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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben, wobei die zu untersuchende Probe eine Substanz umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend die Schritte, dass die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich zunächst in den ersten Zustand gebracht wird und dass mittels eines optischen Signals der zweite Zustand induziert wird, wobei innerhalb des zu erfassenden Probenbereichs räumlich begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden, und wobei das optische Signal in Form einer Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima bereitgestellt wird.
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Des Weiteren betriff die Erfindung ein Mikroskop, insbesondere Laser-Raster Fluoreszenzmikroskop, zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben, wobei die zu untersuchende Probe eine Substanz umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend eine Strahlquelle zur Bereitstellung eines Schaltsignals, mit dem die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich zunächst in den ersten Zustand verbringbar ist, sowie eine weitere Strahlquelle zur Bereitstellung eines optischen Signals, mit dem der zweite Zustand induzierbar ist, derart, dass innerhalb des zu erfassenden Probenbereichs räumlich begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden, wobei das optische Signal eine Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima aufweist.
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Verfahren und Mikroskope der eingangs genannten Art sind aus der Praxis bekannt. Grundsätzlich ist gemäß dem Abbe'schen Gesetz der räumlichen Auflösung abbildender optischer Verfahren durch die Beugungsgrenze eine theoretische Grenze gesetzt, wobei die Beugungsgrenze von der Wellenlänge des verwendeten Lichts abhängt. Mit den hier in Rede stehenden Verfahren und Mikroskopen lassen sich allerdings räumliche Auflösungen erzielen, die über die nach Abbe bekannte theoretische Beugungsgrenze hinaus verbessert sind.
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Bei den bekannten Verfahren werden hierzu in zu untersuchenden Proben Substanzen bereitgestellt, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar sind, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen Eigenschaft voneinander unterscheiden. Bei den meisten bekannten Verfahren handelt es sich bei dem ersten Zustand um einen fluoreszenzfähigen Zustand (im Folgenden Zustand A genannt) und bei dem zweiten Zustand um einen nicht fluoreszenzfähigen Zustand (im Folgenden Zustand B). Nachdem die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich mittels eines Schaltsignals in den fluoreszenzfähigen Zustand A gebracht worden ist, wird mittels eines optischen Signals in räumlich begrenzten Teilbereichen des zu erfassenden Probenbereichs Zustand B induziert und somit eine Unterdrückung der Fluoreszenz von Fluoreszenzmolekülen erzeugt. Der physikalische Prozess der Fluoreszenzunterdrückung kann dabei sehr unterschiedlicher Natur sein. So ist bspw. die stimulierte Emission aus dem zuvor angeregten Zustand oder eine optisch induzierte Strukturänderung der Fluoreszenzmoleküle bekannt.
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Entscheidend ist, dass der durch ein optisches Signal induzierte Übergang von dem ersten in den zweiten Zustand im Probenvolumen in großen Bereichen gesättigt, d. h. vollständig, stattfindet, und in mindestens einem Teilbereich des Probenvolumens gerade nicht stattfindet, indem dort das optische Schaltsignal gezielt nicht eingestrahlt wird. Dieser Effekt kann durch das Erzeugen einer Intensitätsnullstelle des optischen Signals erreicht werden. An der Nullstelle und in deren unmittelbarer Umgebung findet kein Übergang in den zweiten Zustand (im Allgemeinen der nicht fluoreszierende Zustand B) statt, so dass der erste Zustand (im Allgemeinen der fluoreszierende Zustand A) erhalten bleibt. Eine Sättigung des Übergangs A → B durch das optische Signal führt in den beleuchteten Bereichen des zu erfassenden Probenbereichs bereits in naher Umgebung der Intensitäts-Nullstellen zu einem (nahezu) vollständigen Transfer in den Zustand B. Je stärker der Prozess in die Sättigung getrieben wird, d. h. je mehr Energie durch das optische Signal in die Bereiche um die Nullstelle herum eingebracht wird, desto kleiner wird der Bereich mit Fluoreszenzmolekülen im fluoreszenzfähigen Zustand A bzw. allgemein in einem „leuchtfähigen” Zustand. In Abhängigkeit vom Sättigungsgrad in der unmittelbaren Nullstellen-Umgebung kann dieser Bereich prinzipiell beliebig klein gemacht werden. Folglich lassen sich Regionen des Zustands A markieren, die beliebig viel kleiner sind als die kleinsten aufgrund der Beugungsgrenze möglichen Regionen eines aufgebrachten optischen Signals. Wird der Bereich des Zustands A anschließend ausgelesen, z. B. durch Einstrahlen eines Testsignals, so stammt das (Fluoreszenz-)Messsignal aus einem definierten Bereich, der kleiner sein kann als es die Beugungsgrenze zulässt. Wird die Probe auf die beschriebene Art Punkt für Punkt abgerastert, so entsteht ein Bild mit einer Auflösung die besser ist, als es die Beugungstheorie erlaubt.
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Verfahren, der hier beschriebenen Art, bei denen als Unterschied zwischen zwei Zuständen die optische Eigenschaft fluoreszenzfähig/nicht fluoreszenzfähig ausgenutzt wird, sind bspw. aus der
DE 103 25 459 A1 und der
DE 103 25 460 A1 bekannt. Bei diesen Verfahren werden Fluoreszenzmoleküle mit Hilfe eines optischen Signals von einem Zustand A (fluoreszenzfähig) in einen Zustand B (nicht fluoreszenzfähig) gebracht, wobei bei dem Übergang A → B die Sättigung erreicht wird. Die in dem fluoreszenzfähigen Zustand A verbleibenden Bereiche der Probe resultieren jeweils aus einem eine Nullstelle aufweisenden Intensitätsminimum des eingestrahlten optischen Signals. Die Intensitätsminima sind Teil eines Interferenzmusters. Das Abrastern der Probe erfolgt durch Verschiebung der Intensitätsminima des optischen Signals, wobei die Verschiebung durch Phasenverschiebung der interferierenden Strahlen bewirkt wird.
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Bei den bekannten Verfahren ist nachteilig, dass durch die interferierenden Strahlen ein Interferenzmuster mit lokalen punktförmigen Intensitätsminima ausgebildet wird. Ein Abrastern der Probe erfordert dementsprechend einen punktuellen Scannvorgang in mindestens zwei Dimensionen, was den Scannvorgang äußerst zeitaufwendig macht.
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Aus der
DE 10 2004 034 962 A1 sowie aus der
DE 10 2004 034 996 A1 ist jeweils für sich gesehen bereits ein Verfahren zur Probenuntersuchung mit erhöhter Auflösung bekannt, wobei die Probe mit einem ersten und einem zweiten Beleuchtungslicht beleuchtet wird. Das erste Beleuchtungslicht bewirkt eine Anregung der Probe in einen ersten Zustand und das zweite Beleuchtungslicht dient zur induzierten Rückführung des angeregten ersten Zustands in einen zweiten Zustand. Das zweite Beleuchtungslicht weist in der Probe eine linienförmige Intensitätsverteilung auf, wobei das Querschnittsprofil Intensitätsnullstellen mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima aufweist. Erzeugt wird das zweite Beleuchtungslicht durch die Beugung kohärenten Lichts an einer periodischen Struktur. Das resultierende Beleuchtungslicht weist in einer lateralen Strahlrichtung und in axialer Strahlrichtung eine periodische Struktur in Form eines sog. Talbot-Musters auf. Die gleichzeitige Strukturierung in lateraler und axialer Richtung erfolgt durch die interferometrische Überlagerung von drei mindestens in einer Achse ebenen Wellen (–1., 0. und +1. Ordnung). Im einfachsten Fall wird die Erzeugung der drei Ordnungen durch eine Bestrahlung eines Amplitudengitters mit einer ebenen Welle realisiert.
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Bei dem bekannten Verfahren ist problematisch, dass zwar eine gleichzeitige Strukturierung in lateraler und axialer Richtung realisierbar ist, dass es sich bei der Talbot-Struktur jedoch um ein äußerst komplexes Beleuchtungsmuster handelt, das wenig Flexibilität bietet. Zum einen lässt sich die Breite der Intensitätsminima bzw. -maxima nur schwer verändern. Zum anderen ergibt sich in Abständen der Talbot-Länge ein Versatz der Linienförmigen Struktur, der für viele Anwendungen unbrauchbar ist. Da die Talbot-Länge von der Gitterkonstanten und der eingestrahlten Wellenlänge abhängt, ist bei fest vorgegebener Beleuchtungswellenlänge eine Veränderung zudem nur durch einen Austausch des verwendeten Gitters möglich. Dies ist in der Praxis äußerst aufwändig.
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Aus der
US 2001/0045523 A1 ist für sich gesehen ein hochauflösendes Mikroskop bekannt, bei dem zusätzlich zu einem Anregungslichtstrahl, der mittels einer Schlitzblende und einer zylinderförmigen Linse zu einer Beleuchtungslinie geformt werden kann, ein Quenching-Lichtstrahl vorgesehen ist. Das Quenching-Beleuchtungslicht wird über zwei parallele zylinderförmige Linsen auf zwei parallele Schlitze geführt, so dass eine Doppellinie entsteht, wobei das zentrale Intensitätsminimum mit der Anregungslinie zur Deckung gebracht wird.
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Die
DE 101 18 355 B4 zeigt ein Verfahren bzw. eine Vorrichtung zur Mehrphotonenanregung einer Probe, wobei zur optimalen Ausnutzung der Beleuchtungslichtintensität der nichtlineare Charakter der Mehrphotonenanregung ausgenutzt wird, indem zwei Teilstrahlen unter einem Kippwinkel zueinander ausgerichtet werden, so dass eine durch Interferenz der Teilstrahlen hervorgerufene Intensitätsverteilung Bereiche maximaler Intensität neben Bereichen minimaler Intensität aufweist.
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Die
DE 101 54 699 A1 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zum räumlich eng begrenzten Anregen eines optischen Übergangs. Dabei wird ein Anregungslichtstrahl in einen Fokusbereich der Probe gelenkt und mittels eines Abregungslichtstrahls, der aus zwei entgegengesetzten Richtungen auf die Probe gelenkt wird, in einem Teilbereich des Fokusbereich eines gezielte Abregung der Probe herbeigeführt, Durch die Überlagerung der beiden Abregungslichtstrahlen entsteht ein Interferenzmuster, dessen Phasenlage so eingestellt wird, dass sich an einem Fokuspunkt ein Intensitätsminimum ausbildet.
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Aus der
EP 1 584 918 A2 ist für sich gesehen ein Verfahren bzw. eine Vorrichtung zur Fluoreszenz-Lebensdauer-Imaging-Nanoskopie bekannt, das/die im Rahmen der STED-Mikroskopie eingesetzt werden können.
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Der vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie ein Mikroskop der eingangs genannten Art anzugeben, wonach mit konstruktiv einfachen und kostengünstigen Mitteln und gleichzeitig kompakter Bauform ein schnelles Abrastern einer Probe sowie eine flexible Veränderung der linienförmigen Beleuchtung ermöglicht ist.
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Erfindungsgemäß ist die voranstehende Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Danach ist das Verfahren derart ausgestaltet und weitergebildet, dass die Fokuslinie mittels einer linienförmigen Ausleuchtung in einer zur Pupille des Objektivs konjugierten Pupillenebene – Pupillenlinie – und durch Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie erzeugt wird, wobei die Phasenmodulation derart vorgenommen wird, dass entlang der Pupillenlinie ein oder mehrere Phasensprünge eingeführt werden.
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Die voranstehende Aufgabe ist des Weiteren durch ein Mikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 23 gelöst. Danach ist das Mikroskop gekennzeichnet durch ein optisches Bauteil, das eine Beleuchtungslinie in einer zur Pupille des Mikroskopobjektivs konjugierten Pupillenebene erzeugt, sowie ein phasenmodulierendes Element, das zur Erzeugung des Querschnittsprofils der Fokuslinie ein oder mehrere Phasensprünge entlang der Pupillenlinie einführt.
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Die Erfindung macht sich den Umstand zunutze, dass ein im Vergleich zu einem Punkt-Scann deutlich schnellerer Linien-Scann möglich ist, wenn der zweite Zustand entlang einer (prinzipiell beliebig) schmalen Linie induziert werden kann. Hierzu wird das optische Signal in Form einer Fokuslinie bereitgestellt, wobei die Fokuslinie ein Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle – zur Konservierung des ersten Zustands entlang einer (prinzipiell beliebig) schmalen Linie – mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima – zur Induzierung des zweiten Zustands in Sättigung – aufweist.
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In erfindungsgemäßer Weise ist dabei erkannt worden, dass sich für das optische Signal ein Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitätsnullstelle und seitlich benachbarten Intensitätsmaxima in ganz besonders raffinierter Weise dadurch realisieren lässt, dass zunächst eine sog. Pupillenlinie erzeugt wird, worunter eine linienförmige Ausleuchtung in einer zur Pupille des Objekts konjugierten Pupillenlinie zu verstehen ist. Durch Phasenmodulation entlang der erzeugten Pupillenlinie, konkret durch Einführung von einem oder mehreren Phasensprüngen, kann sodann auf einfache Weise das optische Signal in Form einer Fokuslinie mit dem gewünschten Querschnittsprofil bereitgestellt werden.
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In konstruktiver Hinsicht ist dabei vorgesehen, dass die Fokuslinie generiert wird, indem in das Mikroskop ein optisches Bauteil integriert wird, das zunächst eine Beleuchtungslinie in einer zur Pupille des Mikroskopobjektivs konjugierten Pupillenebene erzeugt. Des Weiteren ist ein phasenmodulierendes Element vorgesehen, das zur Erzeugung des Querschnittsprofils der Fokuslinie ein oder mehrere Phasensprünge entlang der Pupillenlinie einführt. Das so generierte Querschnittsprofil weist keine für viele Anwendungen störende Sprünge wie ein Talbot-Muster auf und lässt sich insbesondere durch geeignete Veränderungen der Phasenmodulation flexibel anpassen.
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das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Mikroskop lassen sich in besonders vorteilhafter Weise in Verbindung mit sehr langlebigen oder zeitlich sogar dauerhaft stabilen ersten und zweiten Zuständen einsetzen. In diesem Fall kann für die Sättigung des Übergangs vom ersten in den zweiten Zustand ein vergleichsweise langer Zeitraum gewählt werden, innerhalb dessen die zur Sättigung notwendige Energie des optischen Signals eingestrahlt wird. Die lokalen Intensitäten zur Übergangssättigung können dadurch sehr gering gewählt werden. Vor allem kann die von einer Strahlquelle des optischen Signal zur Verfügung stehende Gesamtenergie auf großräumige Bereiche im Probenraum verteilt und mehrere Intensitätsnullstellen oder eine ausgedehnte Nullstelle erzeugt werden. Trotz der daraus resultierenden geringen lokalen Intensitäten in der Umgebung der Nullstelle(n) im Vergleich zur Auftragung des Gesamtsignals um nur eine punktförmige Nullstelle herum kann die Sättigung erreicht werden. Dazu muss das Signal nur genügend lange eingestrahlt werden, bis schließlich alle Moleküle in Umgebung der Nullstellen im zweiten Zustand sind. Dies ist ein entscheidender Unterschied zum Fall eines kurzlebigen Zustandes (z. B. im STED-Verfahren mit typischen Lebenszeit von ~1 ns für einen fluoreszenzfähigen Zustand A), wo die zur Sättigung notwendige Energie in so kurzer Zeit eingestrahlt werden muss (deutlich schneller als die Rate A → B), dass die Gesamtleistung der Strahlquelle nur für die Erzeugung einer (oder maximal einiger weniger) lokalen Nullstellen ausreicht. Es lässt sich für konkrete Systeme zeigen, dass im Falle stabiler Zustände (z. B. photochrome Farbstoffe) oder langlebiger Zustände (z. B. Transfer in das Tripletsystem beim GSD-Verfahren, GSD = Ground State Depletion – Grundzustandsentvölkerung) die Leistung preiswerter und kommerzieller Lasersysteme auf so große Bereiche verteilt werden kann, dass mehrere punktförmige Intensitäts-Nullstellen (>> 10) oder ganze Streifen verschwindender Intensität in der Probe erzeugt werden können, in deren unmittelbarer Umgebung nach wie vor die Sättigung erreicht werden kann. Dies ermöglicht eine parallelisierte Bildaufnahme, wenn die Probe mit der Vielzahl von Punkt-Nullstellen oder mit Nullstellen-Linien gleichzeitig abgerastert wird und die Signale gleichzeitig für jede Nullstelle getrennt von einem Detektor erfasst werden. Auf diese Weise lassen sich Mikroskope mit Auflösungen unterhalb der klassischen Beugungsgrenze konstruieren, deren Bildaufnahmegeschwindigkeit im Bereich STED basierten Verfahren liegt und im Vergleich zu Systemen mit einer einzigen lokalen Nullstelle deutlich erhöht ist.
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Im Rahmen einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass ein Phasensprung im Pupillenmittelpunkt eingeführt wird. Dieser Phasensprung wird in weiter vorteilhafter Weise so gewählt, dass er der Länge eines halben Wellenzugs entspricht, so dass die eine Hälfte der Linie um einen halben Wellenzug verzögert wird. Auf diese Weise entsteht in der Fokalebene eine Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil, das sich aus einer Intensitätsnullstelle mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima zusammensetzt. Alternativ ist es möglich, entlang der Pupillenlinie mehrere Phasensprünge um vorzugsweise jeweils einen halben Wellenzug einzuführen, so dass im Ergebnis ebenfalls die Hälfte der Gesamtlinie, d. h. die Hälfte der Lichtmenge, die durch die Pupille gestrahlt wird, im Vergleich zur anderen Hälfte um einen halben Wellenzug verzögert ist.
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Im Hinblick auf eine konstruktiv einfache Ausführung kann vorgesehen sein, dass die Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie mittels eines in einem Zwischenbild der Pupille angeordneten räumlichen Phasenmodulators auf Flüssigkeitsbasis realisiert wird. Alternativ ist die Einfügung eines optischen Bauteils mit einer phasenverzögernden optischen Beschichtung denkbar. Prinzipiell können alle phasenverzögernden Elemente, wie Substrate mit dielektrischen Beschichtungen, Phasenmodulatoren auf Basis von Flüssigkristallen oder achromatische Phasenfilter eingesetzt werden. Idealerweise ist die Optik mit der phasenverzögernden Eigenschaft in oder nahe einer Pupillenebene angeordnet.
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Im Hinblick auf eine konstruktiv einfache Bauform kann vorgesehen sein, dass die Pupillenlinie durch Fokussieren eines Beleuchtungslichtstrahls einer Beleuchtungslichtquelle mit einer Zylinderlinse oder einer Powell-Linse erzeugt wird. Alternativ kann die Pupillenlinie durch Abbilden einer Spaltblende in die Pupillenebene erzeugt werden. Denkbar ist auch der Einsatz holographischer Elemente.
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In besonders vorteilhafter Weise wird die Pupillenlinie mittels eines Achrogate-Filters in den Strahlengang eingekoppelt. In bevorzugter Weise könnte die Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie dann mittels zusätzlich phasenverzögernder Schichten auf dem Filter, beispielsweise in Form von dielektrischen Beschichtungen, realisiert werden.
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Im Hinblick auf eine besonders kompakte Bauform könnten das optische Bauteil zur Erzeugung der Pupillenlinie und das phasenmodulierende Element als bauliche Einheit ausgeführt sein. Im Hinblick auf eine hohe Flexibilität können das optische Bauteil zur Erzeugung der Pupillenlinie und das phasenmodulierende Element auch jeweils als separate Einheiten an unterschiedlichen Positionen im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet sein.
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Zur Sicherstellung einer kohärenten linienförmigen Beleuchtung der Pupille des Mikroskopobjektivs ist die Beleuchtungslichtquelle zur Erzeugung des optischen Signals bevorzugt als Laserlichtquelle ausgeführt.
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In besonders vorteilhafter Weise ist das Licht des optischen Signals senkrecht zur Pupillenlinie polarisiert, um auf diese Weise Depolarisierungseffekte weitestgehend auszuschließen.
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Im Rahmen einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Fokuslinie nacheinander in unterschiedlichen Raumrichtungen erzeugt. Dabei kann es sich beispielsweise um orthogonal zueinander orientierte Raumrichtungen handeln. Entsprechend kann vorgesehen sein, dass das gesamte zu erfassende Probevolumen nacheinander in jeder der Raumrichtungen abgerastert wird. Anschließend können die aufgenommenen Einzelbilder mathematisch zu einem Gesamtbild zusammengeführt werden, wodurch eine Auflösungserhöhung in mehr als einer Richtung realisiert ist.
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Es kann vorgesehen sein, dass der Übergang von dem ersten Zustand in den zweiten Zustand mittels Mehr-Photonen-Absorption realisiert wird. Alternativ oder zusätzlich kann das Auslesen eines von der Probe ausgehenden Messsignals mittels Mehr-Photonen-Anregung realisiert werden. Eine derartige Ausgestaltung bietet sich insbesondere bei speziellen Anwendungen an, beispielsweise wenn es gilt, ein Bleichen der Probe zu verhindern.
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Im Rahmen einer weiter bevorzugten Ausführung ist vorgesehen, dass das optische Signal und ein Testsignal zum Auslesen der ersten Zustände jeweils mittels gepulster Lichtquellen erzeugt werden. Dabei erweist sich eine Synchronisation der gepulsten Lichtquellen als vorteilhaft.
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Die Beleuchtungslichtquelle zum Erzeugen des optischen Signals kann mit mindestens einer weiteren Lichtquelle kombiniert sein, wobei die weitere Lichtquelle zum Auslesen des von der Probe ausgehenden Messsignals und/oder zur Erzeugung eines Schaltsignals zum Induzieren des ersten Zustandes dienen könnte. Insbesondere könnte die weitere Lichtquelle die Probe ganz oder teilweise ausleuchten, wobei eine linienförmige Ausleuchtung bevorzugt ist.
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Zudem könnte die Fokuslinie des optischen Schaltsignals mit einer weiteren Linie räumlich überlagert sein. In besonders vorteilhafter Weise ist die räumliche Überlagerung derart gewählt, dass die Intensitäts-Nullstelle der Fokuslinie des optischen Signals mit dem Maximum einer Linie zum Auslesen des von der Probe ausgehenden Messsignals räumlich überlagert ist. Je nach Anwendung kann dabei jeder Linie eine eigene Scanneinrichtung, vorzugsweise in Form eines Scannspiegels, zugeordnet sein, oder die Linien werden gemeinsam mit einer einzigen Scanneinrichtung gescannt.
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Um die Geschwindigkeitsvorteile bei der Bilderzeugung voll auszunutzen, wird die Scannrichtung in idealer Weise auf die jeweilige Verlaufsrichtung der Pupillenlinie abgestimmt. In weiter vorteilhafter Weise kann eine Liniendetektion des von der Probe ausgehenden Messsignals mittels eines Zeilendetektors durchgeführt werden. Der Zeilendetektor kann beispielsweise als CCD-Zeile ausgeführt sein, Der Einsatz eines EMCCDs oder einer APD (Avalanche Photodiode) ist ebenfalls denkbar.
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Im Hinblick auf eine Erhöhung der Auflösung auch entlang der optischen Achse ist die Detektorzeile bevorzugt konfokal zur Fokuslinie angeordnet. Konkret kann die Detektorzeile dabei in Detektionsrichtung hinter den Scanneinrichtungen (descannte Detektion) oder vor den Scanneinrichtungen (nicht descannte Detektion) angeordnet sein.
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In besonders vorteilhafter Weise wird das beschriebene Mikroskop zum optisch induzierten Übergang von Farbstoffmolekülen zwischen verschiedenen Molekülzuständen eingesetzt, die sich in mindestens einer optischen Eigenschaft voneinander unterscheiden, So kann das Mikroskop beispielsweise zum Induzieren eines Übergangs zwischen den Zuständen einer Trans-Cis-Isomerisierung oder zum Schalten von photochromen Farbstoffen eingesetzt werden. Des Weiteren ist ein Einsatz zum Transfer von Farbstoffmolekülen in deren Triplettzustand im Rahmen eines GSD-Verfahrens (Ground State Depletion) möglich. Schließlich bietet sich die Durchführung von TED-Verfahren an.
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Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläuterung bevorzugter Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Mikroskops zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Probe zu verweisen. In Verbindung mit Erläuterungen der bevorzugten Ausführungsbeispiele anhand der Zeichnungen werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
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1 in einer schematischen Darstellung ein zyklisches Beleuchtungsschema eines Verfahrens zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben,
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2 in einer schematischen Darstellung die Erzeugung einer Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil mit einem einzigen Intensitätsmaximum,
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3 in einer schematischen Darstellung die erfindungsgemäße Erzeugung einer Fokuslinie mit einem Querschnittsprofil mit mindestens einer Intensitäts-Nullstelle mit seitlich benachbarten Intensitätsmaxima,
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4 in einer schematischen Darstellung den Aufbau eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops und
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5 in einer schematischen Darstellung den Aufbau eines zweiten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Mikroskops.
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1 zeigt schematisch einen zyklischen Beleuchtungsvorgang, wie er zur räumlich hochauflösenden Untersuchung von Proben jenseits der beugungslimitierten Auflösungsgrenze eingesetzt wird. Gemäß 1a wird zunächst im gesamten zu erfassenden Probenraum P eine in der Probe 1 bereitgestellte Substanz, die wiederholt von einem ersten Zustand Z1 in einen zweiten Zustand Z2 überführbar ist, wobei sich die ersten und die zweiten Zustände Z1, Z2 in mindestens einer optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, mittels eines Schaltsignals 2 in den ersten Zustand Z1 gebracht. Im konkret dargestellten Ausführungsbeispiel handelt es bei dem ersten Zustand Z1 um einen fluoreszierenden Zustand A und bei dem zweiten Zustand Z2 um einen nicht fluoreszierenden Zustand B. Bei der in der Probe 1 bereitgestellten Substanz handelt es sich in dem konkret dargestellten Beispiel um eine photochrome Substanz, deren Moleküle durch Bestrahlung mit Licht einer ersten Wellenlänge, dem Schaltsignal 2, in den fluoreszenzfähigen Zustand A gebracht werden. Dies geschieht in idealer Weise durch Beleuchtung durch ein Objektiv 3 mit einer einfachen Beleuchtungslinie des Schaltsignals 2 im Probenraum P, wie es für sich gesehen aus dem Stand der Technik bekannt ist. Alternativ kann die Probe 1 auch im gesamten Probenraum P bestrahlt werden.
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Im Falle der Grundzustands-Entvölkerung (Ground State Depletion, GSD) findet der Übergang in den fluoreszenzfähigen (Singlet)-Zustand üblicherweise spontan statt. Das Einstrahlen optischer Schaltsignale erübrigt sich somit in diesem Fall, es müssen lediglich Wartezeiten von typischerweise 1 bis 100 μs (teilweise auch ein wenig länger) berücksichtigt werden.
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In einem nächsten Schritt – dargestellt in 1b – wird Licht einer anderen Wellenlänge, das sogenannte optische Signal 4, auf den zu erfassenden Probenbereich P aufgebracht. Dies geschieht in Form einer Doppellinie 9 mit dazwischen liegender Intensitäts-Nullstelle 5. Das optische Signal 4 induziert gesättigt den Übergang A → B in allen mit Licht des optischen Signals 4 beleuchteten Bereichen 6. Mit anderen Worten verbleibt lediglich in unmittelbarer Umgebung der Intensitäts-Nullstelle 5 ein eng definierter Bereich der Substanz im Zustand A. Dieser verbleibende Bereich der Substanz in Zustand A kann viel kleiner sein als die beugungslimitierten Strukturen. Die Größe des im Zustand A verbleibenden Bereichs hängt ganz maßgeblich von der Qualität des Intensitätsminimums 5 und damit vom erreichten Sättigungsgrad des Übergangs A → B ab.
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In 1c ist schematisch der Auslesevorgang des Zustands A dargestellt. Dazu wird ein optisches Testsignal 7 so in den zu erfassenden Probebereich P eingestrahlt, dass der gemäß 1b präparierte Bereich, in dem die Substanz in Zustand A verblieben ist, erfasst wird. Das Testsignal 7 wird in bevorzugter Weise ebenfalls linienförmig eingestrahlt. Dabei wird eine einfache Linie mit einem Maximum erzeugt, wobei das Maximum mit der Intensitäts-Nullstelle 5 des optischen Signals 4 räumlich überlagert wird. Dementsprechend kann auch die Detektion bevorzugt linienförmig erfolgen, bspw. durch einen konfokal angeordneten Zeilendetektor, beispielsweise in Form einer CCD-Zeile.
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Der in den 1a bis c dargestellte Zyklus wird wiederholt, wobei das Linienmuster bei jeder Wiederholung etwas weiter geschoben wird. Auf diese Weise lässt sich der gesamte zu erfassende Probenbereich P mit einer Auflösung im Subdiffraktionsbereich abbilden.
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2 zeigt schematisch die Erzeugung einer einzelnen Linienstruktur des Beleuchtungslichts zum Auslesen der Zustände A, d. h. einer einfachen Linie mit einem Maximum, das – wie oben ausgeführt – mit der Intensitäts-Nullstelle 5 der Fokuslinie 10 des optischen Signals 4 überlagert werden kann. Gemäß 2a wird das Beleuchtungslicht durch eine geeignete Optik 11 zunächst linienförmig in einer zur Fokusebene FE konjugierten Ebene FE abgebildet. Mittels einer Abbildungslinse 12 wird die Beleuchtungslinie kohärent in die Pupillenebene PE eines Objektivs 13 fokussiert, mit dem das Beleuchtungslicht in die Probe 1 fokussiert wird. im dargestellten Beispiel verläuft die Beleuchtungslinie in x-Richtung. Dementsprechend wird die Pupille PE – wie in 2b gezeigt – zentralsymmetrisch linienförmig in y-Richtung ausgeleuchtet (Pupillenlinie 14). In der Fokusebene FE des Objektivs 13 entsteht dabei – wie in 2c gezeigt – ebenfalls eine linienförmige Lichtstruktur, die senkrecht zur Pupillenlinie 14 in x-Richtung steht (Fokuslinie 15) und eine Abbildung der Linie in der zur Fokusebene FE konjugierten Ebene FE' darstellt. Der Querschnitt der Fokuslinie 15 hat eine beugungsbegrenzte Ausdehnung, wenn die Pupillenlinie 14 den gesamten Pupillendurchmesser erfasst. Die Querschnittsausdehnung der Fokuslinie 15 ist beugungsbegrenzt etwa 1,4fach größer als die einer beugungsbegrenzten Punktquelle (Airy-Scheibe).
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Die in 2 lediglich schematisch angedeutete Optik 11 kann in verschiedenen Farmen realisiert sein. So kann eine linienförmige Beleuchtung von FE' bzw. der Pupille PE beispielsweise durch Abbildung einer Spaltblende oder durch Fokussieren eines aufgeweiteten Beleuchtungslichtstrahls mittels einer Zylinderlinse oder einer Powell-Linse erreicht werden. Die Verwendung einer Powell-Linse bietet den Vorteil, dass die erzeugte linienförmige Lichtstruktur eine besonders homogene Lichtverteilung aufweist. Eine weitere Variante ist die Beleuchtung über einen nur linienförmig reflektierenden Strahlteiler, der in einer zur Pupillenebene PE konjugierten Ebene des Mikroskops angeordnet ist. Entscheidend für die Erzeugung einer linienförmigen Beleuchtung der Probe 1 in x-Richtung (20) ist prinzipiell nur die kohärente linienförmige Beleuchtung der Pupille PE in y-Richtung (2b).
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3 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel zur Erzeugung einer erfindungsgemäßen Fokuslinie 10 mit zentraler Nullstelle 5 im Querschnitt und seitlich begrenzenden Maxima 9. Dazu wird eine Phasenmodulation des optischen Signals 4 entlang der Pupillenlinie 14 realisiert. in 3a ist die linienförmige Ausleuchtung der Pupille PE dargestellt. Entlang der Pupillenlinie 14 ist im Pupillenmittelpunkt ein Phasensprung von einer halben Wellenlänge eingeführt, so dass die eine Hälfte der Linie 14 gegenüber der anderen Hälfte der Linie 14 um einen halben Wellenzug verzögert ist. Dies ist in 3a durch die unterschiedlich schraffierten Bereiche angedeutet. Diese Phasenmodulation hat zur Folge, dass in der Fokalebene FE eine Doppellinie 9 mit zentraler Intensitäts-Nullstelle 5 entsteht, wie dies in 3b dargestellt ist. Prinzipiell können auch andere Phasenmodulationen zu Strukturen mit einem derartigen Zentralminimum führen. So erzeugt jede zentralsymmetrische Phasenmodulation, welche die Eigenschaft hat, das 50% der Pupillenlinie 14 um einen halben Wellenzug verzögert werden, eine orthogonal zur Pupillenlinie 14 ausgerichtete Fokuslinie 10 mit einem Zentralminimum im Querschnittsprofil. Allerdings wird der Querschnitt der Fokuslinie 10 dabei komplizierter und damit im Allgemeinen aus mehreren Maxima und Minima bestehen.
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Wie in 3a durch die dargestellten Pfeile angedeutet, ist das Licht senkrecht zur Pupillenlinie 14, d. h. in x-Richtung, polarisiert. Auf diese Weise wird erreicht, dass in der Eintrittspupille 14 nur Polarisationsvektoren mit reiner Tangentialkomponente auftreten. Beim Durchlaufen nachfolgender Optiken depolarisieren diese wesentlich schwächer in z-Richtung, d. h. in Strahlrichtung, als beispielsweise Polarisationsvektoren mit (in Bezug auf die Pupille) radialen Komponenten.
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4 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops. Bei der in 4a dargestellten Ausführungsform wird kohärentes Beleuchtungslicht einer Strahlquelle 16 durch eine geeignete Optik 11 linienförmig in eine Zwischenbildebene ZB3 des Mikroskops fokussiert. Die Linie verläuft dabei in x-Richtung. Die Optik 11 zur Realisierung einer linienförmigen Lichtstruktur ist als Zylinderlinse 17 ausgeführt. Das Zwischenbild ZB3 wird über eine Linse 18 in die zur Pupille P1 des Mikroskopobjektivs 13 konjugierte Pupillenebene P2 abgebildet, wo die Lichtverteilung linienförmig in y-Richtung verläuft.
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In der Pupillenebene P3 des Mikroskops ist ein Strahlteiler 19 mit einer streifen, förmigen Reflexionsschicht RS angeordnet. Der Strahlteiler 19 ist nur im Bereich der Linie RS reflektierend, so dass das rückwärts Orts zu detektierende Messsignal 8, welches die gesamte Pupillenebene P3 ausleuchtet, fast vollständig transmittiert wird.
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Die Pupille P3 wird durch Optiken 20 und 18 auf einen Y-Scanner 21 abgebildet, der den Strahl zur Bildaufnahme in y-Richtung scannen kann. Dieser befindet sich ebenfalls in der Pupillenebene P2. Die weitere Abbildung erfolgt über das Scannokular 22 in ein Zwischenbild ZB1, wo wieder ein Lichtstreifen in x-Richtung entsteht. Dieser wird über die Tubuslinse 23 und das Objektiv 13 in die Fokusebene FE im Probenraum abgebildet. In der Pupille P1 des Objektivs 13 entsteht dabei eine linienförmige Lichtverteilung in y-Richtung analog zur Pupillenebene P3, in der sich der Strahlteiler 19 befindet. In der Fokalebene FE entsteht ein (beugungsbegrenzter) Beleuchtungsstreifen analog zur Zwischenbildebene ZB3.
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Zur Erzeugung der Fokuslinie 10 mit zentraler Intensitäts-Nullstelle 5 und seitlichen Intensitäts-Maxima 9 wird erfindungsgemäß eine Phasenmodulation entlang der Pupillenlinie 14 durchgeführt In dem dargestellten Ausführungsbeispiel wird dazu in der Pupille P3 ein Phasensprung eingeführt, indem ein Teil des Strahlteilers 19 mit einer phasenverzögernden Struktur PV versehen wird, welche die Phase des Lichts um einen halben Wellenzug verzögert. Die hier transparent ausgeführte Beschichtung PV deckt dabei wie in 4b gezeigt – die eine Hälfte der über den gesamten Pupillendurchmesser verlaufenden Reflexionsschicht RS ab. Beim Durchlaufen der Beschichtung PV wird das Licht aufgrund des Brechungsindex der Schicht verzögert gegen das Licht, das unbeschichtete Stellen (also Luft) durchläuft. Die Beschichtung PV kann z. B. aus einem Dielektrikum wie Magnesiumfluorit oder Siliziumdioxid hergestellt sein und auf die Reflexionsschicht RS aufgedampft werden. Auch eine Struktur basierend auf einer Flüssigkristall-Schicht ist denkbar.
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Eine alternative Realisierung wäre die Einfügung eines phasenverzögernden Elements in einer weiteren Pupillenebene, die durch weitere Abbildungslinsen erzeugt werden kann (hier nicht dargestellt). In dieser weiteren Pupillenebene könnten dann phasenverzögernde Elemente, wie Substrate mit dielektrischen Beschichtungen, Phasenmodulatoren auf Basis von Flüssigkristallen oder achromatische Phasenfilter angeordnet werden. Entscheidend ist nur die Einführung einer Optik mit der beschriebenen phasenverzögernden Eigenschaft, wobei diese in idealer Weise in oder nahe einer Pupillenebene angeordnet ist.
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Das Detektionslicht (im Allgemeinen Fluoreszenz) wird als Messsignal 8 durch das Objektiv 13, die Tubuslinse 23, das Scann-Okular 22, den Scanner 21 (Descanned Detection), die Linsen 18 und 20, einen Filter 24 zur spektralen Filterung und eine Detektorlinse 25 auf einen konfokal angeordneten Zeilendetektor 26 abgebildet. Auch eine Non-Descanned-Detektion ist denkbar, wobei dabei der Detektor 26 zwischen Scanner 21 und Objektiv 13 angeordnet wäre.
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In 5 ist – schematisch – eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Mikroskops dargestellt, wobei der Aufbau konzeptionell dem Aufbau des Mikroskops gemäß 4 ähnelt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind die Strahlverläufe nicht dargestellt. In der Pupillenebene P3, die linienförmig ausgeleuchtet wird (Pupillenlinie 14 in y-Richtung), ist – im Unterschied zur Ausführung gemäß 4 – kein Strahlteiler 19 angeordnet, der gleichzeitig als (räumlicher) Strahlteiler und als phasenverzögendes Element fungiert. Vielmehr sind beide Funktionen separiert, indem der Strahlteiler 19 nunmehr ausschließlich als räumlicher Strahlteiler fungiert, wohingegen die Phasenverzögerung durch eine zusätzlich eingeführte phasenverzögernde Optik 27 erfolgt. Bei der phasenverzögernden Optik 27, die ebenfalls in oder nahe der Pupille P3 angeordnet ist, kann es sich wiederum um ein Substrat handeln, das räumlich strukturiert mit einer phasenverzögernden, transparenten Beschichtung PV (Dielektrikum) versehen ist. In der in 5b dargestellten Ausführung ist die Optik 27 kreisförmig ausgebildet, wobei der in negativer y-Richtung liegende Halbkreis mit der phasenverzögernden Beschichtung PV versehen ist. Des Weiteren kommen wieder Phasenmodulatoren auf Basis von Flüssigkristallen oder achromatische Phasenfilter, Arrays mit beweglichen Mikrospiegeln oder andere deformierbare Spiegel in Frage. Als Strahlteiler 19 zur Trennung von Beleuchtungslicht und Detektionslicht kommt ein konventioneller dichroitischer Strahlteiler 28, bspw. in Form eines Kantenfilters, zum Einsatz. Der dichroitische Strahlteiler 28 ist der phasenverzögernden Optik 27 nachgeschaltet.
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Hinsichtlich weiter vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Mikroskops werde zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.
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Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die voranstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränkt.
