JP5827132B2 - ニューロパチーを治療するための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2009年2月4日に出願された米国仮出願第61/206,770号の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
非適用。
本明細書で開示される方法の実践、ならびに組成物の調製と使用は、特に指示がない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、DNA、および関連分野における従来の技術において、当技術分野の技術範囲内である。これらの技術は、文献で完全に説明される。例えば、Sambrook et al.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 and Third edition,2001、Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,New York,1987 and periodic updates、the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego、Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998、METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,“Chromatin”(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999、およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999を参照されたい。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、線状または環状コンフォメーションで、一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示については、これらの用語をポリマーの長さに関する限定と解釈すべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体、ならびに塩基、糖、および/またはリン酸(ホスホロチオエート主鎖)部分内で修飾されるヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対形成特異性を有し、すなわち、Aの類似体は、Tと塩基対を形成する。
NT−3遺伝子またはGDNF遺伝子の標的部位に特異的に結合するDNA結合ドメインを含む組成物が本明細書に記載される。本明細書で開示される組成物および方法で、任意のDNA結合ドメインを使用することができる。
本明細書に記載されるDNA結合タンパク質(例えば、ZFP)を含む融合タンパク質および異種調節(機能的)ドメイン(またはその機能的フラグメント)も提供される。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン(活性化剤、リプレッサー、共活性化剤、コリプレッサー)、サイレンサ、癌遺伝子(例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリーメンバー等)、DNA修復酵素ならびにそれらの関連する因子および修飾因子、クロマチン結合性タンパク質およびそれらの修飾因子(例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ)、ならびにDNA修飾酵素(例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ)、ならびにそれらの関連する因子および修飾因子が含まれる。DNA結合ドメインならびにヌクレアーゼ開裂ドメインの融合に関する詳細ついて、米国特許出願公開第2005/0064474号、同第2006/0188987号、および同第2007/0218528号明細書を参照されたく、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
タンパク質(例えば、ZFP)、同一物をコードするヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されるタンパク質および/またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段で標的細胞に送達され得る。好適な細胞には、真核および原核細胞ならびに/または細胞株が含まれるが、これらに限定されない。そのような細胞またはそのような細胞から生成された細胞株の非制限的な例には、COS、CHO(例えば、CHO−S、CHO−K1、CHO−DG44、CHO−DUXB11、CHO−DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28−G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0−Ag14、HeLa、HEK293(例えば、HEK293−F、HEK293−H、HEK293−T)、およびperC6細胞、ならびにツマジロクサヨトウ(Sf)等の昆虫細胞、またはサッカロミセス、ピチア、およびシゾサッカロミセス等の真菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞株は、CHO−K1、MDCK、またはHEK293細胞株である。
組成物(例えば、亜鉛フィンガータンパク質、亜鉛フィンガーをコードするタンパク質ポリヌクレオチド、融合タンパク質をコードする融合タンパク質および/またはポリヌクレオチド)の1つ以上を含むキットが、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、キットには、通常、亜鉛フィンガータンパク質(または同一物をコードするポリヌクレオチド)を含む1つ以上の容器が含まれる。キットには、本明細書に記載される方法(例えば、ニューロパチーの治療)のいずれかのために、タンパク質またはポリヌクレオチドの使用に関する指示、通常は書面での指示の好適なセットがさらに含まれ得る。キットには、任意の便利かつ適切なパッケージングが含まれる。指示には、通常、投与量、投薬スケジュール、および所望の使用法のための投与の経路についての情報が含まれる。容器は、単位用量、大量包装(例えば、複数用量包装)、または副次的単位用量であり得る。本発明のキット内に提供される指示は、典型的には、ラベルまたは添付文書(例えば、キット内に含まれる紙シート)上の書面での指示であるが、機械可読な指示(例えば、磁気または光学式記憶ディスクに保有される指示)も許容範囲である。
治療および研究用途を含むが、これらに限定されない、NT−3またはGDNFの調節が望ましい任意の用途のために、開示される組成物および方法を使用することができる。
NT−3またはGDNFを標的とした亜鉛フィンガータンパク質は、米国特許第6,534,261号明細書に記載されるように基本的に改変される。表1は、例示的な6フィンガーNT−3標的ZFPの認識ヘリックスを示す。表2は、例示的な6フィンガーGDNF標的ZFPの認識ヘリックスを示す。
筋肉内送達を介する糖尿病性ニューロパチーの治療のための、NT−3活性化ZFP−TF11971を使用する実行可能性を試験するために、以下の実験を実施した。
ヒトNT−3 mRNA発現を以下のように分析した。製造業者の推奨に従って、ハイピュアRNAアイソレーションキット(ロシュダイアグノスティックス)またはRNeasy(商標)キット(Qiagen,Valencia,CA)のいずれか一方を使用して全RNAを単離した。Liu et al.(2001)J.Biol.Chem.276:11323−11334に記載のように、ABI7700SDS機(Perkin−Elmer)で、96のウェルフォーマット内のTaqman(登録商標)化学を使用してリアルタイム定量RT−PCRを実行した。使用されたTaqman(登録商標)プライマーおよびプローブが以下に記載される。
hNT3−743F GATAAACACTGGAACTCTCAGTGCAA(配列番号67)
hNT3−827R GCCAGCCCACGAGTTTATTGT(配列番号68)
hNT3−776P FAM−CAAACCTACGTCCGAGCACTGACTTCAGA−BHQ1(配列番号69)
hNT3−1AF,AGCCAGGATAATGATGAGATCTTACA(配列番号70)
hNT3−1AR,GGAGATAAGCGAGAAATATCACATAAAA(配列番号71)
hNT3−1APro,FAM−TGAACAAGGTGATGTCCA−BHQ1(配列番号72)
hNT3−1BF,TCGACGTCCCTGGAAACG(配列番号73)
hNT3−1BR,ACATAAAACAAGATGGACATCACCTT(配列番号74)
hNT3−1BPro,FAM−TGCCATGGTTACTTTTGCCACGATCTTACA−BHQ1(配列番号75)
hGAPDH−For,CCATGTTCGTCATGGGTGTGA(配列番号76)
hGAPDH−Rev,CATGGACTGTGGTCATGAGT(配列番号77)
hGAPDH−Pro,FAM−TCCTGCACCACCAACTGCTTAGCA−TAMRA(配列番号78)
48時間の蓄積期間後(すなわち、新鮮培地を細胞に塗布してから48時間後)に、分泌NT−3タンパク質レベルを培地中で決定した。製造業者の指示に従って、NT−3Emax(登録商標)ImmunoAssay System(Promega,Madison,WI)を使用して、培地のアリコート(200μl)をアッセイした。
ラット初代骨格筋細胞において、NT−3標的ZFP−TFがNT−3発現を調節する能力を同様に分析した。Hellsten et al.(1997)J.Physiol.504:695−704に記載のように、特に、ラット初代骨格筋細胞を調製した。簡潔に言えば、21日齢のラット胚の後肢から筋肉組織を切開し、0.1%(w/v)のブドウ糖を含有するリン酸緩衝生理食塩水中の0.1%(w/v)のコラゲナーゼおよび0.2%(w/v)のトリプシンで、37℃で30分間消化した。消化した組織を成長培地(10%のウマ血清を含有するDMEM(インビトロゲン)および2mM Lグルタミン)中に再懸濁した。10mlのピペットを用いて、機械的粉砕で細胞を解離した。1000rpmの回転数で5分間の遠心分離後、細胞ペレットを成長培地中に再懸濁した。細胞懸濁液を100μMのナイロンメッシュを通して濾過し、培養フラスコ内で45分間インキュベートした。未付着の筋芽細胞を回収し、0.1%(w/v)のゼラチン被覆プレート内に維持した。
ラットNT−3 mRNA発現レベルのTaqman(登録商標)分析に関して、以下のプライマーであった。
rNT3 778F 5’− TGTGACAGTGAGAGCCTGTGG(配列番号79)
rNT3 846R 5’−TGTAACCTGGTGTCCCCGAA(配列番号80)
rNT3 800P 5’−FAM−TGACCGACAAGTCCTCAGCCATTGAC−BHQ1(配列番号81)
rGAPDH−For,CCCATGTTTGTGATGGGTGTG(配列番号82)
rGAPDH−Rev,ATCCTGCACCACCAACTGCTTAGC(配列番号83)
rGAPDH−Pro,FAM−ATCCTGCACCACCAACTGCTTAGC−TAMRA(配列番号84)
ストレプトゾトシン誘発糖尿病性ニューロパチーの確立されたラットモデルにおいて、ニューロパチーに対するNT−3標的ZFP−TFの有効性も同様に試験した。
本明細書に記載されるGDNF標的ZFPを、以下のようにラット、ヒト、およびアカゲザル由来細胞において評価した。
18日齢の胎性スプラーグ/ドーリーラットラット線条体細胞を購入し、供給業者によって提案されるように調製した。簡潔に言えば、線条体組織をNeuroPapain(商標)を用いて30℃で30分間治療し、その後粉砕した。次に、B27(インビトロゲン)およびGlutamax(商標)で捕捉した神経基礎培地(インビトロゲン)中の、新たに被覆されたポリ−D−リジン(シグマ)6ウェルプレート上に、1ウェルにつき320,000細胞の密度で細胞を播種した。5%のCO2中で、37℃で3日間のインキュベート後、媒体の半分を新たな媒体に取り換え、さらに3〜4日間培養物を遷延した。
10%のFBSで捕捉したDMEMを用いて、ヒト293LTV細胞を培養した。1ウェルにつき1E5細胞の密度で、24ウェルプレート内に細胞を播種し、翌日、15961、17248、17276、および17287とした、ZFP−TFをコードするプラスミドDNAをトランスフェクトした。GFPをコードするプラスミドもまた、ベクター対照として含んだ。製造業者のプロトコルを使用して、FuGENE(登録商標)6試薬(Roche Applied Biosiences)でトランスフェクションを実行した。遺伝子発現分析をトランスフェクションの48時間後に実行した。特に、RocheのハイピュアRNAアイソレーションキットを使用して全RNAを浄化し、Taqman(登録商標)7300リアルタイムPCRを用いる遺伝子発現分析ために使用した。GDNFおよびアクチンレベルを決定するために使用されたプライマーは、ヒトGDNF:Hs00181185_m1またはHs01055329_m1遺伝子発現アッセイ(Applied Biosystems)およびヒトACTB:4352935E(Applied Biosystems)であった。
非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および10%のFBSで捕捉したMEMでアカゲザルRF6A細胞を維持した。SF溶液およびEH100プログラムを使用するAmaxa社の96ウェルシャトルを使用して、GDNF−ZFP 15961および17248(2E5細胞につき600ng)をコードするプラスミドDNAをフクレオフェクトした。以下のように、トランスフェクション後、48時間遺伝子発現分析を実行した。RocheのハイピュアRNAアイソレーションキットで全RNAを浄化し、TaqMan(登録商標)7300リアルタイムPCRを用いる遺伝子発現分析のために使用した。GDNFおよび18Sレベルを決定するために使用されたプライマー/プローブセットは、
h−rh−GDNF RT−Forward:CAAATGGCAGTGCTTCCTAGAAG(配列番号87)
h−rh−GDNF RT−Reverse:AGTTAAGACACAACCCCGGTTTT(配列番号88)
h−rh−GDNF RT−Probe:TGCAGCTGCCAACCCAGAGAATTCC(配列番号89)
18s RT−Forward:TTCCGATAACGAACGAGACTCT(配列番号90)
18s RT−Reverse:TGGCTGAACGCCACTTGTC(配列番号91)
18s RT−Probe TAACTAGTTACGCGACCCCCGAG(配列番号92)であった。
6−ヒドロキシドーパミン(6−OHDA)モデルのラットGDNFタンパク質レベルおよび行動データを以下のようにアッセイした。convection−enhanced delivery(CED)法を使用して、成人ラット(1つの群につきn=6)の線条体(1つの線条体につき10μL)にAAVベクター(GFPまたはGDNF−ZFP TF)を注入し、線条体内のベクター分布を最大にした。ベクター送達の4週間後、0.2%のアスコルビン酸塩を含む20μLの無菌生理食塩水中で懸濁した10μgの6−OHDAを、CED法によって右線条体に注入した。ラットを6−OHDA注入の3週間後に安楽死させた。
基本的に、Schallert et al.(2000)Neuropharmacology 39:777に記載のように、標準の「円筒」試験を使用して前肢無動を評価した。簡潔に言えば、ラットを垂直円筒内に個別に配置し、それらが新しい環境を探索する時の、円筒の壁上のそれらの左および右前肢の配置を計数する。6−OHDA注入の後8日および14日後に、最初の20回の前肢配置を評価した。
Fitzsimmons et al.(2006)Behav Brain Res 169:352に記載のように、「通路タスク」を使用して感覚運動怠慢を評価し、通路の左側または右側からの食物の回収を監視した。6−OHDA投与の9日後に、最初の20回の食物回収を記録した。
アンフェタミンは、ドーパミンニューロンの末端からのドーパミンの放出を誘導する。ドーパミンニューロンの片側病変は、ラットが病変した側に向かって回転することを引き起こすドーパミンにおける大きな不均衡を引き起こす。したがって、Oiwa et al.(2003) Neurosurg 98:136に記載のように、5mg/kgのD−アンフェタミンの腹腔内投与を受けて誘導される回転数を計数するために、自動ロータメーターを使用してアンフェタミン誘発性回転行動を評価した。6−OHDA投与の15日間後、アンフェタミン注入後1時間ラットを評価した。
GDNFZFP−TFを受けたラットおよび対照ラットにおけるGDNFタンパク質の濃度も同様に、市販のキット(Promega Corporation,Madison,WI)を用いて決定した。14172の対照AAV1およびAAV2GFPベクターまたはAAV1およびAAV2ベクターならびにGFPを対流強化送達(CED)法で注入し、注入の3週間後に完全な線条体を切開した。加えて、AAV−16655を注入され、6−OHDAで治療された、行動面で試験したラットの各半球から完全な線条体を切開した。線条体組織を液体窒素内でスナップ冷凍し、プロテアーゼ阻害剤(Mini Complete,Roche,Palo Alto,CA)で捕捉した300uLの溶解バッファ(Tropix,Applied Biosciences,Foster City,CA)中で、モデル100Fisher Science Dismembratorを均質化し、次に、13,000rpmの回転数で、4℃で15分間遠心分離した。GDNFに特異的な抗体で被覆したウェルに、標準、キット対照または試料を二重に添加した。
製造業者の指示通りに、Lipofectamine2000(インビトロゲン)によって、11971ZFP(11971−p65)と連結した1つのp65ドメインを含有する、または11971ZFP(11971−2x p65)もしくは23570ZFP(23570−2x p65)と連結した2つのp65ドメインを含有する0.5ugのプラスミドで、HEK293T細胞を過渡的にトランスフェクトした。48時間後に、培地中で分泌したNT−3タンパク質レベルを決定した。製造業者の指示に従って、NT−3 Emax ImmunoAssay System(Promega,Madison,WI)を使用して、培地のアリコート(200ul)をアッセイした。対照には、GFP発現プラスミドを伴うトランスフェクションおよび空ベクター(pcDNA)が含まれる。
図13は、緑色蛍光タンパク質(GFP)発現プラスミドをトランスフェクトした細胞と比較して、Fugene(登録商標)6(Roche)を使用してZFP発現プラスミドをトランスフェクトしたヒト293LTV細胞中のヒトGDNF遺伝子活性化を示すグラフである。上の実施例5に記載のように、リアルタイムPCRによってGDNFおよびベータアクチンmRNAレベルを決定し、GDNFとベータアクチン(GDNF/ACTB)との間の割合として相対的なGDNFレベルを表した。この結果は、GDNF特異的ZFPによるGDNF活性化を示す。
10%のFBSで捕捉したOpti−MEM(インビトロゲン)中でLLC−MK2細胞を維持し、プログラムA−23を使用するAmaxaのsingle cuvette nucleofection technology(Lonza AG)を使用してフクレオフェクトした。全RNAを48時間後に抽出し、実施例5に記載のプライマーを伴ってリアルタイムPCRを実行した。図14は、緑色蛍光タンパク質(GFP)ベクターまたは偽トランスフェクトした細胞をトランスフェクトした細胞と比較して、ZFP発現ベクターをフクレオフェクトしたアカゲザルLLC−MK2細胞中のアカゲザルGDNF遺伝子の活性化を示す。18Sに対するGDNFレベルを示す。このデータは、これらのZFP発現ベクターが、アカゲザル細胞中のGDNF発現を誘導する能力があること示す。
ラットGDNF活性化剤(AAV ZFP TF−14172)およびGFP対照(AAV−GFP)をコードするAAV−2ベクターを正常ラットの網膜下腔に注入した。注入の6週間後、RNAを眼杯から単離し、リアルタイムRT−PCRでGDNF mRNAのレベルを測定した。AAV−GFPを注入した眼と比較して、AAV2 ZFP TF−14172を注入した眼において、GDNF mRNAレベルで5倍までの増加を観察し(図15を参照)、GDNF特異的ZFPのインビボでの活性を示した。
生後21日齢(P21)で、RCS(Royal College of Surgeon)ラットにAAV−GFPまたはAAV−16655の網膜下注入を行った。RCSラットは、ヒトにおいて常染色体劣性網膜色素変性症を引き起こすMertk遺伝子内で突然変異を担持する。P60で、網膜電図(ERG)を実行し、杆体および錐体視細胞の機能を評価した。4cd−s/m2の刺激強度で、AAV−GFP(p=0.0006)を注入した眼において51.9±26.0μVであったことと比較して、AAV−16655を注入した眼において平均暗順応b波振幅は97.9±54.3μVであり、杆体機能の維持を示唆した(図15を参照)。25cd−s/m2の刺激強度で、平均明順応b波振幅は、AAV−GFP(p=0.0058)を注入した眼において37.7±10.8μVであったことと比較して、AAV−16655を注入した眼において62.5±36.9であり、錐体機能の維持を示唆した。
Claims (13)
- NT−3の発現を調節し、配列番号20に示す標的部位に結合する亜鉛フィンガータンパク質であって、当該亜鉛フィンガータンパク質が6つの認識ヘリックスをF1からF6の順番で含み、当該亜鉛フィンガータンパク質が、認識ヘリックス領域内に以下の(i)のアミノ酸配列を含むタンパク質からなる、亜鉛フィンガータンパク質:
(i)
F1: QSSHLTR (配列番号8);
F2: RSDDRKT (配列番号7);
F3: RSDHLST (配列番号6);
F4: DSSARKK (配列番号5);
F5: DRSDLSR (配列番号4);及び
F6: QSGHLSR (配列番号3)。 - GDNFの発現を調節する亜鉛フィンガータンパク質であって、当該亜鉛フィンガータンパク質が6つの認識ヘリックスをF1からF6の順番で含み、当該亜鉛フィンガータンパク質が、認識ヘリックス領域内に以下の(i)〜(vi)のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質からなる群より選択される、亜鉛フィンガータンパク質:
(i)
F1: QSGHLAR (配列番号21);
F2: RSDDRKT (配列番号7);
F3: DNPNLNR (配列番号22);
F4: RSDDLSR (配列番号23);
F5: DRSHLSR (配列番号24);及び
F6: RSDHLSR (配列番号25)、ここで、当該亜鉛フィンガータンパク質は、配列番号55に示した標的部位に結合する;
(ii)
F1: QSGHLAR (配列番号21);
F2: RSDDRKT (配列番号7);
F3: RYPNLIR (配列番号26);
F4: RSDDLSR (配列番号23);
F5: DRSHLSR (配列番号24);及び
F6: RSDHLSR (配列番号25)、ここで、当該亜鉛フィンガータンパク質は、配列番号55に示した標的部位に結合する;
(iii)
F1: QSGNLAR (配列番号27);
F2: TSGNLTR (配列番号28);
F3: RSDHLSE (配列番号29);
F4: QNHHRIN (配列番号30):
F5: RSADLTR (配列番号31);及び
F6: QSSDLRR (配列番号32)、ここで、当該亜鉛フィンガータンパク質は、配列番号56に示した標的部位に結合する;
(iv)
F1: RSDNLSV (配列番号33);
F2: RNASRIT (配列番号34);
F3: QSGSLTR (配列番号35);
F4: RSDNLRE (配列番号36);
F5: RSDHLST (配列番号6);及び
F6: QNATRIN (配列番号37)、ここで、当該亜鉛フィンガータンパク質は、配列番号58に示した標的部位に結合する;
(v)
F1: RSDHLSQ (配列番号38);
F2: RSAVRKN (配列番号39);
F3: RSDHLST (配列番号6);
F4: DRSHLAR (配列番号40);
F5: DRSARTR (配列番号41);及び
F6: QSGNLAR (配列番号27)、ここで、当該亜鉛フィンガータンパク質は、配列番号59に示した標的部位に結合する;
(vi)
F1: DRNQLIN (配列番号42);
F2: RSADLSR (配列番号43);
F3: QSSDLSR (配列番号44);
F4: DRSNLTR (配列番号45);
F5: RSDHLSA (配列番号46);及び
F6: DRSDLSR (配列番号4)、ここで、当該亜鉛フィンガータンパク質は、配列番号60に示した標的部位に結合する。 - 請求項1又は2のいずれかに記載の亜鉛フィンガータンパク質および機能ドメインを含む、融合タンパク質。
- 前記機能ドメインは、活性化ドメインまたは抑制ドメインである転写調節ドメインである、請求項3に記載の融合タンパク質。
- 請求項1に記載の亜鉛フィンガータンパク質または請求項3もしくは4に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項1又は2のいずれかに記載の亜鉛フィンガータンパク質、請求項3もしくは4に記載の融合タンパク質、または請求項5に記載のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
- 請求項1又は2のいずれかに記載の亜鉛フィンガータンパク質、請求項3もしくは4に記載の融合タンパク質、請求項5に記載のポリヌクレオチド、または請求項6に記載の薬学的組成物を含む、単離細胞。
- 前記細胞は幹細胞である、請求項7に記載の単離細胞。
- ニューロパチーを特徴とする状態を治療または予防するための薬学的組成物である、請求項6に記載の薬学的組成物。
- 前記ポリヌクレオチドは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターに担持される、請求項9に記載の薬学的組成物。
- 前記亜鉛フィンガータンパク質は、それを必要とする対象に投与される幹細胞中に存在する、請求項9又は10のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記状態は、網膜変性の結果であるか、または嗜癖行動と関連する、糖尿病性ニューロパチー、パーキンソン病、化学療法誘発ニューロパチー、シャルコーマリーツース病である、請求項9〜11のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 前記亜鉛フィンガータンパク質は、請求項1もしくは2のいずれかに記載の亜鉛フィンガータンパク質、請求項3もしくは4のいずれかに記載の融合タンパク質、または請求項5に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を含む、請求項9〜12のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
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US7013219B2 (en) | 1999-01-12 | 2006-03-14 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
US6534261B1 (en) * | 1999-01-12 | 2003-03-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
US6453242B1 (en) | 1999-01-12 | 2002-09-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites |
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IL150069A0 (en) * | 1999-12-06 | 2002-12-01 | Sangamo Biosciences Inc | Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function |
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