DE102016119262B4 - Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe - Google Patents

Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe Download PDF

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Abstract

Bei einem Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts (x) eines vereinzelten Moleküls in einer oder mehreren Raumrichtungen in einer Probe, wobei das Molekül mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht (12) anregbar ist, wird das Anregungslichtmit einer Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet, die in jeder der Raumrichtungen mindestens einen Intensitätsanstiegsbereich (22) mit bekanntem streng monotonem Verlauf der Intensität des Anregungslichts über einem Abstand zu einem Aufpunkt der Intensitätsverteilung aufweist. Ein anfänglicher Ortsbereich (23) in der Probe, in dem das Molekül angeordnet ist, wird bestimmt. (i) in jeder der Raumrichtungen wird mindestens eine Position (x) des Aufpunkts der Intensitätsverteilung so festgelegt wird, dass sich der mindestens eine Intensitätsanstiegsbereich (22) in der jeweiligen Raumrichtung über den anfänglichen Ortsbereich (23) erstreckt; der Aufpunkt der Intensitätsverteilung wird an den Positionen (x) in der Probe angeordnet und zu jeder Position (x) des Aufpunkts der Intensitätsverteilung in der Probe wird das von dem Molekül emittierte Lumineszenzlicht (12) registriert. (ii) aus Intensitätswerten (I; I) des Lumineszenzlichts (12), die zu jeder der Raumrichtungen zwei Intensitätswerte (I; I) umfassen, von welchen einer die Intensität (I) des zu der mindestens einen Position (x) des Aufpunkts der Intensitätsverteilung registrierten Lumineszenzlichts (12) angibt, wird ein weiterer Ortsbereich (24) in der Probe bestimmt wird, in dem das Molekül angeordnet ist und der kleiner als der anfängliche Ortsbereich (23) ist. Die Schritte (i) und (ii) werden mindestens einmal unter Verwendung des weiteren Ortsbereichs (24) als neuer anfänglicher Ortsbereich (23) wiederholt.

Description

  • TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten Moleküls in einer oder mehreren Raumrichtungen in einer Probe, wobei das Molekül mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar ist. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren mit den Merkmalen des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1.
  • Unter einem vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Molekül wird hier ein Molekül verstanden, das einen Mindestabstand zu anderen gleichartigen Molekülen aufweist, die mit demselben Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht im selben Wellenlängenbereich anregbar sind. Dieser Mindestabstand wird sicher eingehalten, wenn der Abstand des vereinzelten Moleküls zu derartigen gleichartigen Molekülen mindestens gleich der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts ist, weil dann das Luminiszenzlicht von den verschiedenen mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Molekülen getrennt erfasst werden kann. Die Erfindung umfasst aber auch Ausführungsformen, bei denen dieser Mindestabstand kleiner als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts ist.
  • Das Lumineszenzlicht, zu dessen Emission das Molekül mit dem Anregungslicht anregbar ist, kann insbesondere Fluoreszenzlicht sein. Das Emittieren des Lumineszenzlichts durch das Molekül kann aber auf jedem photophysikalischen Prozess basieren, der durch das Anregungslicht angeregt wird. Hierzu zählen alle Prozesse der Photolumineszenz und beispielsweise auch eine durch das Anregungslicht angeregte Emission von Lumineszenzlicht durch Quantum Dots.
  • STAND DER TECHNIK
  • Das einfachste Verfahren zum Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls besteht darin, das Molekül mit dem Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anzuregen und das Lumineszenzlicht auf einen Kamera oder allgemeiner auf einen räumlich auflösenden Detektor abzubilden. Für die bei dieser Abbildung erreichbare räumliche Auflösung gilt zwar grundsätzlich die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts. Wenn jedoch eine Vielzahl von Photonen des Lumineszenzlichts mit dem räumlich auflösenden Detektor detektiert wird, die von einem einzigen Molekül an einem festen Ort in der Probe stammen, kann aus der räumlichen Verteilung dieser Photonen über den Detektor der Ort des Moleküls mit einer um einen Faktor 1 / n
    Figure DE102016119262B4_0001
    verbesserten Präzision bestimmt werden. Dabei ist „n“ die Anzahl der registrierten Photonen. Eine deutliche Unterschreitung der Beugungsgrenze bei diesem als Lokalisierung bezeichnet Verfahren setzt daher eine Vielzahl von Photonen des Lumineszenzlichts voraus, die von dem vereinzelten Molekül emittiert und registriert werden. Damit besteht die Gefahr, dass das vereinzelte Molekül beim und evtl. schon vordem Bestimmen seines Orts in der Probe mit der gewünschten Präzision weggeblichen wird. Insbesondere ein wiederholtes Bestimmen des Orts desselben vereinzelten Moleküls, wie es zum Tracking eines sich in einer Probe bewegenden Moleküls erforderlich ist, ist deshalb oft nicht möglich.
  • Wenn ein vereinzeltes Molekül Lumineszenzlicht mit einer gerichteten räumlichen Verteilung emittiert, wirkt sich dies bei der Bestimmung seines Orts aus der Verteilung der Photonen des Lumineszenzlichts über einen räumlich auflösenden Detektor, d. h. durch Lokalisierung, in Form eines Ortsfehlers aus. Dieser Ortsfehler hängt von der Orientierung des Moleküls in der jeweiligen Probe ab. Eine gerichtete Verteilung des emittierten Lumineszenzlichts zeigt sich beispielsweise bei Molekülen, deren Rotationsdiffusionszeiten länger als ihre Verweildauer in ihrem angeregten Zustand sind, aus dem heraus sie das Lumineszenzlicht emittieren (siehe Engelhardt, J. et al. „Molecular Orientation Affects Localization Accuracy in Superresolution Far-Field Fluorescence Microscopy", NanoLett 2011 Jan. 12; 11 (1):209-13).
  • Aus der WO 2006/127692 A2 ist es bekannt, eine interessierende Struktur in einer Probe mit aktivierbaren Molekülen zu markieren, die sich in einem nicht-fluoreszenten Ausgangszustand befinden, aber mit Aktivierungslicht in einen fluoreszenten Zustand überführt werden können, in dem sie mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar sind. So kann mit dem Aktivierungslicht ein geringer Anteil der insgesamt vorhandenen Moleküle in den fluoreszenten Zustand gebracht werden, bei dem nächstbenachbarte Moleküle in dem fluoreszenten Zustand einen größeren Abstand als die Beugungsgrenze aufweisen, d. h. vereinzelt sind. Bei einem anschließenden Beaufschlagen der Probe mit Anregungslicht wird Fluoreszenzlicht nur von den in dem fluoreszenten Zustand befindlichen Molekülen emittiert. So kann das Fluoreszenzlicht von den einzelnen vereinzelten Molekülen in dem fluoreszenten Zustand getrennt registriert werden; und die Orte der einzelnen Moleküle können trotz hoher absoluter Dichte der Moleküle in der Probe durch Lokalisierung mit einer Präzision jenseits der Beugungsgrenze bestimmt werden. Eine Abbildung der Verteilung der Moleküle in der Probe und damit der mit ihnen markierten interessierenden Struktur wird schrittweise erreicht, indem die Schritte des Aktivierens eines geringen Anteils der Moleküle, des Anregens dieser aktivierten Moleküle zur Emission von Fluoreszenzlicht und des Registrieren des Fluoreszenzlichts mit einem räumlich auflösenden Detektor, bis die jeweiligen aktivierten Moleküle weggeblichen sind, wiederholt und damit für immer mehr der Moleküle durchgeführt werden, die die interessierende Struktur markieren.
  • Die WO 2006/127692 A2 beschreibt auch, dass die Aktivierung nur einer Teilmenge der insgesamt vorhandenen Moleküle auf andere Abbildungsverfahren übertragen werden kann. Dabei können durch eine Intensitätsverteilung des Anregungslichts mit durch Minima begrenzten Maxima die vereinzelten Moleküle speziell in bestimmten Ebenen oder anderen räumlichen Untereinheiten der Probe zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt werden.
  • Das aus der WO 2006/127692 A2 bekannte Verfahren wird auch als PALM, d. h. als photoaktivierte Lokalisierungsmikroskopie, bezeichnet. Ein sehr ähnliches, als STORM (stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie) bezeichnetes Verfahren weist grundsätzlich dieselben Vor- und Nachteile auf.
  • Aus der US 8,174,692 B2 ist es bekannt, dass auch Moleküle eines normale Farbstoffs, die nicht aktivierbbar sind, sondern einen fluoreszenten Ausgangszustand aufweisen, und auch nicht zwischen zwei Konformationszuständen geschaltet werden können, von denen nur einer fluoreszent ist, genutzt werden können, um den Ort einzelner Moleküle durch Lokalisierung zu bestimmen. Dazu wird die Probe mit einer so hohen Intensität von Anregungslicht, das die Moleküle zugleich mit einer gewissen Übergangswahrscheinlichkeit in einen relativ langlebigen elektronischen Dunkelzustand überführt, beaufschlagt, dass sich zwischen den aktuell in dem fluoreszenten Zustand befindlichen Molekülen Abstände oberhalb der Beugungsgrenze einstellen.
  • Die jeweils in dem fluoreszenten Zustand vorliegenden Moleküle werden von dem Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt, das mit einer Kamera als räumlich auflösendem Detektor registriert wird. Auf diese Weise werden sukzessive verschiedene Moleküle des Farbstoffs lokalisiert, da die Moleküle, von denen bereits Photonen registriert wurden, in den Dunkelzustand gelangen, aus dem andere Moleküle mit einer gewissen Übergangswahrscheinlichkeit in den fluoreszenten Zustand zurückkehren. Dieses bekannte Verfahren kann kontinuierlich durchgeführt werden, d. h. es können fortlaufend Frames aus der Kamera ausgelesen werden, während die Probe mit der hohen Intensität des Anregungslichts beaufschlagt wird, die den Farbstoff im Wesentlichen in dem Dunkelzustand hält und zugleich die dadurch vereinzelten fluoreszenten Moleküle zur Emission von Lumineszenzlicht anregt.
  • Das aus der US 8,174,692 B2 bekannte Verfahren wird auch als GSDIM (Ground State Depletion Individual Molecule Return Microscopy) bezeichnet.
  • Ein grundsätzlich anderes Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Bestimmen von Orten von mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Molekülen in einer Probe wird bei räumlich hochauflösenden Varianten der Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie angewandt. Bei der Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie basiert die Präzision beim Bestimmen der Orte von fluoreszenten Molekülen in einer Probe auf einer zu jedem Zeitpunkt nur lokalen Anregung der Probe, so dass zu dem jeweiligen Zeitpunkt registriertes Fluoreszenzlicht dem räumlichen Bereich der Anregung zugeordnet werden kann. Wenn die Moleküle in der Probe mit fokussiertem Anregungslicht angeregt werden, setzt die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Anregungslichts die Untergrenze für die räumlichen Abmessungen des Bereichs der Anregung und damit für die räumliche Auflösung, die bei der Abbildung einer mit den fluoreszenten Molekülen markierten Struktur in der Probe erreichbar ist.
  • Bei der STED (Stimulated Emission Depletion)-Fluoreszenzlichtmikroskopie wird die mit fokussiertem Anregungslicht bewirkte Anregung von Molekülen, mit denen eine interessierende Struktur einer Probe markiert ist, im Umfeld jedes Messpunkts durch gerichtete Emission wieder beseitigt. Die gerichtete Emission wird mit STED-Licht stimuliert und verhindert die Emission von Fluoreszenzlicht durch die Moleküle. Danach registriertes Fluoreszenzlicht kann nur noch aus dem Bereich stammen, in dem die Anregung mit dem STED-Licht nicht beseitigt wurde. Dieser Bereich, in dem die Anregung nicht beseitigt wird, kann sehr klein gehalten werden, indem er durch eine Nullstelle der Intensitätsverteilung des STED-Lichts definiert wird und die maximale Intensität des STED-Lichts in der Nullstelle benachbarten Intensitätsmaxima hoch gewählt wird, so dass es die Anregung der Moleküle bereits sehr nahe seiner Nullstelle vollständig beseitigt.
  • Statt eine vorher bewirkte Anregung der Moleküle in Teilen der Probe wieder abzuregen, kann Fluoreszenzverhinderungslicht mit einer eine Nullstelle aufweisenden Intensitätsverteilung auch dazu genutzt werden, fluoreszente Moleküle außerhalb der Nullstelle in einen nicht-fluoreszenten Dunkelzustand zu schalten. Dies erfolgt beispielsweise bei der RESOLFT (Reversible Saturable Optical (Fluorescence) Transitions)-Fluoreszenzlichtmikroskopie oder der GSD (Ground State Depletion)-Fluoreszenzlichtmikroskopie.
  • Bei den als STED-, RESOLFT- oder GSD-Rasterfluoreszenzlichtmikroskopie bekannten Verfahren wird jedes Molekül, bereits bevor Fluoreszenzlicht von ihm registriert wird, in den an die Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichts angrenzenden Bereichen neben dem Anregungslicht mit den dort hohen Intensitäten des Fluoreszenzverhinderungslichts beaufschlagt, die mit einer erheblichen Gefahr des Bleichen der Moleküle verbunden sind. Die Gefahr des Bleichens besteht auch, wenn bei diesen bekannten Verfahren ein vereinzelte, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbares Molekül in einer Probe mit der Nullstelle des Fluoreszenzverhinderungslichtsverfolgt wird, da dazu die Rate der von dem Molekül emittierten Photonen des Luminiszenzlichts fortlaufend zu maximieren ist.
  • Aus der WO 2012/171999 A1 ist ein Verfahren bekannt, bei dem eine Probe mit einem Anregungslichtstrahl, der mit einer Intensitätsverteilung von STED-Licht mit einem Minimum am Fokus des Anregungslichtstrahls überlagert ist, so schnell abgetastet wird, dass bei jedem von vielen aufeinanderfolgenden Abtastvorgängen Fluoreszenzlicht nur in Form von einzelnen Photonen registriert wird, die jeweils nur von einem einzelnen Molekül stammen. Die Orte der verschiedenen einzelnen Moleküle, von denen die Photonen stammen, werden den zugehörigen Positionen des Minimums des STED-Lichts in der Probe zugeordnet.
  • Bei diesem Verfahren werden zwar nur wenige Photonen, im Extremfall nur ein einziges, von jedem Molekül registriert, dem ein Ort in der Probe zugeordnet wird. Die Moleküle werden aber dennoch typischerweise einigen Zyklen von Anregung und stimulierter Emission unterworfen, so dass ihr Bleichen nicht ausgeschlossen ist. Zudem ist mit diesem bekannten Verfahren ein gezieltes Verfolgen eines bestimmten vereinzelten Moleküls nicht sinnvoll möglich.
  • Aus der DE 10 2011 055 367 A1 ist ein Verfahren zum Verfolgen eines einzelnen fluoreszenten Moleküls bekannt. Das Molekül wird mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt und das Fluoreszenzlicht wird registriert. Dabei wird das Anregungslicht mit einer ein lokales Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet, und das Minimum wird dem sich in der Probe bewegenden Molekül nachgeführt. Zu diesem Zweck wird die Intensitätsverteilung des Anregungslichts fortlaufend so gegenüber der Probe verschoben, dass eine Rate von Photonen des von dem Molekül emittierten Fluoreszenzlichts minimiert wird. Dies bedeutet ein Halten des Moleküls in dem Minimum der Intensitätsverteilung des Anregungslichts, bei dem es sich um eine Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts handeln kann.
  • Aus der WO 2015/097000 A1 ist ein Verfahren zum Bestimmen der Orte vereinzelter Moleküle in einer Probe bekannt, wobei sich die vereinzelten Moleküle in einem fluoreszenten Zustand befinden, in dem sie mit Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar sind, und wobei Abstände der vereinzelten Moleküle der Substanz einen Mindestwert einhalten. Die vereinzelten Moleküle werden mit dem Anregungslicht zur Emission des Fluoreszenzlichts angeregt, wobei eine Intensitätsverteilung des Anregungslichts eine Nullstelle aufweist. Das Fluoreszenzlicht von den angeregten vereinzelten Molekülen der Substanz wird für verschiedene Positionen der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts in der Probe registriert. Dabei sind Abstände zwischen nächstbenachbarten Positionen der Nullstelle nicht größer als der halbe Mindestwert des Abstands der vereinzelten Moleküle. Konkret wird die Probe mit der Nullstelle abgetastet, wobei ein Rastermaß beim Abtasten der Probe nicht größer als der halbe Mindestwert ist. Die Orte der vereinzelten Moleküle in der Probe werden aus einem Verlauf der Intensität des Fluoreszenzlichts von dem jeweiligen vereinzelten Molekül über den Positionen der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts abgeleitet. Dabei kann eine Funktion mit Nullstelle an den Verlauf der Intensität des Lumineszenzlichts von dem jeweiligen vereinzelten Molekül angefittet werden; und der Ort des jeweiligen Moleküls kann der Position der Nullstelle der angefitteten Funktion gleichgesetzt werden. Die Funktion kann eine quadratische Funktion sein. Die angefittete Funktion kann aber auch individuell an den Intensitätsverlauf des Lumineszenzlichts von einem vereinzelten Molekül der jeweiligen Substanz als Antwort auf den Intensitätsverlauf des Anregungslichts im Umfeld seiner Nullstelle angepasst werden.
  • Bei dem aus der WO 2015/097000 A1 bekannten Verfahren wird das jeweilige vereinzelte Molekül, bevor es beim Abtasten der Probe in die Nähe der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts gerät, den höheren Intensitäten der angrenzenden Intensitätsmaxima des Anregungslichts ausgesetzt. Diese Intensitäten überschreiten eine Sättigungsintensität des Anregungslichts, oberhalb derer es zu keiner Steigerung der Intensität des Lumineszenzlichts von dem jeweiligen vereinzelten Molekül mehr kommt, so dass dessen Verlauf bei einem Sättigungswert konstant und damit ohne Informationsinhalt ist. Entsprechend werden von jedem vereinzelten Molekül der Substanz sehr viele Photonen emittiert, bevor die Photonen emittiert werden, aus denen der Ort des Moleküls bestimmt wird. Hierdurch besteht eine erhebliche Gefahr des Bleichens des Moleküls, selbst wenn an jeder Position der Nullstelle des Anregungslichts nur eine begrenzte Anzahl von Photonen registriert wird, bevor die Nullstelle weiter verschoben wird.
  • Aus der DE 10 2010 028 138 A1 ist ein Verfahren zum Bestimmen der Verteilung einer Substanz in einem Messgebiet durch Abtasten mit einer Messfront bekannt. Über eine Tiefe der Messfront, die kleiner als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge eines optischen Signals ist, steigt die Intensität des optischen Signals derart an, dass ein Anteil der Substanz in einem Messzustand zunächst von nicht vorhanden anwächst und dann wieder auf nicht vorhanden abfällt. Die Messfront wird in Gegenrichtung zu dem Anstieg der Intensität des optischen Signals über das Messgebiet verschoben. Das Messsignal, bei dem es sich um Fluoreszenzlicht handeln kann, wird erfasst und der jeweiligen Position der Messfront in dem Messgebiet zugeordnet.
  • Aus der DE 10 2014 111 167 A1 ist ein Verfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie bekannt, bei dem eine Probe mit Beleuchtungsstrahlung derart zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt wird, dass die Beleuchtungsstrahlung an einen Punkt in oder auf der Probe zu einem beugungsbegrenzten Beleuchtungsfleck gebündelt wird. Der Punkt wird beugungsbegrenzt in ein Beugungsbild auf einem ortsauflösenden Flächendetektor abgebildet, der eine Ortsauflösung hat, die eine Beugungsstruktur des Beugungsbildes auflöst. Die Probe wird mittels verschiedener Scanpositionen mit einer Schrittweite abgetastet, die kleiner sind als der halbe Durchmesser des Beleuchtungsflecks. Aus den Daten des Flächendetektors und aus den diesen Daten zugeordneten Scanpositionen wird ein Bild der Probe erzeugt, das eine Auflösung aufweist, die über eine Auflösungsgrenze der Abbildung gesteigert ist. Ein solches Verfahren und entsprechende Mikroskope sind auch aus der WO 2013/135487 A1 , der DE 10 2013 019 348 A1 , der DE 10 2012 204 128 A1 , der DE 10 2012 023 024 A1 und der EP 2 317 362 A1 bekannt.
  • Die US 7 772 569 B2 offenbart ein Mikroskopsystem zum Erzeugen von dreidimensionalen Bildern aus einzeln lokalisierten Probenmolekülen. Das Mikroskopsystem umfasst einen Probenhalter, eine Aktivierungslichtquelle, eine Ausleselichtquelle, einen Strahlteiler, mindestens eine Kamera und eine Steuerung. Die Aktivierungslichtquelle aktiviert photoempfindliche lumineszente Sonden, und die Ausleselichtquelle ruft Lumineszenzlicht von den aktivierten Sonden hervor. Der Strahlteiler teilt das Lumineszenzlicht auf mindestens zwei Pfade auf, um mindestens zwei Detektionsebenen zu erzeugen, die unterschiedlichen Objektebenen der Probe entsprechen. Die mindestens eine Kamera detektiert gleichzeitig die mindestens zwei Detektionsebenen. Die Steuerung ist programmiert, um ein Signal von verschiedenen Objektebenen zu dreidimensionalen Daten zu kombinieren.
  • Die DE 10 2015 004 104 A1 offenbart ein Verfahren zum Lokalisieren eines Emitters elektromagnetischer Emissionsstrahlung mittels eines Lokalisationsmikroskops. Das Verfahren weist ein Leiten der elektromagnetischen Emissionsstrahlung durch wenigstens zwei Objektive auf wenigstens einen optischen Detektor auf, wobei die optischen Achsen der wenigstens zwei Objektive in voneinander linear unabhängigen Richtungen verlaufen. Die elektromagnetische Emissionsstrahlung wird durch den wenigstens einen optischen Detektor detektiert, wobei der optische Detektor Messwerte aufnimmt, aus denen die Position des wenigstens einen Emitters ermittelt wird.
  • AUFGABE DER ERFINDUNG
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe aufzuzeigen, wobei das Molekül ist, bei dem die Anzahl der Photonen, zu deren Emission das vereinzelte Molekül angeregt werden muss, bezogen auf die erreichte Präzision verglichen mit den bekannten Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten Moleküls deutlich verringert ist.
  • LÖSUNG
  • Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 gelöst. Die abhängigen Patentansprüche 2 bis 20 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Patentansprüche 21 und 22 betreffen wiederholte Durchführungen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Bestimmen des Orts einer Vielzahl von nacheinander vereinzelten Molekülen bzw. zum Tracken des vereinzelten Moleküls; und Patentanspruch 23 betrifft eine Verwendung eines STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskops zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung geht aus von einem aus der WO 2015/097000 A1 bekannten Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten Moleküls in einer oder mehreren Raumrichtungen in einer Probe, wobei das Molekül mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar ist. Wie bei dem Ausgangsverfahren wird das Anregungslicht mit einer Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet, die in jeder der Raumrichtungen mindestens einen Intensitätsanstiegsbereich mit bekanntem streng monotonem Verlauf der Intensität des Anregungslichts über einem Abstand zu einem Aufpunkt der Intensitätsverteilung aufweist. Dieser Aufpunkt der Intensitätsverteilung wird in jeder der Raumrichtungen an verschiedenen Positionen in der Probe angeordnet. Zu jeder Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung in der Probe wird das von dem Molekül emittierte Lumineszenzlicht registriert; und der Ort des Moleküls in der Probe wird von Intensitäten des registrierten Lumineszenzlichts abgeleitet.
  • Zusätzlich zu dem bekannten Verfahren wird erfindungsgemäß zunächst ein anfänglicher Ortsbereich in der Probe bestimmt, in dem das Molekül angeordnet ist. Dann wird (i) in jeder der Raumrichtungen mindestens eine Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung so festgelegt, dass sich der mindestens eine Intensitätsanstiegsbereich in der jeweiligen Raumrichtung über den gesamten anfänglichen Ortsbereich hinweg erstreckt, und (ii) aus Intensitätswerten des Lumineszenzlichts, die zu jeder der Raumrichtungen zwei Intensitätswerte umfassen, von welchen einer die Intensität des zu der mindestens einen Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung registrierten Lumineszenzlichts angibt, wird ein weiterer Ortsbereich in der Probe bestimmt, in dem das Molekül angeordnet ist und der kleiner als der anfängliche Ortsbereich ist. Die Schritte (i) und (ii), einschließlich des Anordnens des Aufpunkts der Intensitätsverteilung des Anregungslichts an den in Schritt (i) festgelegten Positionen und des Registrierens des von dem Molekül emittierten Lumineszenzlichts zu jeder dieser Positionen, werden mindestens einmal unter Verwendung des weiteren Ortsbereichs als neuer anfänglicher Ortsbereich wiederholt.
  • Auf diese Weise wird der Ort des vereinzelten Moleküls in der Probe in jeder Raumrichtung sehr schnell, d. h. auf Basis einer geringen Anzahl von von dem vereinzelten Molekül emittierten und registrierten Photonen, auf einen kleinen Ortsbereich eingeschränkt. Die Abmessungen dieses kleinen Ortsbereichs entsprechen der Präzision, mit der der Ort des vereinzelten Moleküls bestimmt wird. Sie können problemlos 10 nm und damit die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts deutlich unterschreiten.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Probe auch in dem anfänglichen Ortsbereich des Moleküls nicht räumlich abgetastet, sondern die Positionen des Aufpunkts der Intensitätsverteilung werden aufgrund der zu den bisherigen Positionen des Aufpunkts der Intensitätsverteilung registrierten Intensitäten des Lumineszenzlichts relativ zu dem Ortsbereich intelligent, d. h. unter maximaler Ausnutzung aller bislang aus den registrierten Intensitäten des Lumineszenzlichts verfügbaren Informationen über den tatsächlichen Ort des vereinzelten Moleküls, festgelegt. Dabei können die festgelegten Position des Aufpunkts den Ortsbereich selbst vollständig aussparen.
  • Dass das erfindungsgemäße Verfahren zum räumlich hochaufgelösten Bestimmen des Orts des vereinzelten Moleküls dient, bedeutet, wie sich aus der erreichbaren Präzision von 10 nm und deutlich besser ablesen lässt, dass insbesondere eine räumliche Auflösung deutlich unterhalb der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Anregungslichts und auch des Lumineszenzlichts erreicht wird. In diesem Zusammenhang sei angemerkt, dass die Formulierung „räumliche Auflösung“ hier als Synonym für die Präzision verwendet wird, mit der der Ort des jeweiligen vereinzelten Moleküls in der Probe bestimmt wird.
  • Dass das erfindungsgemäße Verfahren zum Bestimmen des Orts eines vereinzelten Moleküls dient, bedeutet, wie bereits eingangs angesprochen wurde, dass der Ort des vereinzelten Moleküls einen Mindestabstand zu nächstbenachbarten gleichartigen Molekülen einhält, die mit demselben Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht im selben Wellenlängenbereich anregbar sind, so dass das Lumineszenzlicht von den nächstbenachbarten gleichartigen Molekülen nicht aufgrund verschiedener Wellenlängen getrennt werden kann. Dieser Mindestabstand ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren von der Größenordnung der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts oder kleiner. Tatsächlich kann der Mindestabstand wie bei dem Ausgangsverfahren gemäß der WO 2015/097000 A1 auch erheblich kleiner als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts sein, solange er nicht kleiner als eine Ausdehnung des Intensitätsanstiegsbereichs der Intensitätsverteilung des Anregungslichts in der jeweiligen Raumrichtung ist, über der die Intensität des Anregungslichts unter einer Sättigungsintensität und damit die Intensität des Lumineszenzlichts von dem Molekül unterhalb eines Sättigungswerts bleibt. Wenn der Abstand des vereinzelten Moleküls zu nächstbenachbarten, mit dem Anregungslicht anregbaren Molekülen größer als die Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Lumineszenzlichts ist, kann das von dem vereinzelten Molekül emittierte Lumineszenzlicht mit einem räumlich auflösenden Detektor räumlich getrennt von dem Lumineszenzlicht registriert werden, das von ihm nächstbenachbarten Molekülen emittiert wird. Wenn der Abstand der vereinzelten Moleküle zumindest nicht kleiner als der von dem Intensitätsanstiegsbereich in Bezug auf die Intensität des Lumineszenzlichts von den Molekülen beeinflusste Bereich der Intensitätsverteilung des Anregungslichts ist, kann die Differenz der Intensität des Lumineszenzlichts zu dem Sättigungswert bei der Sättigungsintensität des Anregungslichts unmittelbar dem vereinzelten Molekül zugeordnet werden, weil es sich das Molekül dann allein in diesem von dem Intensitätsanstiegsbereich beeinflussten Bereich befindet.
  • Dass das vereinzelte Molekül mit dem Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar ist, bedeutet, dass das vereinzelte Molekül photolumineszent ist. Konkret kann das vereinzelte Molekül fluoreszent, d. h. mit dem Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht anregbar sein. An dieser Stelle sei angemerkt, dass die Angabe „lumineszent“ oder auch „fluoreszent“ hier nur angibt, das das vereinzelte Molekül mit dem Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht bzw. Fluoreszenzlicht anregbar ist, nicht aber, dass es bereits luminesziert bzw. fluoresziert, d. h. angeregt ist.
  • Dass das Anregungslicht mit einer Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet wird, die in jeder der Raumrichtungen mindestens einen Intensitätsanstiegsbereich mit bekanntem, streng monotonem Verlauf der Intensität des Anregungslichts über einem Abstand zu einem Aufpunkt der Intensitätsverteilung aufweist, kann bedeuten, dass der Intensitätsanstiegsbereich durch in unterschiedlichem Abstand zu dem Aufpunkt unterschiedlich starke destruktive Interferenz ausgeformt wird. Weiterhin kann die Intensität des Anregungslichts in dem mindestens einen Intensitätsanstiegsbereich von null, d. h. zum Beispiel von einer vollständigen destruktiven Interferenz des Anregungslichts, ansteigen. Dann umfasst der Intensitätsanstiegsbereich insbesondere kleine Intensitäten des Anregungslichts, die das vereinzelte Molekül nur wenig durch Anregung zur Emission von Lumineszenzlicht beanspruchen. Dabei kann der Intensitätsanstiegsbereich an eine Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts angrenzen, an die auf der gegenüberliegenden Seit in der jeweiligen Raumrichtung ein weiterer Intensitätsanstiegsbereich angrenzt, wobei die beiden Intensitätsanstiegsbereiche in Bezug auf die Nullstelle symmetrisch zueinander ausgebildet sein können. Die Nullstelle kann zugleich als der Aufpunkt der Intensitätsverteilung des Anregungslichts verwendet werden, der sich dann in günstiger Weise nahe den kleinsten Intensitäten des Anregungslichts befindet, die das vereinzelte Molekül nur wenig beanspruchen. Allgemein ist der Aufpunkt der Intensitätsverteilung des Anregungslichts ein innerhalb der Intensitätsverteilung definierter Bezugspunkt, dessen jeweilige Position in der Probe definiert ist und der entsprechend an definierten Positionen in der Probe positionierbar ist. Wenn der Aufpunkt der Intensitätsverteilung des Anregungslichts eine Nullstelle ist, an die Intensitätsanstiegsbereiche angrenzen, steigt die Intensität des Anregungslichts über jeden dieser Intensitätsanstiegsbereich mit zunehmendem Abstand zu dem Aufpunkt streng monoton, das heißt kontinuierlich an. Je nach Art des Aufpunkts der Intensitätsverteilung kann die Intensität des Anregungslichts mit zunehmendem Abstand zu dem Aufpunkt aber auch streng monoton über die Intensitätsanstiegsbereiche hinweg abfallen.
  • Unabhängig davon, ob zwei an eine Nullstelle oder einen anderen Aufpunkt der Intensitätsverteilung des Anregungslichts anschließenden Intensitätsanstiegsbereiche symmetrisch zueinander ausgebildet sind, kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren von beiden Intensitätsanstiegsbereichen Gebrauch gemacht werden, indem beispielsweise im Schritt (i) Positionen des Aufpunkts auf unterschiedlichen Seiten des anfäglichen Ortsbereichs festgelegt werden.
  • Die Nullstelle kann eine durch Interferenz gebildete Ideale Nullstelle sein, in der die Intensität des Anregungslichts tatsächlich auf null zurückgeht. Eine geringe Restintensität des Anregungslichts in der Nullstelle ist jedoch unschädlich, zumal es nicht Kern des erfindungsgemäßen Verfahren ist, die Nullstelle, sofern sie in der Intensitätsverteilung des Anregungslichts vorhanden so, so in der Probe zu positionieren, dass ihre Position mit dem Ort des Moleküls in der Probe zusammenfällt. Aus demselben Grund kann die von den Intensitätsanstiegsbereichen begrenzte Nullstelle grundsätzlich auch durch in der jeweiligen Raumrichtung beabstandete gaußförmige Intensitätsverteilungen, konkret durch das zwischen diesen verbleibende Intensitätsminimum, ausgebildet werden. Weiterhin kann der mindestens eine Intensitätsanstiegsbereich auch durch eine Flanke nur einer gaußförmigen Intensitätsverteilung bereitgestellt werden. In diesem Fall ist jedoch der Schwerpunkt des zu der gaußförmigen Intensitätsverteilung fokussierten Anregungslichts ein von den besonders interessanten kleinen Intensitäten des Anregungslichts in dem Intensitätsanstiegsbereich relativ weit entfernter Aufpunkt der Intensitätsverteilung.
  • Auch mit einem nur in einer einzigen Raumrichtung verlaufenden Intensitätsanstiegsbereich kann der Ort des Moleküls in der Probe in zwei oder allen drei Raumrichtungen hoch aufgelöst bestimmt werden. Ebenso kann mit nur in zwei Raumrichtungen verlaufenden Intensitätsanstiegsbereichen der Ort des vereinzelten Moleküls in der Probe nicht nur in diesen zwei sondern auch in allen drei Raumrichtungen hoch aufgelöst bestimmt werden. Dazu ist das erfindungsgemäße Verfahren unter Ausrichtung des oder der Intensitätsanstiegsbereiche in unterschiedlichen Raumrichtungen durchzuführen. Dies kann für die verschiedenen Ausrichtungen des oder der Intensitätsanstiegsbereiche nacheinander oder auch quasi gleichzeitig erfolgen, beispielsweise unter Wiederholung der Schritte (i) und (ii) erst dann, wenn sie für alle Raumrichtungen der Ausrichtung des oder der Intensitätsanstiegsbereiche zumindest einmal durchgeführt wurden.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der anfängliche Ortsbereich, in dem das Molekül angeordnet ist, auf unterschiedliche Weise bestimmt werden. Beispiele hierfür werden weiter unten angegeben.
  • Dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren im Schritt (i) in jeder der Raumrichtungen die mindestens eine Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung so festgelegt wird, dass sich der mindestens eine Intensitätsanstiegsbereich in der jeweiligen Raumrichtung über den anfänglichen Ortsbereich erstreckt, bedeutet, dass sich das Molekül sicher in dem von dem Intensitätsanstiegsbereich in Bezug auf die Intensität des Lumineszenzlichts von dem Molekül beeinflusste Bereich der Intensitätsverteilung des Anregungslichts befindet.
  • Dass im Schritt (ii) Intensitätswerte des Lumineszenzlichts, die zu jeder der Raumrichtungen zwei Intensitätswerte umfassen, von welchen einer die Intensität des zu der mindestens einen Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung registrierten Lumineszenzlichts ist, ausgewertet werden, schließt nicht aus, dass der jeweilige zweite Intensitätswert zu der jeweiligen Raumrichtung für alle Raumrichtungen derselbe Wert ist, so dass in dem Schritt (ii) insgesamt nur n+1 Intensitätswerte ausgewertet werden, wobei „n“ die Anzahl der Raumrichtungen ist, in denen der Ort des vereinzelten Moleküls bestimmt wird. Grundsätzlich kann für jede Raumrichtung aber auch ein zusätzlicher Intensitätswert Berücksichtigung finden, so dass dann insgesamt 2n-Intensitätswerte ausgewertet werden.
  • Um in dem Schritt (ii) den weiteren Ortsbereich in der Probe zu bestimmen, in dem das Molekül angeordnet ist und der kleiner als der anfängliche Ortsbereich ist, ist die Abhängigkeit der Intensität des Lumineszenzlichts, das von dem vereinzelten Molekül emittiert wird, von dem Abstand des vereinzelten Moleküls zu dem Aufpunkt der Intensitätsverteilung des Anregungslichts zu berücksichtigen. Diese Abhängigkeit hängt von dem bekannten, in Richtung dieses Abstands streng monoton ansteigenden oder abfallenden Verlauf der Intensität des Anregungslichts in dem Intensitätsanstiegsbereich und auch von dem photophysikalischen Prozess ab, der der Anregung des Moleküls zur Emission des Lumineszenzlichts zugrunde liegt. So ergibt sich bei einem an eine durch destruktive Interferenz gebildeten Nullstelle angrenzenden Intensitätsanstiegsbereich und einer Photolumineszenz auf Basis eines Einphotonenprozesses näherungsweise eine quadratische Abhängigkeit der Intensität des von dem Molekül emittierten Lumineszenzlichts von dessen Abstand zu der Nullstelle. Bei einer Photolumineszenz auf Basis eines Zweiphotonenprozesses ist die Abhängigkeit noch ausgeprägter und folgt einer Funktion x4. Faktisch muss bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der streng monotone Verlauf der Intensität des Anregungslichts in dem Intensitätsanstiegsbereich nur insoweit bekannt sein, wie er sich auf die Intensität des Lumineszenzlichts von dem Molekül auswirkt. D. h., die Abhängigkeit der Intensität des Lumineszenzlichts vom Abstand des Moleküls zu dem Aufpunkt der Intensitätsverteilung des Anregungslichts muss bekannt sein, um sie bei der Bestimmung des weiteren Ortsbereichs berücksichtigen zu können. Diese Abhängigkeit lässt sich aber leicht bestimmen, beispielsweise empirisch durch Abtasten der Umgebung des Moleküls mit dem Intensitätsanstiegsbereich in kleinen Schritten.
  • Dass in dem Schritt (ii) der kleinere weitere Ortsbereich des Moleküls in der Probe aus Intensitätswerten des Lumineszenzlichts bestimmt wird, die zu jeder der Raumrichtungen zwei Intensitätswerte des Lumineszenzlichts umfassen, schließt nicht nur die Möglichkeit ein, verschiedene Raten von Photonen des Lumineszenzlichts zu berücksichtigen, sondern auch die Möglichkeit, zeitliche Abstände der registrierten Photonen zu betrachten. Dabei versteht es sich, dass der Mittelwert der zeitlichen Abstände der registrierten Photonen gleich dem Kehrwert der Rate der zu einer Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung des Anregungslichts registrierten Photonen des Lumineszenzlichts ist.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Schritte (i) und (ii) mindestens einmal wiederholt. D. h., der Ortsbereich, in dem sich das Molekül in der Probe befindet, wird gegenüber dem anfänglichen Ortsbereich zumindest zweimal verkleinert. Dies bedeutet, dass mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens zumindest zweimal der Ortsbereich des Moleküls in der Probe gegenüber seiner ersten Abschätzung eingeengt wird. Es können auch weitere Einengungen des Ortsbereichs auf dieselbe oder auf andere Weise erfolgen. Der nach den mindestens zwei Einengungen des anfänglichen Ortsbereichs erhaltene kleinere Ortsbereich kann aber auch direkt verwendet werden, um den Ort des vereinzelten Moleküls anzugeben, beispielsweise als Zentrum des Ortsbereichs mit dem Radius des Ortsbereichs als möglichem Fehler.
  • Der zweite Intensitätswert zu der jeweiligen Raumrichtung, der in dem Schritt (ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgewertet wird, kann eine Intensität des zu einer zweiten Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung in der Probe registrierten Lumineszenzlichts sein. Diese zweite Position kann in der jeweiligen Raumrichtung an anderer Stelle auf derselben Seite wie die mindestens eine Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung oder auf der der mindestens einen Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung gegenüberliegenden Seite des anfänglichen Ortsbereichs liegen. In jedem Fall wird die Auswirkung der unterschiedlichen Intensitäten des Anregungslichts in dem Intensitätsanstiegsbereich bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens an zwei Positionen des Aufpunkts der Intensitätsverteilung des Anregungslichts erfasst, von denen bekannt ist, wo sie in der jeweiligen Raumrichtung in Bezug auf den anfänglichen Ortsbereich des Moleküls liegen.
  • Unter Berücksichtigung des bekannten Verlaufs der Intensität des Anregungslichts in dem Intensitätsanstiegsbereich kann in Verbindung mit dem Abstand der Positionen des Aufpunkts in der jeweiligen Raumrichtung aus den zugehörigen Intensitäten des Lumineszenzlichts auf den tatsächlichen Ort des Moleküls in der jeweiligen Raumrichtung geschlossen werden. Auch bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens müssen für jede Raumrichtung nicht zwei separate Positionen des Aufpunkts bezüglich der dazu registrierten Intensitäten des Lumineszenzlichts berücksichtigt werden. Vielmehr können z. B. zur Bestimmung des Orts des Moleküls in zwei Raumrichtungen die Positionen des Aufpunkts in einer von diesen beiden Raumrichtungen aufgespannten Ebene in den Ecken eines Dreiecks liegen, also insgesamt nur drei Positionen umfassen. Entsprechend können die Positionen des Aufpunkts zur Bestimmung des Ortes in drei Raumrichtungen in den Ecken eines Tetraeders liegen. Grundsätzlich sind natürlich auch zwei separate Positionen des Aufpunkts je Raumrichtung möglich, in der der Ort des Moleküls bestimmt wird. Unter dem Gesichtspunkt, den Ort des Moleküls in der Probe mit möglichst wenig Photonen des Lumineszenzlichts zu bestimmen, ist die damit größere Zahl der Positionen des Aufpunkts in der Probe, zu denen das Lumineszenzlicht registriert wird, aber nicht unbedingt bevorzugt.
  • In einer anderen Ausführungsform ist der zweite Intensitätswert zu der jeweiligen Raumrichtung im Schritt (ii) ein Maß für die relative Leuchtstärke des vereinzelten Moleküls. Bei diesem Maß kann es sich konkret um eine Maximalintensität des Lumineszenzlichts von dem Molekül bei Anregung mit dem Anregungslicht oder um einen hiermit unmittelbar korrelierter Intensitätswert handeln. Die Maximalintensität oder der damit korrelierte Intensitätswert kann für das vereinzelte Molekül konkret gemessen oder auch für alle potentiellen vereinzelten Moleküle mit einem bestimmten Wert abgeschätzt werden.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Lumineszenzlicht zu den verschiedenen Positionen des Aufpunkts der Intensitätsverteilung in der Probe quasi gleichzeitig registriert werden, indem der Aufpunkt wiederholt zwischen den Positionen in der Probe verschoben wird. Zu diesem Zweck kann dieselbe Intensitätsverteilung des Anregungslichts mit Hilfe eines Scanners verschoben werden kann. Es ist aber auch möglich, die Intensitätsverteilung für jede der verschiedenen Positionen ihres Aufpunkts in der Probe neu auszubilden, beispielsweise mit Hilfe eines im Strahlengang des Anregungslichts angeordneten Spatial Light Modulators (SLM). Dann kann zumindest insoweit auf einen Scanner verzichtet werden. Weiterhin ist es möglich, den Aufpunkt der Intensitätsverteilung des Anregungslichts in der Probe zu verschieben, indem das Anregungslicht nacheinander durch ganz oder teilweise verschiedene Lichtquellen bereitgestellt wird. Bei allen diesen möglichen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der Aufpunkt der Intensitätsverteilung des Anregungslichts zwischen seinen Positionen in der Probe wiederholt hin und her verschoben werden. Es versteht sich, dass dabei das zu den einzelnen Positionen des Aufpunkts gehörige Lumineszenzlicht von dem Molekül getrennt registriert wird. Das quasi gleichzeitige Registrieren des Lumineszenzlicht zu den verschiedenen Positionen des Aufpunkts der Intensitätsverteilung des Anregungslichts hat den Vorteil, dass das Beaufschlagen der Probe mit dem Anregungslicht und das Registrieren des Lumineszenzlichts von der Probe sofort abgebrochen werden kann, wenn es die zu den einzelnen Positionen des Aufpunkts der Intensitätsverteilung des Anregungslichts registrierten Photonen des Lumineszenzlichts bereits erlauben, den anfänglichen Ortsbereich in der Probe, in dem das Molekül angeordnet ist, um ein vorgegebenes Maß einzuengen.
  • Ein entsprechendes Abbruchkriterium kann zwar auch bei einem kontinuierlichen Registrieren des Lumineszenzlichts zu jeder Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung des Anregungslichts in der Probe angewandt werden. Es gibt jedoch Fälle, in denen die Betrachtung der Intensitäten des zu allen Positionen des Aufpunkts der Intensitätsverteilung des Anregungslichts registrierten Lumineszenzlichts schon nach insgesamt weniger Photonen von dem Molekül erkennen lässt, dass der anfängliche Ortsbereich um ein gewünschtes Maß eingrenzbar ist.
  • Wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Lumineszenzlicht zu den Positionen des Aufpunkts der Intensitätsverteilung des Anregungslichts jeweils nur solange registriert wird, bis die Intensitäten des registrierten Lumineszenzlichts zu den Positionen mit einer ausreichenden Genauigkeit erfasst sind, dass der weitere Ortsbereich um einen vorgegebenen Wert kleiner als der anfängliche Wert bestimmbar ist, kann dieser vorgegebene Wert in einem Bereich von 5 % bis 75 % liegen. Dabei bezieht sich diese Angabe auf die Abmessung des Ortsbereichs in der jeweiligen Raumrichtung. Es versteht sich, dass die Intensitäten des zu den verschiedenen Positionen des Aufpunkts der Intensitätsverteilung des Anregungslichts registrierten Lumineszenzlichts umso genauer erfasst werden müssen, desto mehr der weitere Ortsbereich gegenüber dem anfänglichen Ortsbereich eingegrenzt werden soll. Eine geringere Eingrenzung erfordert eine geringere Genauigkeit bei der Erfassung der Intensitäten des Lumineszenzlichts zu den verschiedenen Positionen des Aufpunkts, aber auch mehr Wiederholungen der Schritte (i) und (ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens, um dieselbe Präzision zu erreichen. Hier kann in Bezug auf die Anzahl der Photonen des Lumineszenzlichts, die für das Erreichen einer bestimmten Präzision bei der Bestimmung des Orts des Moleküls in der Probe benötigt werden, eine Optimierung durchgeführt werden.
  • Wie bereits angesprochen wurde, sollte sich der gesamte anfängliche Ortsbereich an jeder Position des Aufpunkts in einem Bereich der Intensitätsverteilung des Anregungslichts befinden, in dem die Intensitäten in dem Intensitätsanstiegsbereich unter der Sättigungsintensität des Anregungslichts bleiben, über der eine weitere Erhöhung der Intensität des Anregungslichts keine höhere Intensität des Lumineszenzlichts von dem vereinzelten Molekül mehr zur Folge hat. Bevorzugt ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, wenn eine maximale Intensität, d. h. ein absolutes Intensitätsniveau des Anregungslichts jeweils so eingestellt wird, dass sich der anfängliche Ortsbereich bezüglich jeder in dem Schritt (i) festgelegten Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung des Anregungslichts in einem Bereich von nicht mehr als 90 % der Sättigungsintensität des Anregungslichts befindet.
  • Mit kleiner werdendem Ortsbereich kann die maximale Intensität des Anregungslichts erhöht werden. Auf diese Weise kann der kleiner werdende Ortsbereich wieder auf die volle Bandbreite der unterschiedlichen Intensitäten des Anregungslichts in dem Intensitätsanstiegsbereich und damit auf die volle Bandbreite der unterschiedlichen Intensitäten des Lumineszenzlichts von dem vereinzelten Molekül aufgeteilt werden.
  • Konkret kann die maximale Intensität des Anregungslichts über alle Wiederholungen der Schritte (i) und (ii) um mindestens 50 % erhöht werden. Sie kann aber auch um mindestens 100 % oder auch auf das 3-fache, 4-fache oder mehrfache ihres Anfangswerts erhöht werden.
  • Die Schritte (i) und (ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens können solange wiederholt werden, bis der weitere Ortsbereich in dem zuletzt durchgeführten Schritt (ii) nicht mehr größer als eine vorgegebene Präzision ist. Diese vorgegebene Präzision kann im Bereich von 20 nm oder kleiner liegen. Sie kann auch kleiner als 10 nm sein. Auch eine vorgegebene Präzision in der Größenordnung von 1 nm und damit herab bis zu 0,5 nm ist möglich. Grundsätzlich weist das erfindungsgemäße Verfahren keine inhärente Grenze für die bei der Bestimmung des Orts des vereinzelten Moleküls in der Probe erreichbare Präzision auf. Im jeweiligen Einzelfall auftretende Verhältnisse, wie beispielsweise ein abnehmendes Signal-zu-Rauschen-Verhältnis können jedoch die praktisch erreichbare Präzision begrenzen. So kann als Abbruchkriterium für das Wiederholen der Schritte (i) und (ii) bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch das Unterschreiten eines vorgegebenen Signal-zu-Rauschen-Verhältnisses oder einer Untergrenze für eine erreichte weitere Verkleinerung des Ortsbereichs festgelegt werden, in dem sich das vereinzelte Molekül in der Probe befindet.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls ein das vereinzelte Molekül umfassender Bereich der Probe in jeder der Raumrichtungen mit dem mindestens einen Intensitätsanstiegsbereich abgetastet werden, wobei aus dem Verlauf der Intensität des Lumineszenzlichts während des Abtastens der erste anfängliche Ortsbereich bestimmt wird. Dieses räumliche Abtasten zumindest eines Bereichs der Probe kann mit vergleichsweise geringer Intensität des Anregungslichts und in vergleichsweise großen räumlichen und kleinen zeitlichen Schritten durchgeführt werden, weil der anfängliche Ortsbereich hieraus nur grob bestimmt werden muss. Statt mit dem mindestens einen Intensitätsanstiegsbereich kann der das vereinzelte Molekül umfassende Bereich der Probe zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls mit einer gaußförmigen Intensitätsverteilung des Anregungslichts, d. h. mit einem einfachen fokussierten Strahl des Anregungslichts, in jeder der Raumrichtungen abgetastet werden. Dies entspricht einer konfokalmikroskopischen Abbildung des vereinzelten Moleküls in der Probe.
  • In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls das Anregungslichts mit einer gaußförmigen Intensitätsverteilung nur punktweise oder auf Kreis- oder Spiralbahnen auf einen das vereinzelte Molekül umfassenden Bereich der Probe gerichtet, wobei der erste anfängliche Ortsbereich aus dem Verlauf der Intensität des Lumineszenzlichts über die Punkte bzw. Bahnen bestimmt wird. Um dabei die Anzahl der von dem vereinzelten Molekül emittierten Photonen des Lumineszenzlichts zu begrenzen, ist die gaußförmige Intensitätsverteilung sehr schnell zu bewegen und/oder bezüglich der maximalen Intensität des Anregungslichts klein zu halten. Bei dem Bewegen der gaußförmigen Intensitätsverteilung auf Kreis- oder Spiralbahnen kann der Intensitätsanstiegsbereich in der Peripherie der gaußförmigen Intensitätsverteilung des Anregungslichts genutzt werden, um das vereinzelte Molekül nur mit geringer Intensität des Anregungslichts zu beaufschlagen, die aber ausreichend ist, um den anfänglichen Ortsbereich durch Lokalisierung des Moleküls zu bestimmen.
  • Bei noch einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls ein das vereinzelte Molekül umfassender Bereich der Probe räumlich, d. h. insgesamt, mit dem Anregungslicht beaufschlagt und auf einen das Lumineszenzlicht mit räumlicher Auflösung registrierenden Detektor, wie beispielsweise eine Kamera, abgebildet. Dann kann der erste anfängliche Ortsbereich aus der mit dem Detektor registrierten räumlichen Verteilung des Lumineszenzlichts bestimmt werden. Da der Ortsbereich bei dieser Bestimmung noch nicht besonders eingeengt werden muss, reichen hierfür wenige Photonen von dem vereinzelten Molekül aus.
  • Bei allen hier geschilderten, zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls durchführbaren Schritten, um den ersten anfänglichen Ortsbereich zu bestimmen, kann zugleich eine Maximalintensität des Lumineszenzlichts von dem Molekül bei Anregung mit dem Anregungslicht oder ein damit korrelierter Intensitätswert erfasst werden, die/der ein Maß für die relative Leuchtstärke des vereinzelten Moleküls ist.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Lumineszenzlicht auch grundsätzlich räumlich, beispielsweise mit einem räumlich auflösenden Detektor, wie einer Kamera, aber auch einem kleineren Array von beispielsweise nur 2x2 oder 3x3 Punktsensoren, registriert werden. Aus der Summe der über die verschiedenen Positionen des Aufpunkts des Anregungslichts registrierten Photonen des Lumineszenzlichts von dem vereinzelten Molekül kann dessen Position zusätzlich durch Lokalisierung bestimmt werden. Dabei kann ein sich bei der Lokalisierung ergebender anderer Ort des Moleküls in der Probe auf eine bestimmte Orientierung des Moleküls in der Probe hinweisen, weil zwar die Lokalisierung zur Bestimmung des Orts des Moleküls in der Probe von dessen Orientierung beeinflusst wird, nicht aber die erfindungsgemäße Bestimmung des Orts des Moleküls in der Probe. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kommt es nicht darauf an, wo das jeweilige von dem Molekül emittierte Photon registriert wird. Entsprechend kann das Lumineszenzlicht bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch mit einem Punktdetektor registriert werden.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Probe vor dem Bestimmen des Orts des vereinzelten Moleküls mit einem Schaltsignal beaufschlagt werden, das das Molekül von benachbarten gleichartigen Molekülen vereinzelt, indem es die benachbarten gleichartigen Moleküle - im Gegensatz zu dem vereinzelten Molekül - in einen Dunkelzustand schaltet, in dem sie mit dem Anregungslicht nicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar sind. Dieser Dunkelzustand kann ein anderer Konformationszustand der Moleküle sein, der nicht lumineszent ist. Es kann sich aber auch um einen elektronischen Dunkelzustand handeln. Alternativ kann das Schaltsignal nur das zu vereinzelnde Molekül in einen lumineszenten Zustand schalten. Das Schaltsignal kann Schaltlicht mit einer anderen Wellenlänge und Intensität als das Anregungslicht sein. Es kann aber auch dieselbe Wellenlänge wie und nur eine andere Intensität als das Anregungslicht aufweisen. Grundsätzlich kann das Schaltsignal auch das Anregungslicht selbst sein.
  • Eine wiederholte Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann zum Bestimmen des Orts einer Vielzahl von nacheinander vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission des Lumineszenzlichts anregbaren Molekülen genutzt werden, die eine interessierende Struktur in der Probe markieren. In einer anderen Ausführungsform dient eine wiederholte Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Verfolgen des sich in der Probe bewegenden vereinzelten Moleküls. Dabei kann der erste anfängliche Ortsbereich bei jeder Wiederholung des erfindungsgemäßen Verfahrens der kleinste zuvor bestimmte weitere Ortsbereich des Moleküls plus ein diesen umgebender Fehlerbereich sein. Die Breite dieses Fehlerbereichs ist auf die maximale Bewegungsgeschwindigkeit des Moleküls in der Probe abzustimmen.
  • Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann ein STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskop verwendet werden, wobei das durch das STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskop bereitgestellte STED-Licht mit einer von Intensitätsmaxima benachbarten Nullstelle als das Anregungslicht verwendet wird.
  • Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beigefügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnungen - insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
  • Die in den Patentansprüchen und der Beschreibung genannten Merkmale sind bezüglich ihrer Anzahl so zu verstehen, dass genau diese Anzahl oder eine größere Anzahl als die genannte Anzahl vorhanden ist, ohne dass es einer expliziten Verwendung des Adverbs „mindestens“ bedarf. Wenn also beispielsweise von einem vereinzelten Molekül die Rede ist, ist dies so zu verstehen, dass genau ein vereinzeltes Molekül, zwei vereinzelte Moleküle oder mehr vereinzelte Moleküle vorhanden sind, deren Orte bestimmt werden. Die in den Patentansprüchen angeführten Merkmale können durch andere Merkmale ergänzt werden oder die einzigen Merkmale sein, die der beanspruchte Gegenstand aufweist.
  • Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Umfangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.
  • Weitere Informationen zu möglichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können der WO 2015/097000 A1 entnommen werden. Alles was dort offenbart ist und nicht im Widerspruch zu der vorliegenden Erfindung steht, kann auch bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung realisiert werden.
  • Figurenliste
  • Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
    • 1 zeigt schematisch ein STED-Mikroskop, das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Bestimmen des Orts eines vereinzelten, mit Anregungslicht zur Emission von Lumineszenzlicht anregbaren Moleküls in einer Probe verwendbar ist.
    • 2 zeigt einen Schnitt durch eine Intensitätsverteilung von Anregungslicht mit einer von Intensitätsmaxima benachbarten Nullstelle, das bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem STED-Mikroskop gemäß 1 auf eine Probe gerichtet wird, und resultierende Intensitäten von Lumineszenzlicht, das von dem an den jeweiligen Ort in der Probe angeordneten lumineszenten Molekül emittiert wird.
    • 3 illustriert eine erste Durchführung von Schritten des erfindungsgemäßen Verfahrens in Bezug auf einen ersten anfänglichen Ortsbereich des vereinzelten Moleküls in der Probe.
    • 4 illustriert eine zweite Durchführung der Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens in Bezug auf einen verkleinerten anfänglichen Ortsbereich des vereinzelten Moleküls in der Probe.
    • 5 illustriert eine alternative Ausführungsform einer Durchführung der Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer gaußförmigen Intensitätsverteilung des Anregungslichts.
    • 6 illustriert zwei aufeinanderfolgende Durchführungen der Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer ersten Relativanordnung von Positionen eines Aufpunkts der Intensitätsverteilung des Anregungslichts in Bezug auf die anfänglichen Ortsbereiche.
    • 7 illustriert zwei aufeinanderfolgende Durchführungen der Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer anderen Relativanordnung der Positionen des Aufpunkts der Intensitätsverteilung des Anregungslichts in Bezug auf die anfänglichen Ortbereiche.
    • 8 ist ein Blockdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung des Orts eines vereinzelten Moleküls in einer Probe.
    • 9 ist ein Blockdiagramm einer wiederholten Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Abbildung einer mit vereinzelbaren Molekülen markierten Struktur in einer Probe; und
    • 10 ist ein Blockdiagramm einer wiederholten Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Tracken einer Bewegung eines vereinzelten Moleküls in einer Probe.
  • FIGURENBESCHREIBUNG
  • 1 zeigt schematisch ein STED-Fluoreszenzlicht-Mikroskop 1, mit dem ein erfindungsgemäßes Verfahren durchführbar ist. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nicht notwendigerweise alle Bestandteile des STED-Fluoreszenzlichtmikroskops 1 verwendet. Das STED-Fluoreszenzlichtmikroskop 1 umfasst jedoch alle Bestandteile, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendig sind. Eine Lichtquelle 2, die bei der üblichen Verwendung des STED-Fluoreszenzlichtmikroskops 1 STED-Licht bereitstellt, stellt bei der Verwendung des STED-Fluoreszenzlichtmikroskops 1 zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Anregungslicht 3 bereit. Mit Strahlformungsmitteln 4 wird das Anregungslicht 3 so geformt, dass es im Fokus eines Objektivs 5 eine Intensitätsverteilung mit mindestens einem Intensitätsanstiegsbereich aufweist. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist das Anregungslicht 3 im Fokus des Objektivs 5 eine Intensitätsverteilung mit einer Nullstelle auf, der in allen Raumrichtungen, in denen der Ort eines vereinzelten Moleküls in einer Probe 6 bestimmt werden soll, Intensitätsmaxima auf beiden Seiten benachbart sind. Die Flanken dieser Intensitätsmaxima bilden dann die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren genutzten Intensitätsanstiegsbereiche aus. Die Strahlformungsmittel 4 können ausschließlich passive Komponenten oder auch eine aktive Optik, wie beispielsweise einen Spatial Light Modulator (SLM) umfassen. Eine weitere Lichtquelle 7 des STED-Fluoreszenzlicht-Mikroskops 1, die bei seiner üblichen Verwendung Anregungslicht bereitstellt, kann bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Schaltlicht 8 bereitstellen, um das Molekül in der Probe 6 zu vereinzeln, dessen Ort in der Probe anschließend bestimmt wird. Das Vereinzeln des Moleküls kann dabei darauf basieren, dass andere gleichartige Moleküle mit dem Schaltlicht 8 in einen Dunkelzustand geschaltet werden, in dem sie nicht mit dem Anregungslicht 3 zur Emission von Lumineszenzlicht anregbar sind. Das Schaltlicht 8 wird in den Strahlengang des Anregungslichts 3 eingekoppelt, wozu hier ein dichroitischer Strahlteiler 9 vorgesehen ist. Mit einem Scanner 10 wird der Anstiegsbereich bzw. die Nullstelle des Anregungslichts 3 in der Probe 6 verschoben. Über einen dichroitischen Strahlteiler 11, der von der Probe 6 aus vor dem Scanner 10 angeordnet ist, wird Lumineszenzlicht 12 von der Probe 6 aus dem Strahlengang des Anregungslichts 3 ausgekoppelt und mit einer Optik 13 auf eine Kamera 14 abgebildet. Die Kamera 14 ist ein Beispiel für einen räumlich auflösenden Detektor für das Lumineszenzlicht 12. Alternativ hierzu wird mit einem dichroitischen Strahlteiler 15 das Lumineszenzlicht 12 von der Probe 6 einem Punktdetektor 16 mit einer vorgeschalteten Lochblende 17 zugeführt. Das Lumineszenzlicht 12 aus der Probe 6 stammt von dem vereinzelten Molekül, das mit dem Anregungslicht 3 zur Emission des Lumineszenzlichts angeregt wird. Der dieser Emission von Lumineszenzlicht zugrundeliegende Vorgang ist Photolumineszenz, insbesondere Fluoreszenz. Die Probe 6 ist auf einem Probenhalter 18 angeordnet. Mit dem Probenhalter 18 kann die Probe beispielsweise zusätzlich in z-Richtung, d. h. in Richtung der optischen Achse des Objektivs 5 verlagert werden, um den Intensitätsanstiegsbereich bzw. die Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts 3 auch in dieser Richtung in der Probe 6 zu verlagern, insbesondere wenn die Nullstelle auch in z-Richtung von Intensitätsmaxima benachbart ist. Auf die Kamera 14 wird die Probe 6 so abgebildet, dass eine Lokalisierung des vereinzelten Moleküls aus der räumlichen Verteilung der Photonen des Lumineszenzlichts 12 von dem Molekül über der Kamera 14 möglich ist. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird jedoch zumindest zusätzlich der Ort des Moleküls in der Probe 6 aufgrund der Intensitäten des Lumineszenzlichts 12 bei unterschiedlicher Anordnung des Intensitätsanstiegsbereichs bzw. der Nullstelle der Intensitätsverteilung des Anregungslichts 3 in der Probe 6 bestimmt.
  • In 2 ist die Intensitätsverteilung 19 des Anregungslichts 3 längs eines Schnitts in x-Richtung quer zur optischen Achse des Objektivs 5 gemäß 1 gezeigt. Die Intensitätsverteilung umfasst eine zentrale Nullstelle 20, in der die Intensität IA des Anregungslichts 3 bis auf null oder zumindest nahe null zurückgeht. Dieser Nullstelle 20 sind auf beiden Seiten Intensitätsmaxima 21 benachbart. Zwischen der Nullstelle 20 und den Intensitätsmaxima 21 sind Intensitätsanstiegsbereiche 22 ausgebildet. In diesen Intensitätsanstiegsbereichen 22 steigt die Intensität IA des Anregungslichts 3 von null auf eine Sättigungsintensität IS und darüber hinaus an. Bei der Sättigungsintensität IS erreicht die Intensität L des mit dem Anregungslicht 3 angeregten Lumineszenzlichts 12 einen Sättigungswert ISW , über den hinaus die Intensität L nicht weiter ansteigt. Die Intensitätsverteilung 19 des Anregungslichts 3 ist symmetrisch zu der Nullstelle 20 ausgebildet, d. h. die Intensitätsanstiegsbereiche verlaufen symmetrisch zueinander.
  • 3 gibt für eine Lage der Nullstelle 20 bei xN die resultierende Intensität L des Lumineszenzlichts 12 in Abhängigkeit von dem Ort x des vereinzelten Moleküls in der Probe an. Die Intensität L steigt über die Intensitätsanstiegsbereiche 22 von null auf den Sättigungswert ISW an. Dies wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wie folgt genutzt. Beispielsweise aus der Verteilung des Lumineszenzlichts 12 von dem vereinzelten Molekül über der Kamera 14 bei räumlicher Beleuchtung der Probe 6 mit dem Anregungslicht 3 gemäß 1 wird ein anfänglicher Ortsbereich 23 bestimmt, in dem sich der Ort des Moleküls in der Probe 6 befindet. Durch Positionieren der Nullstelle 20 mit Hilfe des Scanners 10 gemäß 1 an einer Position xN1 wird der hier linke Intensitätsbereich 22 so in der Probe 6 angeordnet, dass er den anfänglichen Ortsbereich 23 überspannt. Dann wird während des Beaufschlagens der Probe 6 mit dem Anregungslicht 3 das von dem an dem tatsächlichen Ort x0 befindlichen Molekül emittierte Lumineszenzlicht 12 registriert und dessen Intensität I1 bestimmt. Die Genauigkeit, mit der die Intensität I1 bestimmt wird, hängt von der Anzahl der Photonen des Lumineszenzlichts 12 ab, die zu dieser Position xN1 der Nullstelle registriert wird. Wenn die Intensität I1 ebenso wie der Sättigungswert Isw genau bekannt wären, könnte aus dem bekannten Verlauf der Intensität L über den Abstand zu der Nullstelle 20 exakt auf den Ort x0 des vereinzelten Moleküls geschlossen werden. Mit einer begrenzten Anzahl von Photonen, die zur Bestimmung der Intensität I1 registriert werden, verbleibt hier jedoch ein Fehler. Ebenso verbleibt ein Fehler bei der Bestimmung des Sättigungswerts Isw beispielsweise aus den anfangs mit der Kamera 14 registrierten Photonen des Lumineszenzlichts 12 von dem Molekül. Hingegen ist der Verlauf der Intensität L des Lumineszenzlichts 12 recht genau bestimmbar. In der Nähe der Nullstelle 20 ist er bei Anregung des Moleküls zur Emission des Lumineszenzlichts 12 durch einen Einphotonenprozess in aller Regel quadratisch von dem Abstand zu der Nullstelle 20 abhängig. Trotz der Ungenauigkeiten bei der Bestimmung von I1 und ISW lässt sich daher aufgrund der Messung von I1 ein weiterer Ortsbereich 24 bestimmen, in dem der Ort x0 des Moleküls liegt und der deutlich kleiner als der Ortsbereich 23 ist. Dieser weitere Ortsbereich 24 ist in 3 für bestimmte fehlerbehaftete Messwerte von I1 und ISW eingezeichnet.
  • 4 zeigt, wie die Kenntnis über den weiteren Ortsbereich 24 bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur neuerlichen Positionierung der Nullstelle 20 jetzt an der Position xN2 genutzt wird, um den tatsächlichen Ort x0 des Moleküls mit noch höherer Präzision, d. h. räumlicher Auflösung, in der Probe 6 zu bestimmen. Hierzu wird die Position xN2 der Nullstelle 20 wieder so angeordnet, dass sich der linke Intensitätsanstiegsbereich 22 über den Ortsbereich 24 hinweg erstreckt. Zudem wird die absolute Intensität des Anregungslichts 3 so erhöht, dass der Sättigungswert Isw des Lumineszenzlichts 12 über einen kleineren Abstand zu der Nullstelle 20 erreicht wird. Dann wird zu dieser Position xN2 der Nullstelle 20 die Intensität I2 des Lumineszenzlichts 12 von dem Molekül bestimmt. Aus dieser Intensität I2 und dem Sättigungswert Isw kann dann ein weiterer Ortsbereich 25 bestimmt werden, in dem sich das Molekül in der Probe 6 befindet und der wieder kleiner als der Ortsbereich 24 ist. Dieser weitere Ortsbereich 25 kann dann zur Positionierung der Nullstelle 20 an noch einer weiteren Position in der Probe 6 genutzt werden, um den Ort x0 des Moleküls in der Probe mit noch höherer Präzision zu bestimmen. Der Ortsbereich 25 gibt aber den Ort x0 des Moleküls in der Probe bereits mit sehr viel höherer Genauigkeit als der anfängliche Ortsbereich 23 an. Tatsächlich kann der Ort x0 des Moleküls in der Probe 6 mit dem erfindungsgemäßen Verfahren praktisch mit einem Fehler von nicht mehr als der Größenordnung von 1 nm bestimmt werden.
  • Statt den weiteren Ortsbereich 24, 25 aus der Intensität I1 bzw. I2 und dem Sättigungswert Isw der Intensität L des Lumineszenzlichts 12 zu bestimmen, kann die Nullstelle 20 auch an zwei verschiedenen Positionen xN1a und xN1b in der Probe angeordnet werden, um die zugehörigen Intensitäten des Lumineszenzlichts 12 zu messen und dann kann aus diesen zwei Intensitäten und dem Verlauf der Intensität L über den Abstand zu der Nullstelle 20 der weitere Ortsbereich 24, 25 bestimmt werden, ohne dabei auf den Sättigungswert Isw zurückgreifen zu müssen.
  • 5 illustriert ein entsprechendes Vorgehen bei einer gaußförmigen Intensitätsverteilung des Anregungslichts 3, die hier mangels Erreichens eines Sättigungsgrenzwerts in einer ebenfalls gaußförmige Intensitätsverteilung des Lumineszenzlichts 12 resultiert. Die Intensitätsanstiegsbereiche 22 finden sich dabei an den Flanken der gaußförmigen Intensitätsverteilungen. Um den anfänglichen Ortsbereich 23 des Orts x0 des Moleküls in der Probe 6 einzugrenzen, wird hier der Schwerpunkt 26 der gaußförmigen Intensitätsverteilung des Anregungslichts 3 an zwei unterschiedlichen Positionen xG1a und xG1b positioniert, so dass jeweils der in 5 linke Intensitätsanstiegsbereich 22 den anfänglichen Ortsbereich 23 überspannt. Zu jeder dieser Positionen xG1a und xG1b wird die Intensität I1a, bzw. I1b des Lumineszenzlichts 12 von dem Molekül registriert. Aus den Intensitäten I1a und I1b wird zusammen mit dem Verlauf der Intensität L des Lumineszenzlichts 12 über dem Abstand zu dem Schwerpunkt 26 ein kleinerer weiterer Ortsbereich 24 bestimmt, in dem sich der Ort x0 des Moleküls in der Probe 6 befindet. Dabei ist zu berücksichtigen, dass 5 nicht im demselben Maßstab dargestellt ist wie die 3 und 4 und dass dann, wenn vorteilhafter Weise möglichst niedrige Intensitäten des Anregungslichts 3 in den Anstiegsbereichen 22 genutzt werden, um das vereinzelte Molekül möglichst wenig zu beanspruchen, die Possitionen xG1a , xG1b des Aufpunkts der Intensitätsverteilung IA des Anregungslichts 3 viel weiter weg von dem interessierenden Ort x0 des Moleküls in der Probe angeordnet werden müssen als die Positionen xN1 bzw. xN2 der Nullstelle 20. Dies liegt daran, dass die gaußförmige Intensitätsverteilung IA des Anregungslichts 3 eine Halbwertsbreite von der Beugungsgrenze bei der Wellenlänge des Anregungslichts 3 aufweist, und die Bereiche kleiner Intensität IA des Anregungslichts 3 etwa diese Halbwertsbreite von dem Schwerpunkt 26 entfernt sind, während die kleinen Intensitäten des Anregungslichts 3 in den Intensitätsanstiegsbereichen 22 bei der Intensitätsverteilung des Anregungslichts 3 mit der Nullstelle 20 direkt an die Nullstelle 20 angrenzen.
  • 6 zeigt den anfänglichen Ortsbereich 23 des Moleküls in der Probe 6 in einer x-y-Ebene senkrecht zur optischen Achse des Objektivs 5 gemäß 1. Um diesen Ortsbereich herum sind vier gleich beabstandete Positionen der Nullstelle 20 als Aufpunkt der Intensitätsverteilung des Anregungslichts 3 gemäß 2 eingezeichnet. Wenn zu jeder dieser Positionen der Nullstelle 20 die Intensität des Lumineszenzlichts von dem Molekül 27 registriert wird, kann daraus der weitere Ortsbereich 24 bestimmt werden. Dabei ist eine der in 6 dargestellten Position der Nullstelle 20 nur fakultativ, was bei der hier oben rechts dargestellten Position zeichnerisch angedeutet ist. Entsprechend kann in einem nächsten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens der weitere Ortsbereich 24 durch Positionieren der Nullstelle 20 an daran angrenzenden Positionen weiter auf den weiteren Ortsbereich 25 eingeschränkt werden, der den Ort des Moleküls 27 in der Probe 6 mit noch kleinerem Fehler angibt. Auch hier ist eine der in 6 dargestellte Position der Nullstelle 20 fakultativ, was wieder oben rechts zeichnerisch angedeutet ist.
  • 7 zeigt eine andere Anordnung der Nullstelle 20 gegenüber dem anfänglichen Ortsbereich 23 und dem weiteren Ortsbereich 24 in jeweils drei gleich beabstandeten Positionen. Auch diese drei Positionen umfassen je Raumrichtung x und y, in denen der Ort des Moleküls 27 bestimmt wird, mindestens zwei verschiedene Positionen.
  • Das in den 6 und 7 für zwei Dimensionen illustrierte Vorgehen kann auch auf drei Dimensionen ausgeweitet werden. Dazu sind zu jedem Ortsbereich 23-25 jeweils mindestens vier Positionen der Nullstelle 20 festzulegen.
  • 8 ist ein Blockdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Nach dem Start 28 erfolgt ein Bestimmen 29 des anfänglichen Ortsbereichs 23. Dann erfolgt für den bestimmten Ortsbereich ein Festlegen 30 von Positionen des Aufpunkts, d. h. der Nullstelle 20 oder des Schwerpunkts 26. Im folgenden Schritt 31 wird die Intensitätsverteilung des Anregungslichts 3 unter Anordnung des Aufpunkts an den Positionen auf die Probe 6 gerichtet und das von dem vereinzelten Molekül in der Probe 6 emittierte Lumineszenzlicht wird registriert. Auf Basis der in dem Schritt 31 erfassten Intensitäten des Lumineszenzlichts erfolgt dann ein Bestimmen 32 eines weiteren Ortsbereichs 24, ggf. unter zusätzlicher Verwendung des Sättigungswerts Isw des Lumineszenzlichts von dem Molekül. Anschließend findet eine Überprüfung 33 statt, ob die durch die Abmessung des Ortsbereichs 24 gegebene Präzision bereits eine Vorgabe für diese Präzision erfüllt. Wenn die Überprüfung 33 ergibt, dass die Präzision noch nicht hoch genug ist, werden die Schritte 30-32 wiederholt, wobei beim Festlegen 30 die Positionen des Aufpunkts relativ zu dem weiteren Ortsbereich 24 festgelegt werden. Wenn die Überprüfung 33 ein positives Ergebnis hat, ist das Ende 34 des Verfahrens für die Bestimmung des Orts des Moleküls 27 in der Probe 6 erreicht.
  • 9 ist ein Blockdiagramm eines Verfahrens, bei dem das Verfahren gemäß 8 bezüglich seiner Schritte 29-33 wiederholt durchgeführt wird. Hier erfolgt nach dem Start 28 zunächst ein Vereinzeln 35 der Moleküle. Dann werden in einer Routine 36 unter Anwendung der Schritte 29-33 für jedes der vereinzelten Moleküle deren Orte bestimmt. Bei einer Überprüfung 37 wird festgestellt, ob eine mit den Molekülen markierte Struktur bereits mit ausreichendem Detaillierungsgrad abgebildet ist. Wenn nein, werden von den Molekülen, die die Struktur markieren, erneut einige vereinzelt. Wenn die markierte Struktur bei der Überprüfung 37 als ausreichend abgebildet angesehen wird, ist das Ende 34 erreicht.
  • 10 ist ein Blockdiagramm für eine wiederholte Ausführung der Schritte 29-33 gemäß 8 zum Tracken eines vereinzelten Moleküls 27 in der Probe 6. Dazu wird nach dem Start 28 der momentane Ort des Moleküls 27 mit der gewünschten Genauigkeit durch Ausführung der Schritte 29-33 bestimmt. Anschließend wird optional gewartet 38 oder es wird sofort erneut der aktuelle Ort des Moleküls in der Probe 6 bestimmt. Bei jeder der Wiederholungen des Bestimmens des Orts des Moleküls 27 mit den Schritten 29-33 kann der zuletzt bestimmte kleinste Ortsbereich des Moleküls 27 in der Probe 6 auf einen neuen anfänglichen Ortsbereich zentrisch aufgeweitet werden, der dann als anfänglicher Ortsbereich 23 für die neuerliche Durchführung der Schritte 29-33 verwendet wird. Die Aufweitung des zuletzt bestimmten kleinsten Ortsbereichs istso vorzunehmen, dass sich das Molekül 27 in der Zwischenzeit noch nicht aus dem aufgeweiteten Ortsbereich heraus bewegt haben kann.
  • Bezugszeichenliste
    • 1
    STED-Fluoreszenzlichtmikroskop
    2
    Lichtquelle
    3
    Anregungslicht
    4
    Strahlformungsmittel
    5
    Objektiv
    6
    Probe
    7
    Lichtquelle
    8
    Schaltlicht
    9
    dichroitischer Strahlteiler
    10
    Scanner
    11
    dichroitischer Strahlteiler
    12
    Lumineszenzlicht
    13
    Optik
    14
    Kamera
    15
    dichroitischer Strahlteiler
    16
    Punktdetektor
    17
    Lochblende
    18
    Probenhalter
    19
    Intensitätsverteilung
    20
    Nullstelle (Aufpunkt) der Intensitätsverteilung 19 des Anregungslichts 3
    21
    Maximum
    22
    Intensitätsanstiegsbereich
    23
    anfänglicher Ortsbereich
    24
    weiterer Ortsbereich
    25
    weiterer Ortsbereich
    26
    Schwerpunkt (Aufpunkt) der Intensitätsverteilung 19 des Anregungslichts 3
    27
    Molekül
    28
    Start
    29
    Bestimmen
    30
    Festlegen
    31
    Schritt
    32
    Bestimmen
    33
    Überprüfung
    34
    Ende
    35
    Vereinzeln
    36
    Routine
    37
    Überprüfung
    38
    Warten
    IA
    Intensität des Anregungslichts 3
    L
    Intensität des Lumineszenzlichts 12
    IS
    Sättigungsintensität des Anregungslichts 3
    ISW
    Sättigungswert der Intensität L des Lumineszenzlichts 12
    x0
    Ort des Moleküls 27 in der Probe 6
    xN1
    Position der Nullstelle 20 der Intensitätsverteilung 19 des Anregungslichts 3
    xN2
    Position der Nullstelle 20 der Intensitätsverteilung 19 des Anregungslichts 3
    xG1a
    Position des Schwerpunkts 26 der Intensitätsverteilung 19 des Anregungslichts 3
    XG1b
    Position des Schwerpunkts 26 der Intensitätsverteilung 19 des Anregungslichts 3

Claims (22)

  1. Verfahren zum räumlich hochauflösenden Bestimmen des Orts eines vereinzelten Moleküls (27) in einer oder mehreren Raumrichtungen in einer Probe (6), wobei das Molekül (27) mit Anregungslicht (3) zur Emission von Lumineszenzlicht (12) anregbar ist, - wobei das Anregungslicht (3) mit einer Intensitätsverteilung (19) auf die Probe (6) gerichtet wird, die in jeder der Raumrichtungen mindestens einen Intensitätsanstiegsbereich (22) mit bekanntem streng monotonem Verlauf der Intensität (IA) des Anregungslichts (3) über einen Abstand zu einem Aufpunkt (20, 26) der Intensitätsverteilung (19) aufweist, - wobei der Aufpunkt (20, 26) der Intensitätsverteilung (19) in jeder der Raumrichtungen an verschiedenen Positionen in der Probe (6) angeordnet wird, - wobei zu jeder Position des Aufpunkts (20, 26) der Intensitätsverteilung (19) in der Probe (6) das von dem Molekül (27) emittierte Lumineszenzlicht (12) registriert wird und - wobei der Ort des Moleküls in der Probe (x0) von Intensitäten des registrierten Lumineszenzlichts (12) abgeleitet wird, dadurch gekennzeichnet, - dass ein anfänglicher Ortsbereich (23) in der Probe (6) bestimmt wird, in dem das Molekül (27) angeordnet ist, - dass (i) in jeder der Raumrichtungen mindestens eine Position des Aufpunkts (20, 26) der Intensitätsverteilung (19) so festgelegt wird, dass sich der mindestens eine Intensitätsanstiegsbereich (22) in der jeweiligen Raumrichtung über den anfänglichen Ortsbereich (23) erstreckt, - dass (ii) aus Intensitätswerten (I1, ISW, I1a, I1b) des Lumineszenzlichts (12), die zu jeder der Raumrichtungen zwei Intensitätswerte (I1, ISW bzw. I1a, I1b) umfassen, von welchen einer (I1 bzw. I1a) die Intensität des zu der mindestens einen Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung (19) registrierten Lumineszenzlichts (12) angibt, ein weiterer Ortsbereich (24, 25) in der Probe (6) bestimmt wird, in dem das Molekül (27) angeordnet ist und der kleiner als der anfängliche Ortsbereich (23) ist, und - dass die Schritte (i) und (ii) mindestens einmal unter Verwendung des weiteren Ortsbereichs als neuer anfänglicher Ortsbereich (23) wiederholt werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität (IA) des Anregungslichts (3) in dem mindestens einen Intensitätsanstiegsbereich (22) von null ansteigt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Aufpunkt eine Nullstelle (20) der Intensitätsverteilung (19) ist, an die sich in jeder der Raumrichtungen auf einer Seite der mindestens eine Intensitätsanstiegsbereich (22) und auf der gegenüberliegenden Seite ein weiterer Intensitätsanstiegsbereich (22) anschließt.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Intensitätsanstiegsbereich (22) und der weitere Intensitätsanstiegsbereich (22) symmetrisch zu der Nullstelle (20) ausgebildet sind.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Intensitätswert zu der jeweiligen Raumrichtung eine Intensität (I1b) des zu einer zweiten Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung (19) registrierten Lumineszenzlichts (12) ist, die in der jeweiligen Raumrichtung an anderer Stelle auf derselben Seite wie die mindestens eine Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung (19) oder auf der der mindestens einen Position des Aufpunkts der Intensitätsverteilung (19) gegenüberliegenden Seite des anfänglichen Ortsbereichs (23) liegt.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der Positionen, die bei jeder Ausführung des Schritts (i) festgelegt werden, zwischen n+1 und 2n liegt, wobei n die Anzahl der Raumrichtungen ist, in denen das Molekül (27) lokalisiert wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Intensitätswert zu der jeweiligen Raumrichtung einen Sättigungswert (ISW) der Intensität (IL) des Lumineszenzlichts (12) von dem Molekül (27) bei Anregung mit dem Anregungslicht (3) ist.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lumineszenzlicht (12) zu den Positionen des Aufpunkts der Intensitätsverteilung (19) quasi gleichzeitig registriert wird, indem der Aufpunkt (20, 26) wiederholt zwischen den Positionen verschoben wird.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lumineszenzlicht (12) zu den Positionen des Aufpunkts (20, 26) der Intensitätsverteilung (19) nur so lange registriert wird, bis die Intensitäten des registrierten Lumineszenzlichts (12) zu den Positionen mit einer ausreichenden Genauigkeit erfasst sind, so dass der weitere Ortsbereich (24, 25) um einen vorgegebenen Wert kleiner als der anfängliche Ortsbereich (23) bestimmbar ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der vorgegebene Wert, um den der weitere Ortsbereich (24, 25) in der jeweiligen Raumrichtung kleiner als der anfängliche Ortsbereich (23) bestimmbar ist, in einem Bereich von 5 % bis 75 % liegt.
  11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine maximale Intensität des Anregungslichts (3) so eingestellt wird, dass sich der anfängliche Ortsbereich (23) bezüglich jeder Position des Aufpunkts (20, 26) der Intensitätsverteilung (19) in einem Bereich von nicht mehr als 90 % einer Sättigungsintensität (ls) des Anregungslichts (3) befindet.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die maximale Intensität des Anregungslichts (3) bei mindestens einer Wiederholung der Schritte (i) und (ii) erhöht wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die maximale Intensität des Anregungslichts (3) über alle Wiederholungen der Schritte (i) und (ii) um mindestens 50 % erhöht wird.
  14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (i) und (ii) solange wiederholt werden, bis der weitere Ortsbereich (24, 25) nicht mehr größer als eine vorgegebene Präzision ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die vorgegebene Präzision im Bereich zwischen 0,5 und 20 nm liegt.
  16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein das vereinzelte Molekül (27) umfassender Bereich der Probe (6) zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls (27) mit dem mindestens einen Intensitätsanstiegsbereich (22) oder einer gaußförmigen Intensitätsverteilung (19) des Anregungslichts (3) in jeder der Raumrichtungen abgetastet wird, wobei aus dem Verlauf der Intensität (IL) des Lumineszenzlichts (12) während des Abtastens der erste anfängliche Ortsbereich (23) bestimmt wird.
  17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht (3) zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls (27) mit einer gaußförmigen Intensitätsverteilung (19) punktweise oder auf Kreis- oder Spiralbahnen auf einen das vereinzelte Molekül (27) umfassenden Bereich der Probe (6) gerichtet wird, wobei der erste anfängliche Ortsbereich (23) aus dem Verlauf der Intensität (IL) des Lumineszenzlichts (12) über die Punkte bzw. Bahnen bestimmt wird.
  18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein das vereinzelte Molekül (27) umfassender Bereich der Probe (6) zu Beginn des Bestimmens des Orts des vereinzelten Moleküls (27) räumlich mit dem Anregungslicht (3) beaufschlagt und auf einen räumlich auflösenden Detektor abgebildet wird, wobei aus einer räumlichen Verteilung des mit dem Detektor registrierten Lumineszenzlichts (12) der erste anfängliche Ortsbereich (23) bestimmt wird.
  19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lumineszenzlicht (12) mit räumlicher Auflösung registriert wird, wobei zusätzlich eine räumliche Verteilung des insgesamt registrierten Lumineszenzlichts (12) hinsichtlich des Orts des Moleküls (27) in der Probe (6) ausgewertet wird.
  20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (6) vor dem Bestimmen des Orts des vereinzelten Moleküls (27) mit einem Schaltsignal beaufschlagt wird, das das Molekül (27) von benachbarten gleichartigen Molekülen vereinzelt, indem die benachbarten gleichartigen Moleküle (27) nach dem Vereinzeln - im Gegensatz zu dem vereinzelten Molekül (27) - mit dem Anregungslicht (3) nicht zur Emission von Lumineszenzlicht (12) anregbar sind.
  21. Wiederholte Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum Bestimmen des Orts einer Vielzahl von nacheinander vereinzelten, mit Anregungslicht (3) zur Emission des Lumineszenzlichts (12) anregbaren Molekülen (27), die eine interessierende Struktur in der Probe (6) markieren.
  22. Wiederholte Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zum Verfolgen des sich in der Probe (6) bewegenden vereinzelten Moleküls (27). 23. Verwendung eines STED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskops zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei durch dasSTED-Rasterfluoreszenzlichtmikroskop bereitgestelltes STED-Licht als das Anregungslicht (3) verwendet wird.
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