Anordnungen und Wirkverbindungen-zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen, was aber nicht für die unabhängigen Patentansprüche des erteilten Patents gilt.
Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
Im Folgenden werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Figuren beschrieben. Diese beschränken nicht den Gegenstand dieser Offenbarung und den Schutzumfang.
Kurzbeschreibung der Figuren

1 zeigt schematisch eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens;
2 zeigt ein erfindungsgemäßes Lichtmikroskop mit einem Detektor mit mehreren Detektorelementen;
3 zeigt ein erfindungsgemäßes Lichtmikroskop mit zwei Detektoren mit jeweils mehreren Detektorelementen;
4 zeigt einen Teil eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops mit einem Faserbündel;
5 zeigt einen Beleuchtungsstrahlengang eines weiteren erfindungsgemäßen Lichtmikroskops mit einem Faserbündel;
6 zeigt ein weiteres erfindungsgemäßes Lichtmikroskop mit einem Faserbündel;
7 zeigt ein weiteres Beispiel eines Faserbündels mit mehreren konzentrischen Gruppen von Lichtleitfasern;
8 illustriert die Strahlverlagerung eines Beleuchtungsmusters mit einem Galvo-Scanner;
9 illustriert die Anpassung der maximalen Ausdehnung des Beleuchtungsmusters mittels einer Zoom-Optik;
10 zeigt einen Teil eines weiteren erfindungsgemäßen Lichtmikroskops mit Strahlteilern zur Erzeugung von Punktlichtquellen;
11 zeigt eine Lichtquelle und einen Teil des Strahlengangs eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops mit einer Mikrospiegelanordnung.

Beschreibung der Figuren
1 zeigt schematisch den Ablauf eines beispielhaften erfindungsgemäßen Verfahrens zur Lokalisierung eines vereinzelten Emitters E, z.B. eines einzelnen mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Moleküls, in einer Probe 2.. Der Emitter E emittiert Fluoreszenzlicht (Lichtemissionen D), wenn die Probe 2 mit Beleuchtungslicht B (hier Anregungslicht) bestrahlt wird. Zur Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs kann die Probe 2 z.B. mittels einer Weitfeldbeleuchtung mit dem Beleuchtungslicht B beleuchtet werden.
Die Position des Emitters E wird zunächst in einer Vorlokalisierung (1 oben) geschätzt. Dazu werden die Lichtemissionen D von den Detektorelementen 7 eines Detektors 5 positionsabhängig in einer Detektionsebene erfasst. Bei dem Detektor 5 kann es sich z.B. um eine Kamera (etwa eine CCD-Kamera oder eine CMOS-Kamera) handeln, die positionsabhängig Lichtintensitäten des von dem Emitter E emittierten Lichts erfasst. Diese Lichtintensitäten sind in 1 in Form von den einzelnen Detektorelementen 7 zugeordneten Graustufen dargestellt. Aus den Lichtintensitäten kann mithilfe einer Recheneinheit 8 die Position des Emitters E in der Probe 2 abgeschätzt werden, z.B. (wie aus der PALM/STORM-Mikroskopie bekannt) durch Bestimmen eines Zentroids der Lichtintensitätsverteilung auf dem Detektor 5, durch einen Fit einer zweidimensionalen Gauß-Verteilung an die Lichtintensitätsverteilung, durch Verwendung eines Maximum-Likelihood-Positionsschätzers oder durch Momentbestimmung.
In einer anschließenden Hauptlokalisierung (1 unten) wird dann die Position des Emitters E in der Probe 2 mit hoher Genauigkeit nach dem MINFLUX-Prinzip bestimmt. Dazu wird die Probe 2 mit einer Intensitätsverteilung I des Beleuchtungslichts B (hier des Anregungslichts) mit einem lokalen Minimum M (z.B. einem 2D-Donut oder einem 3D-Donut) beleuchtet. Das lokale Minimum M wird dabei, insbesondere nacheinander, an Beleuchtungspositionen 10 in der Probe 2 platziert, die ein Beleuchtungsmuster 11 bilden. In dem Ausführungsbeispiel gemäß 1 wird ein sechseckförmiges Beleuchtungsmuster 11 verwendet, das symmetrisch um die in der Vorlokalisation geschätzte Position S angeordnet ist. Jedoch kann alternativ z.B. auch, wie aus der sogenannten RASTMIN-Methode bekannt, ein kartesisches oder hexagonales Raster von Beleuchtungspositionen 10 verwendet werden. Für jede Beleuchtungsposition 10 werden die Lichtemissionen D des Emitters E erfasst, wobei insbesondere einzelne Photonen registriert werden. Dann wird mittels einer Recheneinheit 8 des Lichtmikroskops 1 aus den für die einzelnen Beleuchtungspositionen 10 erfassten und registrierten Lichtemissionen D die Position des Emitters E bestimmt, z.B. unter Verwendung eines Maximum-Likelihood-Positionsschätzers oder einer Momentbestimmung.
Das Beleuchtungsmuster 11 hat eine maximale Ausdehnung L, die bei dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel dem Durchmesser eines Abtastkreises A um die geschätzte Position S entspricht. Insbesondere ist die Größe der Intensitätsverteilung I im Vergleich zu der Größe des Abtastkreises A nicht maßstabsgerecht dargestellt.
Die maximale Ausdehnung L wird erfindungsgemäß in Abhängigkeit einer Positionsunsicherheit σ_R der in der Vorlokalisierung geschätzten Position S eingestellt oder festgelegt. Dabei ist insbesondere die maximale Ausdehnung L umso größer je unsicherer die Positionsschätzung ist. Durch die Abstimmung der maximalen Ausdehnung L auf die Positionsunsicherheit σ_R der Vorlokalisierung ist es möglich, die Position des Emitters E nach dem MINFLUX-Prinzip in einem einzigen Schritt mit fest vorgegebenen Beleuchtungspositionen 10 (also im Gegensatz zu aus dem Stand der Technik bekannten Methoden nicht-iterativ) zu bestimmen.
Die Abhängigkeit zwischen Positionsunsicherheit σ_R und der maximalen Ausdehnung ergibt sich daraus, dass der Bereich in der Probe 2, in dem sich der Emitter E mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit tatsächlich befindet, umso größer ist, je unsicherer die Positionsschätzung bei der Vorlokalisierung ist. Der Fangbereich der Hauptlokalisierung (MINFLUX-Lokalisierung) muss dann mindestens so groß sein wie der Bereich, in dem sich der Emitter E mit der gegebenen Wahrscheinlichkeit aufhält. Ein größerer Fangbereich kann durch eine größere maximale Ausdehnung L des Beleuchtungsmusters 11 erzielt werden.
Statt wie bei manchen aus dem Stand der Technik bekannten MINFLUX-Verfahren unabhängig von der Genauigkeit der Vorlokalisierung durch mehrere Iterationsschritte der Hauptlokalisierung eine hohe Genauigkeit zu erreichen, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere eine im Vergleich zum Stand der Technik genauere Vorlokalisation durchgeführt, um in der anschließenden einschrittigen Hauptlokalisierung insgesamt eine ausreichende Genauigkeit zu erhalten.
Die Positionsunsicherheit σ_R lässt sich insbesondere bei der Vorlokalisierung, aber auch bei der Hauptlokalisierung durch die Anzahl der erfassten und registrierten Photonen einstellen (je mehr Photonen erfasst und registriert werden, desto geringer die Positionsunsicherheit σ_R). Daher wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere ein Photonenbudget zwischen der Vorlokalisierung und der Hauptlokalisierung aufgeteilt, um mit dem nicht-iterativen, einschrittigen MINFLUX-Verfahren eine gewünschte Genauigkeit zu erhalten.
Ein nicht-iteratives MINFLUX-Verfahren hat den Vorteil, dass eine deutlich einfachere Mikroskop-Steuerung ohne Rückkopplungsschleifen verwendet werden kann.
Die Positionsunsicherheit σ_R kann aus in der Vorlokalisierung erhaltenen Daten ermittelt werden und die maximale Ausdehnung L kann auf Basis der ermittelten Positionsunsicherheit σ_R eingestellt werden. Alternativ dazu kann zunächst die maximale Ausdehnung L festgelegt werden und die Vorlokalisierung kann dann so durchgeführt werden, dass sich eine gewünschte zu der maximalen Ausdehnung L passende Positionsunsicherheit σ_R ergibt, z.B. durch Erfassung und Registrierung einer bestimmten Anzahl von Photonen.
2 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Lichtmikroskops 1 zur Lokalisierung eines vereinzelten Emitters E in einer Probe 2 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Bei dem Lichtmikroskop 1 handelt es sich um ein MINFLUX-Mikroskop, das eine Lichtquelle 3 mit einem Laser 31 aufweist, der einen Beleuchtungslichtstrahl von Beleuchtungslicht B erzeugt. Der Beleuchtungslichtstrahl durchläuft eine erste Strahlablenkungseinheit 12 und eine zweite Strahlablenkungseinheit 13, z.B. zwei elektrooptische Deflektoren (EODs), die einen Teil einer Beleuchtungsoptik 15 bilden und den Beleuchtungslichtstrahl jeweils in einer ersten Richtung und einer zu der ersten Richtung orthogonalen zweiten Richtung in einer senkrecht zu einer Ausbreitungsrichtung des Beleuchtungslichtstrahls erstreckten Ebene ablenken (auch als x-Richtung und y-Richtung bezeichnet), wenn die erste Strahlablenkungseinheit 12 und die zweite Strahlablenkungseinheit 13 ein entsprechendes Steuersignal von der Steuereinheit 9 erhalten.
Weiterhin wird der Beleuchtungslichtstrahl von einem Lichtmodulator 4 der Beleuchtungsoptik 15 moduliert, insbesondere phasenmoduliert, um am Fokus in der Probe 2 eine Intensitätsverteilung I mit einem lokalen Minimum M (insbesondere einen 2D-Donut oder einen 3D-Donut) zu erzeugen. Der Lichtmodulator 4 kann, wie in 2 beispielhaft dargestellt, von dem Beleuchtungslichtstrahl transmittiert werden. Alternativ kann der Beleuchtungslichtstrahl auch von einem Beugungsgitter des Lichtmodulators 4 gebrochen oder einer Oberfläche des Lichtmodulators 4 reflektiert und dabei phasenmoduliert werden.
Die Beleuchtungsoptik 15 umfasst weiterhin einen dichroitischen Strahlteiler 26, der den phasenmodulierten Beleuchtungslichtstrahl reflektiert und ein Objektiv 14, das den Beleuchtungslichtstrahl in die Probe 2 fokussiert.
Der von dem Beleuchtungslicht B angeregte vereinzelte Emitter E in der Probe 2 emittiert Fluoreszenzlicht (Lichtemissionen D), das den dichroitischen Strahlteiler 26 aufgrund seiner Wellenlänge transmittiert und zu einem Detektor 5 des Lichtmikroskops 1 gelangt. Der Detektor 5 weist eine Mehrzahl an Detektorelementen 7 auf, die in einer senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Lichtemissionen D erstreckten Detektionsebene angeordnet sind.
Die einzelnen Detektorelemente 7 erfassen einzelne von dem Emitter E emittierte Photonen, die von einer Recheneinheit 8 des Lichtmikroskops 1 bzw. des Detektors 5 registriert werden. Bei dem Detektor 5 kann es sich z.B. um eine Kamera oder ein SPAD-Array handeln.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probe 2 zunächst mit dem Beleuchtungslicht B beleuchtet, um die Vorlokalisierung durchzuführen. Dazu kann z.B. eine Weitfeldbeleuchtung der Probe 2 mittels der Lichtquelle 3 oder einer weiteren Lichtquelle (nicht gezeigt) vorgesehen sein. Alternativ kann die Probe 2 bei der Vorlokalisierung mit fokussiertem Beleuchtungslicht B abgetastet werden, z.B. mittels der ersten Strahlablenkungseinheit 12 und der zweiten Strahlablenkungseinheit 13 oder mit einem galvanometrischen Scanner (nicht gezeigt). Dabei kann wie bei der anschließenden Hauptlokalisierung die Intensitätsverteilung I mit dem lokalen Minimum M verwendet werden, oder die Probe 2 kann mit einer anderen Lichtverteilung, beispielsweise einem regulären, näherungsweise gaußförmigen Fokus, abgetastet werden. Im letztgenannten Fall ist es vorteilhaft, wenn der Lichtmodulator 4 einzeln ansteuerbare Pixel aufweist, um durch Wechsel des angezeigten Phasenmusters zwischen einer Intensitätsverteilung I mit lokalem Minimum M und einem regulären Fokus umschalten zu können.
Optional kann gleichzeitig zu oder vor der Beleuchtung mit dem Anregungslicht während der Vorlokalisierung Aktivierungslicht eingestrahlt werden (fokussiert oder im Weitfeld), um fotoaktivierbare Fluorophore zu aktivieren.
Aus den bei der Vorlokalisierung von den Detektorelementen 7 des Detektors 5 erfassten und von der Recheneinheit 8 registrierten Photonen (Lichtemissionen D) schätzt die Recheneinheit 8 die Position S des Emitters E, z.B. durch Bestimmung eines Zentroids einer Verteilung von Lichtintensitäten (bzw. Photonenzahlen), die von den Detektorelementen 7 erfasst wurden. Alternativ kann die Positionsschätzung durch die Recheneinheit 8 z.B. auch durch einen Fit einer Gaußfunktion an die Lichtintensitätsverteilung des detektierten Lichts, mittels eines Maximum-Likelihood-Schätzers oder durch Momentbestimmung erfolgen.
In der folgenden Hauptlokalisierung wird die Probe 2 mit der Intensitätsverteilung I mit dem lokalen Minimum M an fest vorgegebenen Beleuchtungspositionen 10 beleuchtet, die ein Beleuchtungsmuster 11 bilden, das abhängig von der Positionsunsicherheit σ_R der Vorlokalisierung eine entsprechende maximale Ausdehnung L aufweist (siehe 1). Die erste Strahlablenkungseinheit 12 und die zweite Strahlablenkungseinheit 13 positionieren den Fokus des Beleuchtungslichtstrahls dabei in der Fokusebene in der Probe 2 an den Beleuchtungspositionen 10. Für jede Beleuchtungsposition 10 werden von den Detektorelementen 7 des Detektors 5 Lichtemissionen D erfasst. Die Recheneinheit 8 bestimmt dann aus den Lichtemissionen D, z.B. mittels eines Maximum-Likelihood-Schätzers, die Position des Emitters E.
Optional kann die Recheneinheit 8 auch die Positionsunsicherheit σ_R berechnen und auf Basis der berechneten Positionsunsicherheit σ_R die maximale Ausdehnung L des Beleuchtungsmusters 11 einstellen. Alternativ dazu kann in der Recheneinheit 8 oder in einem externen mit der Recheneinheit 8 verbundenen Speicher ein vorgegebener der maximalen Ausdehnung L abgelegt sein. Die Recheneinheit 8 kann dann z.B. aus der vorgegebenen maximalen Ausdehnung L eine erforderliche Positionsunsicherheit σ_R berechnen. Schließlich kann die Recheneinheit 8 aus der erforderlichen Positionsunsicherheit σ_R eine minimale Anzahl von Photonen berechnen, die bei der Vorlokalisation erfasst und registriert werden müssen, um die erforderliche Positionsunsicherheit σ_R zu erreichen. Bei der Vorlokalisation kann die Recheneinheit 8 dann ermitteln, ob die minimale Anzahl von Photonen erreicht ist. Wenn dies der Fall ist, kann die Steuereinheit 9 das Lichtmikroskop 1 derart steuern, dass die Vorlokalisierung beendet wird und die Hauptlokalisierung initiiert wird.
3 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 1 (MINFLUX-Mikroskop). Dieses ist analog zu dem in 2 gezeigten Lichtmikroskop 1 aufgebaut, weist aber im Detektionsstrahlengang einen ersten Detektor 5 und einen zweiten Detektor 6 mit jeweils mehreren, in einer Detektionsebene angeordneten Detektorelementen 7 auf. Das Detektionslicht, also die Lichtemissionen D, werden dabei durch einen Strahlteiler 30 getrennt. Dabei kann es sich um einen neutralen Strahlteiler 30 handeln, der das Detektionslicht unabhängig von dessen Eigenschaften in einem vorgegebenen Verhältnis (z.B. 1:1) aufteilt. Alternativ kann es sich bei dem Strahlteiler 30 z.B. auch um einen Polarisationsstrahlteiler handeln. In diesem Fall kann z.B. vor dem Strahlteiler 30 ein Polarisationsschaltelement (nicht gezeigt), z.B. eine Pockels-Zelle, angeordnet werden, um das Detektionslicht durch ein Steuersignal abhängig von seiner Polarisationsrichtung selektiv zu dem ersten Detektor 5 oder dem zweiten Detektor 6 zu führen.
Beispielsweise kann der erste Detektor 5 für die Vorlokalisierung optimiert sein und der zweite Detektor 6 kann für die Hauptlokalisierung optimiert sein. Bei dem ersten Detektor 5 kann es sich z.B. um eine CCD- oder CMOS-Kamera handeln. Dies hat im Kontext der Vorlokalisierung den Vorteil, dass relativ schnell einzelne Emitter E in einem relativ großen Bildfeld lokalisiert werden können. Der zweite Detektor 6 kann ein SPAD-Array sein. Für die Hauptlokalisierung nach dem MINFLUX-Prinzip hat dies insbesondere den Vorteil, dass eine Einzelphotonenzählung für eine MINFLUX-Lokalisierung mit erweitertem Fangbereich möglich ist, dass also Emitter E in einem größeren Bereich eindeutig lokalisierbar sind.
4 zeigt einen Teil eines Lichtmikroskops 1 zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel mit einer Lichtquelle 3, die mehrere Punktlichtquellen 16 aufweist, die als Faserenden 18 von Lichtleitfasern 17 eines Faserbündels 19 ausgebildet sind. Die Lichtquelle 3 weist mehrere Laser 31 zur Erzeugung von jeweiligen Eingangslichtstrahlen 22 von Beleuchtungslicht B sowie mehrere Linsen 27 auf, welche als Faserkoppler 28 fungieren, um die Eingangslichtstrahlen 22 in jeweilige Lichtleitfasern 17 des Faserbündels 19 einzukoppeln. Die an den Faserenden 18 der Lichtleitfasern 17 austretenden Lichtstrahlen durchlaufen dann eine Beleuchtungsoptik 15. Dabei werden sie gemeinsam mittels einer weiteren Linse 27, die als Kollimator 33 ausgebildet ist, kollimiert und gegeneinander verkippt. Am Schnittpunkt der kollimierten Lichtstrahlen ist senkrecht zu einer optischen Achse O ein Lichtmodulator 4 angeordnet, der die Lichtstrahlen mittels eines Phasenmusters phasenmoduliert, um für jeden der Lichtstrahlen am Fokus in der Probe 2 eine jeweilige Intensitätsverteilung I mit einem lokalen Minimum M zu erzeugen. Die Lichtstrahlen werden dann gemeinsam von einem Objektiv 14 in die Probe 2 fokussiert (in 4 nicht gezeigt).
Zwischen den Lasern 31 und den Faserkopplern 28 können optional Intensitätsmodulatoren 32, z.B. akustooptische Modulatoren (AOM) angeordnet sein, um durch die Steuereinheit 9 selektiv Eingangslichtstrahlen 22 in ihrer Intensität zu modulieren, insbesondere so, dass immer nur ein Eingangslichtstrahl 22 in eine jeweilige Lichtleitfaser 17 eingekoppelt wird, während die anderen Eingangslichtstrahlen 22 mittels der Intensitätsmodulatoren 32 komplett abgeschattet werden. Auf diese Weise kann die Probe 2 nacheinander an den Beleuchtungspositionen 10 mit dem Beleuchtungslicht B aus den einzelnen Lichtleitfasern 17 beleuchtet werden.
Eine andere Möglichkeit, die Probe 2 mit Beleuchtungslicht B aus Lichtleitfasern 17 nacheinander an den Beleuchtungspositionen 10 zu belichten, ist in 5 dargestellt. Hier erzeugt ein einziger als Pulslaser ausgebildeter Laser 31 das Beleuchtungslicht B in Form von Lichtpulsen LP. Das Beleuchtungslicht B wird dann mittels Strahlteilern 30 und Spiegeln 29 in verschiedene Lichtstrahlen aufgespalten, welche anschließend über als Faserkoppler 28 ausgebildete Linsen 27 in jeweilige Lichtleitfasern 17 eines Faserbündels 19 eingekoppelt werden. Die einzelnen Lichtleitfasern 17 sind dabei unterschiedlich lang, was in 5 schematisch durch eine unterschiedliche Anzahl von Schleifen 17a dargestellt ist. Auf diese Weise entstehen zeitversetzte Lichtpulse LP1, LP2, LP3, LP4, die durch die jeweiligen Lichtleitfasern 17 propagieren. Die Phasenmodulation der Lichtstrahlen zur Erzeugung von zeitlich und örtlich versetzten Intensitätsverteilungen I mit lokalen Minima M kann analog zu dem in 4 gezeigten Aufbau mittels eines Lichtmodulators 4 einer Beleuchtungsoptik 15 erfolgen, der in einem Schnittpunkt zueinander verkippter kollimierter Lichtstrahlen steht, die durch einen gemeinsamen Kollimator 3 aus dem Licht erzeugt werden, das aus den Faserenden 18 austritt.
In 6 ist ein weiteres Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 1 dargestellt, das Faserenden 18 von Lichtleitfasern 17 als Punktlichtquellen 16 verwendet. Ähnlich wie bei der Ausführungsform nach 5 wird das Licht eines als Pulslaser ausgebildeten Lasers 31 auf mehrere unterschiedlich lange Lichtleitfasern 17 (angedeutet durch die Schleifen 17a) aufgeteilt, hier mittels eines gemeinsamen Faserkopplers 28. Im Unterschied zu dieser Ausführungsform wird jedoch das an als Faserkopplern 28 ausgebildeten Linsen 27 aus den Faserenden 18 austretende Licht mit Strahlteilern 30 und Spiegeln 29 einer Beleuchtungsoptik 15 zusammengeführt. Die Strahlteiler 30 bzw. Spiegel 29 stehen dabei insbesondere in einer Pupillenebene, die zur Eintrittspupille (Rückapertur) des Objektivs 14 konjugiert ist. Es handelt sich bei dieser Ebene also um eine Fourierebene bezüglich der Bildebene (die zur Fokusebene in der Probe 2 konjugiert ist). Die Strahlteiler 30 und Spiegel 29 sind dabei so justiert, dass die einzelnen Lichtstrahlen in unterschiedlichen Winkeln an den reflektierenden Oberflächen der Strahlteiler 30 und Spiegel 29 abgelenkt werden. Dadurch entsteht in der Fokusebene der erwünschte laterale Versatz zwischen den Lichtstrahlen, um die Probe 2 an den Beleuchtungspositionen 10 zu beleuchten. Der zusammengeführte Lichtstrahl wird bei dieser Ausführungsform gemeinsam mittels eines Lichtmodulators 4 moduliert, der ebenfalls in einer zu der Pupillenebene konjugierten Ebene oder in einem kleinen Abstand zu dieser Ebene positioniert ist. Durch die unterschiedlich langen Lichtleitfasern 17 entsteht, wie oben für das in 5 dargestellte Ausführungsbeispiel beschrieben, eine Pulsfolge von Lichtpulsen LP des Beleuchtungslichts B, so dass die Beleuchtungspositionen 10 in einer zeitlichen Abfolge mit dem Beleuchtungslicht B beleuchtet werden. Die übrigen Komponenten des Lichtmikroskops 1 sind insbesondere analog zu dem in 1 gezeigten und weiter oben beschriebenen Ausführungsbeispiel aufgebaut. Bezüglich des Aufbaus und der Funktion dieser Komponenten wird auf die entsprechenden Teile dieser Figurenbeschreibung verwiesen.
7 zeigt ein Beispiel eines Faserbündels 19 mit einer ersten Gruppe G1, einer zweiten Gruppe G2 und einer dritten Gruppe G3 von Lichtleitfasern 17, die konzentrisch um ein Zentrum Z des Faserbündels 19 angeordnet sind. Die erste Gruppe G1 weist dabei den größten Abstand von dem Zentrum auf, gefolgt von der zweiten Gruppe G2 und der dritten Gruppe G3. Durch selektives Einkoppeln von Beleuchtungslicht B in die Gruppen G1, G2, G3 von Lichtleitfasern 17 oder durch Abschatten bestimmter Gruppen G1, G2, G3 (z.B., wie oben beschrieben mittels Intensitätsmodulatoren wie AOMs) lässt sich die maximale Ausdehnung L des Beleuchtungsmusters 11 einstellen.
8 zeigt eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 1 mit Lichtleitfasern 17 und einem galvanometrischen Scanner 34 zur lateralen Verlagerung des durch die Lichtleitfasern 17 vorgegebenen Beleuchtungsmusters 11. Die Lichtquelle 3 sowie die Beleuchtungsoptik 15 des Lichtmikroskops 1 können dabei analog zu den in den 4 oder 5 gezeigten Ausführungsformen aufgebaut sein und die Phasenmodulation der Einzellichtstrahlen erfolgt insbesondere wie für diese Ausführungsbeispiele beschrieben, d.h. die aus den Faserenden 18 austretenden Lichtstrahlen werden von einem Kollimator 33 kollimiert und gegeneinander verkippt, wobei sich der Lichtmodulator 4 zur Phasenmodulation der Lichtstrahlen im Schnittpunkt der kollimierten Lichtstrahlen befindet. Die Faserenden 18 sind hier in einer Bildebene BE angeordnet und der Lichtmodulator 4 befindet sich in einer konjugierten Ebene KE zur Eintrittspupille des Objektivs 14, welche eine Fourier-Ebene bezüglich der Bildebene BE ist. Die von dem Lichtmodulator 4 phasenmodulierten Lichtstrahlen werden von einer Linse 27 (Scan-Linse) in eine zu der Bildebene BE konjugierte Zwischenbildebene ZBE fokussiert, welche sich zwischen zwei verstellbaren Spiegeln des galvanometrischen Scanners 34 befindet. Durch die Spiegel des galvanometrischen Scanners 34 werden die Lichtstrahlen gemeinsam abgelenkt. Sie durchlaufen anschließend eine Tubuslinse 35 und werden von dem Objektiv 14 in die Probe 2 fokussiert.
In 9 ist eine Zoom-Optik 25 zur Einstellung eines Vergrößerungsfaktors als Teil einer Beleuchtungsoptik 15 dargestellt. Mit einer solchen Optik lässt sich die Größe eines Beleuchtungsmusters 11 von Beleuchtungspositionen 10 anpassen, also insbesondere die maximale Ausdehnung L des Beleuchtungsmusters 11 einstellen. Die Zoom-Optik 25 befindet sich im Beleuchtungsstrahlengang hinter einem Kollimator 33, der die Lichtstrahlen, die aus als Punktlichtquellen 16 fungierenden Faserenden 18 von Lichtleitfasern 17 eines Faserbündels 19 austreten, kollimiert und gegeneinander verkippt. Sie besteht aus mehreren Linsen 27 und einer einstellbaren Linse 37. Zwischen der einstellbaren Linse 37 und einer weiteren Linse 27 der Zoom-Optik 25 ist der Lichtmodulator 4 zur Phasenmodulation des Beleuchtungslichts B angeordnet. Die von der einstellbaren Linse 37 ausgehenden kollimierten Lichtstrahlen schneiden sich in einer Ebene, in welcher der Lichtmodulator 4 angeordnet ist und werden gemeinsam in ihrer Phase moduliert. Durch Verfahren der einstellbaren Linse 37 entlang der optischen Achse O lässt sich der Abstand der Beleuchtungspunkte 10 in der Zwischenbildebene ZBE einstellen.
10 zeigt einen Teil eines Strahlengangs eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 1, bei dem Punktlichtquellen 16 ohne Lichtleitfasern 17 erzeugt werden, indem ein von einer Lichtquelle 3 (nicht gezeigt) erzeugter Eingangslichtstrahl 22 des Beleuchtungslichts B durch eine Beleuchtungsoptik 15 mit Strahlteilern 30 und Spiegeln 29 in Teilstrahlen aufgespalten wird und die Teilstrahlen von einem Lichtmodulator 4 in ihrer Phase moduliert werden, um am Fokus in der Probe 2 Intensitätsverteilungen mit lokalem Minimum M zu erzeugen. Hinter dem Lichtmodulator 4 sind Intensitätsmodulatoren 32, z.B. akustooptische Modulatoren, angeordnet, welche die Intensität der einzelnen Teillichtstrahlen steuern, insbesondere so, dass die Beleuchtungspositionen 10 in zeitlicher Abfolge beleuchtet werden, wobei jeweils nur ein Teilstrahl die Probe erreicht, während die anderen Teilstrahlen von den jeweiligen Intensitätsmodulatoren 32 vollständig abgeschattet werden. Alternativ dazu kann natürlich auch in der zuletzt beschriebenen Ausführungsform eine Folge von Lichtpulsen LP erzeugt werden, wenn ein Pulslaser zur Erzeugung des Beleuchtungslichts B verwendet wird und die unterschiedlichen Lichtwege der Teilstrahlen entsprechende unterschiedliche Längen aufweisen.
11 zeigt eine Lichtquelle 3 und einen Teil eines Strahlengangs mit Beleuchtungsoptik 15 eines erfindungsgemäßen Lichtmikroskops 1 gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel. Ein z.B. von einem Laser (nicht gezeigt) ausgehender Eingangslichtstrahl 22 wird dabei auf eine Mikrospiegelanordnung 23 mit mehreren beweglichen Mikrospiegeln 24 gelenkt. Die Mikrospiegel 24 können einzeln elektrisch angesteuert werden, um den jeweiligen Mikrospiegel 24 um eine jeweilige Drehachse zu drehen. Durch die Reflexion des Eingangslichtstrahls 22 an den Mikrospiegeln 24 entstehen Teillichtstrahlen. Durch entsprechende Drehung der Mikrospiegel 24 werden die Teillichtstrahlen wahlweise in den Strahlengang des Lichtmikroskops 1 eingekoppelt oder zu einem Absorber 39 gelenkt. Durch zeitlich versetztes Ansteuern der Mikrospiegel 24 lässt sich die Probe 2 (in 11 nicht gezeigt) nacheinander an unterschiedlichen Beleuchtungspositionen 10 beleuchten, die ein Beleuchtungsmuster 11 bilden. Durch Auswahl entsprechender Mikrospiegel 24, über die das Beleuchtungslicht B in den Strahlengang des Lichtmikroskops 1 eingekoppelt wird, kann auch die maximale Ausdehnung L des Beleuchtungsmusters 11 eingestellt werden.
Im Strahlengang hinter den Mikrospiegel 24 befindet sich eine Mikrolinsenanordnung 40 umfassend mehrere Mikrolinsen 41. Die Mikrolinsenanordnung 40 ist so positioniert, dass jeweils eine Mikrolinse 41 einem Mikrospiegel 24 zugeordnet ist und das von diesem ausgehende Beleuchtungslicht B in eine Zwischenbildebene ZBE fokussiert, wodurch Punktlichtquellen 16 entstehen. Hinter der Zwischenbildebene ZBE ist im divergierenden Strahlengang ein Kollimator 33 angeordnet, der das Licht der einzelnen Teillichtstrahlen kollimiert und verkippt, so dass sich die kollimierten Teillichtstrahlen in einer zur Pupille des Objektivs 14 (nicht gezeigt) konjugierten Ebene KE (also einer Fourier-Ebene bezüglich der Zwischenbildebene ZBE) schneiden. An dieser Position befindet sich ein Lichtmodulator 4, der das Beleuchtungslicht B der Teillichtstrahlen gemeinsam in seiner Phase moduliert, um am Fokus in der Probe 2 für jeden Teillichtstrahl eine Intensitätsverteilung I mit einem lokalen Minimum M auszubilden.
Dieser Strahlengang entspricht also insbesondere dem in 4 gezeigten und weiter oben beschriebenen Aufbau. Alternativ ist es selbstverständlich wie bei der in 6 gezeigten Ausführungsform auch hier möglich, die Teilstrahlen mittels Strahlteilern 30 und Spiegeln 29 zu vereinigen und den vereinigten Lichtstrahl mit dem Lichtmodulator 4 in seiner Phase zu modulieren.
Bezugszeichenliste

1: Lichtmikroskop
2: Probe
3: Lichtquelle
4: Lichtmodulator
5: Detektor, erster Detektor
6: Zweiter Detektor
7: Detektorelement
8: Recheneinheit
9: Steuereinheit
10: Beleuchtungsposition
11: Beleuchtungsmuster
12: Erste Strahlablenkungseinheit
13: Zweite Strahlablenkungseinheit
14: Objektiv
15: Beleuchtungsoptik
16: Punktlichtquelle
17: Lichtleitfaser
17a: Schleife
18: Faserende
19: Faserbündel
22: Eingangslichtstrahl
23: Mikrospiegelanordnung
24: Mikrospiegel
25: Zoom-Optik
26: Dichroitischer Strahlteiler
27: Linse
28: Faserkoppler
29: Spiegel
30: Strahlteiler
31: Laser
32: Intensitätsmodulator
33: Kollimator
34: Scanner
35: Tubuslinse
37: Einstellbare Linse
39: Absorber
40: Mikrolinsenanordnung
41: Mikrolinse
A: Abtastkreis
B: Beleuchtungslicht
D: Lichtemissionen
E: Emitter
G1: Erste Gruppe
G2: Zweite Gruppe
G3: Dritte Gruppe
I: Intensitätsverteilung
BE: Bildebene
KE: Konjugierte Ebene
ZBE: Zwischenbildebene
L: Maximale Ausdehnung
LP: Lichtpuls
M: Minimum
O: Optische Achse
S: Position
Z: Zentrum

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 102011055367 A1 [0005]
DE 102013114860 A1 [0006]
DE 102016119262 A1 [0008]
DE 102016119263 A1 [0008]
DE 102016119264 A1 [0008]
DE 102017104736 A1 [0011]
EP 3372989 A1 [0011]
WO 2020/128106 A1 [0013]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

„Balzarotti F, Eilers Y, Gwosch KC, Gynna AH, Westphal V, Stefani FD, Elf J, Hell SW. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 2017 Feb 10;355(6325):606-612 [0007]
Gwosch KC, Pape JK, Balzarotti F, Hoess P, Ellenberg J, Ries J, Hell SW. MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolution in cells. Nat Methods. 2020 Feb;17(2):217-224 [0009]
Masullo LA, Steiner F, Zähringer J, Lopez LF, Bohlen J, Richter L, Cole F, Tinnefeld P, Stefani FD. Pulsed Interleaved MINFLUX. Nano Letters 2021, 21 (1), 840-846 [0013]
Balzarotti F, Eilers Y, Gwosch KC, Gynna AH, Westphal V, Stefani FD, Elf J, Hell SW. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 2017 Feb 10;355(6325):606-612 [0033]

Claims

Verfahren zur Lokalisierung vereinzelter Emitter (E) in einer Probe (2), umfassend eine Vorlokalisierung mit den Schritten - Beleuchten der Probe (2) mit Beleuchtungslicht (B), wobei das Beleuchtungslicht (B) Lichtemissionen (D) eines vereinzelten Emitters (E) in der Probe (2) induziert oder moduliert; - Erfassen der Lichtemissionen (D) des Emitters (E); - Schätzen der Position (S) des Emitters (E) in der Probe (2) aus den erfassten Lichtemissionen (D); und eine anschließende Hauptlokalisierung mit den Schritten - Beleuchten der Probe (2) mit einer ein lokales Minimum (M) aufweisenden Intensitätsverteilung (I) des oder eines anderen Beleuchtungslichts (B) an Beleuchtungspositionen (10), die um die in der Vorlokalisierung geschätzte Position (S) des Emitters (E) angeordnet sind; - Erfassen der Lichtemissionen des Emitters (E) für die jeweiligen Beleuchtungspositionen (10); - Bestimmen der Position (S) des Emitters (E) in der Probe (2) aus den für die Beleuchtungspositionen (10) erfassten Lichtemissionen (D), dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungspositionen (10) für die Hauptlokalisierung vor dem Beleuchten der Probe (2) mit der Intensitätsverteilung (I) festgelegt werden, wobei die Beleuchtungspositionen (10) ein Beleuchtungsmuster (11) bilden, das eine maximale Ausdehnung (L) aufweist, wobei die maximale Ausdehnung (L) abhängig von einer Positionsunsicherheit (σ_r) der in der Vorlokalisierung geschätzten Position (S) eingestellt oder festgelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungslicht (B) Anregungslicht ist, das die Lichtemissionen (D) des Emitters (E) induziert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungspositionen (10) auf einem Abtastkreis (A) oder einer Abtastkugel um die geschätzte Position (S) des Emitters (E) angeordnet sind, wobei die maximale Ausdehnung (L) dem Durchmesser des Abtastkreises (A) oder der Abtastkugel entspricht.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungsmuster (11) ein Raster (R), insbesondere ein kartesisches Raster oder ein hexagonales Raster, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Positionsunsicherheit (σ_r) aus den erfassten Lichtintensitäten (D) bestimmt wird, wobei die maximale Ausdehnung (L) des Beleuchtungsmusters (11) entsprechend der bestimmten Positionsunsicherheit (σ_r) eingestellt wird, insbesondere wobei die Positionsunsicherheit (σ_r) aus einer in der Vorlokalisierung registrierten Anzahl von von dem Emitter (E) emittierten Photonen bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die maximale Ausdehnung (L) des Beleuchtungsmusters (11) auf einen vorgegebenen Wert festgelegt wird, wobei die Vorlokalisierung so durchgeführt wird, dass sich ein Wert der Positionsunsicherheit (σ_r) ergibt, dem der vorgegebene Wert der maximalen Ausdehnung (L) zugeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte der Vorlokalisierung wiederholt werden oder ein Zeitintervall, während dem die Vorlokalisierung durchgeführt wird, angepasst wird, bis die Positionsunsicherheit (σ_r) der geschätzten Position (S) einen vorgegebenen oder vorgebbaren Grenzwert unterschreitet.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die maximale Ausdehnung (L) gemäß der Bedingung L = a · σ_r eingestellt oder festgelegt wird, wobei L die maximale Ausdehnung bezeichnet, wobei σ_r die Positionsunsicherheit der in der Vorlokalisierung geschätzten Position bezeichnet, und wobei a einen Proportionalitätsfaktor bezeichnet, insbesondere wobei die Positionsunsicherheit (σ_r) eine Standardabweichung oder eine Varianz einer Lokalisierungsverteilung des Emitters (E) ist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Proportionalitätsfaktor (a) einen Wert im Bereich von 1 bis 3 aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Positionsunsicherheit (σ_r) der in der Vorlokalisierung geschätzten Position (S) 50 nm oder weniger, insbesondere 20 nm oder weniger, weiter insbesondere 10 nm oder weniger, beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in der Vorlokalisierung geschätzte Position (S) eine größere Positionsunsicherheit (σ_r) aufweist als die in der Hauptlokalisation bestimmte Position des Emitters (E).
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Schätzen der Position (S) des Emitters (E) in der Vorlokalisierung mit einem nichtiterativen Verfahren durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (2) in der Vorlokalisierung mit einem Fokus oder einem Intensitätsminimum (M) des Beleuchtungslichts (B) abgetastet wird, wobei insbesondere ein Abtastbild der Probe (2) erstellt wird, oder dass in der Vorlokalisierung ein Weitfeldbild der Probe (2) erzeugt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der Vorlokalisierung die Positionen (S) mehrerer Emitter (E) geschätzt werden, insbesondere mit einem stochastischen Lokalisationsverfahren, wobei ein erster Emitter aus den mehreren Emittern (E) ausgewählt wird, insbesondere automatisch, und wobei die Position des ersten Emitters in der Hauptlokalisierung bestimmt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für den Emitter (E) eine Gesamtphotonenzahl von zu registrierenden Photonen festgelegt wird, wobei die Gesamtphotonenzahl in eine erste Photonenzahl und eine zweite Photonenzahl aufgeteilt wird, wobei die Position (S) des Emitters (E) in der Vorlokalisierung geschätzt wird, wenn die in der Vorlokalisierung erfassten Lichtemissionen (D) die erste Photonenzahl erreichen.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Position (S) des Emitters (E) in der Hauptlokalisierung bestimmt wird, wenn die in der Hauptlokalisierung erfassten Lichtemissionen (D) die zweite Photonenzahl erreichen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtemissionen (D) des Emitters (E) bei der Vorlokalisierung mit einem eine Vielzahl an Detektorelementen (7) aufweisenden Detektor (5) erfasst werden, wobei insbesondere die Detektorelemente (7) die Lichtemissionen (D) positionsabhängig in einer Detektionsebene erfassen.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die während der Vorlokalisierung geschätzte Position (S) des Emitters (E) mit einem Positionsschätzer oder durch Momentbestimmung auf Basis der von den Detektorelementen (7) erfassten Lichtemissionen (D) ermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass eine Funktion an aus den von den Detektorelementen (7) erfassten Lichtemissionen (D) erhaltene Daten angepasst wird, wobei die während der Vorlokalisierung geschätzte Position (S) aus der angepassten Funktion ermittelt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtemissionen (D) des Emitters (E) bei der Hauptlokalisierung mit einem eine Vielzahl an Detektorelementen (7) aufweisenden Detektor (5) erfasst werden, wobei insbesondere die Detektorelemente (7) die Lichtemissionen positionsabhängig in einer Detektionsebene erfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass einzelne von dem Emitter (P) emittierte und von den Detektorelementen (7) des Detektors (5) detektierte Photonen registriert werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anordnung der Beleuchtungspositionen (10) durch mindestens eine Lichtquelle (3) und/oder durch eine Beleuchtungsoptik (15) während der Lokalisierung des Emitters (E) fest vorgegeben ist.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (2) an den Beleuchtungspositionen (10) über jeweilige Punktlichtquellen (16) mit dem Beleuchtungslicht (B) beleuchtet wird.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Punktlichtquellen (16) durch jeweilige Faserenden (18) von Lichtleitfasern (17) gebildet werden, aus denen das Beleuchtungslicht (B) austritt.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Gruppen (G1,G2,G3) von Lichtleitfasern (17) vorgesehen sind, wobei in der Hauptlokalisierung abhängig von der Positionsunsicherheit (σ_r) der in der Vorlokalisierung geschätzten Position (S) eine der Gruppen (G1,G2,G3) ausgewählt wird, und wobei die Probe (2) in der Hauptlokalisierung mittels der ausgewählten Gruppe von Lichtleitfasern (17) an den Beleuchtungspositionen (10) beleuchtet wird, so dass die maximale Ausdehnung (L) des Beleuchtungsmusters (11) durch die Auswahl der Gruppe eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Punktlichtquellen (16) durch Reflexion eines Eingangslichtstrahls (22) an einem oder mehreren Mikrospiegeln (24) einer Mikrospiegelanordnung (23) gebildet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungspositionen (10) zwischen verschiedenen Hauptlokalisierungen einstellbar sind, insbesondere durch Einstellung eines Vergrößerungsfaktors, weiter insbesondere durch Auswahl oder Wechsel eines Objektivs (14) oder durch Einstellung einer Zoom-Optik (25), durch Einstellung einer Mikrospiegelanordnung (23) oder durch selektive Verwendung unterschiedlicher Lichtleitfasern (17).
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (2) mittels Lichtpulsen (LP) des Beleuchtungslichts (B) beleuchtet wird, insbesondere wobei aufeinanderfolgende Lichtpulse (LP) unterschiedlichen Beleuchtungspositionen (10) zugeordnet sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts (B) mindestens drei um das lokale Minimum (M) herum angeordnete Maxima aufweist, wobei sich eine Winkellage der Maxima entlang einer durch eine Ausbreitungsrichtung des Beleuchtungslichts (B) definierten optischen Achse (O) ändert.
Lichtmikroskop (1) zur Lokalisierung vereinzelter Emitter (E) in einer Probe (2), insbesondere nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 29, umfassend - eine Lichtquelle (3), die dazu ausgebildet ist, die Probe (2) mit Beleuchtungslicht (B) zu beleuchten, wobei das Beleuchtungslicht (B) Lichtemissionen (D) eines Emitters (E) in der Probe (2) induziert oder moduliert, - einen Lichtmodulator (4), der dazu ausgebildet ist, in der Probe (2) eine in mindestens einer Raumrichtung ein lokales Minimum (M) aufweisende Intensitätsverteilung (I) des Beleuchtungslichts (B) oder eines anderen Beleuchtungslichts (B) zu erzeugen, - mindestens einen Detektor (5), der dazu ausgebildet ist, Lichtemissionen (D) des Emitters (P) zu erfassen, - eine Recheneinheit (8), die dazu ausgebildet ist, aus erfassten Lichtemissionen (D) eine Position (S) des Emitters (P) in der Probe (2) zu schätzen und/oder zu bestimmen, - eine Steuereinheit (9), die dazu ausgebildet ist, i. während einer Vorlokalisierung die Lichtquelle (3) so zu steuern, dass die Lichtquelle (3) die Probe (2) mit dem Beleuchtungslicht (B) beleuchtet, den Detektor (5) so zu steuern, dass der Detektor (5) die Lichtemissionen (D) des Emitters (P) erfasst und die Recheneinheit (8) so zu steuern, dass die Recheneinheit (8) die Position (S) des Emitters (P) in der Probe (2) aus den von dem Detektor (5) erfassten Lichtemissionen (D) schätzt, und ii. während einer anschließenden Hauptlokalisierung die Lichtquelle (3) und den Lichtmodulator (4) so zu steuern, dass die Lichtquelle (3) die Probe (2) mit einer ein lokales Minimum (M) aufweisenden Intensitätsverteilung (I) des oder eines anderen Beleuchtungslichts (B) an für die Hauptlokalisierung vor dem Beleuchten der Probe (2) mit der Intensitätsverteilung (I) festgelegten Beleuchtungspositionen (10) beleuchtet, wobei die Beleuchtungspositionen (10) um die in der Vorlokalisierung geschätzte Position (S) des Emitters (E) angeordnet sind, wobei die Beleuchtungspositionen (10) ein Beleuchtungsmuster (11) bilden, das eine maximale Ausdehnung (L) aufweist, die abhängig von einer Positionsunsicherheit (σ_r) der in der Vorlokalisierung geschätzten Position (S)eingestellt oder festgelegt ist, den Detektor (5) oder einen weiteren Detektor so zu steuern, dass der Detektor (5) oder der weitere Detektor die Lichtemissionen (D) des Emitters (E) jeweils für die Beleuchtungspositionen (10) erfasst, wobei die Recheneinheit (8) dazu ausgebildet ist, die Position (S) des Emitters (E) in der Probe (2) aus den für die Beleuchtungspositionen (10) erfassten Lichtemissionen (D) zu bestimmen.
Lichtmikroskop (1) nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (5) eine Vielzahl von, insbesondere einzeln auslesbaren, Detektorelementen (7) aufweist.
Lichtmikroskop (1) nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (3) eine Mehrzahl an Lichtleitfasern (17) aufweist, wobei die Lichtleitfasern (17) jeweilige Faserenden (18) aufweisen, und wobei die Lichtleitfasern (17) dazu ausgebildet sind, die Probe (2) über die Faserenden (18) an den Beleuchtungspositionen (10) mit in die Lichtleitfasern (17) eingekoppeltem Beleuchtungslicht (B) zu beleuchten.
Computerprogramm umfassend Befehle, die das Lichtmikroskop (1) gemäß einem der Ansprüche 30 bis 32 dazu veranlassen, das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29 durchzuführen.
Verwendung eines Faserbündels (19) mit einer Mehrzahl an Lichtleitfasern (17) in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, wobei die Probe (2) über jeweilige Faserenden (18) der Lichtleitfasern (17) an den Beleuchtungspositionen (10) mit dem Beleuchtungslicht (B) beleuchtet wird.