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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur räumlich hochauflösenden Untersuchung
von Proben, wobei die Probe durch ein Objektiv beleuchtet wird und wobei
die zu untersuchende Probe eine Substanz umfasst, die wiederholt
von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand überführbar ist,
wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen
Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend die Schritte,
dass die Substanz in einem zu erfassenden Probenbereich zunächst in
den ersten Zustand gebracht wird und dass mittels eines optischen
Signals der zweite Zustand induziert wird, wobei innerhalb des zu
erfassenden Probenbereichs räumlich
begrenzte Teilbereiche gezielt ausgespart werden, wobei das optische
Signal derart bereitgestellt wird, dass sich in dem zu erfassenden
Probenbereich eine Stehwelle mit definierten Intensitäts-Nullstellen
ausbildet, wobei zur Erzeugung der Stehwelle mindestens zwei kohärente Lichtstrahlen in
die Pupille des Objektivs fokussiert werden.
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Des
Weiteren betrifft die Erfindung ein Mikroskop, insbesondere Laser-Raster-Fluoreszenzmikroskop,
zur räumlich
hochauflösenden
Untersuchung von Proben, wobei die zu untersuchende Probe eine Substanz
umfasst, die wiederholt von einem ersten Zustand in einen zweiten
Zustand überführbar ist, wobei
sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen
Eigenschaften voneinander unterscheiden, umfassend ein Objektiv,
Mittel zur Bereitstellung eines Schaltsignals, mit dem die Substanz
in einem zu erfassenden Probenbereich zunächst in den ersten Zustand
verbringbar ist, sowie Mittel zur Bereitstellung eines optischen
Signals zum Induzieren des zweiten Zustandes derart, dass innerhalb
des zu erfassenden Probenbereichs räumlich begrenzte Teilbereiche
gezielt aussparbar sind und sich in dem zu erfassenden Probenbereich
eine Stehwelle mit definierten Intensitäts-Nullstellen ausbildet, wobei
zur Erzeugung der Stehwelle Mittel zur Bereitstellung von mindestens
zwei kohärenten Lichtstrahlen
sowie Mittel zum Fokussieren der mindestens zwei kohärenten Lichtstrahlen
in die Pupille des Objektivs vorgesehen sind.
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Verfahren
und Mikroskope der eingangs genannten Art sind aus der Praxis bekannt.
Grundsätzlich
ist gemäß dem Abbe'schen Gesetz der
räumlichen
Auflösung
abbildender optischer Verfahren durch die Beugungsgrenze eine theoretische
Grenze gesetzt, wobei die Beugungsgrenze von der Wellenlänge des
verwendeten Lichts abhängt.
Mit den hier in Rede stehenden Verfahren und Mikroskopen lassen
sich allerdings räumliche
Auflösungen
erzielen, die über
die nach Abbe bekannte theoretische Beugungsgrenze hinaus verbessert
sind.
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Bei
den bekannten Verfahren werden hierzu in zu untersuchenden Proben
Substanzen bereitgestellt, die wiederholt von einem ersten Zustand
in einen zweiten Zustand überführbar sind,
wobei sich die ersten und die zweiten Zustände in mindestens einer optischen
Eigenschaft voneinander unterscheiden. Bei den meisten bekannten
Verfahren handelt es sich bei dem ersten Zustand um einen fluoreszenzfähigen Zustand
(im Folgenden Zustand A genannt) und bei dem zweiten Zustand um
einen nicht fluoreszenzfähigen
Zustand (im Folgenden Zustand B). Nachdem die Substanz in einem
zu erfassenden Probenbereich mittels eines Schaltsignals in den
fluoreszenzfähigen
Zustand A gebracht worden ist, wird mittels eines optischen Signals
in räumlich
begrenzten Teilbereichen des zu erfassenden Probenbereichs Zustand
B induziert und somit eine Unterdrückung der Fluoreszenz von Fluoreszenzmolekülen erzeugt.
Der physikalische Prozess der Fluoreszenzunterdrückung kann dabei sehr unterschiedlicher
Natur sein. So ist bspw. die stimulierte Emission aus dem zuvor angeregten
Zustand oder eine optisch induzierte Strukturänderung der Fluoreszenzmoleküle bekannt.
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Entscheidend
ist, dass der durch ein optisches Signal induzierte Übergang
von dem ersten in den zweiten Zustand im Probenvolumen in großen Bereichen
gesättigt,
d. h. vollständig,
stattfindet, und in mindestens einem Teilbereich des Probenvolumens
gerade nicht stattfindet, indem dort das optische Schaltsignal gezielt
nicht eingestrahlt wird. Dieser Effekt kann durch das Erzeugen einer
Intensitätsnullstelle
des optischen Signals erreicht werden. An der Nullstelle und in
deren unmittelbarer Umgebung findet kein Übergang in den zweiten Zustand
(im Allgemeinen der nicht fluoreszierende Zustand B) statt, so dass
der erste Zustand (im Allgemeinen der fluoreszierende Zustand A)
erhalten bleibt. Eine Sättigung
des Übergangs
A → B durch
das optische Signal führt
in den beleuchteten Bereichen des zu erfassenden Probenbereichs
bereits in naher Umgebung der Intensitäts-Nullstellen zu einem (nahezu)
vollständigen
Transfer in den Zustand B. Je stärker
der Prozess in die Sättigung
getrieben wird, d. h. je mehr Energie durch das optische Signal
in die Bereiche um die Nullstelle herum eingebracht wird, desto
kleiner wird der Bereich mit Fluoreszenzmolekülen im fluoreszenzfähigen Zustand
A bzw. allgemein in einem „leuchtfähigen” Zustand.
In Abhängigkeit
vom Sättigungsgrad
in der un mittelbaren Nullstellen-Umgebung kann dieser Bereich prinzipiell
beliebig klein gemacht werden. Folglich lassen sich Regionen des
Zustands A markieren, die beliebig viel kleiner sind als die kleinsten
aufgrund der Beugungsgrenze möglichen
Regionen eines aufgebrachten optischen Signals. Wird der Bereich
des Zustands A anschließend ausgelesen,
z. B. durch Einstrahlen eines Testsignals, so stammt das (Fluoreszenz-)Messsignal
aus einem definierten Bereich, der kleiner sein kann als es die
Beugungsgrenze zulässt.
Wird die Probe auf die beschriebene Art Punkt für Punkt abgerastert, so entsteht
ein Bild mit einer Auflösung
die besser ist, als es die Beugungstheorie erlaubt.
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Verfahren,
der hier beschriebenen Art, bei denen als Unterschied zwischen zwei
Zuständen
die optische Eigenschaft fluoreszenzfähig/nicht fluoreszenzfähig ausgenutzt
wird, sind bspw. aus der
DE 103
25 459 A1 und der
DE
103 25 460 A1 bekannt. Bei diesen Verfahren werden Fluoreszenzmoleküle mit Hilfe
eines optischen Signals von einem Zustand A (fluoreszenzfähig) in
einen Zustand B (nicht fluoreszenzfähig) gebracht, wobei bei dem Übergang
A → B die
Sättigung
erreicht wird. Die in dem fluoreszenzfähigen Zustand A verbleibenden
Bereiche der Probe resultieren jeweils aus einem eine Nullstelle aufweisenden
Intensitätsminimum
des eingestrahlten optischen Signals. Die Intensitätsminima
sind Teil eines Interferenzmusters. Das Abrastern der Probe erfolgt
durch Verschiebung der Intensitätsminima
des optischen Signals, wobei die Verschiebung durch Phasenverschiebung
der interferierenden Strahlen bewirkt wird.
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Bei
den genannten Verfahren ist nachteilig, dass das durch die interferierenden
Strahlen erzeugte Interferenzmuster mit lokalen punktförmigen Intensitätsminima
nur sehr schwierig über
einen hinreichend langen Zeitraum in einem zur Erzielung höchster Auflösungen hinreichend
stabilen Zustand gehalten werden kann. Dies gilt insbesondere beim
Einsatz hochnumerischer Optiken. Diese können die sie passierenden Lichtstrahlen
depolarisieren und unter Umständen
auch Phasenverschiebungen zur Folge haben, was sich negativ auf
das Interferenzmuster auswirken und im Extremfall sogar zu einer
völligen Zerstörung der
Interferenzstruktur führen
kann.
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Aus
der
DE 103 30 402
A1 ist ein doppelkonfokales Rastermikroskop mit zwei Beleuchtungsteilstrahlengängen bekannt,
wobei zur Verbesserung der lateralen Auf lösung ein optischen Element
zur räumlichen
und/oder zeitlichen Sortierung der Wellenlängenanteile der Laserlichtquelle
innerhalb des Strahlquerschnitts eines Beleuchtungsteilstrahlengangs
vorgesehen ist. Bei der Anwendung des beschriebenen Mikroskops in
der STED-4Pi-Mikroskopie kann durch einen manipulierten STED-Strahl in 4Pi-Anordnung
mit destruktiver Interferenz im Fokus und verwaschener Seitenmaxima
eine laterale Auflösungssteigung
derart erzielt werden, dass die Anregungsstrahlen ebenfalls in 4Pi-Anordnung
mit einem spiegelverkehrten räumlichen
Chirp konstruktiv im Fokus zur Interferenz gebracht werden.
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Ähnliche
Verfahren zur STED-4Pi-Mikroskopie sind aus der
DE 103 40 965 A1 sowie
aus den folgenden Publikationen bekannt: (i) Egner, A. et al.: Fluorescence
microscopy with super-resolved optical sections. In: TRENDS in Cell
Biology, Vol. 15, No. 4, Apr 2005, S. 207–215; (ii) Wirsing, B.: Aus
Mikroskopie wird Nanoskopie. In: Internetpräsenz von Innovations-Report
(Berichte), Apr 2002; (iii) Hell, S. W.: Toward fluorescence nanoscopy.
In Nature biotechnology, Vol. 21, No. 11, Nov 2003, S. 1347–1355; (iv)
Dyba, M. et al.: Immunofluorescence stimulated emission depletion
microscopy. In: nature biotechnology, Vol. 21, No. 11, 2003, S.
1303–1304
(iii); (v) Dyba, M. et al.: Focal Spots of Size λ/23 Open Up Far-Field Florescence
Microscopy at 33 nm Axial Resolution. In: Phys. Rev. Lett., Vol.
88, 2002, S. 163901 -1 bis -4.
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Aus
der
US 5,866,911 sowie
der
US 2001/0045523
A1 sind weitere mikroskopische STED-Verfahren bekannt.
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Aus
der
DE 101 54 699
A1 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zum räumlich eng
begrenzten Anregen eines optischen Übergangs bekannt, wobei ein
Anregungslichtstrahl mit einem räumlichen,
ein Intensitätsminimum
an dem Fokuspunkt und auf verschiedenen Seiten des Fokuspunkts mehrere
Intensitätsmaxima
aufweisenden Interferenzmuster eines den optischen Übergang
beeinflussenden, in Teilstrahlen aufgespaltenen und in dem Fokusbereich aus
unterschiedlichen Richtungen mit sich selbst zur Interferenz gebrachten
Abregungslichtrate überlagert wird.
Die Wellenfronten der Teilstrahlen werden derart aberriert, dass
auf jeder Seite des Fokuspunkts die Intensitätsmaxima des Interferenzmusters
räumlich
aufgeweitet werden, ohne das Intensitätsminimum am Fokuspunkt zu
beseitigen.
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Aus
der
DE 101 18 355
B4 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Mehrphotonenanregung
einer Probe bekannt, wobei zur Beleuchtung mindestens zwei kohärente Teilstrahlen
aus verschiedenen Richtungen vorgesehen sind, die in dem Bereich
der Messebene miteinander interferieren.
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Aus
der
EP 1 582 858 A1 ist
für sich
gesehen bekannt, in einem Verfahren zur Anregung der Moleküle von einem
ersten Zustand in einen Zustand mit einem optischen Signal die Probe,
bevor das optische Signal auf sie gerichtet wird, zur Auflösungserhöhung auf
unter 5°C
abzukühlen.
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Aus
der
WO 03/031951
A1 ist für
sich gesehen ein mikroskopisches Fernfeldverfahren bekannt, bei
dem räumliche
Informationen eines Objekts durch Beleuchten des Objekts mit strukturiertem Licht
und Vergleich der erhaltenen Antwort mit Simulationsdaten eines
Objekts mit bekannten räumlichen Informationen
gewonnen wird.
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Aus
der
DE 43 31 570 A1 sind
ein Verfahren und eine Vorrichtung zum optischen Anregen eines Energiezustands
einer Probe in einem Probenpunkt mit hoher Ortsauflösung bekannt.
Dabei wird die laterale Auflösung
verbessert, indem die Anregung durch Zusammenwirken von wenigstens
zwei Lichtanteilen unterschiedlicher Lichteigenschaften erfolgt
und die Strahlachsen der Lichtanteile derart gegeneinander versetzt
angeordnet sind, dass die fokalen Intensitätsverteilungen der Lichtanteile
im Probenpunkt in ihren Hauptmaxima überlappend, lateral gegeneinander
verschoben sind.
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Aus
der
DE 100 12 462
A1 ist eine Vorrichtung zur Beleuchtung eines Objekts bekannt,
bei der zur Vereinfachung der Justierung ein das Licht eines Beleuchtungsstrahlengangs
veränderndes
optisches Bauteil vorgesehen ist, dessen optische Eigenschaften
derart beeinflussbar sind, dass sich das Beleuchtungsmuster des
Beleuchtungsstrahlengangs im Objektbereich in seiner Form verändert.
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Aus
der Publikation Frohn, J. T. et al.: True optical resolution beyond
the Rayleigh limit achieved by standing wave illumination. In: Proc.
Nat. Acad. Sc., Vol. 97, No. 13, Jun 2000, S. 7232–7236 ist
ein Verfahren zur Verbesserung der Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie
bekannt, bei dem die Probe mit einem netzartigen Interferenzmuster
einer Laserlichtquelle beleuchtet wird.
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Aus
der
DE 10 2004
032 953 B4 ist eine optische Vorrichtung mit einer fokussierenden
Optik bekannt, wobei durch Verwendung unterschiedlicher Grenzflächen eine über den
Strahldurchmesser des Beleuchtungslichtbündels ortsabhängige Phasenverschiebung
erzeugt wird.
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In
der Publikation Presley, J. F.: Imaging the secretory pathway: The
past and future impact of live cell optical technique. In: Biochimica
et Biophysica Acta, Vol. 1744, 2005, S. 259–272 sind unterschiedliche
optische Techniken zur hochauflösenden
Untersuchung von lebenden Zellen beschrieben.
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Aus
der
DE 10 2006
038 647 A1 sind für
sich gesehen ein Verfahren und ein Fluoreszenzlichtmikroskop zum
räumlich
hochaufgelösten
Abbilden einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur bekannt.
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Die
US 2002/0064789 A1 beschreibt
einen optischen Regler, der auf einer ultrahoch aufgelösten Kolokalisierung
einzelner fluoreszierender Proben basiert.
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Aus
der
WO 2006/058187
A2 ist für
sich gesehen ein Mikroskop bekannt bei dem mittels mehrerer Beleuchtungswellen
innerhalb der Anregungsregion der Probe ein symmetrisches Bravais-Gitter
gebildet wird.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
sowie ein Mikroskop der eingangs genannten Art anzugeben, wonach
mit konstruktiv einfachen und kostengünstigen Mitteln eine hohe Auflösung erreicht
ist, die auch beim Einsatz hochnumerischer Optiken über einen hinreichend
langen Zeitraum stabil gehalten werden kann.
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Die
voranstehende Aufgabe ist durch ein Verfahren mit den Merkmalen
des Patentanspruchs 1 gelöst.
Danach ist das Verfahren derart ausgestaltet und weitergebildet,
dass die kohärenten
Lichtstrahlen nur in Tangentialrichtung der Pupille des Objektivs
polarisiert sind.
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Die
voranstehende Aufgabe ist des Weiteren durch ein Mikroskop mit den
Merkmalen des Patentanspruchs 18 gelöst. Danach ist das Mikroskop
derart ausgestaltet und weitergebildet, dass die kohärenten Lichtstrahlen
nur in Tangentialrichtung der Pupille des Objektivs polarisiert
sind.
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In
erfindungsgemäßer Weise
ist erkannt worden, dass sich durch eine Polarisierung der kohärenten Lichtstrahlen
nur in Tangentialrichtung der Pupille des Objektivs unerwünschte Veränderungen
des Polarisationszustandes des Lichts verhindern lassen, die auftreten
können,
wenn (linear) polarisiertes Licht durch eine Optik hoher numerischer
Apertur fokussiert wird. Wenn x- und y-Richtungen die Ebene der Eintrittspupille
und z die optische Achse definieren, so kann ein im Allgemeinen
ursprünglich
zum Beispiel in x-Richtung polarisierter Lichtstrahl nach Durchlaufen
der Optik auch Polarisationskomponenten in y- und z-Richtung aufweisen.
Dies gilt im Allgemeinen auch für
Nullstellen einer Stehwelle im Fokusraum. Ein ursprünglich in
x-Richtung polarisierter Lichtstrahl wird daher an den Positionen
der Nullstellen der x-Komponente des Lichts unter Umständen Licht
in y- und z-Richtung aufweisen. Dies hängt unter anderem von der Position,
der relativen Phase und vom Polarisationszustand der in die Eintrittspupille
fokussierten Lichtstrahlen ab. Mittels einer Polarisation der Lichtstrahlen
ausschließlich
in Tangentialrichtung der Pupille des Objektivs werden die Nullstellen
der Stehwelle auch durch die beschriebenen Depolarisationseffekte
hochnumerischer Objektive nicht oder nur unbedeutend beeinflusst,
so dass die Nullstellen der Stehwellen auch beim Abrastern der Probe
ständig
erhalten bleiben.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
und das erfindungsgemäße Mikroskop
lassen sich in besonders vorteilhafter Weise in Verbindung mit sehr
langlebigen oder zeitlich sogar dauerhaft stabilen ersten und zweiten
Zuständen
einsetzen. In diesem Fall kann für
die Sättigung
des Übergangs
vom ersten in den zweiten Zustand ein vergleichsweise langer Zeitraum
gewählt
werden, innerhalb dessen die zur Sättigung notwendige Energie
des optischen Signals eingestrahlt wird. Die lokalen Intensitäten zur Übergangssättigung
können
dadurch sehr gering gewählt werden.
Vor allem kann die von einer Strahlquelle des optischen Signals
zur Verfügung
stehende Gesamtenergie auf großräumige Bereiche
im Probenraum verteilt und mehrere Intensitätsnullstellen oder eine ausgedehnte
Nullstelle erzeugt werden. Trotz der daraus resultierenden geringen
lokalen Intensitäten
in der Umgebung der Nullstelle(n) im Vergleich zur Auftragung des
Gesamtsignals um nur eine punktförmige
Nullstelle herum kann die Sättigung
erreicht werden. Dazu muss das Signal nur genügend lange eingestrahlt werden,
bis schließlich
alle Moleküle
in Umgebung der Nullstellen im zweiten Zustand sind. Dies ist ein
entscheidender Unterschied zum Fall eines kurzlebigen Zustandes
(z. B. im STED-Verfahren mit typischen Lebenszeit von ~1 ns für einen fluoreszenzfähigen Zustand
A), wo die zur Sättigung notwendige
Energie in so kurzer Zeit eingestrahlt werden muss (deutlich schneller
als die Rate A → B), dass
die Gesamtleistung der Strahlquelle nur für die Erzeugung einer (oder
maximal einiger weniger) lokalen Nullstellen ausreicht. Es lässt sich
für konkrete Systeme
zeigen, dass im Falle stabiler Zustände (z. B. photochrome Farbstoffe)
oder langlebiger Zustände
(z. B. Transfer in das Tripletsystem beim GSD-Verfahren, GSD = Ground
State Depletion = Grundzustandsentvölkerung) die Leistung preiswerter
und kommerzieller Lasersysteme auf so große Bereiche verteilt werden
kann, dass mehrere punktförmige
Intensitäts-Nullstellen
(>> 10) oder ganze Streifen verschwindender
Intensität
in der Probe erzeugt werden können,
in deren unmittelbarer Umgebung nach wie vor die Sättigung
erreicht werden kann. Dies ermöglicht
eine parallelisierte Bildaufnahme, wenn die Probe mit der Vielzahl
von Punkt-Nullstellen oder mit Nullstellen-Linien gleichzeitig abgerastert
wird und die Signale gleichzeitig für jede Nullstelle getrennt
von einem Detektor erfasst werden. Auf diese Weise lassen sich Mikroskope
mit Auflösungen
unterhalb der klassischen Beugungsgrenze konstruieren, deren Bildaufnahmegeschwindigkeit
im Bereich STED basierten Verfahren liegt und im Vergleich zu Systemen
mit einer einzigen lokalen Nullstelle deutlich erhöht ist.
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Im
Rahmen einer konkreten Ausführungsform
ist vorgesehen, dass Stehwellen in einer Richtung erzeugt werden,
indem genau zwei kohärente Lichtstrahlen
in die Pupille des Objektivs fokussiert werden. Eine Überlagerung
der Stehwellen in zwei Richtungen kann erreicht werden, indem vier
paarweise kohärente
Lichtstrahlen in die Pupille des Objektivs fokussiert werden. Durch
die Überlagerung bildet
sich ein 2D-Gittermuster, wobei im Hinblick auf eine leichte Auswertbarkeit
eine orthogonale Überlagerung
der Stehwellen bevorzugt wird, so dass ein Schachbrettmuster entsteht.
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Im
Hinblick auf eine besonders einfache Konstruktion ist vorgesehen,
dass die kohärenten Lichtstrahlen
mit mindestens einer Linse in ein Zwischenbild der Eintrittspupille
des Objektivs fokussiert werden.
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Im
Rahmen einer weiteren Ausführungsform ist
der Einsatz von Lichtleitfasern vorgesehen, über die die kohärenten Lichtstrahlen
bereitgestellt werden. Im einfachsten Fall kann es sich dabei beispielsweise
um Glasfasern handeln. Die kohärenten
Lichtstrahlen lassen sich besonders einfach in die Eintrittspupille
des Objektivs fokussieren, wenn die Austrittsflächen der Lichtleitfasern beispielsweise
in einem Zwischenbild der Eintrittspupille des Objektivs positioniert
sind. In besonders vorteilhafter Weise werden polarisationserhaltende
Lichtleitfasern eingesetzt, wobei die Vorteile einer derartigen
Ausführung weiter
unten im Detail erläutert
werden.
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Alternativ
können
die kohärenten
Lichtstrahlen mittels eines im Strahlengang angeordneten vorzugsweise
holographischen Gitters oder mittels eines im Strahlengang angeordneten
vorzugsweise programmierbaren Phasenmodulators erzeugt werden. Zur
Erzeugung von höchstauflösenden Bildern wird
als Objektiv in idealer Weise eine hochnumerische Optik verwendet,
die von vornherein kleinstmögliche
Lichtstrukturen im Rahmen der Beugungsgrenze erzeugt. In Verbindung
mit hochnumerischen Systemen lässt
sich ein Maximum an Auflösung
erreichen.
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Zum
Abrastern des gesamten zu erfassenden Probenbereichs kann vorgesehen
sein, dass die Intensitäts-Nullstellen
der Stehwelle schrittweise verschoben werden. Eine derartige Verschiebung
kann insbesondere durch Veränderungen
der relativen Phasenlagen der einzelnen kohärenten Lichtstrahlen zueinander
erreicht werden. In besonders einfach zu handhabender Weise können die Änderungen
der relativen Phasen der einzelnen kohärenten Lichtstrahlen realisiert
werden, indem die optische Weglänge
in mindestens einem der kohärenten
Lichtstrahlen verändert
wird. Zum Nachweis des von der Probe ausgehenden Messsignals ist
ein Detektor vorgesehen, der beispielsweise als CCD-Detektor, als
EMCCD-Detektor oder als APD-Array (Avalanche Photodiode) ausgeführt ist.
Der Auslesevorgang des Detektors ist in vorteilhafter Weise mit
dem Rastervorgang synchronisiert, beispielsweise derart, dass der Detektor
nach jedem Rasterschritt ausgelesen wird.
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Zur
Erzeugung der Lichtstrahlen können
beispielsweise Laserlichtquellen eingesetzt werden. Alternativ ist
der Einsatz von Weißlichtquellen
denkbar, wobei in diesem Fall die Kohärenzlänge der Lichtquelle hinreichend
kurz sein muss. Im Falle von Weißlichtquellen werden in vorteilhafter
Weise verstellbare Retroreflektoren eingesetzt, mit denen ein Wellenlängenabgleich
zwischen paarweise kohärenten
Lichtstrahlen durchgeführt
werden kann.
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Im
Hinblick auf ein hohes Maß an
Flexibilität ist
der Einsatz zusätzlicher
Lichtquellen vorgesehen, deren Licht einerseits zum Rückschalten
der Substanz aus dem zweiten Zustand in den ersten Zustand und/oder
zum Auslesen der ersten Zuständen in
den Strahlengang einkoppelbar ist. Im Gegensatz zu der punktförmigen Ausleuchtung,
die bei dem optischen Signal zur Realisierung einer Stehwelle gewählt wird,
werden die zusätzlichen
Lichtquellen bevorzugt so eingesetzt, dass sie das Gesichtsfeld großräumig ausleuchten.
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Im
Rahmen konkreter Anwendungen, beispielsweise bei der Untersuchung
lebender Zellen, die der Abbildung biologischer Vorgänge in der
Nähe der
Zellmembran dienen, kann das Auslesen der ersten Zustände im TIRF-Modus
(Total Internal Reflectance Fluorescence) erfolgen. Dazu können die Stehwellen
als evaneszente Felder ausgebildet werden, so dass aufgrund der
in Folge von Totalreflexion begrenzten Eindringtiefe die Stehwelle
nur in einer sehr dünnen
Schicht der Probe wirksam ist. Auf diese Weise lassen sich Prozesse
in der Nähe
der Zellmembran lebender Zelle mit höchster räumlicher Auflösung visualisieren.
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Es
gibt nun verschiedene Möglichkeiten,
die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten
und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits
auf die nachfolgende Erläuterung
bevorzugter Ausführungsbeispiele
des erfindungsgemäßen Verfahrens
und des erfindungsgemäßen Mikroskops zur
räumlich
hochauflösenden
Untersuchung von Proben zu verweisen. In Verbindung mit Erläuterungen
der bevorzugten Ausführungsbeispiele
anhand der Zeichnungen werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen
und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
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1 in
einer schematischen Darstellung ein zyklisches Beleuchtungsschema
eines Verfahrens zur räumlich
hochauflösenden
Untersuchung von Proben,
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2 in
einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops
und
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3 in
einer schematischen Darstellung unterschiedliche Varianten der Fokussierung
kohärenter
Lichtstrahlen in die Eintrittspupille des Objektivs zusammen mit
verschiedenen Polarisationszuständen
und
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4 in
einer schematischen Darstellung ein Ausführungsbeispiel mit insgesamt
vier paarweise kohärenten
Lichtstrahlen.
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1 zeigt
schematisch einen zyklischen Beleuchtungsvorgang, wie er zur räumlich hochauflösenden Untersuchung
von Proben jenseits der beugungslimitierten Auflösungsgrenze eingesetzt wird. Gemäß 1a wird zunächst im gesamten zu erfassenden
Probenraum P eine in der Probe 1 bereitgestellte Substanz,
die wiederholt von einem ersten Zustand Z1 in einen zweiten Zustand
Z2 überführbar ist, wobei
sich die ersten und die zweiten Zustände Z1, Z2 in mindestens einer
optischen Eigenschaften voneinander unterscheiden, mittels eines
Schaltsignals 2 in den ersten Zustand Z1 gebracht. Im konkret
dargestellten Ausführungsbeispiel
handelt es bei dem ersten Zustand Z1 um einen fluoreszierenden Zustand
A und bei dem zweiten Zustand Z2 um einen nicht fluoreszierenden
Zustand B. Bei der in der Probe 1 bereitgestellten Substanz
handelt es sich in dem konkret dargestellten Beispiel um eine photochrome Substanz,
deren Moleküle
durch Bestrahlung mit Licht einer ersten Wellenlänge, dem Schaltsignal 2, in
den fluoreszenzfähigen
Zustand A gebracht werden. Dies geschieht in idealer Weise, indem
die Probe 1 im gesamten Probenraum P durch Beleuchtung durch
ein Objektiv 3 mit dem Schaltsignal 2 bestrahlt wird.
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Im
Falle der Grundzustands-Entvölkerung (Ground
State Depletion, GSD) findet der Übergang in den fluoreszenzfähigen (Singlet)-Zustand üblicherweise
spontan statt. Das Einstrahlen optischer Schaltsignale erübrigt sich
somit in diesem Fall, es müssen
lediglich Wartezeiten von typischerweise 1 bis 100 μs (teilweise
auch ein wenig länger)
berücksichtigt
werden.
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In
einem nächsten
Schritt – dargestellt
in 1b – wird
Licht einer anderen Wellenlänge,
das sogenannte optische Signal 4, auf den zu erfassenden
Probenbereich P aufgebracht. Dies geschieht in Form einer Lichtstruktur
mit definierten Intensitäts-Nullstellen 5.
Das optische Signal 4 induziert gesättigt den Übergang A → B in allen mit Licht des optischen
Signals 4 beleuchteten Bereichen 6. Mit anderen
Worten verbleiben lediglich in unmittelbarer Umgebung der Intensitäts-Nullstellen 5 eng
definierte Bereiche der Substanz im Zustand A. Die verbleibenden
Bereiche A1, A2,
A3, ... der Substanz in Zustand A können viel
kleiner sein als die Dimensionen der Lichtstruktur des optischen
Signals 4 selbst, d. h. konkret viel kleiner als beugungslimitierte
Strukturen. Die Größe der im
Zustand A verbleibenden Bereiche A1, A2, A3, ... der Substanz
hängt ganz
maßgeblich von
der Qualität
der Intensitätsminima 5 und
damit vom erreichten Sättigungsgrad
des Übergangs
A → B ab.
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In 1c ist schematisch der Auslesevorgang
des Zustands A dargestellt. Dazu wird ein optisches Testsignal 7 so
in den zu erfassenden Probebereich P eingestrahlt, dass diejenigen
gemäß 1b präparierten
Bereiche, in denen die Substanz in Zustand A verblieben ist, erfasst
werden. Eventuell noch existierende Bereiche der Substanz im Zustand A,
die außerhalb
des zu erfassenden Probenbereichs P liegen, dürfen dabei nicht erfasst werden.
Das von der Substanz im Zustand A ausgehende Fluoreszenzlicht wird
als Messsignal 8 von einem Detektor (nicht gezeigt) erfasst,
wobei eine eindeutige Zuordnung der detektierten Messsignale 8 zu
den Einzelbereichen A1, A2,
A3, ... vorgenommen wird.
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Der
in den 1a bis c dargestellte Zyklus wird
wiederholt, wobei das Stehwellenmuster bei jeder Wiederholung etwas
weiter geschoben wird. Auf diese Weise lässt sich der gesamte zu erfassende Probenbereich
mit einer Auflösung
im Subdiffraktionsbereich abbilden.
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2 zeigt
schematisch ein Ausführungsbeispiel
eines erfindungsgemäßen Mikroskops
mit einer Stehwelle 9 im Probenbereich P. Gemäß der Darstellung
in 2a werden dazu zwei kohärente Lichtstrahlen 10, 11 mittels
einer Linse 12 in ein Zwischenbild ZB der Eintrittspupille
EP des Objektivs 13 fokussiert. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist einer
der beiden kohärenten
Lichtstrahlen 10 mit einer durchgezogenen Linie und der
andere Lichtstrahl 11 mit einer gestrichelten Linie dargestellt.
Mit anderen Worten ist in dem dargestellten Ausführungsbeispiel die Fokussierung
der kohärenten
Lichtstrahlen 10, 11 so gewählt, dass im Zwischenbild ZB
die Brennpunkte P1',
P2' gebildet sind.
Prinzipiell kann die Fokussierung nicht nur in das Zwischenbild
ZB, sondern auch unmittelbar in das Bild oder in eine beliebige
dazu konjugierte Ebene erfolgen. Über einen Strahlteiler 14 werden
die beiden kohärenten
Lichtstrahlen 10, 11 in den Strahlengang des Mikroskops
eingekoppelt. Über
das Scan-Okular 15 und die Tubuslinse 16 werden
die beiden Strahlen 10, 11 in die Eintrittspupille
EP abgebildet, so dass dort die beiden Brennpunkte P1, P2 entstehen.
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Wie
in 2a angedeutet, kann über den Strahlteiler 14 das
Licht weiterer Lichtquellen eingekoppelt werden, bspw. das Schaltsignal 2 oder
das Testsignal 7. Auch die Messsignale 8 können über den
Strahlteiler 14 zu einem nicht gezeigten Detektor geführt werden.
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Wie
in 2b im Detail dargestellt, hat die beschriebene
Fokussierung der beiden kohärenten Lichtstrahlen 10, 11 in
der Eintrittspupille EP des Objektivs 13 zur Folge, dass
sich im Probenbereich P zwei ebene Wellen 17, 18 ausbilden.
Durch Interferenz der beiden ebenen Wellen 17, 18 bildet
sich in der Fokalebene FE die in 2b dargestellte
Stehwelle 9 mit definierten Intensitäts-Nullstellen aus.
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3 zeigt
schematisch unterschiedliche Polarisationszustände der in die Pupillenebene
PE fokussierten kohärenten
Lichtstrahlen 10, 11 sowie die daraus jeweils
resultierenden Polarisationszustände
der Stehwellen 9 im Probenbereich P. Wie bereits ausgeführt wird
ein Rastern der Probe 1 durch ein Verschieben der Stehwelle 9 senkrecht
zu ihrer Verlaufsrichtung dadurch erreicht, dass die relative Phase
der beiden Lichtstrahlen 10, 11 in den Brennpunkten
P1 und P2 variiert wird. In den 3a und
b ist der Fall linear polarisierten Lichts in y-Richtung dargestellt,
wobei die Punkte P1 und P2 in y-Richtung versetzt sind. 3c und d zeigen den Fall linear polarisierten
Lichts in x-Richtung, wobei die Punkte P1 und P2 in y-Richtung versetzt
sind. Dabei sind jeweils die gleichphasigen Fälle (3a und
c), in denen die Wellenpakete im gleichen Takt schwingen, und die
gegenphasigen Fälle
(3b und d) dargestellt, in denen die
Wellenpakete im Gegentakt schwingen. Die unter schiedlichen Polarisationszustände werden
im Folgenden nur am Beispiel dieser beiden konkreten Phasenlagen
beschrieben. Für
ein kontinuierliches Verschieben der Intensitäts-Nullstellen der Stehwelle 9 in
der Fokusebene FE müssen dagegen
in diskreten Schritten auch weitere Phasenlagen dazwischen generiert
werden.
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Beim
Durchlaufen der kohärenten
Lichtstrahlen 10, 11 durch stark fokussierende
Objektive/Linsen 13 werden die Polarisationsrichtungen
der Lichtwellen gekippt. Dies ist jeweils in den rechten Teilbildern
der 3 dargestellt. Im Falle des in y-Richtung polarisierten
Lichts (3a, b) entstehen Polarisationskomponenten
in z-Richtung. Diese
sind in dem in 3a gezeigten Fall gegenphasig,
d. h. sie interferieren negativ, und es entsteht effektiv kein Licht
mit z-Polarisation. Für
Strahlen, die nicht auf der optischen Achse liegen, entsteht im
Allgemeinen aber bereits hier eine z-Komponente. Das bedeutet, dass die
Intensitäts-Nullstellen
zwar bezüglich
der ursprünglichen
Polarisation (in y-Richtung) eine Nullstelle aufweisen, im Allgemeinen
aber einen endlichen Anteil an z-polarisiertem Licht enthalten.
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Deutlicher
wird dies in dem in 3b dargestellten
Fall. Hier führt
das Kippen der Polarisationsvektoren und die gegenphasige Lage der
kohärenten Lichtstrahlen 10, 11 zu
einer Depolarisation in z-Richtung, wobei die kohärenten Lichtstrahlen 10, 11 in z-Richtung
positiv interferieren und daher eine deutlich ausgeprägte z-Komponente
haben. Diese ist umso stärker,
je größer der
Fokussierwinkel des Objektivs 13 ist. Da die Lichtstrahlen 10, 11 zur
Erzeugung einer Stehwelle 9 mit engen Minima unter möglichst
großem
Winkel abgelenkt werden sollen, ist diese Anordnung unbrauchbar.
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Eine
erfindungsgemäße Anordnung
ist in den 3c und d dargestellt ist.
In diesen Fällen
sind die Brennpunkte P1 und P2 in y-Richtung versetzt, und die Polarisation
ist in x-Richtung gewählt.
Beim Fokussieren – selbst
mittels einer hochnumerischen Optik 13 – findet hier keine Depolarisation
statt, d. h. auch im Fokusraum ist das Licht weiterhin in x-Richtung
polarisiert. Eine Zerstörung
der Intensitäts-Nullstellen
der Stehwelle 9 durch andere Polarisationen findet nicht
statt. Dies gilt für
alle Phasenlagen und damit für
eine beliebige Position der Nullstellen im Fokusraum. Demzufolge
sind die in den 3c und d dargestellten
Verhältnisse
ganz besonders geeignet, als optisches Signal 4 für den gesättigten Übergang
von dem ersten Zustand A in den zweiten Zustand B zu dienen. Entscheidend
ist jedenfalls, dass in der Eintrittspupille EP nur Polarisationsvektoren mit
reiner Tangentialkomponente auftreten und Radialkomponenten, die
stark in z-Richtung depolarisieren, vermieden werden. Die Intensitäts-Nullstellen bleiben
dann in allen Polarisationsrichtungen erhalten, auch wenn das Stehwellenmuster 9 beliebig durch
die Probe 1 gerastert wird.
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Für Lichtstrahlen,
die nicht auf der optischen Achse liegen, sind die Verhältnisse
demgegenüber etwas
komplizierter. In diesen Fällen
treten auch bei reiner Tangential-Polarisation leichte Depolarisationseffekte
auf. Es lässt
sich jedoch durch Rechnungen für
realistische Verhältnisse
zeigen, dass der Anteil des depolarisierten Lichts in derartigen
Fällen
bei einer Anordnung gemäß den 3c und d in der Größenordnung 10–3 bis
10–2 liegt,
was ausreichend gering ist. Im Falle einer Anordnung gemäß der 3a und b liegt demgegenüber insbesondere
der z-Anteil der Polarisation typischerweise in der gleichen Größenordnung
wie die ursprüngliche
Polarisation und ist teilweise sogar größer, wodurch die Nullstellen
vollständig
zerstört
würden.
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4 zeigt
ein Ausführungsbeispiel
mit insgesamt vier Lichtstrahlen, von denen jeweils zwei paarweise
kohärent
sind. Konkret gezeigt ist die Eintrittspupille EP mit den vier Brennpunkten
P1 bis P4. Die Lichtstrahlen 19–22 weisen ausschließlich Polarisationsvektoren
mit Tangentialkomponenten auf, was durch die dargestellten Pfeile
angedeutet ist. Die beiden in x-Richtung versetzten Brennpunkte
P1 und P3, d. h. die Lichtstrahlen 19 und 21,
sind zueinander kohärent
und weisen eine Polarisation in y-Richtung auf. Daraus resultiert
ein 2D-Linienmuster in der Fokalebene FE mit gut erhaltenen Intensitäts-Nullstellen.
Die beiden Lichtstrahlen 20 und 22 mit den Brennpunkten
P2 und P4 sind ebenfalls zueinander kohärent und weisen eine Polarisation
in x-Richtung auf, so dass das resultierende Linienmuster um 90° gedreht
und in x-Richtung polarisiert ist. Dementsprechend interferieren
die beiden resultierenden Linienmuster nicht miteinander, vielmehr
kommt es zu einer einfachen Addition der Intensitätswerte.
Das Resultat ist dementsprechend ein zweidimensionales Gittermuster
mit periodisch auftretenden Intensitäts-Nullstellen. Diese können im
Rahmen eines Probenscanns in x-Richtung verschoben werden, indem die
relativen Phasen der kohärenten
Lichtstrahlen 19, 21 mit den Brennpunkten P1 und
P3 variiert werden. Eine Verschiebung der Nullstellen in y-Richtung ist
durch Variation der relativen Phase der kohärenten Lichtstrahlen 20, 22 mit
den Brennpunkten P2 und P4 möglich.
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Hinsichtlich
weiter vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens
und des erfindungsgemäßen Mikroskops
wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der
Beschreibung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.
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Schließlich sei
ausdrücklich
darauf hingewiesen, dass die voranstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele
lediglich zur Erörterung
der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele
einschränken.