JP6050611B2 - 配列特異性およびdna−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ - Google Patents
配列特異性およびdna−結合親和度が変更された、合理設計メガヌクレアーゼ Download PDFInfo
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Description
OD000122によって一部援助された。したがって、米国政府も、本発明において若干の権利を保有する場合がある。
特異的な、残留切断活性を保持するので、不要の部位を切断することがしばしばある(SMITH ET AL.(2000),NUCLEIC ACIDS RES.28:3361−9)。これらの不要な切断は、処置生物体において、突然変異および毒性を引き起こす可能性がある(PORTEUS ET AL.(2005),NAT.BIOTECHNOL.23:967−73)。
AL.(2002),GENES DEV.16:1568−81;GOUBLE ET AL.(2006),J.GENE MED.8(5):616−622)の修飾に限定される。
ET AL.(2003),NUCLEIC ACIDS RES.31:2952−62)。
ポリペプチドを含むが、該組み換えメガヌクレアーゼは、配列番号2、配列番号3、配列番号4及び配列番号5から選ばれる、I−CREIメガヌクレアーゼ認識配列内の半分部位と、少なくとも1塩基対異なる認識配列半分部位に対して特異性を持ち、かつ、この組み換えメガヌクレアーゼは、従来技術に認められる排外的修飾ではない、表5に掲げられる少なくとも一つの修飾を含む。
。この発明におけるメガヌクレアーゼは、配列番号1のI−CREIメガヌクレアーゼの残基2−153に対して少なくとも85%の配列類似性を有するポリペプチドを含むが、DNA結合親和度は、(1)(A)H、N、Q、S、T、K若しくはRによるE80、D137、I81、L112、P29、V64若しくはY66の置換、又は(B)K若しくはRによるT46、T140若しくはT143の置換から選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾によって上昇するか、又は、逆に、(2)(A)H、N、Q、S、T、D若しくはEによるK34、K48、R51、K82、K116若しくはK139の置換、又は(B)D若しくはEによるI81、L112、P29、V64、Y66、T46、T140若しくはT143の置換から選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾によって低下する。
H172の置換から選ばれる一つの置換に対応する少なくとも一つの修飾によって低下する。
A)D若しくはEによるR302の置換から選ばれる置換に対応する少なくとも一つの修飾によって変えられる第1ポリペプチド、及び(2)配列番号6のI−MSOIメガヌクレアーゼの残基6−160に対して少なくとも85%の配列類似性を有する第2ポリペプチドであって、ダイマー形成に対する親和度が、(B)K若しくはRによるD20、E11若しくはQ64の置換から選ばれる置換に対応する少なくとも一つの修飾によって変えられる第2ポリペプチドを含む組み換えメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーを提供する。
色体の中に切断部位を生産し、興味の配列は、相同組み換え又は非相同的末端接合によって、切断部位において染色体の中に挿入される。
る第1残基については、G、C、T若しくはAの内の適切なもののメンバーである基1及び/又は基2の置換を選択すること;又は(B)前記第1塩基から6オングストロームより遠い位置にある第1残基については、G、C、T及びAの内の適切なもののメンバーである基2及び/又は基3の置換を選択することによって、所望の変化を促進するアミノ酸置換を特定することによって実現する方法を提供する。なお、上述したそれぞれの基は、後述するように定義する。この方法は、同じ塩基に対する別の接触残基ついても、同じ位置における他の塩基に対する接触残基についても、さらに、別の位置についても繰り返してよい。
本発明は、一部は、メガヌクレアーゼが2本鎖DNA認識配列とコンタクトする際、DNA塩基と特異的接触を形成し、かつ、DNAバックボーンと非特異的接触を形成し、そうすることによって、該酵素の認識配列特異性およびDNA−結合親和度に影響を及ぼす、メガヌクレアーゼLAGLIDADGファミリーにおける特異的アミノ酸残基の特定および特徴解明に基づく。この発見は、以下に詳細に説明するように、メガヌクレアーゼの特異性及び/又は親和性を変えることが可能な、メガヌクレアーゼにおけるアミノ酸置換を特定するため及び天然のメガヌクレアーゼが認識しない所望のDNA配列を認識することが可能であり、及び/又は、天然のメガヌクレアーゼに比べて特異性及び/又は親和度が増大または減少させたメガヌクレアーゼを合理的に設計し、開発するために用いられた。さらに、DNA−結合親和度は、酵素活性の外に、配列特異性にも影響を及ぼすので、本発明は、天然メガヌクレアーゼに比べ活性を変更させた、合理的設計メガヌクレアーゼを提供する。さらに、本発明は、ダイマーを形成するためにコンタクトされたモノマー間のインターフェイスにおける残基が、ヘテロダイマー形成を促進するように修飾された合理設計メガヌクレアーゼを提供する。最後に、本発明は、組み換え細胞および生物体の生産における使用ばかりでなく、本出願に開示されるように、遺伝子療法、抗病原体、抗癌及びインビトロ応用における合理設計メガヌクレアーゼの使用を提供する。
む、合理設計LAGLIDADGメガヌクレアーゼを生成するための方法を提供する。しかしながら、酵素活性は、DNA−結合親和度と相関するのであるから、DNA認識配列に対する結合に与るアミノ酸を変えることは、2本鎖DNAに対する全体的結合親和度を増大又は減少することになり、特異的塩基対相互作用を介するメガヌクレアーゼの特異性ばかりでなく、メガヌクレアーゼの活性も変える可能性がある。同様に、DNAバックボーンに対する結合によるアミノ酸を変えることは、2本鎖DNAに対する全体的結合親和度を増大又は減少することによって、酵素の活性ばかりでなく、認識配列に対する結合の特異性又は縮重の程度を変える可能性がある。
本出願において参照される特許および科学文献は、当業者にとって利用可能な知識を確定する。本出願において引用される、公刊された米国特許、承認済みの出願、出版された外国特許、および、GENBANKのデータベース配列を含む参照資料は、参照により、あたかも、それぞれが、特異的、個別的に、参照によって含まれるのと同程度に、本出願に含まれる。
DGメガヌクレアーゼのモノマー又はジ−LAGLIDADGメガヌクレアーゼの一つのLAGLIDADGサブユニットによって認識される2本鎖DNA分子間の核酸配列を意味する。
が「変更された」ことになる。
と非共有的に結合する傾向を意味する。結合親和度は、解離定数KDによって測定される(例えば、WT認識配列に対するI−CREIのKDは約0.1NMである)。本出願で用いる場合、基準認識配列に対する組み換えメガヌクレアーゼのKDが、基準メガヌクレアーゼに比べて、統計的に有意な値(P<0.05)だけ増加又は減少した場合に、結合
親和度を「変更させた」ことになる。
のための鋳型として使用される。したがって、標的配列とは著明に異なっていてもよい外来性のDNA配列が、染色体配列に組み込まれる。相同組み換えプロセスは、主に真核生物において起こる。本出願では、「相同性」という用語は「配列類似性」と等価的に用いられ、出自又は系統関係による同一性を要求することを意図するものではない。
可能である。本出願では、配列類似度は、アミノ酸配列の場合はBLASTPプログラムを用い、核酸配列の場合はBLASTNプログラムを用いて算出される。両方とも、NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION(WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV/)を通じて使用可能であり、例えば、ALTSCHUL ET AL.(1990), J.MOL.BIOL.215:403−410;GISH AND STATES(1993), NATURE GENET.3:266−272;MADDEN ET AL.(1996),METH.ENZYMOL.266:131−141;ALTSCHUL ET AL.(1997),NUCLEIC ACIDS RES.25:3389−3402);ZHANG ET AL.(2000) J.COMPUT.BIOL.7(1−2):203−14に記載される。本出願では、二つのアミノ酸配列の類似パーセントは、BLASTPアルゴリスムにおける下記のパラメータに基づくスコアである。単語サイズ=3;ギャップ開放ペナルティー=−11;ギャップ延長ペナルティー=−1;及びスコアリングマトリックス=BLOSUM62である。本出願では、二つの核酸配列の類似パーセントは、BLASTNアルゴリスムにおける下記のパラメータに基づくスコアである。単語サイズ=11;ギャップ開放ペナルティー=−5;ギャップ延長ペナルティー=−2;マッチ評価=1
;及びミスマッチペナルティー=−3である。
本発明の一様態では、組み換えLAGLIDADGファミリーのメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法が提供される。この様態では、先ず、半分部位の各位置における塩基指向性を変えることが可能なアミノ酸置換を予測することによって、組み換えメガヌクレアーゼを合理的に設計する。これらの置換は、個別に又は組み合わせて、実験的にその有効性が検証され、所望の切断特異性を持つメガヌクレアーゼを生産する。
の基準メガヌクレアーゼ)のアミノ酸側鎖及びそれら接触部の空間的、化学的性質を決めることによって予測される。これらのアミノ酸としては、基準DNA半分部位との接触に与る側鎖が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。一般に、この決定には、メガヌクレアーゼと、その2本鎖DNA認識配列との間の複合体の構造に関する知識、又はきわめて類似性の高い複合体の構造(例えば、同じメガヌクレアーゼと、別のDNA認識配列との間の複合体構造、又はメガヌクレアーゼの対立遺伝子変種または系統的変種と、そのDNA認識配列との間の複合体構造)に関する知識が必要である。
NICHOLLS ET AL.(1991),PROTEINS,STRUCTURE,FUNCTION AND GENETICS 11(4):281FF)、グラフィックディスプレイ・プログラムINSIGT(登録商標)(TSI,INC.,SHOREVIEW、ミネソタ州)を含む、適切なソフトウェアプログラムを用いて生産することが可能である。タンパク質−DNA複合体の、三次元構造描画を生産し、視認し、かつ操作するために好適なコンピュータハードウェアは市販されており、従来技術で周知である(例えば、SILICON GRAPHICS WORKSTATION,SILICON GRAPHICS,INC.,MOUNTAINVIEW、カリフォルニア州)。
及び−6では、接触面は、野生型接触には与らないが、異なるアミノ酸によって置換された場合、塩基に接触する可能性のある、さらに新たなアミノ酸位置を含むように定義された。
)、メチオニン(M)、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、およびトリプトファン(W)を含む3群に割り当てられる。しかしながら、トリプトファンは、比較的屈曲性が低いので、比較的頻繁な使用が期待されない。さらに、リシン、アルギニン、およびメチオニン側鎖の屈曲性によって、これらのアミノ酸は、長い距離または中間距離からの塩基接触が可能となるために、それらが、2群と3群の両群に含められることを保証する。これらの群をさらに、下記に表1として示す。
DNA認識に関する単純な規則を用いて、そこでは、ある特定の塩基対位置において、塩基の内の一つが、または両方が合理的設計接触を通じて認識される、そのような接触面を予測することが可能である。
素と、位置Xにおける塩基対の二つの塩基のそれぞれとの間の距離を測定することが可能であり、もしもその残基が両方の塩基の9オングストローム以内にある場合、該塩基対の二つの塩基に影響を及ぼすために異なる置換を実行することが可能である(例えば、一方の鎖の近位塩基に影響を及ぼすために1群の残基、又は他方の鎖の遠位塩基に影響を及ぼすために3群の残基)。それとは別に、ペアの両塩基と相互作用を持つことが可能な残基置換の組み合わせは、特異性に影響を及ぼすことが可能である(例えば、アンチセンス鎖に接触するA群の残基と組み合わせたセンス鎖に接触するT群の残基はT/Aを選択する)。最後に、残基の複数の候補修飾は、経験的に(例えば、組み換えメガヌクレアーゼを生産し、その配列認識を調べることによって)、又はコンピュータ的に(例えば、修飾された酵素のメガヌクレアーゼ−DNA複合体のコンピュータモデル化によって)その有効性を検証して、複数候補の中から選択することが可能である。
クレアーゼ酵素のドメインに対し、活性を完全に消失させることなく、さらに新たなアミノ酸置換、挿入又は欠失を行うことが可能である。置換は、構造的または機能的に束縛された位置における、類似のアミノ酸残基の保存的置換であってもよく、又は構造的または機能的に比較的に束縛されない位置における非保存的置換であってもよい。このような置換、挿入又は欠失は、当業者によって、不当な努力を要することなく、通例の実験操作によって特定することが可能である。したがって、ある実施態様では、本発明の組み換えメガヌクレアーゼは、基準メガヌクレアーゼの配列に対し、85%から99%の間の任意のパーセント(例えば、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、97.5%、99%)の配列類似性を持つタンパクを含む。各野生型I−CREI、I−MSOI、I−SCEI、およびI−CEUIタンパクに関して、多くのN−末端およびC−末端配列は、X線結晶実験でははっきりと見ることができない。これは、これらの位置が、構造的又は機能的に束縛されていないことを示唆する。それゆえ、これらの残基は、配列類似性の計算から排除することが可能であり、下記の基準メガヌクレアーゼ配列を使用することが可能である。I−CREIについては配列番号1の残基2−153;I−MSOIについては配列番号6の残基6−160;I−SCEIについては配列番号9の残基3−186;I−CEUIについては配列番号12の残基5−211である。
LAGLIDADGメガヌクレアーゼ・ファミリーは、多様な系統群の宿主生物体由来の200を超えるメンバーから構成される。このファミリーのメンバーは全て、特異的DNA配列の切断に与る他の構造的モチーフと共に、高度に保存されるLAGLIDADGモチーフの1個又は2個の複製を有する。LAGLIDADGモチーフの1つの複製有する酵素(すなわち、モノ−LAGLIDADGメガヌクレアーゼ)はダイマーとして機能し、一方、このモチーフの2つの複製を有する酵素(すなわち、ジ−LAGLIDADGメガヌクレアーゼ)はモノマーとして機能する。
)の間に全体構造の類似性が見られることは、X線結晶学によって明らかにされている。したがって、このファミリーのメンバーは、この構造モチーフ内部の特定のアミノ酸について修飾し、該酵素の全体活性又は配列特異性を変えることが可能であり、かつ、対応する修飾は、他のファミリーメンバーにおいても類似の結果をもたらすことが当然期待される。概論については、CHEVALIERET AL. (2001), NUCLEIC ACID RES. 29(18):3757−3774)を参照されたい。
1側面において、本発明は、CHLAMYDOMONAS REINHARDTIIのI−CREIメガヌクレアーゼに基づく、又はこのメガヌクレアーゼから得られた合理的設計メガヌクレアーゼに関する。I−CREIメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列は、GENBANKアクセス#PO5725に対応する、配列番号1に示される。結晶構造PDB#1BP7における野生型I−CREIメガヌクレアーゼの、二つの、認識配列半分部位を下記の表3に示す。
Gとすると、位置26のグルタミンと結合することが可能である(野生型I−CREI結晶構造に観察されるように、水分子を介して)(図1(C)を参照)。センス鎖をGとすると、位置77のアルギニンと水素結合することが可能であり、アンチセンス鎖をCとすると、位置26のグルタミン酸と水素結合することが可能である(図1(D)を参照)。センス鎖をAとすると、位置77のグルタミンと水素結合することが可能であり、アンチセンス鎖をTとすると、位置26のアラニンと疎水性接触を形成することが可能である(図1(E)を参照)。もしも塩基の特異的接触が位置77によって与えられるとすると、野生型接触Q26を置換し(例えば、セリン残基によって)、その特異性に対する影響を低下、または除去することが可能である。それとは別に、位置26および77における相補的突然変異を組み合わせて、特定の塩基対を指定することが可能である(例えば、A26は、アンチセンス鎖においてTを指定し、Q77は、センス鎖においてAを指定する(図1(E))。これらの予言された残基置換は、全て、実験的にその有効性が実証された。
星印は、その残基が、アンチセンス鎖の塩基に接触することを示す。
他の側面では、本発明は、MONOMASTIX SP.のI−MSOIメガヌクレアーゼに基づく、又はこのヌクレアーゼから得られた合理設計メガヌクレアーゼに関する。I−MSOIメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列は、GENBANKアクセス#AAL34387に対応し、配列番号6に示される。結晶構造PDB#1M5Xにおける野生型I−MSOIメガヌクレアーゼの、二つの認識配列半分部位を下記の表6に示す。
星印は、その残基がアンチセンス鎖の塩基に接触することを示す。
他の側面では、本発明は、SACCHAROMYCESCEREVISIAEのI−SCEIメガヌクレアーゼに基づく、又はこのヌクレアーゼから得られた合理設計メガヌクレアーゼに関する。I−SCEIメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列は、GENBANKアクセス#CAA09843に対応し、配列番号9に示される。結晶構造PDB#1R7Mにおける野生型I−SCEIメガヌクレアーゼの、認識配列を下記の表8に示す。
他の側面では、本発明は、CHLAMYDOMONASEUGAMETOSのI−CEUIメガヌクレアーゼに基づく、又はこのヌクレアーゼから得られた合理設計メガヌクレアーゼに関する。I−CEUIメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列は、GENBANKアクセス#P32761に対応し、配列番号12に示される。結晶構造PDB#2EX5における野生型I−CEUIメガヌクレアーゼの、二つの認識配列半分部位を下記に示す。
本発明は、従来技術において記載され、別法によって開発された、いくつかの組み換えメガヌクレアーゼを包含することを意図しない。これらの排除されたメガヌクレアーゼとしては、ARNOULD ET AL.(2006),J.MOL.BIOL.355:443−58;SUSSMAN ET AL.(2004),J.MOL.BIOL.3
42:31−41;CHAMES ET AL.(2005),NUCLEIC ACIDS RES.33:E178;SELIGMAN ET AL.(2002),NUCLEIC ACIDS RES.30:3870−9;およびASHWORTH ET AL.(2006) NATURE 441(7093):656−659によって記載されるものが挙げられる。なお、上記の全開示を、C33、R33、A44、H33、K32、F33、R32、A28、A70、E33、V33、A26及びR66から選ばれる単一置換を持つ、I−CREIに基づく組み換えメガヌクレアーゼを含め、引用により本出願に含める。さらに排除されるものは、A68/N70/N75及びD44/D70/N75から選ばれた3置換、K44/T68/G60/N75及びR44/A68/T70/N75から選ばれる4置換を持つI−CREIに基づく組み換えメガヌクレアーゼである。最後に、特に指定して排除されるものは、置換L28及びR83のペアを持つI−MSOIに基づく組み換えメガヌクレアーゼである。これらの置換又は置換の組み合わせは、本出願では「排除修飾」と呼ばれる。
他の側面では、本発明は、DNA認識配列半分部位の二つ以上の位置において半分部位指向を変えるために、上の節2.2.1−2.2.4に記載した、二つ以上のアミノ酸置換を組み合わせることによって得られる合理設計メガヌクレアーゼに関する。例えば、ただしこれらに限定されるものではないが、さらに詳しく後述されるように、酵素DJ1は、修飾R30/E38(これは、位置−7においてCを好む)、R40(これは位置−6においてGを好む)、R42(これは、位置−5においてGを好む)及びN32(これは、位置−9において完全縮重を好む)を取り込むことによって、I−CREIから得られる。この合理設計DJ1メガヌクレアーゼは、A−7A−6C−5に対する野生型の指向性に比べ、ほぼ変わらない程度でC−7G−6G−5を認識し、位置−9におけるAに対する耐性を増大させる。
。
前述のように、本発明の組み換えメガヌクレアーゼのDNA結合親和度は、DNAのフォスフォジエステルバックボーンと接触面を形成するいくつかのアミノ酸を変えることによって修飾することが可能である。この接触面は、DNAバックボーンから9オングストローム未満の距離のβ−炭素を持つ酵素のアミノ酸を、この残基が野生型メガヌクレアーゼ−DNA複合体においてDNAバックボーンと接触するかどうかとは無関係に含む。DNA結合は、酵素活性に必要な前提条件であるから、DNA結合親和度の上昇/低下は、それぞれ、酵素活性の上昇/低下を起こすことが示されている。しかしながら、DNA結合親和度の上昇/低下はさらに、メガヌクレアーゼの配列特異性の低下/上昇を起こすことが示されている。それゆえ、活性および特異性は両方とも、フォスフォジエステルバックボーン接触を修飾することによって修飾することが可能である。
ン酸)を導入することは、結合親和度を下げることが予想される。ただし、立体障害の作用には影響される。
(1)対応する酵素において、陰性荷電(D又はE)、疎水性(A、C、F、G、I、L、M、P、V、W、Y)、又は無荷電/極性(H、N、Q、S、T)のアミノ酸を、表12から選ぶ。
(2)アミノ酸が陰性荷電しているか又は疎水性である場合は、それを、無荷電/極性(作用が小さい)又は陽性荷電(KまたはR、作用が大きい)となるように突然変異させる。
(3)アミノ酸が無荷電/極性である場合、それを陽性荷電に突然変異させる。
(1)対応する酵素において、陽性荷電(K又はR)、疎水性(A、C、F、G、I、L、M、P、V、W、Y)、又は無荷電/極性(H、N、Q、S、T)のアミノ酸を、表12から選ぶ。
(2)アミノ酸が陽性荷電している場合は、それを、無荷電/極性(作用が小さい)又は陰性荷電(作用が大きい)となるように突然変異させる。
(3)アミノ酸が疎水性又は無荷電である場合、それを陰性荷電に突然変異させる。
他の側面では、本発明は、二つのモノマーで、その一方は野生型で、その一方または両方が、非天然形または組み換え形であるモノマーのコンタクトによって形成されるヘテロダイマーであるメガヌクレアーゼを提供する。例えば、野生型I−CREIメガヌクレアーゼは、通常、それぞれが、擬似パリンドローム認識配列において一つの半分部位に結合する、二つのモノマーから構成されるホモダイマーである。ヘテロダイマー組み換えメガヌクレアーゼは、異なる半分部位を認識する二つのメガヌクレアーゼを組み合わせることによって、例えば、細胞において二つのメガヌクレアーアゼを共時発現することによって、又は溶液中で二つのメガヌクレアーゼを混合することによって生産することが可能である。二つのモノマーにおいて、それらのコンタクトによるダイマー形成に影響を及ぼす、それぞれのアミノ酸を変えることによって、ヘテロダイマーの形成を、ホモダイマーの形成よりも優先することが可能である。特定の実施態様では、二つのモノマーのインターフェイスにおけるいくつかのアミノ酸が、第1モノマーでは、陰性荷電のアミノ酸(D又は
E)から陽性荷電のアミノ酸(K又はR)に変えられ、第2モノマーでは、陽性荷電のアミノ酸から陰性荷電のアミノ酸に変えられる(表13参照)。例えば、I−CREI由来のメガヌクレアーゼの場合、位置7及び57におけるリシンが、第1モノマーではグルタミン酸に突然変異され、第2モノマーでは、位置8および61におけるグルタミン酸がリシンに突然変異される。このプロセスの結果は、第1モノマーが、ダイマーインターフェイスにおいて過剰な陽性荷電残基を持ち、第2モノマーが、ダイマーインターフェイスにおいて過剰な陰性荷電残基を持つ、一対のモノマーである。それゆえ、この第1及び第2モノマーは、インターフェイスにおける変更アミノ酸の間の静電気的相互作用のために、その同じモノマーペアよりも優先的にコンタクトする。
に比較的小さな残基で置換し、ヘテロダイマーにおける衝突を取り除くことが可能であるし、または未修飾のままでもよい。
本発明の側面はさらに、合理設計メガヌクレアーゼを用いた、組み換え、トランスジェニック又は他のやり方で遺伝学的に修飾された細胞および生物体を生産する方法を提供する。したがって、ある実施態様では、相同組み換えによる興味の配列の正確な挿入(単数又は複数)を可能とするために、細胞または生物体のゲノムDNAの単一部位又は比較的少数部位に、二本鎖切断点を特異的に引き起こすための、組み換えメガヌクレアーゼが開発された。別の実施態様では、(A)非相同的末端接合による興味の配列の稀な挿入(単数又は複数)を可能とするために、又は(B)非相同的末端接合による標的配列の破壊を可能とするために、細胞または生物体のゲノムDNAの単一部位又は比較的少数部位に、二本鎖切断点を特異的に引き起こすための、組み換えメガヌクレアーゼが開発された。興味の配列の、相同的組み換え又は非相同的末端接合に関して本出願で用いる場合、「挿入」という用語は、興味の配列が染色体の中に組み込まれるように、興味の配列が染色体にコンタクトすることを意味する。相同組み換えの場合、挿入された配列は内因性配列を置換し、そのため、元のDNAは等しい長さではあるがヌクレオチド配列が変更された外因性DNAによって置換される。それとは別に、挿入配列はそれが置換する配列よりもより多数の又はより少数の塩基を含むことが可能である。
いて、興味の配列による相同組み換え、または非相同末端接合が可能とされる。組み換えメガヌクレアーゼタンパクは、例えば、マイクロインジェクション又はリポソームトランスフェクション(例えば、LIPOFECTAMINE(登録商標)、INVITROGEN CORP.,CARLSBAD、カリフォルニア州)を含む、ただしこれらに限定されないが、技術によって細胞中に導入することが可能である。このリポソーム処方は、標的細胞との脂質二重層融合を促進するのに用いることが可能であり、そのため、リポソームの内容物又はその表面にコンタクトするタンパクの細胞内部への取り込みを可能にする。それとは別に、酵素は、適切な取り込みタンパク、例えば、HIVTATタンパクなどに融合させて細胞の取り込みを指示するようにすることも可能である(例えば、HUDECZ ET AL.(2005),MED.RES.REV.25:679−736を参照)。
ET AL.(1973),VIROLOGY 54(2):536−539;ZATLOUKAL ET AL.(1992),ANN.N.Y.ACAD.SCI.,660:136−153);(2)物理的方法、例えば、マイクロインジェクション(CAPECCHI(1980),CELL22(2):479−488)、電気穿孔(WONG
ET AL,(1982),BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN.107(2):584−587;FROMM ET AL,(1985),PROC.NAT’L ACAD SCI.USA 82(17):5824−5828;米国特許第5,384,253号)、および、弾丸注入法(JOHNSTON ET AL,(1994),METHODS CELL.BIOL.43(A):353−365;FYNAN ET AL,(1993),PROC.NAT’L ACAD.SCI.USA 90(24):11478−11482)など;(3)ウィルスベクター(CLAPP(1993),CLIN. PERINATOL.20(1):155−168;LU ET AL,(1993),J.EXP.MED.178(6):2089−2096;EGLITIS ET AL,(1988),AVD.EXP.MED.BIOL.241:19−27;EGLITIS ET AL.(1988),BIOTECHNIQUES 6(7):608−614);および、(4)受容体介在性機構(CURIEL ET AL.(1991),PROC.NAT’L ACAD.SCI.USA 88(19):8850−8854;CURIEL ET AL.(1992),HUM.GEN.THER.3(2):147−154;WAGNER ET AL.(1992),P
ROC.NAT’L ACAD.SCI.USA 89(13):6099−6103)が挙げられる。
UPTAKE、電気穿孔、シリコンカーバイド線維による搖動、弾丸注入、または微小弾丸発射などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
BALTIMORE(1983),CELL 33:741−748)、ニューロン特
異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメント・プロモーター;BAYNE AND
RUDDLE(1989),PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 86:5473−5477)、膵臓特異的プロモーター(EDLUND ET AL.(1985),SCIENCE 230:912−916)、および、乳腺特異的プロモーター(例えば、ミルクフェイ・プロモーター、米国特許第4,873,316号、および欧州特許公開EP0264166)が挙げられる。発達時の調整に与るプロモーター、例えば、マウスのHOXプロモーター(KESSEL AND GRUSS(1990),SCIENCE 249:374−379)、および、α−フェトプロテイン・プロモーター(CAMPES AND TILGHMAN(1989),GENES DEV.3:537−546)なども含まれる。
本発明の局面は、遺伝子治療のための、組み換えメガヌクレアーゼの使用を可能とする。本出願で用いる「遺伝子治療」という用語は、その構造及び/又は機能において欠陥的である遺伝子又は遺伝子調整配列と置換するために、患者の中に、少なくとも一つの遺伝子の機能的コピー又は遺伝子調整配列、例えば、プロモーター、エンハンサー又はサイレンサーを導入することを含む治療処置を意味する。さらに、「遺伝子治療」という用語は、有害遺伝子または調整要素に対し、該遺伝子の発現を下げるか又は除去するために為される修飾を指すことが可能である。遺伝子治療は、先天性病態、患者の生涯に亘る特定の遺伝子座位における突然変異または損傷による病態又は感染生物体による病態を治療するために実行することが可能である。
を持つことが可能である。
AL.(2006),J.VASC.SURG.43(5):1021−7を参照)。リポソーム処方の生産および使用のための方法は、従来技術で周知である(例えば、米国特許第6,316,024号、米国特許第6,379,699号、米国特許第6,387,397号、米国特許第6,511,676号、および米国特許第6,593,308号、およびそれらの中に引用される参考文献を参照)。ある実施態様では、リポソームは、興味の配列の外、組み換えメガヌクレアーゼタンパク、または組み換えメガヌクレアーゼ遺伝子配列を輸送するために使用される。
本発明の局面はさらに、病原体による感染の治療法を提供する。病原性生物体としては、ウィルス、例えば、ただしこれらに限定されるものではないが、単純ヘルペスウィルス1、単純ヘルペスウィルス2、ヒト免疫不全ウィルス1、ヒト免疫不全ウィルス2、痘瘡ウィルス、ポリオウィルス、エプスタインバーウィルスもしくはヒトパピローマウィルスなど、及び細菌生物体、例えば、これらに限定されるものではないが、BACILLUS
ANTHRACIS、HAEMOPHILUS種、PNEUMOCOCCUS種、STAPHYLOCOCCUS AUREUS、STREPTOCOCCUS種、メシシリン耐性STAPHYLOCOCCUS AUREUS及びMYCOPLASMA TUBERCULOSISなどが挙げられる。病原生物体としてはさらに、真菌生物体、例えば、ただしこれらに限定されるものではないが、CANDIDA、BLASTOMYCES、CRYPTOCOCCUS、およびHISTOPLASMA種などが挙げられる。
本発明の局面はさらに、インビトロ分子生物学研究および開発のためのツールを提供する。核酸、例えば、プラスミド、PCR産物、BAC配列、YAC配列、ウィルス及び真核および前核生物体由来のゲノム配列などの核酸の単離、クローニング及び操作のために、部位特異的エンドヌクレアーゼ(例えば、制限酵素)を用いることは、従来技術で普通のことである(例えば、AUSUBEL ET AL.,「分子生物学における最近のプロトコール(“CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,”)」、WILEY 1999を参照されたい)。したがって、ある実施態様では、インビトロにおける核酸の操作に合理設計メガヌクレアーゼを使用してもよい。例えば、同じDNA分子の中に一対の認識配列を認識する、合理設計メガヌクレアーゼは、その後の操作、例えば、細菌プラスミド、BAC又はYACへのコンタクトなどのための介在DNAセグメントを単離するのに使用することが可能である。
することが可能である(例えば、ヒトのCFTR遺伝子のΔF−508対立遺伝子を認識する合理設計メガヌクレアーゼ、実施例4を参照)。この実施態様では、ヒトの患者、又は他の生物体から単離されたDNA配列が、合理設計メガヌクレアーゼによって、場合によっては、追加の部位特異的ヌクレアーゼと組み合わせて消化され、得られたDNA断片のパターンが、ゲル電気泳動、毛細管電気泳動、質量分析又はその他の従来技術で既知の方法によって分析される。この断片化パターン及び具体的には合理設計メガヌクレアーゼによる切断の有無は、ゲノム中に認識配列が存在するか否かを明らかにすることによって該生物体の遺伝子型を示す。別の実施態様では、合理設計メガヌクレアーゼは、病原性ウィルス、真菌、または細菌のゲノムにおける多型領域を標的とし、該生物体を特定するのに使用される。この実施態様では、合理設計メガヌクレアーゼは、病原体に固有の認識配列を切断するが(例えば、細菌における16Sおよび23SRRNA遺伝子の間のスペーサー領域;例えば、VAN DER GIESSEN ET AL.(1994),MICROBIOLOGY 140:1103−1108を参照)、これを用いて、ゲノムのエンドヌクレアーゼ消化及びそれに続く、電気泳動、質量分析、または、従来技術で既知の、その他の方法による断片化パターンの分析に基づいて、他の、近縁生物体と区別することが可能である。
他の側面で、本発明は、エンドヌクレアーゼ切断活性を除去した合理設計DNA−結合タンパク質を提供する。合理設計メガヌクレアーゼの触媒活性の除去は、触媒に与るアミノ酸を突然変異させることによって実行することが可能である(例えば、I−CREIにおけるQ47のEへの突然変異、CHEVALIER ET AL.(2001),BIOCHEMISTRY,43:14015−14026を参照);I−SCEIにおけるD44またhD145のNへの突然変異;I−CREIにおけるE66のQへの突然変異;I−MSOIにおけるD22のNへの突然変異)。次に、この不活性化メガヌクレアーゼを別のタンパク質、例えば、ただしこれらに限定されるものではないが、転写アクチベーター(例えば、GAL4トランスアクチベーションドメイン、またはVP16トランスアクチベーションドメイン)、転写リプレッサー(例えば、KRUPPELタンパクのKRABドメイン)、DNAメチラーゼドメイン(例えば、M.CVIPI、またはM.SSSI)、またはヒストンアセチルトランスフェラーゼ・ドメイン(例えば、HDAC1、またはHDAC2)などのエフェクタードメインに融合させることが可能である。もっとも著明なのとして加工されたジンクフィンガードメインがある、加工されたDNA結合ドメイン及び、エフェクタードメインから成るキメラタンパクは、従来技術で既知である(例えば、PAPWORTH ET AL.(2006),GENE 366:27−38参照)。
1. メガヌクレアーゼの設計
一対のメガヌクレアーゼが、HIV−1 TAT遺伝子に認められるDNA部位5’−GAAGAGCTCATCAGAACAGTCA−3’(配列番号15)を認識し、切断
するように設計された。表5に従って、二つのメガヌクレアーゼ、TAT1及びTAT2が、下記の塩基接触部(非WT接触部は太字で表す)を用い、それぞれ、半分部位5’−GAAGAGCTC−3’(配列番号16)、および5’−TGACTGTTC−3’(配列番号17)に結合するように設計された。
再設計I−CREI酵素のための突然変異を、重複PCR戦略において突然変異誘発性プライマーを用いて導入した。一次PCRで生成されたI−CREIの組み換えDNA断片を、二次PCRにおいて接合し、全長の組み換え核酸を生産した。組み換えI−CREI構築体は全て、精製用遺伝子の3‘末端に、6個のヒスチジンタグを融合させたPET21Aベクター(NOVAGEN CORP.,SAN DIEGO、カリフォルニア州)にクローンした。核酸配列は全て、サンガーのジデオキシヌクレオチド配列決定法(SANGER ET AL.(1977),PROC.NATL.ACAD.SCI.USA.74(12):5463−7を参照)を用いて確認した。
レートから掻き落とし、それを用いて50 ML の2XYTブロスに接種した。細胞を、波長600NMにおいて光学的濁度が0.9に達するまで、振とうしながら37℃で育成した。次に、育成温度を37℃から22℃に下げた。タンパク質の発現は、1MM IPTGを添加することによって誘発し、細胞は、振とうしながら2時間半インキュベートした。次に、10分間6000 X Gの遠心によって細胞をペレットとした。ペレットを、1MLの結合バッファー(20MM TRIS−HCL,PH8.0,500MM NACL,10MMイミダゾール)において渦巻き攪拌によって再縣濁させた。次に、細胞を、50%電力における12パルスの超音波処理によって破壊し、細胞砕片を、15分間14,000 X Gの遠心によってペレットとした。細胞上清を、4MLの結合バッファーで希釈し、200μLのニッケル充填金属キレート性セファローズカラム(PHARMACIA)に負荷した。
前述のように精製した酵素は全て、メガヌクレアーゼの認識配列を含む、直線状の2本鎖DNA基質とインキュベーションすることによって活性について定量した。認識配列のセンス及びアンチセンスの両鎖に対応する合成オリゴヌクレオチドをアニールし、平滑末端コンタクトによって、PUC19プラスミドのSMAI部位にクローンした。このクローンされた結合部位の配列は、サンガーのジデオキシヌクレオチド配列決定法によって確認した。プラスミド基質は、全て、メガヌクレアーゼ消化と同時に、XMNI、SCAI、またはBPMIによって直線化された。この酵素消化物は、5μLの0.05μM DNA基質、2.5μLの5μM組み換えI−CREIメガヌクレアーゼ、9.5μLのSAバッファー及び0.5μLのXMNI、SCAI又はBPMIを含んでいた。消化物は、37℃で又はあるメガヌクレアーゼ酵素用として42℃で、4時間インキュベートした。消化は、0.3MG/MLのプロテイナーゼK及び0.5%SDSを加えることによって停止させ、37℃で1時間インキュベートした。消化物を、1.5%アガロースにおいて分析し、臭化エチジウム染色によって視像化した。
意図する半分部位の完全パリンドロームに対応する、一組のDNA基質のほか、この半分部位における27通りの可能な単一塩基対置換の内の一つとインキュベートした。
精製組み換えTAT1およびTAT2メガヌクレアーゼは、野生型メガヌクレアーゼ配列とは異なるDNAを認識した(図2(B))。野生型I−CREIメガヌクレアーゼは、WT認識配列を切断するが、TAT1のために意図された配列、TAT2のために意図された配列のいずれも切断しない。同様に、TAT1及びTAT2は、その意図された認識配列は切断するが、野生型配列は切断しない。次に、これらのメガヌクレアーゼを、半分部位指向性および全体特異性について評価した(図3)。野生型I−CREIは、その天然の半分部位における単一塩基対置換についてきわめて耐性が高いことが認められた。一方、TAT1及びTAT2は、きわめて特異的で、TAT1の場合は、位置−1、−2、−3、−6及び−8において、TAT2の場合は、位置−1、−2及び−6における塩基置換に対して完全に耐性を持たなかった。
1. 親和度を上昇および活性を上昇させたメガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼCCR1およびBRP2を、それぞれ、半分部位5’−AACCCTCTC−3’(配列番号18)および5’−CTCCGGGTC−3’(配列番号19)を切断するように設計した。これらの酵素を、実施例1の場合と同様、表1に従って生産した。
クレアーゼ
野生型I−CREIは、その半分部位に対する置換に対して高い耐性を持つことが認められている(図3(A))。この酵素の特異性をさらに高めるための試みとして、通常、DNAバックボーンのリン酸塩と塩橋を造る、酵素の位置116のリシンを、アスパラギン酸に突然変異させてDNA−結合親和度を下げた。この合理設計酵素の、野生型認識配列に対する切断は、はっきりと低下していたが、この組み換え酵素の特異性は、野生型よりも相当に高かった。K116D変種の半分部位の指向性を、実施例1と同様に評価したところ、この酵素は、位置−1、−2及び−3における天然半分部位からの逸脱に対しては全く耐性を持たないことが認められ、半分部位の残りの6位置では、少なくとも部分的な塩基指向性を示した(図3(B))。
1. 溶液の中で形成されたメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーによる非パリンドロームDNA部位の切断
二つのメガヌクレアーゼLAM1及びLAM2が、それぞれ、半分部位5’−TGCGGTGTC−3’(配列番号20)及び5’−CAGGCTGTC−3’(配列番号21)を切断するように設計された。これら二つの酵素から成るヘテロダイマーは、バクテリオファージλ P05遺伝子に見られるDNA配列5’−TGCGGTGTCCGGCG
ACAGCCTG−3’(配列番号22)を認識することが予想された。
ベートし、二つの酵素が、サブユニットを交換し、再度平衡に達するのを可能とした。LAM1ホモダイマー、LAM2ホモダイマー及びLAM1/LAM2ヘテロダイマーの混合物と予想される、得られた酵素液を、LAM1半分部位の完全パリンドローム、LAM2半分部位の完全パリンドローム及びバクテリオファージλゲノムに認められる非パリンドロームハイブリッド部位に対応する、3種の異なる認識配列と共にインキュベートした。精製LAM1酵素単独は、LAM1パリンドローム部位を切断するが、LAM2パリンドローム部位も、LAM1/LAM2ハイブリッド部位も切断しない。同様に、精製LAM2酵素単独は、LAM2パリンドローム部位を切断するが、LAM1部位も、LAM1/LAM2ハイブリッド部位も切断しない。しかしながら、LAM1及びLAM2の1:
1混合物は、3種全てのDNA部位を切断する。LAM1/LAM2ハイブリッド部位の切断は、二つの、異なる、再設計メガヌクレアーゼが溶液の中で混合されて、非パリンドローム的DNA部位を切断することが可能なヘテロダイマー酵素を形成することが可能であることを示す。
前述のLAM1及びLAM2酵素をコードする遺伝子は、実施例1において記載したように、大腸菌における同時発現のためにオペロンの中に配置された。この共時発現酵素は、実施例1と同様に精製され、かつ、酵素混合物は、前述の、三つの可能性のある認識配列とインキュベートされた。この共時発現酵素は、LAM1/LAM2ハイブリッド部位を含む三つ全ての部位を切断することが認められたが、これは、二つの、異なる合理設計メガヌクレアーゼが共時発現されて、非パリンドロームDNA部位を切断することが可能なヘテロダイマー酵素を形成することを示す。
非パリンドロームDNA部位の切断を必要とする応用のために、異なる(パリンドローム的)DNA部位を認識し、切断するホモダイマーの形成を最小に留めながら、酵素ヘテロダイマーの形成を増進することが望ましい。このために、位置7、57及び96におけるリシンがグルタミン酸に変更されたLAM1酵素の変種が生産された。次に、この酵素を、位置8及び61のグルタミン酸をリシンに変えたLAM2の変種と、前述と同様に共時発現し、精製した。この場合、LAM1ホモダイマーの形成は、一方のモノマーにおけるE7、E57及びE96と、他方のモノマーにおけるE8及びE61の間における静電気的反発によって低下すると予想された。同様に、LAM2ホモダイマーの形成は、一方のモノマーにおけるK7、K57及びK96と、他方のモノマーにおけるK8及びK61の間における静電気的反発によって低下すると予想された。逆に、LAM1/LAM2ヘテロダイマーは、LAM1におけるE7、E57、およびE96、およびLAMにおけるK8及びK61の間の静電気的牽引によって好まれることが予想された。インターフェイスが修飾されたこの二つのメガヌクレアーゼが、前述のように、共時発現され、定量されると、LAM1/LAM2ハイブリッド部位が、二つのパリンドローム部位に対し優先的に切断されることが認められた。これは、メガヌクレアーゼのタンパク−タンパクインターフェイスにおける置換が、ヘテロダイマーの優先的形成の駆動が可能であることを示す。
1.遺伝子治療に関連するDNA配列を切断するメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー
軟骨無形成症を引き起こす突然変異である、ヒトのFGR3遺伝子における配列5’−CTGGGAGTCTCAGGACAGCCTG−3’(配列番号23)を切断する、合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー(ACH1/ACH2)を生産することが可能である。例えば、前述したように、I−CREIメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認識配列半分部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
単純ヘルペスウィルス−1および単純ヘルペスウィルス−2のUL36遺伝子の配列5’−CTCGATGTCGGACGACACGGCA−3’(配列番号28)を切断する合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー(HSV1/HSV2)を生産することが可能である。例えば、前述したように、I−CREIメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認識配列半分部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
GGACAGTTTA−3’(配列番号29)を切断する合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー(ANT1/ANT2)を生産することが可能である。例えば、前述したように、I−CREIメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認識配列半分部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ARABIDOPSISTHALIANNA GL2遺伝子の配列5’−CACTAA
CTCGTATGAGTCGGTG−3’(配列番号32)を切断する合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー(GLA1/GLA2)を生産することが可能である。例えば、前述したように、I−CREIメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認識配列半分部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
AAATCTCTAAGGTCTGTGCA−3’(配列番号34)を切断する合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー(MGC1/MGC2)を生産することが可能である。例えば、前述したように、I−CREIメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認識配列半分部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
ATTCAAGCGAGCATTAA−3’(配列番号35)を切断する合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー(CYP/HGH2)を生産することが可能である。例えば、前述したように、I−CREIメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認識配列半分部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
SACCHAROMYCES CEREVISIAE URA3遺伝子の配列5’−TTAGATGACAAGGGAGACGCAT−3’(配列番号36)を切断する合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー(URA1/URA2)を生産することが可能である。例えば、前述したように、I−CREIメガヌクレアーゼに基づいて、下記の接触残基および認識配列半分部位を持つメガヌクレアーゼが設計された。
本実施例において上に概説した合理設計メガヌクレアーゼを、実施例1と同様にして、クローンし、大腸菌において発現し、精製した。次いで、各精製メガヌクレアーゼを、そのヘテロダイマー形成パートナー(例えば、ACH1をACH2と、HGH1をHGH2と、など)と1:1で混合し、各メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーのために意図される
非パリンドロームDNA認識配列を含む、直線化DNA基質とインキュベートした。図3に示すように、各合理設計メガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーは、その意図されたDNA部位を切断する。
Claims (12)
- 参照メガヌクレアーゼモノマーによるダイマー形成に対する親和度を変更させた組み換えメガヌクレアーゼモノマーであって、
前記参照メガヌクレアーゼモノマーは、配列番号1のI−CREIメガヌクレアーゼモノマーであり、
配列番号1のI−CREIメガヌクレアーゼの残基2−153に対して少なくとも92.5%の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
ダイマー形成に対する親和度が、
(A)D又はEによるK7、K57又はK96の置換;
又は
(B)K又はRによるE8又はE61の置換から成る群より選ばれる置換に対応する少なくとも一つの修飾によって変えられる、組み換えメガヌクレアーゼモノマー。 - 組み換えメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマーであって、
配列番号1のI−CREIメガヌクレアーゼの残基2−153に対して少なくとも92.5%の配列同一性を有し、参照メガヌクレアーゼモノマーによるダイマー形成に対する親和度を変更させた第1ポリペプチドであって、
ダイマー形成に対する親和度が、
(A)D又はEによるK7、K57又はK96の置換から成る群から選ばれる置換に対応する少なくとも一つの修飾によって変えられる第1ポリペプチド及び、
配列番号1のI−CREIメガヌクレアーゼの残基2−153に対して少なくとも92.5%の配列同一性を有し、参照メガヌクレアーゼモノマーによるダイマー形成に対する親和度を変更させた第2ポリペプチドであって、
ダイマー形成に対する親和度が、
(B)K又はRによるE8又はE61の置換から成る群から選ばれる置換に対応する少なくとも一つの修飾によって変えられる第2ポリペプチドを含み、
前記参照メガヌクレアーゼモノマーは、配列番号1のI−CREIメガヌクレアーゼモノマーである、組み換えメガヌクレアーゼ・ヘテロダイマー。 - 表5から選ばれる少なくとも一つの修飾をさらに含む、請求項1又は2記載の組み換えメガヌクレアーゼモノマー又はヘテロダイマー。
- 真核細胞の染色体に挿入される興味の外因性配列を含む遺伝学的に修飾された真核細胞を生産するための方法であって、
真核細胞を、
(I)メガヌクレアーゼをコードする第1核酸配列及び、
(II)前記興味の配列を含む第2核酸配列
を含む一つ以上の核酸によってトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼが前記染色体の中に切断部位を生産し、かつ、前記興味の配列が前記切断部位において前記染色体の中に挿入され、
前記メガヌクレアーゼが請求項1〜3のいずれか1項による組み換えメガヌクレアーゼであることを特徴とする方法。 - 前記第2核酸が、前記切断部位に側接する配列に対し相同な配列をさらに含み、前記興味の配列が、相同組み換えによって前記切断部位において挿入される、請求項4記載の方法。
- 前記第2核酸が、前記切断部位に対し実質的相同性を欠き、前記興味の配列が、非相同的末端接合によって前記染色体に挿入される、請求項4記載の方法。
- 真核細胞の染色体に挿入される興味の外因性配列を含む、遺伝学的に修飾された真核細胞を生産するための方法であって、
真核細胞にメガヌクレアーゼタンパクを導入すること;
及び、
前記興味の配列を含む核酸によって前記真核細胞をトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼが、前記染色体の中に切断部位を生産し、前記興味の配列が、前記切断部位において前記染色体の中に挿入され;
かつ、
前記メガヌクレアーゼが請求項1〜3のいずれか1項による組み換えメガヌクレアーゼであることを特徴とする方法。 - 前記核酸が、前記切断部位に側接する配列に対し相同な配列をさらに含み、前記興味の配列が、相同組み換えによって前記切断部位において挿入される、請求項7記載の方法。
- 前記核酸が、前記切断部位に対し実質的相同性を欠き、前記興味の配列が、非相同的末端接合によって前記染色体に挿入される、請求項7記載の方法。
- 真核細胞(但し、ヒト配偶子、ヒト接合子、及びヒト胚盤胞細胞を除く。)の染色体中の標的配列を破壊することによって遺伝学的に修飾された真核細胞を生産するための方法であって、
メガヌクレアーゼをコードする核酸によって真核細胞をトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼが、前記染色体の中に切断部位を生産し、前記標的配列が、前記切断部位において非相同的末端接合によって破壊され;
かつ、
前記メガヌクレアーゼが、請求項1〜3のいずれか1項による組み換えメガヌクレアーゼであることを特徴とする方法。 - 遺伝学的に修飾された生物体を生産する方法であって、
請求項4〜10のいずれか1項の方法に従って遺伝学的に修飾された真核細胞を生産するステップと、
及び、
前記遺伝学的に修飾された真核細胞を育成して遺伝学的に修飾された非ヒト生物体を生産するステップと、
を含む方法。 - 前記真核細胞が、非ヒト配偶子、非ヒト接合子、非ヒト胚盤胞細胞、胚幹細胞及びプロトプラスト細胞から成る群より選ばれる、請求項11記載の方法。
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