CN106030287B - 用于确定物质的单个分子在试样中的地点的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

为了确定物质的单个分子在试样中的地点(xM)，其中，所述物质的所述单个分子处于荧光状态下，在所述荧光状态下，能够用激励光激励所述单个分子发射荧光，其中，所述物质的所述单个分子在试样的目标区域中的间距遵循一最小值d＝λ/(2nsinα√(1+I/IS))，用所述激励光激励所述物质的单个分子发射荧光，其中，所述激励光的强度分布具有至少一个零部位。针对所述激励光的强度分布的至少一个零部位在所述试样的目标区域中的不同位置(xN)记录所述物质的被激励的单个分子的荧光。在此，所述激励光的强度分布的至少一个零部位的最邻近的位置(xN)之间的间距不大于所述最小值d的一半，在所述至少一个零部位的最邻近的位置上记录所述物质的被激励的单个分子的荧光。然后，由各分子的荧光强度(I)关于所述激励光的强度分布的所述至少一个零部位在所述试样的目标区域中的位置(xN)的变化曲线推导出所述物质的单个分子的地点(xM)。

Description

用于确定物质的单个分子在试样中的地点的方法和设备
技术领域
本发明涉及用于确定物质的单个分子在试样中的地点的方法和用于执行该方法的设备。所述方法和所述设备尤其使用于此目的：以高的位置分辨率成像所述物质的分子在试样中的分布和所述试样的以该物质标记的结构。
通常，本发明属于荧光显微镜的领域。这意味着，通过充分利用物质分子的荧光特性来确定其在试样中的地点。
当在这里谈到分子的荧光状态时，这意味着，能够用激励光激励分子发射荧光，但不意味着，分子已经处于被激励的、发荧光的状态。
当在这里谈到非荧光状态时，这相应地意味着，不能够用激励光激励分子发射荧光，并且也不同于荧光化，即发射荧光。在此，仅仅意味着，分子在非荧光状态下不发射被记录到的荧光，当荧光被记录时，分子在荧光化状态下能够被激励用于该荧光的发射。因此，非荧光状态下的分子能够例如能够被激励发射其它色彩、即波长的荧光，所述荧光能够区别于在荧光状态下能够被激励发射的荧光。具体地，分子可以是在荧光状态下能够被激励发射绿色的荧光并且在非荧光化状态下能够被激励发射红色的荧光。在这里，分子的非荧光化的状态也被称作暗状态，在所述非荧光化的状态下，总的来说，不能够激励分子发射荧光。
背景技术
为了确定发射荧光的分子在试样中的地点，存在两种基本的处理方法。在第一种处理方法中，由用光传感器阵列所记录的荧光的空间分布确定地点。在第二种处理方法中，分子的地点等同于用于发射荧光的、在空间上受限的激励的位置，在所述位置上，分子的荧光被记录。
在第一种处理方法中，由所述物质发射的荧光用光传感器阵列记录，通过镜头使试样成像到所述光传感器阵列上，在该第一种处理方法中，在物质分子在试样中的分布的成像或者试样的由此被标记的结构的成像中可达到的空间准确性通常由所谓的阿贝(Abbesche)衍射极限限制。因此，由被记录在光传感器阵列的确定位置上的单个光子能够仅具有数量级λ/2nsinα的地点不精确度(Ortunschaerfe)地推断出发射光子的分子在试样中的确定地点，其中，λ为荧光的波长，n为试样和镜头之间的光学材料的折射系数，并且α为镜头的半打开角度。
然而，当被记录在光传感器阵列上的荧光能够配属于试样中的单个荧光分子时，如果分子发射较大数量的光子，则能够以超过衍射极限的准确度确定分子的地点。为此，确定光传感器阵列的位置分布的重心，单个光子在所述位置上被记录到，并且由此推导出进行发射的分子的地点。在这种被称作局部化的方法中所实现的准确度以增加，其中，n为被分子所发射并且用光传感器阵列所记录的光子的数量。
当分子发射具有经调整的空间分布的荧光时，这在由荧光在光传感器阵列上的强度分布确定分子地点时通过地点缺陷(Ortsfehlers)形式的局部化发生作用。这种地点缺陷取决于分子在试样中的定向。例如，在这样的分子中出现所发射的荧光的被调整的分布，所述分子的旋转扩散时间比其在被激励状态下的停留持续时间长，从被激励的状态出来，所述分子发射荧光。(见Engelhardt,J.et al.,Molecular orientation affectsLocalization accuracy in supperresolution far-field fluorescence microscopy,Nano Lett.2011Jan 12；11(1):209-13)。
从WO 2006/127692 A2已知，用物质分子标记试样中的目标结构，所述分子处于非荧光的初始状态下，但是能够通过调节光转化到荧光状态下。因此，能够用调节光将较小份额的分子带至荧光状态下，在所述较小份额情况下，荧光状态下的最邻近分子具有大于衍射极限的间距。在接着用激励光加载时，只有处于荧光状态下的分子发射荧光。因此，荧光状态下的单个分子的荧光能够被分开记录；并且，尽管物质分子的绝对浓度高，能够通过局部化以超过衍射极限的准确度确定单个分子的地点。物质分子的分布的成像由此逐步地实现，即，重复这些步骤：调节荧光状态下的分子的小份额、激励这些分子发射荧光和用光传感器阵列记录荧光，并且，与此同时在统计上有条件地对物质的所有其它分子执行这些步骤。
WO 2006/127692 A2也说明，将部分量的物质分子激活到荧光状态下能够转用到其它的光学成像方法。在此，能够通过激励光的具有由极小值限界的极大值的强度分布来激励特别是在试样的确定平面内或者其它空间子单元中的物质分子发射荧光。
为了以超过衍射极限的准确度确定物质的每个分子的地点，从WO 2006/127692A2已知的方法需要分子的随着所想要的空间准确度上升的数量的光子。此外，所述方法对分子提出高的要求，由此能够将所述分子小份额地转到荧光状态下，其中，处于荧光状态下的分子具有大于衍射极限的间距。典型地，所述分子涉及可在两种位形状态(Konformationszustaenden)之间转化的蛋白质，在这两种位形状态中只有一种是荧光的，或者所述分子涉及光致变色的荧光团。
从WO 2006/127692 A2已知的方法也被称作PAIM，即被称作光激活的局部化显微镜。非常类似的、被称作STORM(Stochastische Optische Rekonstruktionsmikroskopie，随机光学重建显微镜)的方法具有基本上相同的优点和缺点。
从US 8,174,692 B2已知，通常的染料也能够作为物质使用，以便通过局部化确定物质的单个分子的地点，所述染料不可接通(einschaltbar)而是具有荧光的初始状态，并且也不能够在两种位形状态之间转化，在这两种位形状态中只有一种是荧光的。在此，用激励光以这样高的强度加载试样，使得在当前处于其荧光状态下的分子之间产生衍射极限以上的间距，所述激励光使物质的分子同时以一定的跃迁可能性转化为相对长寿命的电子暗状态。
以激励光激励分别处于荧光状态下的分子发射荧光，所述荧光用光传感器阵列位置分辨地记录。以此方式使物质的按顺序的不同分子局部化，因为已经被记录其光子的分子达到暗状态，其它分子从所述暗状态以一定的跃迁可能性返回到荧光状态。这种已知的方法能够连续地执行，即，在用激励光的使物质基本上保持在其暗状态下并且仅激励个别分子发射荧光的高强度加载试样期间能够从光传感器阵列读出连续的帧。
从US 8,174,692 B2已知的方法也被称作GSDIM(Ground State DepletionIndividual Molecule Return Microscopy，基态耗尽的单分子返回显微镜)。
仅仅在横向于镜头光轴的x方向和y方向上但不在镜头光轴的z方向上实现在通过局部化确定单个荧光分子的地点时的高准确度，通过所述镜头使相应的试样成像到光传感器阵列上。然而，从Aquino,D.et al.,Two-color nanoscopy of three-dimensionalvolumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores,NatureMeth.8,353-359(2011)已知，在PAIM方法、STORM方法或者GSDIM方法中，通过4Pi方法用在光轴的z方向上相互反向的镜头通过具有x-y测量面的扫描能够确定单个荧光分子的地点。
当发射荧光的分子的地点等同于其空间受限的、用于发射荧光的激励的位置时，其中，通过其空间受限的激励的地点探测或扫描相应的试样，则这被称作格栅荧光显微镜。通常，在这里在激励光波长情况下的阿贝衍射极限也适用于在所述格栅荧光显微镜中实现的空间准确度。但是，已知不同的方法，通过所述方法，格栅荧光显微镜中的准确度能够通过减小物质分子被激励发射荧光的有效空间区域来提高到超过衍射极限。
在格栅荧光显微镜中，某些光子的记录足以识别，物质的发射荧光的分子存在于当前的激励区域内。被记录的光子的数量仅仅被使用于确定物质分子在当前的激励区域内的局部浓度。
在STED(Stimulated Emission Depletion，受激发射损耗)荧光显微镜中，在目标测量点的周围通过被调整的发射又消除物质分子的用激励光引起的激励，试样的结构用所述分子标记。经调整的发射被STED光刺激并且防止分子发射荧光，从而荧光仅还能够来自于这样的区域，在所述区域中激励未被清除。激励未被清除的区域能够保持非常小，其方式是，该区域由STED光的强度分布的零部位定义，并且将STED光的绝对强度选择得高，从而所述STED光已经非常靠近零部位地完全清除分子的激励。
取代使之前所引起的、试样的部分中的分子激励又平静，也能够使用具有零部位的强度分布的光用于，通过位形改变将零部位之外的物质分子转化到非荧光状态下，如这在RESOLFT荧光显微镜中发生的，或者转到电子暗状态下，如在GSD(Ground StateDepletion，基态耗损)荧光显微镜中是这种情况。
从DE 10 2005 034 443 A1已知GSD方法，在该GSD方法中仅仅用一种波长的光工作。这种光主要激励试样中的物质分子发射荧光，直到所确定的强度。在该强度之上，光将物质的分子基本上完全转化到暗状态。将光以一强度分布施加到试样上，该强度分布具有处于所说明的强度以下的局部极小值，由此，物质的分子被有效地激励发射荧光的区域在空间上被限制。
从WO 2012/171999 A1已知一种方法，在该方法中，通过用激励光束快速地扫描试样，在多个先后相继的扫描过程中每一个中仅记录来自单个分子的荧光，所述激励光束被STED光的在激励光束的焦点上具有极小值的强度分布包围。分子的地点等同于激励光束的焦点的所属的位置，来自所述分子的荧光被记录。
从DE 10 2011 055 367 A1已知一种用于追踪单个荧光分子的方法。通过激励光促使分子发射荧光，并且荧光被记录。在此，激励光以具有局部极小值的强度分布对准试样，并且所述极小值跟踪在试样中运动的分子。为此目的，激励光的强度分布这样相对于试样移动，使得由颗粒发射的荧光强度保持最小。实际上，由颗粒发射的荧光强度涉及一比率，以该比率由各分子从激励光的强度分布的极小值发射单个光子。极小值能够涉及激励光的强度分布的零部位。
从DE 10 2010 028 138 A1已知一种用于通过用测量前部扫描来确定物质在测量区域中的分布的方法。测量前部的深度小于光学信号波长情况下的衍射极限，在测量前部的深度上，光学信号的强度这样增加，使得在测量状态下的物质份额首先从不存在起增加并且然后又下降到不存在。所述测量前部在测量区域上向相对于光学信号强度增大的反方向移动。所述测量信号至少从测量前部的区域中被检测到并且对应于在测量前部在测量区域中的相应的位置。
在所谓的SSIM(Saturated Structured Illumination Microscopy,见Gustafsson,M.G.I.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102,13081-13086(2005))中，以激励光的强度分布沿不同方向扫描试样，所述强度分布具有线状的零部位并且在零部位之外具有这样高的强度，使得达到试样中的荧光物质的被激励的分子的荧光强度的饱和。在扫描期间所记录的来自试样的荧光由于荧光物质的分布位于零部位的区域中的、对荧光无贡献的分子而改变。根据这样的空间频率来分析评估这种荧光，所述空间频率在扫描时出现在不同的方向上并且然后由所述空间频率重建荧光分子在试样中的分布的成像。
SSIM不使用荧光分子在试样中的分布，在所述分布中，分子的平均间距大于在激励光或者荧光的波长情况下的衍射极限。能够仅仅用荧光分子执行SSIM，所述荧光分子能够被激励到从其所获得的荧光强度饱和，而不因此被转化到暗状态。所获得的仅是荧光物质的分子在试样中的分布的间接成像。不确定单个荧光分子在试样中的地点。
发明内容
本发明以此任务为基础：阐明用于确定物质的单个分子在试样中的地点的方法和设备，借助于它们能够通过分析评估单个分子的荧光获得物质中的分子在试样中的分布在空间上高分辨的成像，其中，除了确定单个分子的地点之外还能够通过局部化使用所述荧光。
本发明的任务通过根据独立权利要求1所述的方法和根据并列权利要求23所述的设备解决。所述方法和所述设备的有利的实施方式在从属权利要求中定义。
本发明提供了一种用于确定物质的单个分子在试样中的地点的方法，其中，物质的单个分子处于荧光状态下，在所述荧光状态下，能够用激励光激励所述分子发射荧光，并且，其中，试样的目标区域中的物质的单个分子之间的间距遵循最小值。
所述方法具有已经从WO 2006/127692 A1已知的、用激励光激励物质的单个分子发射荧光的步骤，其中，激励光的强度分布具有至少一个局部极小值，并且，所述方法还具有针对至少一个极小值在试样的目标区域中的不同位置记录物质的被激励的单个分子的荧光的步骤。
根据本发明，试样的目标区域中的物质的单个分子的间距的最小值为其中，λ为激励光的波长，n为光学材料的折射系数(Brechungsindex)，在所述光学材料中构造有至少一个极小值，α为光学组件的半打开角度，通过该光学组件使激励光对准试样，I为激励光在试样中的最大强度且Is为激励光的与物质有关的荧光激励饱和强度。在荧光激励饱和强度为Is的情况下，达到物质分子荧光在理论上可能的强度的确定百分比，从该百分比起，也涉及荧光强度的饱和。典型地，该百分比为荧光在理论上可能的强度的50％。最小值d相当于空间成像时的准确度，如在高分辨的STED、GSD和RESOIFT格栅荧光显微镜中实现所述准确度。
如所实现的，非无条件地有意义的是，在试样的目标区域中，物质的处于荧光状态下的单个分子之间的间距遵循最小值d。也非必需的是，荧光状态下的所有物质分子以其间距遵循最小值。然而，不能够通过在这里所说明的方法确定在更小的间距情况下的荧光分子的地点。
根据本发明，单个分子在激励光强度分布的局部极小值地点上的荧光强度最大如在激励光在试样中的最大强度的地点上的一半大。不言而喻地，较大的强度对比、也就是说更显著的局部极小值是有利的，在所述局部极小值上，单个分子的荧光强度降低到单个分子的荧光的最大强度的较小份额。因此，单个分子的荧光强度例如能够降低至少80％到最大强度的最高20％或者降低至少90％到最大强度的最高10％。理想地，单个分子在局部极小值上的荧光强度降低到零，即涉及激励光的强度分布的零部位。
根据本发明，所述至少一个极小值的最邻近位置之间的间距不大于最小值d的一半，在所述最邻近的位置上记录试样的被激励的单个分子的荧光。然后，根据本发明，物质的单个分子的地点由各分子的荧光强度关于所述至少一个极小值在试样的目标区域中的位置的变化曲线推导出。
当荧光分子到达极小值的区域中时，用于使分子发射荧光的激励和相应地由分子所发射和因此被记录的荧光的强度降低。因为在根据本发明的方法中考虑单个荧光分子，荧光能够从所述单个荧光分子被分别记录并且相应地被分析评估，则允许由所记录的荧光的强度根据极小值的位置的变化曲线以提高的空间准确度确定各荧光分子在试样中的地点。
当试样中单个分子的以上所定义的最小间距比激励光波长λ情况下和同时在荧光波长情况下的衍射极限λ/2n sinα小得多时，这也适用，因为激励光在试样中的最大强度I比荧光激励饱和强度Is大得多。此时，从试样记录的荧光也能够配属于至少一小组单个分子，并且，当所述分子中的一个分别到达激励光的强度的局部极小值的区域中时，荧光强度降低至一个显著的份额。在遵循试样中单个分子的最小间距d的情况下，这种下降对应于恰好一个单个分子。
极小值位置的最大为d/2的小间距负责，检测到该下降并在空间上分辨该下降的变化曲线，针对所述极小值位置记录所述荧光。即，在根据本发明的方法中，用激励光的强度分布的局部极小值以最大为d/2的步幅扫描试样的目标区域。
通过光学组件使激励光对准试样，所述光学组件能够是镜头，但是也能够涉及其它的光学组件，通过所述其它光学组件使激励光的两束子射束成一角度交叠，以便通过干涉构造至少一个极小值。然后，α为所述子射束之间的半角或者子射束中的每一个和光轴之间的角度。当直接在试样中构造极小值时，n能够是试样的折射系数，或者，当在邻近试样的材料中构造极小值时，n能够是该材料的折射系数。例如当使用类似于在TIRFM(TotalInternal Reflection Fluorescence Microscopy，全内反射荧光显微镜)中的光学组件用于构造极小值时，是这种情况。
因为单个分子的地点的确定仅仅基于各分子的在极小值的每个位置上所确定的荧光强度，而不考虑荧光从分子发射的准确方向，根据本发明的方法属于格栅荧光显微镜；且单个分子的地点的确定取决于分子的定向。
具体地，为了从荧光强度的变化曲线推导出物质的单个分子的地点，能够针对各分子的荧光强度关于至少一个极小值的位置的变化曲线拟合出一个具有局部极小值的函数。然后，各分子的地点能够等同于所拟合的函数的局部极小值的位置。所述函数能够是二次函数。但是，所拟合的函数的基本形式也能够单独地与各物质的分子的荧光强度的变化曲线相匹配，作为对激励光在至少一个极小值周围的强度变化曲线的回应。
也在本发明的框架下的是，各分子的地点等同于至少一个极小值的位置，所述位置由此突出：与在极小值的在不同方向上最邻近的位置上相比，从各分子记录到较少的荧光。当极小值或者说围绕极小值的、弱激励的区域碰上各分子时，对于极小值的这些位置而言，只记录分子的荧光的极小强度，在所述弱激励的区域中激励各分子仅发射具有极小强度的荧光。因为这原则上也能够具有其它的原因，但是，仅仅当在极小值的在不同方向上最邻近的位置上记录到比极小强度多的荧光时，极小值的位置能够等同于分子的地点，在所述极小值的位置上，只有各分子的荧光的极小强度被记录。如果满足这些条件，各分子在试样中的地点能够以围绕极小值的、弱激励的区域的尺寸的空间准确度来确定。
当极小强度为零或者几乎为零时，对于这种地点确定的方式仅仅需要各分子的荧光的非常少的光子，即仅仅极小值位置上的非常少的光子，在所述位置上，荧光的极小强度被记录，并且，分别只需要少量的光子较多地在极小值的在不同方向上最邻近的位置上，直到明确：荧光强度在那里超过极小强度。由此能够使极小值快速地在其单个位置之间移动。在极小强度为零的情况下，足以确定荧光是否来自各分子。为此，仅仅必须在相应的位置上等待如获得各分子的荧光的至少多个光子最大应持续的时间这样长的时间。通常，仅仅当局部极小值为激励光的强度分布的零部位时，在围绕局部极小值的、弱激励的区域中实现为零的极小强度。
如果要充分利用围绕极小值的、弱激励的区域用于确定单个分子的地点，必须确保，用弱激励的区域击中每个单个分子。这在至少一个极小值的最邻近位置之间的间距、即步幅不大于弱激励的区域的直径时实现，从而用弱激励的区域完全扫描试样的目标区域，在所述最邻近位置上，物质的被激励的单个分子的荧光被记录，以所述步幅扫描试样的目标区域。
当这样高地调节激励光的邻近于至少一个极小值的强度，使得达到由以激励光激励的单个分子所发射的荧光强度的饱和，在围绕极小值的、弱激励的区域和位于其周围的区域也在空间上强烈地被缩小，在所述弱激励的区域中，激励各分子仅发射具有极小强度的荧光，在所述周围的区域中，各分子的荧光强度取决于其到极小值的距离。这与根据本发明方法的位置准确度的提高有相同意义。虽然仅仅当极小值在试样中的位置(在所述位置上确定单个分子的荧光强度)具有相应的小间距时，这能够是有用的。但是，这也通过至少一个极小值的最邻近位置之间最大为d/2的间距来确保，在所述最邻近位置上，物质的被激励的单个分子的荧光被记录。
在试样的目标区域中，荧光状态下的单个分子的平均间距大于激励光和荧光波长情况下的衍射极限，所述荧光状态下的单个分子尤其能够由此实现：物质分子可通过调节信号从其荧光状态转化到非荧光状态或者从非荧光状态转化到其荧光状态，其中，所述状态之间(直到达到饱和为止)跃迁可能性随着调节信号的强度上升。那么，在试样的目标区域中的分子密度这样高使得物质的最相邻分子之间的间距小于最小值d的情况下，通过调节信号，分别只能有分子的一部分保持荧光状态或者说转化到荧光状态。物质分子的这部分能够借助于调节信号的强度这样调节，使得荧光状态下的物质的单个分子之间的间距遵循最小值d。因为物质的哪些分子分别属于处于荧光状态的那部分与跃迁可能性有关，那么能够先后相继地确定物质的不同分子在试样中的地点。
通过已经被确定地点的分子能够不同地处理。所述分子基本上能够持久地退色(weggebleicht)。分子也能够在反馈信号发生作用的情况下和/或自发地、即仅仅通过热激励返回到其最初的非荧光状态下或者通过调节光使大多数其它分子转化到其非荧光状态。然后，能够通过调节信号和必要时反馈信号针对荧光状态下的其它的单个分子分别重复地或者继续地将最近的邻居之间的间距调到最小值d。在此，如果分别确定了荧光状态下的单个分子的地点，则按顺序地获得物质分子在试样中的分布的成像。
在先后相继地求取物质的不同份额的位置时，能够用调节信号和必要时用反馈信号连续地或者间歇地加载试样。对试样的荧光的记录也能够连续地或者间歇地进行。但是，在每种情况下，针对激励光的极小值在试样中的每个位置分开地进行所述记录。但是，这不排除，极小值在试样中的位置连续地移动，如果在荧光被记录的时间段期间极小值仅仅少量地、无论如何不远于d/4地运动的话。
原则上，调节信号能够是某个化学的或物理的信号，通过所述调节信号能够使物质分子在其荧光状态和其非荧光状态之间转化，以便调节荧光状态下的分子的份额，在该荧光状态下，最近的邻居之间的间距遵循最小值。调节信号优选为调节光。
具体地，通过调节光能够将物质分子从其荧光状态转化到其非荧光状态，其中，物质分子的非荧光状态能够是电子能量状态。在后一种情况下，典型地，调节光也激励物质的荧光分子发射荧光，并且所述荧光分子发射数个荧光光子之后才转化到非荧光状态。由此，调节光能够同时为在根据本发明的方法中所使用的激励光，从而仅须使用具有一种波长的光。
如果根据本发明方法的最后说明的实施方式区别于作为GSDIM已知的现有技术，则如GSDIM中一致地涉及用于确定物质的单个分子在试样中的地点的方法，以获得物质分子在试样中的分布的在空间上高分辨的成像，其中，物质分子一开始具有荧光状态，其中，物质分子在其荧光状态下能够被激励光激励发射荧光，其中，物质分子能够通过激励光从其荧光状态转化到非荧光的暗状态，其中，物质的分子从其非荧光状态返回到其荧光状态，并且，其中，试样中的物质分子之间的间距小于最小值。
也还与GSDIM一致地，根据本发明的方法的这种实施方式具有步骤：用激励光将物质分子的这样的份额调节到荧光状态，使得当前处于荧光状态下的物质的分子之间的间距在试样的目标区域中遵循最小值；和记录物质的用激励光所激励的、荧光状态下的分子的荧光。
根据本发明涉及，试样的目标区域中的物质的单个分子的间距的最小值激励光的强度分布具有至少一个局部极小值，其中，单个分子在激励光的强度分布的局部极小值的地点上的荧光强度最大如在激励光在试样中的最大强度的地点上一半大。改变至少一个局部极小值在试样的目标区域中的位置。针对至少一个局部极小值在试样中的不同位置，针对围绕所述至少一个局部极小值的记录区域，能够与从试样的其它的区域所发射的荧光分开地记录用激励光所激励的、荧光状态下的物质分子的荧光。在此，至少一个局部极小值的最邻近位置之间的间距不大于最小值d的一半，在所述最邻近位置上，物质的被激励的单个分子的荧光被记录。即，以步距方式用至少一个局部极小值扫描试样的目标区域，所述步距不大于d/2。
然后，物质的单个分子的地点由来自记录区域的荧光强度关于至少一个局部极小值在试样的目标区域中的位置的变化曲线推导出。这种由荧光强度的变化曲线对单个分子的地点的推导能够正如同以上已经示例性地解释地进行。激励光的强度的和至少一个局部极小值的最邻近位置之间的间距的调节也能够如以上所陈述地进行。
至少一个局部极小值尤其能够涉及点状的极小值，所述极小值在试样的目标区域内的位置在试样的所有延伸方向上改变，即在二维的试样中在两个方向上改变，和在三维的试样中在三个方向上改变。在点状的极小值的情况下，能够由各分子的荧光强度关于至少一个局部极小值在试样的目标区域中的位置的变化曲线推导出物质的单个分子的在试样的所有延伸方向上的地点。不言而喻地，在此以有意义的方式考虑荧光强度关于极小值在所有延伸方向上的位置的变化曲线。相应地，在二维或者三维的试样中，针对荧光强度的变化曲线拟合出具有极小值的二维或者三维函数。
在点状的极小值的情况下，能够通过相对于各极小值共焦地布置的点探测器记录来自包围至少一个极小值的记录区域的荧光。在此，记录区域应具有极小值位置的间距的多倍、优选至少三倍的尺寸并且与极小值同中心地布置。
所述至少一个极小值也能够沿着线或者平面延伸。然后，极小值在试样的目标区域中的位置在横向于线或者平面的扫描方向上改变。在此，物质的单个分子的地点分别在所述扫描方向上由各分子的荧光强度关于至少一个局部极小值的位置的变化曲线推导出。为了确定单个分子在另外的方向上的位置，所述线或平面相对于试样能够不同地定向并且在相应不同的扫描方向上移动。但是，原则上，也能够以其它的方式如例如通过局部化来确定单个分子在另外的方向上的位置。
激励光的强度分布能够具有不仅仅一个而是多个局部极小值。然后，在试样的目标区域中共同地改变所述多个极小值的位置，其中，针对每一个极小值分开地记录物质的被激励的单个分子的荧光。所述极小值尤其能够以格栅形式布置。在点状的极小值的情况下，格栅能够是二维或三维的。无论如何，多个极小值之间的间距必须大于在荧光的波长情况下的衍射极限。所述间距也可选择得大于可能的记录区域，从所述记录区域针对每个极小值处记录荧光。此外，优选，极小值之间的间距比在这样的位置的间距大多倍，单个极小值在所述试样中布置在所述位置上，以便测量荧光的所属的强度。优选，极小值的间距如极小值在试样中的、荧光被测量的位置的间距至少三倍这样大。
试样中的单个荧光分子的荧光能够通过相对于试样静止的光传感器阵列记录，试样成像到所述光传感器阵列上，即通过数字摄像机例如CCD或者CMOS摄像机成像。此外，如果试样的目标区域中的物质的单个分子的间距大于在荧光的波长情况下的衍射极限，则附加地能够由从各分子总共——即与极小值的位置无关地——所记录的荧光在光传感器阵列上的分布通过局部化确定物质的单个分子的地点。因此，荧光的相同光子——已通过所述光子根据极小值在试样中的位置确定了分子的地点——在充分利用它们在光传感器阵列上的分布的情况下被用于分子的第二地点确定，其中，所述极小值和其在试样中的移动是无关紧要的。地点确定的两种方法的结果能够被组合用于提高整体准确度。
如果试样的目标区域中的物质的单个分子的单个间距小于在荧光的波长情况下的衍射极限，从而荧光能够不完全分开地对应于各分子，则这些分子的地点能够通过较复杂的局部化算法确定。在这些算法中，按照根据本发明的方法所求取的地点能够作为初始值引入。
当按照根据本发明的方法和通过局部化确定用于单个分子的不同地点时，就单个分子在试样中的固定定向而言能够分析评估所述不同地点。这基于，根据从分子记录的荧光在光传感器阵列上的分布对物质分子在试样中的位置的确定取决于分子的固定定向，但是借助于移动的极小值的地点确定不取决于分子的固定定向。
因此，能够执行根据本发明的方法作为对已知的方法如PALM、STORM、GSDIM或者诸如此类的补充，而不干扰已知的方法，但是便于以其它方式获得对单个分子的附加的位置信息，即使分析评估所记录的相同的光子。
当用光传感器阵列记录荧光时，连续的帧能够从光传感器阵列被读出并且对应于至少一个极小值在试样中的相应位置。但是，在此，极小值的一个位置而不是多个位置的多个帧能够对应于一个帧。但是，这不排除，当借此引入的“运动不准确度”保持得小时，至少一个极小值连续地在试样中移动。
特别地适合用于执行根据本发明的方法的优选实施方式的、根据本发明的设备具有发出激励光的激励光源，通过所述激励光源能够激励处于荧光状态下的物质分子发射荧光，并且通过所述激励光源能够使物质分子从其荧光状态转化到非荧光状态。此外，存在光学组件，所述光学组件使激励光对准试样。探测器装置记录荧光，所述荧光由物质的用激励光激励的、荧光状态下的分子发射。根据本发明，光成形光学装置形成激励光在试样中的强度分布，所述强度分布具有至少一个局部极小值，其中，单个分子的荧光强度在激励光的强度分布的局部极小值的地点上最大与在激励光在试样中的最大强度的地点上的一半同样大。此外，设置格栅装置，激励光的至少一个极小值能够通过所述格栅装置定位在试样中的不同位置上。探测器装置能够将由被衍射限制的、包围至少一个极小值的格栅区域所发射的荧光与由试样的其它区域所发射的荧光分开地记录。在此，至少一个极小值的最邻近位置之间的间距不大于在所述最邻近位置上，探测器装置记录来自格栅区域的荧光。即，扫描装置按步距扫描试样的目标区域，所述步距不大于最小值d的一半。
优选，光成形光学装置使具有局部极小值的格栅的激励光对准试样，并且格栅装置使强度分布这样相对于试样移动，使得用围绕极小值的、弱激励的区域完全扫描试样的目标区域，在所述弱激励的区域之内，物质不被激励发射荧光。在Chmyrov,A.et al:Nanoscopy with more than 100,000‘doughnuts’,Nature methods 10 737-740(2013)中说明，能够怎样实现零部位的格栅。
为了限制至少一个局部极小值和在三维试样情况下在光轴的z方向上的局部极小值，能够使用4Pi方法。在此，能够采取与Schmidt,R.et al.:Spherical nanosized focalspot unravels the interior of cells,Nature Meth.5,539-544(2008)中相同的、用于形成STED光在z方向上的强度分布的措施来形成相同方向上的极小值。如果激励光的相干的子射束通过相互反向的两个镜头对准到试样中并且在那里产生干涉，则也能够在试样中构造由局部极小值组成的三维格栅。
优选，探测器装置具有相对于试样静止的图像传感器阵列，试样成像到所述图像传感器阵列上。这能够通过CCD或者CMOS摄像机实现。
从权利要求、说明书和附图得出本发明的有利拓展方案。在说明书中所提到的特征和多个特征的组合的优点仅仅是示例性的并且能够替代地或者累积地发生作用，而所述优点不必强制性地被根据本发明的实施方式实现。在不由此改变所附的权利要求的主题的情况下，就原始的申请材料和专利的公开内容而言，以下适用：从附图——尤其所示出的几何形状和多个构件相对于彼此的相对尺寸以及它们的相对的布置和作用连接中提取出另外的特征。本发明的不同的实施方式的特征和不同的权利要求的特征的组合也能够不同于所选择的权利要求的引用关系并且以此建议。这也涉及在分开的附图中所示出或者在其说明书中所提到的这样的特征。这些特征也能够与不同的权利要求的特征组合。也能够取消在权利要求中所列举的、用于本发明的另外的实施方式的特征。
就其数量而言，在权利要求和说明书中所提到的特征可这样理解：存在恰好这个数量或者大于所提到的数量的数量，而不需要明确地使用副词“至少”。即，当例如讨论元件时，这可这样理解：恰好一个元件、两个元件或者多个元件。所述特征能够通过其它的特征补充或者是唯一的特征，相应的产品由所述特征组成。
包含在权利要求中的参考标记不是对由权利要求所保护的主题的范围的限制。它们仅仅有助于使权利要求更容易理解的目的。
附图说明
以下参照在附图中所示出的优选实施例进一步解释和说明本发明。
图1示出试样的目标区域，其具有多个布置在该区域中的物质分子，用所述分子标记试样中的目标结构，其中，仅个别物质分子处于荧光状态中。
图2针对试样的目标区域示出用激励光的强度分布的局部极小值来扫描，其中，示出试样中的单个荧光分子。
图3荧光强度图，该荧光由根据图2的单个荧光分子在极小值的不同位置上所记录。
图4用根据图2的极小值扫描试样时在激励光强度显著更高的情况下一个单个荧光分子的荧光强度图。
图5用根据图2的极小值扫描试样时在根据图4的激励光的强度高的情况下两个单个荧光分子的荧光强度图。
图6荧光分子的通过光传感器阵列总共记录的荧光在光传感器阵列上的分布的截面。
图7画出试样的目标区域的具有两个不同方向中的线状零部位的扫描的草图。
图8画出试样的目标区域的具有点状零部位的格栅的扫描的草图。
图9根据本发明的方法的实施方式的流程图。
图10根据本发明的方法的其它的实施方式的流程图；和
图11画出根据本发明的设备的草图。
具体实施方式
在图1中示出试样2的目标区域1，在所述目标区域中用物质的分子4标记结构3，所述物质具有荧光状态和非荧光状态。在考虑所有分子4时，即与它们的状态无关，这些分子与其最近的相邻分子的间距非常小，所述间距比在如下所述荧光的波长情况下的衍射极限小得多：所述荧光能够在所述分子在其荧光状态中以激励光激励时由分子4获得。所述间距也小于最小值其中，λ为激励光的波长，n为光学材料的折射系数，在所述光学材料中构造有至少一个极小值，α为用于使激励光对准试样的光学装置的半打开角度，I为激励光在试样2中的最大强度，并且Is为激励光的与物质有关的荧光激励饱和强度。该最小值d相应于空间成像时的准确度，如所述准确度在高分辨的STED格栅荧光显微镜、GSD格栅荧光显微镜和RESOLFT格栅荧光显微镜中实现。
然而，只有分别用“x”标记的单个分子5处于荧光状态中，而在这里仅由点描述的其它分子处于非荧光状态中并且因此未受激励光促使发射荧光。各个荧光分子5在目标区域1中具有间距，所述间距遵循最小值d并且优选也遵循荧光波长情况下的衍射极限。后者能够实现，分开地、即分别与所确定的单个分子5相对应地记录由单个分子5发射的荧光。能够以不同的方式将相应的小份额的分子4调节到荧光状态5下，如所述方式通常来自通过关键字PAIM、STORM和GSDIM已知的方法。
图2说明，如何用激励光23来加载并且在此用激励光的强度分布的局部极小值6按由箭头标出的步距来扫描试样2的分别目标区域1。在此，这些步距和极小值6在试样2中的最邻近位置的所得间距7不大于在激励光波长情况下和单个分子5的用该激励光所激励的荧光波长情况下的半衍射极限。在这里，在图2中，仅由“x”描述这些单个分子中的唯一一个。在围绕极小值6的区域8中，各个单个分子5的荧光强度与单个分子到极小值6的间距有关。在这里，区域8之外的荧光强度能够饱和。这意味着，激励光23的强度在区域8之外这样大，使得获得单个分子5的最大荧光强度。
图3示出单个分子5的荧光强度IF，用根据图2的点状极小值6遍历所述单个分子，其中，分子5虽然根据图2被准确地遍历，但是在此不是准确地与极小值6的位置xN中的一个相遇，在所述位置上测量荧光强度IF。在此，在图3中分别用“x”描绘在极小值6在试样2中不同的位置xN上被记录的荧光强度IF。在这里，极小值6涉及激励光23的强度的零部位并相应也涉及荧光强度IF的零部位。极小值上的荧光强度IF至少降低为区域8之外的荧光强度IF的50％。如果针对在位置xN上所记录的强度IF的改变拟合一具有局部极小值的函数9，则能够由极小值的位置推导出分子在试样中的地点xM，并且这具有比位置xN的间距高的空间准确度。位置xN的间距不大于、在这里甚至小于最小值d的一半。最小值d相当于强度IF的被极小值6影响的变化曲线的半值宽度。
具有局部极小值的函数9能够适应于在用根据图2的极小值6遍历分子5时所期待的强度IF变化曲线。当根据图2的极小值6以一行错过分子5时，通过虚线10在图3中描绘荧光强度IF的相应的变化曲线。点划线11示出在以两行错过分子时的强度IF。由荧光强度IF的相应的实际测量值也能够求取垂直于x方向的y方向上的分子的地点。
图4示出荧光强度IF关于根据图2的、零部位形式的极小值6的不同位置xN的变化曲线12针对激励光23的极小值6之外的显著较高的绝对强度。在这里，在紧围绕极小值6的弱激励的区域32之外非常快地达到荧光强度IF的饱和，所述荧光由各荧光分子5发射。在这些边界条件下，如果在这些标出的位置xN上邻接有极小值6的在其上各荧光分子5的荧光被记录的其它位置xN，则极小值6的在其上荧光强度IF记录为零的位置xN能够等同于分子xM的地点。
图5示出在有两个分子5处于荧光状态下的情况下荧光强度IF关于极小值在试样中的位置xN的变化曲线，这两个分子以非常紧密的间距一起处于试样2中。该紧密的间距显著位于荧光波长情况下的衍射极限以下。因此，在这里，强度IF不能够通过光传感器阵列分开地对应于单个分子5，试样2成像到所述光传感器阵列上。然而，在激励光23的强度与分子的最小间距相协调的情况下，对于两个分子，荧光强度IF在极小值的位置xN上的塌陷分开地出现，因为区域8的尺寸和同时最小值d的尺寸随着激励光的强度而降低，所述最小值相当于极小值区域中的强度IF的半值宽度。当分子5的间距至少如以上所定义的最小值d一样大时，在极小值6的位置处于分子5之间时荧光强度IF又增高，从而强度IF的单个塌陷能够对应于单个分子。
在图5中示出这样的情况，在该情况下，即使是完全被极小值遇到的荧光分子5的荧光强度IF也不降低到零，因为在这里，极小值6不涉及零部位。更确切地说，当分子5中的一个到达极小值6的区域中时，强度IF仅降低了其最大值的大约90％。然而，至少在强度IF塌陷保持在至少50％时，这不损害由强度IF的变化曲线确定单个分子5的地点xM1和xM2。
图6以加和的强度ΣI在光传感器阵列上的分布的一个截面示出单个分子5的荧光的在单个位置xN上加和的强度ΣI，试样成像到所述光传感器阵列上并且通过所述光传感器阵列记录荧光。对于到目前为止在图3和4中画出草图的分析评估仅仅涉及到，单个分子5的荧光的哪个强度I针对极小值6的哪个位置xN被记录，但是没有涉及，如果所述荧光能够对应于单个荧光分子5，该荧光在哪里被记录，而根据图6分析评估了对于单个荧光分子5总共所记录的荧光在光传感器阵列上的分布13。由其重心(Schwerpunkt)也能够确定分子在试样中的地点，更确切地说，与极小值6的位置无关地并且以已知为局部化的方式确定。然而，在此，分子5在试样2中表面上的地点x′M与分子在试样2中可能的固定定向和相应地总是类似地取向的电子偶极矩有关，所述偶极矩导致所发射的荧光在空间上定向的分布(见Engelhardt,J.et al.,Molecular orientation affects Localization accuracy insuperresolution far-field fluorescence microscopy,Nano Lett.2011Jan 12；11(1):209-13)。在根据图3和4所解释的地点确定的方法中，不是这种情况。
在图2中已说明点状的极小值6。通过所述极小值能够在一次性地扫描试样时——向两个方向扫描二维的试样、向三个方向扫描三维的试样——确定每个单个荧光分子的地点。如果根据图7使用线形的极小值或者(垂直于图像平面定向的)平面形式的极小值，则横向于极小值的走向用极小值扫描试样，以便确定式样在各扫描方向14，15上的位置。相应地，如在图7(a)和(b)中所示，二维的试样必须在至少两个、优选正交的扫描方向14，15上被扫描，以便完全地确定单个分子的地点。在此，多个荧光分子5也能够同时位于线或者面形式的极小值的区域中，如果能够分开由所述荧光分子分别发射的荧光的话。
激励光23也不必在极小值6之外以这样的强度加载整个试样2并且也不必加载试样2的整个目标区域1，使得单个分子5的荧光总是能够被记录，如果它不是恰好处于围绕极小值6的、弱激励的区域32中的话。更确切地说，激励光23的强度能够集中到围绕极小值6的区域上。在此，该区域以另外的极小值终止，在所述另外的极小值之后激励光23的强度又增加，或者结束。在第一种情况下，也能够使用该另外的极小值来求取单个分子5的地点，而在第二种情况下，荧光分子5的荧光强度IF关于极小值6在试样2中较大数量的位置xN的改变被识别并且因此能够在确定各荧光分子5的地点xM时保持不被考虑。
图8说明，与仅用一个根据图2的极小值6相比，如何能够用点状局部极小值6构成的格栅以少得多的步距来扫描试样2的目标区域1。在此，仅四个极小值也足够用于扫描所示出的几乎整个目标区域1，通过这四个极小值分别经过(angefahren)平面内的20个位置。如在图8中所示出的，原则上，极小值的这种样式能够通过相对于彼此正交地定向的线形的格栅的交叠实现，所述格栅通过相干的子射束的交叠产生(见Chmyrov,A.et al:Nanoscopywith more than 100,000‘doughnuts’,Nature methods 10 737-740(2013))。
图9说明根据本发明的方法的基本流程。在步骤16中，调节物质的总共现有的分子4的份额，这些分子作为单个分子5处于荧光状态下。在步骤17中，用激励光23的强度分布激励处于荧光状态下的分子5发射荧光，所述强度分布具有至少一个局部极小值6。在步骤18中，与极小值6在试样2中的当前的位置相对应地记录该荧光。然后，在步骤19中，以相对于极小值的上一个位置不大于d/2的小间距移动极小值6。接着重新激励17和记录18，直到扫描完整个试样。然后物质的分子4的新的份额被转化到荧光状态中，即，在重复步骤16时随机地选择其它的单个分子5，然后在那里接着重复由步骤17至19组成的环节(Schleife)。这样长时间地执行在图9中画出草图的步骤16至19，直到借助于这些步骤已经确定这样多的单个分子4在试样2中的地点，使得这些地点以所想要的准确度描述分子4在试样2中的整体分布。为此，不必确定所有的分子4在试样2中的地点。更确切地说，确定足够数量的单个分子5形式的分子4代表的地点就足够。
如果在图9中画出草图的方法中在步骤18中用光传感器阵列记录荧光，试样2成像到所述光传感器上，则针对每个单个荧光分子5所记录的、整个荧光在光传感器上的分布13也能够使用于通过局部化来确定其地点(见图6)。
在根据本发明的方法中，也能够强烈地概括在图9中分开地示出的步骤16至19。这在图10中画出草图。在这里，在步骤20中，通过同时作为调节光使用的激励光来负责，保持在荧光状态下的单个分子5相互之间具有足够大的间距，以便分开地记录它们的荧光，并且这些单个分子5至少在激励光23的分布的至少一个极小值6之外被激励发射荧光。
与之并列地进行由记录18试样2中单个荧光分子5的荧光的步骤和使极小值6移动19的步骤组成的环节。在此，当由此得到的、在荧光强度IF被记录的每个时间段之内极小值6在试样2中的运动与在确定分子5的地点时所力求的准确度相比保持小时，所述移动甚至能够连续地进行。
鉴于这对具有仅一个波长的GSD显微镜(见DE 10 2005 034 443A1)和对GSDIM已知，能够执行这种方法也是意外的。即，根据本发明的方法认为，到达激励光23的极小值6的区域中的分子4由于激励光23的在那里降低的强度而不立即返回到其荧光状态下，而是，保持在其荧光状态下的单个分子5的通过激励光23强度所调节的分布在足够长的时间上得以维持，以便用极小值6扫描试样2的目标区域1。但是，至少对于具有小的区域8和相应地更小的半值宽度d的局部极小值6和在与单个分子5在其荧光状态下的停留持续时间相比极小值6在试样2中运动更迅速的情况下，激励光23在极小值6中的降低的强度对物质的分子4在其荧光状态下和其非荧光状态下的分布没有强烈的影响。因此，能够确定单个分子5在其在荧光状态下的停留持续时间期间的地点，并且这种确定不被在极小值的区域中遏制在荧光状态下的分子4阻止。必要时，分子在荧光状态和非荧光状态之间的跃迁可能性针对根据本发明的方法适配地调整，如所述跃迁可能性尤其通过激励光23的强度确定的那样。为此目的，例如能够给试样2添加合适的化学剂和/或适当地调节试样2中的氧气浓度。具有仅仅小的弱激励的区域32的极小值6也能够是有帮助的，所述极小值相对快速地在其在试样2中的单个位置之间经过。
图11画出用于执行根据本发明的方法的设备21。该设备具有激励光源22，该激励光源发出激励光23。激励光23由光成形光学装置24这样成形，使得所述激励光在用镜头25聚焦到试样2中之后具有所想要的强度分布，所述强度分布具有至少一个极小值6。为了使极小值6以最大d/2的步幅在试样2内部移动，设置扫描装置26。来自试样2的荧光27用分光镜28朝向光传感器阵列29耦合输出，试样2被镜头25成像到所述光传感器阵列上。光传感器阵列29能够实现，在单个分子5在试样2中局部化的意义上也分析评估荧光27的被试样2记录的强度。反之，这里用虚线所示出的点探测器30也足够用于根据本发明确定单个分子5在试样2中的地点，荧光27通过另外的分光镜31朝向——从试样2出发看在扫描装置26后方——点探测器耦合输出，并且，所述点探测器记录来自于包围极小值6的记录区域的荧光。扫描装置26这样构造，使得它至少这样密地确立激励光2的极小值6的荧光27在该处由试样2记录的位置，使得这些位置的间距7不大于在激励光23波长和荧光27波长情况下的衍射极限。
参考标记列表
1 目标区域
2 试样
3 目标结构
4 分子
5 在荧光状态下的单个分子
6 极小值
7 间距
8 区域
9 变化曲线
10 变化曲线
11 变化曲线
12 变化曲线
13 分布
14 扫描方向
15 扫描方向
16 步骤
17 步骤
18 步骤
19 步骤
20 步骤
21 设备
22 激励光源
23 激励光
24 光成形光学装置
25 镜头
26 扫描装置
27 荧光
28 分光镜
29 光传感器阵列
30 点传感器
31 分光镜
32 弱激励的区域
xN 极小值在x方向上的位置
xM 单个分子在x方向上的地点
IF 单个分子的荧光强度
ΣI 单个分子的荧光强度的总和

Claims (25)

1.用于确定物质的单个分子(5)在试样(2)中的地点(xM)的方法，
-其中，所述物质的单个分子(5)处于荧光状态下，在所述荧光状态下，能够用激励光(23)激励单个分子发射荧光(27)，
-其中，在所述试样(2)的目标区域(1)中，所述物质的单个分子(5)的间距遵循一最小值，并且
-其中，所述方法具有以下步骤：
-用所述激励光(23)激励所述物质的所述单个分子(5)发射荧光(27)，其中，所述激励光(23)的强度分布具有至少一个局部极小值(6)，和
-针对所述至少一个局部极小值(6)在所述试样(2)的目标区域(1)中的不同位置(xN)记录所述物质的被激励的单个分子(5)的荧光(27)，
其特征在于，
-在所述试样(2)的目标区域(1)中，物质的单个分子(5)的间距的最小值其中，
-λ为所述激励光的波长，
-n为光学材料的折射系数，在所述光学材料中构造所述至少一个局部极小值，
-α为光学组件的半打开角度，通过所述光学组件使所述激励光对准所述试样，
-I为所述激励光(23)在所述试样(2)中的最大强度，和
-Is为所述激励光的与所述物质有关的荧光激励饱和强度，
-单个分子(5)在所述激励光(23)的强度分布的局部极小值(6)的位置上的荧光(27)强度最大如在所述激励光(23)在所述试样(2)中的最大强度的位置上的一半大，
-所述至少一个局部极小值(6)的最邻近的位置(xN)之间的间距(7)不大于所述最小值d的一半，在所述最邻近的位置上记录所述物质的被激励的单个分子(5)的荧光(27)，和
-由各分子(5)的荧光(23)的强度(IF)关于所述至少一个局部极小值(6)在所述试样(2)的目标区域(1)中的位置(xN)的变化曲线推导出所述物质的单个分子(5)的地点(xM)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，由各分子(5)的荧光(27)的强度(IF)关于所述至少一个局部极小值(6)的位置(xN)的变化曲线拟合出具有局部极小值的函数(9)，并且，各分子(5)的地点(xM)等同于所拟合的函数(9)的局部极小值的位置。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述函数(9)为二次函数。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，各分子(5)的地点(xM)等同于所述至少一个局部极小值(6)的位置(xN)，所述位置以如下方式突显，即，与在所述局部极小值(6)的在不同方向上最邻近的位置(xN)中相比，从各分子(5)记录到较少的荧光(27)。
5.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一个局部极小值(6)的最邻近的位置(xN)之间的间距(7)不大于围绕所述局部极小值(6)的、弱激励的区域(32)，在所述最邻近的位置上记录所述物质的被激励的单个分子(5)的荧光(27)，在所述弱激励的区域中激励各分子(5)仅发射具有极小强度的荧光(27)。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，这样高地调节所述激励光(23)的邻近所述至少一个局部极小值(6)的强度，使得达到荧光(27)强度(IF)饱和，所述荧光由用所述激励光(23)激励的单个分子(5)发射。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，
-通过调节信号以随着所述调节信号的强度提高的跃迁可能性能够使所述物质的分子(4)
-从其荧光状态转化到非荧光状态，或者
-从非荧光状态转化到其荧光状态，
-在考虑所有分子(4)时，与分子状态无关，在所述试样(2)的目标区域(1)中，所述物质的最邻近的分子(4)之间的间距小于最小值d，并且
-用所述调节信号来调节所述物质的处于荧光状态下的单个分子(5)之间的间距。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
-用所述调节信号反向于分子的转化方向使所述物质的分子(4)
-在反馈信号的作用下和/或
-自发地
以另外的跃迁可能性返回到其最初的状态中，
-针对荧光状态下的当时其他的单个分子(5)分别重复地或者继续地用调节信号和必要时用反馈信号调节具有最小值d的间距，和
-分别确定荧光状态下的单个分子(5)的位置，以获得物质的分子(4)在所述试样(2)中的分布的成像。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，用所述调节信号和必要时用所述反馈信号连续地或者间歇地加载所述试样(2)。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述调节信号为调节光。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，用所述调节光使所述物质的分子(4)从其荧光状态转化到其非荧光状态。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述物质的分子(4)的非荧光状态为电子能量状态。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述调节光与所述激励光(23)具有相同的波长。
14.根据权利要求1至4、8至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一个局部极小值(6)为点状的极小值，所述点状的极小值在所述试样(2)的目标区域(1)内的位置在所述试样(2)的所有延伸方向上改变，并且，由各分子(5)的荧光(27)强度(IF)关于所述至少一个局部极小值(6)在所述试样(2)的目标区域(1)中的位置(xN)的变化曲线推导出所述物质的单个分子(5)在所述试样(2)的所有延伸方向上的地点(xM)。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，用相对于所述局部极小值(6)共焦地布置的点探测器(30)记录来自包围所述至少一个局部极小值(6)的记录区域的荧光(27)。
16.根据权利要求1至4、8至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一个局部极小值(6)沿着线或者平面延伸，所述局部极小值在所述试样(2)的目标区域(1)中的位置(xN)在横向于所述线或者所述平面的扫描方向(14，15)上改变，所述物质的单个分子(5)在所述扫描方向(14，15)上的地点(xM)由各分子(5)的荧光(27)的强度(IF)关于所述至少一个局部极小值(6)在所述试样(2)的目标区域(1)中的位置(xN)的变化曲线推导出。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述线或者平面相对于所述试样(2)不同地定向，以便确定所述物质的单个分子(5)在不同的空间方向上的地点(xM)。
18.根据权利要求1至4、8至12、15、17中任一项所述的方法，其特征在于，激励光的强度分布具有多个极小值(6)，所述极小值在所述试样(2)的目标区域(1)中的位置共同改变，其中，对于所述极小值(6)中的每一个分开地记录所述物质的被激励的单个分子(5)的荧光(27)。
19.根据权利要求1至4、8至12、15、17中任一项所述的方法，其特征在于，用相对于所述试样(2)静止的光传感器阵列(29)记录所述荧光(27)。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，连续的帧从所述光传感器阵列(29)被读出并且被配属于所述至少一个局部极小值(6)在所述试样(2)中的相应位置。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述至少一个局部极小值(6)在所述试样(2)中连续地移动。
22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，在所述试样(2)的目标区域(1)中，所述物质的单个分子(5)的间距大于在荧光(27)波长情况下的衍射极限，并且，附加地由从各分子(5)总共记录的荧光(ΣI)在所述光传感器阵列(29)上的分布(13)来确定物质的在荧光状态下的单个分子(5)的地点(xM)。
23.用于执行根据以上权利要求中任一项所述的方法的设备，
-具有激励光源(22)，所述激励光源发出激励光(23)，
-通过所述激励光能够激励物质的处于荧光状态下的分子(4)发射荧光，并且
-通过所述激励光能够使所述物质的分子(4)从其荧光状态转化到非荧光的暗状态，
-具有光学组件，所述光学组件使具有强度分布的激励光对准所述试样(2)，
-具有探测器装置，所述探测器装置记录由所述物质的用激励光激励的、处于荧光状态下的分子(5)所发射的荧光(27)，其特征在于，
-光成形光学装置(24)形成所述激励光(23)在所述试样(2)中的强度分布，所述强度分布具有至少一个局部极小值(6)，其中，单个分子(5)在所述激励光(23)的强度分布的局部极小值(6)位置上的荧光(27)强度最大为在所述激励光(23)在所述试样(2)中的最大强度的位置上的一半大，
-设置扫描装置(26)，通过所述扫描装置能够使所述至少一个局部极小值(6)定位在所述试样(2)中的不同位置(xN)中，
-所述探测器装置能够将由包围所述至少一个局部极小值的记录区域所发射的荧光(27)与由所述试样(2)的其它区域所发射的荧光分开地记录，
-所述至少一个局部极小值(6)的最邻近的位置(xN)之间的间距(7)不大于在所述最邻近的位置上，所述探测器装置记录来自所述记录区域的荧光(27)，其中，
-λ为所述激励光的波长，
-n为光学材料的折射系数，在所述光学材料中构造所述至少一个局部极小值，
-α为光学组件的半打开角度，所述光学组件使所述激励光对准所述试样，
-I为所述激励光(23)在所述试样(2)中的最大强度，和
-Is为所述激励光的与所述物质有关的荧光激励饱和强度。
24.根据权利要求23所述的设备，其特征在于，所述光成形光学装置(24)构造所述激励光(23)在所述试样中的、具有极小值(6)格栅的强度分布，并且，所述扫描装置(26)使所述强度分布相对于所述试样(2)这样移动，使得用围绕零部位(6)的、弱激励的区域(32)完全扫描所述试样(2)的目标区域(1)，在所述弱激励的区域内激励所述物质的处于荧光状态下的分子(4)仅发射具有极小强度的荧光(27)。
25.权利要求23或者24所述的设备，其特征在于，所述探测器装置具有相对于所述试样静止的图像传感器阵列(29)。
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