ES2533370T3 - Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia y afinidad de unión a ADN alteradas - Google Patents

Abstract

Un método para producir una célula eucariota genéticamente modificada que incluye una secuencia exógena insertada en un cromosoma de dicha célula eucariota, que comprende: transfectar una célula eucariota con uno o más ácidos nucleicos que incluyen (i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una meganucleasa, y (ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que incluye dicha secuencia exógena; en el que dicha meganucleasa produce un sitio de escisión en dicho cromosoma y dicha secuencia exógena se inserta en dicho cromosoma en dicho sitio de escisión; en el que dicha meganucleasa comprende un polipéptido que tiene al menos un 85 % de similitud de secuencia con los restos 6-160 de la meganucleasa 1-Msol de SEC ID Nº: 6; y en el que dicha meganucleasa tiene especificidad por un semisitio de secuencia de reconocimiento que difiere en al menos un par de bases de un semisitio dentro de una secuencia de reconocimiento de meganucleasa 1-Msol seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 7 y SEC ID Nº: 8; en el que: (1) se ha alterado la especificidad en la posición -1: (a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K75, Q77, A49, C49 y K79; (b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en C77, L77 y Q79, o (c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K77, R77, E49 y E79; y/o (2) se ha alterado la especificidad en la posición -2: (a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en Q75, K81, C47, 147 y L47; (b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E75, D75, R47, K47, K81 y R81; o (c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K75, E47 y E81; yo (3) se ha alterado la especificidad en la posición -3: (a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en Q72, C26, L26, V26, A26 y L26; (b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E72, Y72, H26, K26 y R26; o (c) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K72, Y72 y H26; y/o (4) se ha alterado la especificidad en la posición -4: (a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K28, K83 y Q28; (b) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R83 y K82, o (c) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K28 y Q83; y/o (5) se ha alterado la especificidad en la posición -5: (a) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R45 y E28; (b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación que comprende Q28; o (c) a una C en una hebra sentido mediante una modificación que comprende R28; y/o (6) se ha alterado la especificidad en la posición -6: (a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K43, V85, L85 y Q30; (b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E43, E85, K30 y R30; o (c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R43, K43, K85, R85, E30 y D30; y/o (7) se ha alterado la especificidad en la posición -7: (a) a una C en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en E32 y E41; (b) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en R32, R41 y K41; (c) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K32, M41, L41 e I41; y/o (8) se ha alterado la especificidad en la posición -8: (a) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K32 y K35; (b) a una C en una hebra sentido mediante una modificación que comprende E32; o (c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación que consiste en K32, K35 y R35; y/o (9) se ha alterado la especificidad en la posición -9; (a) a una A en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en N34 y H34; (b) a una T en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en S34, C34, V34, T34 y A34; o (c) a una G en una hebra sentido mediante una modificación seleccionada del grupo que consiste en K34, R34 y H34, en la que la meganucleasa recombinante no comprende los restos 6-160 de la meganucleasa I-Msol de SEC ID Nº: 6 con solo el par de modificaciones L28 y R83; y con la condición de que la célula no sea una célula germinal humana o una célula embrionaria humana.

Description

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recombinación homóloga reemplaza eficazmente la secuencia diana con la secuencia de interés. En otras realizaciones, la secuencia de interés se flanquea por secuencias de ADN con homología o similitud de secuencia sustancial con la secuencia diana de modo que la recombinación homóloga inserta la secuencia de interés dentro del genoma en el locus de la secuencia diana. En algunas realizaciones, la secuencia de interés es sustancialmente

5 idéntica a la secuencia diana excepto para mutaciones u otras modificaciones en la secuencia de reconocimiento de meganucleasa de modo que la meganucleasa no pueda escindir la secuencia diana después de que se haya modificado por la secuencia de interés.

Como se usa en el presente documento con respecto tanto a secuencias de aminoácidos como a secuencias de ácido nucleico, las expresiones “porcentaje de similitud” y “similitud de secuencia” se refieren a una medida del grado de similitud de dos secuencias basándose en una alineamiento de las secuencias que maximiza la similitud entre los restos de aminoácidos o nucleótidos alineados, y que está en función del número de restos o nucleótidos idénticos o similares, el número de restos o nucleótidos totales, y la presencia y longitud de huecos en el alineamiento de secuencia. Está disponible diversos algoritmos y programas informáticos para determinar la similitud de secuencia 15 usando parámetros convencionales. Como se usa en el presente documento, la similitud de secuencia se mide usando el programa BLASTp para secuencias de aminoácidos y el programa BLASTn para secuencias de ácidos nucleicos, ambos de los cuales están disponibles a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (www.ncbi.nlm.nih.gov/) y se describen en, por ejemplo, Altschul et al (1990), J. Mol. Biol. 215:403 -410; Gish y States (1993), Nature Genet. 3:266-272; Madden et al. (1996), Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:33 89-3402); Zhang et al. (2000), J. Comput. Biol. 7(1-2):203-14. Como se usa en el presente documento, el porcentaje de similitud de dos secuencias de aminoácidos es la puntuación basada en los siguientes parámetros para el algoritmo BLASTp: tamaño de la palabra = 3; penalización de apertura de hueco = -11; penalización de extensión de hueco = -1; y matriz de puntuación = BLOSUM62. Como se usa en el presente documento, el porcentaje de similitud de dos secuencias de ácido nucleico es la puntuación basada en los siguientes

25 parámetros para el algoritmo BLASTn: tamaño de palabra = 11; penalización de apertura de hueco = -5; penalización de extensión de hueco = -2; recompensa de coincidencia = 1; y penalización de emparejamiento erróneo = -3.

Como se usa en el presente documento con respecto a modificaciones de dos proteínas o secuencias de aminoácidos, la expresión “que corresponde a” se usa para indicar que una modificación especificada en la primera proteína es una sustitución del mismo resto de aminoácido que en la modificación en la segunda proteína, y que la posición de aminoácido de la modificación en las primeras proteínas corresponde a o se alinea con la posición de aminoácido de la modificación en la segunda proteína cuando las dos proteínas se someten a alineamientos de secuencia convencionales (por ejemplo, usando el programa BLASTp). Por lo tanto, la modificación del resto “X” al aminoácido “A” en la primera proteína se corresponderá con la modificación del resto “Y” a aminoácido “A” en la segunda proteína

35 si los restos X e Y se corresponden entre sí en un alineamiento de secuencia, y a pesar del hecho de que X e Y pueden ser números diferentes.

Como se usa en el presente documento, la enumeración de un intervalo numérico para una variable pretende transmitir que la invención puede practicarse con la variable igual a cualquiera de los valores dentro de ese intervalo. Por lo tanto, para una variable que es inherentemente discreta, la variable puede ser igual a cualquier valor de número entero dentro del intervalo numérico, incluyendo los puntos finales del intervalo. De forma similar, para una variable que es inherentemente continua, la variable puede ser igual a cualquier valor real dentro del intervalo numérico, incluyendo los puntos finales del intervalo. Como ejemplo, y sin limitación, una variable que se describe que tiene valores entre 0 y 2 puede tomar los valores 0, 1 ó 2 si la variable es inherentemente discreta, y puede tomar los valores

45 0,0, 0,1, 0,01, 0,001 o cualquier otro valor real > 0 y < 2 si la variable es inherentemente continua.

Como se usa en el presente documento, a no ser que se indique específicamente de otro modo, la palabra “o” se usa en el sentido inclusivo de “y/o” y no en el sentido exclusivo de “bien/o”

2.1 Meganucleasas diseñadas racionalmente con especificidad de secuencia alterada

Se describen métodos para diseñar racionalmente meganucleasas de la familia LAGLIDADG recombinantes. En este aspecto, se diseñan racionalmente meganucleasas recombinantes prediciendo primero las sustituciones de aminoácidos que pueden alterar la preferencia de bases en cada posición en el semi-sitio. Estas sustituciones pueden

55 validarse experimentalmente e individualmente o en combinaciones para producir meganucleasas con la especificidad de escisión deseada.

Se predicen sustituciones de aminoácidos que pueden provocar un cambio deseado en la preferencia de bases determinando las cadenas laterales de aminoácidos de una meganucleasa de referencia (por ejemplo, una meganucleasa de tipo silvestre o una meganucleasa de referencia de origen no natural) que son capaces de participar en la realización de contactos con las bases de ácidos nucleicos de la secuencia de reconocimiento de ADN de la meganucleasa y la cadena principal de fosfodiéster de ADN, y la naturaleza espacial y química de esos contactos. Estos aminoácidos incluyen pero sin limitación cadenas laterales implicadas en la puesta en contacto con el semi-sitio de ADN de referencia. Generalmente, esta determinación requiere tener conocimiento de la estructura del complejo 65 entre la meganucleasa y su secuencia de reconocimiento de ADN bicatenario, o conocimiento de la estructura de un complejo altamente similar (por ejemplo, entre la misma meganucleasa y una secuencia de reconocimiento de ADN

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Por lo tanto, en realizaciones específicas, se determina una estructura tridimensional de un complejo de meganucleasa-ADN y se define una “superficie de contacto” para cada par de bases en un semi-sitio de secuencia de reconocimiento de ADN. En algunas realizaciones, la superficie de contacto comprende los aminoácidos de la enzima con carbonos-p a menos de 9,0 A de un donador o aceptor con enlaces de hidrógeno en el surco principal en una de 5 las bases en el par, y con cadenas laterales orientadas hacia el ADN, independientemente de si los restos realizan contactos con las bases en el complejo de ADN-meganucleasa de tipo silvestre. En otras realizaciones, pueden excluirse restos si los restos no entran en contacto en el complejo de ADN-meganucleasa de tipo silvestre, o pueden incluirse o excluirse restos a discreción del diseñador para alterar el número o identidad de los restos considerados. En un ejemplo, como se describe posteriormente, para las posiciones de base -2, -7, -8 y -9 del semi-sitio de I-CreI de tipo

10 silvestre, las superficies de contacto se limitaron a las posiciones de aminoácidos que realmente interaccionan en el complejo de ADN-enzima de tipo silvestre. Para las posiciones -1, -3, -4, -5 y -6, sin embargo, se definió que las superficies de contacto contenían posiciones de aminoácidos adicionales que no estaban implicadas en contactos de tipo silvestre pero que podrían potencialmente entrar en contacto con una base si se sustituyeran con un aminoácido diferente.

15 Debería observarse que, aunque un semi-sitio de secuencia de reconocimiento se representa normalmente con respecto a solamente una hebra de ADN, las meganucleasas se unen en el surco principal de ADN bicatenario, y entran en contacto con bases de ácidos nucleicos en ambas cadenas. Además, las designaciones de hebras “sentido” y “antisentido” son completamente arbitrarias con respecto a la unión y reconocimiento de meganucleasas. La

20 especificidad de secuencia en una posición puede conseguirse a través de interacciones con un miembro de un par de bases, o por una combinación de interacciones con ambos miembros de un par de bases. Por lo tanto, por ejemplo, para favorecer la presencia de un par de bases A/T en la posición X, en la que la base A está en la hebra “sentido” y la base T está en la hebra “antisentido”, se seleccionan restos que están suficientemente cerca para entrar en contacto con la hebra sentido en la posición X y que favorece la presencia de una A y/o se seleccionan restos que están

25 suficientemente cerca para entrar en contacto con la hebra antisentido en la posición X y que favorecen la presencia de una T. Un resto se considera suficientemente cerca si el carbono-β del resto está a una distancia de 9 Å del átomo más cercano de la base relevante.

Por lo tanto, por ejemplo, un aminoácido con un carbono-β a una distancia de 9 Å de la hebra sentido de ADN pero

30 mayor de 9 A de la hebra antisentido se considera para interacciones potenciales solamente con la hebra sentido. De forma similar, un aminoácido con un carbono-β a una distancia de 9 Å de la hebra antisentido de ADN pero mayor de 9 A de la hebra sentido se considera para interacciones potenciales solamente con la hebra antisentido. Los aminoácidos con carbonos-p que están a una distancia de 9 Å de ambas hebras de ADN se consideran para interacciones potenciales con cualquiera de las hebras.

35 Para cada superficie de contacto, las sustituciones de aminoácidos potenciales se seleccionan basándose en su capacidad predicha para interaccionar favorablemente con una o más de las cuatro bases de ADN. El proceso de selección se basa en dos criterios primarios: (i) el tamaño de las cadenas laterales de aminoácidos, que afectará a sus interacciones estéricas con diferentes bases de ácido nucleico, y (ii) la naturaleza química de las cadenas laterales de

40 aminoácidos, que afectarán a sus interacciones electroestáticas y de enlace con las diferentes bases de ácido nucleico.

Con respecto al tamaño de las cadenas laterales, los aminoácidos con cadenas laterales más cortas y/o más pequeñas pueden seleccionarse si un carbono-β de aminoácido en una superficie de contacto está a <6 A de una

45 base, y pueden seleccionarse cadenas laterales más largas y/o mayores si un carbono-β de aminoácido en una superficie de contacto está a >6 A de una base. Pueden seleccionarse aminoácidos con cadenas laterales que son de tamaño intermedio si un carbono-β de aminoácido en una superficie de contacto está a 5-8 A de una base.

Los aminoácidos con cadenas laterales relativamente más cortas y más pequeñas pueden asignarse al Grupo 1,

50 incluyendo glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), cisteína (C), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), aspartato (D), asparagina (N) y prolina (P). Se espera, sin embargo, que la prolina se use menos frecuentemente debido a su inflexibilidad relativa. Además, se espera que la glicina se use menos frecuentemente debido a que introduce flexibilidad no deseada en la cadena principal peptídica y su tamaño muy pequeño reduce la probabilidad de contactos eficaces cuando reemplaza un resto más grande. Por otro lado, la glicina puede usarse en algunos casos para

55 promover una posición degenerada. Los aminoácidos con cadenas laterales de longitud y tamaño relativamente intermedio pueden asignarse al Grupo 2, incluyendo lisina (K), metionina (M), arginina (R), glutamato (E) y glutamina (Q). Los aminoácidos con cadenas laterales relativamente más largas y/o mayores pueden asignarse al Grupo 3, incluyendo lisina (K), metionina (M), arginina (R), histidina (H), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W). Se espera, sin embargo, que el triptófano se use menos frecuentemente debido a su inflexibilidad relativa. Además, la flexibilidad

60 de la cadena lateral de lisina, arginina y metionina permite que estos aminoácidos realicen contactos de base desde distancias largas o intermedias, garantizando su inclusión en los Grupos tanto 2 como 3. Estos grupos también se muestran en forma tabular a continuación.

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de reconocimiento de tipo silvestre, y las Figuras I(C)-(E) muestran las interacciones específicas entre los restos de aminoácidos de la enzima y bases en la posición -4 de un semi-sitio para tres meganucleasas diseñadas racionalmente de la invención con especificidad alterada en la posición -4 del semi-sitio.

5 Por lo tanto, la preferencia de bases en cualquier posición de base especificada del semi-sitio puede alterarse racionalmente a cada uno de los otros tres pares de bases usando los métodos descritos en el presente documento. En primer lugar, se determina la superficie de reconocimiento de tipo silvestre en la posición de base especificada (por ejemplo, analizando estructuras co-cristalinas del complejo de meganucleasa-ADN; o por realización de modelos informáticos de los complejos de meganucleasa-ADN). En segundo lugar, se determinan los restos de contacto

10 existentes y potenciales basándose en las distancias entre los carbonos p de las posiciones de aminoácidos circundantes y las bases de ácido nucleico en cada hebra de ADN en la posición de base especificada. Por ejemplo, y sin limitación, como se muestra en la Figura 1 (A), los restos de contacto de ADN-meganucleasa de tipo silvestre I-CreI en la posición -4 implican una glutamina en la posición 26 que realiza un enlace de hidrógeno con una base A en la hebra de ADN antisentido. El resto 77 también se identificó como potencialmente capaz de entrar en contacto con la

15 base -4 en la hebra sentido de ADN. El carbono p del resto 26 está a 5,9 A de distancia de N7 de la base A de la hebra de ADN antisentido, y el carbono p del resto 77 está a 7,15 A de distancia del metilo C5 de la T en la hebra sentido. De acuerdo con las reglas químicas de base y distancia descritas en el presente documento, una C en la hebra sentido podría realizar un enlace de hidrógeno con un ácido glutámico en la posición 77 y una G en la hebra antisentido podría enlazar con glutamina en la posición 26 (mediada por una molécula de agua, como se observa en la estructura

20 cristalina de I-CreI de tipo silvestre) (véase Figura 1 (C)); una G en la hebra sentido podría realizar un enlace de hidrógeno con una arginina en la posición 77 y una C en la hebra antisentido podría realizar un enlace de hidrógeno con un ácido glutámico en la posición 26 (véase Figura 1(D)); una A en la hebra sentido podría realizar un enlace de hidrógeno con una glutamina en la posición 77 y una T en la hebra antisentido podría formar contactos hidrófobos con una alanina en la posición 26 (véase Figura 1 (E)). Si el contacto específico de base se proporciona por la posición 77,

25 entonces el contacto de tipo silvestre, Q26, puede sustituirse (por ejemplo, con un resto de serina) para reducir o retirar su influencia en la especificidad. Como alternativa, pueden combinarse mutaciones complementarias en las posiciones 26 y 77 para especificar un par de bases particular (por ejemplo, A26 especifica una T en la hebra antisentido y Q77 especifica una A en la hebra sentido (Figura 1 (E)). Todas estas sustituciones de restos predichas se han validado experimentalmente.

30 Por lo tanto, de acuerdo con la invención, se ha identificado una variedad sustancial de modificaciones de aminoácidos para el dominio de reconocimiento de ADN de la meganucleasa I-CreI que, individualmente o en combinación, dan como resultado meganucleasas recombinantes con especificidades alteradas en bases individuales dentro del semi-sitio de secuencia de reconocimiento de ADN, de modo que estas meganucleasas diseñadas racionalmente

35 tienen semi-sitios diferentes de la enzima de tipo silvestre. Las modificaciones de aminoácidos de I-CreI y el cambio resultante en la especificidad del semi-sitio de secuencia de reconocimiento se muestran en la Tabla 1:

TABLA 1

Base de hebra sentido favorecida

Posn.

A C G T A/T A/C A/G C/T G/T A/G/T A/C/G/T

-1

Y75 R70* K70 Q70* T46* G70

L75*

H75* E70* C70 A70

C75*

R75* E75* L70 S70

Y139*

H46* E46* Y75* G46*

C46* A46*

K46* R46* D46* Q75* H75*

H139

Q46* H46*

-2

Q70 E70 H70 Q44* C44*

T44*

D70 D44*

A44*

K4* E44*

V44* I44*

R44*

L44*

N44*

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-3

Q68 C24* E68 F68 R68 M68 C68 H68 Y68 K68

I24*

K24* L68

R24*

F68

-4

A26* E77 R77 S77 S26*

Q77

K26* E26* Q26*

-5

E42 R42 K28* C28* Q42 M66 K66

-6

Q40 C28* E40 R28* R40 C40 I40 A40 A79 S40 S28*

V40

A28*

C79

H28*

I79 V79

Q28*

-7

N30* E38 K38 I38 C38 H38

Q38

K30* R38 L38 N38

R30*

E30* Q30*

-8

F33 Y33 E33 D33 F33 H33 L33 V33 I33 F33 C33 R32* R33

-9

E32 R32 L32 D32 S32

K32

V32 132 N32

A32

H32

C32

Q32 T32

Las entradas en negrita son resto de contacto de tipo silvestre y no constituyen “modificaciones” como se usan en el presente documento. 5 Un asterisco indica que el resto entra en contacto con la base en la hebra antisentido

2.2.2 Meganucleasas derivadas de I-MsoI

10 En otro aspecto, la presente invención se refiere a meganucleasas diseñadas racionalmente que se basan en o derivan de la meganucleasa I-MsoI de Monomastix sp. La secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la meganucleasa I-MsoI se muestra en SEC ID N°: 6, que corresponde al N0 de acceso de Genbank AAL34387. A continuación se muestran dos semi-sitios de secuencia de reconocimiento de la meganucleasa I-MsoI de tipo silvestre a partir de la estructura cristalina PDB N°1M5X:

15

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Obsérvese que la secuencia de reconocimiento no es perfectamente palindrómica, incluso fuera de los cuatro pares de bases centrales. Los dos semi-sitios de secuencia de reconocimiento se muestran en negrita en sus hebras sentido respectivas.

5 Se ha identificado un número sustancial de modificaciones de aminoácidos para el dominio de reconocimiento de ADN de la meganucleasa I-MsoI que, individualmente o en combinación, pueden dar como resultado meganucleasas recombinantes con especificidades alteradas en bases individuales dentro de los semi-sitios de secuencia de reconocimiento de ADN, de modo que estas meganucleasas diseñadas racionalmente tienen secuencias de reconocimiento diferentes de la enzima de tipo silvestre. Se muestran modificaciones de aminoácidos de I-MsoI y el

10 cambio predicho en la especificidad de semi-sitio de secuencia de reconocimiento en la Tabla 2:

TABLA 2

Base de hebra sentido favorecida

Posición

A C G T

-1

K75* Q77 A49* C49* K79* D77 E77 K49* R75* K75* R79* K79* K77 R77 E49* E79* C77 L77 Q79*

-2

Q75 K81 C47* I47* L47* E75 D75 R47* K47* K81* R81* K75 E47* E81* A75 C75 V75 175 T75 Q47* Q81 *

-3

Q72 C26* L26* V26* A26* I26* E72 Y72 H26* K26* R26* R72 K72 Y26* F26* K72 Y72 H26*

-4

K28 Q83 K28* R28* E83 R83 K83 K28 K83 Q28*

-5

K28 C28* L28* I28* K28* R28* R45 E28* Q28*

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-6

I30* V30* S30* L30* Q43 E43 E85 K30* R30* R43 K43 K85 R85 E30* D30* K43 185 V85 L85 Q30*

-7

Q41 E32 E41 R32 R41 K41 K32 M41 L41 141

-8

Y35 K35 E32 R32 K32 K35 R35 K32 K35

-9

N34 H34 D34 E34 S34 K34 R34 H34 S34 C34 V34 T34 A34

Las entradas en negrita representan restos de contacto de tipo silvestre y no constituyen “modificaciones” como se usa en el presente documento. Un asterisco indica que el resto entra en contacto con la base en la hebra antisentido. 5

2.2.3 Meganucleasas derivadas de I-SceI

En otro aspecto, la presente invención se refiere a meganucleasas diseñadas racionalmente que se basan en, o derivan de, la meganucleasa I-SceI de Saccharomyces cerevisiae. La secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la

10 meganucleasa I-SceI se muestra en SEC ID N°: 9, que corresponde al N0 de acceso de Genbank CAA09843. La secuencia de reconocimiento de la meganucleasa de I-SceI de tipo silvestre de la estructura cristalina PDB N°1R7M se muestra a continuación:

Sentido 5'-TTACCCTGTT A T C C C T A G-3'SECID N°10

Antisentido 3'-AA TGGGACAA T A G G G A T C-5' SECIDN°11

Posición 1 2345678910 11 12 13 14 15 16 17 18

15 Obsérvese que la secuencia de reconocimiento no es palindrómica y que no hay cuatro pares de bases que separen los semi-sitios.

Se ha identificado una variedad sustancial de modificaciones de aminoácidos para el dominio de reconocimiento de ADN de la meganucleasa I-SceI que, individualmente o en combinación, pueden dar como resultado meganucleasas

20 recombinantes con especificidades alteradas en bases individuales dentro de la secuencia de reconocimiento de ADN, de modo que estas meganucleasas diseñadas racionalmente tienen secuencias de reconocimiento diferentes de la enzima de tipo silvestre. Las modificaciones de aminoácidos de I-SceI y el cambio predicho en la especificidad de secuencia de reconocimiento se muestran en la Tabla 3:

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TABLA 3

Base de hebra sentido favorecida

Posición

A C G T

4

K50 R50* K50* E57 E50* R57 K57 K57 M57 Q50*

5

K48 Q102 R48* K48* E102 E59 E48* K102 R102 Q48* C102 L102 V102

6

K59 R59* K59* K84 E59* Q59* Y46

7

C46* L46* V46* R46* K46* E86 K86 R86 E46* K68 C86 L86 Q46*

8

K61* S61* V61* A61* L61* E88 R61* H61* E61* R88 K88 K88 Q61* H61*

9

T98* C98* V98* L98* R98* K98* E98* D98* Q98*

10

V96* C96* A96* K96* R96* D96* E96* Q96*

11

C90* L90* K90* R90* E90* Q90*

12

Q193 E165 E193 D193 K165 R165 C165 L165 C193 V193

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Base de hebra sentido favorecida

Posición

A C G T

A193 T193 S193

13

C193* L193* K193* R193* D192 E193* D193* K163 R192 Q193* C163 L163

14

L192* C192* E161 R192* K192* K147 K161 R161 R197 D192* E192* K161 Q192*

15

E151 K151 C151 L151 K151

17

N152* S152* C150* L150* V150* T150* K152* K150* N152* S152* D152* D150* E150* Q152* Q150*

18

K155* C155* R155* K155* E155* H155* Y155*

Las entradas en negrita son restos de contacto de tipo silvestre y no constituyen “modificaciones” como se usa en el presente documento. Un asterisco indica que el resto entra en contacto con la base en la hebra antisentido.

5

2.2.4 Meganucleasas derivadas de I-CeuI

En otro aspecto, se describen meganucleasas diseñadas racionalmente que se basan en o derivan de la meganucleasa I-CeuI de Chlamydomonas eugametos. La secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la

10 meganucleasa I-CeuI se muestra en SEC ID N°: 12, que corresponde al N0 de acceso de Genbank P32761. A continuación se muestran dos semi-sitios de secuencia de reconocimiento de la meganucleasa I-CeuI de tipo silvestre de la estructura cristalina PDB N°2EX5:

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Obsérvese que la secuencia de reconocimiento no es palindrómica, incluso fuera de los cuatro pares de bases centrales, a pesar del hecho de que I-CeuI es un homodímero, debido a la degeneración natural de la interfaz de 5 reconocimiento de I-CeuI (Spiegel et al (2006), Structure 14:869-80). Los dos semi-sitios de secuencia de reconocimiento se muestran en negrita en sus hebras sentido respectivas.

Se ha identificado una variedad sustancial de modificaciones de aminoácidos para el dominio de reconocimiento de ADN de la meganucleasa I-CeuI que, individualmente o en combinación, dan como resultado meganucleasas

10 recombinantes con especificidades alteradas en bases individuales dentro del semi-sitio de secuencia de reconocimiento de ADN, de modo que estas meganucleasas diseñadas racionalmente puedan tener secuencias de reconocimiento diferentes de la enzima de tipo silvestre. Las modificaciones de aminoácidos de I-CeuI y el cambio predicho en la especificidad de secuencia de reconocimiento se muestran en la Tabla 4:

15 TABLA 4

Base de hebra sentido favorecida

Posición

A C G T

-1

C92* A92* V92* K116* R116* D116* K92* E116* E92* Q116* Q92*

-2

Q117 C90* L90* V90* E117 D117 R174* K124* K90* R90* K68* K117 R124 K124 E124* E90* D90* C117 V117 T117 Q90*

-3

C70* V70* T70* L70* K70* K70* E70* E88* Q70*

-4

Q126 N126 K88* L88* C88* C72* L72* V72* E126 D126 R88* K88* K72* R126 K126 E88* D88* K126 L126 Q88*

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-5

C74* L74* V74* T74* K74* E74* K128 R128 E128 C128 L128 V128 T128

-6

Q86 D86 E86 R84* K84* K128 R128 R86 K86 E84* K86 C86 L86

-7

L76* C76* K76* R76* K76* H76* E76* R84 H76* Q76*

-8

Y79 R79 Q76 D79 E79 D76 E76 R79 K79 K76 R76 C79 L79 V79 L76

-9

Q78 N78 H78 K78 D78 E78 R78 K78 H78 K78 V78 L78 C78 T78

Las entradas en negrita son restos de contacto de tipo silvestre y no constituyen “modificaciones” como se usa en el presente documento. 5 Un asterisco indica que el resto entra en contacto con la base en la hebra antisentido.

2.2.5 Meganucleasas recombinante específicamente excluidas

La presente invención no pretende adoptar ciertas meganucleasas recombinantes que se han descrito en la técnica

10 anterior y que se han desarrollado por métodos alternativos. Estas meganucleasas excluidas incluyen las descritas por Arnould et al (2006), J. Mol Biol. 355:443-58; Sussman et al (2004), J. Mol Biol. 342:31-41; Chames et al (2005), Nucleic Acids Res 33: e178; Seligman et al (2002), Nucleic Acids Res 30:3870-9; y Ashworth et al (2006), Nature 441 (7093): 656-659; las descripciones completas de las cuales se incorporan por la presente por referencia, incluyendo meganucleasas recombinantes basadas en I-CreI con sustituciones sencillas seleccionadas de C33, R33, A44, H33,

15 K32, F33, R32, A28, A70, E33, V33, A26 y R66. También se excluyen meganucleasas recombinantes basadas en I-CreI con tres sustituciones seleccionadas de A68/N70/N75 y D44/D70/N75, o con cuatro sustituciones seleccionadas de K44/T68/G60/N75 y R44/A68/T70/N75. En último lugar, se excluye específicamente la meganucleasa recombinante basada en I-MsoI con el par de sustituciones L28 y R83. Estas sustituciones o combinaciones de sustituciones se denominan en el presente documento “modificaciones excluidas”.

20

2.2.6 Meganucleasas con múltiples cambios en el semi-sitio de secuencia de reconocimiento

En otro aspecto, se describen meganucleasas diseñadas racionalmente que se producen combinando dos o más modificaciones de aminoácidos como se describe en las secciones 2.2.1-2.2.4 anteriores, para alterar la preferencia 25 de semi-sitio en dos o más posiciones en un semi-sitio de secuencia de reconocimiento de ADN. Por ejemplo, sin limitación, y como se describe más completamente posteriormente, la enzima DJ1 derivó de ICreI incorporando las modificaciones R30/E38 (que favorecen C en la posición -7), R40 (que favorece G en la posición -6), R42 (que favorece G en la posición -5) y N32 (que favorece degeneración completa en la posición -9). La meganucleasa DJ1 diseñada racionalmente reconoce de forma invariable C-7 G-6 G-5 en comparación con la preferencia de tipo silvestre

30 por A.7 A-6 C.5, y tiene tolerancia aumentada para A en la posición -9.

La capacidad para combinar sustituciones de restos que afectan a diferentes posiciones de bases se debe en parte a la naturaleza modular de las meganucleasas LAGLIDADG. Una mayoría de los contactos de base en las interfaces de reconocimiento de LAGLIDADG se realizan por cadenas laterales de aminoácidos individuales, y la interfaz está

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relativamente sin interconectividad o redes de enlaces de hidrógeno entre cadenas laterales que interaccionan con bases adyacentes. Esto generalmente permite la manipulación de restos que interaccionan con una posición de base sin afectar a las interacciones de cadenas laterales en bases adyacentes. La naturaleza aditiva de las mutaciones enumeradas en las secciones 2.2.1-2.2.4 anteriores también es un resultado directo del método usado para identificar

5 estas mutaciones. El método predice sustituciones de cadenas laterales que interaccionan directamente con una base sencilla. Generalmente se evita la interconectividad o redes de enlaces de hidrógenos entre cadenas laterales para mantener la independencia de las sustituciones dentro de la interfaz de reconocimiento.

Ciertas combinaciones de sustituciones de cadenas laterales son completa o parcialmente incompatibles entre sí.

10 Cuando se incorpora un par o conjunto incompatible de aminoácidos en una meganucleasa diseñada racionalmente, la enzima resultante tendrá actividad catalítica reducida o eliminada. Normalmente, estas incompatibilidades se deben a interferencia estérica entre las cadenas laterales de los aminoácidos introducidos y la actividad puede restaurarse identificando y retirando esta interferencia. Específicamente, cuando se incorporan dos aminoácidos con cadenas laterales grandes (por ejemplo, aminoácidos de los grupo 2 ó 3) en posiciones de aminoácidos que están adyacentes

15 entre sí en la estructura de meganucleasa (por ejemplo, posiciones 32 y 33, 28 y 40, 28 y 42, 42 y 77 ó 68 y 77 en el caso de meganucleasas derivadas de I-CreI), es probable que estos dos aminoácidos interfieran entre sí y reduzcan la actividad enzimática. Esta interferencia puede eliminarse sustituyendo uno o ambos aminoácidos incompatibles a un aminoácido con una cadena lateral más pequeña (por ejemplo, grupo 1 o grupo 2). Por ejemplo, en meganucleasas diseñadas racionalmente derivadas de I-CreI, K28 interfiere tanto con R40 como con R42. Para maximizar la actividad

20 enzimática, R40 y R42 pueden combinarse con una serina o ácido aspártico en la posición 28.

Pueden usarse combinaciones de sustituciones de amino, identificadas como se describe en el presente documento, para alterar racionalmente la especificidad de una meganucleasa de tipo silvestre (o una meganucleasa previamente modificada) a partir de una secuencia de reconocimiento original a una secuencia de reconocimiento deseada que 25 puede estar presente en un ácido nucleico de interés (por ejemplo, un genoma). La Figura 2A, por ejemplo, muestra la hebra “sentido” de la secuencia de reconocimiento de meganucleasa I-CreI WT (SEC ID N°: 4) así como varias otras secuencias para las que sería útil una meganucleasa diseñada racionalmente. Las bases conservadas entre la secuencia de reconocimiento WT y la secuencia de reconocimiento deseada están sombreadas. De acuerdo con la invención, pueden diseñarse racionalmente meganucleasas recombinantes basadas en la meganucleasa I-CreI para

30 cada una de estas secuencias de reconocimiento deseadas, así como cualquier otra, por sustituciones de aminoácidos adecuadas como se describe en el presente documento.

3. Meganucleasas diseñadas racionalmente con afinidad de unión a ADN alterada

35 Como se ha descrito anteriormente, la afinidad de unión a ADN de las meganucleasas recombinantes de la invención pueden modularse alterando ciertos aminoácidos que forman la superficie de contacto con la cadena principal de fosfodiéster de ADN. La superficie de contacto comprende los aminoácidos en la enzima con carbonosp a menos de 9 A de la cadena principal de ADN y con cadenas laterales orientadas hacia el ADN, independientemente de si los restos realizan contactos con la cadena principal de ADN en el complejo de ADN-meganucleasa de tipo silvestre. Debido a

40 que la unión con ADN es un precursor necesario para la actividad enzimática, se ha mostrado que los aumentos/reducciones de la afinidad de unión con ADN provocan aumentos/ reducciones, respectivamente, en la actividad enzimática. Sin embargo, también se mostrado que los aumentos/reducciones de la afinidad de unión con ADN provocan reducciones/aumentos en la especificidad de secuencia de meganucleasa. Por lo tanto, tanto la actividad como la especificidad pueden modularse modificando los contactos de cadena principal de fosfodiéster.

45 Específicamente, para aumentar la actividad enzimática/reducir la especificidad enzimática:

(i) Retirar repulsión electrostática entre la enzima y cadena principal de ADN. Si un aminoácido identificado tiene una cadena lateral cargada negativamente (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) que se esperaría que

50 repeliera la cadena principal de ADN cargado negativamente, la repulsión puede eliminarse sustituyendo un aminoácido con una cadena lateral cargada positivamente o no cargada, sometida a efectos de interferencia estérica. Un ejemplo verificado experimentalmente es la mutación de ácido glutámico 80 en I-CreI a glutamina.

(ii) Introducir interacción de atracción electrostática entre la enzima y la cadena principal de ADN. En cualquiera de las posiciones de la superficie de contacto, se espera que la introducción de un aminoácido con una cadena lateral

55 cargada positivamente (por ejemplo, lisina o arginina) aumente la afinidad de unión, sujeta a efectos de interferencia estérica.

(iii) Introducir un enlace de hidrógeno entre la enzima y la cadena principal del ADN. Si un aminoácido de la superficie de contacto no realiza un enlace de hidrógeno con la cadena principal de ADN debido a que carece de una funcionalidad de enlaces de hidrógeno apropiada o tiene una cadena lateral que es demasiado corta,

60 demasiado larga y/o demasiado inflexible para interaccionar con la cadena principal de ADN, puede introducirse un aminoácido polar capaz de donar un enlace de hidrógeno (por ejemplo, serina, treonina, tirosina, histidina, glutamina, asparagina, lisina, cisteína o arginina) con la longitud y flexibilidad apropiadas, sujeto a efectos de interferencia estérica.

65 Específicamente, para reducir la actividad enzimática/aumentar la especificidad enzimática:

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específicamente una rotura de doble cadena en un sitio sencillo o en relativamente pocos sitios en el ADN genómico de una célula o un organismo para (a) posibilitar la inserción o las inserciones poco comunes de una secuencia de interés por unión de extremos no homólogos o (b) posibilitar la rotura de la secuencia diana por unión de extremos no homólogos. Como se usa en el presente documento con respecto a recombinación homóloga o unión de extremos no

5 homólogos de secuencias de interés, el término “inserción” significa la ligación de una secuencia de interés en un cromosoma de modo que la secuencia de interés se integra en el cromosoma. En el caso de recombinación homóloga, una secuencia insertada puede reemplazar una secuencia endógena, de modo que el ADN original se reemplaza por ADN exógeno de igual longitud, pero con una secuencia de nucleótidos alterada. Como alternativa, una secuencia insertada puede incluir más o menos bases que la secuencia que reemplaza.

Por lo tanto, de acuerdo con este aspecto de la invención, los organismos recombinantes incluyen, pero sin limitación, especies vegetales monocotiledóneas tales como arroz, trigo, maíz y centeno, y especies dicotiledóneas tales como legumbres (por ejemplo, alubias, soja, lentejas, cacahuetes, guisantes), alfalfa, trébol, tabaco y especies de Arabidopsis. Además, los organismos recombinantes pueden incluir, pero sin limitación, animales tales como seres

15 humanos y primates no humanos, caballos, vacas, cabras, cerdos, ovejas, perros, gatos, cobayas, ratas, ratones, lagartos, peces e insectos tales como especies de Drosophila. En otras realizaciones, el organismo es un hongo tal como una especie de Candida, Neurospora o Saccharomyces.

En algunas realizaciones, los métodos de la invención implican la introducción de una secuencia de interés en una célula tal como una célula germinal o célula madre que pueda convertirse en un organismo recombinante maduro o permita que el organismo modificado genéticamente resultante dé lugar a descendencia que porta la secuencia insertada de interés en su genoma.

Pueden suministrarse proteínas de meganucleasa a células para escindir ADN genómico, lo que posibilita la

25 recombinación homóloga o unión a extremos no homólogos en el sitio de escisión con una secuencia de interés, por diversos mecanismos diferentes conocidos en la técnica. Por ejemplo, la proteína meganucleasa recombinante puede introducirse en una célula por técnicas que incluyen, pero sin limitación, microinyección o transfecciones de liposomas (véase, por ejemplo, Lipofectamine, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). La formulación de liposomas puede usarse para facilitar la fusión de bicapas lipídicas con una célula diana, permitiendo de este modo que los contenidos del liposoma

o proteínas asociadas con su superficie se introduzcan en la célula. Como alternativa, la enzima puede fusionarse con un péptido de captación apropiado tal como el de la proteína TAT de VIH para dirigir la captación celular (véase, por ejemplo, Mudez et al. (2005), Med. Res. Rev. 25: 679-736).

Como alternativa, se insertan secuencias génicas que codifican la proteína meganucleasa en un vector y se

35 transfectan en una célula eucariota usando técnicas conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley 1999). La secuencia de interés puede introducirse en el mismo vector, un vector diferente, o por otros medios conocidos en la materia.

Los ejemplos no limitantes de vectores para transfección de ADN incluyen vectores de virus, plásmidos, cósmidos y vectores YAC. La transfección de secuencias de ADN puede conseguirse por diversos métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, se usan liposomas e inmunoliposomas para suministran secuencias de ADN a células (véase, por ejemplo, Lasic et al. (1995), Science 267: 1275-76). Además, pueden utilizarse virus para introducir vectores en células (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N0 7.037.492). Como alternativa, pueden utilizarse estrategias de transfección de modo que los vectores se introduzcan como ADN desnudo (véase, por

45 ejemplo, Rui et al. (2002), Life Sci. 71(15): 1771-8).

Los métodos generales para suministrar ácidos nucleicos a células incluyen: (1) métodos químicos (Graham et al. (1973), Virology 54(2): 536-539; Zatloukal et al. (1992), Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:136-153); (2) métodos físicos tales como microinyección (Capecchi (1980), Cell 22(2): 479-488), electroporación (Wong et al. (1982), Biochim. Biophys. Res. Commun. 107(2): 584-587; Fromm et al. (1985), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82(17): 5824-5828; Patente de Estados Unidos N0 5.384.253) e inyección balística (Johnston et al. (1994), Methods Cell. Biol. 43(A): 353-365; Fynan et al. (1993), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90 (24): 11478-11482); (3) vectores virales (Clapp (1993), Clin. Perinatol. 20(1): 155-168; Lu et al. (1993), J. Exp. Med. 178 (6):2089-2096; Eglitis et al. (1988), Avd. Exp. Med. Biol. 241: 19-27; Eglitis et al. (1988), Biotechniques 6(7): 608-614); y (4) mecanismos mediados por receptor (Curiel et al. (1991), Proc.

55 Nat'l Acad. Sci. USA 88(19): 8850-8854; Curiel et al. (1992), Hum. Gen. Ther. 3(2): 147-154; Wagner et al. (1992), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89 (13): 6099-6103).

En ciertas realizaciones, se produce una planta modificada genéticamente, que contiene la secuencia de interés insertada en el genoma. En ciertas realizaciones, la planta modificada genéticamente se produce transfectando la célula vegetal con secuencias de ADN correspondientes a la meganucleasa recombinante y la secuencia de interés, que puede estar o no flanqueada por las secuencias de reconocimiento de meganucleasa y/o secuencias sustancialmente idénticas a la secuencia diana. En otras realizaciones, la planta modificada genéticamente se produce transfectando la célula vegetal con secuencias de ADN correspondientes a la meganucleasa recombinante solamente, de modo que la escisión promueva unión de extremos no homólogos y rompa la secuencia diana que contiene la 65 secuencia de reconocimiento. En tales realizaciones, las secuencias de meganucleasa están bajo el control de secuencias reguladoras que posibilitan la expresión de la meganucleasa en las células vegetales hospedadoras. Estas

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secuencias reguladoras incluyen, pero sin limitación, promotores vegetales constitutivos tales como el promotor NOS, promotores génicos inducibles químicamente tales como el promotor inducible por dexametasona (véase, por ejemplo, Gremillon et al. (2004), Plant J. 37: 218-228), y promotores específicos de tejido vegetal tales como el promotor LGC1 (véase, por ejemplo, Singh et al. (2003), FEBS Lett. 542: 47-52).

5 Los métodos adecuados para introducir ADN en células vegetales incluyen prácticamente cualquier método por el que pueda introducirse ADN en una célula, incluyendo pero sin limitación una infección de Agrobacterium, transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh et al. (1993), Plant Molecular Biology, 21: 415-428), captación de ADN mediada por inhibición/desecación, electroporación, agitación con fibras de carburo de silicio, inyección balística o

10 bombardeo de microproyectiles y similares.

En otras realizaciones, se produce un animal modificado genéticamente usando una meganucleasa recombinante. Como con células vegetales, las secuencias de ácido nucleico pueden introducirse en una célula germinal o una célula que con el tiempo se convertirá en un organismo transgénico. En algunas realizaciones, la célula es un huevo 15 fertilizado, y pueden inyectarse moléculas de ADN exógeno en el pro-núcleo del huevo fertilizado. Los huevos microinyectados se transfieren a los oviductos de madres adoptivas seudoembarazadas y se permite que se desarrollen. La meganucleasa recombinante se expresa en el huevo fertilizado (por ejemplo, bajo el control de un promotor constitutivo tal como 3-fosfoglicerato quinasa) y facilita la recombinación homóloga de la secuencia de interés en uno o varios sitios discretos en el genoma. Como alternativa, los animales modificados genéticamente

20 pueden obtenerse utilizando células madre embrionarias recombinantes (“ES”) para la generación de los organismos transgénicos, como se describe en Gossler et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065 9069.

En ciertas realizaciones, un vector de expresión de mamíferos recombinante es capaz de dirigir la expresión específica de tejido del ácido nucleico preferentemente en un tipo celular particular. Se conocen en la técnica elementos 25 reguladores específicos de tejido. Los ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert et al. (1987), Genes Dev. 1: 268-277), promotores específicos linfoides (Calame y Eaton (1988), Adv. Immunol. 43: 235-275), en promotores particulares de receptores de linfocitos T (Winoto y Baltimore (1989), EMBO J. 8: 729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983), Cell 33: 729-740; Queen y Baltimore (1983), Cell 33: 741-748), promotores específicos de neuronas (por ejemplo, el promotor de 30 neurofilamentos; Byrne y Ruddle (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), promotores específicos del páncreas (Edlund et al. (1985), Science 230: 912-916) y promotores específicos de glándula mamaria (por ejemplo, promotor de suero de la leche; Patente de Estados Unidos N0 4.873.316 y Publicación de Patente Europea EP 0 264 166). También se abarcan promotores regulados por el desarrollo, por ejemplo, los promotores de hox murinos (Kessel y Gruss (1990), Science 249: 374-379) y el promotor de a-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989), Genes Dev. 3:

35 537-546).

En ciertas realizaciones, una meganucleasa diseñada racionalmente puede marcarse con un epítopo peptídico (por ejemplo, un epítopo HA, FLAG o Myc) para controlar los niveles de expresión o localización. En algunas realizaciones, la meganucleasa puede fusionarse con una señal de localización subcelular tal como una señal de localización nuclear

40 (por ejemplo, la señal de localización nuclear de SV40) o señales de localización de cloroplastos o mitocondrias. En otras realizaciones, la meganucleasa puede fusionarse con una señal de exportación nuclear para situarla en el citoplasma. La meganucleasa también puede fusionarse con una proteína no relacionada o dominio proteico tal como una proteína que estimula la recombinación homóloga o reparación de ADN (por ejemplo, recA, RAD51, RAD52, RAD54, RAD57 o BRCA2).

45

6. Métodos para Terapia Génica

Se describe el uso de meganucleasa recombinante para terapia génica. Como se usa en el presente documento, “terapia génica” significa tratamientos terapéuticos que comprenden introducir en un paciente una copia funcional de al 50 menos un gen, o secuencia reguladora génica tal como un promotor, potenciador o silenciador para reemplazar un gen

o región reguladora génica que sea defectuosa en su estructura y/o función. La expresión “terapia génica” también puede referirse a modificaciones hechas a un gen deletéreo o elemento regulador (por ejemplo, oncogenes) que reduce o elimina la expresión del gen. Puede realizarse terapia génica para tratar afecciones congénitas, afecciones resultantes de mutaciones o daño a loci genéticos específicos durante la vida del paciente, o afecciones resultantes de

55 organismos infecciosos.

Pueden reemplazarse o deshabilitarse genes disfuncionales por la inserción de secuencias de ácido nucleico exógeno en una región del genoma que afecta a la expresión génica. En ciertas realizaciones, la meganucleasa recombinante se dirige a una secuencia particular en la región del genoma para modificar de modo que alivie la afección. La

60 secuencia puede ser una región dentro de un exón, intrón, promotor u otra región reguladora que esté provocando expresión disfuncional del gen. Como se usa en el presente documento, la expresión “expresión disfuncional” significa expresión aberrante de un producto génico porque la célula produce muy poco del producto génico, demasiado del producto génico, o produce un producto génico que tiene una función diferente tal como sin la función necesaria o que tiene más funciones que la necesaria.

65

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Pueden usarse secuencias de ácido nucleico exógeno insertadas en la región modificada para proporcionar secuencias “reparadas” que normalizan el gen. Puede conseguirse reparación génica por la introducción de secuencias génicas apropiadas en el gen lo que permite que se restablezca la función apropiada. En estas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico para insertar puede ser la secuencia codificante completa de una

5 proteína o, en ciertas realizaciones, un fragmento del gen que comprende solamente la región para reparar. En otras realizaciones la secuencia de ácido nucleico para insertar comprende una secuencia promotora u otros elementos reguladores de modo que se reparen mutaciones que provocan expresión o regulación anómala. En otras realizaciones, la secuencia de ácido nucleico para insertar contiene el codón de parada de la traducción apropiado que falta en un gen mutado. La secuencia de ácido nucleico también puede tener secuencias para detener la transcripción en un gen recombinante sin señales de parada de la transcripción apropiadas.

Como alternativa, las secuencias de ácido nucleico pueden eliminar la función génica completamente rompiendo la secuencia reguladora del gen o proporcionando un silenciador para eliminar la función génica. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico exógena proporciona un codón de parada de la traducción para evitar la 15 expresión del producto génico. En otras realizaciones, las secuencias de ácido nucleico exógeno proporcionan elemento de parada de la transcripción para evitar la expresión de una molécula de ARN de longitud completa. En otras realizaciones más, la función génica se rompe directamente por la meganucleasa introduciendo inserciones de bases, supresiones de bases y/o mutaciones de desplazamiento de fase a través de unión de extremos no homólogos.

En muchos casos, es deseable dirigir las secuencias genéticas apropiadas a una célula o población de células diana que es la causa de la patología. Dicha dirección de agentes terapéuticos evita que los agentes terapéuticos se dirijan a células sanas. Esto aumenta la eficacia del tratamiento, reduciendo a la vez los efectos potencialmente negativos que el tratamiento podría tener en células sanas.

25 El suministro de genes de meganucleasa recombinantes y la secuencia de interés para insertar en el genoma de las células de interés puede conseguirse por diversos mecanismos. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se suministran a las células por medio de virus con genes virales particulares inactivados para evitar la reproducción del virus. Por lo tanto, un virus puede alterarse de modo que sea capaz solamente de suministro y mantenimiento dentro de una célula diana, pero no conserve la capacidad para replicarse dentro de la célula o tejido diana. Pueden introducirse una o más secuencias de ADN en el genoma viral alterado, para producir un genoma viral que actúe como un vector, y puede o no insertarse en un genoma hospedador y expresarse posteriormente. Más específicamente, ciertas realizaciones incluyen emplear un vector retroviral tal como, pero sin limitación, los vectores MFG o pLJ. Un vector MFG es un vector de virus de leucemia murina de Moloney simplificado (MoMLV) en el que las secuencias de ADN que codifican las proteínas pol y env se han suprimido para hacerlo defectuoso para replicación. Un vector

35 retroviral pLJ también es una forma del MoMLV (véase, por ejemplo, Korman et al. (1987), Proc. Nat'l Acad. Sci., 84: 2150-2154). En otras realizaciones, puede usarse un adenovirus recombinante o virus adeno-asociado como un vector de suministro.

En otras realizaciones, el suministro de proteína meganucleasa recombinante y/o secuencias génicas de meganucleasa recombinante a una célula diana se consigue mediante el uso de liposomas. La producción de liposomas que contienen cargas de ácido nucleico y/o proteína se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Lasic et al. (1995), Science 267: 1275-76). Los inmunoliposomas incorporan anticuerpos contra antígenos asociados a células en liposomas, y pueden suministrar secuencias de ADN para la meganucleasa o la meganucleasa en sí misma a tipos celulares específicos (véase, por ejemplo, Lasic et al. (1995), Science 267: 1275-76; Young et al. (2005), J. Calif. Dent.

45 Assoc. 33(12): 967-71; Pfeiffer et al. (2006), J. Vasc. Surg. 43(5):1021-7). Se conocen bien en la técnica métodos para producir y usar formulaciones de liposomas (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N0 6.316.024, Patente de Estados Unidos N0 6.379.699, Patente de Estados Unidos N0 6.387.397, Patente de Estados Unidos N0 6.511.676 y Patente de Estados Unidos N0 6,593,308 y referencias citadas en las mismas). En algunas realizaciones, se usan liposomas para suministrar las secuencias de interés así como la proteína meganucleasa recombinante o secuencias génicas de meganucleasa recombinante.

7. Métodos para Tratar Infección por Patógenos

Se describen métodos para tratar infección por un patógeno. Los organismos patógenos incluyen virus tales como,

55 pero sin limitación, virus del herpes simple 1, virus del herpes simple 2, virus de la inmunodeficiencia humana 1, virus de la inmunodeficiencia humana 2, virus variola, virus de la polio, virus de Epstein-Barr y virus del papiloma humano, y organismos bacterianos tales como, pero sin limitación, Bacillus anthracis, especies de Haemophilus, especies de Pneumococcus, Staphylococcus aureus, especies de Streptococcus, Staphylococcus aureus resistente a meticilina y Mycoplasma tuberculosis. Los organismos patógenos también incluyen organismos fúngicos tales como, pero sin limitación, especies de Candida, Blastomyces, Cryptococcus y especies de Histoplasma.

En algunas realizaciones, una meganucleasa diseñada racionalmente puede dirigirse a una secuencia de reconocimiento dentro del genoma del patógeno, por ejemplo a un gen o elemento regulador que sea esencial para el crecimiento, reproducción o toxicidad del patógeno. En ciertas realizaciones, la secuencia de reconocimiento puede 65 estar en un plásmido bacteriano. La escisión mediada por meganucleasa de una secuencia de reconocimiento en un genoma de patógeno puede estimular la mutación dentro de un gen diana esencial en forma de una inserción, deleción

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concentradores desechables Vivospin (ISC, Inc., Kaysville, UT). Las enzimas se intercambiaron a tampón SA (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCh 5 mM, EDTA 5mM) para ensayos y almacenamiento usando columnas de desalación de centrifugación Zeba (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL). La concentración enzimática se determinó por absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción de 23.590 M"1cm"1. La pureza y el peso

5 molecular de las enzimas se confirmaron después por espectrometría de masas MALDI-TOF.

Se produjeron enzimas heterodiméricas por purificación de las dos proteínas de forma independiente y mezclándolas in vitro o construyendo un operón artificial para expresión en tándem de las dos proteínas en E. coli. En el caso anterior, las meganucleasas purificadas se mezclaron 1:1 en solución y se pre-incubaron a 42 0C durante 20 minutos

10 antes de la adición de sustrato de ADN. En el segundo caso, los dos genes se clonaron secuencialmente en el vector de expresión pET-21a usando MdeIIEcoRI y EcoRI/HindIII. El primer gen en el operón termina con dos codones de parada para evitar errores de lectura durante la transcripción. Un espaciador de ácido nucleico de 12 pares de bases y una secuencia Shine-Dalgarno del vector pET21 separaron el primer y segundo genes en el operón artificial.

15 3. Ensayos de Escisión.

Todas las enzimas purificadas como se han descrito anteriormente se ensayaron con respecto a actividad por incubación con sustratos de ADN lineales, bicatenarios que contenían la secuencia de reconocimiento de meganucleasas. Se hibridaron oligonucleótidos genéticos correspondientes a las hebras tanto sentido como 20 antisentido de la secuencia de reconocimiento y se clonaron en el sitio Smal del plásmido pUC19 por ligación de extremos romos. Las secuencias de los sitios de unión clonados se confirmaron por secuenciación de didesoxinucleótidos Sanger. Todos los sustratos plasmídicos se linealizaron con XmnI, ScaI o BpmI simultáneamente con el producto de digestión de la meganucleasa. Los productos de digestión enzimática contenían 5 pl de sustrato de ADN 0,05 pM, 2,5 pl de meganucleasa I-CreI recombinante 5 pM, 9,5 pl de tampón SA y 0,5 pl de XmnI, Scal o BpmI.

25 Los productos de digestión se incubaron a 37 0C o 42 0C para ciertas enzimas meganucleasas, durante 4 horas. Las digestiones se detuvieron añadiendo Proteinasa K 0,3 pg/ml y SDS 0,5 %, y se incubaron durante una hora a 37 °C. Las digestiones se analizaron en agarosa 1,5 % y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio.

Para evaluar la preferencia de semi-sitios de meganucleasa, se incubaron meganucleasas diseñadas racionalmente

30 con un conjunto de sustratos de ADN correspondientes a un palíndromo perfecto del semi-sitio pretendido así como cada una de las 27 sustituciones de pares de bases sencillas posibles en el semi-sitio. De esta manera, fue posible determinar cuán tolerante es cada enzima a desviaciones de su semi-sitio pretendido.

4. Especificidad de Secuencia de Reconocimiento.

35 Las meganucleasas recombinantes purificadas TAT1 y TAT2 reconocieron secuencias de ADN que eran distintas de la secuencia de reconocimiento de meganucleasa de tipo silvestre (Figura 2 (B)). La meganucleasa ICreI de tipo silvestre escinde la secuencia de reconocimiento WT, pero no corta la secuencia pretendida para TAT1 ni la secuencia pretendida para TAT2. TAT1 y TAT2, de forma similar, cortan sus secuencias de reconocimiento pretendidas pero no

40 la secuencia de tipo silvestre. Las meganucleasas se evaluaron después con respecto a preferencia de semi-sitio y especificidad global (Figura 3). Se descubrió que I-CreI de tipo silvestre era altamente tolerante a sustituciones de par de bases sencillo en su semi-sitio natural. Por el contrario, se descubrió que TAT1 y TAT2 eran altamente específicas y completamente intolerantes a sustituciones de bases en las posiciones -1, -2, -3, -6 y -8 en el caso de TAT1 y las posiciones -1, -2 y -6 en el caso de TAT2.

45

EJEMPLO 2

Diseño Racional de Meganucleasas con Afinidad de Unión a ADN Alterada

50 1. Meganucleasas con afinidad aumentada y actividad aumentada.

Las meganucleasas CCR1 y BRP2 se diseñaron para escindir los semi-sitios 5'-AACCCTCTC-3' (SEC ID N° 18) y 5'-CTCCGGGTC-3' (SEC ID N°19), respectivamente. Estas enzimas se produjeron de acuerdo con la Tabla 1 como en el Ejemplo 1:

55 CCR1:

Posición

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

Base

A A C C C T C T C

Restos de Contacto

N32 Y33 R30/E38 R28IE40 E42 Q26 K24/Y68 Q44 R70

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BRP2:

Posición

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

Base

C T C C G G G G C

Restos de Contacto

S32 C33 R30/E38 R28/E40 R42 S26/R77 R68 Q44 R70

Ambas enzimas se expresaron en E. coli, se purificaron y se ensayaron como en el Ejemplo 1. Se descubrió que

5 ambas enzimas de primera generación escindían sus secuencias de reconocimiento pretendidas con tasas que eran considerablemente más bajas que las de I-CreI de tipo silvestre con su secuencia de reconocimiento natural. Para aliviar esta pérdida de actividad, la afinidad de unión a ADN de CCR1 y BRP2 se aumentó mutando E80 a Q en ambas enzimas. Se descubrió que estas versiones de segunda generación de CCR1 y BRP2 escindían sus secuencias de reconocimiento pretendidas con tasas catalíticas sustancialmente aumentadas.

10

2. Meganucleasas con afinidad de unión a ADN reducida y actividad reducida pero especificidad aumentada.

Se descubrió que I-CreI de tipo silvestre era altamente tolerante a sustituciones en su semi-sitio (Figura 3(A)). En un intento de hacer la enzima más específica, la lisina en la posición 116 de la enzima, que normalmente realiza un 15 puente salino con un fosfato de la cadena principal de ADN se mutó a ácido aspártico para reducir la afinidad de unión a ADN. Se descubrió que esta enzima diseñada racionalmente escindía la secuencia de reconocimiento de tipo silvestre con actividad sustancialmente reducida pero la enzima recombinante era considerablemente más específica que la de tipo silvestre. La preferencia de semi-sitio de la variante K116D se evaluó como en el Ejemplo 1 y se descubrió que la enzima era completamente intolerante a la desviación de su semi-sitio natural en las posiciones -1, -2

20 y -3 y presentaba al menos preferencia de base parcial en las 6 posiciones restantes en el semi-sitio ((Figura 3(B)).

EJEMPLO 3

Heterodímeros de Meganucleasa Diseñada Racionalmente 25

1. Escisión de sitios de ADN no palindrómicos por heterodímeros de meganucleasa formados en solución.

Se diseñaron dos meganucleasas, LAM1 y LAM2, para escindir los semi-sitios 5'-TGCGGTGTC-3' (SEC ID N0 20) y 5'-CAGGCTGTC-3' (SEC ID N0 21), respectivamente. Se esperaba que el heterodímero de estas dos enzimas

30 reconociera la secuencia de ADN 5'-TGCGGTGTCCGGCGACAGCCTG-3' (SEC ID ° 22) hallada en el gen p05 del bacteriófago X.

LAM1:

Posición

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

Base

T G C G G T G T C

Restos de Contacto

C32 R33 R30/E38 D28/R40 R42 Q26 R68 Q44 R70

LAM2:

Posición

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

Base

C A G G C I G T C

Restos de Contacto

S32 Y33 E30/R38 R40 K28/E42 Q26 R68 Q44 R70

LAM1 y LAM2 se clonaron, se expresaron en E. coli y se purificaron individualmente como se describe en el Ejemplo 1.

40 Las dos enzimas se mezclaron después 1:1 y se incubaron a 42 °C durante 20 minutos para permitirles intercambiar subunidades y reequilibrarse. La solución de enzima resultante, que se espera que sea una mezcla de homodímero LAM1, homodímero LAM2 y heterodímero LAM1/LAM2, se incubó con tres secuencias de reconocimiento diferentes correspondientes al palíndromo perfecto del semi-sitio LAMI, el palíndromo perfecto del semi-sitio LAM2 y el sitio híbrido no palindrómico hallado en el genoma del bacteriófago X. La enzima LAMI purificada sola corta el sitio

45 palindrómico de LAM1, pero no el sitio palindrómico LAM2 ni el sitio híbrido de LAM1/LAM2. De forma similar, la enzima LAM2 purificada sola corta el sitio palindrómico LAM2 pero no el sitio palindrómico LAM1 ni el sitio híbrido de LAM1/LAM2. La mezcla 1:1 de LAM1 y LAM2, sin embargo, escinde los tres sitios de ADN. La escisión del sitio híbrido LAM1/LAM2 indica que pueden mezclarse dos meganucleasas rediseñadas distintas en solución para formar una enzima heterodimérica capaz de escindir un sitio de ADN no palindrómico.

50

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2. Escisión de sitios de ADN no palindrómicos por heterodímeros de meganucleasa formados por co-expresión.

Los genes que codifican las enzimas LAM1 y LAM 2 descritas anteriormente se dispusieron en un operón para expresión simultánea en E. coli como se describe en el Ejemplo 1. Las enzimas co-expresadas se purificaron como en

5 el Ejemplo 1 y la mezcla de enzimas se incubó con las tres secuencias de reconocimiento potenciales descritas anteriormente. Se descubrió que la mezcla de enzimas co-expresada escindía los tres sitios, incluyendo sitio híbrido LAM1/LAM2, lo que indica que pueden co-expresarse dos meganucleasas diseñadas racionalmente distintas para formar una enzima heterodimérica capaz de escindir un sitio de ADN no palindrómico.

10 3. Escisión preferente de sitios de ADN no palindrómicos por heterodímeros de meganucleasa con interfaces proteína-proteína modificadas.

Para aplicaciones que requieran la escisión de sitios de ADN no palindrómicos, es deseable promover la formación de heterodímeros de enzima minimizando a la vez la formación de homodímeros que reconocen y escinden diferentes 15 sitios de ADN (palindrómicos). Para este fin, se produjeron variantes de la enzima LAM1 en las que las lisinas en las posiciones 7, 57 y 96 se cambiaron a ácidos glutámicos. Esta enzima se co-expresó después y se purificó como anteriormente con una variante de LAM2 en la que los ácidos glutámicos en las posiciones 8 y 61 se cambiaron a lisina. En este caso, se esperaba que la formación del homodímero de LAM1 se redujera debido a la repulsión electrostática entre E7, E57 y E96 en un monómero y E8 y E61 en el otro monómero. De forma similar, se esperaba 20 que la formación del homodímero de LAM2 se redujera debido a repulsión electrostática entre K7, K57 y K96 en un monómero y K8 y K61 en el otro monómero. Por el contrario, se esperaba que el heterodímero LAM1/LAM2 se favoreciera debido a atracción electrostática entre E7, E57 y E96 en LAM y K8 y K61 en LAM2. Cuando las dos meganucleasas con interfaces modificadas se co-expresaron y ensayaron como se ha descrito anteriormente, se descubrió que el sitio híbrido LAM1/LAM2 se escindía preferentemente frente a los dos sitios palindrómicos, lo que

25 indica que las sustituciones en la interfaz proteína-proteína de meganucleasa pueden dirigir la formación preferente de heterodímeros.

EJEMPLO 4

30 Heterodímeros de Meganucleasa Adicionales que Escinden Secuencias de ADN Fisiológicas

1. Heterodímeros de meganucleasa que escinden secuencias de ADN relevantes para la terapia génica.

Puede producirse un heterodímero de meganucleasa diseñado racionalmente (ACH1/ACH2) que escinde la secuencia

35 5'-CTGGGAGTCTCAGGACAGCCTG-3' (SEC ID N0 23) en el gen FGFR3 humano, en el que mutaciones provocan acondroplasia. Por ejemplo, se diseñó una meganucleasa basada en la meganucleasa I-CreI, como se ha descrito anteriormente, con los siguientes restos de contacto y semi-sitios de secuencia de reconocimiento:

ACH1: 40

Posición

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

Base

C T G G G A G T C

Restos de Contacto

D32 C33 E30/R38 R40/D28 R42 A26/Q77 R68 Q44 R70

ACH2:

Posición

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

Base

C A G G C T G T C

Restos de Contacto

D32 Y33 E30/R38 R40 K28/E42 Q26 R68 Q44 R70

45 Puede producirse un heterodímero de meganucleasa diseñada racionalmente (HGH1/HGH2) que escinda la secuencia 5'-CCAGGTGTCTCTGGACTCCTCC-3' (SEC ID N0 24) en el promotor del gen de Hormona del Crecimiento Humana. Por ejemplo, se diseñó una meganucleasa basada en la meganucleasa I-CreI, como se ha descrito anteriormente, con los siguientes restos de contacto y semi-sitios de secuencia de reconocimiento:

50 HGH1:

Posición

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

Base

C C A G G T G T C

Restos de Contacto

D32 C33 N30/Q38 R40/D28 R42 Q26 R68 Q44 R70

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BRP2:

Posición

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

Base

C T C C G G G T C

Restos de Contacto

S32 C33 R30/E38 E40/R28 R42 S26/R77 R68 Q44 R70

Puede producirse un heterodímero de meganucleasa diseñada racionalmente (MGC1/MGC2) que escinde la

5 secuencia 5'-TAAAATCTCTAAGGTCTGTGCA-3' (SEC ID N° 34) en el gen de Magnesio Quelatasa de Nicotiana tabacum. Por ejemplo, se diseñó una meganucleasa basada en la meganucleasa I-CreI, como se ha descrito anteriormente, con los siguientes restos de contacto y semi-sitios de secuencia de reconocimiento:

MGC1: 10

Posición

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

Base

T A A A A T C T C

Restos de Contacto

C32 Y33 N30/Q38 Q40/ K28 Q26 Y68/K24 Q44 R70

MGC2:

Posición

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

Base

T G C A C A G A C

Restos de Contacto

S32 R33 R30/E38 Q40 K28 A26/Q77 R68 T44 R70

15 Puede producirse un heterodímero de meganucleasa diseñada racionalmente (CYP/HGH2) que escinde la secuencia 5'-CAAGAATTCAAGCGAGCATTAA-3' (SEC ID N° 35) en el gen CYP82E4 de Nicotiana tabacum. Por ejemplo, se diseñó una meganucleasa basada en la meganucleasa I-CreI, como se ha descrito anteriormente, con los siguientes restos de contacto y semi-sitios de secuencia de reconocimiento:

20 CYP:

Posición

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

Base

C A A G A A T T C

Restos de Contacto

D32 Y33 N30/Q38 R40/ K28 Q77/A26 Y68 Q44 R70

HGH2:

Posición

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

Base

T T A A T G C T C

Restos de Contacto

S32 C33 N30/Q38 Q40 K66 R77/S26 Y68/K24 Q44 R70

25

4. Heterodímeros de meganucleasa que escinden secuencias de ADN en genomas de levadura

Puede producirse un heterodímero de meganucleasa diseñada racionalmente (URA1/URA2) que escinde la secuencia 5'-TTAGATGACAAGGGAGACGCAT-3' (SEC ID N°36) en el gen URA3 de Saccharomyces cerevisiae. Por ejemplo, 30 se diseñó una meganucleasa basada en la meganucleasa I-CreI, como se ha descrito anteriormente, con los siguientes restos de contacto y semi-sitios de secuencia de reconocimiento:

URA1:

Posición

-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

Base

T T A G A T G A C

Restos de Contacto

S32 C33 N30/Q38 R40 K28 Q26 R68 T44 R70

Claims (1)

1. imagen1

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